CN101478985B - 经典猪瘟病毒e2结构糖蛋白内的新型毒力决定子 - Google Patents

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Abstract

在猪中，经典猪瘟病毒(CSFV)E2糖蛋白是中和抗体和保护免疫性的主要诱导子。E2介导病毒吸附于靶细胞，并携带与病毒毒力相关的遗传决定子。CSFV E2还在残基829和837之间包含由单克隆抗体(mAb)WH303识别的离散表位(TAVSPTTLR)，其用于区分CSFV和相关的瘟病毒牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和边界病病毒(BDV)。在该报告中，强毒力Brescia分离物(BICv)的CSFV感染克隆用于逐渐地将CSFV E2的mAbWH303表位突变为BVDV毒株NADL E2的同源氨基酸序列(TSFNMDTLA)。尽管由此产生的病毒突变体T1v(TSFSPTTLR)、T2v(TSFNPTTLR)、T3v(TSFNMTTLR)表现出与亲代BICv的那些相似的体外生长特征，但是突变体T4v(TSFNMDTLR)和T5v(TSFNMDTLA)相对于亲代BICv表现出病毒产量的10倍减少，和血小板尺寸的显著减小。只在T3v、T4v和T5v中失去针对WH303的免疫组化反应性。

Description

经典猪瘟病毒E2结构糖蛋白内的新型毒力决定子
发明背景
发明领域
本发明涉及在E2结构糖蛋白内的新型经典猪瘟病毒(classical swinefever virus，CSFV)毒力决定子的分离和表征，和这些新型毒力决定子对设计活减毒CSF疫苗的应用。
相关技术描述
经典猪瘟(CSF)是猪的高度接触传染性疾病，其本质上可以是急性的或慢性的(van Oirschot，J.T.1986.在：猪的疾病(Diseases of Swine)，第6版，Leman等，eds.，爱荷华州立大学出版社(Iowa State University Press)，Ames，爱荷华，第289页)。病原体，即CSF病毒(CSFV)是具有正向单链RNA基因组的小的有包膜病毒，其与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和边界病病毒(BDV)一起被分类为黄病毒科(Flaviridae)家族中瘟病毒(Pestivirus)属的成员(Hulst等，2001.病毒学杂志(J.Virol.)75：9585-9595)。该12.5kb的CSFV基因组包含单一开放阅读框，其编码4000个氨基酸的多蛋白，并通过由细胞蛋白酶和病毒蛋白酶引起的对该多蛋白的共翻译和翻译后加工而最终产生11-12种最终分裂产物(NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH)(Rice，C.M.1996.在：基础病毒学(Fundamental Virology)，第3版，Fields和Howley编，Lippincott Raven，费城，第931-959页)。
毒力和宿主范围表型在CSFV分离物中和瘟病毒之间变化。受高毒力CSFV毒株感染导致受感染动物的死亡，而中度-低度毒力的分离物诱导延长的慢性疾病(van Oirschot，见上)。另外，BVDV和BDV虽然分别是牛和绵羊物种中疾病的病原体，但是也能够在不诱导临床疾病的条件下感染猪(van Oirschot，见上)。尽管可以获得来自不同毒力表型，即BVDV和BDV的CSFV的基因组序列，但是缺乏对在天然宿主中的CSFV毒力的遗传基础的理解(van Oirschot，见上)。使用反向遗传学能够鉴定病毒毒力决定子，从而促进候选活减毒CSF疫苗的开发(Mayer等，2004.疫苗(Vaccine)22：317-328；Meyers等，1999.病毒学杂志(J.Virol.)73：10224-10235；Moorman等，1996.病毒学杂志(J.Virol.)70：763-770；Moser等2001.病毒基因(Virus Genes)23：63-68；Risatti等，2005a.病毒学杂志(J.Virol.)79：3787-3796；Risatti等，2005b.病毒学(Virology)343：116-117；Ruggli等，1996.病毒学杂志(J.Virol.)70：3478-3487；Tratschin等，1998.病毒学杂志(J.Virol.)72：7681-7684；van Gennip等，2000.疫苗(Vaccine)19：447-459)。
