CN110184242B - 柯萨奇病毒a组6型(cva6)的小鼠强毒力攻毒株及其应用 - Google Patents

柯萨奇病毒a组6型(cva6)的小鼠强毒力攻毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种柯萨奇病毒A组6型(CVA6)的小鼠强毒力攻毒株及其应用。所述的柯萨奇病毒A组6型的小鼠强毒力攻毒株为强毒株CVA6‑S4，其全核酸序列如SEQ ID NO.2所示，全氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还涉及所述的强毒株CVA6‑S4在柯萨奇病毒疫苗效力评估和制备主动免疫动物模型中的应用。

Description

柯萨奇病毒A组6型(CVA6)的小鼠强毒力攻毒株及其应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一种柯萨奇病毒A组6型(CVA6)的小鼠强毒力攻毒株及其应用。
背景技术
2012年以前在中国大陆大多数地区引起手足口病的主要的肠道病毒血清型为EV71和CVA16，且重症病例和死亡病例以EV71感染为主。而近年的流行病学调查结果显示，CVA6已经成为引起手足口病的主要肠道病毒血清型，在一些地区其比例甚至已经超过50％。例如2013年吉林省长春市发生手足口病疫情，CVA6在病原谱中占比66.9％[1]。因CVA6感染而引起的重症病例也呈明显上升趋势[2]。除此之外，CVA6感染病例还具有其他重要特征，如导致成人感染患病[3]。患者临床症状往往并非典型的手足口病，而是头皮、耳朵、脸颊等全身多部位的丘疹、紫癜和疼痛性水泡疹，并伴有发热、神经系统症状和关节炎[4]。所以为了更全面的预防手足口病，需要研发包含多种肠道病毒抗原的多价手足口病疫苗，而CVA6为多价手足口病疫苗的重要抗原成分。
在疫苗的研发过程中，需要建立合适的感染模型对候选疫苗的效力进行评价，最常用的感染模型仍然是小鼠模型。国际学术期刊已发表的文章更多采用的是小日龄乳鼠的被动免疫保护模型，包括使用抗血清的预防性和治疗性被动保护模型和母传抗体被动免疫保护模型。被动免疫保护模型虽证实了中和抗体的保护作用，但不能模拟自然状态下疫苗免疫和病毒感染的过程，不能反映动物接种疫苗后的体液和细胞免疫应答及攻毒后的保护效力。所以更好的用于评价疫苗效力的动物模型是主动免疫保护模型，即使用候选疫苗直接对小鼠进行免疫并对小鼠进行攻毒。而大日龄小鼠对包括CVA6在内的柯萨奇A组病毒不敏感，使攻毒前没有初次免疫和加强免疫的窗口期，是主动免疫保护模型建立的技术障碍。因此，主动免疫保护模型建立的核心技术是获得能感染14日龄小鼠的攻毒株，使得新生乳鼠获得间隔一周的2次免疫，加强免疫后第5日中和抗体出现后进行攻毒，观察攻毒后14日龄小鼠的发病及致死率，与未免疫攻毒的对照组比较，以免疫攻毒组的小鼠存活率或发病保护率，计算候选疫苗保护效力。
参考文献：
[1]Han JF,Xu S,Zhang Y,Zhu SY,Wu DL,Yang XD,Liu H,Sun BX,Wu XY,QinCF.Hand,foot,and mouth disease outbreak caused by coxsackievirus A6,China,2013.J Infect 2014；69:303-305.
[2]赵奇，朱俊萍。中国手足口病的流行状况及病原谱变化分析。病毒学报。2015；31：554-59。
[3]Ramirez-Fort MK,Downing C,Doan HQ,Benoist F,Oberste MS,Khan F,Tyring SK.Coxsackievirus A6associated hand,foot and mouth disease in adults:clinical presentation and review of the literature.J Clin Virol2015；60:381-386.
[4]Mirand A,Henquell C,Archimbaud C,Ughetto S,Antona D,Bailly JL,Peigue-Lafeuille H.Outbreak of hand,foot and mouth disease/herpanginaassociated with coxsackievirus A6and A10infections in 2010,France:a largecitywide prospective observational study.Clin Microbiol Infect 2012；18:E110-118.
