CN106661102B - 作为对抗肠病毒感染之免疫原的病毒颗粒及其制造 - Google Patents

Abstract

本发明关于一种作为对抗肠病毒感染之免疫原的病毒颗粒及其制造方法。具体而言，本发明特征在于使用人胚肾293(HEK293)细胞以制造肠病毒A型之病毒颗粒，具体而言是指克沙奇病毒A6(CVA6)颗粒、或克沙奇病毒A10(CVA10)颗粒、或两者皆包含、及其他可选之肠病毒A型病毒颗粒，像是克沙奇病毒A16(CVA16)、及/或肠病毒A71(EV71)。令人惊讶的是，于HEK293细胞中所能收获之病毒颗粒相当高，且可有效诱发对抗肠病毒感染之免疫反应，特别是对CVA6及CVA10。本发明亦关于一种对抗肠病毒感染之人用免疫组合物，包含如本文所述之病毒颗粒，以及一种预防肠病毒感染或其所造成疾病之方法，具体而言是指手足口病(Hand‑Food‑Mouth disease；HFMD)，该方法是藉由施予该免疫组合物给有需要之个体。

Description

作为对抗肠病毒感染之免疫原的病毒颗粒及其制造

技术领域

本发明关于一种作为对抗肠病毒感染之免疫原的病毒颗粒，及藉由使用人胚肾293(HEK293)细胞制造该病毒颗粒之方法。本发明亦关于一种对抗肠病毒感染之人用免疫组合物，及一种诱发对抗肠病毒感染、或其所造成疾病之免疫反应的方法，具体而言是指手足口病(HFMD)。

背景技术

肠病毒，属于微小核糖核酸病毒科，是一种含有正股RNAs之小型、无封套的病毒。肠病毒属目前包含12种：肠病毒A、肠病毒B、肠病毒C、肠病毒D、肠病毒E、肠病毒F、肠病毒G、肠病毒H、肠病毒J、鼻病毒A、鼻病毒B、及鼻病毒C。该等病毒感染肠道可造成各种类型的疾病。典型肠病毒疾病为脑膜炎、麻痹、心肌炎、手足口病(HFMD)、疱疹性咽峡炎、胸膜痛、肝炎、皮疹及呼吸性疾病，包含肺炎。目前供人类使用之唯一的肠病毒疫苗为脊髓灰质炎病毒疫苗，其属于肠病毒C。目前尚无可供人类使用之抗非脊髓灰质炎肠病毒之疫苗。

肠病毒具有一RNA基因体，包括5端非转译区(untranslated region；UTR)，蛋白编码区、3端非转译区(UTR)，及一不同长度之poly-A尾，其位于3端。RNA基因体大小为7.4Kbp，以及该单一的开放阅读框架(open reading frame；ORF)编码一聚合蛋白。该聚合蛋白被再分作三区，P1、P2及P3。P1编码四种病毒结构蛋白VP4、VP2、VP3及VP1，而P2及P3编码七种非结构性蛋白2A至2C，以及3A至3D。克沙奇病毒被分为A群有23种血清型(1～22、24)、及B群有6种血清型(1～6)(Knipe and Howley,2001)。近来，人类清道夫受体B类成员2(SCARB2)被发现为EV71及CVA16感染之重要受体(Yamayoshi et al.,2009)。

基于中国台湾定点医疗监测，进行系统性分析主要之肠病毒血清型的流行病学，并监控中国台湾之肠病毒感染(Tseng et al.,2007)。数据显示每年有不同的流行肠病毒血清型，特别是CVA16及EV71，其主要以手足口病(HFMD)方式出现。相对于CVA16及EV71，其他常见于周遭之血清型，包括E30、E6、E11、CB3、CB4、CB5、CVA4、CVA6及CVA10，于2000～2005年间已被发现可造成HFMD爆发。此研究亦证实该等血清型反复循环的流行病模式对公共健康有很大的影响。目前尚不清楚，于不同基因型及/或血清型亚型间之交叉保护程度(Tsenget al.,2007)。根据中国台湾疾病管制中心的资料，除了CVA16及EV71以外，于2001～2008年间，CVA6通常为中国台湾5个最主要常见之肠病毒血清型之一(Lo et al.,2011)。

于新加坡，2001～2007年间，发现部分高峰之非EV71 HFMD活性是由CVA6及/或CVA10或CVA16所造成(Ang et al.,2009)。主要的血清型为CVA10(39.9％)及CVA6(28％)，接着为CVA16(17.5％)及EV71(6.3％)。于西班牙，于2010及2012年间，有许多HFMD爆发及偶发之病例。可于53个病患中侦测到肠病毒(66％)。CVA6为最常见之基因型，接着为CVA16及EV71，但是其他较不主流的类型也有被发现过。有趣地，于2010间，于一开始时，CVA16为HFMD之唯一致病因子，但于该年末时，CVA6变得主要，且于2011年间尚无法侦测到CVA16。于2012年，则CVA6及CVA16则一起流行了。于2012年，与HFMD症状有关之EV71仅有三个病例(Cabrerizo et al.,2013)。于中国台湾近来发生CVA6 HFMD爆发，且部分病患被发现具有脱甲症及脱皮，接着HFMD(Wei et al.,2011)。综合目前流行病学结果，HFMD之主要致病原为CVA16、EV71、CVA6及CVA10(Kaminska et al.,2013)。

于感染过程中，虽然CVA6及CVA10造成神经性疾病之倾向差，但该等病毒仍可诱发红疹、口腔粘膜疹及脱甲症。先前研究已发展以福尔马林去活化之EV71疫苗(Chou et al.,2013及Zhu et al.,2013)，发现对于CVA16感染不具保护力(Chong et al.,2012)。对于CVA6及CVA10，没有先前研究报告有适用的细胞株可用于生产病毒颗粒以供人类疫苗制造。

WO 99/53034提供修饰的病毒基因体，以作为疫苗或载体，其改进基因体之能力，以保留弱化的突变。WO2010139193 A1揭示了以去活化纯化之EV71病毒B型及C型及CoxA16病毒以制备之手足口病疫苗。US20120045468 A1提供抗EV71感染之免疫组合物(如疫苗)及其相关方法。

目前仍需要发展一种候选疫苗以对抗肠病毒A型，特别是指CVA6或CVA10或两者。

发明内容

本发明发展了一种藉由培养肠病毒于人胚肾293(HEK293)细胞中，以生产肠病毒A型之病毒颗粒的技术，特别是指CVA6或CVA10。当与先前研究使用Vero细胞者相比较时，于HEK293细胞中病毒颗粒之产量令人惊讶的高，且可有效诱发免疫反应对抗肠病毒感染。藉此所制备之病毒颗粒可被作为有效的免疫原及可用于制备免疫组合物，以对抗肠病毒感染，特别是可供人类使用。

于一方面，本发明提供一种制造对抗肠病毒感染之免疫原的方法，包含：

(a)于人胚肾293(HEK293)细胞之第一培养物中生成克沙奇病毒A6(CVA6)病毒颗粒，并从该第一培养物中，收集该CVA6病毒颗粒；或

(b)于人胚肾293(HEK293)细胞之第二培养物中生成克沙奇病毒A10(CVA10)病毒颗粒，并从该第二培养物中，收集该CVA10病毒颗粒；或

(c)同时进行步骤(a)及(b)。

于另一方面中，本发明提供一种对抗肠病毒感染之免疫组合物，包含CVA6病毒颗粒或CVA10病毒颗粒或两者兼具。

本发明亦提供本文所述之免疫组合物之用途，是用于制备人类疫苗以对抗肠病毒感染或其所造成之疾病。

于又一方面中，本发明提供一种诱发免疫反应以对抗肠病毒感染之方法，包含施予有需要之个体一有效量之免疫组合物，其包含本文所述之CVA6病毒颗粒或CVA10病毒颗粒、或两者兼具。

于部分具体实施例中，该CVA6病毒颗粒及CVA10病毒颗粒是自HEK293细胞之培养中所制备及收集而得，并进行混合后以形成多价免疫组合物。

于部分具体实施例中，本文所述之CVA6病毒颗粒及CVA10病毒颗粒，进一步可与除了CVA6及CVA10以外之肠病毒A型病毒颗粒结合，以形成多价免疫组合物。

于部分具体实施例中，该除了CVA6及CVA10以外之肠病毒A型，是选自由克沙奇病毒A2(CVA2)、克沙奇病毒A3(CVA3)、克沙奇病毒A4(CVA4)、克沙奇病毒A5(CVA5)、克沙奇病毒A7(CVA7)、克沙奇病毒A8(CVA8)、克沙奇病毒A12(CVA12)、克沙奇病毒A14(CVA14)、克沙奇病毒A16(CVA16)、肠病毒A71(EVA71)、肠病毒A76(EVA76)、肠病毒A89(EVA89)、肠病毒A90(EVA90)、肠病毒A91(EVA91)、肠病毒A92(EVA92)、肠病毒A114(EVA114)及肠病毒A119(EVA119)所组成之群组。

于部分实例中，该除了CVA6及CVA10以外之肠病毒A型是选自由CVA16及EV71及其组合所组成之群组。

于部分实例中，本发明之病毒颗粒，是自HEK293细胞培养中所制备及收集而得。

于部分具体实施例中，本发明之病毒颗粒，待从细胞培养中收集后，进行纯化及/或去活化。

于部分具体实施例中，藉由蔗糖梯度分层超速离心进行纯化。

于部分具体实施例中，该去活化是以福尔马林处理进行。

本发明亦提供一种抗体，是可直接辨识本发明之经HEK293细胞培养中所制备之肠病毒A型病毒颗粒。

本发明将一种或多种详细具体实施例详列于以下说明中。本发明之其他特征或特点将可藉由以下各种具体实施例之详细说明及所附之申请专利范围，得以更明了。

附图说明

先前发明内容，以及以下之本发明之详细说明，可搭配所附之图式阅读，以得到更佳之了解。本发明于图式所呈现之较佳具体实施例仅用于阐述之目的。应明了的是，本发明并不局限于所示之该等精确之排列及手段。

