CN1212397C - 筛选抗SARS冠状病毒药物用非感染性病毒重组基因SARS－CoV－EGFP - Google Patents
筛选抗SARS冠状病毒药物用非感染性病毒重组基因SARS－CoV－EGFP Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，是一种可用于筛选抗SARS冠状病毒药物及病毒学基础研究的非感染性病毒重组基因SARS-CoV-EGFP。本发明在SARS冠状病毒全基因组的5’端引入启动子序列T7 Pro，将S蛋白中与病毒致病性和毒力有关的外部结构域的编码序列用编码增强型绿色荧光蛋白的EGFP基因取代，全基因组的3’端依次引入HDV反义基因组核酶序列HDV R2、T7转录终止子序列T7 Ter，建成重组基因SARS-CoV-EGFP，将其插入载体构建成重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP，转染细胞后，经复制、转录、翻译、加工、包装成的重组病毒能使被转染的细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。若在转染的同时加入抗病毒药物，就可根据荧光的有无、强弱，判断药物的作用效果，因而可用于筛选抗SARS冠状病毒的药物。
Description
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种可用于筛选抗SARS冠状病毒药物及病毒学基础研究的非感染性病毒重组基因SARS-CoV-EGFP。
背景技术：
严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的病原体是新分离出来的一种冠状病毒——SARS冠状病毒(SARS coronavirus，SARS-CoV)，其传染性极强，危害性很大。许多涉及抗病毒药物的筛选和病毒学基础研究的实验均要求在BSL3级实验室完成。但由于BSL3级实验室造价及维持费用高昂、防护要求严格、人员准入受限，我国目前这类实验室数量有限，这给大规模药物筛选及病毒学基础研究工作带来极大的不便，限制了许多实验的开展。
众所周知，正链RNA病毒复制形式为RNA-RNA，不形成DNA的中间体，所以无法直接进行基因组操作。如果采用感染性克隆技术将RNA逆转录成cDNA，并进行克隆，cDNA克隆转染细胞后，通过诱导转录成为相应的病毒RNA，并重新获得病毒，这样通过cDNA一环节，就可以对RNA病毒在基因水平上进行操作。该技术已经应用于RNA病毒的复制、表达、致病机制的理论研究以及应用于研制新型疫苗、新型病毒载体、药物筛选等。
表达噬菌体T7 RNA聚合酶的复制缺陷型重组腺病毒，已经成功地应用于诱导感染性克隆pHCV-GFP质粒表达重组丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)。其具体做法是：将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因插入到HCV编码核心蛋白的C基因中，构建成HCV-GFP，然后在HCV-GFP基因组3’端依次连接丁型肝炎病毒(Hepatitis delta virus，HDV)反义基因组核酶碱基序列和T7末端终止序列，再将重组的全长基因组cDNA克隆到原核表达载体pUC19-T7pro的T7启动子的下游，构建成pHCV-GFP质粒。使用时，先将表达噬菌体T7 RNA聚合酶的复制缺陷型重组腺病毒感染肝癌Huh7细胞，2小时后，将pHCV-GFP质粒经脂质体介导转染该Huh7细胞，在细胞内，复制缺陷型重组腺病毒表达的T7 RNA聚合酶诱导pHCV-GFP的T7启动子开始转录，由于T7 RNA聚合酶只识别T7末端终止序列而到此终止转录，继而在HDV反义基因组核酶催化下自身切割为HCV-GFP RNA，该RNA含有重组病毒复制装配所需要的一切信息，可在细胞中自行进一步复制、转录、翻译、加工，包装成使细胞在荧光镜下发绿色荧光的重组HCV-GFP病毒。若在转染pHCV-GFP质粒的同时加入不同浓度的抗病毒药物，如干扰素，若药物有效，则在荧光镜下荧光强度减弱或不发荧光(Qi ZT et al.Arch Virol，2003；148：449-467)；若药物无效，则药物作用细胞的荧光强度同未受药物作用细胞的荧光强度。这样就可根据重组病毒感染细胞所发荧光的强弱很方便地对抗病毒药物进行筛选。
发明内容：
本发明根据重组丙型肝炎病毒HCV-GFP筛选抗病毒药物的原理，提供一种用于筛选抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)药物或病毒学基础研究的非感染性重组病毒SARS-CoV-EGFP。由于它的非感染性，因此不必在BSL3级实验室展开工作，这就为抗SARS-CoV病毒药物筛选或病毒学基础研究带来极大的方便。
本发明是对SARS-CoV全基因组的一种改造。已知的SARS-CoV TOR2(GENEBANK number：AY274119)、CUHK-W1(GENEBANK number：AY278554)、HKU-39849(GENEBANK number：AY278491)、BJ01(GENEBANK number：AY278488)、BJ02(GENEBANK number：AY278487)、BJ03(GENEBANK number：AY278490)、BJ04(GENEBANK number：AY279354)、GZ01(GENEBANK number：AY278489)等株其基因组具有极高的同源性。它们的组织结构为5′-病毒酶(POL)-刺突糖蛋白(S)-包膜蛋白(E)-基质膜蛋白(M)-核衣壳蛋白(N)-polyA尾-3′。其中S蛋白突出于病毒包膜表面形成刺突，可特异性地与宿主细胞受体结合，使细胞和病毒发生膜融合，从而造成感染。S蛋白中氨基酸残基的改变能显著影响病毒的毒力和病毒对宿主细胞的亲嗜性。因此对S蛋白基因进行改造，构建重组非感染性SARS-CoV cDNA克隆，可以得到没有感染性而有复制装配特性(诱导产生)的重组病毒，这样，在非BSL3级实验室就能开展SARS冠状病毒的研究和药物筛选。
SARS-CoV的S蛋白全长为1255个氨基酸残基，与病毒的致病性和毒力有关的外部结构域位于第20-1195位氨基酸残基，本发明将这段编码序列用增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluoresent protein，EGFP)基因置换。同时在SARS-CoV全基因组的5’-端引入T7启动子序列(T7 Pro)，在全基因组的3’-端依次引入丁型肝炎病毒反义基因组核酶序列(HDV Rz)、T7转录终止子序列(T7 Ter)。改造后的重组基因SARS-CoV-EGFP的组织结构为：5’-T7 Pro-POL-EGFPS-E-M-N-polyA尾-HDV Rz-T7 Ter-3’。将此重组基因克隆于pUC19载体的多克隆位点中，构建成重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP。
使用时，先用携带T7 RNA聚合酶基因的复制缺陷型重组腺病毒感染Vero细胞，2小时后将非感染性重组病毒SARS-CoV-EGFP的重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP经脂质体介导转染该细胞，在细胞内，复制缺陷型重组腺病毒表达的T7 RNA聚合酶诱导T7启动子进行转录，由于T7 RNA聚合酶只识别T7末端终止序列，因此，在此之前的基因都可以被转录，并在丁型肝炎病毒反义基因组核酶催化下自身切割为SARS-CoV-EGFP RNA，该RNA含有重组病毒复制装配所需要的一切信息，可在细胞中自行进一步复制、转录、翻译、加工、包装成重组SARS-CoV-EGFP病毒，所产生的病毒能使被转染的细胞在荧光镜下发出绿色荧光。若在转染时，同时加入药物，就可根据荧光的有无、强弱，判断药物的作用效果。
本发明重组基因SARS-CoV-EGFP经诱导表达装配的重组病毒既无感染性，又能有示踪作用，故可在普通实验室进行抗SARS-CoV药物筛选和病毒学基础研究，给工作带来极大的方便。
本发明非感染性重组病毒SARS-CoV-EGFP的制备方法如下：
一、材料
pCA13、pJM17载体和293A细胞株购于美国Microbix公司。含有全长T7 RNA聚合酶基因的复制缺陷型重组腺病毒AdexCAT7由日本Miyamura博士赠送。pUC19载体购于晶美生物公司。pMD-18T载体购于大连TAKARA公司。SARS-CoV TOR2全基因序列克隆由加拿大国家微生物学实验室赠送。EGFP
S基因的、SARS Ter-HDV Rz-T7 Ter基因以及引物为上海生工公司合成，其中EGFP
S基因已经生工公司插入到pMD18-T载体中，成为质粒pMD/EGFP
S；SARS Ter-HDVRz-T7 Ter基因已经生工公司插入到pMD18-T载体中，成为质粒质粒pMD/HT。工具酶等购自美国Biolabs公司。DMEM细胞培养基、Lipofectamine购自GIBCO公司。大肠杆菌DH5α购于上海申能博彩公司。Vero细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所。胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购于美国QIAGEN公司。
二、非感染性重组病毒SARS-CoV-EGFP重组质粒的构建
SARS-CoV TOR2全基因组序列为29751bp，为便于对基因组进行改造，需要将其进行适当的酶切分段，弃去含S蛋白外部结构域的基因片段，代之以人工合成的EGFP
S基因；同时在基因组5’端酶切片段的5’端，用PCR方法引入T7启动子(T7 Pro)；弃去基因组3’端的部分序列，代之以人工合成的SARS Ter-HDV Rz-T7 Ter基因，最后将各片段按5’-T7Pro-POL-EGFP
S-E-M-N-polyA尾-HDV Rz-T7 Ter-3’的顺序依次连接起来克隆到pUC19载体的多克隆位点中，构建成重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP。
1.SARS-CoV TOR2全基因组的酶切分段：
SARS-CoV TOR2全基因组序列先用BamH I消化，分别回收26044bp(为基因组的5’端片段)和3707bp(为基因组的3’端片段，由编码E、M、N及其他功能未知蛋白的序列和polyA尾组成)两个片段。26044bp片段再用Cla I消化，分别回收677bp(为基因组的5’端片段，编码部分POL，此段用于引入T7 Pro)和25367bp(Cla I/BamH I，该片段编码部分POL、完整的S蛋白和其他功能未知蛋白)两个片段。
2.在SARS-CoV TOR2基因组的5’端引入T7启动子(T7 Pro)：
上述677bp片段用引物1(5’-gcgaattcgcggccgctaatacgactcactatagggatattaggtttttacctacc-3’)和引物2(5’-gcatcgatgccatagctatgaccacc-3’)进行PCR扩增引入T7启动子序列。扩增产物用T4 DNA连接酶直接克隆于pMD-18T载体，得到重组质粒pMD-T7，测序鉴定插入片段与设计完全一致。用EcoR I和Cla I消化pMD-T7，回收引入了T7启动子的703bp(EcoR I/Cla I)的片段。片段序列为：5’-gc
atattaggtttttacctacccaggaaaagccaaccaacctcgatctcttgtagatctgttctctaaacgaactttaaaatctgtgtagctgtcgctcggctgcatgcctagtgcacctacgcagtataaacaataataaattttactgtcgttgacaagaaacgagtaactcgtccctcttctgcagactgcttacggtttcgtccgtgttgcagtcgatcatcagcatacctaggtttcgtccgggtgtgaccgaaaggtaagatggagagccttgttcttggtgtcaacgagaaaacacacgtccaactcagtttgcctgtccttcaggttagagacgtgctagtgcgtggcttcggggactctgtggaagaggccctatcggaggcacgtgaacacctcaaaaatggcacttgtggtctagtagagctggaaaaaggcgtactgccccagcttgaacagccctatgtgttcattaaacgttctgatgccttaagcaccaatcacggccacaaggtcgttgagctggttgcagaaatggacggcattcagtacggtcgtagcggtataacactgggagtactcgtgccacatgtgggcgaaaccccaattgcataccgcaatgttcttcttcgtaagaacggtaataagggagccggtggtcatagctatggc