壳体蛋白，和糖蛋白Erns、E1、和E2是CSFV病毒体的结构成分，其中E1和E2通过它们的羧基末端锚定在包膜上，且Erns与病毒包膜松散地结合(Thiel等1991.病毒学杂志(J.Virol.)65：4705-4712；Weiland等1990.病毒学杂志(J.Virol.)64：3563-3569；Weiland等1999.遗传学和病毒学杂志(J.Gen.Virol.)80：1157-1165)。全部三种糖蛋白都与CSFV毒力相关(Meyers，见上；Risatti等2005a，b，见上)。
认为E2糖蛋白是CSFV复制所必需的，因为证明了包含E2基因的部分或完全删除的病毒突变体是无法生活的(van Gennip等2002.疫苗(Vaccine)20：1544-1556)。E2，与Erns(Mayer等，见上)和E1(Wang等2004.病毒学(Virology)330：332-341)一起，参与病毒向宿主细胞的吸附；实际上，嵌合瘟病毒表现出与E2基因供体的那些一致的传染性和细胞向性表型(van Gennip等2000，2002，见上)。E2是最具免疫原性的CSFV糖蛋白(Konig等1995.病毒学杂志(J.Virol.)69：6479-6486；Weiland等1990，见上)，其诱导中和抗体和针对致死攻击的保护。CSFV E2还在残基829和837之间包含被单克隆抗体(mAb)WH303识别的表位(Lin等2000.病毒学杂志(J.Virol.)74：11619-11625)，所述WH303是不能与BVDV或BDV E2反应且常规用于CSF诊断的试剂。
于此，我们报告了CSFV E2的WH303表位中突变的影响，所述突变是使高毒力Brescia CSFV的氨基酸序列逐渐向BVDV毒株NADL的同源氨基酸序列改变的突变，这说明了对猪中病毒毒力的相加效应和在6个氨基酸改变后的完全减毒作用。这样的减毒病毒允许合理的设计活减毒CSF疫苗。当在接种疫苗后第3天和21天用高毒力Brescia病毒攻击时，受到病毒突变体感染的动物得到保护。在WH303表位中的该位点处的修饰容许开发用于区分受接种和受感染动物的诊断检验。
发明概述
我们鉴定了E2糖蛋白中的新型CSFV毒力决定子。
按照该发现，本发明的目的是提供一种重组经典猪瘟病毒(CSFV)，其包括编码修饰的CSFV E2糖蛋白的DNA。
本发明的目的是还提供包括编码CSFV E2糖蛋白的重组经典猪瘟病毒，所述糖蛋白是通过逐渐突变高度致病性毒株Brescia的E2基因的一部分而被修饰的，这导致更接近地类似于来自BVDV的同源E2基因的WH303表位序列的突变的E2病毒，即导致CSFV减毒的修饰。
本发明的另一个目的是提供免疫原性组合物，其包括能存活的重组经典猪瘟病毒，所述重组经典猪瘟病毒包括修饰的CSFV E2糖蛋白。
本发明的另一个目的是提供合理设计的活减毒CSFV疫苗，其减轻CSF的严重性。
本发明的另一个目的是提供合理设计的活减毒CSFV疫苗，其有效用于保护动物在受到高毒力Brescia CSFV攻击时，免患临床CSF疾病。
本发明的又一个目的是提供标记疫苗，其容许了受接种的动物和受CSFV感染的动物之间的血清学差异。
本发明的再一个目的是提供通过施用有效量合理设计的活减毒CSFV疫苗保护动物免患CSF的方法。
通过随后的描述，本发明的其他目的和优势应该容易地变得显而易见。
附图简述
图1描述了在E2糖蛋白mAb WH303表位区域中比较CSFV Brescia、BVDV毒株NADL和CSFV T1-5突变病毒。显示了在CSFV多蛋白中的氨基酸残基位置。斜体字表示在BVDV毒株NADL和CSFV T1v-T5v中与Brescia E2中的那些不同的残基。
图2A和2B比较T1v-T5v突变体和BICv的特征。图2A显示T1v-T5v突变体和BICv的体外生长特征。用T1v、T2v、T3v、T4v、T5v或BICv感染(MOI＝0.01)SK6单层，并且在感染后间或地滴定病毒产量。数据表示来自两次独立实验的平均值和标准偏差。图2B显示突变体T1v-T5v和BICV的斑形成和mAb反应性。用50-100TCID50感染、用0.5％琼脂糖覆盖SK6单层，并在37℃对其进行培养3天。用50％(体积/体积)乙醇-丙酮固定平板，并用mAb WH303和mAb WH308通过免疫组化对其进行区别性染色。
