TW201617448A - 作為對抗腸病毒感染之免疫原的病毒顆粒及其製造 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種作為對抗腸病毒感染之免疫原的病毒顆粒及其製造方法。具體而言，本發明特徵在於使用人胚腎293(HEK293)細胞以製造腸病毒A型之病毒顆粒，具體而言係指克沙奇病毒A6(CVA6)顆粒、或克沙奇病毒A10(CVA10)顆粒、或兩者皆包含、及其他可選之腸病毒A型病毒顆粒，像是克沙奇病毒A16(CVA16)、及/或腸病毒A71(EV71)。令人驚訝的是，於HEK293細胞中所能收獲之病毒顆粒相當高，且可有效誘發對抗腸病毒感染之免疫反應，特別是對CVA6及CVA10。本發明亦關於一種對抗腸病毒感染之人用免疫組合物，包含如本文所述之病毒顆粒，以及一種預防腸病毒感染或其所造成疾病之方法，具體而言係指手足口病(Hand-Food-Mouth disease；HFMD)，該方法係藉由施予該免疫組合物給有需要之個體。
Description
本發明關於一種作為對抗腸病毒感染之免疫原的病毒顆粒，及藉由使用人胚腎293(HEK293)細胞製造該病毒顆粒之方法。本發明亦關於一種對抗腸病毒感染之人用免疫組合物，及一種誘發對抗腸病毒感染、或其所造成疾病之免疫反應的方法，具體而言係指手足口病(HFMD)。
腸病毒，屬於微小核糖核酸病毒科，是一種含有正股RNAs之小型、無封套的病毒。腸病毒屬目前包含12種：腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C、腸病毒D、腸病毒E、腸病毒F、腸病毒G、腸病毒H、腸病毒J、鼻病毒A、鼻病毒B、及鼻病毒C。該等病毒感染腸道可造成各種類型的疾病。典型腸病毒疾病為腦膜炎、麻痺、心肌炎、手足口病(HFMD)、皰疹性咽峽炎、胸膜痛、肝炎、皮疹及呼吸性疾病，包含肺炎。目前供人類使用之唯一的腸病毒疫苗為脊髓灰質炎病毒疫苗，其屬於腸病毒C。目前尚無可供人類使用之抗非脊髓灰質炎腸病毒之疫苗。
腸病毒具有一RNA基因體，包括5端非轉譯區(untranslated region；UTR)，蛋白編碼區、3端非轉譯區(UTR)，及一不同長度之poly-A尾，其位於3端。RNA基因體大小為7.4Kbp，以及該單一的開放閱讀框架(open reading frame；ORF)編碼一聚合蛋白。該聚合蛋白被再分作三區，P1、P2及P3。P1編碼
四種病毒結構蛋白VP4、VP2、VP3及VP1，而P2及P3編碼七種非結構性蛋白2A至2C，以及3A至3D。克沙奇病毒被分為A群有23種血清型(1~22、24)、及B群有6種血清型(1~6)(Knipe and Howley,2001)。近來，人類清道夫受體B類成員2(SCARB2)被發現為EV71及CVA16感染之重要受體(Yamayoshi et al.,2009)。
基於台灣定點醫療監測，進行系統性分析主要之腸病毒血清型的流行病學，並監控台灣之腸病毒感染(Tseng et al.,2007)。資料顯示每年有不同的流行腸病毒血清型，特別是CVA16及EV71，其主要以手足口病(HFMD)方式出現。相對於CVA16及EV71，其他常見於周遭之血清型，包括E30、E6、E11、CB3、CB4、CB5、CVA4、CVA6及CVA10，於2000~2005年間已被發現可造成HFMD爆發。此研究亦證實該等血清型反覆循環的流行病模式對公共健康有很大的影響。目前尚不清楚，於不同基因型及/或血清型亞型間之交叉保護程度(Tseng et al.,2007)。根據台灣疾病管制中心的資料，除了CVA16及EV71以外，於2001~2008年間，CVA6通常為台灣5個最主要常見之腸病毒血清型之一(Lo et al.,2011)。
於新加坡，2001~2007年間，發現部分高峰之非EV71 HFMD活性係由CVA6及/或CVA10或CVA16所造成(Ang et al.,2009)。主要的血清型為CVA10(39.9%)及CVA6(28%)，接著為CVA16(17.5%)及EV71(6.3%)。於西班牙，於2010及2012年間，有許多HFMD爆發及偶發之病例。可於53個病患中偵測到腸病毒(66%)。CVA6為最常見之基因型，接著為CVA16及EV71，但是其他較不主流的類型也有被發現過。有趣地，於2010間，於一開始時，CVA16為HFMD之唯一致病因子，但於該年末時，CVA6變得主要，且於2011年間尚無法偵測到CVA16。於2012年，則CVA6及CVA16則一起流行了。於2012年，與HFMD症狀有關之EV71僅有三個病例(Cabrerizo et al.,2013)。於台灣近來發生CVA6 HFMD爆發，且部分病患被發現具有脫甲症及脫皮，接著HFMD(Wei et al.,2011)。綜合
目前流行病學結果，HFMD之主要致病原為CVA16、EV71、CVA6及CVA10(Kaminska et al.,2013)。
於感染過程中，雖然CVA6及CVA10造成神經性疾病之傾向差，但該等病毒仍可誘發紅疹、口腔粘膜疹及脫甲症。先前研究已發展以福馬林去活化之EV71疫苗(Chou et al.,2013及Zhu et al.,2013)，發現對於CVA16感染不具保護力(Chong et al.,2012)。對於CVA6及CVA10，沒有先前研究報告有適用的細胞株可用於生產病毒顆粒以供人類疫苗製造。
WO 99/53034提供修飾的病毒基因體，以作為疫苗或載體，其改進基因體之能力，以保留弱化的突變。WO2010139193 A1揭示了以去活化純化之EV71病毒B型及C型及CoxA16病毒以製備之手足口病疫苗。US20120045468 A1提供抗EV71感染之免疫組合物(如疫苗)及其相關方法。
目前仍需要發展一種候選疫苗以對抗腸病毒A型，特別係指CVA6或CVA10或兩者。
本發明發展了一種藉由培養腸病毒於人胚腎293(HEK293)細胞中，以生產腸病毒A型之病毒顆粒的技術，特別是指CVA6或CVA10。當與先前研究使用Vero細胞者相比較時，於HEK293細胞中病毒顆粒之產量令人驚訝的高，且可有效誘發免疫反應對抗腸病毒感染。藉此所製備之病毒顆粒可被作為有效的免疫原及可用於製備免疫組合物，以對抗腸病毒感染，特別是可供人類使用。
於一方面，本發明提供一種製造對抗腸病毒感染之免疫原的方法，包含：
(a)於人胚腎293(HEK293)細胞之第一培養物中生成克沙奇病毒A6(CVA6)病毒顆粒，並從該第一培養物中，收集該CVA6病毒顆粒；或(b)於人胚腎293(HEK293)細胞之第二培養物中生成克沙奇病毒A10(CVA10)病毒顆粒，並從該第二培養物中，收集該CVA10病毒顆粒；或(c)同時進行步驟(a)及(b)。