于图式中：

图1显示以CVA6、CVA10、CVA16及EV71感染之RD及Vero细胞培养(感染后5天)。

图2显示于点渍法中，以CVA6、或CVA10、或CVA16或EV71感染之Vero细胞培养中，以单株抗体(N1及MAB979)所测得之有表现的病毒蛋白。

图3显示CVA6及CVA10仅感染HEK293细胞(感染后6天)。

图4显示(A)以蔗糖梯度分层超速离心纯化CVA6病毒；(B)以SDS-PAGE分析之每一个区份的银染结果。

图5显示(A)以蔗糖梯度分层超速离心纯化CVA10病毒；(B)以SDS-PAGE分析之每一个区份的银染结果。

图6显示CVA6及CVA10之空的颗粒(图6A及图6B)，及经福尔马林去活化完整颗粒(图6C及图6D)之部分不规则之正二十面体颗粒结构，两者十分相似。

图7显示CVA6、CVA10及EVA71病毒颗粒之蛋白条带。

图8显示藉由点渍分析显示，病毒及小鼠抗血清间之辨识能力。将四种福尔马林去活化病毒颗粒(CVA6、CVA10、CVA16及EV71)直接滴至用于点渍分析之硝化纤维膜上。

具体实施方式

除非另有定义，所有本文中所用之技术及科学性术语，具有与本领域技艺者所习知者相同意义。

本发明至少部分基于不可预期之发现，即克沙奇病毒株CVA6及CVA10，不像EVA71及CVA16，不会感染用于生产人用疫苗之细胞株，像是Vero细胞、MRC-5细胞及MDCK细胞；相反地，该等病毒(CVA6及CVA10)可于HEK293细胞中复制的很好。该病毒力价可达到10⁶至10⁸TCID50/ml。因此，吾人于世上首次发现以HEK293细胞用于生产、纯化及分析所产生之不同CV病毒株之特性，藉此提供一于HEK293细胞中，用于生产肠病毒A型病毒颗粒之技术，特别是指CVA6及CVA10之肠病毒。本发明之病毒颗粒可做为有效之免疫原，且可用于制备免疫组合物，特别可供人类使用，以对抗肠病毒感染，包括CVA6或CVA10或两者、或其他除了CVA6或CVA10以外之肠病毒A型，像是CVA16或EVA71。

整篇说明书中之说明及申请专利范围，用语“包含”及该用语之其他形式，像是“含有”及“包括”代表了“包含但不限于”，且并非用于排除，举例来说，其他添加物、组件、整数或步骤。

如本文所使用之单数形式“一”、“一个”及“该”，包括复数形式，除非文中有特别指出者例外。

如本文所使用，肠病毒A型包括以下血清型：克沙奇病毒A2(CVA2)、克沙奇病毒A3(CVA3)、克沙奇病毒A4(CVA4)、克沙奇病毒A5(CVA5)、克沙奇病毒A6(CVA6)、克沙奇病毒A7(CVA7)、克沙奇病毒A8(CVA8)、克沙奇病毒A10(CVA10)、克沙奇病毒A12(CVA12)、克沙奇病毒A14(CVA14)、克沙奇病毒A16(CVA16)、肠病毒A71(EVA71)、肠病毒A76(EVA76)、肠病毒A89(EVA89)、肠病毒A90(EVA90)、肠病毒A91(EVA91)、肠病毒A92(EVA92)、肠病毒A114(EVA114)及肠病毒A119(EVA119)。

如本文所使用，“病毒颗粒”乙词可代表病毒之完整的或部分组装之壳体，可包括空的颗粒、完整颗粒、或次颗粒。

如本文所使用，“空的颗粒”乙词是指一病毒颗粒不含有核酸、载体或质体、以及不具感染性。

如本文所使用，“完整颗粒”乙词是指一病毒颗粒含有遗传物质，及四种壳体蛋白(即VP1、VP2、VP3及VP4)。一般而言，VP1具有32～35kDa分子量(SEQ ID NO:4、5或6)、VP2具有24～28kDa分子量(SEQ ID NO:7、8或9)、VP3具有24～28kDa分子量(SEQ ID NO:10、11或12)、VP4具有6～8kDa分子量(SEQ ID NO:13、14或15)。

如本文所使用，“次颗粒”乙词是指病毒空的颗粒之不具感染性的次颗粒。具体而言，该次颗粒是指一病毒颗粒具有与完整颗粒者不同壳体蛋白组成。例如，一次颗粒可(1)含有少于VP1、VP2、VP3及VP4之壳体蛋白、(2)含有多于VP1、VP2、VP3及VP4之壳体蛋白，及/或(3)含有一个或多个不完整切割过程之壳体蛋白。

如本文所使用，该“抗原”是指一颗粒或一分子含有一种或多种抗原决定基，其可刺激宿主免疫系统，以造成体液及/或细胞抗原专一反应。“抗原”乙词与“免疫原”可互换使用。于体内或体外，当与适当细胞接触后之结果，抗原会诱发敏感性或免疫反应，且以一种可观察到之方式，与经敏感化之个体的抗体或免疫细胞反应。于生物体中，一抗原可专一地被抗体辨识及结合。与主要组织兼容性复合体(MHC)结合之抗原可被辨识，且可被T淋巴球(T细胞)表面之受体所结合，进而诱导T细胞活化。本文所使用之“抗原决定基”乙词，是指抗原上一位置，可为一专一性抗体分子或T细胞受体所结合。本文所用之术语可与“抗原性决定原”或“抗原决定位置”互换。

如本文所使用，“免疫反应”或“免疫原性反应”乙词是指一个体之免疫系统对于抗原所产生之任何反应。于脊椎动物的免疫反应之例子包括但不限于，抗体生成、诱发细胞媒介免疫力、及补体活化。以相同抗原反复刺激之免疫反应，亦称二级免疫反应，其反应较初级免疫反应要快。“免疫原性”乙词是指于宿主动物中，可产生对抗一种抗原或多种抗原之免疫反应之能力。此免疫反应可由疫苗诱发形成一基础的保护性免疫力，以对抗一特定的感染性生物体。

如本文所使用，“抗体”乙词是指一免疫球蛋白分子、或免疫球蛋白分子之至少一种免疫原性活性部分，其具有专一的胺基酸序列，且仅可与一抗原或一群彼此近似的抗原结合。抗体的实例包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分之实例，包括Fab及F(ab)'2片段，其可藉由使用酵素(像是胃蛋白酶)处理抗体后以生成。抗体可为单株抗体或多株抗体。“单株抗体”是指一群抗体分子，仅含有一种抗原结合位置，且可与特定抗原决定基进行免疫反应。“多株抗体”是指一群抗体分子，含有多于一种以上之抗原结合位置，且可与多胜肽上之多于一种的抗原决定基进行免疫反应。

如本文所使用，“佐剂”乙词是指一物质被加入免疫组合物(像是疫苗)中，其本身不具有任何特定的抗原性效果，可刺激免疫系统，并增加该免疫组合物之免疫反应。佐剂的实例包括但不限于铝盐、佛氏完全佐剂、佛氏不完全佐剂、单磷脂A/海藻糖二杆菌分枝菌酸酯(trehalose dicorynomycolate)佐剂、含有短小棒杆菌之油包水乳剂、及tRNA、及其他可完成增加免疫反应任务之物质，其藉由模仿进化保守分子之特定位置，包括微脂粒、脂多醣(LPS)、抗原的分子笼、细菌细胞壁的成分、及内胞饮之核酸，像是双股RNA、单股DNA、及未甲基化之含有DNA的CpG双核苷酸。其他实例包括霍乱毒素、大肠杆菌热分解之肠毒素、微脂体、免疫刺激复合物(ISCOM)、免疫刺激性序列寡脱氧核苷酸、及氢氧化铝。该组合物亦可包括一促进活体内运送之聚合物。请参阅Audran et al.Vaccine 21:1250-5,2003；及Denis-Mize et al.Cell Immunol.,225:12-20,2003。此外，本文所述之抗原可不使用任何佐剂以制成疫苗。

如本文所使用，“有效量”乙词系指可给予所欲效果之剂量，其可选择地为治疗效果、或预防效果。例如，有效量为活性物质的剂量，于接受者体内，可足以生成或诱发免疫反应以对抗病原菌(如肠病毒)。基于不同原因，该治疗有效量可能会改变，像是施予路径、频率、体重及接受该医药之个体物种、以及施予之目的。该领域具有技艺者可基于本文所揭示者、建立之方法及其个人经验，于不同状况下，决定该剂量。