发明内容
本发明首先涉及一株柯萨奇病毒A组6型强毒株CVA6-S4，其全核酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述病毒的各个功能蛋白的编码序列为：VP4：749～955、VP2：956～1723、VP3：1724..2443、VP1：2444～3358、2A：3359～3808、2B：3809～4105、2C：4106～5092、3A：5093～5350、3B：5351～5416、3C：5417～5965、3D：5966～7354。
所述的柯萨奇病毒A组6型强毒株CVA6-S4，其全氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还涉及所述的强毒株CVA6-S4在柯萨奇病毒疫苗效力评估中的应用。
本发明还涉及所述的强毒株CVA6-S4在制备柯萨奇病毒主动免疫动物模型中的应用。
本发明还涉及所述的柯萨奇病毒A组6型强毒株CVA6-S4在制备柯萨奇病毒疫苗效力评估的试剂或试剂盒中的应用。
本发明的有益效果是：本研究使用基因组已测序、遗传背景清晰一致、可在RD细胞传代的克隆纯化株CVA6-P8-(13-5)作为出发毒株，采用颅内注射途径，感染日龄逐代增大的ICR小鼠。每代小鼠发病濒临死亡前，取其脑组织制备匀浆液，在RD细胞传代1次，获得高滴度毒株库，再次鼠脑传代。依次在1日龄、5日龄、7日龄、10日龄、12日龄小鼠中传代，获得可使12日龄小鼠致病、致死的强毒力小鼠适应毒种库CVA6-P8-(13-5)-P6+R8。对其进行克隆纯化，获得可使12日龄小鼠致病、致死的强毒株CVA6-S4。对其进行全基因组序列测定，与小鼠适应前的弱毒力CVA6-P8-(13-5)株进行比较，确定与小鼠体内毒力相关的核苷酸、氨基酸突变位点。
将CVA6-S4病毒在RD细胞传代扩增，对病毒收获液进行浓缩制备病毒浓缩液，并以高感染剂量(9.48x106CCID50/剂/只)感染14日龄小鼠，使得2周内100％小鼠致病、83.3％小鼠致死。使用全病毒灭活实心颗粒FP作为实验用疫苗，间隔6日免疫新生乳鼠两次后，以6-12个半数致死剂量(LD50)CVA6-S4攻毒，可以保护100％的14日龄小鼠抵抗CVA6-S4的致死性攻击，而未免疫攻毒组100％小鼠死亡。因此，成功建立了可用于候选疫苗效力评价的主动免疫保护模型。
附图说明
图1、柯萨奇病毒强毒株模型筛选流程图。
图2、柯萨奇病毒A组6型强毒株CVA6-S4主动免疫保护模型的疫苗效力评估：(2A)阴性对照组小鼠与实验组小鼠攻毒后的症状；(2B)攻毒后小鼠14日内的存活率。
图3、CVA6-S3、CVA6-S4、CVA6-S6和CVA6-S7感染12日龄ICR小鼠的存活曲线。
具体实施方式
RD细胞由武汉生物制品研究所有限责任公司质量控制部(Quality ControlDepartment，QC)提供。
质粒：pUC19购自大连TaKaRa，用于建立qRT-PCR方法中的标准品以对CVA6感染模型中的各个组织器官中的病毒载量进行测定。
SPF级ICR小鼠(各日龄)由武汉生物制品研究所有限责任公司实验动物中心提供。
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)克隆菌株DH5α(Φ80lacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,recA1,endA1,hsdR17,supE44,thi-1,gyrA96,relA)购自于TaKaRa公司。
CVA6-P8-(13-5)为武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室保存。为2016年从襄阳地区手足口病患儿的肛拭子样本中分离获得，其实验室编号为HEV69，该CVA6毒株在RD细胞上分离并培养共8代后通过末端稀释法获得第13-5个克隆株，记为CVA6-P8-(13-5)。
Al(OH)3佐剂浓度为14mg/mL，由武汉生物制品研究所有限责任公司提供。
病毒的培养
待T型瓶中RD细胞汇合度达到或接近100％时，于生物安全柜中先用适量无菌的0.01M的PBS溶液润洗细胞2次。然后加入适量的细胞维持液，按照一定的感染复数MOI加入已知滴度的病毒液。并置于37℃的CO2培养箱中静置培养。
病毒的收获及保存
倒置显微镜下观察接种病毒后的细胞状态，待细胞病变达到80％～90％后，转移培养瓶至-20℃冰箱中，然后反复冻融3次后转移至无菌离心管中，7,000g，离心10min使病毒液与细胞碎片分离，将病毒液分装至无菌离心管中，-80℃保存。
病毒的滴定
(1)倒置显微镜下观察T瓶中的RD细胞，当细胞汇合度达到或接近100％时，于超净台中先弃去旧的细胞培养基，然后用适量无菌的0.01M的PBS溶液润洗细胞2次。再加入适量的或TrypLE Select(RD细胞)，于室温的CO2培养箱消化，至细胞完全脱落。加入适当细胞培养基将细胞密度调整至1×105～1.5×105个/mL，将细胞悬液加入到96孔板中，100μL/孔，37℃，5％CO2培养箱中静置培养。
(2)取24孔板，每孔中先加入1350μL的病毒稀释液。取150μL的病毒原液加入到第1孔中，随后依次进行10倍的梯度稀释。
(3)将各个稀释梯度的病毒稀释液悬空滴加到步骤(1)中的96孔细胞培养板中，每一个稀释度加入纵向的8个孔，每孔100μL，置于37℃，5％的CO2培养箱中培养。
(4)7天后于倒置显微镜下观察细胞病变情况，统计每个稀释度出现CPE的孔数；按Reed-Muench法计算公式计算病毒的滴度。LogCCID50/mL＝d×(高于50％的病变率-50％)/(高于50％病变率-小于50％病变率)+XN，公式中：d＝稀释度系数的对数(10倍稀释为1)，距离比例＝(高于50％的病变率-50％)/(高于50％病变率-小于50％病变率)，XN＝高于50％的病变率的病毒稀释度负对数。
病毒的鼠脑及细胞交替传代
(1)1mL注射器使用前进行干烤灭菌。乳鼠脑内接种时用左手大拇指与食指固定鼠头，用70％的酒精棉对头颅部位进行擦拭消毒，然后于颅脑处进行注射，进针2-3mm，注射量依据乳鼠的日龄数，即1日龄注射10μL，5日龄和7日龄注射20μL，更大日龄则注射30μL。观察期两周。两周内若出现濒死时则回收乳鼠鼠脑和各个组织器官，包括心、肝、脾、肺、肾和后腿(按需所取)。
