BR112012029145B1

BR112012029145B1 - Vacina marcada para tratamento profilático da peste suína clássica, método de fabricação de uma vacina de uma cepa de vírus modificado, vivo e atenuado da peste suína clássica, e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112012029145B1
Application number: BR112012029145-9A
Authority: BR
Inventors: Martin Beer; Sandra Blome; Immanuel Leifer
Original assignee: Riemser Pharma Gmbh
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2011-05-18
Publication date: 2021-09-14
Also published as: ES2593965T3; BR112012029145A2; US9315873B2; CA2801897A1; KR20130109008A; CA2801897C; RS55214B1; KR101845571B1; BR112012029145B8; MX337048B; CY1118060T1; HUE029385T2; PT2571519T; EP2571519A1; ZA201208194B; DK2571519T3; SI2571519T1; WO2011144360A1; CN102905725A; US20130129762A1

Abstract

vacina marcada para tratamento profilático da peste suína clássica, método de fabricação de uma vacina de uma cepa de vírus modificado, vivo e atenuado da peste suína clássica, composição farmacêutica e, método para o tratamento profilático da peste suína clássica a invenção se refere a uma vacina marcada para tratamento profilático da peste suína clássica compreendendo o vírus vivo atenuado e modificado da peste suína clássica. a sequência viral de aminoácidos do epítopo tav da proteína e2 compreende uma sequêncía diferente daquela de um vírus de peste suína clássica do tipo selvagem. a invenção se refere a composições farmacêuticas da vacina marcada. a invenção também se refere a um método de fabricação de vacinas marcadas para prevençâo da peste suína clássica usando pressão de anticorpo seletiva.

Description

DESCRIÇÃO

A invenção se refere a uma vacina marcada para tratamento profilático da peste suína clássica compreendendo o vírus vivo atenuado e modificado da peste suína clássica. Em uma modalidade da invenção a vacina marcada é caracterizada pela sequência de nucleotídeo viral, que codifica o epítopo TAV, e/ou a sequência de aminoácidos do epítopo TAV, compreende uma sequência diferente daquela do vírus associado a doença da peste suína, de modo que os indivíduos exibindo infecção com o vírus associado a doença da peste suína podem ser diferenciados dos indivíduos vacinados com a vacina marcada da presente invenção ou por métodos analíticos genômicos e/ou sorológicos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A peste suína clássica (CSF) é uma doença epizoótica animal que ocorre em todo mundo e tem relevância política e econômica significativa (Vandeputte e Chappuis,1999). A peste suína clássica, também conhecida como cólera suína ou praga do porco, é uma das doenças que devem ser notificadas nacionalmente, em relação a Europa bem como para a Organização Mundial para Saúde Animal (OIE) em Paris após o aparecimento em qualquer estado membro. A peste suína clássica é causada por um vírus RNA envelopado pequeno do gênero Pestivirus da família Flaviviridae. Os hospedeiros naturais dos vírus da peste suína são espécie de suínos apenas domesticados e selvagens (por exemplo, o javali europeu).

Tentativas foram feitas dentro da União Europeia para erradicar a CSF através de rigorosas medidas sem vacinação profilática, que foram proibidas desde 1990. Apesar da proibição, a vacinação representa uma opção legalmente aprovada como uma vacinação de emergência, em casos quando a peste suína aparece. Em tal evento a vacinação deve ocorrer via um. dos planos de vacinação de emergência, que foram ratificados pela União Europeia (veja Art. 19 da Counsel Directive 2001/89/EC). Até agora, Romênia foi o único país no qual uma vacinação de emergência foi realizada. As razões para tal aplicação limitada residem em limitações técnicas das vacinas marcadas disponíveis no presente momento, tal como restrições na eficácia da vacina, além disso, para barreiras comerciais relacionadas a animais vacinados convencionalmente (limitação a comercialização nacional). A eficiência das vacinas marcadas licenciadas não podem ser comparadas com vacinas vivas modificadas, que exibem significativas vantagens, e tais vacinas inativadas ou vacinas subunidades não são de qualquer maneira adequadas para vacinação de emergência devido ao início mais tardio da imunidade e a necessidade de revacinações.

Considerando a expansão da União Europeia em direção a países na Europa Oriental e sempre crescente globalização, novas estratégias têm sido discutidas para potencial vacinação de emergência, que desempenhará um papel em evitar um abate de animais em larga escala e perdas econômicas associadas (Leifer et al., 2009). Existe portanto, uma significativa demanda por uma vacina eficiente que permita diferenciação sorológica entre animais vacinados e não vacinados e além disso, exibem todas as vantagens das tradicionais vacinas vivas modificadas.

Devido a primeira geração das vacinas marcadas, que foram baseadas nas glicoproteína E2 do vírus de CSF, têm só uma disponibilidade restrita e graves desvantagens como condições de armazenagem, custos, eficácia, existe um a grande demanda por novas vacinas marcadas. Vários candidatos para tal vacinas foram pesquisados, tal como vacinas de DNA, peptideos imunogênicas, vacinas de vetores, mutantes de deleção e virus da peste quiméricos (Beer et ai., 2007; Dong e Chen, 2007) . A maioria destes candidatos a vacina marcada exibe a desvantagem que são produzidos via métodos modernos de modificação genética. Devido ao medo significativo do consumidor de produtos geneticamente modificados, além dos procedimentos complicados de admissão, vacinas geneticamente modificadas exibem desvantagens significativas.

Vacinas tradicionais dirigidas contra CSFV incluem vacinas vivas modificadas. Tais vacinas são altamente eficientes após aplicação única, porém não permitem a diferenciação entre animais vacinados e infectados com base em um perfil sorológico. Muitas destas vacinas são baseadas na cepa virai clássica "C" ou sua derivada (assim chamadas "vacinas de cepa C") . Adicionalmente, existem vacinas com base na cepa virai japonesa "exultação de cobaia - negativo (GPE-)", a cepa "Thiverval" e a cepa "mexicana PAV", todas as que foram usadas em ambas as configurações regionais e internacionais (Blome et al, 2006; Greiser-Wilke & Moennig, 2004; van Oirschot, 2003). Existem dados extensivos em relação ao uso das vacinas com base na cepa C. É conhecido que quatro dias após aplicação da vacina, uma proteção completa dos animais contra infecção de CSFV desafio virulento pode ser demonstrada. Adicionalmente, sete dias após vacinação, uma proteção completa é fornecida a partir da transmissão vertical do virus desafio em animais portadores (de Smit et al., 2 001) .

A desvantagem significativa das vacinas vivas modificadas conhecidas é a absoluta incapacidade para discriminar sorologicamente entre animais vacinados e infectados. À luz disto, um objetivo da presente invenção é fornecer uma vacina viva modificada que permite discriminação entre animais vacinados e infectados.

Na área das vacinas marcadas, as assim chamadas vacinas de subunidades são conhecidas do estado da técnica anterior, que são baseadas na glicoproteina E2 recombinante de CSFV. O teste de discriminação para tais vacinas é o imunoensaio de absorção por acoplamento enzimático (ELISA), em que anticorpos dirigidos contra a glicoproteina são usados para indiretamente detectar o virus de infecções CSF. No presente momento, apenas uma vacina de subunidade E2 está disponível no mercado, entretanto, a licença foi suspensa por alguns meses (veja o relatórios EMA sobre vacinas de subunidade E2).