-3’
其中，下加单划线的序列为T7启动子序列，共20bp；5’末端的
为EcoR I酶切位点，
为Not I酶切位点；3’末端的
为Cla I酶切位点
3.将25367bp片段(Cla I/BamH I，该片段编码部分POL、完整的S蛋白和其他功能未知蛋白)用Age I消化，回收20844bp片段(Cla I/Age I，该片段编码部分POL及S蛋白的第1-19位氨基酸残基)。弃去4523bp片段，该片段含S蛋白中与病毒的致病性和毒力有关的外部结构域——第20-1195位氨基酸残基的编码序列S蛋白外部结构域的编码序列，用人工合成的EGFP
S基因取代。
EGFP
S基因序列为：5’-gc
gc
tatgtttggctcggcttcattgctggactaattgccatcgtcatggttacaatcttgctttgttgcatgactagttgttgcagttgcctcaagggtgcatgctcttgtggttcttgctgcaagtttgatgaggatgactctgagccagttctcaagggtgtcaaattacattacacataaacgaacttatggatttgtttatgagattttttactcttagatcaattactgcacagccagtaaaaattgacaatgcttctcctgcaagtactgttcatgctacagcaacgataccgctacaagcctcactccctttcggatggcttgttattggcgttgcatttcttgctgtttttcagagcgctaccaaaataattgcgctcaataaaagatggcagctagccctttataagggcttccagttcatttgcaatttactgctgctatttgttaccatctattcacatcttttgcttgtcgctgcaggtatggaggcgcaatttttgtacctctatgccttgatatattttctacaatgcatcaacgcatgtagaattattatgagatgttggctttgttggaagtgcaaatccaagaacccattactttatgatgccaactactttgtttgctggcacacacataactatgactactgtataccatataacagtgtcacagatacaattgtcgttactgaaggtgacggcatttcaacaccaaaactcaaagaagactaccaaattggtggttattctgaggataggcactcaggtgttaaagactatgtcgttgtacatggctatttcaccgaagtttactaccagcttgagtctacacaaattactacagacactggtattgaaaatgctacattcttcatctttaacaagcttgttaaagacccaccgaatgtgcaaatacacacaatcgacggctcttcaggagttgctaatccagcaat
gc-3’。
该合成基因的设计主要兼顾SARS-CoV TOR2原有的限制性酶切位点，其中5’端的
为Age I酶切位点，3’端的
为BamH I酶切位点。下加双划线的序列为EGFP序列。虽然SARS-CoV TOR2的S基因止于原基因的25259nt处，但由于此处没有合适的酶切位点，故适当延长到原序列固有的BamH I酶切位点处。将携带合成的EGFP
S基因的质粒pMD/EGFP
S用AgeI和BamH I消化，回收1683bp(Age I/BamH I)的EGFP
S基因片段。
4.将3707bp片段(为基因组的3’端片段，由编码E、M、N及其他功能未知蛋白的序列和polyA尾组成)用Pvu I消化，回收3566bp片段(BamH I/Pvu I，编码E、M、N及其他功能未知蛋白的序列)。弃去3’端的141bp片段(主要为SARS-CoV TOR2全基因组的polyA尾)用人工合成的SARS Ter-HDV Rz-T7 Ter基因取代。
SARS Ter-HDV Rz-T7 Ter基因序列为：5’-gc
agggtacagtgaataatgctagggagagctgcctatatggaagagccctaatgtgtaaaattaattttagtagtgctatccccatgtgattttaatagcttcttaggagaatgacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
该合成基因的设计也主要兼顾SARS-CoV TOR2全基因组序列固有的限制性酶切位点，其中5’端
为Pvu I酶切位点；3’端
为Not I酶切位点，
为Xba I酶切位点。下加虚划线的序列为HDV Rz序列，下加波纹划线的序列为T7 Ter序列。将携带SARS Ter-HDVRz-T7 Ter基因的质粒pMD/HT用Pvu I和Xba I消化，回收383bp(Pvu I/Xba I)的SARS Ter-HDVRz-T7 Ter基因片段。
5.拼接SARS-CoV-EGFP序列并插入pUC19载体
将pUC19载体用EcoR I和Xba I消化，并回收线性化的pUC19载体，与上述703bp(EcoR I/Cla I)片段、20864bp(Cla I/Age I)片段、1683bp(Age I/BamH I)片段、3566bp(BamHI/Pvu I)片段和383bp(Pvu I/Xba I)片段混合，在T4 DNA连接酶作用下连接，转化大肠杆菌，经质粒抽提、Not I酶切和测序鉴定，得到阳性重组质粒为pUC19/SARS-CoV-EGFP。SARS-CoV-EGFP的核苷酸序列祥见表1，其中下加单划线的序列为T7启动子序列，下加双划线的序列为EGFP序列，下加虚划线的序列为HDV反义基因组核酶序列，下加波纹划线的序列为T7终止子序列。
三、SARS-CoV-EGFP非感染性病毒的检测
先用携带T7 RNA聚合酶基因的复制缺陷型重组腺病毒感染Vero细胞，再用非感染性病毒SARS-CoV-EGFP的重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP经脂质体介导转染该细胞，非感染性病毒表达的荧光蛋白可使转染细胞在荧光镜下呈现绿色荧光。若在转染时，同时加入药物，就可根据荧光的有无、强弱，判断药物的作用效果。
附图说明：
附图1为本发明重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP构建流程示意图。
附图2为本发明重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP的结构模式图
具体实施方式：
一、重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP的构建
1.SARS-CoV TOR2全基因组的酶切分段：
SARS-CoV TOR2全基因组DNA先用BamH I消化，反应条件为：6μl全基因组(1μg/μl)，5μl 10×缓冲液[150mmol氯化钠，10mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.9)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，1μl BamH I(10个单位/μl)，补无菌水至50μl，37℃水浴消化4小时。用0.6％的低熔点琼脂糖电泳分离DNA片段，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒分别纯化回收26044bp和3707bp两个DNA片段。
26044bp片段再用Cla I消化，反应体系为：3μl 26044bp片段(800ng/μl)，3μl 10×缓冲液[50mmol醋酸钾，20mmol三(羟甲基)氨基甲烷·醋酸(pH7.9)，10mmol醋酸镁，1mmol二硫苏糖醇]，1μl Cla I(5个单位/μl)，补无菌水至30μl，37℃水浴消化4小时。用0.6％的低熔点琼脂糖电泳分离DNA片段，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒分别回收677bp和25367bp(Cla I/BamH I)两个DNA片段。
2.在SARS-CoV TOR2基因组的5’端引入T7启动子(T7 Pro)：
677bp片段用引物1(5’-gcgaattcgcggccgctaatacgactcactatagggatattaggtttttacctacc-3’)和引物2(5’-gcatcgatgccatagctatgaccacc-3’)进行PCR扩增引入T7启动子序列。PCR反应体系为：5μl 10×PCR反应缓冲液[500mmol氯化钾，100mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH8.3)，15mmol氯化镁]，677bp片段10ng，引物1和引物2各100nmol，4μl dNTP(各2.5mmol)，1μl Taq酶(2个单位/μl)，补无菌水至50μl。扩增条件为：预变性94℃ 4分钟；94℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；72℃ 10分钟。
PCR扩增产物用QIAGEN公司的PCR产物回收试剂盒纯化，与pMD-18T载体连接，连接条件为：5μl纯化的PCR产物(20ng/μl)，1μl pMD-18T载体(50ng/μl)，1μl 10×缓冲液[10mmol氯化镁，10mmol二硫苏糖醇，50mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.5)，1mmol ATP]，1μlT4 DNA连接酶(20个单位/μl)，补无菌水至10μl，16℃水浴连接过夜。将连接反应液与100μl DH5α感受态菌液(OD600＝0.2)混合，冰浴30分钟，42℃ 90秒，冰浴2分钟，加入900μlLB培养基(1.0％胰蛋白胨，0.5％酵母膏，1.0％氯化钠)，37℃ 150转/分钟活化培养45分钟，取100μl培养菌液涂布含100ng/μl氨苄青霉素的LB平皿，37℃培养过夜。
从平皿上挑取6个转化子，培养后用QIAGEN公司的质粒抽提试剂盒提取转化子质粒。用EcoR I和Cla I消化鉴定，反应条件为：10μl质粒(100ng/μl)，2μl 10×缓冲液[50mmol醋酸钾，20mmol三(羟甲基)氨基甲烷·醋酸(pH7.9)，10mmol醋酸镁，1mmol二硫苏糖醇]，0.4μl Cla I(5个单位/μl)，0.2μl EcoR I(10个单位/μl)，补无菌水至20μl。37℃水浴消化4小时。经1％琼脂糖电泳分离，含703bp插入片段的为重组质粒pMD-T7。
对该阳性克隆进行正向和反向序列测定。序列符合设计要求。再用EcoR I和Cla I消化重组质粒pMD-T7，反应条件为：10μl质粒(300ng/μl)，3μl 10×缓冲液[50mmol醋酸钾，20mmol三(羟甲基)氨基甲烷·醋酸(pH7.9)，10mmol醋酸镁，1mmol二硫苏糖醇]，1μl ClaI(5个单位/μl)，1μl EcoR I(10个单位/μl)，补无菌水至50μl，37℃水浴消化4小时。经1％低熔点琼脂糖电泳分离，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒回收703bp片段(EcoR I/Cla I)。