(2)在生物安全柜中对濒死的乳鼠进行解剖并取出鼠脑和其他组织器官称重，按质量体积比10％(g：10ml)加入无血清的MEM培养基，使用玻璃匀浆器匀浆，制备组织匀浆。4℃，12,000g离心10min，取上清保存。
(3)将鼠脑匀浆液100μL接种到RD细胞汇合度100％的T25细胞培养瓶中，37℃，5％CO2培养箱孵育，每日观察细胞病变情况。待病变程度达到80％时，进行3次反复冻融。4℃，6,000g离心10min除去细胞碎片，吸取上清病毒液，并对上清病毒液和鼠脑匀浆液进行滴定。于-80℃保存，待下次鼠脑传代使用。
病毒的空斑纯化
(1)细胞的6孔板培养：倒置显微镜下观察T瓶中的RD细胞，当细胞汇合度达到或接近100％时，于室温消化，使细胞完全脱落。加入细胞培养基并调整细胞密度至1×105～1.5×105个/mL，往6孔板的每个孔内加入3mL的细胞悬液，37℃的CO2培养箱中培养。
(2)病毒的稀释：将待空斑纯化的病毒原液进行10倍梯度稀释，稀释范围为10-1～10-6。
(3)病毒的吸附：待6孔板中的RD细胞长成致密单层后，于生物安全柜中吸弃旧的细胞培养基，无菌的0.01M的PBS溶液润洗细胞2次。将200μL的稀释范围为10-1～10-6病毒稀释液分别接种到每个孔内，轻轻晃动6孔板使病毒稀释液均匀覆盖到细胞表面，37℃的CO2培养箱孵育1h，孵育过程中每隔10min晃动一次6孔板。
(4)覆盖：将2×MEM培养基与融化好的3％的低熔点琼脂糖胶液等体积混合制成覆盖液，放于65℃恒温加热器中保温备用。待病毒稀释液吸附1h后将其吸弃，无菌的0.01M的PBS溶液润洗细胞2次。待覆盖液略微冷却后，向每孔中加入3mL的覆盖液。室温冷却凝固后放入37℃的CO2培养箱培养。
(5)染色：当肉眼可见6孔板中有空斑形成，且镜检确定为细胞病变时，加入含0.01％中性红染色液的1％琼脂糖胶液，每孔加入1.5mL,放入37℃的CO2培养箱培养。
(6)挑斑：使用200μL的移液枪搭配带滤芯的枪头，对准、插入并吸取要挑取的空斑，加入到200μL的病毒维持液中，以备连续的空斑纯化或扩大培养。
(7)连续空斑纯化：将步骤(6)获得的空斑稀释液进行10倍的梯度稀释后，重复步骤(1)到步骤(5)。
实施例1、小鼠强毒株CVA6-S4的选育及体内毒力比较
以实验室肠道病毒库的一株从RD细胞分离、培养8代，并通过末端稀释法获得的，已完成全基因组测序、遗传背景清晰一致的单克隆株CVA6-P8-(13-5)作为出发母毒株，在ICR小鼠颅内和RD细胞之间交替传代6次后，获得能够稳定致死12日龄ICR小鼠的毒种库CVA6-P8-(13-5)-P6+R8(图1)。
由于CVA6-P8-(13-5)-P6+R8的原倍病毒液浓缩120倍后可以致使14日龄ICR小鼠后肢麻痹瘫痪，所以对其进行三次连续的空斑纯化，挑选高致病率的克隆株。在第一次空斑纯化时挑取8个空斑分别标记为CVA6-S1、CVA6-S2、CVA6-S3、CVA6-S4、CVA6-S5、CVA6-S6、CVA6-S7和CVA6-S8，并进行空斑到空斑的连续三次纯化，获得6个可稳定克隆传代的毒株。
将三次连续空斑纯化后获得的CVA6-S1、CVA6-S3、CVA6-S4、CVA6-S6、CVA6-S7和CVA6-S8克隆株分别在T25培养瓶中扩增一代后，分别再次感染12日龄ICR小鼠，结果显示。CVA6-S3和CVA6-S7对12日龄ICR小鼠的致死率为100％，但发病日程较长，均为第7天才开始出现致死。强毒株CVA6-S4对12日龄ICR小鼠的致死率虽只有约60％，但发病最快，第3天时9只ICR小鼠全部表现为后肢麻痹瘫痪，第4天开始出现致死(如图3所示)。于此相比的，CVA6-S6对12日龄ICR小鼠的致死率为80％，且发病日程也较长，不适合作为攻击毒株。CVA6-S1和CVA6-S8对12日龄ICR小鼠完全无致死性，属于弱毒株。上述结果表明，毒种在小鼠体内和RD细胞中传代过程中，毒株发生适应性突变，各克隆株的毒力有显著差别。
取强毒株CVA6-S4，测定克隆株毒力。并对母株和适应毒株毒力进行比较(表1)。当感染剂量为4.74x105CCID50时，强毒株CVA6-S4对12日龄ICR小鼠的致死率为55.5％(5/9)，对14日龄ICR小鼠的致死率为0(0/9)。而当感染剂量为3.80x 106CCID50时，出发母毒株CVA6-P8-(13-5)对12日龄ICR小鼠的致死率为20％(2/10)，对14日龄ICR小鼠的致死率为0(0/9)。当采用高剂量的CVA6-S4，即9.48x 106CCID50时，其对14日龄ICR小鼠的致死率为83.3％(5/6)。通过不同剂量感染试验计算获得CVA6-S4对14日龄ICR小鼠的半数致死剂量LD50为4.1х106CCID50/mouse。出发母毒株CVA6-P8-(13-5)与强毒株CVA6-S4在大日龄小鼠上的毒力差别显著。
表1、出发母毒株，适应毒种库和强毒株的毒力比较
Figure BDA0002090206360000051
实施例2、候选疫苗的免疫及效力测定
取2窝3日龄的ICR乳鼠，每窝1只母鼠带领6只乳鼠。一窝为实验组，免疫Al(OH)3佐剂吸附的1μg的全病毒灭活实心颗粒(FP)，另一窝为对照组，免疫与实验组相同剂量的Al(OH)3佐剂。待9日龄时各自加强免疫一剂。乳鼠14日龄时，采用6个LD50的CVA6-S4对两组乳鼠进行攻毒(图1)。结果显示，对照组乳鼠全部患病致死，而1.0μg的FP组无明显发病，存活率为100％(图2)。
实施例3、攻毒株CVA6-S4毒力位点分析
出发母毒株CVA6-P8-(13-5)和强毒克隆株CVA6-S4全序列进行测定并分析比对核苷酸、氨基酸的变异(表2)，CVA6-P8-(13-5)与CVA6-S4相比，基因组共5个核苷酸位点突变，分别位于第1371，2261，3245，5288和6926位碱基(表3和表4)。且均引起氨基酸突变，位于5个病毒蛋白，分别为VP2-T139M、VP3-I180V、VP1-V268L、3A-A66T、3D-E321Q突变。因此，二者核苷酸和氨基酸位点的在传代过程中的突变，与毒力密切相关。
表2、CVA6-S4和CVA6-P8-(13-5)氨基酸测序比对结果
Figure BDA0002090206360000052