Independentemente da incapacidade de comercializar tais produtos, tais sistemas exibem desvantagens biológicas graves. Uma tal desvantagem é que pelo menos duas imunizações parentéricas são requeridas antes da proteção completa ser transmitida, que torna tais vacinas completamente incompatíveis com "vacinações com iscas", onde animais são alimentados em uma dose única com iscas com vacina. Além disso, as campanhas de vacinação de emergência são apenas razoáveis quando existe uma proteção contra CSFV do tipo selvagem. Em vários experimentos usando as vacinas de subunidade E2, a proteção completa a partir da transmissão vertical não foi alcançada. Uma desvantagem adicional de tais sistemas é que anticorpos dirigidos contra a glicoproteina Ems são usados para diferenciação sorológica e a sensibilidade e especificidade de tais sistemas testes foi apenas sempre moderada (Floegel-Niesmann, 2003).

Vacinas de GSF vivo e atenuado são conhecidas no estado da técnica, porém foram até agora prejudicadas por várias desvantagens. A maioria das vacinas reveladas no estado da técnica anterior compreende DNA exógeno e são geradas usando métodos de engenharia genética, também conhecidos como tecnologia do DNA recombinante, portanto, associando problemas sérios de avaliação de risco ambiental com o produto. Outros variantes de CSFV são conhecidos onde aminoácidos ou sejam, substituídos ou deletados do epítopo TAV do tipo selvagem (WO 2010/074575 A2). Entretanto, os resíduos aminoácido e/ou nucleotídeos que são modificados na presente invenção não são revelados nem sugeridos pelo estado da técnica anterior.

O repique múltiplo também foi usado para gerar variantes de vírus, que pode ser usado como vacinas, embora a pressão de anticorpo não foi previamente aplicada. 0 repique múltiplo em culturas infectadas por vírus a fim de gerar variantes como revelado no estado da técnica anterior é, portanto, limitado por ter de conduzir um grande número de repiques de cultura e também por uma falta de controle sobre o qual o epítopo é para ser modificado (Hulst et al).

Kortekaas et al descrevem uma vacina de CSF geneticamente estável, vivo e atenuado, que permite a diferenciação sorológica de animais infectados de vacinados. Uma cepa C mutante foi geneticamente modificada usando uma abordagem direcionada, pela qual a tecnologia do DNA recombinante foi usado para introduzir deleções na proteína E2 do CSFV. Mutações adicionais foram subsequentemente adquiridas em vários locais dentro do genoma do vírus via repique múltiplo para criar cepas exibindo proliferação aprimorada. As cepas reveladas por Kortekaas et al são vírus modificado por engenharia genética, que é uma desvantagem significativa à luz dos processos de admissão complicados para liberação de produtos geneticamente modificados no ambiente.

Holinka et al revelam uma cepa de CSFV "FlagT4vn com marcador antigênico duplo viva e atenuada que foi obtido combinando dois determinantes genéticos de atenuação. FlagT4v abriga um marcador antigênico positivo, epítopo Flag sintético, introduzido via uma inserção 19mer em glicoproteina El; e um marcador negativo resultando a partir de mutações de sitio de ligação do epitopo do anticorpo monoclonal WH303 (mAbwH303) na glicoproteina E2. A administração intranasal ou intramuscular de suínos FlagT4v protegidos contra cepa Brescia de CSFV virulento em pós- inoculação cedo (2 ou 3 dias), e tarde (28 dias). A resposta do anticorpo induzida por FlagT4v em porcos reagiu fortemente contra o epitopo Flag, porém falhou em inibir a ligação de mAbWH303 com um sintético peptideo representando o epitopo WH303. A vacina revelada por Holinka se refere a um vírus modificado por engenharia genética que exibe DNA exógeno dentro do seu genoma (a sequência Flag-Tag, além disso, para sequência e marcadores de vetor associado). Isto representa uma desvantagem significativa comparada a presente invenção, que não exibe nenhum DNA exógeno ou recombinante.

O documento WO 2007/143442 A2 descreve os efeitos de mutações dentro do epítopo WH303 de CSFV E2, que muda a sequência de aminoácidos do CSFV virulento de Brescia progressivamente em direção a sequência de aminoácidos homólogos de cepa BVDV NADL. Animais infectados com vírus mutantes foram protegidos quando desafiado com virus Brescia virulento em 3 e 21 dias pós vacinação. A modificação neste sítio dentro do epítopo WH303 também permite desenvolvimento de um teste diagnostico para diferenciar animais vacinados de infectados. Apesar destes efeitos, as mutações foram introduzidas usando engenharia genética, portanto, introduzindo material genético exógeno dentro da vacina virai.

O estado da técnica acima citado revela vacinas que foram modificados via tecnologia genética recombinante para produzir as cepas de vírus. Como descrito acima, vacinas modificadas por engenharia genética estão sujeitos a preocupações de segurança ambiental e são, portanto, impedidos por protocolos de admissão complicados e o medo entre o público geral, portanto, fornecendo desvantagem significativa para seu uso.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Á luz do estado da técnica anterior, o problema subjacente a presente invenção é de fornecer uma vacina marcada para suínos domesticados e selvagens que fornece proteção contra o vírus da peste suína clássica, que permite diferenciação entre animais vacinados e infectados, produzido de preferência por tecnologias convencionais. Em uma modalidade preferida a vacina marcada não é produzida via tecnologia recombinante de modificação genética.

Este problema é resolvido pelas características das reivindicações independentes. Modalidades preferidas da presente invenção são fornecidas pelas reivindicações dependentes.

A invenção, portanto, se refere a uma vacina marcada para tratamento profilático da peste suína clássica compreendendo o vírus vivo atenuado e modificado da peste suína clássica.

Em uma modalidade preferida a invenção ainda se refere a uma vacina marcada para tratamento profilático da peste suína clássica compreendendo o vírus vivo atenuado e modificado da peste suína clássica, caracterizado pela sequência virai de aminoácidos do epítopo TAV da proteína E2 compreende uma sequência diferente daquela de um vírus de peste suína clássica do tipo selvagem, por meio da qual a sequência virai de aminoácidos exibe pelo menos uma das seguintes substituições: - substituição do aminoácido 830; alanina por valina, - substituição do aminoácido 833; prolina por serina, - substituição do aminoácido 839; ácido glutâmico por glicina.

Em uma modalidade preferida a vacina marcada da presente invenção é caracterizada pelo virus modificado não ser produzido via métodos de DNA recombinante.

Em uma modalidade preferida a vacina marcada da presente invenção é caracterizada pela sequência de nucleotideo virai que exibe uma ou mais das seguintes substituições: - substituição na posição de nucleotideo 2862; T por C, - substituição na posição de nucleotideo 2870; G por A, - substituição na posição de nucleotideo 2889; G por A.

Em uma modalidade preferida a vacina marcada da presente invenção é caracterizada pela sequência virai de aminoácidos que exibe uma ou mais das seguintes substituições: - substituição do aminoácido 426; na proteína E1®5; isoleucina por valina, - substituição do aminoácido 576; na proteína El; tirosina por histidina, - - substituição do aminoácido 583; na proteína El; ácido aspártico por ácido glutâmico, - substituição do aminoácido 951: na proteína E.2; treonina por isoleucina.

Em uma modalidade preferida a vacina marcada da presente invenção é caracterizada nucleotideo viral exibe uma ou mais das seguintes substituições: - substituição na posição de nucleotideo 1649; A por G, - substituição na posição de nucleotideo 2099; T por C, - - substituição na posição de nucleotideo 2122; T pór G, - substituição na posição de nucleotideo 3225: C por T.

Em uma modalidade preferida a vacina marcada da presente invenção é caracterizada pela sequência virai de aminoácidos do epítopo TAV compreender a sequência de acordo com SEQ ID NO. 3 ou SEQ ID NO. 4.

Em uma modalidade preferida a vacina marcada da presente invenção é caracterizada pela sequência de nucleotideo virai compreender a sequência de acordo com SEQ ID NO. 1.

