CN111961132A - 新型冠状病毒免疫奶牛所产含特异性抗体牛奶或血清的制备方法及其应用 - Google Patents
新型冠状病毒免疫奶牛所产含特异性抗体牛奶或血清的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了新型冠状病毒免疫奶牛所产含特异性抗体牛奶或血清的制备方法及其应用。利用灭活的新型冠状病毒hCov‑19/Wuhan/ZY38‑1/2020免疫奶牛，可以获得大量的免疫奶和血清，免疫奶和血清中均含有较高含量抗体，能够有效中和病毒，阻止病毒入侵细胞，具有明显的抗SARS‑CoV‑2病毒的作用；免疫奶纯化的Igs蛋白注射小鼠后，能够显著性的降低新冠病毒感染小鼠的死亡率，减少新冠病毒感染对小鼠体重下降的影响，降低小鼠肺脏组织中的病毒含量。本发明提供的免疫牛奶和血清可以作为新冠肺炎预防和治疗制剂的抗体来源，弥补了新冠肺炎康复血浆来源的限制。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2的特异性抗体阳性牛奶和血清的制备及其应用。
背景技术
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 19,COVID-19)于2019年底出现并呈现全球爆发，严重危害人类健康和公共卫生安全，给世界社会和经济带来巨大负担，已引发全球范围内的高度关注。截止到2020年7月底，全球累计新冠肺炎确诊病例超过1400万例，死亡人数超过60万。许多国内外学者推测新冠病毒或将类似于流感病毒，与人类长期共存。而且现有的研究报道和数据表明SARS-CoV-2的致死率远高于流感，然而到目前为止还没有专门针对抗新型冠状病毒的治疗和预防制剂或疫苗可以使用，因此亟需找到针对SARS-CoV-2的有效预防和治疗方法。抑制病毒进入细胞是一个很有效的治疗策略。研究报道血管紧张素转化酶2(angiotension convertiong enzyme 2,ACE2)是SARS-CoV的功能性受体，能够与SARS-CoV表面的S蛋白高效结合，SARS-CoV通过细胞表面受体AC E2入侵细胞(Li Wenhui等，2003；Kuba K,2005)。因此，研究人员构建了重组ACE2蛋白，发现其对SARS-CoV具有潜在的治疗作用(Kuba K,2005)。Daniel W等(2020)的报道发现，SARS-CoV-2的S蛋白也能和ACE2受体结合，且亲和力远高于SARS-CoV的S蛋白。VanessaMonteil等(2020)研究报道，在SARS-CoV-2感染细胞之前，先与体外纯化的重组人ACE2蛋白共孵育一段时间，病毒的感染力会急剧下降，下降幅度可达1000-5000倍，研究也发现在SARS-CoV-2感染细胞之前与鼠类的ACE2蛋白共孵育一段时间则无法抑制SARS-CoV-2的感染。但是，研究发现重组rACE2的半衰期只有几个小时，在体内很快就被清除(Wysocki J等，2010；Haschke M等，2013)。在临床上使用新型冠状病毒肺炎康复者的血清对危重症患者具有一定的疗效，但是用康复者血浆治疗病毒感染的方法并不能得到普及，一方面由于治愈康复期患者身体虚弱、不适合献血，另一方面也受到血浆来源等因素的限制。
本发明首次报道了将SARS-CoV-2灭火后免疫奶牛，收集免疫后的血清和牛奶，将其作为一种特殊的“抗体”中和SARS-CoV-2，阻止病毒入侵细胞，是一种专门针对新型冠状病毒感染时的有效预防和治疗性生物制剂。
发明内容
本发明的目的是针对严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)难以预防和治疗的问题，新型冠状病毒hCov-19/Wuhan/ZY38-1/2020毒株在制备含有新型冠状病毒抗体阳性牛奶或血清中的应用，用制备的抗原免疫奶牛产生含有抗SARS-CoV-2病毒的特异性抗体的免疫血清和免疫奶，利用所获得的新冠病毒免疫奶纯化Igs蛋白，用于制备治疗或预防SARS-CoV-2感染的生物制剂。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
新型冠状病毒hCov-19/Wuhan/ZY38-1/2020毒株在制备含有新型冠状病毒特异性抗体阳性牛奶或血清中的应用，所述的新型冠状病毒登陆号为EPI_ISL_486645；其应用过程包括将灭活的新型冠状病毒hCov-19/Wuhan/ZY38-1/2020株通过颈部或臀部肌肉注射免疫奶牛，从而获取含有新型冠状病毒抗体阳性的牛奶或血清。
以上所述的应用中，优选的，所述的灭活的新型冠状病毒是制备成免疫制剂对奶牛进行免疫，其是将灭活验证合格的新冠病毒液离心去除细胞碎片后，浓缩，获得高浓度的抗原；
水相制备：在浓缩抗原中加入2％～4％吐温80；
油相制备：macro152白油添加5％～6％司本85和1％～2％硬脂酸铝，灭菌；
水相和油相按3:2～4:3比例混合后即为新冠病毒免疫制剂。
本发明的保护范围还包括：
利用上述方法制备的牛奶或血清来评价新型冠状病毒动物模型，其模型的构建方法是将SARS-CoV-2/WBP-1感染小鼠。
利用上述方法制备的牛奶制备成中和新型冠状病毒的饮用药剂。
利用上述方法制备的牛奶或血清用于制备成治疗或预防新型冠状病毒感染的药物。
利用上述方法制备的牛奶或血清用于制备新型冠状病毒Igs抗体，该抗体蛋白用于治疗或预防新型冠状病毒感染的药物。
与现有技术相比，本发明优点如下：
1.本发明中新型冠状病毒免疫奶牛后可以获得大量的免疫奶，而且免疫奶和血清中均含有较高含量抗体，可以作为新冠肺炎预防和治疗制剂的抗体来源，弥补了新冠肺炎康复血浆来源的限制，能够更加广泛的应用于新型冠状病毒引起的新冠肺炎。
2.本发明中的免疫血清和免疫牛奶中含有高浓度的针对SARS-CoV-2的特异性抗体，能够有效中和病毒，阻止病毒入侵细胞，具有明显的抗SARS-CoV-2病毒的作用。
3.本发明中新型冠状病毒免疫奶纯化的Igs抗体注射小鼠后，能够显著性的降低新冠病毒感染小鼠的死亡率，减少新冠病毒感染对小鼠体重下降的影响，降低小鼠肺脏组织中的病毒含量。
附图说明
图1RBD蛋白表达western-blot检测图。
图2免疫奶和血清样品新冠病毒ZY38-1中和抗体效价空斑图。
图3免疫奶对SARS-CoV-2/WBP-1病毒感染小鼠体重的影响示意图。
图4免疫奶对SARS-CoV-2/WBP-1病毒感染小鼠存活率的影响示意图。
图5免疫奶对SARS-CoV-2/WBP-1病毒感染小鼠肺脏组织病毒载量的影响示意图。
具体实施方式
本发明实施例中的试验方法和条件如无特殊说明，均为常规方法。这些实施例仅用于说明本发明，本发明的保护范围不受这些实施例的限制。本发明所述的技术方案，如无特殊说明，均为领域的常规方案；所述试剂或材料如无特殊说明，均来源于商业渠道。本发明中所有与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)活病毒相关的试验均在生物安全三级实验室(ABSL3)完成。
实施例1：
含有新型冠状病毒抗体的牛奶和血清的制备：
新型冠状病毒hCov-19/Wuhan/ZY38-1/2020毒株序列于2020年7月10提交GISAID数据库，登陆号为EPI_ISL_486645，在本发明中，将该病毒简称为新型冠状病毒ZY38-1。
1.新型冠状病毒ZY38-1的增殖培养与灭活
(1)细胞培养：
VERO细胞用含10％FBS的DMEM培养48小时左右传代；
细胞传代：传代时用0.25％的胰酶消化，约10分钟左右即可消化下来。
具体步骤如下：
贴壁细胞用滴管或移液管吸去培养器皿中的旧培养液，用不含血清的DMEM培养基洗去残留的旧培养基；