於另一方面中，本發明提供一種對抗腸病毒感染之免疫組合物，包含CVA6病毒顆粒或CVA10病毒顆粒或兩者兼具。
本發明亦提供本文所述之免疫組合物之用途，係用於製備人類疫苗以對抗腸病毒感染或其所造成之疾病。
於又一方面中，本發明提供一種誘發免疫反應以對抗腸病毒感染之方法，包含施予有需要之個體一有效量之免疫組合物，其包含本文所述之CVA6病毒顆粒或CVA10病毒顆粒、或兩者兼具。
於部分具體實施例中，該CVA6病毒顆粒及CVA10病毒顆粒係自HEK293細胞之培養中所製備及收集而得，並進行混合後以形成多價免疫組合物。
於部分具體實施例中，本文所述之CVA6病毒顆粒及CVA10病毒顆粒，進一步可與除了CVA6及CVA10以外之腸病毒A型病毒顆粒結合，以形成多價免疫組合物。
於部分具體實施例中，該除了CVA6及CVA10以外之腸病毒A型，係選自由克沙奇病毒A2(CVA2)、克沙奇病毒A3(CVA3)、克沙奇病毒A4(CVA4)、克沙奇病毒A5(CVA5)、克沙奇病毒A7(CVA7)、克沙奇病毒A8(CVA8)、克沙奇病毒A12(CVA12)、克沙奇病毒A14(CVA14)、克沙奇病毒A16(CVA16)、腸病毒A71(EVA71)、腸病毒A76(EVA76)、腸病毒A89(EVA89)、腸
病毒A90(EVA90)、腸病毒A91(EVA91)、腸病毒A92(EVA92)、腸病毒A114(EVA114)及腸病毒A119(EVA119)所組成之群組。
於部分實例中，該除了CVA6及CVA10以外之腸病毒A型係選自由CVA16及EV71及其組合所組成之群組。
於部分實例中，本發明之病毒顆粒，係自HEK293細胞培養中所製備及收集而得。
於部分具體實施例中，本發明之病毒顆粒，待從細胞培養中收集後，進行純化及/或去活化。
於部分具體實施例中，藉由蔗糖梯度分層超速離心進行純化。
於部分具體實施例中，該去活化係以福馬林處理進行。
本發明亦提供一種抗體，係可直接辨識本發明之經HEK293細胞培養中所製備之腸病毒A型病毒顆粒。
本發明將一種或多種詳細具體實施例詳列於以下說明中。本發明之其他特徵或特點將可藉由以下各種具體實施例之詳細說明及所附之申請專利範圍，得以更明瞭。
先前發明內容，以及以下之本發明之詳細說明，可搭配所附之圖式閱讀，以得到更佳之了解。本發明於圖式所呈現之較佳具體實施例僅用於闡述之目的。應明瞭的是，本發明並不局限於所示之該等精確之排列及手段。
於圖式中：圖1顯示以CVA6、CVA10、CVA16及EV71感染之RD及Vero細胞培養(感染後5天)。
圖2顯示於點漬法中，以CVA6、或CVA10、或CVA16或EV71感染之Vero細胞培養中，以單株抗體(N1及MAB979)所測得之有表現的病毒蛋白。
圖3顯示CVA6及CVA10僅感染HEK293細胞(感染後6天)。
圖4顯示(A)以蔗糖梯度分層超速離心純化CVA6病毒；(B)以SDS-PAGE分析之每一個區份的銀染結果。
圖5顯示(A)以蔗糖梯度分層超速離心純化CVA10病毒；(B)以SDS-PAGE分析之每一個區份的銀染結果。
圖6顯示CVA6及CVA10之空的顆粒(圖6A及圖6B)，及經福馬林去活化完整顆粒(圖6C及圖6D)之部分不規則之正二十面體顆粒結構，兩者十分相似。
圖7顯示CVA6、CVA10及EVA71病毒顆粒之蛋白條帶。
圖8顯示藉由點漬分析顯示，病毒及小鼠抗血清間之辨識能力。將四種福馬林去活化病毒顆粒(CVA6、CVA10、CVA16及EV71)直接滴至用於點漬分析之硝化纖維膜上。
除非另有定義，所有本文中所用之技術及科學性術語，具有與本領域技藝者所習知者相同意義。
本發明至少部分基於不可預期之發現，即克沙奇病毒株CVA6及CVA10，不像EVA71及CVA16，不會感染用於生產人用疫苗之細胞株，像是Vero細胞、MRC-5細胞及MDCK細胞；相反地，該等病毒(CVA6及CVA10)可於HEK293細胞中複製的很好。該病毒力價可達到106至108TCID50/ml。因此，吾人於世上首次發現以HEK293細胞用於生產、純化及分析所產生之不同CV病毒株之特性，藉此提供一於HEK293細胞中，用於生產腸病毒A型病毒顆粒之技術，
特別係指CVA6及CVA10之腸病毒。本發明之病毒顆粒可做為有效之免疫原，且可用於製備免疫組合物，特別可供人類使用，以對抗腸病毒感染，包括CVA6或CVA10或兩者、或其他除了CVA6或CVA10以外之腸病毒A型，像是CVA16或EVA71。
整篇說明書中之說明及申請專利範圍，用語「包含」及該用語之其他形式，像是「含有」及「包括」代表了「包含但不限於」，且並非用於排除，舉例來說，其他添加物、元件、整數或步驟。
如本文所使用之單數形式「一」、「一個」及「該」，包括複數形式，除非文中有特別指出者例外。
如本文所使用，腸病毒A型包括以下血清型：克沙奇病毒A2(CVA2)、克沙奇病毒A3(CVA3)、克沙奇病毒A4(CVA4)、克沙奇病毒A5(CVA5)、克沙奇病毒A6(CVA6)、克沙奇病毒A7(CVA7)、克沙奇病毒A8(CVA8)、克沙奇病毒A10(CVA10)、克沙奇病毒A12(CVA12)、克沙奇病毒A14(CVA14)、克沙奇病毒A16(CVA16)、腸病毒A71(EVA71)、腸病毒A76(EVA76)、腸病毒A89(EVA89)、腸病毒A90(EVA90)、腸病毒A91(EVA91)、腸病毒A92(EVA92)、腸病毒A114(EVA114)及腸病毒A119(EVA119)。
如本文所使用，「病毒顆粒」乙詞可代表病毒之完整的或部分組裝之殼體，可包括空的顆粒、完整顆粒、或次顆粒。
如本文所使用，「空的顆粒」乙詞係指一病毒顆粒不含有核酸、載體或質體、以及不具感染性。
如本文所使用，「完整顆粒」乙詞係指一病毒顆粒含有遺傳物質，及四種殼體蛋白(即VP1、VP2、VP3及VP4)。一般而言，VP1具有32~35kDa分子量(SEQ ID NO：4、5或6)、VP2具有24~28kDa分子量(SEQ ID NO：7、8或9)、
VP3具有24~28kDa分子量(SEQ ID NO：10、11或12)、VP4具有6~8kDa分子量(SEQ ID NO：13、14或15)。
如本文所使用，「次顆粒」乙詞係指病毒空的顆粒之不具感染性的次顆粒。具體而言，該次顆粒係指一病毒顆粒具有與完整顆粒者不同殼體蛋白組成。例如，一次顆粒可(1)含有少於VP1、VP2、VP3及VP4之殼體蛋白、(2)含有多於VP1、VP2、VP3及VP4之殼體蛋白，及/或(3)含有一個或多個不完整切割過程之殼體蛋白。