Em uma outra modalidade a vacina marcada da presente invenção é caracterizada pelos individuos tratados com a vacina como descrito no presente documento poderem ser diferenciados dos individuos infectados com o virus associado a doença da peste suína via a análise de amostras biológicas obtidas dos ditos indivíduos usando métodos analíticos genômicos e/ou sorológicos.

Em uma outra modalidade a vacina marcada da presente invenção é caracterizada pelo método analítico genômico ser baseado na reação em cadeia polimerase (PCR), de preferência PCR em tempo real, pelo quais primers e/ou sondas que reconhecem ou a sequência de nucleotideo virai modificada e/ou associada com a doença são usados.

Em uma outra modalidade a vacina marcada da presente invenção é caracterizada pelo método analítico sorológico ser baseado em um imunoensaio enzimático (EIA), de preferência um imunoensaio de absorção por acoplamento enzimático (ELISA), pelo quais os anticorpos que se ligam especificamente ou o epitopo IAV modificado e/ou associado com a doença são usados.

Um aspecto adicional da invenção se refere a uma vacina marcada, de preferência como descrito no presente documento, capaz de ser obtido pela geração de variantes escape viral de cepas associadas com a doença ou outras cepas conhecidas de peste suína virai pela aplicação de pressão de anticorpo.

Um aspecto adicional da invenção se refere a um método de fabricação de uma vacina de uma cepa de vírus modificado, vivo e atenuado da peste suína clássica, de preferência como descrito no presente documento, compreendendo a geração de variantes escape de cepas associadas com a doença ou outras cepas conhecidas de peste suína virai pela aplicação de pressão de anticorpo.

Em uma modalidade preferida o método de fabricação como descrito no presente documento é caracterizado pelo método compreender: - repique múltiplo de células, de preferência células de rim de porcos em estágio embrionário infectados com virus associado com a doença da peste suína em cultura de célula, e - aplicação simultânea de anticorpos dirigidos contra o epítopo TAV da proteína E2 do vírus associado a doença da peste suína e/ou soro de coelho imunizado de peptídeo-CTAVSPTTLRTWK policlonal .

A invenção ainda se refere a uma composição farmacêutica compreendendo a vacina marcada como descrito no presente documento junto com um carreador farmaceüticamente aceitável.

Um aspecto adicional da invenção se refere a uma vacina marcada como descrito no presente documento para o uso como um medicamento no tratamento profilático (vacinação), de preferência via injeção intramuscular ou aplicação oral, da peste suína clássica.

Um aspecto adicional da invenção se refere a um método para o tratamento profilático (vacinação) da peste suína clássica compreendendo administração da vacina marcada como descrito no presente documento em um sujeito, de preferência um porco, de preferência via injeção intramuscular ou aplicação oral.

Uma outra situação comum em que peste suína clássica requer a vacinação é na resposta a detecção da infecção do vírus no campo em populações de porcos. Quando a infecção de porcos ocorre, de modo que o vírus da peste suína clássica está presente ou em porcos selvagens ou domésticos, uma vacinação de emergência das populações de porcos nos arredores e/ou vizinhas é requerido. Vacinações são subsequentemente realizadas por até 1 a 2 anos de todos os porcos na região do redor, seja selvagens ou domésticos., a fim de evitar um surto ou infecção do vírus da peste suína em larga escala. Â vacina marcada da presente invenção é idealmente adequada para uma vacinação de emergência no caso da detecção peste suína ou um surto. A vacina marcada facilita rotas rápidas e eficazes de administração via oral, além de através de injeção, e permite discriminação entre animais infectados com o vírus do campo (associado a peste) e a vacina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O desenvolvimento da vacina de acordo com a presente invenção não é baseado em métodos de modificação genética, porém antes no princípio que um vírus se modificará em um modo adaptativo quando colocado sob uma pressão de anticorpo seletiva. A presente invenção, portanto, se refere a uma vacina viva não geneticamente modificada que fornece proteção contra virulento CSFV, que exibe todos os requerimentos para uma vacina marcada (sorologicamente e geneticamente distinta). A vacina marcada foi modificada por engenharia genética aplicando pressão de anticorpo seletiva a diferentes cepas C em cultura de célula. Os variantes gerados possuem de preferência três trocas de aminoácido no epitopo TAV E2 e duas trocas compensatórias na proteina El. A estabilidade destes variantes foi provada por mais que dez repiques de cultura de células em tambores rotatórios e, por exemplo., vacinação intramuscular de porcos conduz a proteção completa contra uma cepa desafio altamente virulenta. Além disso, DIVA direto é permitido por técnicas sorológicas e/ou genéticas, por exemplo, através de coloração imunofluorescência distinta e sistemas de reação em cadeia polimerase da transcriptase reversa em tempo real. Também, DIVA indireto poderia ser alcançado pela otimização de ELISAs E2 comerciais (por exemplo, mudando os valores de corte) ou desenvolvendo sistemas peptídeo-ELISA especifico para TAV. Então, a vacina marcada viva não geneticamente modificada contra CSFV é apresentada.

A produção da vacina de acordo com a presente invenção ocorre como se segue:

Os variantes escape "Riems" de cepa C que aparecem naturalmente são selecionados em um sistema de cultura de células (IFN-células de rim de porcos em. estágio embrionário) via o repique do virus de cepa C durante a aplicação de anticorpos específicos E2-TAV e soro de coelho imunizado de peptídeo-CTAVSPTTLRTWK policlonal.

Os anticorpos aplicados, além dos anticorpos contidos no soro de coelho policlonal tratado com peptídeo, reconhece o epítopo TAV na proteína E2 do vírus de CSF especificamente, e através da ligação com est epitopo neutraliza o vírus CSF (cepa C) . O CSFV exibe uma taxa de mutação alta devido a sua natureza ser de RNA. Sob a pressão de seleção de fornecer anticorpos de neutralização, os vírus, que sofrem mutação no epítopo aos quais os anticorpos se ligam (neste caso, o epítopo TAV) são selecionados, pelos quais os vírus inalterados do tipo selvagem são neutralizados. Através de repique múltiplo sob várias concentrações e misturas de anticorpo e soro de coelho, vários isolados de vírus mutantes podem ser selecionados.

Os vírus com uma substituição no epítopo TAV foram primeiro selecionados. Através de repique adicional destes vírus sob vários tipos de pressão de anticorpo um isolado foi selecionado, que exibiu duas substituições no epítopo TAV e uma única substituição compensatória na proteína El (a interação entre El e E2 é importante para a estrutura do vírus). Estes vírus foram postos sob pressão de anticorpo adicional, que conduz ao isolamento de vírus com três substituições no epítopo TAV, além das duas substituições compensatórias na proteína El. Os vírus resultantes ("Riems" de cepa C Q7, "Riems"' de cepa C S10 e "Riems" de cepa C 011) exibiram, substituições na proteína E2 nas posições 2862, 2870 e 2889, 3225, além das mudanças na proteína El nas posições 2099 e 2122, além de uma substituição na proteína ERNS na posição 1649. Tabela 1: Informação adicional para os variants escape TAV

As mudanças na sequência de nucleotideo permite um sistema RT-PCR em tempo real, que pode diferenciar entre os variantes (Q7, S10, 011) e os isola dos do campo.