于一方面，本发明提供一种制造对抗肠病毒感染之免疫原的方法，包含：

(a)于人胚肾293(HEK293)细胞之第一培养物中生成克沙奇病毒A6(CVA6)病毒颗粒，并从该第一培养物中，收集该CVA6病毒颗粒；或

(b)于人胚肾293(HEK293)细胞之第二培养物中生成克沙奇病毒A10(CVA10)病毒颗粒，并从该第二培养物中，收集该CVA10病毒颗粒；或

(c)同时进行步骤(a)及(b)。

具体而言，于HEK293细胞中生成病毒颗粒，该细胞与所欲之肠病毒接触后，可于HEK293细胞产生病毒感染；将该感染细胞培养一段足够时间后，确保可生成该病毒颗粒；接着将所生成之病毒颗粒收集，其可作为一免疫原，以对抗肠病毒感染。更具体而言，于感染前，约需3～7天培养时间，将细胞培养达到密度约每mL中有10⁵至10⁶个细胞，接着将细胞以MOI(感染复数)约为10^-2至10^-5之病毒进行感染，并培养约3～7天。接着从培养上清液中收获及收集病毒颗粒，并进行接续之处理，像是浓缩、纯化、及/或去活化。

于部分具体实施例中，该细胞培养系于无血清培养基中进行。

于部分具体实施例中，该细胞培养系于转瓶、细胞工厂、及/或生物反应器中进行。

具体而言，本发明之方法进一步包含将CVA6病毒颗粒与CVA10病毒颗粒结合，以形成一多价免疫组合物。

于部分具体实施例中，本发明方法包含将CVA6病毒颗粒或CVA10病毒颗粒、或两者与其他除CVA6及CVA10以外的肠病毒A型病毒颗粒结合，以形成一多价免疫组合物。

于特定具体实施例中，该除了CVA6及CVA10以外之肠病毒A型系选自由：克沙奇病毒A2(CVA2)、克沙奇病毒A3(CVA3)、克沙奇病毒A4(CVA4)、克沙奇病毒A5(CVA5)、克沙奇病毒A7(CVA7)、克沙奇病毒A8(CVA8)、克沙奇病毒A12(CVA12)、克沙奇病毒A14(CVA14)、克沙奇病毒A16(CVA16)、肠病毒A71(EVA71)、肠病毒A76(EVA76)、肠病毒A89(EVA89)、肠病毒A90(EVA90)、肠病毒A91(EVA91)、肠病毒A92(EVA92)、肠病毒A114(EVA114)及肠病毒A119(EVA119)所组成之群组。

于特定具体实施例中，该其他除了CVA6及CVA10以外之肠病毒A型之病毒颗粒系选自由CVA16及EV71及其组合所组成之群组。

于特定具体实施例中，CVA6或CVA10或其他肠病毒A型之病毒颗粒系由HEK293细胞之培养中所生成。特定而言，该等不同肠病毒之病毒颗粒系分别自HEK293细胞之个别培养中所生成及收集，接着将所收集之病毒颗粒结合在一起以形成一多价免疫组合物。

于一特定具体实施例中，本发明提供一种制备对抗肠病毒感染之多价免疫组合物的方法，包含以下步骤：

(a)于HEK293细胞之第一培养物中生成CVA6病毒颗粒，并从第一培养物中收集CVA6病毒颗粒；

(b)于HEK293细胞之第二培养物中生成CVA10病毒颗粒，并从第二培养物中收集CVA10病毒颗粒；

(c)于HEK293细胞之第三培养物中生成CVA16病毒颗粒，并从第三培养物中收集CVA16病毒颗粒；

(d)于HEK293细胞之第四培养物中生成EVA71病毒颗粒，并从第四培养物中收集EVA71病毒颗粒；及

(e)结合CVA6病毒颗粒、CVA10病毒颗粒、CVA16病毒颗粒、及EVA71病毒颗粒，以形成多价免疫组合物。

于部分实例中，各种肠病毒之病毒颗粒系本质上等重量比例结合。例如，本发明之多价免疫组合物可包含四种肠病毒病毒颗粒，CVA6病毒颗粒、CVA10病毒颗粒、CVA16病毒颗粒、EV71病毒颗粒，其间之重量比为1：1：1：1。该比例可因应所需调整。

“多价免疫组合物”乙词意指其可刺激宿主之免疫反应，以生成特定的免疫反应，以对抗两种或多种病毒株或血清型。

于部分具体实施例中，该CVA6或CVA10病毒颗粒或其他病毒颗粒(例如CVA16或EVA71病毒颗粒)进一步进行纯化或去活化或两者皆进行。

于部分具体实施例中，纯化系藉由液相色谱纯化法、蔗糖梯度超速离心纯化、或其组合进行。较佳者，藉由蔗糖梯度超速离心以进行纯化。更佳者，于蔗糖梯度超速离心纯化中使用10～60％蔗糖密度梯度。

具体而言，进行纯化以得到病毒之完整颗粒之区份、空的颗粒区份、及/或次颗粒(sub-particle)之区份。

于部分具体实施例中，完整颗粒之区份可于35～45％蔗糖梯度予以辨识。

于部分具体实施例中，空的颗粒区份可于25～35％蔗糖梯度中予以辨识。

于部分具体实施例中，该次颗粒区份可于低于25％蔗糖梯度予以辨识。

于部分具体实施例中，本发明免疫组合物可包含(i)CVA6之完整颗粒之区份、空的颗粒区份、次颗粒区份、或其任意组合；(ii)CVA10之完整颗粒之区份、空的颗粒区份、次颗粒区份、或其任意组合；(iii)除了CVA6及CVA10以外之肠病毒A型(例如CVA16或EVA71)之完整颗粒之区份、空的颗粒区份、次颗粒区份、或其任意组合；或(iv)(i)、(ii)、及(iii)之任意组合。

于特定具体实施例中，该等病毒之次颗粒区份一般可将之移除，以收集完整颗粒之区份及空的颗粒区份。

于部分具体实施例中，肠病毒之空的颗粒被测得具有P1多胜肽，其是于病毒组装及包装过程中未完全处理所形成者，具有65-95kDa之分子量。于部分具体实施例中，肠病毒之完整颗粒被测得具有VP1(32-35kDa)、VP2(24-28kDa)、VP3(24-28kDa)及VP4(6-8kDa)。

具体而言，将所收集之病毒颗粒去活化，例如，藉由福尔马林处理。于特定实例中，于20～45℃，以甲醛处理2～20天。

于另一具体实施例中，本发明方法进一步包含决定该纯化肠病毒颗粒剂量之步骤。

以上所述的有效剂量之免疫原或组合物，可以非经肠道方式施予，如皮下注射、或肌肉注射。或是，其他施予方式包括栓剂及口服配方皆可适用。以栓剂而言，结合剂及载剂可包括，例如，聚烯烃基二醇、或三酸甘油酯。口服免疫原或组合物，可包括常用之赋形剂，像是医药级糖精、纤维素、碳酸镁及其类似物。该等免疫原或组合物可为溶液、悬浮液、锭剂、药丸、胶囊、缓释配方或粉末形式。

本发明之免疫原或免疫组合物所制备之疫苗，可以适用于该剂型配方之方式施予，以及该剂量是医疗有效的、具保护力的、及具免疫原性的。施予的量可取决于施予个体，包括，例如，个体免疫系统之合成抗体的能力，以及如有需要，以生成一细胞媒介之免疫反应。所需施予之活性成分的精确剂量，取决于专业人士之判断。然而，适用剂量之范围可由该领域具有技艺者来判定，且可能为本发明多胜肽的微克量。起始的施予及补强剂量之适用的间距亦可变的，但可包括起始的施予后，紧接着另一施予。该疫苗之剂量亦可取决于施予路径，且根据宿主大小而改变。

对病毒感染较敏感之个体(特别系指年轻孩童)，可由该领域所习知方法以找到，并施予本发明之组合物。本发明组合物之剂量取决于，例如，于特定抗原时，无论有无佐剂共同施予，以及无论共同施予之佐剂类型、无论施予之模式及频率，皆可由该领域具有技艺者所判定。如有需要，可重复施予，此也可由该领域具有技艺者所决定。例如，一初始剂量可紧接着隔周的三次补强剂量。补强注射可于初次免疫4～8周后给予，以及使用相同配方于8～12周再给予二次补强。可从个体中取得血清或T细胞以测试由该组合物所诱发之抗该病毒之免疫反应。该等分析可对抗蛋白或感染之抗体或毒杀性T细胞之方法，为该领域所习知的。如有需要可给予额外的补强剂。藉由不同量之多胜肽/蛋白，该组合物的剂量、及施予之频率、免疫计划皆可适化，以诱发最佳之免疫反应。于大规模施予前，较佳系先进行效力测试。于效力试验中，一非人类个体(如小鼠、大鼠、兔子、马、猪、牛或猴子)可被以口服方式或非经肠道方式施予本发明组合物。经初次施予后，或适当之补强施予后，测试个体及对照个体(接受假的施予)皆以病毒攻毒以测试该组合物之效力。

于另一具体实施例中，本发明之免疫组合物进一步包含医药可接受佐剂。较佳者，该佐剂包含磷酸铝。

于另一方面，本发明提供一种诱发免疫反应以对抗肠病毒感染之方法，包含施予有需求个体有效量之本发明的免疫原或免疫组合物。

于特定具体实施例中，该肠病毒感染系由肠病毒A型所造成，系选自由克沙奇病毒A2(CVA2)、克沙奇病毒A3(CVA3)、克沙奇病毒A4(CVA4)、克沙奇病毒A5(CVA5)、克沙奇病毒A6(CVA6)、克沙奇病毒A7(CVA7)、克沙奇病毒A8(CVA8)、克沙奇病毒A10(CVA10)、克沙奇病毒A12(CVA12)、克沙奇病毒A14(CVA14)、克沙奇病毒A16(CVA16)、肠病毒A71(EVA71)、肠病毒A76(EVA76)、肠病毒A89(EVA89)、肠病毒A90(EVA90)、肠病毒A91(EVA91)、肠病毒A92(EVA92)、肠病毒A114(EVA114)及肠病毒A119(EVA119)所组成之群组。