向瓶内加入1-2ml消化液(0.25％胰酶)轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面；
在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后，应立即终止消化(吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鲜培养液，终止消化)；
用移液管吸取瓶内培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液；
计数，分装到新培养瓶中，并补加一定量的含血清的新鲜培养液；
盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。(2)新型冠状病毒ZY38-1病毒增殖：
将消化好的Vero细胞接种到细胞培养瓶中，放37℃5％CO2恒温培养箱培养至长出单层细胞；
将-80℃保存的新型冠状病毒ZY38-10.1ml接种到长有单层Vero细胞的培养瓶中，37℃5％CO2恒温培养箱孵育1h；
用移液器小心吸出病毒孵育液，加入10ml含2％FBS的DMEM细胞维持液，37℃5％CO2恒温培养箱培养48-72h；
每天观察细胞状态，80％以上细胞出现病变时收获病毒细胞增殖液；所获得新冠病毒液的病毒滴度为106.5TCID50/ml。
(3)SARS-CoV-2病毒灭活和灭活效果验证：
病毒灭活：将细胞增殖的新型冠状病毒用β-丙内酯进行两次灭活。具体方法为两千分之一β-丙内酯4℃灭活24小时，37℃降解β丙内酯6小时。
灭活效果验证：取灭活后的病毒接种于Vero并观察70小时，收集上清盲传三代，细胞应不出现病变。进一步，将灭活后的病毒液腹腔接种小鼠，观察70小时，小鼠不出现任何不良反应，说明灭活彻底，可以用于下一步的抗原制备。
2.新型冠状病毒抗原制备
将灭活验证合格的新冠病毒液离心去除细胞碎片后，采用100KD孔径的膜浓缩20倍，获得高浓度的抗原。
水相制备：在浓缩抗原中加入2％吐温80。
油相制备：macro152白油添加6％司本85和1％硬脂酸铝，116℃灭菌30min。
水相和油相按4:3比例混合后即为新冠病毒油乳剂免疫抗原。
3.制备的新型冠状病毒油乳剂抗原免疫奶牛
动物免疫：将制备的抗原对奶牛进行颈部和臀部肌肉注射免疫，免疫16头牛，每头牛免疫6ml，每间隔14天免疫一次，共免疫4次，免疫牛未出现不良反应。
样品采集与处理：分别于免疫后不同时间点采集免疫奶牛的血样和牛奶样品进行新型冠状病毒抗体检测。血样采集使用尾静脉采血法，用一次性注射器无菌采集3-5ml非抗凝血，静置析出血清，血样不可剧烈摇晃避免溶血，血样送至实验室后要立即分离血清，不能立即分离的需要及时冷藏(4℃)。
实施例2：
免疫奶和免疫血清中特异性抗体水平测定
1.新型冠状病毒RBD抗原蛋白表达纯化
通过对表达元件的设计和载体改建，在pCMV3表达载体中插入新型冠状病毒RBD基因，构建pCMV3-RBD-his真核表达载体，通过在293T悬浮细胞中瞬时表达获得目的蛋白。1.1pCMV3-RBD-his质粒的构建
提取灭活ZY38-1病毒RNA、反转录扩增病毒cDNA，将cDNA模板用于RBD片段扩增，扩增引物RBD-F:5’-ATGAGGGTCCAACCAACAGAGAGC-3’；RBD-R:5’-GAAGTTCACACACTTGTTCTTCAC-3’。为了便于后续RBD蛋白纯化，在RBD基因后端加上6×HIS序列，获得RBD-his基因。使用KpnI和XbaI对pCMV3空载体和RBD-his基因进行双酶切，酶切后的片段与载体连接后获得重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，进行克隆筛选和测序鉴定，获得正确的重组质粒pCMV3-RBD-his。将pCMV3-RBD-his质粒阳性的大肠杆菌扩大培养，用MN质粒提取试剂盒提取无内毒pCMV3-RBD-his质粒，提取质粒浓度调节为1ug/ul，分装冻存于-80℃保存备用。
1.2悬浮293T细胞的复苏及培养
293T悬浮细胞冻存液在37℃水浴解冻，向100ml的细胞摇瓶中加入20ml培养基，将融化的细胞全部转入细胞瓶中，轻轻混匀细胞。将重悬细胞置于37℃，5％CO2，150-175rpm转速的恒温摇床中培养，检测3-5天内的细胞活性，传代2-3次，当细胞活性大于90％时进行转染。
1.3细胞转染
取20ul步骤1.1中保存的pCMV3-RBD-his质粒至150mmol的NaCl溶液中，终体积为1ml，质粒含量为20ug；同时使用150mmol的NaCl稀释100ul转染试剂至总体积1ml，单独静置五分钟后将上述2种溶液混匀，混和液逐滴加入细胞活性大于90％的细胞摇瓶内部。转染48-72h检测细胞及上清中目的蛋白表达量。
1.4表达产物分析
将pCMV3-RBD-his转染293T细胞，收取24、36、48、72h四个时间点培养细胞及上清液中的蛋白样样品，使用镍柱纯化目的蛋白，Western-blot检测证明24h时RBD蛋白开始表达，72h时培养上清中RBD蛋白含量最高，如图1所示。
Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化的RBD蛋白浓度，用包被液将获得的RBD蛋白稀释50倍，每孔100μl包被96孔聚苯乙烯反应板，2～8℃孵育过夜；弃包被液，加封闭液37℃封闭40min；弃掉封闭液，用PBST洗3次，RBD蛋白特异性标记单抗用稀释液(5％脱脂奶粉的PBST)稀释1000倍，每孔加入100μl，37℃温育40min；吸干，用PBST洗3次，每孔加入100μlTMB工作液，避光作用10min，加入50μl终止液，测定OD630吸光值。结果表明纯化后的RBD蛋白均出现特异性的ELISA反应。
2.新型冠状病毒ZY38-1特异性抗体ELISA检测步骤：
(1)用步骤1表达纯化的新型冠状病毒RBD蛋白为抗原，以100ng/孔包被96孔聚苯乙烯反应板，4℃孵育16h后弃去包被液拍干ELISA包被板，加入封闭液于37℃封闭2h。弃去封闭液，拍干ELISA包被板，每孔加入180μL PBST洗涤液，洗涤3次，拍干ELISA包被板，吹干后置于4℃备用。
(2)将待检血样于4℃、3000rpm离心10min后取上清，待检牛奶样品于4℃、8000rpm离心20min取中间层，处理好的血清和牛奶样品即为一抗，将处理好的血清和牛奶样品置于-20℃保存备用。
(3)将保存的血清和牛奶样品，用稀释液(武汉科前生物股份有限公司)按1:40稀释后，按100μL/孔加入到抗原包被板中。置于37℃温箱中孵育30min，弃去包被液，每孔加入180μL PBST洗涤液，洗涤5次，拍干ELISA包被板。
(4)将辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体，用二抗保护剂(武汉科前生物股份有限公司)稀释至1:16000，加入到一抗孵育过的ELISA包被板中，100μL/孔，37℃温箱中孵育30min，弃去二抗稀释液，每孔加入180μL PBST洗涤液，洗涤5次，拍干ELISA包被板。
(5)分别加入TMB显色液A液50ul、B液50ul到反应孔中，37℃避光反应10min，随后每孔加入50μL中止液，终止反应。
(6)将终止后的反应板放入酶标仪中，读取各孔的OD630nm数据。
结果如表1和表2所示，将SARS-CoV-2病毒制备的抗原免疫奶牛后能够激发宿主产生针对新型冠状病毒的抗体，在免疫牛血清和牛奶中均能检测到新冠病毒抗体，并且在第四次免疫后的76天，牛奶中仍能检测到新冠病毒抗体，血清样品中也含有较高的抗体水平。