As mudanças na sequência de aminoácidos permite a diferenciação entre os variantes (Q7, S10, Oil) e os isolados do campo com base na ligação do anticorpo, pelos quais os anticorpos usado para a neutralização (anticorpo A18s) já não se ligam aos variantes, porém se ligam a todos os isolados do campo devido ao epítopo TAV altamente conservado no CSFV. Anticorpos gerados contra a sequência de peptídeo TAV modificada (exibindo as mutações da presente invenção) podem também ser usados para a diferenciação entre o vírus infeccioso e a vacina, pelos quais os anticorpos dirigidos contra os variantes se ligarão a vacina de vírus modificado da presente invenção e fornecerão a identificação positiva de animais vacinados, porém não se ligarão aos isolados do campo. Tabela 2: Sequências da presente invenção:

A presente invenção se refere a um vírus modificado da peste suína que pode compreender de qualquer ou todas as possíveis combinações de mutações e substituições reveladas no presente documento. Os exemplos e o suporte experimental fornecidos no presente documento demonstram que as cepas virais foram geradas, que exibem apenas um subconjunto de todas as substituições listadas na Tabela 1. Estas cepas virais exibem, um efeito protetor, além de serem, capazes de serem usadas como marcadores, portanto, cumprindo o objetivo da presente invenção. As cepas preferidas da presente invenção se referem a cepas compreendendo, subconjuntos das substituições reveladas, além daquelas cepas que exibem todas as substituições reveladas.

Foi totalmente surpreendente que as combinações de uma ou mais das modificações genéticas específicas (derivadas através de processos naturais como um resultado da pressão de anticorpo) conduziria as propriedades benéficas da vacina marcada como descrito no presente documento. 0 estado da técnica anterior revela modificações similares, porém nada conhecido no estado da técnica sugeriria que os resíduos modificados em particular na presente invenção forneceria uma proteção particularmente eficaz da infecção de CSFV. Suas combinações únicas conduzem ao conjunto de propriedades descritas que permitem a invenção agir como uma vacina capaz de diferenciar entre animais infectados e vacinados.

Era desconhecido que tal pressão de seleção como aplicada no presente pedido através de tratamento com anticorpo conduziria a modificação precisa descrita no presente documento. As combinações de modificações genéticas como descrito no presente documento funcionam juntas, fornecendo o efeito sinérgico de mutações compensatórias que mantêm a estrutura da proteína, enquanto se permite os resíduos TAV fazerem mutações, e então se fornece as características do marcador requeridas pelo objetivo da presente invenção.

O termo engenharia genética se refere a modificação genética ou manipulação do genoma de um organismo, por exemplo, introduzindo material de ácido nucléico exógeno, tal como DNA ou RNA, ou sequências de ácido nucléico sintético dentro do genoma hospedeiro. Esta tecnologia é também conhecida como tecnologia do DNA recombinante.

O termo virus atenuado se refere ao virus que foi modificado, de qualquer forma, de modo que o vírus é menos inofensivo e/ou menos virulento em comparação ao vírus tipo selvagem (associado à doença). Por exemplo, menos sintomas associados à doença aparecem em indivíduos infectados com vírus atenuado em comparação ao vírus tipo selvagem.

O termo pressão de anticorpo ou pressão de anticorpo seletiva nos termos da presente invenção se refere a aplicação de anticorpos durante a cultura de células, de preferência ao longo de repiques múltiplos, que sao direcionadas para um ou mais epítopos específicos do vírus. Tais anticorpos podem ser qualquer tipo de anticorpo conhecido no estado da técnica, seja mono ou policlonal, ou podem estar contidos no soro de animais tratados com um peptídeo de interesse, por exemplo, o epitopo alvo. Tais anticorpos são muitas vezes chamados de anticorpos de neutralização. Sob a pressão de seleção de fornecer anticorpos de neutralização, os vírus, que sofrem mutação no epítopo aos quais os anticorpos se ligam (neste caso, o epítopo TAV) são selecionados devido a sua vantagem de crescimento, como os anticorpos já não se ligam ao dito epítopo e, portanto, já não fornecem um efeito limitante ou neutralizante, pelos quais os vírus inalterados do tipo selvagem são neutralizados pelos anticorpos, estão subsequentemente seletivamente em desvantagem na cultura.

Aqueles vírus, que sofrem mutação no epítopo aos quais os anticorpos se ligam (neste caso, o epítopo TAV), são comumente referidos como variantes escape. Estes variantes são matéria da presente invenção, e são geneticamente e sorologicamente distintos do virus tipo selvagem.

O termo repique múltiplo se refere a prática de cultura de células de repique (também conhecida como subcultura ou divisão de células) ao longo de várias vezes, pelo qual um pequeno número de células é transferido em um novo recipiente, de preferência com meios novos, ou pela diluição de culturas de células dentro de meios novos, ao longo de várias vezes de modo que se permite que as culturas de células continuem em crescimento sem os efeitos associados a alta densidade de células em culturas.

Á luz da vacina marcada, a invenção pode também se relacionar a um grupo unificado de invenções que são combinadas por um único conceito inventivo. A vacina marcada, o próprio virus e suas composições farmacêuticas, seu uso no tratamento de animais por vacinação e métodos para produzir o vírus todos caem em um conceito inventivo geral. Ambas a nova e a inventiva vacina marcada descrita no presente documento permitem c unificam todos os aspectos da presente invenção, de modo que as várias modalidades descritas no presente documento caem dentro de uma única invenção unificadora.

Onde sequências de nucleotídeos são fornecidas no presente pedido, as listagens de sequência são destinadas a englobar ambas as sequências correspondentes de RNA e DNA. Embora algumas sequências de nucleotídeos são fornecidas como sequências de DNA, as sequências correspondentes de RNA (por exemplo, onde o genoma do vírus exibe uma molécula de RNA) são destinadas a serem englobadas na presente invenção. As sequências de nucleotídeos da presente invenção também englobam as sequências complementares àquelas listadas, por exemplo, a sequência complementar que poderia via o pareamento de base de Watson-Crick se ligar a sequência listada. As sequências complementares correspondentes de RNA e/ou DNA não requerem esforço inventivo para converter uma a partir da outra e são facilmente dentro do alcance daquele técnico no assunto.

O procedimento de administração para a vacina virai da presente invenção, composições da invenção tais como composições farmacêuticas, imunológicas, antigênicas ou de vacina ou composições terapêuticas, podem ser administradas através de via parentérica, tal como métodos de aplicação intradermal, intramuscular ou subcutâneo. Tal administração permite uma resposta imune sistemático, ou resposta imunes humorais ou mediadas por células. A vacina de acordo com a presente invenção pode também ser administrada por vias orais, tal como sendo incorporadas na alimentação animal, permitindo a imunização simples e eficaz de grandes populações, por exemplo, o javali europeu.

Os métodos preferidos de aplicação se referem ou a aplicação subcutânea ou a aplicação intramuscular, de preferência por injeção, e aplicação oral.

De modo mais geral, as composições de vacina virai inventivas ou composições terapêuticas podem ser preparadas de acordo com técnicas padrão bem conhecidas por aqueles técnicos na área farmacêutica ou veterinária.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de tais composições pode ser administrada em dosagens e por técnicas bem conhecidas por aqueles técnicos na área médica ou veterinária levando em. consideração fatores tais como a idade, o sexo, peso, espécie e condição do sujeito em particular, e a via de administração. As composições podem ser administrada sozinhas, ou podem ser coadministradas ou administradas sequencialmente com composições, por exemplo, com "outra composição" imunológica, antigênica ou vacina ou composições terapêuticas desse modo fornecendo composições multivalentes ou "coquetel" ou combinação da invenção e métodos as empregando.

Novamente, os ingredientes e modos (sequencial ou coadministração) de administração, bem como dosagens podem ser determinados levando em consideração fatores tais como a idade, o sexo, peso, espécie e condição do sujeito em particular, e a via de administração.

Exemplos de composições da invenção incluem preparações liquidas para orificio, por exemplo, oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrico, etc., administração tal como suspensões, xaropes ou elixires; e, preparações para administração parentérica, subcutânea, intradermal, intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável) tais como suspensões ou emulsões estéreis.