本文所述之“个体”为人类或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括但不限于灵长目、有蹄类、犬类及猫类。

具体而言，本发明之方法可有效提供保护性效果以对抗肠病毒感染，进而预防或治疗由肠病毒感染所致之疾病，特别系指手足口病(HFMD)。

本发明亦提供一种单离之抗体，其可选择性地与具有上述序列之一的胜肽或本文所述之病毒颗粒结合。本发明进一步提供一种产生抗体之方法，藉由使用前述之免疫原或免疫组合物免疫动物，其于动物体内诱发之免疫反应以生成抗体，再从该动物中分离该抗体、或生产该抗体之细胞。

实施例

本发明中，吾人发现克沙奇病毒株CVA6及CVA10，不像EV71及CVA16，不会感染用于生产人类疫苗之细胞株，像是Vero细胞、MRC-5细胞及MDCK细胞。相反地，该等病毒(CVA6及CVA10)于HEK293细胞中复制的很好。因此，吾人为第一个发表于HEK293细胞中生产、纯化CV不同之毒株，并将分析其特性。当以病毒感染剂量(MOI)为10^-2至10^-5用于感染时，于感染后6天内，该CV病毒力价可达超过每ml中有10⁶半数组织培养感染量(TCID₅₀)。当收获病毒浓缩物时，藉由一蔗糖梯度分层超速离心进行纯化，以分离及侦测两种CV病毒区份。于25～35％蔗糖区份所测得之病毒颗粒，具有低的病毒感染力及RNA含量。于35～45％蔗糖区份所得到之病毒颗粒，具有高的病毒感染力及RNA含量，以及经SDS-PAGE分析后，得知系由4种病毒蛋白(VP1、VP2、VP3、及VP4)组成。将该两种病毒区份以福尔马林进行去活化，且于小鼠免疫原性研究中，发现该感染性颗粒区份可诱发CV毒株专一的中和抗体反应。但该等抗血清无法中和EV71及CVA16。另一方面，无论是以CVA6及CVA10之感染性颗粒或非感染性颗粒免疫兔子，皆可产生中和抗体反应，但该等抗体仍无法中和EV71及CVA16感染。该等结果显示于不同肠病毒血清型间之交互反应是微弱的，且需使用源自不同病毒之组成，以发展及混合一有用且有效之多价肠病毒疫苗。

材料及方法

伦理声明

所有实验系按照NHRI实验动物中心之规定进行。动物试验计划皆经NHRI实验动物照护及使用委员会所审核且经批准(批准计划编号：NHRI-IACUC-098033-A、NHRI-IACUC-101042-A及NHRI-IACUC-101050-AC)

细胞、培养基及病毒

人胚肾细胞293(HEK293)系源自Life Technologies^TM。非洲绿猴肾细胞(Vero)、MDCK及横纹肌肉瘤(RD)细胞系由中国台湾疾病管制署(中国台湾CDC)或NHRI疫苗中心所慷慨提供。该原始细胞株系源自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。吾人以VP-SFM、Dulbecco'smodified Eagle's培养基+10％FBS，及其他适当的无血清培养基以培养该等细胞株。该E59株(基因型B4)，EV71病毒之临床分离株，系源自中国台湾CDC。该CVA6、CVA10及CVA16分离株，系源自中国台湾CDC或王贞仁教授(NCKU)。CVA6、CVA10及CVA16病毒系自感染三天后(DPI)之经感染RD细胞上清液收集而得。种病毒力价系以TCID₅₀法判定，且该等种病毒皆存放于-80℃。因为RD细胞不用于人类疫苗生产，因此，使用GMP级认证之HEK293细胞株以繁殖CVA6及CVA10，其无法感染Vero及MDCK细胞株。该萃取的病毒RNA系以一步RT-PCR(Promega,Madison,WI USA)增幅。本发明中所使用之寡核甘酸引子序列，系经客观理性设计，并可从文中得知。该增幅后之DNA系使用ABI 3730 XL DNA分析仪(Applied Biosystem Inc.,Foster City,CA USA)定序。VP1核甘酸序列及所有四个结构性病毒蛋白之胺基酸序列，皆于本文中有所描述。

病毒培养

肠病毒(EV71、CVA16、CVA6及CVA10)，系使用无血清VP-SFM培养基、Dulbecco'smodified Eagle's培养基+10％FBS及其他适用之无血清培养基于T角瓶，以Vero细胞或HEK293细胞培养。经培养6天后，细胞密度可达每ml中1至2.5×10⁶细胞。将细胞以MOI为10^-2至10^-5之病毒进行感染。经感染后6天(DPI)，自培养之上清液中收获及收集病毒。

使用蔗糖梯度超速离心法以纯化病毒颗粒

从T角瓶培养物中收获病毒培养上清液。藉由通过0.65μm滤膜(Sartorius,Germany)，以移除细胞碎片，并以100K TFF压缩机(Pall)将上清液浓缩20倍。将粗病毒浓缩物(～50mL)装载入10～60％连续蔗糖梯度，并以分区回转头，于Hitachi CP80超速离心机中，以32,000rpm离心3小时。收集于10～60％蔗糖之区份(每个区份50mL)，并分别以1L PBS(pH 7.4)(Gibco/Life Technologies,Taipei,Taiwan)进行三次交换透析，接着存于4℃。使用组织培养感染剂量(TCID₅₀)法以分析纯化病毒区份之感染力。将该等区份进行SDS-PAGE及西方墨点分析。将辨识出含有病毒之区份混合后，并以Amicon 100K管(Millipore,Belerica,MA USA)进行渗滤浓缩，接着进行3,000x g离心，之后存于4℃。纯化的病毒区份，系以BCA蛋白法判定总蛋白浓度。将一半的纯化病毒区份(15mL)以每份0.5mL方式存于-80℃；另一半系以1/4000(v/v)福尔马林，于37℃去活化3天，并存于4℃。

下表4及5中之去活化的EV-71颗粒，系以Liu et al.,PLos One.6(5):e20005所述方式制备，下表4及5中之去活化的CVA16颗粒，系以Chong et al.,PLoS One,2012.7(11):e49973所述方式制备。

病毒力价之判定

以TCID₅₀中间数端点判定病毒力价。序列稀释病毒样本(从10^-1至10^-8)后加入生长于96孔盘中之RD细胞中，每次稀释会使用6个重复样本。将96孔盘置于37℃中培养6天，并计算感染RD细胞之细胞病变效应(CPE)以测定TCID₅₀值。使用Reed-Muench法，以计算TCID₅₀值。

SDS-PAGE分析及点渍法

纯化病毒区份之SDS-PAGE分析，系根据制造商建议之方法，于NuPAGE 4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen,CA USA)上进行。将四种经福尔马林去活化之病毒颗粒(CVA6、CVA10、CVA16及EV71)直接滴上BA85硝化纤维膜(Whatman)以进行点渍法。之后，将膜浸泡在溶于PBS之5％脱脂牛奶中，于4℃整夜浸泡。MAB979(Millipore,USA)及鼠抗病毒血清，于室温结合2小时。接着，将膜以15mL试验缓冲液冲洗5次。加入1mL含有辣根过氧化氢酶(HRP)-共轭之驴抗鼠二级抗体(Jackson ImmunoResearch)(1:5,000稀释倍数)之PBS缓冲液，以侦测病毒颗粒与个别抗体结合情形。于室温作用1小时后，以试验缓冲液冲洗该膜6次，及将该点渍干燥。加入TMB受质溶液(KPL)以显示该等点渍。

动物免疫原性研究

于免疫前，将不同量之去活化病毒颗粒以磷酸铝，于室温进行3小时的吸收。将一组6只母的BALB/c小鼠(6-8周龄)，以0.2mL(0.5μg+60μg Alum)进行肌肉免疫(i.m.)。将兔子以0.5mL(2.5μg+300μg Alum)进行肌肉免疫(i.m.)。所有动物系以相同剂量，于首免后间隔两周，进行补强两次。经免疫后之小鼠及兔子，于最后一次补强后1周采血，收集血清，并用于分析病毒中和能力。

病毒中和试验

从免疫小鼠收集血清样本，并于56℃去活化30分钟。将每一个血清样本以新鲜的细胞培养基，以两倍序列稀释方式加入微管中；接着，将400μL 200-TCID₅₀病毒悬浮液加入含有400μL序列稀释后之血清的微管中。经于4℃作用18～24小时后，将100μL序列稀释样本加入含有RD细胞之96孔盘中。于96孔盘之培养物，于37℃作用7天，并藉由计算感染细胞之CPE以测量TCID₅₀值。50％中和抑制剂量(ID₅₀)之计算，系使用Reed-Muench法，计算可降低50％病毒力价时之相应的血清稀释倍数。

以穿透式电子显微镜(TEM)分析病毒颗粒之特性

将去活化的病毒颗粒置于经Formvar包覆的及碳汽化的200mesh之铜网格中。于室温，将样本置于铜网格上15分钟，并使用滤纸将过多的样本移除。经以ddH₂O清洗两次后，将该铜网格以2％磷钨酸溶液染色2分钟，接着使用滤纸移除。该染色后之网格，经3-7天干燥后，以JEM-2100F穿透式电子显微镜观察。