表1免疫奶中SARS-CoV-2特异性抗体水平
注：“—”表示奶牛处于干奶期，未采集样品。
表2免疫血清中SARS-CoV-2特异性抗体水平
注：“—”表示奶牛处于干奶期，未采集样品。
实施例3：
免疫奶和免疫血清中和抗体效价
采用新冠病毒噬斑减少微量中和实验检测免疫奶和免疫血清中抗体对新冠病毒的中和抗体效价，具体步骤如下：
(1)将生长状态良好的Vero细胞传代至12孔细胞培养板，3-5E5/孔，第二天长成致密单层。
(2)将实施列2中处理好并保存于-20℃备用的血清和牛奶样品56℃灭活30min。
(3)在24孔板内用无血清DMEM培养基倍比稀释血清和牛奶样品，根据样品数准备24孔板数量，每板4个样品，另加一个病毒回滴对照。
(4)在每个孔板的第一列加441ul或405ul DMEM，其它孔加300ul。
(5)加9ul血清或45ul牛奶样品至第一列孔内，即每孔内液体的总体积为450ul，震荡混匀。
(6)用排枪从第一列取150ul至第二列，吹打并震荡混匀；更换枪头，从第二列取150ul至第三列，重复操作直到第六列，最后从第六列取出150ul扔掉。
(7)根据样品数量，计算所需病毒稀释液体积和病毒冻存液体积，在所需体积基础上增加3-5ml稀释液，取相应体积的DMEM+2.5％FBS至50ml离心管内。
(8)从-150℃冰箱取出一支新型冠状病毒ZY38-1毒株冻存液，尽快插入浮标并放在盛满自来水的盒子内，不时移动浮标以加速解冻。
(9)取所需体积的病毒冻存液至DMEM稀释液，稀释后的病毒滴度为400pfu/ml；如果所需病毒冻存液体积小于10ul，则先在2ml离心管内将病毒冻存液稀释10倍。
(10)排枪取300ul病毒稀释液加入血清或牛奶稀释液中，每个稀释度换枪头，避免碰到孔壁而使病毒不能和血清或牛奶作用。
(11)加好病毒稀释液后，每个24孔板轻拍振荡混匀，置于培养箱内37℃温育1h，尽量不要将孔板叠放，如果空间有限，叠放不要超过两层。
(12)吸去Vero细胞培养板中的培养基，加入500ul血清或牛奶和病毒的混合液；置于培养箱内37℃温育1h，尽量不要将孔板叠放，如果空间有限，叠放不要超过两层。
(13)吸去混合液，每孔加入1ml DMEM+2.5％FBS+0.9％甲基纤维素，置于培养箱内3-4天。
(14)每孔加入1ml 8％formaldehyde-PBS，固定1h以上。
(15)倒去固定液，用单蒸水清洗一遍。
(16)加0.5％结晶紫染色10min，单蒸水清洗三遍，拍照后数噬斑。
结果如表3和表4所示，免疫血清和免疫奶均能够有效抑制新型冠状病毒ZY38-1病毒在细胞上的增殖。四免14天后，免疫牛血清的中和抗体效价均达到1:12150；免疫奶中的中和抗体效价85％以上可以达到1:270。
表3免疫奶中SARS-CoV-2特异性抗体中和效价
表4免疫血清中SARS-CoV-2特异性抗体中和效价
实施例4：
新型冠状病毒ZY38-1免疫奶在小鼠体内的抗病毒效果评价：
1.SARS-CoV-2毒株鼠适应株的获得：
将人源样品中分离获得的SARS-CoV-2毒株(wuhan-hu-1，NC_045512.2)滴鼻接种于10月龄雌性BALB/c小鼠，感染剂量为50ul，病毒含量为2.3×105PFU。感染3天后，解剖小鼠收集肺脏组织，匀浆，12000rpm离心5min，收集上清作为鼠适应性传代新冠病毒第1代。第1代肺脏组织匀浆液接种4-6周龄小鼠，3天后收获肺脏并且匀浆，得到第2代病毒液。以此在4-6周龄小鼠连续传代，得到第11代病毒液。在传代过程中，第9代小鼠第一次出现因病毒感染而死亡，连续传至14代，每代都会引起小鼠死亡。
将第11代肺脏组织匀浆上清液稀释103、104倍接种于VERO细胞，37℃孵育1h，弃去病毒液，对细胞进行冲洗后覆盖1％的琼脂糖凝胶无酚红DMEM培养基，培养2d，用无菌枪头挑取细胞空斑获得纯化的病毒，将纯化的毒株再次接种细胞进行空斑纯化，最终获得了对小鼠稳定致死的鼠适应株WBP-1，将第11代鼠适应性稳定毒株进行保藏。该毒株已于2020年8月17日送至中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，分类命名：新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1，保藏编号为CCTCC NO：V202031，地址：中国武汉武汉大学。
将纯化获得的SARS-CoV-2/WBP-1鼠适应毒株进行全基因组测序，其序列为SEQ IDNO.1所示。
新型冠状病毒RT-PCR检测鉴定引物如下：
F：5’-CCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTA-3’
R：5’-TGTCAAGAATCTCAAGTGTCTGTGGATC-3’
扩增产物片段长度为484bp。
将保藏的鼠适应株WBP-1在VERO细胞上纯化3次，之后在VERO细胞上连续传代3次，每代病毒均会对小鼠致死，经PCR未发生突变，传代稳定。
2.免疫奶和非免疫奶中Igs抗体纯化，具体实验步骤如下：
(1)牛奶预处理：-20℃保藏牛奶4℃解冻，7000rpm、4℃离心30min，小心去除上层脂肪，将下层液体转移至新的离心管中，再次过滤尽可能除去脂质。
(2)新冠免疫牛奶和非免疫牛奶先用等电点沉淀法去除酪蛋白：向过滤去脂的牛奶中加入等体积PBS，调节PH为4.6，40℃水浴30min，期间不停搅拌，4℃静置过夜，7000rpm、4℃离心30min，去沉淀，上清转移至干净的烧杯中。
(3)硫酸铵法沉淀抗体：向上清中加入等体积PH7.4的饱和硫酸铵，磁力搅拌器搅拌30min，4℃静置过夜，7000rpm、4℃离心30min，去除上清，沉淀用200ml PBS复溶。
(4)复溶蛋白透析除盐：将上述复溶的蛋白样品在12000rpm，4℃离心30min，去除无法溶解的蛋白沉淀，上清液装入透析袋内透除盐，用10mmol PH9.0的Tris-HCl透析48-72h，透析完成后将蛋白样品从透析袋转移至离心管中，12000rpm离心30min，去除蛋白沉淀，上清转移至新的离心管中。
(5)Protein G琼脂糖凝胶纯化抗体：将(4)中的上清过Protein G琼脂糖凝胶柱子，待纯化的抗体过柱后，用预冷的TBS洗涤，去除未结合的和非特异性结合的蛋白，洗涤完后，用10ml 50mM pH2.7的glycine洗脱，收集洗脱液。
(6)纯化抗体浓缩：洗脱液用截留分子大小10kD的超滤管离心浓缩，浓缩后的样品分别分装至1.5ml离心管中，每支1ml，-80℃保存备用
(7)纯化抗体蛋白浓度测定：用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化浓缩的抗体蛋白含量，并调整免疫奶和非免疫纯化样品浓度一致，抗体蛋白含量为5mg/ml。
3.小鼠动物实验：
(1)将20只6-8周龄BALB/c小鼠随机分为4组，每组5只，一组免疫奶纯化抗体蛋白灌胃(IM-i.a)、一组免疫奶纯化抗体蛋白腹腔注射(IM-i.p)，另外2组分别为非免疫奶纯化抗体蛋白灌胃(NIM-i.a)和腹腔注射(NIM-i.p)。灌胃每天一次，每只小鼠200ul；腹腔注射每天一次，每只小鼠200ul。
(2)连续进行5天灌胃和注射后，对小鼠进行新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1病毒感染，所有小鼠滴鼻感染5个LD50 WBP-1新冠病毒。
(3)分别于感染前和感染后对小鼠称重，每天观察记录小鼠的体重和症状，定时更换和添加垫料、饮水和食物，及时取出死亡小鼠进行解剖，直至实验完成。
