CN1502367A - 一种免疫预防滴鼻制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物制品领域，涉及一种灭活呼吸道传播病毒滴鼻剂及其制备方法。本发明含灭活新型冠状病毒和药用敷剂。本发明采用早期“非典”患者鼻咽吸取液分离的新冠状病毒株，接种Vero传代细胞，经甲醛灭活病毒，灭活后盲传三代，证实无活病毒存在，用免疫荧光染色证明病毒保留抗原性，调整浓度及pH，可供滴鼻作为预防SARS的制剂。本发明制备方法简便，只需证明无害即可使用，为制备灭活新冠状病毒疫苗奠定基础。

Description

一种免疫预防滴鼻制剂及其制备方法

技术领域

本发明属生物制品领域，涉及一种免疫预防滴鼻制剂及其制备方法，具体涉及一种灭活呼吸道传播病毒滴鼻剂及其制备方法。

背景技术

2003年2月下旬我国广州发生一种新的传染性非典型肺炎，在香港及世界各国先后亦发生同样疾病。3月中旬意大利医生Ubani向世界卫生组织(WHO)报告这一疾病，命名为SARS(Ref)。4月16日WHO在全世界十个国家协作基础上确定并公布SARS病原为一特殊的新型冠状病毒或冠状病毒变种。(ref)目前世界范围内已有不同国家或地区的实验室分离出新型冠状病毒(简称SARS病毒)。通过对其全基因组测序，已确定其分类地位于已知的冠状病毒第一和第三组之间，属第二组。鉴于这是一种新出现的病毒，目前对各毒株的分离、鉴定、测序还在进行中。

由于SARS来势汹猛，传播迅速，在根据常规制备灭活疫苗的同时，急需研制一种免疫预防制剂如鼻制剂，供对SARS患者密切接触者使用。这一制剂的应用将可为控制SARS传播起重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫预防滴鼻制剂及其制备方法，尤其是一种灭活呼吸道传播病毒滴鼻剂及其制备方法。

本发明免疫预防滴鼻制剂含灭活新型冠状病毒和药用敷剂。

本发明滴鼻制剂所含的新型冠状病毒具有序列1的结构。

本发明免疫预防滴鼻制剂通过下述步骤和方法制备。

1.分离与鉴定新型冠状病毒，

1)取SARS病人的鼻咽洗液，用传代细胞FRhK4细胞作病毒分离，出现病变则继续传代；不出现病变进行盲传三次，同时用已知的可测定新冠状病毒保守序列的引物，作RT-PCR检测及测序，确定是否为新型冠状病毒。以该病毒感染细胞制备抗原片，与临床诊断为非典型肺炎病人双份血清作免疫荧光检测，病人恢复期血清与病毒抗原片的抗体效价有4倍以上升高，证明所分离病毒是非典型肺炎的主要病原体。

2)确定毒株的效价及全基因组测序

将上述毒株在传代细胞中连续传代，稳定传代。用在细胞中作半数细胞病变(TCID₅₀)效价测定，滴度效价为10⁷或以上，作全基因序列测定及分析，证明为新型冠状病毒。

3)病毒灭活，收取接种细胞上清液中病毒，用37％-38％浓度的甲醛加入病毒液中，使甲醛的最终浓度达0.025％，置4℃72小时后，盲传三代，确定无活病毒存在。

4)灭活病毒纯化，用超速离心法收集培养液中的灭活病毒，并用氯化钙密度梯度离心法提纯灭活病毒。以透析式超离心法除去残留的氯化钙。

5)测定灭活病毒量，采用定量RT-PCR法测定病毒RNA拷贝数，以确定病毒含量。

6)测定灭活病毒抑制活病毒感染力，在细胞培养中，接种灭活病毒30分钟后，再接种活病毒，其TCID₅₀明显降低，证明灭活病毒有抑制活病毒感染性的作用。

7)可加入适当的佐剂或稳定剂，以保证灭活病毒抗原的稳定性，制备本发明免疫预防滴鼻制剂。

本发明灭活新冠状病毒免疫预防滴鼻制剂可供对SARS患者密切接触者使用。其具有下述优点：1)制备方法简便，不必按常规制备疫苗的病毒株空斑纯化，检测残余细胞成分及作为注射制剂的需进行急性毒性，慢性毒性，致癌，致崎等步骤。2)只需证明无害即可使用，至少是一种局部特异免疫的制剂。3)可据此制剂获得有关新冠状病毒灭活技术及局部免疫应答的特点。4)为制备灭活新冠状病毒疫苗奠定基础。