如本文所使用，該「抗原」係指一顆粒或一分子含有一種或多種抗原決定基，其可刺激宿主免疫系統，以造成體液及/或細胞抗原專一反應。「抗原」乙詞與「免疫原」可互換使用。於體內或體外，當與適當細胞接觸後之結果，抗原會誘發敏感性或免疫反應，且以一種可觀察到之方式，與經敏感化之個體的抗體或免疫細胞反應。於生物體中，一抗原可專一地被抗體辨識及結合。與主要組織相容性複合體(MHC)結合之抗原可被辨識，且可被T淋巴球(T細胞)表面之受體所結合，進而誘導T細胞活化。本文所使用之「抗原決定基」乙詞，係指抗原上一位置，可為一專一性抗體分子或T細胞受體所結合。本文所用之術語可與「抗原性決定原」或「抗原決定位置」互換。
如本文所使用，「免疫反應」或「免疫原性反應」乙詞係指一個體之免疫系統對於抗原所產生之任何反應。於脊椎動物的免疫反應之例子包括但不限於，抗體生成、誘發細胞媒介免疫力、及補體活化。以相同抗原反覆刺激之免疫反應，亦稱二級免疫反應，其反應較初級免疫反應要快。「免疫原性」乙詞係指於宿主動物中，可產生對抗一種抗原或多種抗原之免疫反應之能力。此免疫反應可由疫苗誘發形成一基礎的保護性免疫力，以對抗一特定的感染性生物體。
如本文所使用，「抗體」乙詞係指一免疫球蛋白分子、或免疫球蛋白分子之至少一種免疫原性活性部分，其具有專一的胺基酸序列，且僅可與一抗原或一群彼此近似的抗原結合。抗體的實例包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分之實例，包括Fab及F(ab)'2片段，其可藉由使用酵素(像是胃蛋白酶)處理抗體後以生成。抗體可為單株抗體或多株抗體。「單株抗體」係指一群抗體分子，僅含有一種抗原結合位置，且可與特定抗原決定基進行免疫反應。「多株抗體」係指一群抗體分子，含有多於一種以上之抗原結合位置，且可與多胜肽上之多於一種的抗原決定基進行免疫反應。
如本文所使用，「佐劑」乙詞係指一物質被加入免疫組合物(像是疫苗)中，其本身不具有任何特定的抗原性效果，可刺激免疫系統，並增加該免疫組合物之免疫反應。佐劑的實例包括但不限於鋁鹽、佛氏完全佐劑、佛氏不完全佐劑、單磷脂A/海藻糖二桿菌分枝菌酸酯(trehalose dicorynomycolate)佐劑、含有短小棒桿菌之油包水乳劑、及tRNA、及其他可完成增加免疫反應任務之物質，其藉由模仿進化保守分子之特定位置，包括微脂粒、脂多醣(LPS)、抗原的分子籠、細菌細胞壁的成分、及內胞飲之核酸，像是雙股RNA、單股DNA、及未甲基化之含有DNA的CpG雙核苷酸。其他實例包括霍亂毒素、大腸桿菌熱分解之腸毒素、微脂體、免疫刺激複合物(ISCOM)、免疫刺激性序列寡去氧核苷酸、及氫氧化鋁。該組合物亦可包括一促進活體內運送之聚合物。請參閱Audran et al.Vaccine 21：1250-5,2003；及Denis-Mize et al.Cell Immunol.,225：12-20,2003。此外，本文所述之抗原可不使用任何佐劑以製成疫苗。
如本文所使用，「有效量」乙詞係指可給予所欲效果之劑量，其可選擇地為治療效果、或預防效果。例如，有效量為活性物質的劑量，於接受者體內，可足以生成或誘發免疫反應以對抗病原菌(如腸病毒)。基於不同原因，該治療有效量可能會改變，像是施予路徑、頻率、體重及接受該醫藥之個體物
種、以及施予之目的。該領域具有技藝者可基於本文所揭示者、建立之方法及其個人經驗，於不同狀況下，決定該劑量。
於一方面，本發明提供一種製造對抗腸病毒感染之免疫原的方法，包含：(a)於人胚腎293(HEK293)細胞之第一培養物中生成克沙奇病毒A6(CVA6)病毒顆粒，並從該第一培養物中，收集該CVA6病毒顆粒；或(b)於人胚腎293(HEK293)細胞之第二培養物中生成克沙奇病毒A10(CVA10)病毒顆粒，並從該第二培養物中，收集該CVA10病毒顆粒；或(c)同時進行步驟(a)及(b)。
具體而言，於HEK293細胞中生成病毒顆粒，該細胞與所欲之腸病毒接觸後，可於HEK293細胞產生病毒感染；將該感染細胞培養一段足夠時間後，確保可生成該病毒顆粒；接著將所生成之病毒顆粒收集，其可作為一免疫原，以對抗腸病毒感染。更具體而言，於感染前，約需3~7天培養時間，將細胞培養達到密度約每mL中有105至106個細胞，接著將細胞以MOI(感染複數)約為10-2至10-5之病毒進行感染，並培養約3~7天。接著從培養上清液中收獲及收集病毒顆粒，並進行接續之處理，像是濃縮、純化、及/或去活化。
於部分具體實施例中，該細胞培養係於無血清培養基中進行。
於部分具體實施例中，該細胞培養係於轉瓶、細胞工廠、及/或生物反應器中進行。
具體而言，本發明之方法進一步包含將CVA6病毒顆粒與CVA10病毒顆粒結合，以形成一多價免疫組合物。
於部分具體實施例中，本發明方法包含將CVA6病毒顆粒或CVA10病毒顆粒、或兩者與其他除CVA6及CVA10以外的腸病毒A型病毒顆粒結合，以形成一多價免疫組合物。
於特定具體實施例中，該除了CVA6及CVA10以外之腸病毒A型係選自由：克沙奇病毒A2(CVA2)、克沙奇病毒A3(CVA3)、克沙奇病毒A4(CVA4)、克沙奇病毒A5(CVA5)、克沙奇病毒A7(CVA7)、克沙奇病毒A8(CVA8)、克沙奇病毒A12(CVA12)、克沙奇病毒A14(CVA14)、克沙奇病毒A16(CVA16)、腸病毒A71(EVA71)、腸病毒A76(EVA76)、腸病毒A89(EVA89)、腸病毒A90(EVA90)、腸病毒A91(EVA91)、腸病毒A92(EVA92)、腸病毒A114(EVA114)及腸病毒A119(EVA119)所組成之群組。
於特定具體實施例中，該其他除了CVA6及CVA10以外之腸病毒A型之病毒顆粒係選自由CVA16及EV71及其組合所組成之群組。
於特定具體實施例中，CVA6或CVA10或其他腸病毒A型之病毒顆粒係由HEK293細胞之培養中所生成。特定而言，該等不同腸病毒之病毒顆粒係分別自HEK293細胞之個別培養中所生成及收集，接著將所收集之病毒顆粒結合在一起以形成一多價免疫組合物。
於一特定具體實施例中，本發明提供一種製備對抗腸病毒感染之多價免疫組合物的方法，包含以下步驟：(a)於HEK293細胞之第一培養物中生成CVA6病毒顆粒，並從第一培養物中收集CVA6病毒顆粒；(b)於HEK293細胞之第二培養物中生成CVA10病毒顆粒，並從第二培養物中收集CVA10病毒顆粒；(c)於HEK293細胞之第三培養物中生成CVA16病毒顆粒，並從第三培養物中收集CVA16病毒顆粒；(d)於HEK293細胞之第四培養物中生成EVA71病毒顆粒，並從第四培養物中收集EVA71病毒顆粒；及
(e)結合CVA6病毒顆粒、CVA10病毒顆粒、CVA16病毒顆粒、及EVA71病毒顆粒，以形成多價免疫組合物。
於部分實例中，各種腸病毒之病毒顆粒係本質上等重量比例結合。例如，本發明之多價免疫組合物可包含四種腸病毒病毒顆粒，CVA6病毒顆粒、CVA10病毒顆粒、CVA16病毒顆粒、EV71病毒顆粒，其間之重量比為1：1：1：1。該比例可因應所需調整。