(4)攻毒后5天，将存活小鼠全部处死，解剖取肺脏、气管、鼻甲骨组织，RT-PCR检测组织样品中新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1病毒含量。
(5)根据统计结果，绘制出体重变化曲线、存活率曲线和组织病毒载量图。
实验结果：
小鼠体重变化结果如图3和表5所示，相比于非免疫奶注射组(NIM-i.p)，免疫奶注射组(IM-i.p)可以显著降低因SARS-CoV-2病毒感染所导致的体重下降；同时，免疫奶灌胃组(IM-i.a)体重下降趋势比非免疫奶灌胃组(NIM-i.a)低。无论是灌胃还是注射，免疫奶体重下降趋势均低于非免疫奶。小鼠体重百分比的计算方式为感染病毒后不同时间各组小鼠体重平均值/感染第0天各组小鼠体重平均值*100％
表5免疫奶纯化抗体蛋白对SARS-CoV-2/WBP-1病毒感染后小鼠体重的影响
小鼠存活率结果如图4和表6所示，小鼠存活率计算方法为每组存活小鼠只数/每组感染小鼠总数*100％，免疫奶注射组(IM-i.p)小鼠100％存活，免疫奶灌胃组(IM-i.a)40％小鼠存活，而非免疫奶注射组(NIM-i.p)和灌胃组(NIM-i.a)小鼠存活率均为20％。
表6免疫奶纯化抗体蛋白对SARS-CoV-2/WBP-1病毒感染后小鼠存活率的影响
小鼠不同组织样品中SARS-CoV-2病毒载量检测结果如图5和表7所示，免疫奶注射组(IM-i.p)鼻甲(turbinate)检测不到新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1，另外3个组均能检测到新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1；免疫奶注射组(IM-i.p)气管(trachea)和肺脏(lung)中SARS-CoV-2病毒含量显著低于另外3个组。在鼻甲和气管中，免疫奶灌胃组(IM-i.a)SARS-CoV-2病毒含量也均低于非免疫奶注射组(NIM-i.p)和灌胃组(NIM-i.a)。
表7免疫奶纯化抗体蛋白对SARS-CoV-2/WBP-1病毒感染后小鼠肺脏、气管和鼻甲组织中新冠病毒载量的影响(log10copies/ml)
上述结果说明，免疫奶在小鼠体内有明显的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1的效果。
序列表
<110> 华中农业大学
武汉市农业科学院
武汉科前生物股份有限公司
<120> 新型冠状病毒免疫奶牛所产含特异性抗体牛奶或血清的制备方法及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29218
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgagtgcact aagcatgcag ccgagtgaca gccacacaga ttttaaagtt cgtttagaga 60
acagatctac aagagatcga aagttggttg gtttgttacc tgggaaggta taaaccaacc 120
aactttcgat ctcttgtaga tctgttctct aaacgaactt taaaatctgt gtggctgtca 180
ctcggctgca tgcttagtgc actcacgcag tataattaat aactaattac tgtcgttgac 240
aggacacgag taactcgtct atcttctgca ggctgcttac ggtttcgtcc gtgttgcagc 300
cgatcatcag cacatctagg tttcgtccgg gtgtgaccga aaggtaagat ggagagcctt 360
gtccctggtt tcaacgagaa aacacacgtc caactcagtt tgcctgtttt acaggttcgc 420
gacgtgctcg tacgtggctt tggagactcc gtggaggagg tcttatcaga ggcacgtcaa 480
catcttaaag atggcacttg tggcttagta gaagttgaaa aaggcgtttt gcctcaactt 540
gaacagccct atgtgttcat caaacgttcg gatgctcgaa ctgcacctca tggtcatgtt 600
atggttgagc tggtagcaga actcgaaggc attcagtacg gtcgtagcgg tgagacactt 660
ggtgtccttg tccctcatgt gggcgaaata ccagtggctt accgcaaggt tcttcttcgt 720
aagaacggta ataaaggagc tggtggccat agttacggcg ccgatctaaa gtcatttgac 780
ttaggcgacg agcttggcac tgatccttat gaagattttc aagaaaactg gaacactaaa 840
catagcagtg gtgttacccg tgaactcatg cgtgagctta acggaggggc atacactcgc 900
tatgtcgata acaacttctg tggccctgat ggctaccctc ttgagtgcat taaagacctt 960
ctagcacgtg ctggtaaagc ttcatgcact ttgtccgaac aactggactt tattgacact 1020
aagaggggtg tatactgctg ccgtgaacat gagcatgaaa ttgcttggta cacggaacgt 1080
tctgaaaaga gctatgaatt gcagacacct tttgaaatta aattggcaaa gaaatttgac 1140
accttcaatg gggaatgtcc aaattttgta tttcccttaa attccataat caagactatt 1200
caaccaaggg ttgaaaagaa aaagcttgat ggctttatgg gtagaattcg atctgtctat 1260
ccagttgcgt caccaaatga atgcaaccaa atgtgccttt caactctcat gaagtgtgat 1320
cattgtggtg aaacttcatg gcagacgggc gattttgtta aagccacttg cgaattttgt 1380
ggcactgaga atttgactaa agaaggtgcc actacttgtg gttacttacc ccaaaatgct 1440
gttgttaaaa tttattgtcc agcatgtcac aattcagaag taggacctga gcatagtctt 1500
gccgaatacc ataatgaatc tggcttgaaa accattcttc gtaagggtgg tcgcactatt 1560
gcctttggag gctgtgtgtt ctcttatgtt ggttgccata acaagtgtgc ctattgggtt 1620
ccacgtgcta gcgctaacat aggttgtaac catacaggtg ttgttggaga aggttccgaa 1680
ggtcttaatg acaaccttct tgaaatactc caaaaagaga aagtcaacat caatattgtt 1740