3.将25367bp片段(Cla I/BamH I)用Age I消化，反应条件为：3μl 25367bp片段(500ng/μl)，3μl 10×缓冲液[10mmol双-三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.0)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，1μl Age I(2个单位/μl)，补无菌水至30μl，37℃水浴消化4小时。经0.6％的低熔点琼脂糖电泳分离，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒回收20844bp(Cla I/Age I)片段。
4.质粒pMD-EGFPΔS含生工公司合成EGFPΔS基因，用Age I和BamH I消化，反应体系为：10μl质粒(300ng/μl)，3μl 10×缓冲液[150mmol氯化钠，10mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.9)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，1.5μl Age I(2个单位/μl)，1μl BamH I(10个单位/μl)，补无菌水至50μl，37℃水浴消化4小时。经1％低熔点琼脂糖电泳分离，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒回收1683bp(Age I/BamH I)片段。
5.质粒pMD-HT携带生工公司合成HDV Rz-T7 Ter基因，用Pvu I和Xba I消化，反应体系为：10μl质粒(300ng/μl)，3μl 10×缓冲液[50mmol氯化钠，10mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.9)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，1μl Pvu I(5个单位/μl)，1μl Xba I(20个单位/μl)，补无菌水至50μl，37℃水浴消化4小时。经1.5％低熔点琼脂糖电泳分离，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒回收383bp(Pvu I/Xba I)片段。
6.将pUC19载体用EcoR I和Xba I消化，反应体系为：2μl质粒(800ng/μl)，2μl 10×缓冲液[50mmol氯化钠，10mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.9)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，0.5μl EcoR I(10个单位/μl)，0.5μl Xba I(20个单位/μl)，补无菌水至20μl，37℃水浴消化4小时。经0.7％低熔点琼脂糖电泳分离消化片段，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒回收线性化片段。
7.拼接SARS-CoV-EGFP序列并插入pUC19载体
在T4 DNA连接酶作用下，经EcoR I/Xba I酶切线性化的pUC19载体与703bp(EcoR I/ClaI)片段、20844bp(Cla I/Age I)片段、1683bp(Age I/BamH I)片段、3566bp(BamH I/Pvu I)片段和383bp(Pvu I/Xba I)片段连接。连接反应条件为：2μl线性化pUC19载体(50ng/μl)，1μl其他各片段(100ng/μl/每种片段)，1μl 10×缓冲液[10mmol氯化镁，10mmol二硫苏糖醇，50mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.5)，1mmol ATP]，1μl T4 DNA连接酶(20个单位/μl)，补无菌水至20μl，16℃连接过夜。将连接反应液与100μlDH5α感受态菌液(OD600＝0.2)混合，冰浴30分钟，42℃ 90秒，冰浴2分钟，加入900μl LB培养基，37℃ 50转/分钟活化培养45分钟，取100μl培养菌液涂布含100ng/μl氨苄青霉素的LB平皿，37℃培养过夜，挑取6个转化子，培养后用QIAGEN公司的小量质粒抽提试剂盒提取转化子质粒，用Not I酶切鉴定，反应条件为：10μl质粒(100ng/μl)，2μl 10×缓冲液[100mmol氯化钠，50mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.9)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，0.2μl NotI(10个单位/μl)，补无菌水至20μl，37℃水浴消化4小时。经0.6％琼脂糖电泳分离，含27096bp插入片段的为阳性克隆pUC19/SARS-CoV-EGFP。阳性克隆经正向和反向序列测定，序列正确的为非感染性病毒SARS-CoV-EGFP的重组质粒，称为pUC19/SARS-CoV-EGFP。
二、SARS-CoV-EGFP非感染性病毒的检测
在直径100mm的细胞培养皿中接种2×106个Vero细胞，细胞培养20小时后换500μl完全培养液(1.34％DMEM，2mmol L-谷氨酰胺，10％胎牛血清，用7.5％的碳酸氢钠调pH至7.0)，加入1μl感染复数(MOI)为10的AdexCAT7，置37℃ 5％CO2培养箱感染2小时后，6μl脂质体Lipofectamine介导转染10μg非感染性重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP，24小时后，用荧光镜观察细胞呈现绿色荧光，说明在细胞内复制缺陷型重组腺病毒表达的T7 RNA聚合酶诱导T7启动子开始转录，并经一系列病毒自身的复制、转录、翻译、加工，最终包装成非感染性重组病毒SARS-CoV-EGFP。
三、用非感染性病毒SARS-CoV-EGFP检测药物的抗病毒作用
用Megagene公司的人IFN-α对该系统进行药物检测评估：在3个直径100mm的细胞培养皿中分别接种2×106个Vero细胞，细胞培养20小时后换500μl完全培养液(1.34％DMEM，2mmol L-谷氨酰胺，10％胎牛血清，用7.5％的碳酸氢钠调pH至7.0)，分别加入1μl感染复数(MOI)为10的AdexCAT7，置37℃ 5％CO2培养箱感染2小时后，6μl脂质体Lipofectamine介导转染10μg非感染性重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP，同时在1个培养皿中加入10个单位的人IFN-α；另1个培养皿中加入1个单位的人IFN-α；还有1个培养皿不加人IFN-α，作对照。置37℃ 5％CO2培养箱继续培养24小时。结果表明，加入10个单位的人IFN-α，24小时后无绿色荧光出现；加入1个单位的人IFN-α，荧光强度弱于未加人IFN-α的对照组。该结果说明一定浓度的人IFN-α能够有效地抑制SARS-CoV-EGFP非感染性病毒的产生，具有潜在的抗SARS-CoV的药用价值。
表1。重组基因SARS-CoV-EGFP核苷酸序列表
1 atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt
61 ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac
121 gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct
181 tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc
241 gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca
301 cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg
361 gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt
421 ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa
481 cgttctgatg ccttaagcac caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg
541 gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc
601 gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggt
Cla I
661 ggtcatagct atggc
ctaaagtct tatgacttag gtgacgagct tggcactgat
721 cccattgaag attatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc actccgtgaa
781 ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc
841 ccagatgggt accctcttga ttgcatcaaa gattttctcg cacgcgcggg caagtcaatg
901 tgcactcttt ccgaacaact tgattacatc gagtcgaaga gaggtgtcta ctgctgccgt
961 gaccatgagc atgaaattgc ctggttcact gagcgctctg ataagagcta cgagcaccag
1021 acacccttcg aaattaagag tgccaagaaa tttgacactt tcaaagggga atgcccaaag
1081 tttgtgtttc ctcttaactc aaaagtcaaa gtcattcaac cacgtgttga aaagaaaaag
1141 actgagggtt tcatggggcg tatacgctct gtgtaccctg ttgcatctcc acaggagtgt
1201 aacaatatgc acttgtctac cttgatgaaa tgtaatcatt gcgatgaagt ttcatggcag
1261 acgtgcgact ttctgaaagc cacttgtgaa cattgtggca ctgaaaattt agttattgaa
1321 ggacctacta catgtgggta cctacctact aatgctgtag tgaaaatgcc atgtcctgcc
1381 tgtcaagacc cagagattgg acctgagcat agtgttgcag attatcacaa ccactcaaac
1441 attgaaactc gactccgcaa gggaggtagg actagatgtt ttggaggctg tgtgtttgcc
1501 tatgttggct gctataataa gcgtgcctac tgggttcctc gtgctagtgc tgatattggc
1561 tcaggccata ctggcattac tggtgacaat gtggagacct tgaatgagga tctccttgag
1621 atactgagtc gtgaacgtgt taacattaac attgttggcg attttcattt gaatgaagag
1681 gttgccatca ttttggcatc tttctctgct tctacaagtg cctttattga cactataaag
1741 agtcttgatt acaagtcttt caaaaccatt gttgagtcct gcggtaacta taaagttacc
1801 aagggaaagc ccgtaaaagg tgcttggaac attggacaac agagatcagt tttaacacca
1861 ctgtgtggtt ttccctcaca ggctgctggt gttatcagat caatttttgc gcgcacactt
1921 gatgcagcaa accactcaat tcctgatttg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt
1981 atttctgaac agtcattacg tcttgtcgac gccatggttt atacttcaga cctgctcacc
2041 aacagtgtca ttattatggc atatgtaact ggtggtcttg tacaacagac ttctcagtgg
2101 ttgtctaatc ttttgggcac tactgttgaa aaactcaggc ctatctttga atggattgag
2161 gcgaaactta gtgcaggagt tgaatttctc aaggatgctt gggagattct caaatttctc
2221 attacaggtg tttttgacat cgtcaagggt caaatacagg ttgcttcaga taacatcaag
2281 gattgtgtaa aatgcttcat tgatgttgtt aacaaggcac tcgaaatgtg cattgatcaa
2341 gtcactatcg ctggcgcaaa gttgcgatca ctcaacttag gtgaagtctt catcgctcaa
2401 agcaagggac tttaccgtca gtgtatacgt ggcaaggagc agctgcaact actcatgcct
2461 cttaaggcac caaaagaagt aacctttctt gaaggtgatt cacatgacac agtacttacc
2521 tctgaggagg ttgttctcaa gaacggtgaa ctcgaagcac tcgagacgcc cgttgatagc
2581 ttcacaaatg gagctatcgt tggcacacca gtctgtgtaa atggcctcat gctcttagag
2641 attaaggaca aagaacaata ctgcgcattg tctcctggtt tactggctac aaacaatgtc
2701 tttcgcttaa aagggggtgc accaattaaa ggtgtaacct ttggagaaga tactgtttgg
2761 gaagttcaag gttacaagaa tgtgagaatc acatttgagc ttgatgaacg tgttgacaaa
2821 gtgcttaatg aaaagtgctc tgtctacact gttgaatccg gtaccgaagt tactgagttt
2881 gcatgtgttg tagcagaggc tgttgtgaag actttacaac cagtttctga tctccttacc
2941 aacatgggta ttgatcttga tgagtggagt gtagctacat tctacttatt tgatgatgct
3001 ggtgaagaaa acttttcatc acgtatgtat tgttcctttt accctccaga tgaggaagaa
3061 gaggacgatg cagagtgtga ggaagaagaa attgatgaaa cctgtgaaca tgagtacggt
3121 acagaggatg attatcaagg tctccctctg gaatttggtg cctcagctga aacagttcga
3181 gttgaggaag aagaagagga agactggctg gatgatacta ctgagcaatc agagattgag
3241 ccagaaccag aacctacacc tgaagaacca gttaatcagt ttactggtta tttaaaactt
3301 actgacaatg ttgccattaa atgtgttgac atcgttaagg aggcacaaag tgctaatcct
3361 atggtgattg taaatgctgc taacatacac ctgaaacatg gtggtggtgt agcaggtgca
3421 ctcaacaagg caaccaatgg tgccatgcaa aaggagagtg atgattacat taagctaaat
3481 ggccctctta cagtaggagg gtcttgtttg ctttctggac ataatcttgc taagaagtgt
3541 ctgcatgttg ttggacctaa cctaaatgca ggtgaggaca tccagcttct taaggcagca
3601 tatgaaaatt tcaattcaca ggacatctta cttgcaccat tgttgtcagc aggcatattt
3661 ggtgctaaac cacttcagtc tttacaagtg tgcgtgcaga cggttcgtac acaggtttat
3721 attgcagtca atgacaaagc tctttatgag caggttgtca tggattatct tgataacctg
3781 aagcctagag tggaagcacc taaacaagag gagccaccaa acacagaaga ttccaaaact
3841 gaggagaaat ctgtcgtaca gaagcctgtc gatgtgaagc caaaaattaa ggcctgcatt
3901 gatgaggtta ccacaacact ggaagaaact aagtttctta ccaataagtt actcttgttt
3961 gctgatatca atggtaagct ttaccatgat tctcagaaca tgcttagagg tgaagatatg
4021 tctttccttg agaaggatgc accttacatg gtaggtgatg ttatcactag tggtgatatc
4081 acttgtgttg taataccctc caaaaaggct ggtggcacta ctgagatgct ctcaagagct
4141 ttgaagaaag tgccagttga tgagtatata accacgtacc ctggacaagg atgtgctggt
4201 tatacacttg aggaagctaa gactgctctt aagaaatgca aatctgcatt ttatgtacta
4261 ccttcagaag cacctaatgc taaggaagag attctaggaa ctgtatcctg gaatttgaga
4321 gaaatgcttg ctcatgctga agagacaaga aaattaatgc ctatatgcat ggatgttaga
4381 gccataatgg caaccatcca acgtaagtat aaaggaatta aaattcaaga gggcatcgtt
4441 gactatggtg tccgattctt cttttatact agtaaagagc ctgtagcttc tattattacg
4501 aagctgaact ctctaaatga gccgcttgtc acaatgccaa ttggttatgt gacacatggt
4561 tttaatcttg aagaggctgc gcgctgtatg cgttctctta aagctcctgc cgtagtgtca
4621 gtatcatcac cagatgctgt tactacatat aatggatacc tcacttcgtc atcaaagaca
4681 tctgaggagc actttgtaga aacagtttct ttggctggct cttacagaga ttggtcctat
4741 tcaggacagc gtacagagtt aggtgttgaa tttcttaagc gtggtgacaa aattgtgtac
4801 cacactctgg agagccccgt cgagtttcat cttgacggtg aggttctttc acttgacaaa
4861 ctaaagagtc tcttatccct gcgggaggtt aagactataa aagtgttcac aactgtggac
4921 aacactaatc tccacacaca gcttgtggat atgtctatga catatggaca gcagtttggt
4981 ccaacatact tggatggtgc tgatgttaca aaaattaaac ctcatgtaaa tcatgagggt
5041 aagactttct ttgtactacc tagtgatgac acactacgta gtgaagcttt cgagtactac
5101 catactcttg atgagagttt tcttggtagg tacatgtctg ctttaaacca cacaaagaaa
5161 tggaaatttc ctcaagttgg tggtttaact tcaattaaat gggctgataa caattgttat
5221 ttgtctagtg ttttattagc acttcaacag cttgaagtca aattcaatgc accagcactt
5281 caagaggctt attatagagc ccgtgctggt gatgctgcta acttttgtgc actcatactc
5341 gcttacagta ataaaactgt tggcgagctt ggtgatgtca gagaaactat gacccatctt
5401 ctacagcatg ctaatttgga atctgcaaag cgagttctta atgtggtgtg taaacattgt
5461 ggtcagaaaa ctactacctt aacgggtgta gaagctgtga tgtatatggg tactctatct
5521 tatgataatc ttaagacagg tgtttccatt ccatgtgtgt gtggtcgtga tgctacacaa
5581 tatctagtac aacaagagtc ttcttttgtt atgatgtctg caccacctgc tgagtataaa
5641 ttacagcaag gtacattctt atgtgcgaat gagtacactg gtaactatca gtgtggtcat
5701 tacactcata taactgctaa ggagaccctc tatcgtattg acggagctca ccttacaaag
5761 atgtcagagt acaaaggacc agtgactgat gttttctaca aggaaacatc ttacactaca
5821 accatcaagc ctgtgtcgta taaactcgat ggagttactt acacagagat tgaaccaaaa
5881 ttggatgggt attataaaaa ggataatgct tactatacag agcagcctat agaccttgta
5941 ccaactcaac cattaccaaa tgcgagtttt gataatttca aactcacatg ttctaacaca
6001 aaatttgctg atgatttaaa tcaaatgaca ggcttcacaa agccagcttc acgagagcta
6061 tctgtcacat tcttcccaga cttgaatggc gatgtagtgg ctattgacta tagacactat
6121 tcagcgagtt tcaagaaagg tgctaaatta ctgcataagc caattgtttg gcacattaac
6181 caggctacaa ccaagacaac gttcaaacca aacacttggt gtttacgttg tctttggagt
6241 acaaagccag tagatacttc aaattcattt gaagttctgg cagtagaaga cacacaagga
6301 atggacaatc ttgcttgtga aagtcaacaa cccacctctg aagaagtagt ggaaaatcct
6361 accatacaga aggaagtcat agagtgtgac gtgaaaacta ccgaagttgt aggcaatgtc
6421 atacttaaac catcagatga aggtgttaaa gtaacacaag agttaggtca tgaggatctt