「多價免疫組合物」乙詞意指其可刺激宿主之免疫反應，以生成特定的免疫反應，以對抗兩種或多種病毒株或血清型。
於部分具體實施例中，該CVA6或CVA10病毒顆粒或其他病毒顆粒(例如CVA16或EVA71病毒顆粒)進一步進行純化或去活化或兩者皆進行。
於部分具體實施例中，純化係藉由液相色譜純化法、蔗糖梯度超速離心純化、或其組合進行。較佳者，藉由蔗糖梯度超速離心以進行純化。更佳者，於蔗糖梯度超速離心純化中使用10~60%蔗糖密度梯度。
具體而言，進行純化以得到病毒之完整顆粒之區份、空的顆粒區份、及/或次顆粒(sub-particle)之區份。
於部分具體實施例中，完整顆粒之區份可於35~45%蔗糖梯度予以辨識。
於部分具體實施例中，空的顆粒區份可於25~35%蔗糖梯度中予以辨識。
於部分具體實施例中，該次顆粒區份可於低於25%蔗糖梯度予以辨識。
於部分具體實施例中，本發明免疫組合物可包含(i)CVA6之完整顆粒之區份、空的顆粒區份、次顆粒區份、或其任意組合；(ii)CVA10之完整顆粒之區份、空的顆粒區份、次顆粒區份、或其任意組合；(iii)除了CVA6及CVA10
以外之腸病毒A型(例如CVA16或EVA71)之完整顆粒之區份、空的顆粒區份、次顆粒區份、或其任意組合；或(iv)(i)、(ii)、及(iii)之任意組合。
於特定具體實施例中，該等病毒之次顆粒區份一般可將之移除，以收集完整顆粒之區份及空的顆粒區份。
於部分具體實施例中，腸病毒之空的顆粒被測得具有P1多胜肽，其是於病毒組裝及包裝過程中未完全處理所形成者，具有65-95kDa之分子量。於部分具體實施例中，腸病毒之完整顆粒被測得具有VP1(32-35kDa)、VP2(24-28kDa)、VP3(24-28kDa)及VP4(6-8kDa)。
具體而言，將所收集之病毒顆粒去活化，例如，藉由福馬林處理。於特定實例中，於20~45℃，以甲醛處理2~20天。
於另一具體實施例中，本發明方法進一步包含決定該純化腸病毒顆粒劑量之步驟。
以上所述的有效劑量之免疫原或組合物，可以非經腸道方式施予，如皮下注射、或肌肉注射。或是，其他施予方式包括栓劑及口服配方皆可適用。以栓劑而言，結合劑及載劑可包括，例如，聚烯烴基二醇、或三酸甘油酯。口服免疫原或組合物，可包括常用之賦形劑，像是醫藥級糖精、纖維素、碳酸鎂及其類似物。該等免疫原或組合物可為溶液、懸浮液、錠劑、藥九、膠囊、緩釋配方或粉末形式。
本發明之免疫原或免疫組合物所製備之疫苗，可以適用於該劑型配方之方式施予，以及該劑量是醫療有效的、具保護力的、及具免疫原性的。施予的量可取決於施予個體，包括，例如，個體免疫系統之合成抗體的能力，以及如有需要，以生成一細胞媒介之免疫反應。所需施予之活性成分的精確劑量，取決於專業人士之判斷。然而，適用劑量之範圍可由該領域具有技藝者來判定，且可能為本發明多胜肽的微克量。起始的施予及補強劑量之適用的間距
亦可變的，但可包括起始的施予後，緊接著另一施予。該疫苗之劑量亦可取決於施予路徑，且根據宿主大小而改變。
對病毒感染較敏感之個體(特別係指年輕孩童)，可由該領域所習知方法以找到，並施予本發明之組合物。本發明組合物之劑量取決於，例如，於特定抗原時，無論有無佐劑共同施予，以及無論共同施予之佐劑類型、無論施予之模式及頻率，皆可由該領域具有技藝者所判定。如有需要，可重複施予，此也可由該領域具有技藝者所決定。例如，一初始劑量可緊接著隔周的三次補強劑量。補強注射可於初次免疫4~8周後給予，以及使用相同配方於8~12周再給予二次補強。可從個體中取得血清或T細胞以測試由該組合物所誘發之抗該病毒之免疫反應。該等分析可對抗蛋白或感染之抗體或毒殺性T細胞之方法，為該領域所習知的。如有需要可給予額外的補強劑。藉由不同量之多胜肽/蛋白，該組合物的劑量、及施予之頻率、免疫計畫皆可適化，以誘發最佳之免疫反應。於大規模施予前，較佳係先進行效力測試。於效力試驗中，一非人類個體(如小鼠、大鼠、兔子、馬、豬、牛或猴子)可被以口服方式或非經腸道方式施予本發明組合物。經初次施予後，或適當之補強施予後，測試個體及對照個體(接受假的施予)皆以病毒攻毒以測試該組合物之效力。
於另一具體實施例中，本發明之免疫組合物進一步包含醫藥可接受佐劑。較佳者，該佐劑包含磷酸鋁。
於另一方面，本發明提供一種誘發免疫反應以對抗腸病毒感染之方法，包含施予有需求個體有效量之本發明的免疫原或免疫組合物。
於特定具體實施例中，該腸病毒感染係由腸病毒A型所造成，係選自由克沙奇病毒A2(CVA2)、克沙奇病毒A3(CVA3)、克沙奇病毒A4(CVA4)、克沙奇病毒A5(CVA5)、克沙奇病毒A6(CVA6)、克沙奇病毒A7(CVA7)、克沙奇病毒A8(CVA8)、克沙奇病毒A10(CVA10)、克沙奇病毒A12(CVA12)、克沙
奇病毒A14(CVA14)、克沙奇病毒A16(CVA16)、腸病毒A71(EVA71)、腸病毒A76(EVA76)、腸病毒A89(EVA89)、腸病毒A90(EVA90)、腸病毒A91(EVA91)、腸病毒A92(EVA92)、腸病毒A114(EVA114)及腸病毒A119(EVA119)所組成之群組。
本文所述之「個體」為人類或非人哺乳動物。非人哺乳動物包括但不限於靈長目、有蹄類、犬類及貓類。
具體而言，本發明之方法可有效提供保護性效果以對抗腸病毒感染，進而預防或治療由腸病毒感染所致之疾病，特別係指手足口病(HFMD)。
本發明亦提供一種單離之抗體，其可選擇性地與具有上述序列之一的胜肽或本文所述之病毒顆粒結合。本發明進一步提供一種產生抗體之方法，藉由使用前述之免疫原或免疫組合物免疫動物，其於動物體內誘發之免疫反應以生成抗體，再從該動物中分離該抗體、或生產該抗體之細胞。
實施例
本發明中，吾人發現克沙奇病毒株CVA6及CVA10，不像EV71及CVA16，不會感染用於生產人類疫苗之細胞株，像是Vero細胞、MRC-5細胞及MDCK細胞。相反地，該等病毒(CVA6及CVA10)於HEK293細胞中複製的很好。因此，吾人為第一個發表於HEK293細胞中生產、純化CV不同之毒株，並將分析其特性。當以病毒感染劑量(MOI)為10-2至10-5用於感染時，於感染後6天內，該CV病毒力價可達超過每ml中有106半數組織培養感染量(TCID50)。當收獲病毒濃縮物時，藉由一蔗糖梯度分層超速離心進行純化，以分離及偵測兩種CV病毒區份。於25~35%蔗糖區份所測得之病毒顆粒，具有低的病毒感染力及RNA含量。於35~45%蔗糖區份所得到之病毒顆粒，具有高的病毒感染力及RNA含量，以及經SDS-PAGE分析後，得知係由4種病毒蛋白(VP1、VP2、VP3、及VP4)組成。將該兩種病毒區份以福馬林進行去活化，且於小鼠免疫原性研究中，發