ggtgacttta aacttaatga agagatcgcc attattttgg catctttttc tgcttccaca 1800
agtgcttttg tggaaactgt gaaaggtttg gattataaag cattcaaaca aattgttgaa 1860
tcctgtggta attttaaagt tacaaaagga aaagctaaaa aaggtgcctg gaatattggt 1920
gaacagaaat caatactgag tcctctttat gcatttgcat cagaggctgc tcgtgttgta 1980
cgatcaattt tctctcgcac tcttgaaact gctcaaaatt ctgtgcgtgt tttacagaag 2040
gccgctataa caatactaga tggaatttca cagtattcac tgagactcat tgatgctatg 2100
atgttcacat ctgatttggc tactaacaat ctagttgtaa tggcctacat tacaggtggt 2160
gttgttcagt tgacttcgca gtggctaact aacatctttg gcactgttta tgaaaaactc 2220
aaacccgtcc ttgattggct tgaagagaag tttaaggaag gtgtagagtt tcttagagac 2280
ggttgggaaa ttgttaaatt tatctcaacc tgtgcttgtg aaattgtcgg tggacaaatt 2340
gtcacctgtg caaaggaaat taaggagagt gttcagacat tctttaagct tgtaaataaa 2400
tttttggctt tgtgtgctga ctctatcatt attggtggag ctaaacttaa agccttgaat 2460
ttaggtgaaa catttgtcac gcactcaaag ggattgtaca gaaagtgtgt taaatccaga 2520
gaagaaactg gcctactcat gcctctaaaa gccccaaaag aaattatctt cttagaggga 2580
gaaacacttc ccacagaagt gttaacagag gaagttgtct tgaaaactgg tgatttacaa 2640
ccattagaac aacctactag tgaagctgtt gaagctccat tggttggtac accagtttgt 2700
attaacgggc ttatgttgct cgaaatcaaa gacacagaaa agtactgtgc ccttgcacct 2760
aatatgatgg taacaaacaa taccttcaca ctcaaaggcg gtgcaccaac aaaggttact 2820
tttggtgatg acactgtgat agaagtgcaa ggttacaaga gtgtgaatat cacttttgaa 2880
cttgatgaaa ggattgataa agtacttaat gagaagtgct ctgcctatac agttgaactc 2940
ggtacagaag taaatgagtt cgcctgtgtt gtggcagatg ctgtcataaa aactttgcaa 3000
ccagtatctg aattacttac accactgggc attgatttag atgagtggag tatggctaca 3060
tactacttat ttgatgagtc tggtgagttt aaattggctt cacatatgta ttgttctttc 3120
taccctccag atgaggatga agaagaaggt gattgtgaag aagaagagtt tgagccatca 3180
actcaatatg agtatggtac tgaagatgat taccaaggta aacctttgga atttggtgcc 3240
acttctgctg ctcttcaacc tgaagaagag caagaagaag attggttaga tgatgatagt 3300
caacaaactg ttggtcaaca agacggcagt gaggacaatc agacaactac tattcaaaca 3360
attgttgagg ttcaacctca attagagatg gaacttacac cagttgttca gactattgaa 3420
gtgaatagtt ttagtggtta tttaaaactt actgacaatg tatacattaa aaatgcagac 3480
attgtggaag aagctaaaaa ggtaaaacca acagtggttg ttaatgcagc caatgtttac 3540
cttaaacatg gaggaggtgt tgcaggagcc ttaaataagg ctactaacaa tgccatgcaa 3600
gttgaatctg atgattacat agctactaat ggaccactta aagtgggtgg tagttgtgtt 3660
ttaagcggac acaatcttgc taaacactgt cttcatgttg tcggcccaaa tgttaacaaa 3720
ggtgaagaca ttcaacttct taagagtgct tatgaaaatt ttaatcagca cgaagttcta 3780
cttgcaccat tattatcagc tggtattttt ggtgctgacc ctatacattc tttaagagtt 3840
tgtgtagata ctgttcgcac aaatgtctac ttagctgtct ttgataaaaa tctctatgac 3900
aaacttgttt caagcttttt ggaaatgaag agtgaaaagc aagttgaaca aaagatcgct 3960
gagattccta aagaggaagt taagccattt ataactgaaa gtaaaccttc agttgaacag 4020
agaaaacaag atgataagaa aatcaaagct tgtgttgaag aagttacaac aactctggaa 4080
gaaactaagt tcctcacaga aaacttgtta ctttatattg acattaatgg caatcttcat 4140
ccagattctg ccactcttgt tagtgacatt gacatcactt tcttaaagaa agatgctcca 4200
tatatagtgg gtgatgttgt tcaagagggt gttttaactg ctgtggttat acctactaaa 4260
aaggctggtg gcactactga aatgctagcg aaagctttga gaaaagtgcc aacagacaat 4320
tatataacca cttacccggg tcagggttta aatggttaca ctgtagagga ggcaaagaca 4380
gtgcttaaaa agtgtaaaag tgccttttac attctaccat ctattatctc taatgagaag 4440
caagaaattc ttggaactgt ttcttggaat ttgcgagaaa tgcttgcaca tgcagaagaa 4500
