ES2593965T3 - Vacuna marcadora contra la peste porcina clásica - Google Patents

Abstract

Vacuna marcadora para el tratamiento preventivo de la peste porcina clásica que comprende virus modificados de la peste porcina clásica vivos atenuados, caracterizada porque la secuencia vírica de aminoácidos del epítope TAV de la proteína E2 comprende una secuencia diferente de la de un virus de la peste porcina clásica natural, donde la secuencia vírica de aminoácidos muestra al menos una de la siguientes sustituciones con referencia al virus de la cepa C "Riems": - sustitución del aminoácido 830 por valina, - sustitución del aminoácido 833 por serina, - sustitución del aminoácido 839 por glicina.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna marcadora contra la peste porcina clásica

La invención se refiere a una vacuna marcadora para el tratamiento preventivo de la peste porcina clásica que 5 comprende virus modificados de la peste porcina clásica vivos atenuados. En una realización de la invención, la vacuna marcadora se caracteriza porque la secuencia de nucleótidos vírica, que codifica para el epítope TAV, y/o la secuencia de aminoácidos del epítope TAV comprenden una secuencia diferente de un virus de la peste porcina asociado con la enfermedad, de modo que los sujetos que presentan infección con el virus de la peste porcina asociada con la enfermedad pueden diferenciarse de los sujetos vacunados con la vacuna marcadora de la presente 10 invención mediante procedimientos analíticos serológicos y/o genómicos.

Antecedentes de la invención

La peste porcina clásica (PPC) es una enfermedad animal epizoótica que se produce a nivel mundial y tiene 15 importancia política y relevancia económica (Vandeputte y Chappuis, 1999). La peste porcina clásica, también conocida como cólera porcina o plaga del cerdo, es una de las enfermedades de notificación obligatoria a nivel nacional, a nivel de la CE así como de la Organización Mundial de Salud Animal (OIE) de París tras su aparición en cualquier país miembro. La peste porcina clásica esta causada por un pequeño virus de ARN con envoltura del género Pestivirus perteneciente a la familia Flaviviridae. Los hospedadores naturales del virus de la peste porcina 20 son exclusivamente especies porcinas domésticas y salvajes (p. ej., el jabalí europeo).

La Unión Europea ha realizado muchos esfuerzos por erradicar la PPC a través de medidas rigurosas sin vacunación preventiva, que ha estado prohibida desde 1990. A pesar de la prohibición, la vacunación representa una opción aprobada a nivel legal como vacunación de urgencia en casos en los que aparece la peste porcina. En estos 25 casos la vacunación debería producirse mediante uno de los planes de vacunación de urgencia, que han sido ratificados por la Unión Europea (véase el art. 19 de la Directiva del Consejo Europeo 2001/89/CE). Hasta ahora, Rumanía ha sido el único país en el se ha llevado a cabo una vacunación de urgencia. Los motivos de esta aplicación limitada recaen en las limitaciones técnicas de las vacunas marcadoras disponibles en este momento, así como en las restricciones de la eficacia de la vacuna, además de barreras comerciales relacionadas con animales 30 vacunados de forma convencional (limitaciones para la comercialización nacional). La eficacia de las vacunas marcadoras aprobadas no puede compararse con las vacunas vivas modificadas que muestran ventajas significativas y dichas vacunas inactivadas o vacunas subunidades no están adaptadas en modo alguno para la vacunación de urgencia debido a una aparición de la inmunidad tardía y a la necesidad de revacunaciones.

35

Considerando la expansión de la Unión Europea a países de Europa del Este y la globalización cada vez mayor, se han descrito nuevas estrategias para una posible vacunación de urgencia, que serán útiles para evitar el sacrificio a gran escala de animales y las pérdidas económicas asociadas (Leifer y col., 2009). Por tanto, existe una demanda significativa de una vacuna altamente eficaz que permita la diferenciación serológica entre animales vacunados y no vacunados y, adicionalmente, muestre todas las ventanas de las vacunas vivas modificadas tradicionales. 40

Debido a que la primera generación de vacunas marcadoras, que se basaba en la glucoproteína E2 del virus de la PPC, tenía solo una disponibilidad restringida y desventajas graves como las condiciones de almacenamiento, costes y eficacia, existe una enorme demanda de nuevas vacunas marcadoras. Se han investigado varios candidatos a este tipo de vacunas, como vacunas de ADN, péptidos inmunogénicos, vacunas vector, mutaciones por 45 deleción y virus de la peste quiméricos (Beer y col., 2007; Dong y Chen, 2007). La mayoría de estos candidatos a vacunas marcadoras muestran la desventaja de que están producidos por métodos modernos de modificación genética. Debido al significativo temor del consumidor a los productos genéticamente modificados, además de los complicados procedimientos de admisión, las vacunas genéticamente modificadas muestran desventajas significativas. 50

Las vacunas tradicionales dirigidas frente al VPPC incluyen vacunas vivas modificadas. Estas vacunas son muy eficaces tras una única aplicación aunque no permiten la diferenciación entre animales vacunados e infectados en función de su perfil serológico. Muchas de estas vacunas se basan en la cepa vírica clásica "C" o un derivado de la misma (denominadas "vacunas de la cepa C"). Adicionalmente, existen vacunas que se basan en la cepa vírica 55 japonesa "exultación de cobaya negativa (GPE-)", la cepa "Thiverval" y la cepa "PAV mejicana”), todas las cuales han sido utilizadas tanto en ámbitos regionales como internacionales (Blome y col, 2006; Greiser-Wilke y Moennig, 2004; van Oirschot, 2003). Existen numerosos datos sobre el uso de las vacunas basadas en la cepa C. Es sabido que cuatro días después de la aplicación de la vacuna, puede comprobarse que existe una protección completa de los animales frente a una infección de provocación del VPPC virulento. Adicionalmente, siete días después de la 60

vacunación, se proporciona una protección completa frente a la transmisión vertical del virus de prueba en los animales portadores (de Smit y col., 2001).

La desventaja significativa de las vacunas vivas modificadas conocidas es la absoluta incapacidad para discriminar a nivel serológico entre los animales vacunados e infectados. A la vista de esto, una tarea de la presente invención es 5 proporcionar una vacuna viva modificada que permita la discriminación entre animales vacunados e infectados.

En el área de las vacunas marcadoras, las denominadas vacunas de subunidades son conocidas en la técnica previa porque se basan en la glucoproteína E2 recombinante del VPPC. La prueba de discriminación para dichas vacunas es el ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), en el que se usan anticuerpos dirigidos frente a 10 la glucoproteína Ems para detectar indirectamente infecciones por el virus de la PPC. En el momento actual, solo hay disponible en el mercado una vacuna de subunidades de E2; no obstante, se ha suspendido su autorización durante algunos meses (véase el informa de la EMA sobre las vacunas de subunidades de E2).

Independientemente de la imposibilidad de comercializar dichos productos, estos sistemas muestran graves 15 desventajas biológicas. Una de estas desventajas es que son necesarias al menos dos inmunizaciones por vía parenteral antes de transmitir una protección completa, lo que hace que estas vacunas sean completamente incompatibles con las "vacunaciones administradas en cebo”, donde se alimenta a los animales con una única dosis de cebo con la vacuna. Además, las campañas de vacunación de urgencia solo son razonables cuando no se consigue protección frente al VPPC natural en diversos experimentos usando las vacunas de subunidades de E2, no 20 se consigue protección completa para la transmisión vertical. Una desventaja adicional de estos sistemas es que se utilizan anticuerpos dirigidos frente a la glucoproteína Ems para una diferenciación serológica y la sensibilidad y especificidad de dichos sistemas de ensayo eran solo moderadas en todas las ocasiones (Floegel-Niesmann, 2003).

Las vacunas de PPC vivas atenuadas son conocidas en la técnica aunque hasta la fecha se han visto dificultadas 25 debido a diversas desventajas. La mayoría de las vacunas descritas en la técnica previa comprende ADN extraño y se generan usando procedimientos de ingeniería genética, conocida por otro lado como tecnología de ADN recombinante, que se asocian por tanto con problemas graves de evaluación del riesgo ambiental con el producto. Se conocen otras variantes de VPPC donde se han sustituido o eliminados aminoácidos del epítope TAV natural (documento WO 2010/074575 A2). No obstante, los restos de aminoácidos y/o nucleótidos que se modifican en la 30 presente invención no se han descrito o sugerido en la técnica previa.

Se han utilizado pases de cultivo múltiples para generar variantes de virus, que pueden usarse como vacunas, aunque previamente no se ha aplicado la presión de anticuerpos. Los pases múltiples de cultivos infectados por virus para generar variantes como se describe en la técnica previa están, por tanto, limitados por el hecho de tener que 35 realizar un gran número de pases de cultivo y también por una falta de control sobre qué epítope se va a modificar (Hulst y col.).