实施例1：发展多价免疫原性成分之HFMD疫苗的想法

一无血清、且以Vero细胞为主，经福尔马林去活化之全病毒EV71疫苗已被开发，且已进行人体临床试验(Wu et al.,2004；Liu et al.,2007；Liu et al.,2011；Chang etal.,2012；Chou et al.,2012；Li et al.,2012；Cheng et al.,2013；Zhu et al.,2013)。令人惊讶的是，预期外之结果显示于细胞培养试验中，EV71疫苗无法保护CVA16感染(Chouet al.,2013)。吾人近期对于CVA16候选疫苗之研究，亦显示鼠的及兔的抗CVA16抗血清无法中和EV71(Chong et al.,2012)。当该等病毒株((EV71、CVA6、CVA10及CVA16)之蛋白序列被排列及分析；发现P1胜肽之相似度，于P1序列上可达65～80％(表1)。为了克服由其他常见之肠病毒株(如CVA6及CVA10)所造成之HFMD，现急需发展一包含不同肠病毒株之多价免疫原性成分的HFMD疫苗。

表1.肠病毒P1胜肽排列之相似度(％)

实施例2：建立克沙奇病毒A群之新颖生物性制程

用于制造人类多价HFMD疫苗的生物性制程已被发展探究。基于公开文献中(Liuet al.,2007；Chou et al.,2012)所述之发展EV71疫苗之现有生物性制程，令吾等惊讶的是，于无血清培养环境下，CVA6及CVA10可于RD细胞中感染及复制，但无法对Vero细胞感染及复制(图1)。然而，RD细胞并不像HEK293细胞一样适合用于生产人类疫苗。请同时参阅表2及表3。

表2：于不同细胞中所生产之肠病毒的病毒力价

病毒力价(TCID50/mL)

CPE：细胞病变效应

为了确认没有病毒蛋白可于Vero细胞培养中被表现及生成，使用两种单株抗体(N1及MAB979可分别专一性辨识EV71及CVA16之VP1及VP2)以侦测被CVA6或CVA10感染之Vero细胞培养物中之病毒性成分。于点渍分析结果显示，CVA6及CVA10皆没有病毒蛋白可被测得(图2)。因此，该无血清之Vero细胞为基础之疫苗概念，可能无法应用于生产多价HFMD疫苗。

实施例3：使用HEK293细胞培养以生产病毒

既然CVA6及CVA10无法感染Vero细胞及RD细胞，无法用于人类疫苗生产，因此，其他可能的GMP级认证之细胞株，如MDCK、MRC-5、CHO及HEK293，遂被进行测试，并用于繁殖CVA6及/或CVA10。令吾人惊讶地，CVA6及CVA10皆仅能感染HEK293细胞(图3)。

为了取得足够之CVA6及CVA10以分析生化及免疫原特性，将该等病毒培养于HEK293细胞中。经6天培养后，细胞密度达到每mL中有1～2.5×10⁶细胞。将细胞以MOI为10^-2至10^-5之浓度进行感染。于感染后6天(DPI)从细胞培养上清液中收获及收集病毒。请参阅表3。

表3：于HEK293细胞中生成之肠病毒之病毒力价

病毒力价

CPE：细胞病变效应

当EV71感染HEK293细胞时，病毒力价可达0.5-1.6x10⁸ TCID50/mL。

基于此结果，生物性制程可使用多种生物反应器系统，包括悬浮式生物反应器、微载体生物反应器及潮汐式生物反应器。

实施例4：藉由蔗糖梯度分层超速离心以纯化CV病毒颗粒

于7或8DPI时，从培养上清液中收获及收集病毒。藉由透过0.65μm及0.22μm滤膜以进行微过滤，藉此将细胞碎片移除，以及使用一100kDa截断之双过滤膜，于切向流过滤(TFF)盒中将病毒原液进行20倍浓缩。接着，将浓缩后的病毒原液装载入10～60％连续蔗糖梯度中，并使用一分区旋转头，于Hitachi CP80超高速离心机中，以32,000rpm进行离心3小时。收集蔗糖梯度区份进行感染RD细胞分析(病毒TCID₅₀)以及SDS-PAGE分析，如图4及图5所示。含有病毒抗原之第一区系在区份10～16，其含有25-35％蔗糖，且经TCID₅₀分析显示，该区没有CVA6及CVA10感染性或相当低(分别如图4A及图5A所示)。基于生化、病毒及免疫原特性，该等病毒颗粒被认为是假的/有缺陷的病毒颗粒或空的颗粒。含有病毒颗粒之第二区被发现与具有感染力之病毒位在同样之区份17～22。基于生化、病毒、及免疫原特性，该等感染性病毒颗粒被认为是真的病毒颗粒或完整的颗粒。确认了空的病毒颗粒区份位于25～35％蔗糖梯度，以及完整的颗粒区份位于35～45％蔗糖梯度。纯化的病毒区份之感染力，系再次以病毒TCID₅₀法、SDS-PAGE及西方墨点分析法再次分析。将分区离心之纯化的CV病毒颗粒混合，并使用Amicon100K管，于3000xg离心，进行双过滤来浓缩。每一个混合后之病毒颗粒区份系个别地以PBS透析。将纯化之病毒原液以BCA蛋白法判定其之总蛋白浓度。将纯化的病毒以0.5mL方式等份存于4℃。

实施例5：藉由穿透式电子显微镜(TEM)分析CV病毒颗粒之生物物理特性

以TEM分析及显示CV空的及完整颗粒之物理结构。为了生物安全性考虑，纯化的病毒液系个别地以福尔马林溶液(v/v 1:4000稀释)，于37℃进行去活化3天。经如同材料及方法所述之方式制备后，以TEM分析样本后，发现于CVA6及CVA10空的颗粒中，有部分不规则之正二十面体颗粒结构(图6A及图6B)。此与福尔马林去活化的完整颗粒(图6C及图6D)之结构是相似的；可能是因为病毒完整颗粒之正二十面体结构系经福尔马林去活化后所破坏之故。两种CV病毒颗粒之直径约30～35nm，于微小核糖核酸病毒科之EV71及CVA16非常相似。[30-35]

实施例6：CVA16病毒颗粒之病毒蛋白组成

由蔗糖梯度分层超速离心及TEM生物物理分析，皆证明CV病毒颗粒具有两种形式。空的颗粒显示含有许多不同分子量(MWs)之蛋白条带(图7，道1及3)。部分高分子量之蛋白代表P1多胜肽于病毒组装及包装过程中，很有可能没有完全完成蛋白分割之过程。有趣的是，可观察到有许多分子量低于17kDa之蛋白条带，是不曾出现在EV71及CVA16之空的颗粒中。将完整颗粒之病毒蛋白，以SDS-PAGE分离及分析，发现含有四个主要的蛋白条带，且具有与在EV71感染性颗粒中发现者有相似的分子量(图7，道2及4)。根据预测之蛋白序列(图7，道2及4)，该等四个主要的蛋白条带分别为人类肠病毒壳体蛋白VP1(32-35kDa)、VP2(24-28kDa)、VP3(24-28kDa)及VP4(6-8kDa)。总结，该等结果指出该两种病毒颗粒具有不同之蛋白组成。再者，该不成熟的壳体系由不完全之蛋白切割病毒蛋白所构成，且可能仍可形成颗粒结构(如下所示)。

实施例7：CV病毒颗粒之免疫原性研究

吾人想进一步探讨是否该两种经福尔马林去活化后之CV病毒颗粒可否产生强力且有效之免疫反应。于免疫前，系将不同量之去活化CV颗粒与磷酸铝，于室温下吸收3小时。将一组6只母BALB/c小鼠(6～8周龄)分别以0.2mL(0.5μg+60μg Alum)进行肌肉免疫(i.m.)。将4只兔子以0.5mL(2.5μg+300μg Alum)进行肌肉免疫(i.m.)。所有动物以相同剂量，于首免后2周进行补强两次。于最后一次补强后1周，将免疫小鼠及兔子采血，收集血清并用于分析病毒中和能力。

无论源自经福尔马林去活化之CVA6完整颗粒或空的CVA6颗粒所免疫之小鼠组的小鼠抗血清，可产生对于CVA6病毒有专一性之中和抗体反应(表4)。此代表于RD TCID₅₀试验中，CVA6专一性抗血清仅可中和CVA6感染，且无法对抗EV71、CVA10或CVA16感染。如预期地，由空颗粒所诱发之小鼠抗血清之平均病毒中和力价(1/32)，低于完整颗粒抗血清所得之力价(1/427)10倍。不同于CVA6，无论以经福尔马林去活化之CVA10空颗粒、或CVA10完整颗粒免疫小鼠，所诱发之CVA10专一性病毒中和反应，皆很低(1/11)或趋近于无(<1/8)(表4)。此点令人感到惊讶，因为于小鼠及兔子之免疫原性研究中，经福尔马林去活化之CVA16完整颗粒，发现可诱发很高之CVA16专一性中和抗体反应。于先前EV71研究中，源自经福尔马林去活化之EV71完整颗粒的小鼠抗血清之EV71专一性中和力价，被发现约为1/2000。基于目前结果，福尔马林去活化可能会破坏CVA10之部分中和抗原决定基，其可能因此造成不佳之病毒中和抗体反应。此点与吾人先前研究所发现者相似，即部分EV71病毒株之病毒中和抗原决定基对于化学去活化(如福尔马林)、UV及热处理，相当敏感。基于目前结果，应增加CVA10之剂量以增强中和抗体反应。

为了进一步探讨经福尔马林去活化之CVA10是否真的是一个不佳之免疫原，或其所诱发之低抗体反应是因为小鼠免疫原性之问题，因此，以2.5μg经福尔马林去活化及铝胶调配后的CVA16颗粒，以i.m.方式，每隔两周进行免疫两组兔子，共免疫三次(每组3只兔子)。其中两只兔子经福尔马林去活化之完整颗粒免疫后所得到之抗血清，被发现具有1/32及1/16倍之中和力价(平均力价为1/26，如表5所示)，以及免疫相同量之经福尔马林去活化及经铝胶调制之空的颗粒的兔子，其抗血清具有相似的抗CVA10病毒之中和力价(1/16及1/32)(表5)。该等中和力价仍远低于该等先前研究所报告之从EV71完整颗粒者所诱发之力价。该等抗EV71力价，分别从小鼠及兔子免疫原性研究中可知，约为1/2000及1/32,000。