acacgcaaat taatgcctgt ctgtgtggaa actaaagcca tagtttcaac tatacagcgt 4560
aaatataagg gtattaaaat acaagagggt gtggttgatt atggtgctag attttacttt 4620
tacaccagta aaacaactgt agcgtcactt atcaacacac ttaacgatct aaatgaaact 4680
cttgttacaa tgccacttgg ctatgtaaca catggcttaa atttggaaga agctgctcgg 4740
tatatgagat ctctcaaagt gccagctaca gtttctgttt cttcacctga tgctgttaca 4800
gcgtataatg gttatcttac ttcttcttct aaaacacctg aagaacattt tattgaaacc 4860
atctcacttg ctggttccta taaagattgg tcctattctg gacaatctac acaactaggt 4920
atagaatttc ttaagagagg tgataaaagt gtatattaca ctagtaatcc taccacattc 4980
cacctagatg gtgaagttat cacctttgac aatcttaaga cacttctttc tttgagagaa 5040
gtgaggacta ttaaggtgtt tacaacagta gacaacatta acctccacac gcaagttgtg 5100
gacatgtcaa tgacatatgg acaacagttt ggtccaactt atttggatgg agctgatgtt 5160
actaaaataa aacctcataa ttcacatgaa ggtaaaacat tttatgtttt acctaatgat 5220
gacactctac gtgttgaggc ttttgagtac taccacacaa ctgatcctag ttttctgggt 5280
aggtacatgt cagcattaaa tcacactaaa aagtggaaat acccacaagt taatggttta 5340
acttctatta aatgggcaga taacaactgt tatcttgcca ctgcattgtt aacactccaa 5400
caaatagagt tgaagtttaa tccacctgct ctacaagatg cttattacag agcaagggct 5460
ggtgaagctg ctaacttttg tgcacttatc ttagcctact gtaataagac agtaggtgag 5520
ttaggtgatg ttagagaaac aatgagttac ttgtttcaac atgccaattt agattcttgc 5580
aaaagagtct tgaacgtggt gtgtaaaact tgtggacaac agcagacaac ccttaagggt 5640
gtagaagctg ttatgtacat gggcacactt tcttatgaac aatttaagaa aggtgttcag 5700
ataccttgta cgtgtggtaa acaagctaca aaatatctag tacaacagga gtcacctttt 5760
gttatgatgt cagcaccacc tgctcagtat gaacttaagc atggtacatt tacttgtgct 5820
agtgagtaca ctggtaatta ccagtgtggt cactataaac atataacttc taaagaaact 5880
ttgtattgca tagacggtgc tttacttaca aagtcctcag aatacaaagg tcctattacg 5940
gatgttttct acaaagaaaa cagttacaca acaaccataa aaccagttac ttataaattg 6000
gatggtgttg tttgtacaga aattgaccct aagttggaca attattataa gaaagacaat 6060
tcttatttca cagagcaacc aattgatctt gtaccaaacc aaccatatcc aaacgcaagc 6120
ttcgataatt ttaagtttgt atgtgataat atcaaatttg ctgatgattt aaaccagtta 6180
actggttata agaaacctgc ttcaagagag cttaaagtta catttttccc tgacttaaat 6240
ggtgatgtgg tggctattga ttataaacac tacacaccct cttttaagaa aggagctaaa 6300
ttgttacata aacctattgt ttggcatgtt aacaatgcaa ctaataaagc cacgtataaa 6360
ccaaatacct ggtgtatacg ttgtctttgg agcacaaaac cagttgaaac atcaaattcg 6420
tttgatgtac tgaagtcaga ggacgcgcag ggaatggata atcttgcctg cgaagatcta 6480
aaaccagtct ctgaagaagt agtggaaaat cctaccatac agaaagacgt tcttgagtgt 6540
aatgtgaaaa ctaccgaagt tgtaggagac attatactta aaccagcaaa taatagttta 6600
aaaattacag aagaggttgg ccacacagat ctaatggctg cttatgtaga caattctagt 6660
cttactatta agaaacctaa tgaattatct agagtattag gtttgaaaac ccttgctact 6720
catggtttag ctgctgttaa tagtgtccct tgggatacta tagctaatta tgctaagcct 6780
tttcttaaca aagttgttag tacaactact aacatagtta cacggtgttt aaaccgtgtt 6840
tgtactaatt atatgcctta tttctttact ttattgctac aattgtgtac ttttactaga 6900
agtacaaatt ctagaattaa agcatctatg ccgactacta tagcaaagaa tactgttaag 6960
agtgtcggta aattttgtct agaggcttca tttaattatt tgaagtcacc taatttttct 7020
aaactgataa atattataat ttggttttta ctattaagtg tttgcctagg ttctttaatc 7080
tactcaaccg ctgctttagg tgttttaatg tctaatttag gcatgccttc ttactgtact 7140
ggttacagag aaggctattt gaactctact aatgtcacta ttgcaaccta ctgtactggt 7200
tctatacctt gtagtgtttg tcttagtggt ttagattctt tagacaccta tccttcttta 7260
gaaactatac aaattaccat ttcatctttt aaatgggatt taactgcttt tggcttagtt 7320