出发母毒株CVA6-P8-(13-5)的全核酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，病毒的各个功能蛋白的编码序列为：VP4：749～955、VP2：956～1723、VP3：1724..2443、VP1：2444～3358、2A：3359～3808、2B：3809～4105、2C：4106～5092、3A：5093～5350、3B：5351～5416、3C：5417～5965、3D：5966～7354。强毒克隆株CVA6-S4全核酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中，病毒的各个功能蛋白的编码序列为：VP4：749～955、VP2：956～1723、VP3：1724..2443、VP1：2444～3358、2A：3359～3808、2B：3809～4105、2C：4106～5092、3A：5093～5350、3B：5351～5416、3C：5417～5965、3D：5966～7354。强毒克隆株CVA6-S4的全氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本发明保护范围的限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉生物制品研究所有限责任公司
<120> 柯萨奇病毒A组6型（CVA6）的小鼠强毒力攻毒株及其应用
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<212> DNA
<213> Coxsackievirus A
<400> 1
ttaaaacagc ttgtgggttg cacccaccca cagggcccac tgggcgctag cacactgatt 60
ctacggaatc tttgtgcgcc tgttttataa ccccttcccc caaaactgta acttagaaga 120
atattacact actgatcaat agcaggcatg gcgcgccagt catgtctaga tcaagcactt 180
ctgtctcccc ggactgagta tcaatagact gctagcgcgg ttgaaggaga aaacgtccgt 240
tacccggcta actacttcga gaaacttagt agcaccattg aagctgcgga gtgtttcgtt 300
cagcactccc ccagtgtaga tcaggtcgat gagtcactgc actccccacg ggcgaccgtg 360
gcagtgactg cgttggcggc ctgcctatgg ggcaacccat aggacgctct aaagtggaca 420
tggtgcgaag agtctattga gctagttagt agtcctccgg cccctgaatg cggctaatcc 480
caactgcgga gcacatgccc tcaatccaga gggtggtgtg tcgtaacggg caactctgca 540
gcggaaccga ctactttggg tgtccgtgtt tccttttatt cttatattgg ctgcttatgg 600
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<211> 2201
<212> PRT
<213> Coxsackievirus A
<400> 3
Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Glu Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asn Val Ala Thr Glu Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr
20 25 30
Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Arg Gln Asp Phe Ala Gln
35 40 45
Asp Pro Ala Lys Phe Thr Arg Pro Val Leu Asp Thr Ile Arg Glu Val
50 55 60
Ala Ala Pro Leu Gln Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65 70 75 80
Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu
85 90 95
Ala Ala Asn Ile Val Leu Ser Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro
100 105 110
Ser Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser
115 120 125
Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Ser Thr Lys Ser Trp Lys Thr Glu Ser
130 135 140
Thr Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Asp Thr Gly Val
145 150 155 160
Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys
165 170 175
Met His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu
180 185 190
Val Ala Ala Ile Pro Glu Phe Val Val Ala Ala Ser Ser Pro Ala Met
195 200 205
Lys Pro Asn Gly Gln Gly Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Thr Asn Pro
210 215 220