附图说明

图1.正常细胞与接种标本后3-4天的细胞病变(400×，FRhk-4)。

图2.用新冠状病毒特异的引物对细胞病变阳性的FRhk-4细胞提取的RNA作RT-PCR，电泳出现预期条带。

图3.GHGZ株的部分核苷酸序列分析，结果证明为新型冠状病毒。

图4.为间接免疫荧光染色片。

图5.对GHGZ株的557个氨基酸的分析。

具体实施方式

实施例1

分离与鉴定冠状病毒

1)自我国广州一名SARS患者的鼻咽洗液分离新型冠状病毒毒株。所述患者女性，发热2天后于2003年2月17日就诊于广州医学院第一医院。患者体温38.5℃有轻微咳嗽，X线检查右肺有新浸润性阴影，并有与SARS患者接触史。

2)病毒分离：所用细胞为FRhk-4传代细胞系，培养于含10％胎牛血清的MEM(Gibco)培养基中。将细胞用无血清MEM洗后，接种鼻咽洗液200ul，同时加入1ug/ml胰蛋白酶(Sigma)。孵育于36.5℃60分钟后，加入1ml不含胎牛血清的MEM(含有1ug/ml胰蛋白酶)，继续培养于36.5℃二氧化碳培养箱内，每日观察细胞病变，出现圆形细胞团缩、折光度增加为细胞病变。

3)将上述细胞病变的上清液(代号为GHGZ-1)接种至另一瓶FRhk-4细胞并同时进行RT-PCR检测，所用引物为冠状病毒的保守核苷酸序列。在检测结果阳性的细胞培养瓶加入1％胎牛血清MEM继续培养，直至出现50％的细胞病变。

4)将上述阳性的细胞培养接种至传代Vero细胞(ATCC来源)，继续扩增病毒，或冻存于-70℃。第一代的GHGZ毒株在4天左右出现细胞病变局灶性细胞变圆(见图1)，以后细胞病变在1-2天扩散至全细胞层。用新冠状病毒特异的引物对细胞病变阳性的FRhk-4细胞提取的RNA作RT-PCR，所述标本的RNA先经转录成cDNA后，用引物：5’-TACACACCTCAGCGTTG-3’和5’-CACGAACGTGACGAAT-3’94℃8分钟后再经40个周期(94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟)扩增，扩增后产物在2％琼脂糖中作电泳，出现预期条带(图2)。病毒测序表明，与其他国家和香港分离的毒株为同一属，结果证明为新型冠状病毒(图3)。

5)为确诊所分离培养的病毒为该患者SARS的病原体，收集19例临床诊断为SARS病人早期与恢复期双份血清用间接免疫荧光法测定。结果显示全部病人恢复期血清抗体至少64倍的效价升高(图4)。因此可以确认GHGZ是该SARS患者的病原。

6)经TCID₅₀测定，第三代后的病毒滴度为10⁷-10⁸，并能在Vero细胞稳定传代。

7)该病毒株经全序列测定分析，对GHGZ株的557个氨基酸的分析。分析“树根”为Okaveieo(AA下82690)。其他均为GeneBank中已登录的其他新冠状病毒株。横线的长短与氨基酸数差别相应。表明该病毒株为在香港、加拿大和美国及北京分离的冠状病毒流行株之母株(图5)。