6481 atggctgctt atgtggaaaa cacaagcatt accattaaga aacctaatga gctttcacta
6541 gccttaggtt taaaaacaat tgccactcat ggtattgctg caattaatag tgttccttgg
6601 agtaaaattt tggcttatgt caaaccattc ttaggacaag cagcaattac aacatcaaat
6661 tgcgctaaga gattagcaca acgtgtgttt aacaattata tgccttatgt gtttacatta
6721 ttgttccaat tgtgtacttt tactaaaagt accaattcta gaattagagc ttcactacct
6781 acaactattg ctaaaaatag tgttaagagt gttgctaaat tatgtttgga tgccggcatt
6841 aattatgtga agtcacccaa attttctaaa ttgttcacaa tcgctatgtg gctattgttg
6901 ttaagtattt gcttaggttc tctaatctgt gtaactgctg cttttggtgt actcttatct
6961 aattttggtg ctccttctta ttgtaatggc gttagagaat tgtatcttaa ttcgtctaac
7021 gttactacta tggatttctg tgaaggttct tttccttgca gcatttgttt aagtggatta
7081 gactcccttg attcttatcc agctcttgaa accattcagg tgacgatttc atcgtacaag
7141 ctagacttga caattttagg tctggccgct gagtgggttt tggcatatat gttgttcaca
7201 aaattctttt atttattagg tctttcagct ataatgcagg tgttctttgg ctattttgct
7261 agtcatttca tcagcaattc ttggctcatg tggtttatca ttagtattgt acaaatggca
7321 cccgtttctg caatggttag gatgtacatc ttctttgctt ctttctacta catatggaag
7381 agctatgttc atatcatgga tggttgcacc tcttcgactt gcatgatgtg ctataagcgc
7441 aatcgtgcca cacgcgttga gtgtacaact attgttaatg gcatgaagag atctttctat
7501 gtctatgcaa atggaggccg tggcttctgc aagactcaca attggaattg tctcaattgt
7561 gacacatttt gcactggtag tacattcatt agtgatgaag ttgctcgtga tttgtcactc
7621 cagtttaaaa gaccaatcaa ccctactgac cagtcatcgt atattgttga tagtgttgct
7681 gtgaaaaatg gcgcgcttca cctctacttt gacaaggctg gtcaaaagac ctatgagaga
7741 catccgctct cccattttgt caatttagac aatttgagag ctaacaacac taaaggttca
7801 ctgcctatta atgtcatagt ttttgatggc aagtccaaat gcgacgagtc tgcttctaag
7861 tctgcttctg tgtactacag tcagctgatg tgccaaccta ttctgttgct tgaccaagct
7921 cttgtatcag acgttggaga tagtactgaa gtttccgtta agatgtttga tgcttatgtc
7981 gacacctttt cagcaacttt tagtgttcct atggaaaaac ttaaggcact tgttgctaca
8041 gctcacagcg agttagcaaa gggtgtagct ttagatggtg tcctttctac attcgtgtca
8101 gctgcccgac aaggtgttgt tgataccgat gttgacacaa aggatgttat tgaatgtctc
8161 aaactttcac atcactctga cttagaagtg acaggtgaca gttgtaacaa tttcatgctc
8221 acctataata aggttgaaaa catgacgccc agagatcttg gcgcatgtat tgactgtaat
8281 gcaaggcata tcaatgccca agtagcaaaa agtcacaatg tttcactcat ctggaatgta
8341 aaagactaca tgtctttatc tgaacagctg cgtaaacaaa ttcgtagtgc tgccaagaag
8401 aacaacatac cttttagact aacttgtgct acaactagac aggttgtcaa tgtcataact
8461 actaaaatct cactcaaggg tggtaagatt gttagtactt gttttaaact tatgcttaag
8521 gccacattat tgtgcgttct tgctgcattg gtttgttata tcgttatgcc agtacataca
8581 ttgtcaatcc atgatggtta cacaaatgaa atcattggtt acaaagccat tcaggatggt
8641 gtcactcgtg acatcatttc tactgatgat tgttttgcaa ataaacatgc tggttttgac
8701 gcatggttta gccagcgtgg tggttcatac aaaaatgaca aaagctgccc tgtagtagct
8761 gctatcatta caagagagat tggtttcata gtgcctggct taccgggtac tgtgctgaga
8821 gcaatcaatg gtgacttctt gcattttcta cctcgtgttt ttagtgctgt tggcaacatt
8881 tgctacacac cttccaaact cattgagtat agtgattttg ctacctctgc ttgcgttctt
8941 gctgctgagt gtacaatttt taaggatgct atgggcaaac ctgtgccata ttgttatgac
9001 actaatttgc tagagggttc tatttcttat agtgagcttc gtccagacac tcgttatgtg
9061 cttatggatg gttccatcat acagtttcct aacacttacc tggagggttc tgttagagta
9121 gtaacaactt ttgatgctga gtactgtaga catggtacat gcgaaaggtc agaagtaggt
9181 atttgcctat ctaccagtgg tagatgggtt cttaataatg agcattacag agctctatca
9241 ggagttttct gtggtgttga tgcgatgaat ctcatagcta acatctttac tcctcttgtg
9301 caacctgtgg gtgctttaga tgtgtctgct tcagtagtgg ctggtggtat tattgccata
9361 ttggtgactt gtgctgccta ctactttatg aaattcagac gtgtttttgg tgagtacaac
9421 catgttgttg ctgctaatgc acttttgttt ttgatgtctt tcactatact ctgtctggta
9481 ccagcttaca gctttctgcc gggagtctac tcagtctttt acttgtactt gacattctat
9541 ttcaccaatg atgtttcatt cttggctcac cttcaatggt ttgccatgtt ttctcctatt
9601 gtgccttttt ggataacagc aatctatgta ttctgtattt ctctgaagca ctgccattgg
9661 ttctttaaca actatcttag gaaaagagtc atgtttaatg gagttacatt tagtaccttc
9721 gaggaggctg ctttgtgtac ctttttgctc aacaaggaaa tgtacctaaa attgcgtagc
9781 gagacactgt tgccacttac acagtataac aggtatcttg ctctatataa caagtacaag
9841 tatttcagtg gagccttaga tactaccagc tatcgtgaag cagcttgctg ccacttagca
9901 aaggctctaa atgactttag caactcaggt gctgatgttc tctaccaacc accacagaca
9961 tcaatcactt ctgctgttct gcagagtggt tttaggaaaa tggcattccc gtcaggcaaa
10021 gttgaagggt gcatggtaca agtaacctgt ggaactacaa ctcttaatgg attgtggttg
10081 gatgacacag tatactgtcc aagacatgtc atttgcacag cagaagacat gcttaatcct
10141 aactatgaag atctgctcat tcgcaaatcc aaccatagct ttcttgttca ggctggcaat
10201 gttcaacttc gtgttattgg ccattctatg caaaattgtc tgcttaggct taaagttgat
10261 acttctaacc ctaagacacc caagtataaa tttgtccgta tccaacctgg tcaaacattt
10321 tcagttctag catgctacaa tggttcacca tctggtgttt atcagtgtgc catgagacct
10381 aatcatacca ttaaaggttc tttccttaat ggatcatgtg gtagtgttgg ttttaacatt
10441 gattatgatt gcgtgtcttt ctgctatatg catcatatgg agcttccaac aggagtacac
10501 gctggtactg acttagaagg taaattctat ggtccatttg ttgacagaca aactgcacag
10561 gctgcaggta cagacacaac cataacatta aatgttttgg catggctgta tgctgctgtt
10621 atcaatggtg ataggtggtt tcttaataga ttcaccacta ctttgaatga ctttaacctt
10681 gtggcaatga agtacaacta tgaacctttg acacaagatc atgttgacat attgggacct
10741 ctttctgctc aaacaggaat tgccgtctta gatatgtgtg ctgctttgaa agagctgctg
10801 cagaatggta tgaatggtcg tactatcctt ggtagcacta ttttagaaga tgagtttaca
10861 ccatttgatg ttgttagaca atgctctggt gttaccttcc aaggtaagtt caagaaaatt
10921 gttaagggca ctcatcattg gatgctttta actttcttga catcactatt gattcttgtt