为了探讨是何种因子造成该等低落之中和抗体反应，吾人可排除疫苗沉淀之可能性，因为观察含有福尔马林处理之CVA10病毒颗粒之溶液，无明显之病毒颗粒聚集的现象。很有可能是福尔马林去活化过程中，破坏部分重要之病毒中和的抗原决定基。

吾人进一步想探讨由CVA6病毒所产生之兔子中和抗体，可否对于EV71有交叉中和能力。如同小鼠抗CVA6抗体，将兔子抗血清于中和试验中进行测试，发现于1/8稀释倍数时对于EV71不具活性(表5及6)。目前结果指出以福尔马林去活化之CVA6候选疫苗所诱发之中和抗体反应是对于病毒有专一性的。吾人先前研究亦证实福尔马林去活化之EV71候选疫苗所诱发之EV71专一性中和抗体反应，对于CVA16不具有、或呈现不佳之交叉中和活性。综合以上结果，应发展一多价EV71/CVA6/CVA10/CVA16疫苗，并对造成HFMD之人类肠病毒进行测试。

实施例8：含有EV71、CVA6、CVA10及CVA16之病毒颗粒的多价HFMD候选疫苗之免疫原性研究

吾人进一步想探讨经福尔马林去活化之CVA6及CVA10完整颗粒，与EV71及CVA16病毒颗粒一同调制后，是否可产生强烈且有效之免疫反应，以对抗该四种病毒。于免疫前，以不同量之去活化颗粒以磷酸铝，于室温下进行吸收3小时。以0.2mL(每种病毒颗粒0.5μg+60μg Alum)以肌肉注射方式(i.m.)免疫一组6只BALB/c母小鼠(6～8周龄)。以0.5mL(每种病毒颗粒2.5μg+300μg Alum)以肌肉注射方式(i.m.)免疫四只兔子。所有动物以相同剂量，于首免后间隔两周补强两次。于最后一次补强后1周将免疫小鼠及兔子采血，并收集血清用于分析病毒中和反应。

以多价福尔马林去活化之完整颗粒者，免疫小鼠组所产生之小鼠抗血清，可生成对抗所有四种病毒之病毒中和抗体反应(表4)。此代表，于RD TCID₅₀试验中，该等抗血清不仅可中和CVA10感染，亦可对抗EV71、CVA6及CVA16感染。此结果亦代表多价福尔马林去活化之完整颗粒可增强抗CVA10病毒中和抗体反应(表4)。

表4.分别由CVA6、CVA10、CVA16及EV71福尔马林去活化之病毒颗粒，所产生之6种小鼠抗血清之肠病毒中和力价，其由TCID50中和试验所测得。

表5.分别由CVA6或CVA10福尔马林去活化之病毒颗粒，所产生之兔子抗血清之肠病毒中和力价，其由TCID50中和试验所测得。

实施例9：以病毒颗粒免疫所产生之小鼠抗血清之辨识能力

吾人使用点渍分析以确认病毒及抗血清间之辨识关系。将五组小鼠抗血清，用于侦测CVA6、CVA10、CVA16及EV71病毒颗粒。两种单株抗体(N1及MAB979分别可专一性辨识EV71及CVA16之VP1及VP2)来侦测对照组之病毒组成。该等结果显示于图8。以CVA6 E颗粒所免疫而得之小鼠抗血清，可辨识CVA6及CVA10病毒颗粒。然而，以CVA6 F颗粒所免疫而得之小鼠抗血清，仅可辨识CVA6病毒颗粒。此相似的结果，亦可见于CVA10试验结果。以CVA10 E颗粒免疫之小鼠抗血清，可辨识CVA6及CVA10病毒颗粒，以及以CVA10 F颗粒免疫之小鼠抗血清，仅可辨识CVA10病毒颗粒。以多价F颗粒免疫所得之小鼠抗血清，可辨识CVA6、CVA10、CVA16及EV71病毒颗粒。然而，该小鼠抗血清对于辨识CVA16病毒颗粒之能力较弱。N1单株抗体仅可高度辨识EV71病毒颗粒，而对其他株没有反应。MAB979单株抗体可高度辨识EV71及CVA16病毒颗粒。该等结果显示，以不同病毒颗粒免疫所得之小鼠抗血清，具有非常不同之辨识能力的特性。

本发明提供一以细胞培养方式之肠病毒疫苗(较佳为HFMD疫苗)之重要信息。具体地，为了消弭HFMD，需要一多价EV71/CVA6/CVA10/CVA16疫苗配方。

简言之，本发明系基于，至少部分，于细胞培养分析中，诱发之小鼠抗体可对抗EV71及CVA16，但无法中和CVA6及CVA10感染。为了发展CVA6及/或CVA10候选疫苗，本发明发现用于发展EV71疫苗之生物性制程不是十分有效，因为CVA6及CVA10无法于有血清及无血清之Vero细胞培养中复制。亦测试过不同细胞基质，像是MDCK、MRC-5及CHO细胞株等用于人类疫苗制造者，皆对于CVA6及CVA10复制不佳。于本发明中，以生产重组腺病毒疫苗之HEK293细胞进行测试，发现对于CVA6及CVA10之复制效果很好。因此，本发明发展一使用HEK293细胞以生产CVA6或CVA10、或其他肠病毒A型之病毒颗粒的技术，并提供一含有CVA6或CVA10或两者的病毒颗粒之免疫组合物以对抗肠病毒感染，以供人类使用；其中该组合物可择地包含其他除了CVA6及CVA10以外之肠病毒A型之病毒颗粒，特别是指CVA16或EVA71或两者。

具体而言，本发明发现从CVA6或CVA10所纯化之感染性病毒颗粒，可对于同源之病毒具有强烈之中和抗体反应，但却无法中和其他病毒，如CVA16及/或EV71。因此，吾人进一步发展一多价疫苗，包含EV71、CVA6、CVA10及CVA16病毒颗粒，其可有效诱发保护性免疫反应，以对抗EV71、CVA6、CVA10及CVA16感染，并预防其所造成之疾病，特别系指HFMD。

序列信息

>CVA6_M0746(870A.A.)(SEQ ID NO:1)

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序列表

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<120> 作为对抗人类肠病毒感染之免疫原的病毒颗粒及其制造

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405 410 415

Gly Pro Trp Gln Ser Thr Ile Leu Gly Gln Leu Cys Arg Tyr Tyr Thr

420 425 430

Gln Trp Ser Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Ala Gly Ser Phe

435 440 445

Met Ala Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Asn

450 455 460

Val Pro Ala Asp Arg Ile Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp

465 470 475 480

Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Val Pro Trp Ile Ser

485 490 495

Asn Thr His Tyr Arg Ala His Ala Arg Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Tyr

500 505 510

Thr Thr Gly Ile Ile Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro

515 520 525

Ile Gly Ala Pro Thr Thr Ala Tyr Ile Val Ala Leu Ala Ala Ala Gln

530 535 540

Asp Asn Phe Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Thr Glu Asp Ile Glu Gln

545 550 555 560

Thr Ala Asn Ile Gln Gly Asp Pro Ile Ala Asp Met Ile Asp Gln Thr

565 570 575

Val Asn Asn Gln Val Asn Arg Ser Leu Thr Ala Leu Gln Val Leu Pro

580 585 590

Thr Ala Ala Asp Thr Glu Ala Ser Ser His Arg Leu Gly Thr Gly Val

595 600 605

Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser

610 615 620

Asp Lys Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn His His Ser Thr

625 630 635 640

Gln Glu Thr Ala Ile Gly Asn Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Ser

645 650 655

Ile Ile Thr Met Pro Thr Thr Gly Thr Gln Asn Thr Asp Gly Tyr Val

660 665 670

Asn Trp Asp Ile Asp Leu Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Cys

675 680 685

Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Val

690 695 700

Ala Lys Pro Asn Gly Glu Leu Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Tyr

705 710 715 720

Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Thr Ser Arg Asp Ser Phe Ala Trp

725 730 735

Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Met Thr Asp Pro Pro

740 745 750

Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp

755 760 765

Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Leu Gln Ala Asn Asp

770 775 780

Leu Asp Tyr Gly Gln Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Ile

785 790 795 800

Arg Thr Val Gly Thr Glu Lys Ser Pro His Ser Ile Thr Leu Arg Val

805 810 815

Tyr Met Arg Ile Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Leu Arg

820 825 830

Asn Gln Pro Tyr Leu Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp

835 840 845

Ile Lys Cys Thr Ser Thr Ser Arg Asp Lys Ile Thr Thr Leu

850 855 860

<210> 4

<211> 305

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 4

Asn Asp Pro Ile Thr Asn Ala Val Glu Ser Ala Val Ser Ala Leu Ala

1 5 10 15

Asp Thr Thr Ile Ser Arg Val Thr Ala Ala Asn Thr Ala Ala Ser Thr

20 25 30

His Ser Leu Gly Ile Gly Arg Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr

35 40 45

Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys

50 55 60

Val Met Asn Arg Asn Gly Val Asn Glu Ala Ser Val Glu His Phe Tyr

65 70 75 80

Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Val Val Glu Val Lys Asp Ser Gly Thr