現該感染性顆粒區份可誘發CV毒株專一的中和抗體反應。但該等抗血清無法中和EV71及CVA16。另一方面，無論是以CVA6及CVA10之感染性顆粒或非感染性顆粒免疫兔子，皆可產生中和抗體反應，但該等抗體仍無法中和EV71及CVA16感染。該等結果顯示於不同腸病毒血清型間之交互反應是微弱的，且需使用源自不同病毒之組成，以發展及混合一有用且有效之多價腸病毒疫苗。
材料及方法
倫理聲明
所有實驗係按照NHRI實驗動物中心之規定進行。動物試驗計畫皆經NHRI實驗動物照護及使用委員會所審核且經批准(批准計畫編號：NHRI-IACUC-098033-A、NHRI-IACUC-101042-A及NHRI-IACUC-101050-AC)
細胞、培養基及病毒
人胚腎細胞293(HEK293)係源自Life TechnologiesTM。非洲綠猴腎細胞(Vero)、MDCK及横纹肌肉瘤(RD)細胞係由台灣疾病管制署(台灣CDC)或NHRI疫苗中心所慷慨提供。該原始細胞株係源自美国典型培養物保藏中心(ATCC)。吾人以VP-SFM、Dulbecco's modified Eagle's培養基+10%FBS，及其他適當的無血清培養基以培養該等細胞株。該E59株(基因型B4)，EV71病毒之臨床分離株，係源自台灣CDC。該CVA6、CVA10及CVA16分離株，係源自台灣CDC或王貞仁教授(NCKU)。CVA6、CVA10及CVA16病毒係自感染三天後(DPI)之經感染RD細胞上清液收集而得。種病毒力價係以TCID50法判定，且該等種病毒皆存放於-80℃。因為RD細胞不用於人類疫苗生產，因此，使用GMP級認證之HEK293細胞株以繁殖CVA6及CVA10，其無法感染Vero及MDCK細胞株。該萃取的病毒RNA係以一步RT-PCR(Promega,Madison,WI USA)增幅。本發明中所使用之寡核甘酸引子序列，係經客觀理性設計，並可從文中得知。該增幅後之DNA係使用ABI 3730 XL DNA分析儀(Applied Biosvstem Inc.,Foster City,CA
USA)定序。VP1核甘酸序列及所有四個結構性病毒蛋白之胺基酸序列，皆於本文中有所描述。
病毒培養
腸病毒(EV71、CVA16、CVA6及CVA10)，係使用無血清VP-SFM培養基、Dulbecco's modified Eagle's培養基+10%FBS及其他適用之無血清培養基於T角瓶，以Vero細胞或HEK293細胞培養。經培養6天後，細胞密度可達每ml中1至2.5×106細胞。將細胞以MOI為10-2至10-5之病毒進行感染。經感染後6天(DPI)，自培養之上清液中收獲及收集病毒。
使用蔗糖梯度超速離心法以純化病毒顆粒
從T角瓶培養物中收獲病毒培養上清液。藉由通過0.65μm濾膜(Sartorius,Germany)，以移除細胞碎片，並以100K TFF壓縮機(Pall)將上清液濃縮20倍。將粗病毒濃縮物(~50mL)裝載入10~60%連續蔗糖梯度，並以分區迴轉頭，於Hitachi CP80超速離心機中，以32,000rpm離心3小時。收集於10~60%蔗糖之區份(每個區份50mL)，並分別以1L PBS(pH 7.4)(Gibco/Life Technologies,Taipei,Taiwan)進行三次交換透析，接著存於4℃。使用組織培養感染劑量(TCID50)法以分析純化病毒區份之感染力。將該等區份進行SDS-PAGE及西方墨點分析。將辨識出含有病毒之區份混合後，並以Amicon 100K管(Millipore,Belerica,MA USA)進行滲濾濃縮，接著進行3,000 x g離心，之後存於4℃。純化的病毒區份，係以BCA蛋白法判定總蛋白濃度。將一半的純化病毒區份(15mL)以每份0.5mL方式存於-80℃；另一半係以1/4000(v/v)福馬林，於37℃去活化3天，並存於4℃。
下表4及5中之去活化的EV-71顆粒，係以Liu et al.,PLos One.6(5)：e20005所述方式製備，下表4及5中之去活化的CVA16顆粒，係以Chong et al.,PLoS One,2012.7(11)：e49973所述方式製備。
病毒力價之判定
以TCID50中間數端點判定病毒力價。序列稀釋病毒樣本(從10-1至10-8)後加入生長於96孔盤中之RD細胞中，每次稀釋會使用6個重複樣本。將96孔盤置於37℃中培養6天，並計算感染RD細胞之細胞病變效應(CPE)以測定TCID50值。使用Reed-Muench法，以計算TCID50值。
SDS-PAGE分析及點漬法
純化病毒區份之SDS-PAGE分析，係根據製造商建議之方法，於NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel(Invitrogen,CA USA)上進行。將四種經福馬林去活化之病毒顆粒(CVA6、CVA10、CVA16及EV71)直接滴上BA85硝化纖維膜(Whatman)以進行點漬法。之後，將膜浸泡在溶於PBS之5%脫脂牛奶中，於4℃整夜浸泡。MAB979(Millipore,USA)及鼠抗病毒血清，於室溫結合2小時。接著，將膜以15mL試驗緩衝液沖洗5次。加入1mL含有辣根過氧化氫酶(HRP)-共軛之驢抗鼠二級抗體(Jackson ImmunoResearch)(1：5,000稀釋倍數)之PBS緩衝液，以偵測病毒顆粒與個別抗體結合情形。於室溫作用1小時後，以試驗緩衝液沖洗該膜6次，及將該點漬乾燥。加入TMB受質溶液(KPL)以顯示該等點漬。
動物免疫原性研究
於免疫前，將不同量之去活化病毒顆粒以磷酸鋁，於室溫進行3小時的吸收。將一組6隻母的BALB/c小鼠(6-8周齡)，以0.2mL(0.5μg+60μgAlum)進行肌肉免疫(i.m.)。將兔子以0.5mL(2.5μg+300μg Alum)進行肌肉免疫(i.m.)。所有動物係以相同劑量，於首免後間隔兩周，進行補強兩次。經免疫後之小鼠及兔子，於最後一次補強後1周採血，收集血清，並用於分析病毒中和能力。
病毒中和試驗
從免疫小鼠收集血清樣本，並於56℃去活化30分鐘。將每一個血清樣本以新鮮的細胞培養基，以兩倍序列稀釋方式加入微管中；接著，將400μL
200-TCID50病毒懸浮液加入含有400μL序列稀釋後之血清的微管中。經於4℃作用18~24小時後，將100μL序列稀釋樣本加入含有RD細胞之96孔盤中。於96孔盤之培養物，於37℃作用7天，並藉由計算感染細胞之CPE以測量TCID50值。50%中和抑制劑量(ID50)之計算，係使用Reed-Muench法，計算可降低50%病毒力價時之相應的血清稀釋倍數。
以穿透式電子顯微鏡(TEM)分析病毒顆粒之特性