Em tais composições, os variantes de CSFV podem estar em mistura com um carreador, diluente, ou excipientè farmaceuticamente aceitável tal como água estéril, solução salina fisiológica, glicose ou afins. As composições podem também ser liofilizadas. As composições podem conter substancias auxiliares tais como agentes molhamento ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, adjuvantes, aditivos de aumento de gelificação ou viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes, corantes, e afins, dependendo da via de administração e da preparação desejada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Comparações de sequência

Figura 2: Análise Indireta de Imunofluorescência

Figura 3: VNT com Rõsrath cepa CSFV

Figura 4: ELISA E2 Idexx com soro de porco a partir do estudo animal 06/10

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

Figura 1: Comparações de sequência. A) Comparação da sequência de nucleotideo da região do epitopo TAV entre os variantes Q7, S.10, Oil e o isolado do campo de cepa C. B) Comparação da sequência de aminoácido da região do epitopo TAV entre os variantes Q7, S10, 011 e o isolado do campo de cepa C.

Figura 2: Análise Indireta de Imunofluorèscência. A) Análise dos mutantes escape E2, Repique 2 B5/2 (vírus precursor para Q7, S10 e 011, que exibe apenas 2 substituições no epitopo TAV). B) Análise do vírus de cepa C.

Figura 3: Três semanas após a imunização de todos os animais, com a exceção de um animal no grupo S10 e um animal no grupo 011, mostraram anticorpos de neutralização. 7 dias após a infecção os animais imunizados demonstraram uma titulação VNT de 640 ou maior. A menor titulação foi 320, mostrado por um animal no grupo imunizado mutante TAV. Os animais controle não imunizados não exibiram titulação em VNT contra Rõsrath.

Figura 4: Os animais imunizados com cepa C mostraram resultados positivos no ELISA E2 21 dias após a imunização. 7 dias após a infecção todos animais imunizados mostraram claramente resultados positivos no ELISA. 0 grupo controle não imunizado não mostrou anticorpos detectáveis após a infecção.

EXEMPLOS Modelo e Métodos Experimentais Imunização de coelhos usando o peptídeo TAV

Pois coelhos de 8-10 semanas de idade (marca auricular 304 e 305) foram imunizados de acordo com o seguinte esquema, usando um conjugado de hemocianina lapa californiana (KLH) com peptídeo-CTAVSPTTLRTWK a fim de gerar soro policlonal de neutralização de cepa C. A imunização foi realizada seguida por 6 reforços, cada ocorrendo aproximadamente em intervalos mensais.

Isolamento de variantes escape E2 do vírus "Riems" de cepa C

A fim de criar pressão de anticorpo com a qual gerar mutações do vírus "Riems" de cepa C na glicoproteína E2, o vírus foi tratado com vários anticorpos dirigidos contra o epítopo TAV da proteína E2, usando várias concentrações. As células infectadas foram subsequentemente incubadas e repicadas várias vezes. Os anticorpos que foram aplicados nos presentes experimentos são anticorpos E2 monoclonais específicos, que estão comercialmente disponíveis para o teste ELISA E2 de CSFV específico. Anticorpos: Al 81 (IDEXX) A18B (Bommeli) A18C (Ceditest) HC34 (CRL, Hannover) WH303 e WH 211 (Weybridge, Grã Bretanha)

A incubação das culturas virais foi realizada de acordo com o seguinte. Várias concentrações e misturas de anticorpos foram aplicadas com várias quantidades de vírus. A incubação ocorreu por 2-6 horas temperatura ambiente. A suspensão de vírus-anticorpo foi fornecida para placas de cultura de células com o crescimento de células confluente e subsequentemente incubadas. Durante este tempo, o vírus foi absorvido dentro das células (células PK15) por 1-2 horas a 37 °C. Finalmente o meio de cultura de células foi adicionado e as placas foram incubadas por 72 horas a 37°C e 5% COT.

Após 72 horas os sobrenadantes da cultura de células foram individualmente separados e armazenados. As placas foram então fixadas e coradas usando coloração de imunofluorescência e um anticorpo C16 (específico para a proteína NS3 de CSFV). Os poços de fracos positivos do sobrenadante da cultura de células foram então repicados sob uma pressão de anticorpo adicional como descrito acima. Os sobrenadantes da cultura de células de poços com células de único positivo ou placas de células de coloração única foram então repicadas sob pressão de anticorpo muito fraca ou sem nenhuma a fim de aumentar a titulação do vírus paral-2 repiques. Vários sobrenadantes da cultura de células foram selecionados para o sequenciamento nas regiões El e E2.

O controle do vírus variante escape foi realizado usando coloração de imunofluorescência com um anticorpo C16 ou o anticorpo A18 usados para produzir os variantes escape.

Vírus variantes que exibem uma mudança no epítopo TAV não pode mais ser corada usando o anticorpo A18.

Histórico de repique

Tabela 3: Históricos de repique dos vírus escape "Riems" de cepa C

Caracterização dos variantes escape B5/2, 116, Q7, S10 e 011

Os variantes escape isolados foram sequenciados na região das proteinas El e E2. Várias colorações de 5 imunofluorèscência foram realizados usando os anticorpos A18-idexx, A18-bommeli, A18-ceditest e o anticorpo Cl 6. Os variantes escape foram repicados em ambas as garrafas de cultura de células (todas), além das culturas em tambor (Q7, S10, 011) e foram subsequentemente sequenciados, diferenciadamente corada e titulada.

Q7 especifico RT-PCR em tempo real

A fim de testar as características genéticas do. vírus e, portanto, testar uma das propriedades marcadoras da vacina, a detecção de RNA virai após a imunização com os variantes escape foi realizada usando primers e uma sonda, que foram capazes de distinguir os variantes escape do "Riems" original de cepa C e CSFV isolados do campo.

Estudo em animal 27/09 - Teste da resposta imune de Riems mutantes de cepa C B5/2-P6 e 116-P2

Nos presentes estudos em animal, três leitões foram imunizados com 2 ml de suspensão de vírus cada (sobrenadante de cultura de células) vía apj-icação int rarnuscular . O agrupamento dos animais foi reali zado como se segue : grupo A (B5/2) , grupo B (116) e o grupo controle Ri errts de cepa C (vacina de peste suína Riemser) . Os testes sorológicos da resposta imune foram reali zados para cada grupo .

Estudo em animal 06/10 - Teste dos variantes escape Q7. SlO e Qll

Os estudos em anímal a seguir foram realizados a f im de testar quaís variantes escape foram os maís promíssores nos porcos receptores em relação à ausência de um efeito peri goso e efi cáci a após a apl icação intFarrluscu1ar. 21 leitões de 8-9 semanas de idade (aprox . 15-2 0 kg) foram usados no estudo. Cada leitão foi imunizado com 2 x 105•0 KID50/ml, i.m. 5 grupos foram testados: Grupo 1 (5 porc-Qs) : mutantes cte cepa C variantes Q7-P7 (105t0 KID50/'ml) Grnpo 2 (5 porcos) : mutantes de cepa C variantes S1O-P8 (1Q'r° KID50/ml) Grupo 3 (5 porcos) : mutantes de cepa C variantes O11-P8 (1Q't° KID50/ml) Grupo 4 (3 porcos) : vacína de peste suína Ríemser (vírus bruto) Grupo 5 (3 porcos): grupo controle não imunizado Imunização e amostr agem de sangue; Odpv Amostragem de sangue (EDTA e Soro), imunização 7dpv Amostragem de sangue (EDTA) 14dpv Amostragem de sangue (EDTA e Soro) 21dpv Amostragem de sangue (EDTA e Soro) Dados relativos a temperatura do corpo e sintomas clínicos foram obtidos diariamente. Desafio: 2 8dpv Amostragem de sangue (EDTA e Soro), swab nasal Infecção-Desafio com o KSPV cepa Koslov altamente virulento (lx IO6'3 KID50) 4dpi Amostragem de sangue (EDTA e Soro), swab 7 dpi Amostragem de sangue (EDTA e Soro), swab nasal nasal swab lOdpi Amostragem de sangue (EDTA e Soro), nasal 14dpi Amostragem de sangue (EDTA e Soro), swab nasal 21 dpi Amostragem de sangue (EDTA e Soro), swab nasal 2 8 dpi Amostragem de sangue (EDTA e Soro), swab nasal