85 90 95

Ser Leu Asp Gly Tyr Thr Val Trp Pro Ile Asp Val Met Gly Phe Val

100 105 110

Gln Gln Arg Arg Lys Leu Glu Leu Ser Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala

115 120 125

Glu Phe Thr Phe Val Ser Asn Leu Asn Asn Ser Thr Thr Pro Gly Met

130 135 140

Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Ser

145 150 155 160

Arg Lys Ser Tyr Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Ala

165 170 175

Lys Leu Ser Asp Pro Pro Pro Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro

180 185 190

Ala Thr Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu

195 200 205

His Lys Gln Ala Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Gln Cys Pro Asn Asn Met

210 215 220

Met Gly His Phe Ala Ile Arg Thr Val Ser Glu Ser Thr Thr Gly Lys

225 230 235 240

Asn Val His Val Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys His Val Arg Ala Trp

245 250 255

Val Pro Arg Pro Leu Arg Ser Gln Ala Tyr Met Leu Lys Asn Tyr Pro

260 265 270

Thr Tyr Ser Gln Thr Ile Thr Asn Thr Ala Thr Asp Arg Ala Ser Ile

275 280 285

Thr Thr Thr Asp Tyr Glu Gly Gly Val Pro Ala Asn Pro Gln Arg Thr

290 295 300

Ser

305

<210> 5

<211> 298

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 5

Gly Asp Pro Val Glu Asp Ile Ile His Asp Ala Leu Gly Asn Thr Ala

1 5 10 15

Arg Arg Ala Ile Ser Ser Ala Ala Asn Val Glu Ser Ala Ala Asn Thr

20 25 30

Thr Pro Ser Ser His Arg Leu Glu Thr Gly Arg Val Pro Ala Leu Gln

35 40 45

Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr Asp Glu Asn Met Ile

50 55 60

Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Arg Asn Gly Val Leu Glu Thr Thr Ile

65 70 75 80

Asn His Phe Phe Ser Arg Ser Gly Leu Val Gly Val Val Asn Leu Thr

85 90 95

Asp Gly Gly Thr Asp Thr Thr Gly Tyr Ala Thr Trp Asp Ile Asp Ile

100 105 110

Met Gly Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Met Phe Thr Tyr Met

115 120 125

Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Thr Thr Thr Glu Asn Gly Glu

130 135 140

Ala Arg Pro Tyr Met Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro

145 150 155 160

Lys Pro Thr Gly Arg Asp Ala Phe Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro

165 170 175

Ser Val Phe Val Lys Leu Asn Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val Pro

180 185 190

Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro

195 200 205

Thr Phe Gly Gln His Pro Glu Thr Ser Asn Thr Thr Tyr Gly Leu Cys

210 215 220

Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ala Val Arg Val Val Ser Arg Glu

225 230 235 240

Ala Ser Gln Leu Lys Leu Gln Thr Arg Val Tyr Met Lys Leu Lys His

245 250 255

Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Ile Arg Ser Gln Pro Tyr Leu Leu

260 265 270

Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Ser Lys Val Thr Asn Ser Ala Arg

275 280 285

Asp Arg Ser Ser Ile Lys Gln Ala Asn Met

290 295

<210> 6

<211> 297

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 6

Gly Asp Pro Ile Ala Asp Met Ile Asp Gln Thr Val Asn Asn Gln Val

1 5 10 15

Asn Arg Ser Leu Thr Ala Leu Gln Val Leu Pro Thr Ala Ala Asp Thr

20 25 30

Glu Ala Ser Ser His Arg Leu Gly Thr Gly Val Val Pro Ala Leu Gln

35 40 45

Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Lys Asn Leu Ile

50 55 60

Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn His His Ser Thr Gln Glu Thr Ala Ile

65 70 75 80

Gly Asn Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Ser Ile Ile Thr Met Pro

85 90 95

Thr Thr Gly Thr Gln Asn Thr Asp Gly Tyr Val Asn Trp Asp Ile Asp

100 105 110

Leu Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Leu Phe Thr Tyr

115 120 125

Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Val Ala Lys Pro Asn Gly

130 135 140

Glu Leu Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala

145 150 155 160

Pro Lys Pro Thr Ser Arg Asp Ser Phe Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn

165 170 175

Pro Ser Val Phe Val Lys Met Thr Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val

180 185 190

Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr

195 200 205

Pro Thr Phe Gly Glu His Leu Gln Ala Asn Asp Leu Asp Tyr Gly Gln

210 215 220

Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Ile Arg Thr Val Gly Thr

225 230 235 240

Glu Lys Ser Pro His Ser Ile Thr Leu Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys

245 250 255

His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Leu Arg Asn Gln Pro Tyr Leu

260 265 270

Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Cys Thr Ser

275 280 285

Thr Ser Arg Asp Lys Ile Thr Thr Leu

290 295

<210> 7

<211> 256

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 7

Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Ala Gln Leu

1 5 10 15

Thr Val Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile Val

20 25 30

Leu Ser Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro Ser Thr Asp Ala Thr

35 40 45

Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser Val Asn Arg Phe Tyr

50 55 60

Thr Leu Ser Thr Lys Ser Trp Lys Thr Glu Ser Thr Gly Trp Tyr Trp

65 70 75 80

Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Asp Thr Gly Val Phe Gly Gln Asn Ala

85 90 95

Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys Met His Val Gln Cys

100 105 110

Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Ala Ile Pro

115 120 125

Glu Phe Val Val Ala Ala Ser Ser Arg Ala Met Lys Pro Asn Gly Gln

130 135 140

Gly Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Thr Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln

145 150 155 160

Glu Phe Arg Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro Leu Ser Gln

165 170 175

Ala Leu Val Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys

180 185 190

Ala Thr Ile Ile Met Pro Tyr Val Asn Ala Leu Pro Phe Asp Ser Ala

195 200 205

Leu Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Val Val Ile Pro Ile Ser Pro Leu

210 215 220

Lys Tyr Cys Asn Gly Ala Thr Thr Glu Val Pro Ile Thr Leu Thr Ile

225 230 235 240

Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Ser Gly Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln

245 250 255

<210> 8

<211> 255

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 8

Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Ala Gln Leu

1 5 10 15

Thr Val Gly Asn Ser Ser Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile Val

20 25 30

Leu Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Thr Asp Ala Thr

35 40 45

Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser Val Asn Arg Phe Tyr

50 55 60

Thr Leu Asp Ser Lys Met Trp Gln Glu Asn Ser Thr Gly Trp Tyr Trp

65 70 75 80

Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Lys Thr Gly Val Phe Gly Gln Asn Ala

85 90 95

Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys Leu His Val Gln Cys

100 105 110

Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Val Ile Pro

115 120 125

Glu Phe Val Ile Ala Gly Arg Gly Ser Asn Thr Lys Pro Asn Glu Ala

130 135 140

Pro His Pro Gly Phe Thr Thr Thr Phe Pro Gly Thr Thr Gly Ala Thr

145 150 155 160

Phe His Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ser Gly Val Pro Leu Ser Gln Ala

165 170 175

Leu Ile Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys Ala

180 185 190

Thr Val Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Val Pro Phe Asp Ser Ala Ile

195 200 205

Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ile Val Ile Pro Val Ser Pro Leu Lys

210 215 220

Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ile Pro Ile Thr Ile Thr Ile Ala

225 230 235 240

Pro Leu Asn Ser Glu Phe Gly Gly Leu Arg Gln Ala Val Ser Gln

245 250 255

<210> 9

<211> 254

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 9

Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Ala Gln Leu

1 5 10 15

Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile Val

20 25 30

Ile Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Thr Asp Ala Thr

35 40 45

Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser Val Asn Arg Phe Phe

50 55 60

Thr Leu Asp Thr Lys Ser Trp Ala Lys Asp Ser Lys Gly Trp Tyr Trp

65 70 75 80

Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Val Gly Val Phe Gly Gln Asn Ala

85 90 95

Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys Val His Val Gln Cys

100 105 110

Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Val Leu Pro

115 120 125

Glu Tyr Val Leu Gly Thr Ile Ala Gly Gly Thr Gly Asn Glu Asn Ser

130 135 140

His Pro Pro Tyr Ala Thr Thr Gln Pro Gly Gln Val Gly Ala Val Leu

145 150 155 160

Thr His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro Leu Ser Gln Leu Thr

165 170 175

Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys Ala Thr

180 185 190

Ile Ile Val Pro Tyr Met Asn Thr Val Pro Phe Asp Ser Ala Leu Asn

195 200 205

His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Val Pro Val Val Pro Leu Asp Phe

210 215 220

Asn Ala Gly Ala Thr Ser Glu Ile Pro Ile Thr Val Thr Ile Ala Pro

225 230 235 240

Met Cys Ala Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala Val Lys Gln

245 250

<210> 10

<211> 240

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 10

Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe Leu Thr Thr

1 5 10 15

Asp Asp Gly Thr Ser Pro Pro Ile Leu Pro Gly Phe Glu Pro Thr Pro

20 25 30

Leu Ile His Ile Pro Gly Glu Phe Thr Ser Leu Leu Asp Leu Cys Gln

35 40 45

Ile Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Gly Thr Thr Gly Val

50 55 60

Ser Arg Leu Leu Ile Pro Val Arg Ala Gln Asn Asn Val Asp Gln Leu

65 70 75 80

Cys Ala Ser Phe Gln Val Asp Pro Gly Arg Asn Gly Pro Trp Gln Ser

85 90 95

Thr Met Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln Trp Ser Gly Ser

100 105 110

Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met Ala Thr Gly Lys

115 120 125

Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ser Ala Gln Pro Ala Thr Arg

130 135 140

Glu Ala Ala Met Leu Gly Thr His Ile Val Trp Asp Phe Gly Leu Gln

145 150 155 160

Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn Thr His Phe Arg

165 170 175

Ala Val Lys Thr Gly Gly Val Tyr Asp Tyr Tyr Ala Thr Gly Ile Val

180 185 190

Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Phe Val Val Pro Pro Asp Thr Pro Thr