將去活化的病毒顆粒置於經Formvar包覆的及碳汽化的200mesh之銅網格中。於室溫，將樣本置於銅網格上15分鐘，並使用濾紙將過多的樣本移除。經以ddH2O清洗兩次後，將該銅網格以2%磷鎢酸溶液染色2分鐘，接著使用濾紙移除。該染色後之網格，經3-7天乾燥後，以JEM-2100F穿透式電子顯微鏡觀察。
實施例1：發展多價免疫原性成分之HFMD疫苗的想法
一無血清、且以Vero細胞為主，經福馬林去活化之全病毒EV71疫苗已被開發，且已進行人體臨床試驗(Wu et al.,2004；Liu et al.,2007；Liu et al.,2011；Chang et al.,2012；Chou et al.,2012；Li et al.,2012；Cheng et al.,2013；Zhu et al.,2013)。令人驚訝的是，預期外之結果顯示於細胞培養試驗中，EV71疫苗無法保護CVA16感染(Chou et al.,2013)。吾人近期對於CVA16候選疫苗之研究，亦顯示鼠的及兔的抗CVA16抗血清無法中和EV71(Chong et al.,2012)。當該等病毒株((EV71、CVA6、CVA10及CVA16)之蛋白序列被排列及分析；發現P1胜肽之相似度，於P1序列上可達65~80%(表1)。為了克服由其他常見之腸病毒株(如CVA6及CVA10)所造成之HFMD，現急需發展一包含不同腸病毒株之多價免疫原性成分的HFMD疫苗。
實施例2：建立克沙奇病毒A群之新穎生物性製程
用於製造人類多價HFMD疫苗的生物性製程已被發展探究。基於公開文獻中(Liu et al.,2007；Chou et al.,2012)所述之發展EV71疫苗之現有生物性製程，令吾等驚訝的是，於無血清培養環境下，CVA6及CVA10可於RD細胞中感染及複製，但無法對Vero細胞感染及複製(圖1)。然而，RD細胞並不像HEK293細胞一樣適合用於生產人類疫苗。請同時參閱表2及表3。
為了確認沒有病毒蛋白可於Vero細胞培養中被表現及生成，使用兩種單株抗體(N1及MAB979可分別專一性辨識EV71及CVA16之VP1及VP2)以偵測被CVA6或CVA10感染之Vero細胞培養物中之病毒性成分。於點漬分析結果顯示，CVA6及CVA10皆沒有病毒蛋白可被測得(圖2)。因此，該無血清之Vero細胞為基礎之疫苗概念，可能無法應用於生產多價HFMD疫苗。
實施例3：使用HEK293細胞培養以生產病毒
既然CVA6及CVA10無法感染Vero細胞及RD細胞，無法用於人類疫苗生產，因此，其他可能的GMP級認證之細胞株，如MDCK、MRC-5、CHO及HEK293，遂被進行測試，並用於繁殖CVA6及/或CVA10。令吾人驚訝地，CVA6及CVA10皆僅能感染HEK293細胞(圖3)。
為了取得足夠之CVA6及CVA10以分析生化及免疫原特性，將該等病毒培養於HEK293細胞中。經6天培養後，細胞密度達到每mL中有1~2.5×106細胞。將細胞以MOI為10-2至10-5之濃度進行感染。於感染後6天(DPI)從細胞培養上清液中收獲及收集病毒。請參閱表3。
當EV71感染HEK293細胞時，病毒力價可達0.5-1.6x108TCID50/mL。
基於此結果，生物性製程可使用多種生物反應器系統，包括懸浮式生物反應器、微載體生物反應器及潮汐式生物反應器。
實施例4：藉由蔗糖梯度分層超速離心以純化CV病毒顆粒
於7或8DPI時，從培養上清液中收獲及收集病毒。藉由透過0.65μm及0.22μm濾膜以進行微過濾，藉此將細胞碎片移除，以及使用一100kDa截斷之雙過濾膜，於切向流過濾(TFF)盒中將病毒原液進行20倍濃縮。接著，將濃縮後的病毒原液裝載入10~60%連續蔗糖梯度中，並使用一分區旋轉頭，於Hitachi CP80超高速離心機中，以32,000rpm進行離心3小時。收集蔗糖梯度區份進行感
染RD細胞分析(病毒TCID50)以及SDS-PAGE分析，如圖4及圖5所示。含有病毒抗原之第一區係在區份10~16，其含有25-35%蔗糖，且經TCID50分析顯示，該區沒有CVA6及CVA10感染性或相當低(分別如圖4A及圖5A所示)。基於生化、病毒及免疫原特性，該等病毒顆粒被認為是假的/有缺陷的病毒顆粒或空的顆粒。含有病毒顆粒之第二區被發現與具有感染力之病毒位在同樣之區份17~22。基於生化、病毒、及免疫原特性，該等感染性病毒顆粒被認為是真的病毒顆粒或完整的顆粒。確認了空的病毒顆粒區份位於25~35%蔗糖梯度，以及完整的顆粒區份位於35~45%蔗糖梯度。純化的病毒區份之感染力，係再次以病毒TCID50法、SDS-PAGE及西方墨點分析法再次分析。將分區離心之純化的CV病毒顆粒混合，並使用Amicon 100K管，於3000xg離心，進行雙過濾來濃縮。每一個混合後之病毒顆粒區份係個別地以PBS透析。將純化之病毒原液以BCA蛋白法判定其之總蛋白濃度。將純化的病毒以0.5mL方式等份存於4℃。
實施例5：藉由穿透式電子顯微鏡(TEM)分析CV病毒顆粒之生物物理特性
以TEM分析及顯示CV空的及完整顆粒之物理結構。為了生物安全性考量，純化的病毒液係個別地以福馬林溶液(v/v 1：4000稀釋)，於37℃進行去活化3天。經如同材料及方法所述之方式製備後，以TEM分析樣本後，發現於CVA6及CVA10空的顆粒中，有部分不規則之正二十面體顆粒結構(圖6A及圖6B)。此與福馬林去活化的完整顆粒(圖6C及圖6D)之結構是相似的；可能是因為病毒完整顆粒之正二十面體結構係經福馬林去活化後所破壞之故。兩種CV病毒顆粒之直徑約30~35nm，於微小核糖核酸病毒科之EV71及CVA16非常相似。[30-35]
實施例6：CVA16病毒顆粒之病毒蛋白組成
由蔗糖梯度分層超速離心及TEM生物物理分析，皆證明CV病毒顆粒具有兩種形式。空的顆粒顯示含有許多不同分子量(MWs)之蛋白條帶(圖7，道1及3)。部分高分子量之蛋白代表P1多胜肽於病毒組裝及包裝過程中，很有可能沒有完全完成蛋白分割之過程。有趣的是，可觀察到有許多分子量低於17kDa之蛋白條帶，是不曾出現在EV71及CVA16之空的顆粒中。將完整顆粒之病毒蛋白，以SDS-PAGE分離及分析，發現含有四個主要的蛋白條帶，且具有與在EV71感染性顆粒中發現者有相似的分子量(圖7，道2及4)。根據預測之蛋白序列(圖7，道2及4)，該等四個主要的蛋白條帶分別為人類腸病毒殼體蛋白VP1(32-35kDa)、VP2(24-28kDa)、VP3(24-28kDa)及VP4(6-8kDa)。總結，該等結果指出該兩種病毒顆粒具有不同之蛋白組成。再者，該不成熟的殼體係由不完全之蛋白切割病毒蛋白所構成，且可能仍可形成顆粒結構(如下所示)。
實施例7：CV病毒顆粒之免疫原性研究