Gly Lys Asn Gly Gln Glu Phe Arg Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Pro Leu Ser Gln Ala Leu Val Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu
245 250 255
Arg Thr Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Met Pro Tyr Val Asn Ala Leu
260 265 270
Pro Phe Asp Ser Ala Leu Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Val Val Ile
275 280 285
Pro Ile Ser Pro Leu Lys Tyr Cys Asn Gly Ala Thr Thr Glu Val Pro
290 295 300
Ile Thr Leu Thr Ile Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Ser Gly Leu Arg
305 310 315 320
Gln Ala Ile Lys Gln Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn
325 330 335
Gln Phe Leu Thr Thr Asp Asp Gly Thr Ser Pro Pro Ile Leu Pro Gly
340 345 350
Phe Glu Pro Thr Pro Leu Ile His Ile Pro Gly Glu Phe Thr Ser Leu
355 360 365
Leu Asp Leu Cys Gln Ile Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr
370 375 380
Gly Thr Thr Gly Val Ser Arg Leu Leu Ile Pro Val Arg Ala Gln Asn
385 390 395 400
Asn Val Asp Gln Leu Cys Ala Ser Phe Gln Val Asp Pro Gly Arg Asn
405 410 415
Gly Pro Trp Gln Ser Thr Met Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr
420 425 430
Gln Trp Ser Gly Ser Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe
435 440 445
Met Ala Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ser Ala
450 455 460
Gln Pro Ala Thr Arg Glu Ala Ala Met Leu Gly Thr His Ile Val Trp
465 470 475 480
Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser
485 490 495
Asn Thr His Phe Arg Ala Val Lys Val Gly Gly Val Tyr Asp Tyr Tyr
500 505 510
Ala Thr Gly Ile Val Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Phe Val Val Pro
515 520 525
Pro Asp Thr Pro Thr Glu Ala Asn Ile Ile Ala Leu Gly Ala Ala Gln
530 535 540
Lys Asn Phe Thr Leu Lys Leu Cys Lys Asp Thr Asp Glu Ile Gln Gln
545 550 555 560
Thr Ala Glu Tyr Gln Asn Asp Pro Ile Thr Asn Ala Val Glu Ser Ala
565 570 575
Val Ser Ala Leu Ala Asp Thr Thr Ile Ser Arg Val Thr Ala Ala Asn
580 585 590
Thr Ala Ala Ser Thr His Ser Leu Gly Thr Gly Arg Val Pro Ala Leu
595 600 605
Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Asn Leu
610 615 620
Ile Glu Thr Arg Cys Val Met Asn Arg Asn Gly Val Asn Glu Ala Ser
625 630 635 640
Val Glu His Phe Tyr Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Val Val Glu Val
645 650 655
Lys Asp Ser Gly Thr Ser Leu Asp Gly Tyr Thr Val Trp Pro Ile Asp
660 665 670
Val Met Gly Phe Val Gln Gln Arg Arg Lys Leu Glu Leu Ser Thr Tyr
675 680 685
Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ser Asn Leu Asn Asn Ser
690 695 700
Thr Thr Pro Gly Met Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala
705 710 715 720
Pro Lys Pro Asp Ser Arg Lys Ser Tyr Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn
725 730 735
Pro Ser Ile Phe Ala Lys Leu Ser Asp Pro Pro Pro Gln Val Ser Val
740 745 750