Estudo em animal 24/1 0 - Teste os ' variantes escape S10 e 011: proteção após a imunização oral

A fim de testar a eficácia da aplicação oral, o estudo animal a seguir foi realizado. 15 leitões foram usados como animais teste, que foram 8-10 semanas de idade (aprox. 15-20 kg). Grupo 1 (6 porcos): mutantes A cepa C variante S10 Grupo 2 (6 porcos): mutantes B cepa C variante 011 Grupo 3 (3 porcos): controle infeccioso (não vacinados) Imunizaçac 0 dpv ■ e amostragem de sangue: Amostragem de sangue (EDTA e Soro), swab nasal 1 4 dpv 2 8 dpv Amostragem Amostragem de de sangue sangue (EDTA e Soro), swab nasal 4 dpi Amostragem de sangue (EDTA e Soro), swab nasal 7 dpi Amostragem de sangue (EDTA e Soro), swab nasal 10 dpi Amostragem de sangue (EDTA e Soro) swab nasal 14 dpi Amostragem de sangue (EDTA e Soro) swab nasal 21 dpi Amostragem de sangue 28 dpi Amostragem de sangue Dados relativos a temperatura do corpo e sintomas clínicos foram obtidos diariamente.

Resultados experimentais Imunização de coelhos com o peptídeo TAV

Ambos os soro de coelhos (304 e 305) foram positivos nos testes ELISA E2 capazes de serem obtidos comercialmente após o terceiro tratamento de reforço (aprox. 12 semanas após a primeira imunização). No teste de neutralização do vírus ambos os soros verificaram-se positivos aproximadamente três semanas após o terceiro reforço. As titulações no teste de neutralização foram baixas e reduzidas após os adicionais 4°-6° reforços. Tabela 4: Caracterização dõ soro de coelho 304 e 305 após a imunização de peptídeo TAV

Isolamento de variantes escape E2 de vírus Riems de cepa C

A incubação de Riems de cepa C com anticorpos E2 específicos conduziu, após apenas uns poucos repiques, ao isolamento de variantes escape que exibiram uma substituição na região E2 na posição 2870. Foi importante para o isolamento de variantes adicionais que a mudança compensatória na proteína El na posição 21:22 também ocorresse, por exemplo, como no isolado 16P1. Se ambas as mudanças ocorreram simultaneamente, então apenas uns poucos repiques foram requeridos sob a pressão de anticorpo e de soro a fim de isolar variantes adicionais que adicionalmente exibiram uma substituição na posição 2889 na proteína E2. Alguns destes variantes escape demonstraram adicionalmente uma mudança na posição 3225 na proteína E2. Um exemplo de tal variante escape é o isolado B5/2, Representação esquemática do epitopo TAV do variante B5/2: Wildtyp C-Stamm: CTAVSPTTLRTEVVK Mutante B5/2: CTAVSSTTLRTGVVK O repique adicional isolado do B5/2 sob pressão de anticorpo conduz ao isolamento do isolado CB32. Este isolado exibiu adicionalmente mais uma substituição na proteína E2 (nucleotideo 2862), além da substituição compensatória na proteína El na posição 2899. O isolado CB32 resultou de uma mistura dos variantes B5/2 e um novo variante com a substituição adicional. A fim. de isolar os novos variantes que exibiram as substituições adicionais, o isolado CB32 foi repicado por repiques múltiplos sob pressão de anticorpo. A partir de um repique H15 subsequente e em conjunto, os isolados Q7, S10 e 011 foram isolados.

Veja Figura 1 para uma comparação de sequência do epítopo TAV do mutante S10, Oil e Q7. Veja Tabela 1 para uma revisão das substituições de nucleotideo e aminoácido nos variantes escape isolados.

Caracterização dos variantes escape B5/2. 116. Q7. 310 e 011

O teste dos variantes escape em relação a ligação de vários anticorpos E2 específicos foi realizado usando imunofluorescência. Tabela 5: Coloração de imunofluorescência indireta de variantes escape E2 selecionados com uma substituição na proteína E2

Na maioria dos casos, um único aminoácido substituição no epitopo TAV foi suficiente para fornecer um sinal negativo quando usando imunofluorescência com o anticorpo AlδBommeli. Variantes escape com duas mutações TAV (tal como B5/2) também mostraram negativo resultados com ambos os anticorpos AlδBommeli e A18C (Figura 2). Tabela 7: Coloração de imunofluorescência de repiques em particular de vários variantes escape E2, exibindo três substituições no epitopo TAV

Todos os isolados testados demonstraram sinais negativos para os repiques selecionados para as colorações A18. Entretanto no 8o repique do S10 isolado, uma pequena colônia foi possível de ser corada usando o anticorpo WH303. Isto suporta uma alta estabilidade das substituições no epitopo TAV. Testes estabilidade adicionais foram realizados para os isolados Q7, S10 e 011, usando culturas em tambor de mais de 10 repiques adicionais. Tabela 8: Coloração diferencial de repiques selecionados com os anticorpos A18 (idexx e bommeli e WH303 (VLA)). O C16 anticorpo específico NS3 (EURL) foi usado para fins de controle

EZ = umas poucas células individuais No 10° repique, não houve vírus variante que demonstrasse uma reversão, de modo que a coloração foi apenas possível com C16. O variante Q7 foi negativo para todas as 5 colorações até o 14° repique, pelo qual no. 16° repique foi também incapaz de ser detectado com o anticorpo Cl 6. Estes achados foram confirmados usando RT-PCR, além dos protocolos de sequenciamento de PCR. É, portanto, claro que nenhum vírus está presente no 16° repique, de modo que um erro de repique pode também ser excluído. Algumas células poderiam., entretanto, ser coradas nos 14° e 16θ repiques do S10 isolado usando o anticorpo Al8 (idexx) . Para o mutante 011, 16 repiques foram realizados antes de algumas células isoladas poderem ser coradas usando o A18 (bommeli) e WH303 anticorpos. Estes resultados demonstram a alta estabilidade das características sorológicas das vacinas virais como descrito no presente documento.

Caracterização dos variantes escape via sequenciamento de El e E2

Tabela 9: Sequenciamento de isolados anteriores exibindo um substituto no epítopo TAV da proteína E2

A substituição na posição 2870 foi mantida em todos os isolados após 10 repiques, que parece ser muito estável.

Isto suporta a conclusão que esta substituição em particular não tem grande efeito na estrutura da proteína, de modo que a reversão da sequência tipo selvagem não fornece vantagem. Tabela 10: Sequenciamento de isolados com 3 substituições no epítopo TAV E2

As mudanças na sequência nos isolados 011, S10 e Q7 toram estáveis para todos os repiques testados (14-17). Tabela 11: Sequenciamento dos isolados Q7, S10 e 011 após vários repiques em culturas em tambor

Todos os repiques de vírus sequenciado dos três variantes continham as substituições nas proteínas El e E2 que foram induzidas por pressão imune. O 16® repique de Q7 não poderia ser sequenciado, provavelmente porque nenhum vírus restou no sobrenadante de cultura de células (veja acima). No caso que vírus revertido apareça, que com base nas várias colorações na Figura 2 não pode ser excluído, eles são apenas detectáveis pelo sequenciamento como de uma percentagem determinada. A enorme maioria do vírus não é, entretanto, revertida e permanece substituída. Os únicos vírus individuais revertidos não poderiam ser detectados por sequenciamento.