图3显示由受到重组病毒T1v-T5v和BICv感染的猪中记录的临床分数。临床分数是如前所述针对修饰计算的，并且基于对两只(T1v、T2v、T3v和T4v)或六只(T5v和BICv)动物的观察。
图4A-B显示受到重组病毒T1v-T5v和BICv感染的猪中的外周白细胞计数(图4A)和血小板计数(图4B)。将计数表述为数量/ml，并且每个点代表两只(T1v、T2v、T3v和T4v)或六只(T5v和BICv)动物的平均值和标准误差。
图5A-C描述来自受到T1v-T5v突变体或BICv感染的猪中的血液(图5A)、鼻拭样(图5B)、和扁桃体刮样(图5C)中的病毒滴度。每个点代表关于两只(T1v、T2v、T3v和T4v)或六只(T5v和BICv)动物的平均TCID50/mL和标准偏差。
图6A-B显示在受到假接种或受到T5v接种并在3或21DPI时受到BICv攻击的猪中的外周白细胞计数(图6A)和血小板计数(图6B)。实心方块代表对照、受到假接种的、和受到攻击的动物的数值。将计数表述为数量/ml，并且表示四个个体的平均值，所述平均值具有显示标准误差的误差柱。
发明详述
开发在CSFV发作的情况下的疾病控制策略需要快速启动保护，这成为比例如保护的持续时间更重要的疫苗表现参数。开发这样的疫苗意味着生产合理设计的活减毒疫苗CSFV毒株。
解释瘟病毒毒力的遗传基础和分子机制尚不清楚。在CSFV的情形中，不同的报告描述了在病毒蛋白质或特异性基因组区域与毒力的联系。消除CSFV毒株Alfort Erns糖蛋白的RNA酶活性的单或双密码子突变在猪中使该病毒减毒(Meyers等，见上)。通过突变BVDV Erns糖蛋白的RNA酶结构域也观察到类似的结果(Meyer等2002.病毒学杂志(J.Virol.)76：8494-8503)。更近地，已经表明，从CSFV强毒力毒株Alfort/187和Eystrup中删除Npro在猪科中导致减毒的病毒(Meyers等，见上)。CSFV E2糖蛋白中的一个氨基酸取代，以及与之联合的Erns中的三个氨基酸取代在猪中导致减弱的毒力(van Gennip等2004.病毒学杂志(J.Virol.)78：8812-8823)。另外，将19个氨基酸符合阅读框地插入到CSFV毒株Brescia的E 1基因中导致体内减毒(Risatti等2005b，见上)。毒力还涉及CSFV E2。用来自疫苗株CS的E2基因替换CSFV毒株Brescia中的E2基因产生嵌合病毒，该嵌合病毒具有显著的体内减毒作用(Risatti等2005a，见上)。与Brescia E2蛋白序列相比，CS疫苗病毒E2蛋白中的22个氨基酸取代的每一个均不影响mAb WH303表位。全部三种病毒，即Brescia、CS和所述嵌合体，与mAb 303剧烈反应，这提示与CSFV减毒有关的另一种遗传决定子的存在。
在此，我们显示了引入到高度致病性CSFV毒株Brescia的E2糖蛋白中的mAb WH 303表位中的突变导致病毒的减毒。将逐渐的变化引入到CSFV Brescia WH 303表位(TAVSPTTLR；SEQ ID NO：1)中，从而模仿在BVDV毒株NADL E2糖蛋白的相同位置处(TSFNMDTLA；SEQ ID NO：2)存在的残基。有趣地，TSFNMDTLR(T4v)或TSFNMDTLA(T5v)缺乏对mAb WH 303的反应性，显示出小斑形态学，并且在体内受到显著地减毒。与由BICv诱导的急性致命疾病不同，T4v和T5v感染是亚-临床的，其特征在于在靶器官中减少的病毒复制和减少的病毒释放。
近期在利用噬菌体-展示的随机肽库表征中和单克隆抗体的过程中，观察到了WH303作为主要的免疫显性表位与CSFV E2和Erns的相关性(Zhang等2006.病毒学档案(Archives of Virology)151(1)：37-54)。发现这些单克隆抗体与共有基序SPTxL结合，该SPTxL也定位在WH 303表位(SPTTL)上。此外，多种肽-疫苗，其包含WH 303表位，由在20-25个氨基酸长度范围内的六个重叠的肽组成，诱导针对CSFV的免疫性(Dong等2005.疫苗(Vaccine)23：3630-3633)。