10981 caaagtacac agtggtcact gtttttcttt gtttacgaga atgctttctt gccatttact
11041 cttggtatta tggcaattgc tgcatgtgct atgctgcttg ttaagcataa gcacgcattc
11101 ttgtgcttgt ttctgttacc ttctcttgca acagttgctt actttaatat ggtctacatg
11161 cctgctagct gggtgatgcg tatcatgaca tggcttgaat tggctgacac tagcttgtct
11221 ggttataggc ttaaggattg tgttatgtat gcttcagctt tagttttgct tattctcatg
11281 acagctcgca ctgtttatga tgatgctgct agacgtgttt ggacactgat gaatgtcatt
11341 acacttgttt acaaagtcta ctatggtaat gctttagatc aagctatttc catgtgggcc
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11461 agagctatag tgtttgtgtg tgttgagtat tacccattgt tatttattac tggcaacacc
11521 ttacagtgta tcatgcttgt ttattgtttc ttaggctatt gttgctgctg ctactttggc
11581 cttttctgtt tactcaaccg ttacttcagg cttactcttg gtgtttatga ctacttggtc
11641 tctacacaag aatttaggta tatgaactcc caggggcttt tgcctcctaa gagtagtatt
11701 gatgctttca agcttaacat taagttgttg ggtattggag gtaaaccatg tatcaaggtt
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11821 cttcaacaac ttagagtaga gtcatcttct aaattgtggg cacaatgtgt acaactccac
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11941 tctgttttgc tatccatgca gggtgctgta gacattaata ggttgtgcga ggaaatgctc
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12061 gcttatgcca ctgcccagga ggcctatgag caggctgtag ctaatggtga ttctgaagtc
12121 gttctcaaaa agttaaagaa atctttgaat gtggctaaat ctgagtttga ccgtgatgct
12181 gccatgcaac gcaagttgga aaagatggca gatcaggcta tgacccaaat gtacaaacag
12241 gcaagatctg aggacaagag ggcaaaagta actagtgcta tgcaaacaat gctcttcact
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12721 aagggaggta ggtttgtgct ggcattacta tcagaccacc aagatctcaa atgggctaga
12781 ttccctaaga gtgatggtac aggtacaatt tacacagaac tggaaccacc ttgtaggttt
12841 gttacagaca caccaaaagg gcctaaagtg aaatacttgt acttcatcaa aggcttaaac
12901 aacctaaata gaggtatggt gctgggcagt ttagctgcta cagtacgtct tcaggctgga
12961 aatgctacag aagtacctgc caattcaact gtgctttcct tctgtgcttt tgcagtagac
13021 cctgctaaag catataagga ttacctagca agtggaggac aaccaatcac caactgtgtg
13081 aagatgttgt gtacacacac tggtacagga caggcaatta ctgtaacacc agaagctaac
13141 atggaccaag agtcctttgg tggtgcttca tgttgtctgt attgtagatg ccacattgac
13201 catccaaatc ctaaaggatt ctgtgacttg aaaggtaagt acgtccaaat acctaccact
13261 tgtgctaatg acccagtggg ttttacactt agaaacacag tctgtaccgt ctgcggaatg
13321 tggaaaggtt atggctgtag ttgtgaccaa ctccgcgaac ccttgatgca gtctgcggat
13381 gcatcaacgt ttttaaacgg gtttgcggtg taagtgcagc ccgtcttaca ccgtgcggca
13441 caggcactag tactgatgtc gtctacaggg cttttgatat ttacaacgaa aaagttgctg
13501 gttttgcaaa gttcctaaaa actaattgct gtcgcttcca ggagaaggat gaggaaggca
13561 atttattaga ctcttacttt gtagttaaga ggcatactat gtctaactac caacatgaag
13621 agactattta taacttggtt aaagattgtc cagcggttgc tgtccatgac tttttcaagt
13681 ttagagtaga tggtgacatg gtaccacata tatcacgtca gcgtctaact aaatacacaa
13741 tggctgattt agtctatgct ctacgtcatt ttgatgaggg taattgtgat acattaaaag
13801 aaatactcgt cacatacaat tgctgtgatg atgattattt caataagaag gattggtatg
13861 acttcgtaga gaatcctgac atcttacgcg tatatgctaa cttaggtgag cgtgtacgcc
13921 aatcattatt aaagactgta caattctgcg atgctatgcg tgatgcaggc attgtaggcg
13981 tactgacatt agataatcag gatcttaatg ggaactggta cgatttcggt gatttcgtac
14041 aagtagcacc aggctgcgga gttcctattg tggattcata ttactcattg ctgatgccca
14101 tcctcacttt gactagggca ttggctgctg agtcccatat ggatgctgat ctcgcaaaac
14161 cacttattaa gtgggatttg ctgaaatatg attttacgga agagagactt tgtctcttcg
14221 accgttattt taaatattgg gaccagacat accatcccaa ttgtattaac tgtttggatg
14281 ataggtgtat ccttcattgt gcaaacttta atgtgttatt ttctactgtg tttccaccta
14341 caagttttgg accactagta agaaaaatat ttgtagatgg tgttcctttt gttgtttcaa
14401 ctggatacca ttttcgtgag ttaggagtcg tacataatca ggatgtaaac ttacatagct
14461 cgcgtctcag tttcaaggaa cttttagtgt atgctgctga tccagctatg catgcagctt
14521 ctggcaattt attgctagat aaacgcacta catgcttttc agtagctgca ctaacaaaca
14581 atgttgcttt tcaaactgtc aaacccggta attttaataa agacttttat gactttgctg
14641 tgtctaaagg tttctttaag gaaggaagtt ctgttgaact aaaacacttc ttctttgctc
14701 aggatggcaa cgctgctatc agtgattatg actattatcg ttataatctg ccaacaatgt
14761 gtgatatcag acaactccta ttcgtagttg aagttgttga taaatacttt gattgttacg
14821 atggtggctg tattaatgcc aaccaagtaa tcgttaacaa tctggataaa tcagctggtt
14881 tcccatttaa taaatggggt aaggctagac tttattatga ctcaatgagt tatgaggatc
14941 aagatgcact tttcgcgtat actaagcgta atgtcatccc tactataact caaatgaatc
15001 ttaagtatgc cattagtgca aagaatagag ctcgcaccgt agctggtgtc tctatctgta
15061 gtactatgac aaatagacag tttcatcaga aattattgaa gtcaatagcc gccactagag
15121 gagctactgt ggtaattgga acaagcaagt tttacggtgg ctggcataat atgttaaaaa
15181 ctgtttacag tgatgtagaa actccacacc ttatgggttg ggattatcca aaatgtgaca
15241 gagccatgcc taacatgctt aggataatgg cctctcttgt tcttgctcgc aaacataaca
15301 cttgctgtaa cttatcacac cgtttctaca ggttagctaa cgagtgtgcg caagtattaa
15361 gtgagatggt catgtgtggc ggctcactat atgttaaacc aggtggaaca tcatccggtg
15421 atgctacaac tgcttatgct aatagtgtct ttaacatttg tcaagctgtt acagccaatg
15481 taaatgcact tctttcaact gatggtaata agatagctga caagtatgtc cgcaatctac
15541 aacacaggct ctatgagtgt ctctatagaa atagggatgt tgatcatgaa ttcgtggatg
15601 agttttacgc ttacctgcgt aaacatttct ccatgatgat tctttctgat gatgccgttg
15661 tgtgctataa cagtaactat gcggctcaag gtttagtagc tagcattaag aactttaagg
15721 cagttcttta ttatcaaaat aatgtgttca tgtctgaggc aaaatgttgg actgagactg
15781 accttactaa aggacctcac gaattttgct cacagcatac aatgctagtt aaacaaggag
15841 atgattacgt gtacctgcct tacccagatc catcaagaat attaggcgca ggctgttttg