gcagagtggt ttttggcata tattcttttc actaggtttt tctatgtact tggattggct 7380
gcaatcatgc aattgttttt cagctatttt gcagtacatt ttattagtaa ttcttggctt 7440
atgtggttaa taattaatct tgtacaaatg gccccgattt cagctatggt tagaatgtac 7500
atcttctttg catcatttta ttatgtatgg aaaagttatg tgcatgttgt agacggttgt 7560
aattcatcaa cttgtatgat gtgttacaaa cgtaatagag caacaagagt cgaatgtaca 7620
actattgtta atggtgttag aaggtccttt tatgtctatg ctaatggagg taaaggcttt 7680
tgcaaactac acaattggaa ttgtgttaat tgtgatacat tctgtgctgg tagtacattt 7740
attagtgatg aagttgcgag agacttgtca ctacagttta aaagaccaat aaatcctact 7800
gaccagtctt cttacatcgt tgatagtgtt acagtgaaga atggttccat ccatctttac 7860
tttgataaag ctggtcaaaa gacttatgaa agacattctc tctctcattt tgttaactta 7920
gacaacctga gagctaataa cactaaaggt tcattgccta ttaatgttat agtttttgat 7980
ggtaaatcaa aatgtgaaga atcatctgca aaatcagcgt ctgtttacta cagtcagctt 8040
atgtgtcaac ctatactgtt actagatcag gcattagtgt ctgatgttgg tgatagtgcg 8100
gaagttgcag ttaaaatgtt tgatgcttac gttaatacgt tttcatcaac ttttaacgta 8160
ccaatggaaa aactcaaaac actagttgca actgcagaag ctgaacttgc aaagaatgtg 8220
tccttagaca atgtcttatc tacttttatt tcagcagctc ggcaagggtt tgttgattca 8280
gatgtggaaa ctaaagatgt tgttgaatgt cttaaattgt cacatcaatc tgacatagaa 8340
gttactggcg atagttgtaa taactatatg ctcacctata acaaagttga aaacatgaca 8400
ccccgtgacc ttggtgcttg tattgactgt agtgcgcgtc atattaatgc gcaggtagca 8460
aaaagtcaca acattgcttt gatatggaac gttaaagatt tcatgtcatt gtctgaacaa 8520
ctacgaaaac aaatacgtag tgctgctaaa aagaataact taccttttaa gttgacatgt 8580
gcaactacta gacaagttgt taatgttgta acaacaaaga tagcacttaa gggtggtaaa 8640
attgttaata attggttgaa gcagttaatt aaagttacac ttgtgttcct ttttgttgct 8700
gctattttct atttaataac acctgttcat gtcatgtcta aacatactga cttttcaagt 8760
gaaatcatag gatacaaggc tattgatggt ggtgtcactc gtgacatagc atctacagat 8820
acttgttttg ctaacaaaca tgctgatttt gacacatggt ttagccagcg tggtggtagt 8880
tatactaatg acaaagcttg cccattgatt gctgcagtca taacaagaga agtgggtttt 8940
gtcgtgcctg gtttgcctgg cacgatatta cgcacaacta atggtgactt tttgcatttc 9000
ttacctagag tttttagtgc agttggtaac atctgttaca caccatcaaa acttatagag 9060
tacactgact ttgcaacatc agcttgtgtt ttggctgctg aatgtacaat ttttaaagat 9120
gcttctggta agccagtacc atattgttat gataccaatg tactagaagg ttctgttgct 9180
tatgaaagtt tacgccctga cacacgttat gtgctcatgg atggctctat tattcaattt 9240
cctaacacct accttgaagg ttctgttaga gtggtaacaa cttttgattc tgagtactgt 9300
aggcacggca cttgtgaaag atcagaagct ggtgtttgtg tatctactag tggtagatgg 9360
gtacttaaca atgattatta cagatcttta ccaggagttt tctgtggtgt agatgctgta 9420
aatttactta ctaatatgtt tacaccacta attcaaccta ttggtgcttt ggacatatca 9480
gcatctatag tagctggtgg tattgtagct atcgtagtaa catgccttgc ctactatttt 9540
atgaggttta gaagagcttt tggtgaatac agtcatgtag ttgcctttaa tactttacta 9600
ttccttatgt cattcactgt actctgttta acaccagttt actcattctt acctggtgtt 9660
tattctgtta tttacttgta cttgacattt tatcttacta atgatgtttc ttttttagca 9720
catattcagt ggatggttat gttcacacct ttagtacctt tctggataac aattgcttat 9780
atcatttgta tttccacaaa gcatttctat tggttcttta gtaattacct aaagagacgt 9840
gtagtcttta atggtgtttc ctttagtact tttgaagaag ctgcgctgtg cacctttttg 9900
ttaaataaag aaatgtatct aaagttgcgt agtgatgtgc tattacctct tacgcaatat 9960
aatagatact tagctcttta taataagtac aagtatttta gtggagcaat ggatacaact 10020
agctacagag aagctgcttg ttgtcatctc gcaaaggctc tcaatgactt cagtaactca 10080