实施例2

病毒灭活实验

1)将接种GHGZ毒株并出现25％～56％细胞病变的Vero细胞，用1ml 0.01M pH7.2PBS吹打刮下，用1000rpm离心沉淀获细胞，再用PBS洗一次后，按每玻片孔6ul滴在其中，吹干后，用-20℃丙酮固定30分钟，作为阳性抗原玻片对照。

2)用上述的病毒感染细胞抗原片用终浓度为0.025％、0.25％及2.5％的甲醛在4℃固定72小时后，用已知含阳性抗体血清经56℃30分钟灭活后进行间接荧光抗体染色，即分别加入1∶40抗体阳性血清，置37℃45分钟后，洗去血清，加入FITC-标记抗人IgG抗体(根据试剂推荐浓度)37℃作用45分钟后，洗去荧光抗体、加上无荧光甘油封片后观察。

3)结果仅有浓度为0.025％甲醛处理的细胞片仍保持与阳性抗体作用的特点，说明0.025％甲醛既可灭活又可以保持新冠状病毒的抗原性，可用于灭活冠状病毒。

实施例3

灭活病毒抑制活病毒复制实验

1)用细胞接种至96孔细胞培养板，待生长铺满孔75％以上，加入已灭活的病毒(TCID₅₀计算相当于10⁷/ml)，30-50后加入GHGZ毒株，分别稀释为10²10³10⁴10⁵10⁶10⁷TCID₅₀/ml。每一稀释度做复孔或三重复孔，另有不加灭活病毒仅加稀释液的活病毒对照及细胞对照。

2)36.5℃孵育后，观察细胞病变，

计算灭活病毒抑制活病毒的效果，结果证明活病毒的复制性下降2个10克的TCID₅₀，由TCID₅₀为10⁷下降为10⁵，或更高。

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Organization Applicant

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    Street：广州市沿江路151号

    City：广州市

    State：广东省

    Country：中国

    PostalCode：510120

    PhoneNumber：

    FaxNumber：

    EmailAddress：

<110>OrganizationName：广州医学院呼吸疾病研究所

Application Project

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<120>Title：一种免疫预防滴鼻剂及其制备方法

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                                       WWBWOR~1.TXT

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                                        WWBWOR~1.TXT

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                                        WWBWOR~1.TXT

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aatcattatt aaagactgta caattctgcg atgctatgcg tgatgcaggc attgtaggcg    13980

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                                        WWBWOR~1.TXT

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                                        WWBWOR~1.TXT

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agcccagatc acaaatggaa actgactttc tcgagctcgc tatggatgaa ttcatacagc    20220