令人信服地，猪中T5v的减毒作用能够包括病毒黏附的一些方面和/或在体内有效进入关键的靶细胞的一些方面。Erns、E1和E2是CSFV病毒体包膜的结构糖蛋白(Thiel等，见上)。锚定到包膜上的E2，作为由二硫键连接的同源和异源二聚体出现(Thiel等，见上；Weiland等1990，1999，见上)，并且与Erns(Hulst等1997.遗传学和病毒学杂志(J.Gen.Virol.)78：2779-2787)和E1(Wang等，见上)一起显示出对病毒的接受非常重要。含有嵌合E2蛋白的改造瘟病毒改变了宿主的范围。拥有来自边界病病毒(BDV)，即一种绵羊瘟病毒的完整E2基因的嵌合BVDV，丧失其在牛肾细胞(MDBK)中形成斑的能力，但保持其在绵羊细胞中形成斑的能力(Lian等2003.遗传学和病毒学杂志(J.Gen.Virol.)84：1269-1274)。然而，MDBK细胞对嵌合体仍是允许的，尽管感染后24小时的病毒后代产率的差别比野生型BVDV少100倍。同样地，用来自BVDV的同源序列部分替换CSFVC毒株E2的氨基末端导致猪肾细胞(SK6)中病毒后代产量10倍的减少。SK6细胞对嵌合体和BVDV E2供体是相似允许的；然而嵌合体没有获得BVDV感染胎牛上皮细胞的能力(van Gennip等2000，见上)。类似地，与BICv、T1v、T2v和T3v相比，在SK6细胞中，T4v和T5v表现出病毒后代产量10倍的减少(图2A)，且缺乏在牛肾细胞(MDBK)中有效复制的能力(数据未显示)。
与SK6细胞中的亲代BICv相比，T4v和T5v表现出大约70％的斑尺寸的减小(图2B)。在SK6细胞上使用BVDV毒株NADL观察到了类似的小斑表型(数据未显示)，这提示这些病毒具有体外改变的黏附和/或传播的能力。尽管，体外斑尺寸减小和CSFV的体内减毒作用之间的联系尚未确定，但是存在一些提示关联的观察资料。Hulst等(病毒学杂志(J.Virol)74：9553-9561；Hulst等2001，见上)观察到，在培养的猪肾细胞中连续传代后获得的CSFV Brescia肝素硫酸盐结合依赖性变体具有减小的斑尺寸。这些变体，其在Erns蛋白质中含有单氨基酸突变，在猪中是高毒力的(Hulst等2000，2001.见上)。然而，两种不同CSFV毒株Brescia来源的重组病毒，其在E1(Risatti等.2005b，见上)和E2(Risatti等.2005a，见上)中含有突变，在培养的猪肾细胞中表现出减小的斑尺寸表型，并且在猪科中是减毒的。
总之，鉴定了与E2糖蛋白相关的新型CSFV遗传毒力决定子。尽管解释减毒作用的机制保持未知，但是有趣的是，与mAb WH303反应性的逐渐丧失与体内毒力的丧失有关，这导致CSFV最终的减毒作用，表明缺乏表位序列和其他瘟病毒(BVDV和BDV)在猪科中不能诱导疾病之间的联系。改进对CSFV毒力遗传基础的理解应该允许合理地设计具有提高的安全性、功效和效用的活减毒CSF疫苗。另外，在病毒T4v和T5v的特殊情形中，缺乏与mAb WH303的反应性打开了这些病毒突变体作为减毒标记疫苗的潜在应用，其中所述mAb WH303识别高度特异和保守的CSFV表位。
实施例
现在，已经一般性地描述了本发明，本发明将通过参考某些具体的实施例得到更好的理解，将这些实施例包括在本文中仅为了进一步举例说明本发明，而非意欲限制由权利要求所定义的本发明的范围。
实施例1
病毒和细胞培养
在具有10％胎牛血清(FCS)(Atlas生物(Atlas Biologicals)，Fort Collins，CO)的Dulbecco极限必需培养基(DMEM)(Gibco，Grand Island，NY)中培养猪肾细胞(SK6)(29)，其不含BVDV。CSFV Brescia毒株在SK6细胞中繁殖，并用于构建传染性cDNA克隆(17)。在96孔板(Costar，Cambridge，MA)中，利用SK6细胞对来自临床样品的CSFV进行滴定。培养了4天后，利用CSFV单克隆抗体WH303或WH308(1)和Vectastain ABC试剂盒(载体实验室(Vector Laboratories)，Buringames，CA)(25)，通过免疫过氧化物酶测定，检测病毒的传染性。利用Reed和Muench(14)的方法计算滴度，并将其表示为TCID50/ml。进行时，检验的灵敏性＞1.8TCID50/ml。
实施例2
构建CSFV传染性克隆T1-T5