195 200 205

Glu Ala Asn Ile Ile Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Asn Phe Thr Leu

210 215 220

Lys Leu Cys Lys Asp Thr Asp Glu Ile Gln Gln Thr Ala Glu Tyr Gln

225 230 235 240

<210> 11

<211> 240

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 11

Gly Ile Pro Ala Glu Leu Arg Pro Gly Thr Asn Gln Phe Leu Thr Thr

1 5 10 15

Asp Asp Asp Thr Ala Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe Thr Pro Thr Pro

20 25 30

Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Ser Leu Leu Glu Leu Cys Arg

35 40 45

Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Glu Ala Thr Gly Leu

50 55 60

Thr Arg Leu Leu Ile Pro Val Ser Ser Gln Asn Lys Ala Asp Glu Leu

65 70 75 80

Cys Ala Ala Phe Met Val Asp Pro Gly Arg Ile Gly Pro Trp Gln Ser

85 90 95

Thr Leu Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln Trp Ser Gly Ser

100 105 110

Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met Ala Thr Gly Lys

115 120 125

Met Leu Val Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Ser Ala Gln Pro Ala Asn Arg

130 135 140

Glu Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp Phe Gly Leu Gln

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn Thr His Phe Arg

165 170 175

Thr Ala Lys Thr Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Tyr Thr Ala Gly Val Val

180 185 190

Thr Leu Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Pro Glu Thr Pro Gly

195 200 205

Glu Ala Tyr Ile Ile Ala Met Gly Ala Ala Gln Asp Asn Phe Thr Leu

210 215 220

Lys Ile Cys Lys Asp Thr Asp Glu Val Thr Gln Gln Ala Val Leu Gln

225 230 235 240

<210> 12

<211> 242

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 12

Gly Ile Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe Leu Thr Thr

1 5 10 15

Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe His Pro Thr Pro

20 25 30

Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Asn Leu Leu Glu Ile Cys Arg

35 40 45

Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Leu Lys Thr Asn Glu Thr Thr

50 55 60

Pro Met Gln Arg Leu Cys Phe Pro Val Ser Val Gln Ser Lys Thr Gly

65 70 75 80

Glu Leu Cys Ala Ala Phe Arg Ala Asp Pro Gly Arg Asp Gly Pro Trp

85 90 95

Gln Ser Thr Ile Leu Gly Gln Leu Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln Trp Ser

100 105 110

Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Ala Gly Ser Phe Met Ala Thr

115 120 125

Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Asn Val Pro Ala

130 135 140

Asp Arg Ile Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp Phe Gly

145 150 155 160

Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Val Pro Trp Ile Ser Asn Thr His

165 170 175

Tyr Arg Ala His Ala Arg Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Tyr Thr Thr Gly

180 185 190

Ile Ile Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Ile Gly Ala

195 200 205

Pro Thr Thr Ala Tyr Ile Val Ala Leu Ala Ala Ala Gln Asp Asn Phe

210 215 220

Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Thr Glu Asp Ile Glu Gln Thr Ala Asn

225 230 235 240

Ile Gln

<210> 13

<211> 69

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 13

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Lys

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Glu Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Arg Gln Asp Phe Ala Gln

35 40 45

Asp Pro Ala Lys Phe Thr Arg Pro Val Leu Asp Thr Ile Arg Glu Val

50 55 60

Ala Ala Pro Leu Gln

65

<210> 14

<211> 69

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 14

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Gly

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Thr Arg Gln Asp Phe Thr Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ser Ile Arg Glu Leu

50 55 60

Ser Ala Pro Leu Asn

65

<210> 15

<211> 69

<212> PRT

<213> 克沙奇病毒 A

<400> 15

Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

1 5 10 15

Asn Ser Ala Ser Glu Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ala Tyr Ala Ala Ser Ala Gly Arg Gln Asp Met Ser Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Asp Pro Val Met Asp Val Ile His Glu Met

50 55 60

Ala Pro Pro Leu Lys

65

Claims (22)

1.一种制造对抗肠病毒感染的免疫原的方法，其特征在于

(a)将克沙奇病毒A6(CVA6)病毒颗粒感染人胚肾293(HEK293)细胞，于人胚肾293(HEK293)细胞之第一培养物中生成克沙奇病毒A6(CVA6)病毒颗粒，并从该第一培养物中，收集该CVA6病毒颗粒；或

(b)将克沙奇病毒A10(CVA10)病毒颗粒感染人胚肾293(HEK293)细胞，于人胚肾293(HEK293)细胞之第二培养物中生成克沙奇病毒A10(CVA10)病毒颗粒，并从该第二培养物中，收集该CVA10病毒颗粒；或

(c)同时进行步骤(a)及(b)。

2.如权利要求1所述的方法，其中CVA6病毒颗粒及CVA10病毒颗粒结合以形成一多价免疫组合物。

3.如权利要求1所述的方法，其中CVA6病毒颗粒、或CVA10病毒颗粒、或两者与除了CVA6及CVA10以外的肠病毒A型之病毒颗粒结合，以形成多价免疫组合物，其中除了CVA6及CVA10以外的肠病毒A型是选自由CVA16、及EV71、及其组合所组成之群组。

4.如权利要求3所述的方法，其中CVA6病毒颗粒及CVA10病毒颗粒与CVA16病毒颗粒及/或EV71病毒颗粒结合，以形成多价免疫组合物。

5.如权利要求3所述的方法，其中CVA6病毒颗粒及CVA10病毒颗粒与CVA16病毒颗粒及EV71病毒颗粒结合，以形成多价免疫组合物。

6.如权利要求3所述的方法，其中除了CVA6及CVA10以外的肠病毒A型之病毒颗粒是从HEK293细胞之第三培养物中生成及收集而得。

7.如权利要求1所述的方法，其中该CVA6或CVA10病毒颗粒可进一步纯化、或去活化、或两者兼具。

8.如权利要求7所述的方法，其中该纯化是藉由蔗糖梯度分层超速离心施行。

9.如权利要求7所述的方法，其中该去活化是以福尔马林处理施行。

10.如权利要求6所述的方法，其中除了CVA6及CVA10以外的肠病毒A型之病毒颗粒是经纯化及/或去活化。

11.一种制备对抗肠病毒感染的多价免疫组合物的方法，其特征在于：

(a)将CVA6病毒颗粒感染人胚肾293(HEK293)细胞，于人胚肾293(HEK293)细胞之第一培养物中生成CVA6病毒颗粒，并从第一培养物中收集CVA6病毒颗粒；

(b)将CVA10病毒颗粒感染人胚肾293(HEK293)细胞，于人胚肾293(HEK293)细胞之第二培养物中生成CVA10病毒颗粒，并从第二培养物中收集CVA10病毒颗粒；

(c)将CVA16病毒颗粒感染人胚肾293(HEK293)细胞，于人胚肾293(HEK293)细胞之第三培养物中生成CVA16病毒颗粒，并从第三培养物中收集CVA16病毒颗粒；

(d)将EV71病毒颗粒感染人胚肾293(HEK293)细胞，于人胚肾293(HEK293)细胞之第四培养物中生成EV71病毒颗粒，并从第四培养物中收集EV71病毒颗粒；及

(e)结合步骤(a)的CVA6病毒颗粒、步骤(b)的CVA10病毒颗粒、步骤(c)的CVA16病毒颗粒、及步骤(d)的EV71病毒颗粒，以形成多价免疫组合物。

12.如权利要求11所述的方法，其中CVA6病毒颗粒、CVA10病毒颗粒、CVA16病毒颗粒及EV71病毒颗粒是经纯化及去活化。

13.一种对抗肠病毒感染的免疫组合物，包含CVA6病毒颗粒、或CVA10病毒颗粒、或两者，其中CVA6病毒颗粒、或CVA10病毒颗粒、或两者是由HEK293细胞培养物中所生成及收集而得。

14.如权利要求13所述的免疫组合物，是供人类使用。

15.如权利要求13所述的免疫组合物，其中该肠病毒感染是由CVA6或CVA10或两者所造成。

16.如权利要求13所述的免疫组合物，进一步包含除了CVA6及CVA10以外的肠病毒A型病毒颗粒，其中除了CVA6及CVA10以外的肠病毒A型是选自由CVA16、及EV71、及其组合所组成之群组。

17.如权利要求16所述的免疫组合物，其包含CVA6病毒颗粒及CVA10病毒颗粒与CVA16病毒颗粒及/或EV71病毒颗粒。

18.如权利要求16所述的免疫组合物，其中除了CVA6及CVA10以外的肠病毒A型病毒颗粒从HEK293细胞之培养物中生成及收集而得。

19.一种对抗肠病毒感染的多价免疫组合物，包含CVA6病毒颗粒、CVA10病毒颗粒、CVA16病毒颗粒、及EV71病毒颗粒，其中CVA6病毒颗粒、CVA10病毒颗粒、CVA16病毒颗粒、及EV71病毒颗粒是由HEK293细胞培养物中所生成及收集而得。

20.一种如权利要求19所述的多价免疫组合物用于制备人类疫苗，以对抗肠病毒感染或其所造成疾病之用途。

21.如权利要求20所述的用途，其中该肠病毒感染是由CVA6、CVA10、CVA16或EV71、或其之任意组合所造成。

22.如权利要求20所述的用途，其中该肠病毒所造成之疾病为手足口病(HFMD)。

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