吾人想進一步探討是否該兩種經福馬林去活化後之CV病毒顆粒可否產生強力且有效之免疫反應。於免疫前，係將不同量之去活化CV顆粒與磷酸鋁，於室溫下吸收3小時。將一組6隻母BALB/c小鼠(6~8周齡)分別以0.2mL(0.5μg+60μg Alum)進行肌肉免疫(i.m.)。將4隻兔子以0.5mL(2.5μg+300μg Alum)進行肌肉免疫(i.m.)。所有動物以相同劑量，於首免後2周進行補強兩次。於最後一次補強後1周，將免疫小鼠及兔子採血，收集血清並用於分析病毒中和能力。
無論源自經福馬林去活化之CVA6完整顆粒或空的CVA6顆粒所免疫之小鼠組的小鼠抗血清，可產生對於CVA6病毒有專一性之中和抗體反應(表4)。此代表於RD TCID50試驗中，CVA6專一性抗血清僅可中和CVA6感染，且無法對抗EV71、CVA10或CVA16感染。如預期地，由空顆粒所誘發之小鼠抗血清之平均病毒中和力價(1/32)，低於完整顆粒抗血清所得之力價(1/427)10倍。
不同於CVA6，無論以經福馬林去活化之CVA10空顆粒、或CVA10完整顆粒免疫小鼠，所誘發之CVA10專一性病毒中和反應，皆很低(1/11)或趨近於無(<1/8)(表4)。此點令人感到驚訝，因為於小鼠及兔子之免疫原性研究中，經福馬林去活化之CVA16完整顆粒，發現可誘發很高之CVA16專一性中和抗體反應。於先前EV71研究中，源自經福馬林去活化之EV71完整顆粒的小鼠抗血清之EV71專一性中和力價，被發現約為1/2000。基於目前結果，福馬林去活化可能會破壞CVA10之部分中和抗原決定基，其可能因此造成不佳之病毒中和抗體反應。此點與吾人先前研究所發現者相似，即部分EV71病毒株之病毒中和抗原決定基對於化學去活化(如福馬林)、UV及熱處理，相當敏感。基於目前結果，應增加CVA10之劑量以增強中和抗體反應。
為了進一步探討經福馬林去活化之CVA10是否真的是一個不佳之免疫原，或其所誘發之低抗體反應是因為小鼠免疫原性之問題，因此，以2.5μg經福馬林去活化及鋁膠調配後的CVA16顆粒，以i.m.方式，每隔兩周進行免疫兩組兔子，共免疫三次(每組3隻兔子)。其中兩隻兔子經福馬林去活化之完整顆粒免疫後所得到之抗血清，被發現具有1/32及1/16倍之中和力價(平均力價為1/26，如表5所示)，以及免疫相同量之經福馬林去活化及經鋁膠調製之空的顆粒的兔子，其抗血清具有相似的抗CVA10病毒之中和力價(1/16及1/32)(表5)。該等中和力價仍遠低於該等先前研究所報告之從EV71完整顆粒者所誘發之力價。該等抗EV71力價，分別從小鼠及兔子免疫原性研究中可知，約為1/2000及1/32,000。
為了探討是何種因子造成該等低落之中和抗體反應，吾人可排除疫苗沉澱之可能性，因為觀察含有福馬林處理之CVA10病毒顆粒之溶液，無明顯之病毒顆粒聚集的現象。很有可能是福馬林去活化過程中，破壞部分重要之病毒中和的抗原決定基。
吾人進一步想探討由CVA6病毒所產生之兔子中和抗體，可否對於EV71有交叉中和能力。如同小鼠抗CVA6抗體，將兔子抗血清於中和試驗中進行測試，發現於1/8稀釋倍數時對於EV71不具活性(表5及6)。目前結果指出以福馬林去活化之CVA6候選疫苗所誘發之中和抗體反應是對於病毒有專一性的。吾人先前研究亦證實福馬林去活化之EV71候選疫苗所誘發之EV71專一性中和抗體反應，對於CVA16不具有、或呈現不佳之交叉中和活性。綜合以上結果，應發展一多價EV71/CVA6/CVA10/CVA16疫苗，並對造成HFMD之人類腸病毒進行測試。
實施例8：含有EV71、CVA6、CVA10及CVA16之病毒顆粒的多價HFMD候選疫苗之免疫原性研究
吾人進一步想探討經福馬林去活化之CVA6及CVA10完整顆粒，與EV71及CVA16病毒顆粒一同調製後，是否可產生強烈且有效之免疫反應，以對抗該四種病毒。於免疫前，以不同量之去活化顆粒以磷酸鋁，於室溫下進行吸收3小時。以0.2mL(每種病毒顆粒0.5μg+60μg Alum)以肌肉注射方式(i.m.)免疫一組6隻BALB/c母小鼠(6~8周齡)。以0.5mL(每種病毒顆粒2.5μg+300μg Alum)以肌肉注射方式(i.m.)免疫四隻兔子。所有動物以相同劑量，於首免後間隔兩周補強兩次。於最後一次補強後1周將免疫小鼠及兔子採血，並收集血清用於分析病毒中和反應。
以多價福馬林去活化之完整顆粒者，免疫小鼠組所產生之小鼠抗血清，可生成對抗所有四種病毒之病毒中和抗體反應(表4)。此代表，於RD TCID50試驗中，該等抗血清不僅可中和CVA10感染，亦可對抗EV71、CVA6及CVA16感染。此結果亦代表多價福馬林去活化之完整顆粒可增強抗CVA10病毒中和抗體反應(表4)。
實施例9：以病毒顆粒免疫所產生之小鼠抗血清之辨識能力
吾人使用點漬分析以確認病毒及抗血清間之辨識關係。將五組小鼠抗血清，用於偵測CVA6、CVA10、CVA16及EV71病毒顆粒。兩種單株抗體(N1及MAB979分別可專一性辨識EV71及CVA16之VP1及VP2)來偵測對照組之病毒組成。該等結果顯示於圖8。以CVA6 E顆粒所免疫而得之小鼠抗血清，可辨識CVA6及CVA10病毒顆粒。然而，以CVA6 F顆粒所免疫而得之小鼠抗血清，僅可辨識CVA6病毒顆粒。此相似的結果，亦可見於CVA10試驗結果。以CVA10 E顆粒免疫之小鼠抗血清，可辨識CVA6及CVA10病毒顆粒，以及以CVA10 F顆粒免疫之小鼠抗血清，僅可辨識CVA10病毒顆粒。以多價F顆粒免疫所得之小鼠抗血清，可辨識CVA6、CVA10、CVA16及EV71病毒顆粒。然而，該小鼠抗血清對於辨識CVA16病毒顆粒之能力較弱。N1單株抗體僅可高度辨識EV71病毒顆粒，而對其他株沒有反應。MAB979單株抗體可高度辨識EV71及CVA16病毒顆粒。該等結果顯示，以不同病毒顆粒免疫所得之小鼠抗血清，具有非常不同之辨識能力的特性。
本發明提供一以細胞培養方式之腸病毒疫苗(較佳為HFMD疫苗)之重要資訊。具體地，為了消弭HFMD，需要一多價EV71/CVA6/CVA10/CVA16疫苗配方。
簡言之，本發明係基於，至少部分，於細胞培養分析中，誘發之小鼠抗體可對抗EV71及CVA16，但無法中和CVA6及CVA10感染。為了發展CVA6及/或CVA10候選疫苗，本發明發現用於發展EV71疫苗之生物性製程不是十分有效，因為CVA6及CVA10無法於有血清及無血清之Vero細胞培養中複製。亦測試過不同細胞基質，像是MDCK、MRC-5及CHO細胞株等用於人類疫苗製造者，皆對於CVA6及CVA10複製不佳。於本發明中，以生產重組腺病毒疫苗之HEK293細胞進行測試，發現對於CVA6及CVA10之複製效果很好。因此，本發
明發展一使用HEK293細胞以生產CVA6或CVA10、或其他腸病毒A型之病毒顆粒的技術，並提供一含有CVA6或CVA10或兩者的病毒顆粒之免疫組合物以對抗腸病毒感染，以供人類使用；其中該組合物可擇地包含其他除了CVA6及CVA10以外之腸病毒A型之病毒顆粒，特別是指CVA16或EVA71或兩者。