将高毒力Brescia分离物的全长传染性克隆(IC)(pBIC)(17)用作模板，其中突变E2残基829和837之间的WH303表位(TAVSPTTLR；SEQ IDNO：1)的6个残基，从而反映BVDV分离物NADL中存在的同源残基(TSFNMDTLA；SEQ ID NO：2)的那些(Lin等，见上)。逐渐加入突变，产生了用于拯救下列病毒突变体的5种IC：T1v(TSFSPTTLR；SEQ ID NO：3)、T2v(TSFNPTTLR；SEQ ID NO：4)、T3v(TSFNMTTLR；SEQ ID NO：5)、T4v(TSFNMDTLR；SEQ ID NO：6)和T5v(TSFNMDTLA；SEQ ID NO：7)(图1)。通过按照供应商的说明利用快变XL定点突变试剂盒(QuickChange XLSite-Directed Mutagenesis kit)(Stratagene，Cedar Creek，TX)和利用表1中所述的引物和靶质粒进行的定点突变引入突变。
表1.用于构建T1-T5病毒的引物。
 引物*   序列  SEQ ID NO：
  T1F   5’-GGGTGTTATAGAGTGCACGTCATTTAGCCCGACAACTCTGAGAAC-3’   8
  T2F   5’-GGGTGTTATAGAGTGCACGTCATTTAATCCGACAACTCTGAGAAC-3’   9
  T3F   5’-GGGTGTTATAGAGTGCACGTCATTTAATATGACAACTCTGAGAAC-3’   10
  T4F   5’-GAGTGCACGTCATTTAATATGGACACTCTGAGAACAGAAGTGGTA-3’   11
  T5F   5’-TCATTTAATATGGACACTCTGGCAACAGAAGTGGTAAAGACCTTC-3’   12
*仅提供了正向引物序列。反向引物与互补序列相对应。
从CSFV毒株Brescia的全长ICs或突变体T1-T5体外转录传染性RNA，并将其用于转染SK6细胞(图1A)。在转染后第4天从转染的细胞中拯救病毒。拯救的病毒基因组的核苷酸序列与亲代DNA质粒相同，这证实了在编码WH303表位的基因座处的突变仅反映在T1v-T5v中。
实施例3
体外拯救CSFV Brescia和T1-T5v突变病毒
将全长基因组传染性克隆用Srf1线性化，并利用T7 Megascript系统(Ambion，Austin，TX)对其进行体外转录。用LiCl沉淀RNA产物，并通过利用BTX 630电穿孔器(BTX，圣地亚哥，CA)，在500伏特，720欧姆，100瓦特下的电穿孔将其转染到SK6细胞中。将细胞涂布到12孔板和25cm2烧瓶中，并在37EC和5％CO2大气中培养4天。通过利用CSFV E2特异性单克隆抗体(WH308)的免疫过氧化物酶染色，检测病毒。将拯救的病毒储液保存在-70℃。通过对所突变病毒的E2基因测序证实引入突变的精确性。
实施例4
体外和体内分析T1v-T5v
在多步生长曲线中评估了T1v-T5v相对于亲代pBICv的体外生长特征(图2A)。用0.01 TCID50/细胞的感染复数(MOI)感染SK6细胞培养物。吸附病毒1小时(时间0)，并且在感染后到72小时内间或地收集样品。尽管突变体T1v、T2v、和T3表现出几乎不能与pBICv区分的生长特征，而T4和T5v表现出最终病毒产量10倍的减少。相对于BICv、T1v、T2v、和T3v，T4v和T5v还表现出斑尺寸80-90％的减小(图2B)。最后，尽管与Mab WH303的免疫细胞化学反应性对于T1v、T2v、和pBICv是等同的，而该反应性在T3v中部分丧失，且在T4v和T5v感染的细胞中完全消除(图2B)。这些结果说明了影响CSFV体外复制能力的WH303表位突变对WH303反应性具有类似的影响。
为了在猪科中检查逐渐的WH303表位突变对CSFV毒力的影响，在6组用105 TCID50病毒鼻内接种的Yorkshire猪中比较T1v-T5v突变体和BICv野生型病毒的毒力表型，并监测临床疾病。来自该实验的结果显示在表2中和图3-5中。通过在6DPI时对从T1v-T5v-感染的动物扁桃体回收的病毒进行核苷酸序列分析，证实了WH303表位突变的同一性和稳定性(数据未显示)。
表2.用T1-T5v或BICv感染后猪科的存活和发烧反应
Figure G2007800235147D00091
Figure G2007800235147D00101
*4只动物中有2只表现出发烧。
#包括在保护研究中使用的动物。