Kortekaas y col. describen una vacuna para PPC viva atenuada, genéticamente estable, que permite la diferenciación serológica entre animales infectados y vacunados. Se modificó genéticamente una cepa C mutada 40 usando una estrategia dirigida, en la que se utilizó tecnología de ADN recombinante para introducir deleciones en la proteína E2 del VPPC. Posteriormente se adquirieron mutaciones adicionales en diversas localizaciones dentro del genoma vírico mediante múltiples pases para crear cepas que mostraban una proliferación potenciada. Las cepas descritas en Kortekaas y col. son virus modificados mediante ingeniería genética, lo que supone una desventaja significativa a la vista de los complicados procesos de admisión para la liberación de productos genéticamente 45 modificados al entorno.

Holinka y col. describen la cepa del VPPC atenuado vivo con marcador antigénico doble "FlagT 4vn" que se obtuvo combinando dos determinantes genéticos de atenuación. FlagT4v es portador de un marcador antigénico positivo, el epítope Flag sintético, introducido mediante una inserción 19mer en la glucoproteína E1; y de un marcador negativo 50 resultado de las mutaciones del sitio de unión del epítope del anticuerpo monoclonal WH303 (AcmWH303) en la glucoproteína E2. La administración intranasal o intramuscular de FlagT4v protegía a los cerdos frente a la cepa Brescia de VPPC virulenta en tiempo postinoculación temprano (2 o 3 días) y tardío (28 días). FlagT4v inducía una respuesta anticorpal en cerdos que reaccionaba fuertemente contra el epítope Flag pero no conseguía inhibir la unión del AcmWH303 a un péptido sintético que representaba el epítope WH303. La vacuna descrita por Holinka se 55 refiere a un virus modificado genéticamente que muestra ADN extraño en su genoma (secuencia Flag-Tag además de la secuencia y marcadores del vector asociados). Esto representa una desventaja significativa en comparación con la presente invención, en la que no se muestra ADN extraño ni recombinante.

En el documento WO 2007/143442 A2 se describen los efectos de las mutaciones dentro del epítope WH303 de E2 del VPPC, que cambia la secuencia de aminoácidos del VPPC virulento Brescia progresivamente hacia la secuencia de aminoácidos homóloga de la cepa NADL de BVDV. Los animales infectados con virus mutantes estaban protegidos cuando se les inyectaba el virus virulento Brescia los días 3 y 21 después de la vacunación. La modificación en este sitio dentro del péptido WH303 también permite el desarrollo de una prueba diagnóstica para 5 diferenciar a los animales vacunados de los infectados. A pesar de estos efectos, las mutaciones se introdujeron usando tecnología de ingeniería genética, introduciendo por tanto material genético extraño en la vacuna vírica.

En el estado del arte mencionado anteriormente se describen vacunas que se han modificado genéticamente mediante tecnología genética recombinante para producir cepas víricas. Como se describió anteriormente, las 10 vacunas modificadas genéticamente son objeto de problemas de seguridad ambiental y, por tanto, se impide su desarrollo mediante protocolos de admisión complicados y al temor entre la población general, lo que proporciona, por tanto, una desventaja significativa para su uso.

Resumen de la invención 15

A la luz de la técnica previa el problema técnico que subyace a la presente invención es proporcionar una vacuna marcadora para cerdos domésticos y salvajes que proporciona protección frente al virus de la peste porcina clásica, lo que permite la diferenciación entre animales vacunados e infectados, producida preferiblemente mediante tecnologías convencionales. En una realización preferida la vacuna marcadora no se produce mediante tecnología 20 de modificación genética recombinante.

Este problema se resuelve mediante las características de las reivindicaciones independientes. En las reivindicaciones dependientes se proporcionan realizaciones preferidas de la presente invención.

25

Por tanto, la invención se refiere a una vacuna marcadora para el tratamiento preventivo de la peste porcina clásica que comprende virus modificados de la peste porcina clásica vivos atenuados.

En una realización preferida, la invención además se refiere a una vacuna marcadora para el tratamiento profiláctico de la peste porcina clásica que comprende virus modificados de la peste porcina clásica vivos atenuados, 30

caracterizada porque la secuencia vírica de aminoácidos del epítope TAV de la proteína E2 comprende una secuencia diferente de la de un virus de la peste porcina clásica natural, donde la secuencia vírica de aminoácidos muestra al menos una de la siguientes sustituciones:

 sustitución del aminoácido 830 por valina, 35

 sustitución del aminoácido 833 por serina,

 sustitución del aminoácido 839 por glicina.

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque el virus modificado no muestra secuencias de ácido nucleico recombinantes. 40

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque la secuencia vírica de nucleótidos muestra una o más de las siguientes sustituciones:

 sustitución en el nucleótido de la posición 2862 por T, 45

 sustitución en el nucleótido de la posición 2870 por T,

 sustitución en el nucleótido de la posición 2889 por G.

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque la secuencia vírica de aminoácidos muestra una o más de las siguientes sustituciones: 50

 sustitución del aminoácido 426; en la proteína ERNS; por valina,

 sustitución del aminoácido 576; en la proteína E1; por histidina,

 sustitución del aminoácido 583; en la proteína E1; por ácido glutámico,

 sustitución del aminoácido 951; en la proteína E2; por isoleucina. 55

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque la secuencia vírica de nucleótidos muestra una o más de las siguientes sustituciones:

 sustitución en el nucleótido de la posición 1649 por G,

 sustitución en el nucleótido de la posición 2099 por C,

 sustitución en el nucleótido de la posición 2122 por G,

 sustitución en el nucleótido de la posición 3225 por T.

5

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque la secuencia vírica de aminoácidos del epítope TAV comprende la secuencia de acuerdo con la SEC ID N. º 3 o la SEC ID N. º 4.

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque la secuencia vírica de nucleótidos comprende la secuencia de acuerdo con la SEC ID N. º 1. 10

En otra realización la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque los sujetos tratados con la vacuna como se describe en este documento pueden diferenciarse de los sujetos infectados con el virus de la peste porcina asociado con la enfermedad a través del análisis de muestras biológicas obtenidas a partir de dichos sujetos usando procedimientos analíticos serológicos y/o genómicos. 15

En otra realización la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque el procedimiento analítico genómico se basa en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferiblemente PCR en tiempo real, en el que se utilizan cebadores y/o sondas que reconocen tanto la secuencia vírica de nucleótidos modificada y/o asociada con la enfermedad. 20

En otra realización la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque el procedimiento analítico serológico se basa en un inmunoensayo enzimático (EIA), preferiblemente un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), en el que se utilizan anticuerpos que se unen específicamente al epítope TAV bien modificado y/o asociado con la enfermedad. 25

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una vacuna marcadora, preferiblemente como se describe en este documento, que se obtienen mediante la generación de variantes de escape víricas de cepas víricas de la peste porcina asociadas con la enfermedad u otras conocidas mediante la aplicación de presión de anticuerpos.

30

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento de fabricación de una cepa de vacuna del virus modificado de la fiebre porcina clásica vivo atenuado, preferiblemente como se describe en este documento, que comprende la generación de variantes de escape de las cepas víricas de la peste porcina asociadas con la enfermedad y otras conocidas mediante la aplicación de presión de anticuerpos.

35

En una realización preferida el procedimiento de fabricación como se describe en este documento se caracteriza porque el procedimiento comprende:

 múltiples pases de células, preferiblemente células renales embrionarias de cerdo, infectadas con el virus de la peste porcina asociado con la enfermedad en cultivos celulares y 40

 aplicación simultánea de anticuerpos dirigidos frente al epítope TAV de la proteína E2 del virus de la peste porcina asociada con la enfermedad y/o suero policlonal de conejos inmunizados con el péptido CTAVSPTTLRTEVVK.

La invención además se refiere a una composición farmacéutica que comprende la vacuna marcadora como se 45 describe en este documento junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una vacuna marcadora como se describe en este documento para su uso como medicamento en el tratamiento preventivo) (vacunación, preferiblemente mediante inyección intramuscular o aplicación oral, de la peste porcina clásica. 50

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento preventivo (vacunación) de la peste porcina clásica que comprende la administración de la vacuna marcadora como se describe en este documento a un sujeto, preferiblemente un cerdo, preferiblemente mediante inyección intramuscular o aplicación oral. 55

Otra situación frecuente en la que la peste porcina clásica requiere vacunación es en respuesta a la detección de la infección vírica de campo en poblaciones porcinas. Cuando se produce una infección de los cerdos, de modo que aparece el virus de la peste porcina clásica en cerdos salvajes o domésticos, es necesaria una vacunación de urgencia de las poblaciones de cerdos circundantes y/o vecinas. Posteriormente, se llevan a cabo vacunaciones 60

durante un período de 1 a 2 años de todos los cerdos de la región circundante, tanto salvajes como domésticos, para evitar una epidemia o infección a gran escala por el virus de la peste porcina. La vacuna marcadora de la presente invención se adapta de forma ideal a una vacunación de urgencia en el caso de detección o epidemia de peste porcina. La vacuna marcadora facilita una administración rápida y eficaz a través de las vías orales, además de mediante inyección, y permite la discriminación entre animales infectados con el virus de campo (asociado con la 5 peste) y la vacuna.