15901 tcgatgatat tgtcaaaaca gatggtacac ttatgattga aaggttcgtg tcactggcta
15961 ttgatgctta cccacttaca aaacatccta atcaggagta tgctgatgtc tttcacttgt
16021 atttacaata cattagaaag ttacatgatg agcttactgg ccacatgttg gacatgtatt
16081 ccgtaatgct aactaatgat aacacctcac ggtactggga acctgagttt tatgaggcta
16141 tgtacacacc acatacagtc ttgcaggctg taggtgcttg tgtattgtgc aattcacaga
16201 cttcacttcg ttgcggtgcc tgtattagga gaccattcct atgttgcaag tgctgctatg
16261 accatgtcat ttcaacatca cacaaattag tgttgtctgt taatccctat gtttgcaatg
16321 ccccaggttg tgatgtcact gatgtgacac aactgtatct aggaggtatg agctattatt
16381 gcaagtcaca taagcctccc attagttttc cattatgtgc taatggtcag gtttttggtt
16441 tatacaaaaa cacatgtgta ggcagtgaca atgtcactga cttcaatgcg atagcaacat
16501 gtgattggac taatgctggc gattacatac ttgccaacac ttgtactgag agactcaagc
16561 ttttcgcagc agaaacgctc aaagccactg aggaaacatt taagctgtca tatggtattg
16621 ccactgtacg cgaagtactc tctgacagag aattgcatct ttcatgggag gttggaaaac
16681 ctagaccacc attgaacaga aactatgtct ttactggtta ccgtgtaact aaaaatagta
16741 aagtacagat tggagagtac acctttgaaa aaggtgacta tggtgatgct gttgtgtaca
16801 gaggtactac gacatacaag ttgaatgttg gtgattactt tgtgttgaca tctcacactg
16861 taatgccact tagtgcacct actctagtgc cacaagagca ctatgtgaga attactggct
16921 tgtacccaac actcaacatc tcagatgagt tttctagcaa tgttgcaaat tatcaaaagg
16981 tcggcatgca aaagtactct acactccaag gaccacctgg tactggtaag agtcattttg
17041 ccatcggact tgctctctat tacccatctg ctcgcatagt gtatacggca tgctctcatg
17101 cagctgttga tgccctatgt gaaaaggcat taaaatattt gcccatagat aaatgtagta
17161 gaatcatacc tgcgcgtgcg cgcgtagagt gttttgataa attcaaagtg aattcaacac
17221 tagaacagta tgttttctgc actgtaaatg cattgccaga aacaactgct gacattgtag
17281 tctttgatga aatctctatg gctactaatt atgacttgag tgttgtcaat gctagacttc
17341 gtgcaaaaca ctacgtctat attggcgatc ctgctcaatt accagccccc cgcacattgc
17401 tgactaaagg cacactagaa ccagaatatt ttaattcagt gtgcagactt atgaaaacaa
17461 taggtccaga catgttcctt ggaacttgtc gccgttgtcc tgctgaaatt gttgacactg
17521 tgagtgcttt agtttatgac aataagctaa aagcacacaa ggataagtca gctcaatgct
17581 tcaaaatgtt ctacaaaggt gttattacac atgatgtttc atctgcaatc aacagacctc
17641 aaataggcgt tgtaagagaa tttcttacac gcaatcctgc ttggagaaaa gctgttttta
17701 tctcacctta taattcacag aacgctgtag cttcaaaaat cttaggattg cctacgcaga
17761 ctgttgattc atcacagggt tctgaatatg actatgtcat attcacacaa actactgaaa
17821 cagcacactc ttgtaatgtc aaccgcttca atgtggctat cacaagggca aaaattggca
17881 ttttgtgcat aatgtctgat agagatcttt atgacaaact gcaatttaca agtctagaaa
17941 taccacgtcg caatgtggct acattacaag cagaaaatgt aactggactt tttaaggact
18001 gtagtaagat cattactggt cttcatccta cacaggcacc tacacacctc agcgttgata
18061 taaagttcaa gactgaagga ttatgtgttg acataccagg cataccaaag gacatgacct
18121 accgtagact catctctatg atgggtttca aaatgaatta ccaagtcaat ggttacccta
18181 atatgtttat cacccgcgaa gaagctattc gtcacgttcg tgcgtggatt ggctttgatg
18241 tagagggctg tcatgcaact agagatgctg tgggtactaa cctacctctc cagctaggat
18301 tttctacagg tgttaactta gtagctgtac cgactggtta tgttgacact gaaaataaca
18361 cagaattcac cagagttaat gcaaaacctc caccaggtga ccagtttaaa catcttatac
18421 cactcatgta taaaggcttg ccctggaatg tagtgcgtat taagatagta caaatgctca
18481 gtgatacact gaaaggattg tcagacagag tcgtgttcgt cctttgggcg catggctttg
18541 agcttacatc aatgaagtac tttgtcaaga ttggacctga aagaacgtgt tgtctgtgtg
18601 acaaacgtgc aacttgcttt tctacttcat cagatactta tgcctgctgg aatcattctg
18661 tgggttttga ctatgtctat aacccattta tgattgatgt tcagcagtgg ggctttacgg
18721 gtaaccttca gagtaaccat gaccaacatt gccaggtaca tggaaatgca catgtggcta
18781 gttgtgatgc tatcatgact agatgtttag cagtccatga gtgctttgtt aagcgcgttg
18841 attggtctgt tgaataccct attataggag atgaactgag ggttaattct gcttgcagaa
18901 aagtacaaca catggttgtg aagtctgcat tgcttgctga taagtttcca gttcttcatg
18961 acattggaaa tccaaaggct atcaagtgtg tgcctcaggc tgaagtagaa tggaagttct
19021 acgatgctca gccatgtagt gacaaagctt acaaaataga ggaactcttc tattcttatg
19081 ctacacatca cgataaattc actgatggtg tttgtttgtt ttggaattgt aacgttgatc
19141 gttacccagc caatgcaatt gtgtgtaggt ttgacacaag agtcttgtca aacttgaact
19201 taccaggctg tgatggtggt agtttgtatg tgaataagca tgcattccac actccagctt
19261 tcgataaaag tgcatttact aatttaaagc aattgccttt cttttactat tctgatagtc
19321 cttgtgagtc tcatggcaaa caagtagtgt cggatattga ttatgttcca ctcaaatctg
19381 ctacgtgtat tacacgatgc aatttaggtg gtgctgtttg cagacaccat gcaaatgagt
19441 accgacagta cttggatgca tataatatga tgatttctgc tggatttagc ctatggattt
19501 acaaacaatt tgatacttat aacctgtgga atacatttac caggttacag agtttagaaa
19561 atgtggctta taatgttgtt aataaaggac actttgatgg acacgccggc gaagcacctg
19621 tttccatcat taataatgct gtttacacaa aggtagatgg tattgatgtg gagatctttg
19681 aaaataagac aacacttcct gttaatgttg catttgagct ttgggctaag cgtaacatta
19741 aaccagtgcc agagattaag atactcaata atttgggtgt tgatatcgct gctaatactg
19801 taatctggga ctacaaaaga gaagccccag cacatgtatc tacaataggt gtctgcacaa
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19981 cagaaggttc agtcaaaggt ctaacacctt caaagggacc agcacaagct agcgtcaatg
20041 gagtcacatt aattggagaa tcagtaaaaa cacagtttaa ctactttaag aaagtagacg
20101 gcattattca acagttgcct gaaacctact ttactcagag cagagactta gaggatttta
20161 agcccagatc acaaatggaa actgactttc tcgagctcgc tatggatgaa ttcatacagc
20221 gatataagct cgagggctat gccttcgaac acatcgttta tggagatttc agtcatggac
20281 aacttggcgg tcttcattta atgataggct tagccaagcg ctcacaagat tcaccactta
20341 aattagagga ttttatccct atggacagca cagtgaaaaa ttacttcata acagatgcgc
20401 aaacaggttc atcaaaatgt gtgtgttctg tgattgatct tttacttgat gactttgtcg