Pro Phe Met Ser Pro Ala Thr Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr
755 760 765
Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Ala Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Gln
770 775 780
Cys Pro Asn Asn Met Met Gly His Phe Ala Ile Arg Thr Val Ser Glu
785 790 795 800
Ser Thr Thr Gly Lys Asn Val His Val Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys
805 810 815
His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Leu Arg Ser Gln Ala Tyr Met
820 825 830
Leu Lys Asn Tyr Pro Thr Tyr Ser Gln Thr Ile Thr Asn Thr Ala Ala
835 840 845
Asp Arg Ala Ser Ile Thr Thr Thr Asp Tyr Glu Gly Gly Val Pro Ala
850 855 860
Asn Pro Gln Arg Thr Ser Gly Arg Leu Gly Gln Gln Ser Gly Ala Ile
865 870 875 880
Tyr Val Gly Asn Phe Arg Val Val Asn Arg His Leu Ala Thr Arg Asn
885 890 895
Asp Trp Ala Asn Leu Val Trp Glu Ser Ser Ser Arg Asp Leu Leu Val
900 905 910
Ser Ser Thr Thr Ala Gln Gly Cys Asp Thr Ile Ala Arg Cys Asp Cys
915 920 925
Gln Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Asn Ser Lys Arg Lys His Tyr Pro Val
930 935 940
Ser Phe Ser Lys Pro Ser Leu Val Phe Val Glu Ala Ser Glu Tyr Tyr
945 950 955 960
Pro Ala Arg Tyr Gln Ser His Leu Met Leu Ala Lys Gly His Ser Glu
965 970 975
Pro Gly Asp Cys Gly Gly Ile Leu Arg Cys Gln His Gly Val Ile Gly
980 985 990
Ile Val Ser Thr Gly Gly Asn Gly Leu Val Gly Phe Ala Asp Val Arg
995 1000 1005
Asp Leu Leu Trp Leu Asp Glu Glu Ala Met Glu Gln Gly Val Ser
1010 1015 1020
Asp Tyr Ile Lys Gly Leu Gly Asp Ala Phe Gly Thr Gly Phe Thr
1025 1030 1035
Asp Ala Val Ala Arg Glu Val Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Leu Ile
1040 1045 1050
Gly Ser Glu Gly Ala Val Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ile Lys
1055 1060 1065
Leu Ile Ser Ala Leu Val Ile Val Ile Arg Ser Asp Tyr Asp Met
1070 1075 1080
Val Thr Leu Thr Ala Thr Leu Ala Leu Ile Gly Cys His Gly Ser
1085 1090 1095
Pro Trp Ala Trp Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser Ile Leu Gly Ile
1100 1105 1110
Pro Ile Ala Gln Lys Gln Ser Ala Ser Trp Leu Lys Lys Phe Asn
1115 1120 1125
Asp Met Ala Asn Ala Ala Lys Gly Phe Glu Trp Ile Ser Asn Lys
1130 1135 1140
Ile Ser Lys Phe Ile Asp Trp Leu Lys Glu Lys Ile Ile Pro Ala
1145 1150 1155
Ala Arg Glu Lys Val Glu Phe Leu Asn Asn Leu Lys Gln Leu Pro
1160 1165 1170
Leu Leu Glu Asn Gln Ile Ser Asn Leu Glu Gln Ser Ala Ala Ser
1175 1180 1185
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1190 1195 1200
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1205 1210 1215
Arg Val Tyr Ala Leu Glu Lys Arg Met Asn Asn Tyr Met Gln Phe
1220 1225 1230
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1235 1240 1245
Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Ala Thr Gly Ile Ile Ala Arg
1250 1255 1260