如所预期地，尽管BICv是高度致病性的，其有效地在猪科中诱导发烧、临床迹象、和死亡，而T1v-T5v突变体显示出具有受到递增减毒作用的毒力表型(表2，图3)。T1v和T2v也是高度致病性的，其在猪科中，以类似于BICv的方式诱导发烧和死亡(表2)；然而，T2v在临床分数中显示出相对于BICv的略微延迟(表3)。T3v诱导致命性疾病，但对于BICv具有相延迟的动力学，如死亡发生在4-8天后(表2)。显著地，T4v和T5v不诱导致命性疾病，其中T4v仅诱导轻微和短暂的发烧，且T5v几乎不诱导临床疾病(表2，图3)。类似地，BICv、T1v、T2v和T3v感染在6DPI时导致白细胞(WBC)计数和血小板计数的剧烈减少，所述白细胞和血小板计数保持低水平直到死亡，而T4v和T5v-感染诱导短暂且小得多的影响。
表3.在用T5v或BICv感染后的临床样品和组织中的病毒滴度1
Figure G2007800235147D00102
Figure G2007800235147D00111
1滴度表示为TCID50/ml
2DPI，感染后的天数
3阴性：≤1.80TCID50/ml
4ND：未确定
病毒血症和病毒释放中也反映了T1v-T5v的减毒作用。尽管T1v和T2v诱导了与由BICv诱导的那些相当的病毒血症滴度，而T3v滴度减少了101-102log10，且T4v和T5v诱导的滴度比在感染后相似时间时的BICv滴度低103-105log10(图5A)。对来自鼻拭样和扁桃体刮样的病毒滴度观察到相似的模式(分别地，图5B和C)，其中T3v、T4v和T5v滴度在后来的DPI时降到可检测水平之下。
为了更详细地研究T5v的发病机理，在2、4、6、8、和14DPI时，对T5v和BICv-感染的动物进行安乐死(一只动物/时间点/组)，并确定扁桃体、下颌淋巴结、脾、血液和肾组织样品和鼻拭样和扁桃体刮样样品的组织样品的病毒滴度(表3)。与BICv相比，T5v在扁桃体中表现出显著较低水平的病毒复制(大约102-104log10)。在来自局部引流下颌淋巴结、脾和肾之间的病毒滴度中，观察到T5v和BICv之间相似的差别(表3)。
这些结果说明CSFV E2的WH303表位中增多量的突变对猪科具有使病毒减毒的相加效应，其中T4v和T5v中出现的突变导致病毒毒力的显著降低。此外，T5v感染的特征在于非常轻微且短暂的临床疾病，扁桃体和靶组织中减少的病毒复制，以及显著减少的病毒释放。
实施例5
DNA测序和分析
通过双脱氧核苷酸链终止法(Sanger等1977.美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)74：5463-5467)，利用CSFV特异性引物对全长传染性克隆、体外拯救的病毒、和从感染的动物中回收的病毒进行完全地测序。利用染料终止剂周期测序试剂盒(Dye Terminator Cycle SequencingKit)(Perkin-Elmer，波士顿，MA)制备测序反应物。在PRISM 3730xI自动化DNA测序仪(PE生物系统(PE Biosystems)，Foster City，CA)上对反应产物进行测序。利用Phrap软件程序(www.phrap.org)组装序列数据，其中利用CAP3进行证实性组装。最后的DNA共有序列在每个碱基位置表现出平均5倍的冗余性。利用BioEdit进行了序列比较。
实施例6
动物感染
最初筛选了猪中每种T1v-T5v突变体相对于高毒力Brescia病毒的毒力表型。在此的所有动物研究中所使用的猪是鼻内接种了105TCID50的每种突变体或野生型病毒的10-12周龄、40磅的猪。为了筛选，将12只猪随机分配到6组中，每组2只，并用T1v-T5v突变体或pBICv之一接种每组中的猪。在整个实验过程中每日观察临床症状(厌食、精神不振、发烧、紫皮变色、步态蹒跚、腹泻和咳嗽)，并如前对修饰所述地给修饰打分。
为了评估感染过程中T5v突变对病毒在不同器官中的释放和分配的影响，将10只猪随机分配到2组中，每组5只动物，并用T5v或pBICv接种。在2、4、6、8和14DPI时，处死各组中的一只猪。在验尸时，获得来自猪的血液、鼻拭样和扁桃体刮样样品。将组织样品(扁桃体、下颌淋巴结、脾和肾)在液氮中速冻，以进行病毒滴定。
为了进行保护研究，将12只猪随机分配到3组中，每组4只动物。用T5v接种组1和2中的猪，假感染组3中的动物。在3DPI(组1)或21DPI(组2)时，用BICv攻击连同组3中的动物一起的动物。如上所述地在实验过程中每日记录临床症状和体温。在攻击后间或地收集血液、血清、鼻拭样和扁桃体刮样，其中从前腔静脉获得的血液在含有EDTA的管(Vacutainer)中，从而进行总体和区分性白细胞计数。利用BeckmanCoulter ACT(Beckman，Coulter，CA)获得总体和区分性白细胞和血小板计数。
实施例7