20461 agataataaa gtcacaagat ttgtcagtga tttcaaaagt ggtcaaggtt acaattgact
20521 atgctgaaat ttcattcatg ctttggtgta aggatggaca tgttgaaacc ttctacccaa
20581 aactacaagc aagtcaagcg tggcaaccag gtgttgcgat gcctaacttg tacaagatgc
20641 aaagaatgct tcttgaaaag tgtgaccttc agaattatgg tgaaaatgct gttataccaa
20701 aaggaataat gatgaatgtc gcaaagtata ctcaactgtg tcaatactta aatacactta
20761 ctttagctgt accctacaac atgagagtta ttcactttgg tgctggctct gataaaggag
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20881 cagatcttaa tgacttcgtc tccgacgcag attctacttt aattggagac tgtgcaacag
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21181 atgcatcatc atcggaagca tttttaattg gggctaacta tcttggcaag ccgaaggaac
21241 aaattgatgg ctataccatg catgctaact acattttctg gaggaacaca aatcctatcc
21301 agttgtcttc ctattcactc tttgacatga gcaaatttcc tcttaaatta agaggaactg
21361 ctgtaatgtc tcttaaggag aatcaaatca atgatatgat ttattctctt ctggaaaaag
21421 gtaggcttat cattagagaa aacaacagag ttgtggtttc aagtgatatt cttgttaaca
21481 actaaacgaa catgtttatt ttcttattat ttcttactct cactagtggt agtgaccttg
Age I
21541 accggtgc
21601
21661
21721
21781
21841
21901
21961
22021
22081
22141
22201
22261
tggta tgtttggctc ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa
22321 tcttgctttg ttgcatgact agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt
22381 cttgctgcaa gtttgatgag gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt
22441 acacataaac gaacttatgg atttgtttat gagatttttt actcttagat caattactgc
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22561 accgctacaa gcctcactcc ctttcggatg gcttgttatt ggcgttgcat ttcttgctgt
22621 ttttcagagc gctaccaaaa taattgcgct caataaaaga tggcagctag ccctttataa
22681 gggcttccag ttcatttgca atttactgct gctatttgtt accatctatt cacatctttt
22741 gcttgtcgct gcaggtatgg aggcgcaatt tttgtacctc tatgccttga tatattttct
22801 acaatgcatc aacgcatgta gaattattat gagatgttgg ctttgttgga agtgcaaatc
22861 caagaaccca ttactttatg atgccaacta ctttgtttgc tggcacacac ataactatga
22921 ctactgtata ccatataaca gtgtcacaga tacaattgtc gttactgaag gtgacggcat
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23141 aggtgttaaa gactatgtcg ttgtacatgg ctatttcacc gaagtttact accagcttga
23201 gtctacacaa attactacag acactggtat tgaaaatgct acattcttca tctttaacaa
23261 gcttgttaaa gacccaccga atgtgcaaat acacacaatc gacggctctt caggagttgc
BamH I
23321 taatccagca atggatccaa tttatgatga gccgacgacg actactagcg tgcctttgta
23381 agcacaagaa agtgagtacg aacttatgta ctcattcgtt tcggaagaaa caggtacgtt
23441 aatagttaat agcgtacttc tttttcttgc tttcgtggta ttcttgctag tcacactagc
23501 catccttact gcgcttcgat tgtgtgcgta ctgctgcaat attgttaacg tgagtttagt
23561 aaaaccaacg gtttacgtct actcgcgtgt taaaaatctg aactcttctg aaggagttcc
23421 tgatcttctg gtctaaacga actaactatt attattattc tgtttggaac tttaacattg
23481 cttatcatgg cagacaacgg tactattacc gttgaggagc ttaaacaact cctggaacaa
23541 tggaacctag taataggttt cctattccta gcctggatta tgttactaca atttgcctat
23601 tctaatcgga acaggttttt gtacataata aagcttgttt tcctctggct cttgtggcca
23661 gtaacacttg cttgttttgt gcttgctgct gtctacagaa ttaattgggt gactggcggg
23721 attgcgattg caatggcttg tattgtaggc ttgatgtggc ttagctactt cgttgcttcc
23781 ttcaggctgt ttgctcgtac ccgctcaatg tggtcattca acccagaaac aaacattctt
23841 ctcaatgtgc ctctccgggg gacaattgtg accagaccgc tcatggaaag tgaacttgtc
23901 attggtgctg tgatcattcg tggtcacttg cgaatggccg gacactccct agggcgctgt
23961 gacattaagg acctgccaaa agagatcact gtggctacat cacgaacgct ttcttattac
24021 aaattaggag cgtcgcagcg tgtaggcact gattcaggtt ttgctgcata caaccgctac
24081 cgtattggaa actataaatt aaatacagac cacgccggta gcaacgacaa tattgctttg
24141 ctagtacagt aagtgacaac agatgtttca tcttgttgac ttccaggtta caatagcaga
24201 gatattgatt atcattatga ggactttcag gattgctatt tggaatcttg acgttataat
24261 aagttcaata gtgagacaat tatttaagcc tctaactaag aagaattatt cggagttaga
24321 tgatgaagaa cctatggagt tagattatcc ataaaacgaa catgaaaatt attctcttcc
24381 tgacattgat tgtatttaca tcttgcgagc tatatcacta tcaggagtgt gttagaggta
24441 cgactgtact actaaaagaa ccttgcccat caggaacata cgagggcaat tcaccatttc
24501 accctcttgc tgacaataaa tttgcactaa cttgcactag cacacacttt gcttttgctt
24561 gtgctgacgg tactcgacat acctatcagc tgcgtgcaag atcagtttca ccaaaacttt
24621 tcatcagaca agaggaggtt caacaagagc tctactcgcc actttttctc attgttgctg
24681 ctctagtatt tttaatactt tgcttcacca ttaagagaaa gacagaatga atgagctcac
24741 tttaattgac ttctatttgt gctttttagc ctttctgcta ttccttgttt taataatgct
24801 tattatattt tggttttcac tcgaaatcca ggatctagaa gaaccttgta ccaaagtcta
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24921 tgtagtacag cgctgtgcat ctaataaacc tcatgtgctt gaagatcctt gtaaggtaca
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25101 atccagctgg tggtgcgctt atagctaggt gttggtacct tcatgaaggt caccaaactg
25161 ctgcatttag agacgtactt gttgttttaa ataaacgaac aaattaaaat gtctgataat
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26601 ttaactttaa tctcacatag caatctttaa tcaatgtgta acattaggga ggacttgaaa
Pvu I
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26841
26901
26961
Not I
27021 gggt
27081
Claims (4)
1.一种非感染性病毒重组基因SARS-CoV-EGFP，由SARS-CoV全基因组改造而成，其特征在于在SARS-CoV全基因组的5’端引入启动子序列T7 Pro，将S蛋白中第20-1195位氨基酸残基的编码序列用编码绿色荧光蛋白EGFP的基因取代，全基因组的3’端依次引入HDV反义基因组核酶序列HDV Rz、T7转录终止子序列T7 Ter，SARS-CoV-EGFP的核苷酸序列如核苷酸序列表1。
2.一种重组表达质粒，其特征在于重组表达质粒是由权利要求1所述的非感染性病毒重组基因插入原核表达载体构成。
3.按权利要求2所述的重组表达质粒，其特征在于所说的原核表达载体为pUC19。
4.权利要求1所述非感染性病毒重组基因用于筛选抗SARS冠状病毒药物的用途。
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