ggttctgatg ttctttacca accaccacaa acctctatca cctcagctgt tttgcagagt 10140
ggttttagaa aaatggcatt cccatctggt aaagttgagg gttgtatggt acaagtaact 10200
tgtggtacaa ctacacttaa cggtctttgg cttgatgacg tagtttactg tccaagacat 10260
gtgatctgca cctctgaaga catgcttaac cctaattatg aagatttact cattcgtaag 10320
tctaatcata atttcttggt acaggctggt aatgttcaac tcagggttat tggacattct 10380
atgcaaaatt gtgtacttaa gcttaaggtt gatacagcca atcctaagac acctaagtat 10440
aagtttgttc gcattcaacc aggacagact ttttcagtgt tagcttgtta caatggttca 10500
ccatctggtg tttaccaatg tgctatgagg cccaatttca ctattaaggg ttcattcctt 10560
aatggttcat gtggtagtgt tggttttaac atagattatg actgtgtctc tttttgttac 10620
atgcaccata tggaattacc aactggagtt catgctggca cagacttaga aggtaacttt 10680
tatggacctt ttgttgacag gcaaacagca caagcagctg gtacggacac aactattaca 10740
gttaatgttt tagcttggtt gtacgctgct gttataaatg gagacaggtg gtttctcaat 10800
cgatttacca caactcttaa tgactttaac cttgtggcta tgaagtacaa ttatgaacct 10860
ctaacacaag accatgttga catactagga cctctttctg ctcaaactgg aattgccgtt 10920
ttagatatgt gtgcttcatt aaaagaatta ctgcaaaatg gtatgaatgg acgtaccata 10980
ttgggtagtg ctttattaga agatgaattt acacctcttg atgttgttag acaatgctca 11040
ggtgttactt tccaaagtgc agtgaaaaga acaaccaagg gtacacacca ctggttgtta 11100
ctcacaattt tgacttcact tttagtttta gtccagagta ctcaatggtc tttgttcttt 11160
tttttgtatg aaaatgcctt tttacctttt gctatgggta ttattgctat gtctgctttt 11220
gcaatgatgt ttgtcaaaca taagcatgca tttctctgtt tgtttttgtt accttctctt 11280
gccactgtag cttattttaa tatggtctat atgcctgcta gttgggtgat gcgtattatg 11340
acatggttgg atatggttga tactagtttg tctggtttta agctaaaaga ctgtgttatg 11400
tatgcatcag ctgtagtgtt actaatcctt atgacagcaa gaactgtgta tgatgatggt 11460
gctaggagag tgtggacact tatgaatgtc ttgacactcg tttataaagt ttattatggt 11520
aatgctttag atcaagccat ttccatgtgg gctcttataa tctctgttac ttctaactac 11580
tcaggtgtag ttacaactgt catgtttttg gccagaggta ttgtttttat gtgtgttgag 11640
tattgcccta ttttcttcat aactggtaat acacttcagt gtataatgct agtttattgt 11700
ttcttaggct atttttgtac ttgttacttt ggcctctttt gtttactcaa ccgctacttt 11760
agactgactc ttggtgttta tgattactta gtttctacac aggagtttag atatatgaat 11820
tcacagggac tactcccacc caagaatagc atagatgcct tcaaactcaa cattaaattg 11880
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ggcatactaa ttgttacgac tattgtatac cttacaatag tgtaacttct tcaattgtca 25980
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atactgaaaa atgggaatct ggagtaaaag actgtgttgt attacacagt tacttcactt 26100
cagactatta ccagctgtac tcaactcaat tgagtacaga cactggtgtt gaacatgtta 26160
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<210> 2
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gaagttcaca cacttgttct tcac 24
Claims (7)
1.新型冠状病毒hCov-19/Wuhan/ZY38-1/2020毒株在制备含有新型冠状病毒阳性抗体牛奶或血清中的应用，所述的新型冠状病毒登陆号为EPI_ISL_486645。
2.根据权利要求1所述的应用，所述新型冠状病毒是制备成免疫制剂后对奶牛进行免疫，其是将灭活验证合格的新冠病毒液离心去除细胞碎片后，浓缩，获得高浓度的抗原；
水相制备：在浓缩抗原中加入2%~4%吐温80；
油相制备：macro152白油添加5%~6%司本85和1%~2%硬脂酸铝，灭菌；
水相和油相按3:2~4:3比例混合后即为新冠病毒免疫制剂。
3. 权利要求1中所述的应用制备的牛奶或血清来评价新型冠状病毒动物模型，所述模型的构建方法是将SARS-CoV-2/WBP-1感染小鼠，所述的SARS-CoV-2/WBP-1保藏编号为CCTCC NO：V202031。
4.权利要求1中所述的应用制备的牛奶在制备成中和新型冠状病毒的饮用药剂中的应用。
5.权利要求1中所述的应用制备的牛奶或血清在制备治疗或预防新型冠状病毒感染的药物中的应用。
6.权利要求1中所述的应用制备的牛奶或血清用于制备新型冠状病毒Igs抗体中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述的Igs抗体在制备治疗或预防新型冠状病毒感染的药物中的应用。
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