gatataagct cgagggctat gccttcgaac acatcgttta tggagatttc agtcatggac    20280

aacttggcgg tcttcattta atgataggct tagccaagcg ctcacaagat tcaccactta    20340

aattagagga ttttatccct atggacagca cagtgaaaaa ttacttcata acagatgcgc    20400

aaacaggttc atcaaaatgt gtgtgttctg tgattgatct tttacttgat gactttgtcg    20460

                                        WWBWOR~1.TXT

agataataaa gtcacaagat ttgtcagtga tttcaaaagt ggtcaaggtt acaattgact    20520

atgctgaaat ttcattcatg ctttggtgta aggatggaca tgttgaaacc ttctacccaa    20580

aactacaagc aagtcaagcg tggcaaccag gtgttgcgat gcctaacttg tacaagatgc    20640

aaagaatgct tcttgaaaag tgtgaccttc agaattatgg tgaaaatgct gttataccaa    20700

aaggaataat gatgaatgtc gcaaagtata ctcaactgtg tcaatactta aatacactta    20760

ctttagctgt accctacaac atgagagtta ttcactttgg tgctggctct gataaaggag    20820

ttgcaccagg tacagctgtg ctcagacaat ggttgccaac tggcacacta cttgtcgatt    20880

cagatcttaa tgacttcgtc tccgacgcag attctacttt aattggagac tgtgcaacag    20940

tacatacggc taataaatgg gaccttatta ttagcgatat gtatgaccct aggaccaaac    21000

atgtgacaaa agagaatgac tctaaagaag ggtttttcac ttatctgtgt ggatttataa    21060

agcaaaaact agccctgggt ggttctatag ctgtaaagat aacagagcat tcttggaatg    21120

ctgaccttta caagcttatg ggccatttct catggtggac agcttttgtt acaaatgtaa    21180

atgcatcatc atcggaagca tttttaattg gggctaacta tcttggcaag ccgaaggaac    21240

aaattgatgg ctataccatg catgctaact acattttctg gaggaacaca aatcctatcc    21300

agttgtcttc ctattcactc tttgacatga gcaaatttcc tcttaaatta agaggaactg    21360

ctgtaatgtc tcttaaggag aatcaaatca atgatatgat ttattctctt ctggaaaaag    21420

gtaggcttat cattagagaa aacaacagag ttgtggtttc aagtgatatt cttgttaaca    21480

actaaacgaa catgtttatt ttcttattat ttcttactct cactagtggt agtgaccttg    21540

accggtgcac cacttttgat gatgttcaag ctcctaatta cactcaacat acttcatcta    21600

tgaggggggt ttactatcct gatgaaattt ttagattaga cactctttat ttaactcagg    21660

atttatttct tccattttat tctaatgtta cagggtttca tactattaat catacgtttg    21720

acaaccctgt catacctttt aaggatggta tttattttgc tgccacagag aaatcaaatg    21780

ttgtccgtgg ttgggttttt ggttctacca tgaacaacaa gtcacagtcg gtgattatta    21840

ttaacaattc tactaatgtt gttatacgag catgtaactt tgaattgtgt gacaaccctt    21900

tctttgctgt ttctaaaccc atgggtacac agacacatac tatgatattc gataatgcat    21960

ttaattgcac tttcgagtac atatctgatg ccttttcgct tgatgtttca gaaaagtcag    22020

gtaattttaa acacttacga gagtttgtgt ttaaaaataa agatgggttt ctctatgttt    22080

ataagggcta tcaacctata gatgtagttc gtgatctacc ttctggtttt aacactttga    22140

aacctatttt taagttgcct cttggtatta acattacaaa ttttagagcc attcttacag    22200

ccttttcacc tgctcaagac acttggggca cgtcagctgc agcctatttt gttggctatt    22260

taaagccaac tacatttatg ctcaagtatg atgaaaatgg tacaatcaca gatgctgttg    22320

attgttctca aaatccactt gctgaactca aatgctctgt taagagcttt gagattgaca    22380

                                        WWBWOR~1.TXT

aaggaattta ccagacctct aatttcaggg ttgttccctc aggagatgtt gtgagattcc    22440

ctaatattac aaacttgtgt ccttttggag aggtttttaa tgctactaaa ttcccttctg    22500

tctatgcatg ggagagaaaa aaaatttcta attgtgttgc tgattactct gtgctctaca    22560