Q7 específico RT-PCR em tempo real

A fim de diferenciar entre animais vacinados e infectados, um sistema RT-PCR foi aplicado. Uma vez que o epítopo TAV é altamente conservado em todos os vírus de CSF, as substituições no epítopo TAV foram usados como uma base para primers e sondas no ensaio PCR em tempo real. Tabela 13: RT-PCR em tempo real foi usado para controlar a carga de vírus. Os sistemas PCR a seguir foram aplicados: CSF Mix 1 (CSFV específico, reconhece todas as cepas), Q7-TAV (específico para os variantes) e mistura cepa C-TAV (cepa C tipo selvagem, com uma sensibilidade muito menor pode também ser detectada) . Os resultados são fornecidas como valores Ct (limite de ciclo).

A carga de vírus foi determinada usando RT-PCR em tempo real. 0 sistema CSF-Mix 1 reconheceu todas as cepas de CSFV e não diferenciou entre a cepa C tipo selvagem e os novos variantes escape. O sistema Q7-TAV reconheceu todos os três variantes escape especificamente. O sistema de cepa C TAV apenas reconheceu a cepa C tipo selvagem (nenhum dos variantes escape), com um valor Ct de aproximadamente 14.

A redução muito pequena na diferença nos valores Ct entre o sistema Q7-TAV RT-PCR e o sistema cepa C-TAV com o aumento de número de repiques fornece forte evidencia para uma quantidade muito pequena de revertidos após um alto número de repiques. Em geral, uma diferença entre os dois sistemas de 14 valores Ct representa uma razão de mutantes para revertidos de aprox. 1:8000, pelo qual um valor Ct de 10 representa uma razão de 1:1000.

Estudo em animal 27/09 - Exame da resposta imune de cepa C Riems mutantes B5/2-P6 e I16-P2

A imunização intramuscular foi realizada com 3 leitões, pelos quais cada leitão recebeu 2 ml da suspensão de vírus (sobrenadante de cultura de células) . 0 grupo A foi tratado com B5/2, o grupo B foi tratado com 116 e o grupo controle foi tratado com a vacina de peste suína Riemser. Os estudos fornecem a análise da resposta imune após a imunização, testam as propriedades marcadoras da vacinação após a resposta imune modificada (ELISA) e testam as propriedades do vírus em animais vacinados (estabilidade genética e propriedades de replicação).

Uma titulação de retorno dos vírus aplicados forneceu os seguintes resultados: B5/2-P6: Titulação do vírus IO4'2" vírus/ml I16-P2: Titulação do vírus 104'75 vírus/ml

Tolerância dos animais à vacina

Os porcos tratados não demonstraram sintomas óbvios após a imunização (sem febre ou sintomas de doença). O número de leucócitos não foi aumentado acima do normal para os primeiros 7 dias após a imunização.

O vírus não poderia ser isolado do sangue. 0 RNA isolado das amostras de sangue 4 dias e 7 após a imunização foi usado para análise de RT-PCR. O produto de PCR foi entretanto inadequado para um sequenciamento subsequente. Isto demonstra uma taxa de replicação do virus muito baixa nos animais.

Estudo em animal 06/10 - Teste os variantes escape Q7. S1O e 011

Titulação de retorno revelou as seguintes concentrações de vírus, que foram usados nos experimentos Q7-P8 104r0 Kl D so/ml S10-P8 104'25 KID.jõ/ml 011-P7 1Q4'25 KIDS0/ml Vacina de peste suina de cepa C 1Q2'25 KIDgo/ml

Após a imunização, não havia mudanças nem na temperatura do corpo nem sintomas de doença típicos para peste suína para ser encontrado.

Análise clínica após a infecção desafio

A febre foi definida como uma temperatura retal do corpo de >4 0°C por pelo menos dois dias sucessivos. grupos foram testados: Grupo 1 (5 porcos): mutantes de cepa C variantes Q7-P7 (1O5'° KID5Q/ml) Grupo 2 (5 porcos) : mutantes de cepa C variantes S10-P8 (105'θ KID5o/ml) Grupo 3 (5 porcos) : mutantes de cepa C variantes 011-P8 (105r0 KID50/ml) Grupo 4 (3 porcos): vacina de peste suína Riemser (vírus bruto) Grupo 5 (3 porcos): grupo controle não imunizado

No grupo 1, o aumento esporádico das medidas de temperatura entre o 3o e 13® dia após a infecção desafio, que não foram, entretanto, relacionadas a qualquer outra perturbação visível no bem-estar dos animais. Apenas animal número 4 demonstrou febre de mais de 4 dias.

O grupo 2 exibiu esporádicos aumentos na temperatura em 3 animais tratados, no qual o animal número 9 demonstrou significativas temperaturas altas.

No grupo 3 apenas animal número 14 demonstrou um aumento da temperatura do corpo com febre no 4° e no 5o dia após a infecção desafio.

Os animais do grupo 4 não demonstraram febre, nos quais um aumento esporádico temperatura foi medidos em 2 animais tratados.

Todos os animais do grupo 5 demonstraram febre entre o 2o e o 7o dia após a infecção. Devido aos significativos sintomas de peste suína todos os animais do grupo 5 foram sacrificados 7 dias após a infecção. Os sintomas mais comuns foram os efeitos ao sistema nervoso central (paralisia do membro posterior e ataxia, diarreia, conjuntivite e sonolência). Um animal demonstrou hematoma na pele

O vírus foi incapaz de ser isolado de animais imunizados de swabs nasais, em que os animais controle não vacinados testaram positivo 7 dias após a infecção.

Resultados RT-PCR com amostras de soro

Os resultados RT-PCR demonstraram que após 14 dias após a infecção apenas sinais muito fracos puderam ser obtidos de animais imunizados quando testado para a presença do vírus associado com a doença virulento. Entretanto, os animais controle não vacinados demonstraram fortes sinais positivos com valores Ct positivos de 30 ou menos, 3 dias após a infecção. Os valores Ct de animais não vacinados caíram para 17 após 7 dias.

Resultados de RT-PCR dos swabs nasals

Os resultados de RT-PCR de animais imunizados foram unicamente negativos. Os animais controle não vacinados, entretanto, demonstraram um sinal ositive forte com valores Ct entre 25 e 28, 7 dias após a infecção.

Teste de neutralização de vírus com CSFV Alfort

O teste de neutralização de vírus se refere a determinação de se os animais (sejam vacinados ou não

vacinados) exibem anticorpos que são capazes de neutralizar um virus virulento. Todos os grupos imunizados mostraram anticorpos de neutralização 21 dias após a imunização. 7 dias após a infecção o teste de neutralização de vírus, a titulação contra Alfort foi 640 ND50 ou mais, em todos os grupos imunizados. Um animal no grupo imunizado 011 e um animal no grupo controle de cepa C exibiram uma titulação de 480. Os animais controle não imunizados não exibiram titulação do vírus contra Alfort em VNT.

Teste de neutralização cio vírus (VNT) com CSFV Rõsrath

Veja Figura 3 para VNT com a cepa de CSFV Rõsrath. Três semanas após a imunização de todos os animais, com a exceção de um animal no grupo S10 e um. animal no grupo 011, mostraram anticorpos de neutralização. 7 dias após a infecção os animais imunizados demonstraram em geral uma titulação VNT de 640 ou maior. A menor titulação foi 320, mostrada por um animal no grupo imunizado mutante TAV. Os animais controle não imunizados não exibiram titulação em VNT contra Rõsrath.