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1265 1270 1275
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1280 1285 1290
Met Asp Asp Leu Cys Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Met Ser Leu
1295 1300 1305
Phe Cys Gln Met Val Ser Thr Val Asp Phe Ile Pro Pro Met Ala
1310 1315 1320
Ser Leu Glu Glu Lys Gly Val Ser Phe Thr Ser Lys Phe Val Ile
1325 1330 1335
Ala Ser Thr Asn Ala Ser Asn Ile Ile Val Pro Thr Val Ser Asp
1340 1345 1350
Ser Asp Ala Ile Arg Arg Arg Phe Tyr Met Asp Cys Asp Ile Glu
1355 1360 1365
Val Thr Asp Ser Tyr Lys Thr Asp Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly
1370 1375 1380
Arg Ala Ala Lys Leu Cys Ser Glu Asn Asn Thr Ala Asn Phe Lys
1385 1390 1395
Arg Cys Ser Pro Leu Val Cys Gly Lys Ala Ile Gln Leu Arg Asp
1400 1405 1410
Arg Lys Ser Lys Val Arg Tyr Ser Val Asp Thr Val Val Ser Glu
1415 1420 1425
Leu Ile Arg Glu Tyr Asn Asn Arg Ser Ala Ile Gly Asn Thr Ile
1430 1435 1440
Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Pro Lys Phe Arg Pro Ile Arg Ile
1445 1450 1455
Ser Leu Glu Glu Ala Pro Ala Pro Asp Val Ile Ser Asp Leu Leu
1460 1465 1470
Ala Ser Val Asp Ser Glu Glu Val Arg Gln Tyr Cys Arg Asp Gln
1475 1480 1485
Gly Trp Ile Ile Pro Glu Thr Pro Thr Asn Val Glu Arg His Leu
1490 1495 1500
Ser Arg Ala Val Leu Ile Met Gln Ser Ile Thr Thr Val Val Ala
1505 1510 1515
Val Val Ser Leu Val Tyr Val Ile Tyr Lys Leu Phe Ala Gly Phe
1520 1525 1530
Gln Gly Ala Tyr Ser Gly Ala Pro Lys Gln Val Leu Lys Lys Pro
1535 1540 1545
Ile Leu Arg Thr Ala Thr Val Gln Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala
1550 1555 1560
Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Ile Arg Gln Val Gln Thr Asp Gln
1565 1570 1575
Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg Asp Arg Leu Ala Val Leu
1580 1585 1590
Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile Trp Val Glu His Lys
1595 1600 1605
Leu Val Asn Ile Leu Asp Ala Val Glu Leu Val Asp Glu Gln Gly
1610 1615 1620
Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Ile Thr Leu Asp Thr Asn Glu Lys
1625 1630 1635
Phe Arg Asp Ile Thr Lys Phe Ile Pro Glu Asn Ile Ser Ala Ala
1640 1645 1650
Ser Asp Ala Thr Leu Val Ile Asn Thr Glu His Met Pro Ser Met
1655 1660 1665
Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly Phe Leu Asn Leu
1670 1675 1680
Ser Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr
1685 1690 1695
Lys Ala Gly Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Val
1700 1705 1710
Ile Gly Ile His Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Cys Ala
1715 1720 1725
Gly Leu Lys Arg Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gln Gly Glu Ile Gln
1730 1735 1740
Trp Val Lys Pro Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu Asn Ile Asn Gly