actcaacatt tttttcaacc tttaagtgct atggcgtttc tgccactaag ttgaatgatc    22620

tttgcttctc caatgtctat gcagattctt ttgtagtcaa gggagatgat gtaagacaaa    22680

tagcgccagg acaaactggt gttattgctg attataatta taaattgcca gatgatttca    22740

tgggttgtgt ccttgcttgg aatactagga acattgatgc tacttcaact ggtaattata    22800

attataaata taggtatctt agacatggca agcttaggcc ctttgagaga gacatatcta    22860

atgtgccttt ctcccctgat ggcaaacctt gcaccccacc tgctcttaat tgttattggc    22920

cattaaatga ttatggtttt tacaccacta ctggcattgg ctaccaacct tacagagttg    22980

tagtactttc ttttgaactt ttaaatgcac cggccacggt ttgtggacca aaattatcca    23040

ctgaccttat taagaaccag tgtgtcaatt ttaattttaa tggactcact ggtactggtg    23100

tgttaactcc ttcttcaaag agatttcaac catttcaaca atttggccgt gatgtttctg    23160

atttcactga ttccgttcga gatcctaaaa catctgaaat attagacatt tcaccttgct    23220

cttttggggg tgtaagtgta attacacctg gaacaaatgc ttcatctgaa gttgctgttc    23280

tatatcaaga tgttaactgc actgatgttt ctacagcaat tcatgcagat caactcacac    23340

cagcttggcg catatattct actggaaaca atgtattcca gactcaagca ggctgtctta    23400

taggagctga gcatgtcgac acttcttatg agtgcgacat tcctattgga gctggcattt    23460

gtgctagtta ccatacagtt tctttattac gtagtactag ccaaaaatct attgtggctt    23520

atactatgtc tttaggtgct gatagttcaa ttgcttactc taataacacc attgctatac    23580

ctactaactt ttcaattagc attactacag aagtaatgcc tgtttctatg gctaaaacct    23640

ccgtagattg taatatgtac atctgcggag attctactga atgtgctaat ttgcttctcc    23700

aatatggtag cttttgcaca caactaaatc gtgcactctc aggtattgct gctgaacagg    23760

atcgcaacac acgtgaagtg ttcgctcaag tcaaacaaat gtacaaaacc ccaactttga    23820

aagattttgg tggttttaat ttttcacaaa tattacctga ccctctaaag ccaactaaga    23880

ggtcttttat tgaggacttg ctctttaata aggtgacact cgctgatgct ggcttcatga    23940

agcaatatgg cgaatgccta ggtgatatta atgctagaga tctcatttgt gcgcagaagt    24000

tcaatggact tacagtgttg ccacctctgc tcactgatga tatgattgct gcctacactg    24060

ctgctctagt tagtggtact gccactgctg gatggacatt tggtgctggc gctgctcttc    24120

aaataccttt tgctatgcaa atggcatata ggttcaatgg cattggagtt acccaaaatg    24180

ttctctatga gaaccaaaaa caaatcgcca accaatttaa caaggcgatt agtcaaattc    24240

aagaatcact tacaacaaca tcaactgcat tgggcaagct gcaagacgtt gttaaccaga    24300

                                        WWBWOR~1.TXT

atgctcaagc attaaacaca cttgttaaac aacttagctc taattttggt gcaatttcaa    24360

gtgtgctaaa tgatatcctt tcgcgacttg ataaagtcga ggcggaggta caaattgaca    24420

ggttaattac aggcagactt caaagccttc aaacctatgt aacacaacaa ctaatcaggg    24480

ctgctgaaat cagggcttct gctaatcttg ctgctactaa aatgtctgag tgtgttcttg    24540

gacaatcaaa aagagttgac ttttgtggaa agggctacca ccttatgtcc ttcccacaag    24600

cagccccgca tggtgttgtc ttcctacatg tcacgtatgt gccatcccag gagaggaact    24660

tcaccacagc gccagcaatt tgtcatgaag gcaaagcata cttccctcgt gaaggtgttt    24720

ttgtgtttaa tggcacttct tggtttatta cacagaggaa cttcttttct ccacaaataa    24780

ttactacaga caatacattt gtctcaggaa attgtgatgt cgttattggc atcattaaca    24840

acacagttta tgatcctctg caacctgagc ttgactcatt caaagaagag ctggacaagt    24900

acttcaaaaa tcatacatca ccagatgttg atcttggcga catttcaggc attaacgctt    24960