Descripción detallada de la invención

El desarrollo de la vacuna según se describe en la presente invención no se basa en procedimientos de modificación 10 genético sino más bien en el principio de que un virus se modificará a sí mismo de forma adaptativa cuando se someta a presión selectiva con anticuerpos. Por tanto, la presente invención se refiere a una vacuna viva no genéticamente modificada que proporciona protección frente al VPCC, que muestra todos los requisitos de una vacuna marcadora (serológica y genéticamente diferenciada). La vacuna marcadora se diseñó aplicando la presión selectiva con anticuerpos a diferentes cepas C en cultivo celular. Las variantes generadas poseen preferiblemente 15 tres cambios de aminoácido en el epítope TAV de E2 y dos cambios compensatorios en la proteína E1. Se comprobó la estabilidad de estas variantes realizando más de diez pases de cultivo celular en rotatubos y, por ejemplo, vacunación intramuscular de cerdos que induce a una protección completa frente a una cepa de provocación altamente virulenta. Adicionalmente, el DIVA directo puede realizarse mediante técnicas serológicas y/o genéticas, por ejemplo mediante tinción de inmunofluorescencia diferenciada y sistemas de reacción en cadena de 20 la polimerasa mediante transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR). También, podría obtener un DIVA indirecto optimizando ELISA para E2 comerciales (p. ej., cambiando los valores de exclusión) o desarrollando sistemas ELISA específicos de péptido de TAV. Por tanto, se presenta una vacuna marcadora viva no genéticamente modificada frente al VPPC.

25

La producción de la vacuna como se describe en la presente invención se lleva a cabo como sigue:

Las variantes de escape de la cepa C natural "Riems" se seleccionan en un sistema de cultivo celular (células de riñón de embrión de cerdo-IFN) mediante pases de cultivo del virus de la cepa C durante la aplicación de anticuerpos específicos para E2-TAV y suero policlonal de conejo inmunizado con el péptido CTAVSPTTLRTEVVK. 30

Los anticuerpos aplicados, además de los anticuerpos contenidos en el suero policlonal de conejo tratado con el péptido, reconocen el epítope TAV en la proteína E2 del virus de la PPC específicamente, y mediante la unión a este epítope se neutraliza el virus de la PPC (cepa C). El VPPC muestra una alta tasa de mutación debido a su ARN natural. Bajo la presión de selección de los anticuerpos neutralizantes proporcionados, se seleccionan los virus, que 35 sufren mutación en el epítope al que se unen los anticuerpos (en este caso, el epítope de TAV), en el que se neutralizan los virus naturales sin variaciones. Mediante múltiples pases con diversas concentraciones y mezclas de anticuerpos y suero de conejo, pueden seleccionarse varias cepas aisladas del virus mutadas.

Se seleccionaron en primer lugar los virus con una sustitución en el epítope de TAV. Mediante pases adicionales de 40 estos virus bajo distintos tipos de presión de anticuerpos se seleccionó una cepa aislada, que muestra dos sustituciones en el epítope TAV y una única sustitución compensatoria en la proteína E1 (la interacción entre E1 y E2 es importante para la estructura del virus). Estos virus se sometieron a una presión de anticuerpos adicional, que llevó al aislamiento de virus con tres sustituciones en el epítope TAV además de dos sustituciones compensatorias en la proteína E1. Los virus resultantes (cepa C "Riems" Q7, cepa C "Riems" S10 y cepa C "Riems" O11) mostraban 45 sustituciones en la proteína E2 en las posiciones 2862, 2870 y 2889, 3225, además de los cambios en la proteína E1 en las posiciones 2099 y 2122, además de una sustitución en la proteína ERNS en la posición 1649.

Tabla 1: Información adicional sobre las variantes de escape de TAV

Posición en el genoma

Sustitución de nucleótidos (de la cepa C a la variante de escape) Aminoácido Proteína Sustitución de aminoácido (cambio de aminoácido resultado de la cepa C a la variante de escape)

1649

A a G 426 ERNS Isoleucina a valina

2099

T a C 576 E1 Tirosina a histidina

2122

T a G 583 E1 Ácido aspártico a ácido glutámico

2862

C a T 830 E2 (epítope TAV) Alanina a valina

2870

C a T 833 E2 Prolina a serina

(epítope TAV)

2889

A a G 839 E2 (epítope TAV) Ácido glutámico a glicina

3225

C a T 951 E2 Treonina a isoleucina

Los cambios en la secuencia de nucleótidos permiten aplicar un sistema de RT-PCR en tiempo real, que puede diferenciar entre las variantes (Q7, S10, O11) y las cepas aisladas de campo.

Los cambios en la secuencia de aminoácidos permite la diferenciación entre las variantes (Q7, S10, O11) y las 5 cepas aisladas de campo en función de la unión al anticuerpo, en el que los anticuerpos utilizados para la neutralización (anticuerpos A18) se dejan de unir a las variantes, aunque se unen a todas las cepas aisladas de campo debido al epítope TAV altamente conservado en el VPPC. Los anticuerpos generados frente a la secuencia peptídica de TAV modificada (que muestra las mutaciones de la presente invención) también pueden utilizarse para la diferenciación entre el virus infeccioso y la vacuna, en el que los anticuerpos dirigidos frente a las variantes se 10 unirán a la vacuna vírica modificada de la presente invención y proporcionarán la identificación positiva de los animales vacunados, aunque no se unirán a las cepas aisladas de campo.

Tabla 2: Secuencias de la presente invención:

SEC ID Nº

Cepa ADN/proteína Secuencia 5'-3'

SEC ID N.º 1

Q7/S10/O11 ADN

SEC ID N.º 2

Cepa C ADN

SEC ID N.º 3

B5/2 proteína TAVSSTTLRTGWK

SEC ID N.º 4

Q7/S10/O11 proteína TVVSSTTLRTGVVK

SEC ID N.º 5

Cepa C proteína TAVSPTTLRTEWK

La presente invención se refiere a un virus de la peste porcina modificado que pueden comprender cualquiera o todas las posibles combinaciones de mutaciones y sustituciones descritas en este documento. Los ejemplos y soporte experimental proporcionado en este documento demuestran que se generaron cepas víricas que muestran solo un subgrupo de todas las sustituciones enumeradas en la tabla 1. Estas cepas víricas muestran un efecto 20 protector además de ser posible que se utilicen como marcadores, cumpliéndose por completo el objetivo de la presente invención. Las cepas preferidas de la presente invención hacen referencia a cepas que comprende subgrupos de las sustituciones descritas, además de aquellas cepas que muestran todas las sustituciones descritas.

Fue totalmente sorprendente que las combinaciones de una o más de las modificaciones genéticas específicas 25 (derivadas mediante procesos naturales como resultado de la presión de anticuerpos) pudieran llevar a las propiedades beneficiosas de la vacuna marcadora como se describe en este documento. En la técnica previa se muestran algunas modificaciones similares, aunque no se conoce en la técnica nada que pudiera sugerir que los restos en particular modificados de la presente invención podrían proporcionar una protección especialmente eficaz frente a una infección por VPPC. Sus combinaciones exclusivas llevan al grupo de propiedades descritas que 30 permiten que la invención actúe como una vacuna capaz de diferenciar entre animales infectados y vacunados.

Se desconocía que dicha presión selectiva como se aplica en la presente solicitud mediante el tratamiento con anticuerpos podría llevar a la modificación precisa descrita en este documento. Las combinaciones de las modificaciones genéticas como se describe en este documento funcionan juntas, proporcionando el efecto sinérgico 35 de mutaciones compensatorias que mantienen la estructura de la proteína, al tiempo que se permite que los restos de TAV muten y proporcionen, de este modo, las características de marcador necesarias para el cometido de la presente invención.

El término ingeniería genética se refiere a la modificación o manipulación genética del genoma de un organismo, por 40 ejemplo, introduciendo material de ácido nucleico extraño, como ADN o ARN, o secuencias de ácido nucleico sintéticas en el genoma del huésped. Esta tecnología también se conoce como tecnología de ADN recombinante.