ELISA E2 (idexx)

O ELISA E2 é um kit ELISA comercialmente disponível para teste para a presença da peste suína clássica. Na média, os animais imunizados com cepa C mostraram resultados positivos no ELISA E2 21 dias após a imunização. Os animais imunizado com mutantes TAV também mostraram resultados positivos após 7 dias no ELISA E2 idexx. O grupo controle não imunizado não mostrou anticorpos detectáveis após a infecção.

Veja Figura 4 para o ELISA E2 Idexx com soro de porco.

No ELISA E2, os resultados para mutantes TAV antes infecção foram positivos, porém não fortes, enquanto que após a infecção os resultados se tornaram fortemente positivo, o que sugere um forte efeito de reforço. Os animais controle imunizados com cepa 0 foram fortemente positivos no ELISA E2 antes da infecção.

Os resultados dos animais imunizado com o mutantes TAV são comparáveis com os animais imunizado com o grupo controle de cepa C. O isolamento do vírus após a infecção foi negativo e os resultados do RT-PCR foram questionáveis ou fracamentè positivo, que foi também demonstrado no grupo controle de cepa C. Todos os animais exibiram titulações altas no teste de neutralização de vírus contra Alfort, além do Rosrath. Todos os animais imunizados demonstraram proteção completa contra a cepa de vírus infecciosa Koslov quatro semanas após a imunização intramuscular.

Estudo em animal 24/10 - Teste dos variantes escape S10 e Qll: proteção após a imunização oral

A fim de testar a eficácia da aplicação oral, o estudo animal a seguir foi realizado. 15 leitões foram usados como animais teste, que tinham 8-10 semanas de idade (aprox. 15-20 kg).

Dose da vacinação e modelo experimental: Grupo 1 (6 porcos) : mutantes A cepa C variante S10 (105 Kl D so /ml) Grupo 2 (6 porcos) : mutantes B cepa C variante 011 (104 KIDs.ó/ml) Grupo 3 (3 porcos) : controle infeccioso (não vacinados) Grupo 1: Todos os animais deste grupo foram completamente protegidos antes da infecção desafio. Nenhum sintoma associado de doença foi detectado. Todos os animais mostraram anticorpos de neutralização, que foram detectáveis por ambos os testes VNT e ELISA. Grupo 2: Os animais no Grupo 2 demonstraram uma mistura de proteção e infecção. 2 animais demonstraram sintomas de doença, tais como febre alta e outros sintomas típicos da peste suína. Os animais afetados foram sacrificados. Os animais protegidos mostraram anticorpos de neutralização, que foram detectáveis por ambos os testes VNT e ELISA. Grupo 3: Todos os animais foram infectados e mostraram sintomas de doença. Os animais afetados foram sacrificados.

O estudo de imunização oral demonstra que a imunização oral, especialmente usando o mutante S10, conduz a proteção eficaz da infecção. 0 isolado 011 também demonstrou resultados benéficos, considerando que a dose de vacinação foi reduzida em comparação ao vírus S10 administrado.

Literatura:

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Kortekaas et al, Rational design of a classical swine fever C-strain vaccine virus that enables the differentiation between infected and vaccinated animals, 200 9. L.G. Holinka et al: Development of live attenuated antigenic marker classical swine fever vaccine, Virology, 200 9. Hulst et al, Passage of Classical Swine Fever Virus in Cultured Swine Kidney Cells Selects Virus Variants That Bind to Heparan Sulfate due to a Single Amino Acid Change in Envelope Protein Erns, Journal of Virology, Oct. 2000, p.9553-9561 Vol. 74, No. 20.

Claims

1. VACINA MARCADA PARA TRATAMENTO PROFILÁTICO DA PESTE SUÍNA CLÁSSICA compreendendo o vírus vivo atenuado e modificado da peste suína clássica, caracterizada por a sequência viral de aminoácidos do epítopo TAV da proteína E2 compreender uma sequência diferente daquela de um vírus de peste suína clássica do tipo selvagem, por meio da qual a sequência viral de aminoácidos exibe pelo menos uma das seguintes substituições com referência ao vírus “Riems” de cepa C: - substituição do aminoácido 830 por valina, - substituição do aminoácido 833 por serina, - substituição do aminoácido 839 por glicina.

2. VACINA MARCADA, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por o vírus modificado não exibir sequências de ácido nucléico recombinante.

3. VACINA MARCADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a sequência de nucleotídeo viral exibir uma ou mais das seguintes substituições com referência ao vírus “Riems” de cepa C: - substituição na posição de nucleotídeo 2862 por T, - substituição na posição de nucleotídeo 2870 por T, - substituição na posição de nucleotídeo 2889 por G.

4. VACINA MARCADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a sequência viral de aminoácidos exibir uma ou mais das seguintes substituições com referência ao vírus “Riems” de cepa C: - substituição do aminoácido 426; na proteína ERNS; por valina, - substituição do aminoácido 576; na proteína E1; por histidina, - substituição do aminoácido 583; na proteína E1; por ácido glutâmico, - substituição do aminoácido 951: na proteína E2; por isoleucina.

5. VACINA MARCADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a sequência de nucleotídeo viral exibir uma ou mais das seguintes substituições com referência ao vírus “Riems” de cepa C: - substituição na posição de nucleotídeo 1649 por G, - substituição na posição de nucleotídeo 2099 por C, - substituição na posição de nucleotídeo 2122 por G, - substituição na posição de nucleotídeo 3225 por T.

6. VACINA MARCADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a sequência viral de aminoácidos do epítopo TAV compreender a sequência de acordo com SEQ ID NO. 3 ou SEQ ID NO. 4.

7. VACINA MARCADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a sequência de nucleotídeo viral compreender a sequência de acordo com SEQ ID NO. 1.

8. VACINA MARCADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por os indivíduos tratados com a vacina poderem ser diferenciados dos indivíduos infectados com o vírus associado a doença da peste suína via a análise de amostras biológicas obtidas dos ditos indivíduos usando métodos analíticos genômicos e/ou sorológicos.

9. VACINA MARCADA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por o método analítico genômico ser baseado na reação em cadeia polimerase (PCR), de preferência PCR em tempo real, pelo quais primers e/ou sondas que reconhecem ou a sequência de nucleotídeo viral modificada e/ou associada com a doença são usados.

10. VACINA MARCADA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por o método analítico sorológico ser baseado em um imunoensaio enzimático (EIA), de preferência um imunoensaio de absorção por acoplamento enzimático (ELISA), pelo quais os anticorpos que se ligam especificamente ou o epítopo TAV modificado e/ou associado com a doença são usados.

11. VACINA MARCADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por ser capaz de ser obtida pela geração de variantes escape viral de cepas associadas com a doença ou outras cepas conhecidas de peste suína viral pela aplicação de pressão de anticorpo.

12. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE UMA VACINA DE UMA CEPA DE VÍRUS MODIFICADO, VIVO E ATENUADO DA PESTE SUÍNA CLÁSSICA, caracterizado por compreender a geração de variantes escape de cepas associadas com a doença ou outras cepas conhecidas de peste suína clássica viral pela aplicação de pressão de anticorpo.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o método compreender: - repique múltiplo de células, de preferência células de rim de porcos em estágio embrionário infectadas com o vírus associado a doença da peste suína em cultura de célula, e - aplicação simultânea de anticorpos 5 dirigidos contra o epítopo TAV da proteína E2 do vírus associado a doença da peste suína e/ou soro de coelho imunizado de peptídeo-CTAVSPTTLRTVVK policlonal.

14. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a vacina marcada de acordo com qualquer uma 10 das reivindicações 1 a 11 e ter um carreador farmaceuticamente aceitável.

15. VACINA MARCADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por ser para o tratamento profilático (vacinação) da peste suína 15 clássica.