ctgtcgtcaa cattcaaaaa gaaattgacc gcctcaatga ggtcgctaaa aatttaaatg    25020

aatcactcat tgaccttcaa gaattgggaa aatatgagca atatattaaa tggccttggt    25080

atgtttggct cggcttcatt gctggactaa ttgccatcgt catggttaca atcttgcttt    25140

gttgcatgac tagttgttgc agttgcctca agggtgcatg ctcttgtggt tcttgctgca    25200

agtttgatga ggatgactct gagccagttc tcaagggtgt caaattacat tacacataaa    25260

cgaacttatg gatttgttta tgagattttt tactcttgga tcaattactg cacagccagt    25320

aaaaattgac aatgcttctc ctgcaagtac tgttcatgct acagcaacga taccgctaca    25380

agcctcactc cctttcggat ggcttgttat tggcgttgca tttcttgctg tttttcagag    25440

cgctaccaaa ataattgcgc tcaataaaag atggcagcta gccctttata agggcttcca    25500

gttcatttgc aatttactgc agctatttgt taccatctat tcacatcttt tgcttgtcgc    25560

tgcaggtatg gaggcgcaat ttttgtacct ctatgccttg atatattttc tacaatgcat    25620

caacgcatgt agaattatta tgagatgttg gctttgttgg aagtgcaaat ccaagaaccc    25680

attactttat gatgccaact actttgtttg ctggcacaca cataactatg actactgtat    25740

accatataac agtgtcacag atacaattgt cgttactgaa ggtgacggca tttcaacacc    25800

aaaactcaaa gaagactacc aaattggtgg ttattctgag gataggcact caggtgttaa    25860

agactatgtc gttgtacatg gctatttcac cgaagtttac taccagcttg agtctacaca    25920

aattactaca gacactggta ttgaaaatgc tacattcttc atctttaaca agcttgttaa    25980

agacccaccg aatgtgcaaa tacacacaat cgacggctct tcaggagttg ctaatccagc    26040

aatggatcca atttatgatg agccgacgac gactactagc gtgcctttgt aagcacaaga    26100

aagtgagtac gaacttatgt actcattcgt ttcggaagaa acaggtacgt taatagttaa    26160

tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt attcttgcta gtcacactag ccatccttac    26220

                                        WWBWOR~1.TXT

tgcgcttcga ttgtgtgcgt actgctgcaa tattgttaac gtgagtttag taaaaccaac    26280

ggtttacgtc tactcgcgtg ttaaaaatct gaactcttct gaaggagttc ctgatcttct    26340

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gtaataggtt tcctattcct agcctggatt atgttactac aatttgccta ttctaatcgg    26520

aacaggtttt tgtacataat aaagcttgtt ttcctctggc tcttgtggcc agtaacactt    26580

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gcaatggctt gtattgtagg cttgatgtgg cttagctact tcgttgcttc cttcaggctg    26700

tttgctcgta cccgctcaat gtggtcattc aacccagaaa caaacattct tctcaatgtg    26760

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aactataaat taaatacaga ccacgccggt agcaacgaca atattgcttt gctagtacag    27060

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tatcattatg aggactttca ggattgctat ttggaatctt gacgttataa taagttcaat    27180

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acctatggag ttagattatc cataaaacga acatgaaaat tattctcttc ctgacattga    27300

ttgtatttac atcttgcgag ctatatcact atcaggagtg tgttagaggt acgactgtac    27360

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ctgacaataa atttgcacta acttgcacta gcacacactt tgcttttgct tgtgctgacg    27480

gtactcgaca tacctatcag ctgcgtgcaa gatcagtttc accaaaactt ttcatcagac    27540

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ttttaatact ttgcttcacc attaagagaa agacagaatg aatgagctca ctttaattga    27660