T5v感染保护猪抗致病性BICv的攻击
评估了T5v诱导针对BICv攻击的保护的能力。在3或21DPI时，用105TCID50致病性BICv攻击接种了T5v的猪。没有接受T5v的假接种对照猪在受到BICv攻击后4天(DPC)时产生厌食、精神不振、和发烧，在7DPC时引起循环白细胞和血小板的明显减少，并且在12DPC时死亡或临近死亡并被安乐死(表4和图6)。
表4.在受到BICv攻击后，猪的存活和感染T5的动物的发烧反应
  攻击DPI1   存活者/总数   直到死亡的平均时间天(SD)   发烧发作的平均时间天(SD)   发烧持续的时间天(SD)   平均最高每日体温(SD)
  3   4/4   -   4(0.8)2   1(0.0)   103.1(0.6)
  21   4/4   -   -   -   102.9(0.3)
  对照3   0/2   12(0.0)   4(0.0)   5(0.7)   105.9(0.7)
1用T5感染后的天数
24只动物中有两只表现出发烧
3对照：假接种动物
显然地，在3DPI时，T5v诱导了针对BICv-诱导的临床疾病的完全保护。所有猪都幸免于感染，并保持为临床正常的，其中仅有两只动物在4DPC时表现出短暂的发烧(表4)，但它们的血液学数值没有显著改变(图6)。类似地，在T5v感染后21天时受到攻击的猪在临床上保持正常(表4)。
还在4、6、8、14和21DPC时，利用mAb WH303特异性检测，检验了BICv攻击病毒的病毒血症和病毒释放(数据未显示)。如所预料地，在假-接种的对照动物中，在5DPC时观察到BICv病毒血症，其病毒滴定保持高水平(在8DPC时是106TCID50/ml)直到死亡，且在4DPC时，从鼻拭样和扁桃体刮样滴定BICv，在8DPC时，达到滴度104-105TCID50/ml。相反，受到攻击后，在来自T5v-接种的猪的所有临床样品(血液、鼻拭样、或扁桃体刮样)中不存在BICv。这些结果显示T5v能够迅速地诱导完全保护，以避免致命性CSFV的攻击，即T5v-免疫的猪表现出没有来自攻击病毒的可检测的病毒血症或释放。
因此，当在T5接种后3或28天时受到高毒力亲代病毒Brescia的攻击时，T5v能够在实验接种动物中诱导完全保护，以避免临床疾病的出现和所述攻击病毒的复制。
将本说明书中提及的全部公开物和专利引入本文作为参考，其程度如同将每篇公开物或专利特别地和分别地指定引入作为参考时的程度。
为了举例说明和描述本发明，阐述了本发明的前述说明和某些代表性实施方案和具体内容。它不意欲是无遗漏的，或将本发明限制为公开的精确形式。在不偏离本发明范围的条件下可以对其进行改进和改变，这对于本领域中熟练的技术人员是显而易见的。
序列表
<110>曼努埃尔·V·博尔卡
吉列尔莫·R·里斯卡蒂
<120>经典猪瘟病毒E2结构糖蛋白内的新型毒力决定子
<130>0088.06
<160>12
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>1
Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg
1               5
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>2
Thr Ser Phe Asn Met Asp Thr Leu Ala
1               5
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>3
Thr Ser Pne Ser Pro Thr Thr Leu Arg
1               5
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>4
Thr Ser Phe Asn Pro Thr Thr Leu Arg
1               5
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>5
Thr Ser Phe Asn Met Thr Thr Leu Arg
1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>6
Thr Ser Phe Asn Met Asp Thr Leu Arg
1               5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>7