1745 1750 1755
Pro Thr Arg Thr Lys Leu Glu Pro Ser Val Phe His Asp Ile Phe
1760 1765 1770
Glu Gly Asn Lys Glu Pro Ala Val Leu His Ser Lys Asp Pro Arg
1775 1780 1785
Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly
1790 1795 1800
Asn Thr Ile His Glu Pro Asp Glu Tyr Ile Lys Glu Ala Ala Leu
1805 1810 1815
His Tyr Ala Asn Gln Leu Lys Gln Leu Asn Ile Asp Thr Ser Gln
1820 1825 1830
Met Ser Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr Asp Asn Leu Glu Ala
1835 1840 1845
Ile Asp Leu His Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr Ser Ala Leu Gly
1850 1855 1860
Ile Lys Lys Arg Asp Ile Leu Asp Pro Thr Thr Arg Asp Val Ser
1865 1870 1875
Lys Met Lys Phe Tyr Met Asp Lys Tyr Gly Leu Asp Leu Pro Tyr
1880 1885 1890
Ser Thr Tyr Val Lys Asp Glu Leu Arg Ser Ile Asp Lys Ile Lys
1895 1900 1905
Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser
1910 1915 1920
Val Tyr Leu Arg Met Ala Phe Gly His Leu Tyr Glu Thr Phe His
1925 1930 1935
Ala Asn Pro Gly Thr Val Thr Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro
1940 1945 1950
Asp Val Phe Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu Leu Pro Gly Ser Leu
1955 1960 1965
Phe Ala Phe Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser Leu Ser Pro Val
1970 1975 1980
Trp Phe Arg Ala Leu Glu Leu Val Leu Arg Glu Ile Gly Tyr Gly
1985 1990 1995
Asp Glu Ala Ile Ser Leu Ile Glu Gly Ile Asn His Thr His His
2000 2005 2010
Val Tyr Arg Asn Lys Thr Tyr Cys Val Leu Gly Gly Met Pro Ser
2015 2020 2025
Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile
2030 2035 2040
Ile Ile Arg Ser Leu Leu Ile Lys Thr Phe Lys Gly Val Asp Leu
2045 2050 2055
Asp Gln Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly Asp Asp Val Leu Ala Ser
2060 2065 2070
Tyr Pro Phe Pro Ile Asp Cys Ser Glu Leu Ala Arg Thr Gly Lys
2075 2080 2085
Glu Tyr Gly Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys Ser Pro Cys Phe
2090 2095 2100
Asn Glu Val Asn Trp Glu Asn Ala Thr Phe Leu Lys Arg Gly Phe
2105 2110 2115
Leu Pro Asp Glu Gln Phe Pro Phe Leu Ile His Pro Thr Met Pro
2120 2125 2130
Met Lys Glu Ile His Glu Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Ala Arg
2135 2140 2145
Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His
2150 2155 2160
Asn Gly Lys Gln Glu Tyr Glu Lys Phe Val Ser Ala Ile Arg Ser
2165 2170 2175
Val Pro Ile Gly Lys Ala Leu Ala Ile Pro Asn Tyr Glu Asn Leu
2180 2185 2190
Arg Arg Asn Trp Leu Glu Leu Phe
2195 2200

Claims (4)

1.一株柯萨奇病毒A组6型强毒株CVA6-S4，其特征在于，所述的强毒株CVA6-S4的全核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的柯萨奇病毒A组6型强毒株CVA6-S4在柯萨奇病毒疫苗效力评估中的应用。
3.权利要求1所述的柯萨奇病毒A组6型强毒株CVA6-S4在制备柯萨奇病毒主动免疫动物模型中的应用。
4.权利要求1所述的柯萨奇病毒A组6型强毒株CVA6-S4在制备柯萨奇病毒疫苗效力评估的试剂或试剂盒中的应用。
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