El término virus atenuado se refiere a un virus que ha sido modificado, en todo tipo de formas, de modo que el virus es menos peligroso y/o menos virulento en comparación con el virus natural (asociado con la enfermedad). Por ejemplo, aparecen menos síntomas asociados con la enfermedad en los sujetos infectados con el virus atenuado en comparación con el virus natural.

5

El término presión de anticuerpos o presión selectiva de anticuerpos en términos de la presente invención se refiere a la aplicación de anticuerpos durante el cultivo celular, preferiblemente durante múltiples pases, que van dirigidos frente a uno o más epítopes específicos del virus. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier tipo de anticuerpo conocido en la técnica, mono o policlonales, o pueden estar contenidos en el suero de animales tratados con un péptido de interés, por ejemplo, el epítope diana. Dichos anticuerpos a menudo se denominan anticuerpos 10 neutralizantes. Bajo la presión de selección proporcionando los anticuerpos neutralizantes, los virus que sufren mutación en el epítope al que se unen los anticuerpos (en este caso, el epítope TAV) se seleccionan debido a su ventaja de crecimiento, ya que los anticuerpos dejan de unirse a dicho epítope y, por tanto, ya no proporcionan un efecto limitante o neutralizante, por lo que los virus naturales sin cambios que son neutralizados por los anticuerpos están posteriormente en desventaja selectiva en el cultivo. 15

Dichos virus, que sufren una mutación en el epítope al que se unen los anticuerpos (en este caso, el epítope TAV), se denominan normalmente como variantes de escape. Estas variantes son objeto de la presente invención y se diferencian genética y serológicamente del virus natural.

El término múltiples pases de cultivo se refiere a la práctica de pases del cultivo celular (también conocido como 20 subcultivo o división de las células) durante un número de veces, por la que se transfiere un pequeño número de células a un nuevo recipiente, preferiblemente con medio recién preparado, o mediante dilución de los cultivos celulares en medio nuevo, durante varias veces de modo que se permite que los cultivos celulares continúen creciendo sin los efectos asociados de la alta densidad celular en los cultivos.

25

A la luz de la vacuna marcadora, la invención también puede referirse a un grupo unificado de invenciones que se combinan bajo un único concepto de invención. La vacuna marcadora, el propio virus y las composiciones farmacéuticas de las mismas, su uso para tratar a los animales mediante la vacunación y los procedimientos para la producción del virus están todos dentro de un concepto de invención general. La nueva e ingeniosa vacuna marcadora descrita en este documento posibilita tanto como unifica todos los aspectos de la presente invención, de 30 modo que las diversas realizaciones descritas en este documento están dentro de una única invención unificada.

Donde se proporcionan las secuencias de nucleótidos de la presente solicitud, los listados de secuencias pretenden abarcar las correspondientes secuencias tanto de ARN como de ADN. Aunque algunas secuencias de nucleótidos se proporcionan como secuencias de ADN, se pretende que la presente invención abarque las correspondientes 35 secuencias de ARN (por ejemplo, cuando el genoma del virus presente una molécula de ARN). Las secuencias de nucleótidos de la presente invención también abarcan a las secuencias complementarias de aquellas enumeradas, por ejemplo, la secuencia complementaria que podría unirse a la secuencia enumerada mediante la unión por apareamiento de bases de Watson y Crick. Las correspondientes secuencias complementarias de ARN y/o ADN no requieren un esfuerzo inventivo para su conversión de una en la otra y están fácilmente al alcance de un experto en 40 la materia.

El procedimiento de administración de la vacuna vírica de la presente invención, las composiciones de la invención como composiciones farmacéuticas, inmunológicas, antigénicas o de vacuna o las composiciones terapéuticas, pueden ser una administradas mediante rutas parenterales, como procedimientos de aplicación intradérmicos, 45 intramusculares o subcutáneos. Dicha administración permite una respuesta inmunitaria sistémica, o respuestas inmunitarias humorales o mediadas por células. La vacuna como se describe en la presente invención también puede administrarse mediante rutas orales, como incorporándola al pienso del animal, lo que permite una inmunización fácil y eficaz de grandes poblaciones, por ejemplo, el jabalí europeo.

50

Los procedimientos de aplicación preferidos se refieren bien a la aplicación subcutánea o aplicación intramuscular, preferiblemente mediante inyección, y aplicación oral.

Más en general, las composiciones de vacuna o composiciones terapéuticas de la vacuna vírica de la invención pueden prepararse mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la materia farmacéutica o 55 veterinaria.

Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de dichas composiciones en dosis y mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la materia médica o veterinaria teniendo en cuenta factores como edad, sexo, peso, especie y estado del sujeto en particular, así como la vía de administración. Las composiciones pueden 60

administrarse solas, o pueden coadministrarse o administrarse secuencialmente con composiciones, por ejemplo, con "otras" composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna, o terapéuticas, proporcionando de este modo composiciones multivalentes, cócteles o combinaciones de la invención y procedimientos en los que se utilizan. De nuevo, los compuestos y manera (secuencial o coadministración) de administración, así como la dosis, pueden determinarse teniendo en cuenta factores como edad, sexo, peso, especie y estado del sujeto en particular, así 5 como la vía de administración.

Entre los ejemplos de composiciones de la invención se incluyen preparaciones líquidas para orificios, por ejemplo, oral, nasal, anal, vaginal, perioral, intragástrica, etc., administración con suspensiones, jarabes o elixires; y preparaciones para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (p. ej., 10 administración inyectable) como suspensiones o emulsiones estériles.

En dichas composiciones las variantes del VPPC pueden estar mezcladas con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las composiciones también pueden estar liofilizadas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares como agentes 15 humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, adyuvantes, gelificantes o aditivos que potencian la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colores y similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada.

Breve descripción de las figuras 20

Figura 1: Comparaciones de secuencias

Figura 2: Análisis de inmunofluorescencia indirecta

25

Figura 3: PNV con la cepa Rösrath del VPPC

Figura 4: E2-ELISA de Idexx con suero de cerdo del animal del estudio 06/10

Descripción detallada de las figuras 30

Figura 1: Comparaciones de secuencias. A) Comparación de las secuencias de nucleótidos de la región del epítope TAV entre las variantes Q7, S10, O11 y la cepa aislada de campo de la cepa C. B) Comparación de las secuencias de aminoácidos de la región del epítope TAV entre las variantes Q7, S10, O11 y la cepa aislada de campo de la cepa C. 35

Figura 2: Análisis de inmunofluorescencia indirecta. A) Análisis de los mutantes de escape de E2, pase 2 B5/2 (virus precursor de Q7, S10 y O11, que muestra solo 2 sustituciones en el epítope TAV). B) Análisis de la cepa C del virus.

Figura 3: Tres semanas después de las inmunizaciones todos los animales, a excepción de un animal del grupo S10 40 y otro del grupo O11, presentaban anticuerpos neutralizantes. Siete días después de la infección los animales inmunizados presentaban un valor en la PNV de 640 o mayor. El valor más bajo era 320, observado en un animal del grupo inmunizado con mutante de TAV. Los animales control no inmunizados no mostraban valor en la PNV frente a la cepa Rösrath.

45

Figura 4: Los animales inmunizados con la cepa C mostraban resultados positivos en el E2-ELISA 21 días después de la inmunización. Siete días después de la infección todos los animales inmunizados mostraban resultados claramente positivos en el ELISA. El grupo control no inmunizado no presentaba anticuerpos detectables tras la infección.

50 EJEMPLOS Diseño y procedimientos experimentales Inmunización de conejos utilizando el péptido TAV 55

Se inmunizó a dos conejos de 8 a 10 semanas de edad (etiqueta de la oreja 304 y 305) conforme al siguiente esquema, usando el péptido CTAVSPTTLRTEWK conjugado con hemocianina de lapa californiana (KLH, por sus siglas en inglés) para obtener un suero policlonal neutralizante de la cepa C. La inmunización se realizó mediante 6 refuerzos, cada uno a intervalos de aproximadamente 1 mes. 60

Aislamiento de variantes de escape de E2 del virus de la cepa C "Riems"

Para crear la presión de anticuerpos con la que se generan las mutaciones del virus de la cepa C "Riems" en la glucoproteína E2, el virus se trató con varios anticuerpos dirigidos frente al epítope TAV de la proteína E2, usando 5 varias concentraciones. Las células infectadas se incubaron posteriormente y se realizaron varios pases de cultivo. Los anticuerpos que se aplicaron en los presentes experimentos son anticuerpos monoclonales específicos de E2, que están disponibles en el mercado para la prueba de ELISA para el VPPC específico de E2.