cttctatttg tgctttttag cctttctgct attccttgtt ttaataatgc ttattatatt    27720

ttggttttca ctcgaaatcc aggatctaga agaaccttgt accaaagtct aaacgaacat    27780

gaaacttctc attgttttga cttgtatttc tctatgcagt tgcatacgca ctgtagtaca    27840

gcgctgtgca tctaataaac ctcatgtgct tgaagatcct tgtaaggtac aacactaggg    27900

gtaatactta tagcactgct tggctttgtg ctctaggaaa ggttttacct tttcatagat    27960

ggcacactat ggttcaaaca tgcacaccta atgttactat caactgtcaa gatccagctg    28020

gtggtgcgct tatagctagg tgttggtacc ttcatgaagg tcaccaaact gctgcattta    28080

gagacgtact tgttgtttta aataaacgaa caaattaaaa tgtctgataa tggaccccaa    28140

                                        WWBWOR~1.TXT

tcaaaccaac gtagtgcccc ccgcattaca tttggtggac ccacagattc aactgacaat    28200

aaccagaatg gaggacgcaa tggggcaagg ccaaaacagc gccgacccca aggtttaccc    28260

aataatactg cgtcttggtt cacagctctc actcagcatg gcaaggagga acttagattc    28320

cctcgaggcc agggcgttcc aatcaacacc aatagtggtc cagatgacca aattggctac    28380

taccgaagag ctacccgacg agttcgtggt ggtgacggca aaatgaaaga gctcagcccc    28440

agatggtact tctattacct aggaactggc ccagaagctt cacttcccta cggcgctaac    28500

aaagaaggca tcgtatgggt tgcaactgag ggagccttga atacacccaa agaccacatt    28560

ggcacccgca atcctaataa caatgctgcc accgtgctac aacttcctca aggaacaaca    28620

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tcatcacgta gtcgcggtaa ttcaagaaat tcaactcctg gcagcagtag gggaaattct    28740

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actaagaaat ctgctgctga ggcatctaaa aagcctcgcc aaaaacgtac tgccacaaaa    28920

cagtacaacg tcactcaagc atttgggaga cgtggtccag aacaaaccca aggaaatttc    28980

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tcgggaacat ggctgactta tcatggagcc attaaattgg atgacaaaga tccacaattc    29160

aaagacaacg tcatactgct gaacaagcac attgacgcat acaaaacatt cccaccaaca    29220

gagcctaaaa aggacaaaaa gaaaaagact gatgaagctc agcctttgcc gcagagacaa    29280

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cttcaaaatt ccatgagtgg agcttctgct gattcaactc aggcataaac actcatgatg    29400

accacacaag gcagatgggc tatgtaaacg ttttcgcaat tccgtttacg atacatagtc    29460

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atctcacata gcaatcttta atcaatgtgt aacattaggg aggacttgaa agagccacca    29580

cattttcatc gaggccacgc ggagtacgat cgagggtaca gtgaataatg ctagggagag    29640

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attttaatag cttcttagga gaatcacaaa aaaaaaaaaa                          29740

<212>Type：DNA

<211>Length：29740

     SequenceName：冠状病毒

     SequenceDescription：

Custom Codon

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Sequence Name：冠状病毒

Claims (9)

1.一种免疫预防滴鼻制剂，其特征是含灭活新型冠状病毒和药用敷剂。

2.根据权利要求1所述的免疫预防滴鼻制剂，其特征是所述新型冠状病毒具有序列1的结构。

3.一种权利要求1和2的免疫预防滴鼻制剂的制备方法，包括下述步骤和方法，

1)分离与鉴定新型冠状病毒，

2)病毒株滴定，

3)甲醛灭活接种细胞上清液中病毒，

4)灭活病毒制剂细胞传代，证实无活病毒存在，

5)纯化灭活后病毒悬液，

6)收集纯化灭活病毒，测定病毒RNA拷贝数，确定病毒含量。

7)以抗体阳性血清间接免疫荧光抗体染色病毒感染细胞，证实灭活后病毒抗原性。

8)灭活病毒干扰试验测定其对活病毒感染力的抑制作用。

4.根据权利要求3的方法，其中新型冠状病毒为GHGZ毒株。

5.根据权利要求3的方法，其中甲醛灭活上清中病毒的终浓度为0.025％、0.25％及2.5％。

6.根据权利要求3的方法，其中甲醛灭活冠状病毒的终浓度为0.025％。

7.根据权利要求3的方法，其中用免疫荧光法鉴定灭活新冠状病毒滴鼻剂的抗原性及毒株与不同地区间抗血清交叉的技术。

8.灭活新型冠状病毒在制备免疫预防滴鼻药物制剂中的应用

9.灭活新型冠状病毒在制备免疫预防呼吸道传播病毒滴鼻药物制剂中的应用。

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