Thr Ser Phe Asn Met Asp Thr Leu Ala
1               5
<210>8
<211>45
<212>DNA
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>8
gggtgttata gagtgcacgt catttagccc gacaactctg agaac                     45
<210>9
<211>45
<212>DNA
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>9
gggtgttata gagtgcacgt catttaatcc gacaactctg agaac                     45
<210>10
<211>45
<212>DNA
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>10
gggtgttata gagtgcacgt catttaatat gacaactctg agaac                     45
<210>11
<211>45
<212>DNA
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>11
gagtgcacgt catttaatat ggacactctg agaacagaag tggta                     45
<210>12
<211>45
<212>DNA
<213>未知的
<220>
<223>化学合成的
<400>12
tcatttaata tggacactct ggcaacagaa gtggtaaaga ccttc                     45

Claims (9)

1.包括编码突变的经典猪瘟病毒E2糖蛋白的DNA的重组经典猪瘟病毒，所述经典猪瘟病毒E2糖蛋白已经通过逐渐突变高度致病性毒株Brescia的E2基因的一个区域而被修饰，其中所述区域编码经典猪瘟病毒E2糖蛋白的氨基酸829-837，并且其中所述E2糖蛋白的氨基酸829-837替换为SEQ IDNO:6所示的序列TSFNMDTLR，即导致经典猪瘟病毒减毒的修饰。
2.包括编码突变的经典猪瘟病毒E2糖蛋白的DNA的重组经典猪瘟病毒，所述经典猪瘟病毒E2糖蛋白己经通过逐渐突变高度致病性毒株Brescia的E2基因的一个区域而被修饰，其中所述区域编码经典猪瘟病毒E2糖蛋白的氨基酸829-837，并且其中所述E2糖蛋白的氨基酸829-837替换为SEQ IDNO:7所示的序列TSFNMDTLA，即导致经典猪瘟病毒减毒的修饰。
3.合理设计的活减毒经典猪瘟疫苗，所述疫苗包括权利要求1所述的重组经典猪瘟病毒。
4.合理设计的活减毒经典猪瘟疫苗，所述疫苗包括权利要求2所述的重组经典猪瘟病毒。
5.权利要求1或2所述的重组经典猪瘟病毒在制备用于针对经典猪瘟免疫动物的药物中的应用。
6.保护动物以避免临床经典猪瘟的有效量的权利要求4所述的疫苗在制备用于保护所述动物免患经典猪瘟的药物中的应用。
7.mAb WH303在制备用于区分感染经典猪瘟病毒的动物和用权利要求4所述的合理设计的活减毒经典猪瘟疫苗接种的动物的药物中的应用，其中所述mAbWH303用在分析来自受评估动物的血清的竞争ELISA中，从而确定所述血清是否抑制mAb WH303的结合。
8.mAb WH303在制备用于区分感染经典猪瘟病毒的动物和用权利要求3所述的合理设计的活减毒经典猪瘟疫苗接种的动物的药物中的应用，所述mAbWH303用在分析来自受评估动物的血清的竞争ELISA中，从而确定所述血清是否抑制mAbWH303的结合。
9.生产包括编码修饰的经典猪瘟病毒E2糖蛋白的DNA的减毒重组经典猪瘟病毒的方法，所述方法包括：
（a）逐渐突变高度致病性毒株Brescia的E2基因的区域，其中所述区域编码经典猪瘟病毒E2糖蛋白的氨基酸829-837，并且其中所述经典猪瘟病毒E2糖蛋白的氨基酸829-837替换为SEQ ID NO:6所示的序列TSFNMDTLR或SEQ ID NO:7所示的序列TSFNMDTLA；和
（b）作为所述修饰的结果，获得经典猪瘟病毒的减毒。
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