Anticuerpos: 10

A18I (IDEXX)

A18B (Bommeli)

A18C (Ceditest)

HC34 (CRL, Hannover) 15

WH303 y WH 211 (Weybridge, Gran Bretaña)

La incubación de los cultivos víricos se llevó a cabo conforme al siguiente protocolo. Se aplicaron varias concentraciones y mezclas de anticuerpos con diversas cantidades de virus. La incubación se realizó durante 2 a 6 horas a temperatura ambiente. La suspensión de virus y anticuerpo se suministró a las placas de cultivo celular con 20 crecimiento celular en confluencia y posteriormente se incubó. Durante este tiempo, el virus fue absorbido dentro de las células (células PK15) durante 1 a 2 horas a 37ºC. Finalmente, se añadió medio de cultivo celular y las placas se incubaron durante 72 horas a 37ºC y atmósfera de COT al 5%.

Después de 72 horas, se separaron de forma individual los sobrenadantes de los cultivos celulares y se 25 conservaron. A continuación las placas se fijaron y tiñeron usando tinción de inmunofluorescencia y un anticuerpo C16 (específico para la proteína NS3 del VPPC). Los pocillos de los cultivos celulares de sobrenadantes débilmente positivos se pasaron a continuación a otro pocillo con una presión de anticuerpos adicional como se describió anteriormente. Los sobrenadantes de los cultivos de pocillos con células únicas positivas o las placas de células con tinción única se pasaron a continuación a pocillos con una presión de anticuerpos muy débil o nula para aumentar el 30 título de virus en 1 o 2 pases. Se seleccionaron varios sobrenadantes de cultivo celular para la secuenciación de las regiones E1 y E2.

El control de los virus variantes de escape se llevó a cabo usando tinción de inmunofluorescencia con un anticuerpo C16 o el anticuerpo A18 utilizado para producir las variantes de escape. Las variantes víricas que muestran un 35 cambio en el epítope TAV dejaban de teñirse con el anticuerpo A18.

Registros de los pases

Tabla 3: Registros de los pases de los virus de escape de la cepa C "Riems"40

Variante O11

Variante Q7 Variante S10

Pase

Sustitución Pase Sustitución Pase Sustitución

SP867/2+ A18(B)/HC34 (0,2mg/ml)

D5+ A18 (B, C)

2870

16P1+ A18(B,I,C) je 0,25mg/ml (50µl)+ 50µl 305

2870 2122

B1A1+0,25mg/ml A18(C,B,I) (100µl) + 100µl 305

B5/2

2870, 2122, 2889, 3225

B5/2-P2 (sin presión)

B5/2-P3 (sin presión)

B5/2-P3+0,1mg

A18(I)+50µl 304

B5/2-P3* +0,1mg A18 (I) +50ml 305

C32+ 50µl A18 (I) + 50µl 305

CB32-P2 (-)

2870, 2122, 2889, 3225, 2862, 2099

CB32-P3 +A18(I,C) cada 50µl, +305(25)

Z2+A18(I,C) 50µl, +304/305 25µl

F8 +304/305 30µl

G18 + 304 30µl

H15 (-)

H15 (-) 2870, 2122, 2889, 3225, 2862,2099 H15 +304 50µl 2870, 2122, 2889, 3225, 2862, 2099

I16 +A18(I,C) 50µl +10µl HC34 +304 25µl

I15 A18(I,C) 30µl +304 30µl +HC34 15µl I14 A18(I,C) 30µl +304 30µl +HC34 15µl

K12 (-)

04 +A18 (I 50µl, B 25µl) +304/305 25µl N2 +A18(C 30µl, I 50µl) +304 50µl +305 25µl +HC34 15µl

L7 (-)

P4 +305 50µl 06 +A18 (I 50µl, B 25µl) +304/305 25µl

N17 (-)

Q7 Q6 +A18 (I 50µl, B 25µl) +304 50µl

O11

2870, 2122, 2889, 3225, 2862, 2099 R9 +A18 I 50µl + 304 50µl

S10

Caracterización de las variantes de escape B5/2, I16, Q7, S10 y O11

Las variantes de escape aisladas se secuenciaron en la región de las proteínas E1 y E2. Se llevaron a cabo varias 5 tinciones por inmunofluorescencia usando los anticuerpos A18-idexx, A18-bommeli, A18-ceditest y el anticuerpo C16. Las variantes de escape se pasaron a ambas botellas de cultivo celular (todos) además de a cultivos en rotatubos (Q7, S10, O11) y, posteriormente, se secuenciaron, tiñeron de forma diferencial y se valoraron.

RT-PCR en tiempo real específica de Q7 10

Para comprobar las características genéticas del virus y analizar, por tanto, una de las propiedades de marcador de la vacuna, se llevó a cabo la detección del ARN vírico tras la inmunización con las variantes de escape usando cebadores y una sonda, que eran capaces de diferenciar las variantes de escape de la cepa C original "Riems" y las cepas aisladas de campo del VPPC. 15

Estudio en animales 27/09: comprobación de la respuesta inmunitaria de los mutantes de la cepa C Riems B5/2-P6 y I16-P2

En los actuales estudios en animales, se inmunizaron tres crías de cerdo con 2 ml de suspensión vírica 20 (sobrenadante de cultivo celular) mediante aplicación intramuscular. El agrupamiento de los animales se realizó del

siguiente modo: grupo A (B5/2), grupo B (I16) y el grupo control de la cepa C Riems (vacuna de la peste porcina Riemser). Se realizó una prueba serológica de la respuesta inmunitaria para cada grupo.

Estudio en animales 06/10: comprobación de las variantes de escape Q7, S10 y O11 5

Los siguientes estudios en animales se llevaron a cabo para comprobar qué variantes de escape eran las más prometedores en los cerdos receptores con respecto a la ausencia de un efecto peligroso y la eficacia tras la aplicación intramuscular.

Se utilizaron en el estudio 21 crías de cerdo de 8 a 9 semanas de edad (aproximadamente 15-20 kg). Cada cría de 10 cerdo se inmunizó con 2 x 105,0 KID50/ml, i.m.

Se probaron 5 grupos:

Grupo 1 (5 cerdos):

mutantes de las variantes Q7-P7 de la cepa C (105,0 KID50/ml)

Grupo 2 (5 cerdos):

mutantes de las variantes S10-P8 de la cepa C (105,0 KID50/ml)

Grupo 3 (5 cerdos):

mutantes de las variantes O11-P8 de la cepa C (105,0 KID50/ml)

Grupo 4 (3 cerdos):

vacuna de la peste porcina Riemser (virus sin modificar)

Grupo 5 (3 cerdos):

grupo de control sin inmunizar

15

Inmunización y muestras de sangre

O dpv

Muestras de sangre (EDTA y suero), inmunización

7 dpv

Muestras de sangre (EDTA)

14 dpv

Muestras de sangre (EDTA y suero)

21 dpv

Muestras de sangre (EDTA y suero)

Se obtuvieron diariamente los datos correspondientes a la temperatura corporal y a los síntomas clínicos.

20

Provocación:

28 dpv

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

Infección de provocación con la cepa del VPPC altamente virulenta Koslov (1x 106,5 KID50)

4 dpi

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

7 dpi

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

10 dpi

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

14 dpi

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

21 dpi

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

28 dpi

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

Estudio en animales 24/10: comprobación de las variantes de escape S10 y O11; protección tras la inmunización oral 25

Para comprobar la eficacia de la aplicación oral, se llevó a cabo el siguiente estudio en animales.

Se utilizaron 15 crías de cerdo como animales del ensayo, que tenía de 8 a 10 semanas de edad (aproximadamente 15-20 kg). 30

Grupo 1 (6 cerdos):

mutantes A de la variante S10 de la cepa C

Grupo 2 (6 cerdos):

mutantes B de la variante O11 de la cepa C

Grupo 3 (3 cerdos):

control infeccioso (sin vacunar)

Inmunización y muestras de sangre

0 dpv

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

14 dpv

Muestras de sangre

28 dpv

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

4 dpi

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

7 dpi

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

10 dpi

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

14 dpi

Muestras de sangre (EDTA y suero), frotis nasal

21 dpi

Muestras de sangre

28 dpi

Muestras de sangre

Se obtuvieron diariamente los datos correspondientes a la temperatura corporal y a los síntomas clínicos.

Resultados experimentales 5 Inmunización de conejos con el péptido TAV

Los sueros de ambos conejos (304 y 305) eran positivos en la prueba de E2-ELISA obtenido en el mercado tras el tercer tratamiento de refuerzo (aproximadamente 12 meses después de la primera inmunización). En la prueba de neutralización del virus ambos sueros probados eran positivos aproximadamente después del tercer refuerzo. Los 10 valores en la prueba de neutralización eran menores y se reducían adicionalmente tras el 4ª a 6ª refuerzo.

Tabla 4: Caracterización del los sueros de conejo 304 y 305 tras la inmunización con el péptido TAV.