具體而言，本發明發現從CVA6或CVA10所純化之感染性病毒顆粒，可對於同源之病毒具有強烈之中和抗體反應，但卻無法中和其他病毒，如CVA16及/或EV71。因此，吾人進一步發展一多價疫苗，包含EV71、CVA6、CVA10及CVA16病毒顆粒，其可有效誘發保護性免疫反應，以對抗EV71、CVA6、CVA10及CVA16感染，並預防其所造成之疾病，特別係指HFMD。
>CVA6_M0746(870 A.A.)(SEQ ID NO：1)
>CVA10_M2014(862 A.A.)(SEQ ID NO：2)
>CVA16_5079(862 A.A.)(SEQ ID NO：3)
<110> 國家衛生研究院
<120> 作為對抗人類腸病毒感染之免疫原的病毒顆粒及其製造
<130> NHR0009TW
<150> 62003973
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<400> 15
Claims (26)
- 一種製造對抗腸病毒感染之免疫原的方法，包含(a)於人胚腎293(HEK293)細胞之第一培養物中生成克沙奇病毒A6(CVA6)病毒顆粒，並從該第一培養物中，收集該CVA6病毒顆粒；或(b)於人胚腎293(HEK293)細胞之第二培養物中生成克沙奇病毒A10(CVA10)病毒顆粒，並從該第二培養物中，收集該CVA10病毒顆粒；或(c)同時進行步驟(a)及(b)。
- 如申請專利範圍第1項之方法，包含將CVA6病毒顆粒及CVA10病毒顆粒結合以形成一多價免疫組合物。
- 如申請專利範圍第1項之方法，包含將CVA6病毒顆粒、或CVA10病毒顆粒、或將CVA6及CVA10兩者與除了CVA6及CVA10以外之另外的腸病毒A型之病毒顆粒結合，以形成多價免疫組合物。
- 如申請專利範圍第3項之方法，其中該除了CVA6及CVA10以外之腸病毒A型，係選自由克沙奇病毒A2(CVA2)、克沙奇病毒A3(CVA3)、克沙奇病毒A4(CVA4)、克沙奇病毒A5(CVA5)、克沙奇病毒A7(CVA7)、克沙奇病毒A8(CVA8)、克沙奇病毒A12(CVA12)、克沙奇病毒A14(CVA14)、克沙奇病毒A16(CVA16)、腸病毒A71(EVA71)、腸病毒A76(EVA76)、腸病毒A89(EVA89)、腸病毒A90(EVA90)、腸病毒A91(EVA91)、腸病毒A92(EVA92)、腸病毒A114(EVA114)及腸病毒A119(EVA119)所組成之群組。
- 如申請專利範圍第3項之方法，其中除了CVA6及CVA10以外之腸病毒A型係選自由CVA16、及EV71、及其組合所組成之群組。
- 如申請專利範圍第3項之方法，其中該另外的病毒顆粒係從HEK293細胞之第三培養物中生成及收集而得。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該CVA6或CVA10病毒顆粒可進一步純化、或去活化、或兩者兼具。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該純化係藉由蔗糖梯度分層超速離心施行。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該去活化係以福馬林處裡施行。
- 如申請專利範圍第6項之方法，其中該另外的病毒顆粒係經純化及/或去活化。
- 一種製備對抗腸病毒感染之多價免疫組合物的方法，包含：(a)於HEK293細胞之第一培養物中生成CVA6病毒顆粒，並從第一培養物中收集CVA6病毒顆粒；(b)於HEK293細胞之第二培養物中生成CVA10病毒顆粒，並從第二培養物中收集CVA10病毒顆粒；(c)於HEK293細胞之第三培養物中生成CVA16病毒顆粒，並從第三培養物中收集CVA16病毒顆粒；(d)於HEK293細胞之第四培養物中生成EVA71病毒顆粒，並從第四培養物中收集EVA71病毒顆粒；及(e)結合CVA6病毒顆粒、CVA10病毒顆粒、CVA16病毒顆粒、及EVA71病毒顆粒，以形成多價免疫組合物。
- 如申請專利範圍第11項之方法，其中該CVA6病毒顆粒、CVA10病毒顆粒、CVA16病毒顆粒及EVA71病毒顆粒係經純化及去活化。
- 一種對抗腸病毒感染之免疫組合物，包含CVA6病毒顆粒、或CVA10病毒顆粒、或兩者。
- 如申請專利範圍第13項之免疫組合物，係供人類使用。
- 如申請專利範圍第13項之免疫組合物，其中該腸病毒感染係由CVA6或CVA10或兩者所造成。
- 如申請專利範圍第13項之免疫組合物，其中該病毒顆粒係由HEK293細胞培養物中所生成及收集而得。
- 如申請專利範圍第13項之免疫組合物，進一步包含除了CVA6及CVA10以外之另外的腸病毒A型病毒顆粒。
- 如申請專利範圍第18項之免疫組合物，其中該除了CVA6及CVA10以外之腸病毒A型，係選自由克沙奇病毒A2(CVA2)、克沙奇病毒A3(CVA3)、克沙奇病毒A4(CVA4)、克沙奇病毒A5(CVA5)、克沙奇病毒A7(CVA7)、克沙奇病毒A8(CVA8)、克沙奇病毒A12(CVA12)、克沙奇病毒A14(CVA14)、克沙奇病毒A16(CVA16)、腸病毒A71(EVA71)、腸病毒A76(EVA76)、腸病毒A89(EVA89)、腸病毒A90(EVA90)、腸病毒A91(EVA91)、腸病毒A92(EVA92)、腸病毒A114(EVA114)及腸病毒A119(EVA119)所組成之群組。
- 如申請專利範圍第18項之免疫組合物，腸病毒A型係選自由CVA16、及EV71、及其組合所組成之群組。
- 如申請專利範圍第18項之免疫組合物，其中該另外的病毒顆粒從HEK293細胞之培養物中生成及收集而得。
- 一種對抗腸病毒感染之多價免疫組合物，包含CVA6病毒顆粒、CVA10病毒顆粒、CVA16病毒顆粒、及EVA71病毒顆粒。
- 如申請專利範圍第22項之多價免疫組合物，其中該病毒顆粒係從HEK293細胞之培養物中生成及收集而得。
- 一種如申請專利範圍第20項之多價免疫組合物用於製備人類疫苗，以對抗腸病毒感染或其所造成疾病之用途。
- 如申請專利範圍第24項之用途，其中該腸病毒感染係由CVA6、CVA10、CVA16或EVA71、或其之任意組合所造成。
- 如申請專利範圍第24項之用途，其中該腸病毒所造成之疾病為手足口病(HFMD)。
- 一種針對由HFK293細胞培養物所生成之腸病毒A型病毒顆粒之抗體。
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