Suero

% de inhibición del E2-ELISA IDEXX de NT Alfort Nota

304

6 <5 1. inmunización

305

10 <5

304

28 <5 1. Refuerzo

305

19 <5

304

45 <5 2. Refuerzo

305

26 <5

304

87 5 3. Refuerzo

305

60 <5

304

90 10 4. Refuerzo

305

77 5

304

No realizado 5 2 semanas después del 5. refuerzo

305

No realizado <5

304

No realizado 7,5 1 semanas después del 6. refuerzo

305

No realizado <5

304

No realizado <5 3 semanas después del 6. refuerzo

305

No realizado <5

15 Aislamiento de variantes de escape de E2 del virus de la cepa C Riems

La incubación de la cepa C Riems con anticuerpos específicos de E2 llevan, tras solo unos cuantos pases, al aislamiento de las variantes de escape que exhiben una sustitución en la región E2 en la posición 2870. Era importante para el aislamiento de variantes adicionales que también se produzca un cambio compensatorio en la 20 proteína E1 en la posición 2122, por ejemplo como en la cepa aislada 16P1. Si ambos cambios se producían de forma simultánea, entonces solo eran necesarios pocos pases bajo presión de anticuerpos y el suero para aislar variantes adicionales que mostraban adicionalmente una sustitución en la posición 2889 de la proteína E2. Algunas de estas variantes de escape mostraban adicionalmente un cambio en la posición 3225 en la proteína E2. Un ejemplo de dichas variantes de escape en la cepa aislada B5/2. 25

Representación esquemática del epítope TAV de la variante B5/2:

Cepa C natural: CTAVSPTTLRTEVVK

Mutante B5/2: CTAVSSTTLRTGVVK 30

Pases adicionales de la cepa aislada B5/2 bajo la presión de anticuerpos llevaban al aislamiento de la cepa aislada CB32. Esta cepa aislada mostraba adicionalmente una sustitución adicional en la proteína E2 (nucleótidos 2862), además de una sustitución compensatoria en la proteína E1 en la posición 2899. La cepa aislada CB32 resultaba de una mezcla de las variantes B5/2 y una nueva variante con la sustitución adicional. Para aislar las nuevas variantes que mostraban las sustituciones adicionales, la cepa aislada CB32 se sometía a pases de cultivo múltiples veces 5 bajo presión de anticuerpos. Las cepas aisladas Q7, S10 y O11 se aislaban a partir de pases sucesivos y ligados de H15.

Véase en la figura 1 una comparación de secuencias del epítope TAV de los mutantes S10, O11 y Q7. Véase en la tabla 1 una revisión de las sustituciones de nucleótidos y aminoácidos en las variantes de escape aisladas. 10

Caracterización de la variantes de escape B5/2, I16, Q7, S10 y O11

La comprobación de las variantes de escape con respecto a la unión de diversos anticuerpos específicos de E2 se llevó a cabo usando inmunofluorescencia. 15

Tabla 5: Tinción por inmunofluorescencia indirecta de las variantes de escape de E2 seleccionadas con una sustitución en la proteína E2

Mutantes de E2

C16 CSF-NS3B A18Bommeli CSF-E2

SNT

positivo negativo

16P1

positivo negativo

25P3

positivo negativo

60P3

positivo negativo

12P5

positivo negativo

34P5

positivo positivo

50P5

positivo negativo

51P5

positivo negativo

5P6

positivo negativo

48P6

positivo negativo

59P7

positivo negativo

60P7

positivo negativo

C-Stamm

positivo positivo

Alfort

positivo positivo

20

En la mayoría de los casos, una única sustitución de aminoácidos en el epítope TAV era suficiente para proporcionar una señal negativa cuando se usaba inmunofluorescencia con el anticuerpo A18Bommeli. Las variantes de escape con dos mutaciones TAV (como B5/2) también mostraban resultados negativos con ambos anticuerpos A18Bommeli y A18C (figura 2).

25

Tabla 7: Tinción por inmunofluorescencia de pases particulares de diversos variantes de escape de E2, que muestran tres sustituciones en el epítope TAV.

Mutantes de E2

A18 Idexx 1:400 A18 Bommeli 1:250 A18 Ceditest 1:500 303 1:100 211 1:100 C16 1:90

I16-P3

- - - - - +++

Q7-P8

- - - - - +++

O11-P7

- - - - - +++

S10-P8

- - - 1 colonia - +++

Cepa C

+++ +++ +++ +++ +++ +++

Todas las cepas aisladas probadas mostraban señales negativas para los pases seleccionados de las tinciones de A18. No obstante, en el pase 8o de la cepa aislada S10, podía teñirse una pequeña colonia usando el anticuerpo 30 WH303. Esto apoya una alta estabilidad de las sustituciones en el epítope TAV. Se llevaron a cabo pruebas adicionales de estabilidad para las cepas aisladas Q7, S10 y O11, usando cultivos en rotatubos durante 10 pases más.

35

Tabla 8: Tinción diferencial de pases seleccionados con los anticuerpos A18 (idexx y bommeli, WH303 [VLA]). El anticuerpo específico de NS3 C16 (EURL) se usó como control

Muestra

Q7-P10 Q7-P14 Q7-P16 S10-P10 S10-P14 S10-P16 O11-P10 Cepa C anticuerpo

Idexx

- - - - (+; EZ) (+; EZ) - +++

Idexx

Bommeli

- - - - - - - +++

Bommeli

WH 303

- - - - - - - +++

WH 303

C16

+++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++

C16

O11-P14

- - - +++ - - -

O11-P16

- (+; EZ) (+; EZ) +++ - - - -

Antikörper

Idexx Bommeli WH303 C16

EZ = algunas células individuales

En el pase 10o, no se observaba ninguna variante vírica que mostrara una reversión, por lo que la tinción era solo 5 posible con C16. La variante Q7 era negativa para todas las tinciones hasta el pase 14o, por lo cual en el pase 16o tampoco era posible detectarla con el anticuerpo C16. Estos hallazgos se confirmaron usando RT-PCR además de los protocolos de PCR de secuenciación. Por tanto, es claro que no existen virus en el pase 16o, por lo que también puede excluirse un error de pase de cultivo. No obstante, algunas células podían teñirse en los pases 14o y 16o de la cepa aislada S10 usando el anticuerpo A18 (idexx). Para el mutante O11, se realizaron 16 pases antes de que se 10 tiñeran algunas células individuales usando los anticuerpos A18 (bommeli) y WH303. Estos resultados demuestran la alta estabilidad de las características serológicas de las vacunas víricas como se describe en este documento.

Caracterización de las variantes de escape mediante secuenciación de E1 y E2 15

Tabla 9: Secuenciación de las cepas aisladas de forma temprana que mostraban una sustitución en el epítope TAV de la proteína E2

Mutantes

secuenciación original secuenciación en el pase 10

48P6

Sustitución 2870 Sustitución 2870

2SNTP1

Sustitución 2870 Sustitución 2870

59P7

Sustitución 2870 Sustitución 2870

60P7

Sustitución 2870 Sustitución 2870

5P6b

Sustitución 2870 Sustitución 2870

D9

Sustitución 2870 Sustitución 2870

E51

Sustitución 2870 Sustitución 2870

E52

Sustitución 2870 Sustitución 2870

16P1

Sustitución 2870, sustitución 2122 Sustitución 2870, sustitución 2122

La sustitución en la posición 2870 se mantuvo en todas las cepas aisladas después de 10 pases, lo que significa que 20 eran muy estables. Esto apoya la conclusión de que esta sustitución en particular no tiene un efecto importante sobre la estructura de la proteína, de modo que una reversión a la secuencia natural no proporciona ventajas.

Tabla 10: Secuenciación de aislados con 3 sustituciones en el epítope TAV de E2. 25

Mutante de E2

Valor del virus/ml sustitución ERNS sustitución E1 sustitución E2 Mutaciones estables

I16-P3

105,25 1649 2099 2862 (80%) I16-P24

2122 2870 1649 (1657,1878)

2889 2122, 2870, 2889

3225

Q7-P8

105 1649 2099 2862 Q7-P17

2122 2870 1649, 2099, 2122

2889 2862, 2870, 2889, 3225

3225

O11-P7

105 1649 2099 2862 O11-P14

2122 2870 1649, 2099, 2122

2889 2862, 2870, 2889,3225

3225

S10-P8

105 1649 2099 2862 S10-P15

2122 2870 1649, 2099, 2122

2889 2862, 2870, 2889, 3225

3225

Los cambios de secuencia en las cepas aisladas O11, S10 y Q7 eran estables en todos los pases probados (14-17).

Tabla 11: Secuenciación de las cepas aisladas Q7, S10 y O11 tras varios pases en cultivos en rotatubos

Muestra

Q7-P10 Q7-P14 Q7-P16 S10-P10 S10-P14 S10-P17 O11-P9 O11-P14 O11-P16

Proteína E1

2099 2099 no 2099 2099 2099 n.d. 2099 2099

2122 2122 secuenciada 2122 2122 2122 n.d. 2122 2122

Proteína E2

2862 2862 2862 2862 2862 2862 2862

2870 2870 2870 2870 2870 2870 2870

2889 2889 2889 2889 2889 2889 2889

5

Todos los pases de los virus secuenciados de las tres variantes contenían las sustituciones en las proteínas E1 y E2 que han sido inducidas mediante presión inmunitaria. El pase 16o de Q7 no podía ser secuenciado, probablemente debido a que no quedaban virus en el sobrenadante del cultivo celular (véase anteriormente). En caso de que aparezcan virus revertientes, que en función de las diversas tinciones de la figura 2 no puedan excluirse, estos solo eran detectables mediante secuenciación a partir de un porcentaje determinado. No obstante, la enorme mayoría de 10 los virus no revierten y permanecen con las sustituciones. No podían detectarse virus revertidos individuales únicos mediante secuenciación.

RT-PCR en tiempo real específica de Q7

15

Para diferenciar entre animales vacunados e infectados, se aplicó un sistema de RT-PCR. Debido a que el epítope TAV está altamente conservado en todos los virus de la PPC, las sustituciones en el epítope TAV se utilizaron como base para cebadores y sondas en el ensayo de PCR en tiempo real.

Tabla 13: Se utilizó una RT-PCR en tiempo real para controlar la carga vírica. Se aplicaron los siguientes sistemas 20 de PCR: mezcla 1 PPC (específico del VPPC, reconoce todas las cepas), Q7-TAV (específico para las variantes) y mezcla TAV de cepa C (cepa C natural, también puede detectarse con una sensibilidad mucho más baja). Los resultados se proporcionan como valores Cu (umbral del ciclo).

Sistema de muestra

Q7-P10 Q7-P14 Q7-P16 S10-P10 S10-P14 S10-P17 O11-P9 O11-P14 O11-P16

Mezcla 1 PPC

21,2 20,4 n.d. 20,5 19,2 20,1 20,1 19,5 20,1

Mezcla TAV de cepa C

36,5 35,7 37,8 34,9 31,2 30,2 35,8 33,6 33

rRT-PCR Q7-TAV

22,4 21,9 27,3 21,4 20,9 21 20,9 20,2 21,6

25

La carga vírica se determinó usando RT-PCR en tiempo real. El sistema de mezcla 1 PPC reconocía todas las cepas del VPPC y no diferenciaba entre la cepa C natural y las nuevas variantes de escape. El sistema Q7-TAV reconocía específicamente las tres variantes de escape. El sistema cepa C-TAV solo reconocía la cepa C natural (ninguna de las variantes de escape), con un valor de Cu de aproximadamente 14. 30

La reducción muy pequeña en la diferencia de los valores de Cu entre el sistema RT-PCR Q7-TAV y el sistema cepa C-TAV con el aumento un número de pases proporciona fuertes evidencias de una cantidad muy pequeña de revertientes tras un número elevado de pases. En general, una diferencia entre los dos sistemas de un valor Cu de 14 representa una relación entre mutantes y revertientes de aproximadamente 1:8000, mientras que un valor Cu de 5 10 representa una relación de 1:1000.

Estudio en animales 27/09: examen de la respuesta inmunitaria de los mutantes de la cepa C Riems B5/2-P6 y I16-P2

10

La inmunización intramuscular se llevó a cabo en 3 crías de cerdo, donde cada cría de cerdo recibió 2 ml de suspensión vírica (sobrenadante de cultivo celular). El grupo A se trató con B5/2, el grupo B se trató con 116 y el grupo control se trató con la vacuna de la peste porcina Riemser. Estos estudios proporcionan un análisis de la respuesta inmunitaria tras la inmunización, la comprobación de las propiedades de marcador de la vacunación tras la respuesta inmunitaria modificada (ELISA) y la comprobación de las propiedades del virus en animales vacunados 15 (estabilidad genética y propiedades de replicación).

Una valoración por retroceso de los virus aplicados proporcionó los siguientes resultados:

B5/2-P6:

Valor del virus 104,25 virus/ml

I16-P2:

Valor del virus 104,75 virus/ml

20

Tolerancia de los animales a la vacuna

Los cerdos tratados no mostraban síntomas obvios tras la inmunización (ni fiebre ni síntomas de enfermedad). El número de leucocitos no aumentaba por encima de lo normal durante los primeros 7 días después de la inmunización. 25

No podía aislarse el virus de la sangre. El ARN aislado de las muestras de sangre 4 y 7 días después de la inmunización se utilizó para el análisis mediante RT-PCR. No obstante, el producto de PCR no era adecuado para una posterior secuenciación. Esto demuestra una velocidad de replicación muy baja del virus en los animales.

30 Estudio en animales 06/10: comprobación de las variantes de escape Q7, S10 y O11

La valoración por retroceso mostró las siguientes concentraciones de virus, que se utilizaron en los experimentos:

Q7-P8

104,0 KID50/ml

S10-P8

104,25 KID50/ml

O11-P7

104,25 KID50/ml

Vacuna de la cadena C de peste porcina

102,25 KID50/ml

35

Tras la inmunización, no se encontraron cambios en la temperatura corporal ni en los síntomas de la enfermedad de la peste porcina.

Análisis clínico tras la infección de provocación

40

La fiebre se definió como una temperatura corporal rectal de >40ºC durante al menos dos días sucesivas.

Se probaron 5 grupos:

Grupo 1 (5 cerdos):

mutantes de las variantes Q7-P7 de la cepa C (105,0 KID50/ml)

Grupo 2 (5 cerdos):

mutantes de las variantes S10-P8 de la cepa C (105,0 KID50/ml)

Grupo 3 (5 cerdos):

mutantes de las variantes O11-P8 de la cepa C (105,0 KID50/ml)

Grupo 4 (3 cerdos):

vacuna de la pese porcina de Riemser (virus sin modificar)

Grupo 5 (3 cerdos):

grupo control sin inmunizar

45

En el grupo 1 se observaron medidas de aumento de temperatura esporádicas entre el 3er y el 13o día tras la infección de provocación que, no obstante, no estaban relacionados con ninguna otra alteración visible del bienestar de los animales. Solo el animal n. º 4 mostró fiebre durante 4 días.

En el grupo 2 se mostró un aumento esporádico de la temperatura en 3 animales tratados, donde el animal n. º 9 mostró temperaturas altas significativas.

En el grupo 3 solo el animal n. º 14 mostró un aumento en la temperatura corporal con fiebre el 4o y 5o día tras la infección de provocación. 5

Los animales del grupo 4 no mostraron fiebre, en el que se observó un aumento esporádico de la temperatura en 2 animales tratados.

Todos los animales del grupo 5 mostraron fiebre entre el 2o y el 7o día tras la infección. Debido a los síntomas 10 significativos de peste porcina en todos los animales del grupo 5 se sacrificaron a los 7 días posteriores a la infección. Los síntomas más frecuentes fueron efectos sobre el sistema nervioso central (paresia y ataxia de las patas traseras, diarrea, conjuntivitis y somnolencia). Un animal mostró hematomas en la piel.

No era posible aislar el virus a partir de frotis nasales de los animales inmunizados, por lo que los animales control 15 no vacunados presentaban una prueba positiva 7 días después de la infección.

Resultados de la RT-PCR con muestras de suero

Los resultados de la RT-PCR mostraban que 14 días después de la infección solo podían obtenerse señales muy 20 débiles de los animales inmunizados cuando se comprobaba la presencia del virus virulento asociado con la enfermedad. Sin embargo, los animales control no vacunados mostraban fuertes señales positivas con valores Cu positivos de 30 o menores 3 días después de la infección. Los valores de Cu de los animales no vacunados caían a 17 después de 7 días.

25 Resultados de la RT-PCR a partir de los frotis nasales

Los resultados de la RT-PCR de los animales inmunizados fueron exclusivamente negativos. Sin embargo, los animales control no vacunados mostraban una fuerte señal positiva con valores de Cu positivos de 25 y 28 a los 7 días después de la infección. 30

Prueba de neutralización del virus con VPPC Alfort

La prueba de neutralización de virus se refiere a la determinación de qué animales (vacunados o no vacunados) presentan anticuerpos que son capaces de neutralizan al virus virulento. Todos los grupos inmunizados mostraban 35 anticuerpos neutralizantes 21 días después de la inmunización. Siete días después de la infección el valor de la prueba de neutralización de virus frente a Alfort era de 640 ND50 o superior, en todos los grupos inmunizados. Un animal del grupo inmunizado con O11 y otro del grupo control con la cepa C mostraban un valor de 480. Los animales control no inmunizados no mostraban valor del virus frente a la cepa Alfort en la PNV.

40 Prueba de neutralización del virus (PNV) con VPPC Rösrath

Véase en la figura 3 la PNV con la cepa VPPC Rösrath.

Tres semanas después de la inmunización todos los animales, a excepción de un animal del grupo S10 y otro del 45 grupo O11, presentaban anticuerpos neutralizantes. Siete días después de la infección los animales inmunizados mostraban, en general, un valor en PNV de 640 o mayor. El valor más bajo era 320, observado en un animal del grupo inmunizado con mutante de TAV. Los animales control no inmunizados no mostraban valor en la PNV frente a la cepa Rösrath.

50 E2-ELISA (idexx)

El E2-ELISA es un kit de ELISA disponible en el mercado para comprobar la presencia de la peste porcina clásica. Como promedio, los animales inmunizados con la cepa C mostraban resultados positivos en el E2-ELISA 21 días después de la inmunización. Los animales inmunizados con mutantes de TAV también mostraban resultados 55 positivos después de 7 días en el E2-ELISA de Idexx. El grupo control no inmunizado no presentaba anticuerpos detectables tras la infección.

Véase en la figura 4 el E2-ELISA de idexx con suero de cerdo.

60

En el E2-ELISA, los resultados de los mutantes de TAV antes de la infección eran positivos, aunque no fuertes, mientras que tras la infección los resultados se hacían fuertemente positivos, lo que sugiera un fuerte efecto de refuerzo. Los animales control inmunizados con la cepa C eran fuertemente positivos en el E2-ELISA antes de la infección.

5

Los resultados de los animales inmunizados con los mutantes de TAV son comparables a los de los animales inmunizados con el grupo control con la cepa C. El aislamiento del virus tras la infección era negativo y los resultados de la RT-PCR eran cuestionables o débilmente negativos, lo que también se mostraba en el grupo control con la cepa C. Todos los animales mostraban valores superiores en la prueba de neutralización del virus frente a Alfort además de frente a Rösrath. Todos los animales inmunizados mostraban una protección completa frente a la 10 cepa vírica infecciosa Koslav cuatro semanas después de la inmunización intramuscular.

Estudio en animales 24/10: comprobación de las variantes de escape S10 y O11; protección tras la inmunización oral

15

Para comprobar la eficacia de la aplicación oral se llevó a cabo el siguiente estudio en animales. Se utilizaron 15 crías de cerdo como animales de ensayo, que tenía de 8 a 10 semanas de edad (aproximadamente 15-20 kg).

Dosis de vacuna y diseño experimental:

Grupo 1 (6 cerdos):

mutantes A de la variante S10 de la cepa C (105 KID50/ml)

Grupo 2 (6 cerdos):

mutantes B de la variante O11 de la cepa C (104 KID50/ml)

Grupo 3 (3 cerdos):

control infeccioso (sin vacunar)

20

Grupo 1: Todos los animales de este grupo estaban completamente protegidos antes de la infección de provocación. No se detectaron síntomas asociados con la enfermedad. Todos los animales mostraban anticuerpos neutralizantes, que se detectaban con ambas pruebas de PNV y ELISA.

Grupo 2: Los animales del grupo 2 mostraban una mezcla de protección e infección. Dos animales mostraban 25 síntomas de la enfermedad, como fiebre alta y otros síntomas típicos de la peste porcina. Los animales afectados fueron sacrificados. Los animales protegidos mostraban anticuerpos neutralizantes, que se detectaban con ambas pruebas de PNV y ELISA.

Grupo 3: Todos los animales estaban infectados y mostraban síntomas de la enfermedad. Los animales afectados 30 fueron sacrificados.

El estudio de inmunización oral mostró que la inmunización oral, especialmente cuando se usaba el mutante S10, inducía una protección eficaz frente a la infección. La cepa aislada O11 también mostraba resultados beneficiosos, considerando que la dosis de vacunación se había reducido en comparación con el virus S10 administrado. 35

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Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Vacuna marcadora para el tratamiento preventivo de la peste porcina clásica que comprende virus modificados de la peste porcina clásica vivos atenuados,

   caracterizada porque la secuencia vírica de aminoácidos del epítope TAV de la proteína E2 comprende una 5 secuencia diferente de la de un virus de la peste porcina clásica natural, donde la secuencia vírica de aminoácidos muestra al menos una de la siguientes sustituciones con referencia al virus de la cepa C "Riems":

   - sustitución del aminoácido 830 por valina,

   - sustitución del aminoácido 833 por serina, 10

   - sustitución del aminoácido 839 por glicina.
2. 2. Vacuna marcadora de acuerdo con la reivindicación precedente, caracterizada porque el virus modificado no muestra secuencias recombinantes de ácido nucleico.

   15
3. 3. Vacuna marcadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque

   la secuencia vírica de nucleótidos muestra una o más de las siguientes sustituciones con referencia al virus de la cepa C "Riems":

   20

   - sustitución en el nucleótido de la posición 2862 por T,

   - sustitución en el nucleótido de la posición 2870 por T,

   - sustitución en el nucleótido de la posición 2889 por G.
4. 4. Vacuna marcadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada 25 porque

   la secuencia vírica de aminoácidos muestra una o más de las siguientes sustituciones con referencia al virus de la cepa C "Riems":

   - sustitución del aminoácido 426; en la proteína ERNS; por valina, 30

   - sustitución del aminoácido 576; en la proteína E1; por histidina,

   - sustitución del aminoácido 583; en la proteína E1; por ácido glutámico,

   - sustitución del aminoácido 951; en la proteína E2; por isoleucina.
5. 5. Vacuna marcadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada 35 porque

   la secuencia vírica de nucleótidos muestra una o más de las siguientes sustituciones con referencia al virus de la cepa C "Riems":

   - sustitución en el nucleótido de la posición 1649 por G, 40

   - sustitución en el nucleótido de la posición 2099 por C,

   - sustitución en el nucleótido de la posición 2122 por G,

   - sustitución en el nucleótido de la posición 3225 por T.
6. 6. Vacuna marcadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada 45 porque

   la secuencia vírica de aminoácidos del epítope TAV comprende la secuencia de acuerdo con la SEC ID N. º 3 o LA SEC ID N. º 4.
7. 7. Vacuna marcadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada 50 porque

   la secuencia vírica de nucleótidos comprende la secuencia de acuerdo con la SEC ID N. º 1.
8. 8. Vacuna marcadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los sujetos tratados con la vacuna pueden diferenciarse de los sujetos infectados con el virus de la peste 55 porcina asociado con la enfermedad a través del análisis de muestras biológicas obtenidas a partir de dichos sujetos usando procedimientos analíticos serológicos y/o genómicos.
9. 9. Vacuna marcadora de acuerdo con la reivindicación previa, caracterizada porque el procedimiento analítico genómico se basa en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferiblemente PCR en tiempo real, 60

   en el que se utilizan cebadores y/o sondas que reconocen la secuencia vírica de nucleótidos modificada y/o asociada con la enfermedad.
10. 10. Vacuna marcadora de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque

    el procedimiento analítico serológico se basa en un inmunoensayo enzimático (EIA), preferiblemente un ensayo 5 inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), en el que se utilizan anticuerpos que se unen específicamente al epítope TAV bien modificado y/o asociado con la enfermedad.
11. 11. Vacuna marcadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que puede obtenerse mediante la generación de variantes de escape víricas de cepas víricas de la peste porcina asociadas con 10 la enfermedad u otras conocidas mediante la aplicación de presión de anticuerpos.
12. 12. Procedimiento de fabricación de una cepa para vacuna del virus modificado de la peste porcina clásica viva atenuada, preferiblemente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende la generación de variantes de escape de cepas víricas de la peste porcina clásica asociadas con la enfermedad u otras 15 conocidas mediante la aplicación de presión de anticuerpos.
13. 13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque el procedimiento comprende:

    20

    - múltiples pases de células, preferiblemente células renales embrionarias de cerdo, infectadas con el virus de la peste porcina asociado con la enfermedad en cultivos celulares y

    - aplicación simultánea de anticuerpos dirigidos frente al epítope TAV de la proteína E2 del virus de la peste porcina asociado con la enfermedad y/o suero policlonal de conejo inmunizado con el péptido CTAVSPTTLRTEVVK. 25
14. 14. Composición farmacéutica que comprende la vacuna marcadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. 15. Vacuna marcadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso como 30 medicamento en el tratamiento preventivo (vacunación), preferiblemente mediante inyección intramuscular o aplicación oral, de la peste porcina clásica.