CN1769436A

CN1769436A - 南京椴3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶a还原酶蛋白编码序列

Info

Publication number: CN1769436A
Application number: CN 200410065264
Authority: CN
Inventors: 蒋继宏; 曹小迎; 开国银; 陈凤美; 卢芳
Original assignee: 蒋继宏
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2004-11-02
Publication date: 2006-05-10
Anticipated expiration: 2024-11-02
Also published as: CN100360664C

Abstract

一种南京椴tm－Hmgr蛋白编码序列，属于基因工程领域。所分离出的DNA分子包括：编码具有南京椴tm－Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸第131－1888位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40－55℃条件下与SEQ ID No.3中从核苷酸第131－1888位的核苷酸序列杂交。本发明是一种3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A的还原酶，有助于提高南京椴中萜类化合物次生代谢产物或其前体的含量，且可以开拓新蛋白资源，对于保护人民的健康生长将有所帮助，同时对我国的农业和医药的研究和发展具有重要的意义。

Description

南京椴3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白编码序列

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在南京椴中表达的tm-Hmgr蛋白(南京椴3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白，Tilia miqucliana 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Reductase，TMHMGR)及其核酸序列。

背景技术

南京椴(Tilia miqueliana Maxim)俗称菩提树，属椴树科椴树属，产于华东各省、湖南东部、广东，生于山坡、山沟林中。南京椴属落叶乔木，树干通直，材质好，生长慢，寿命长。其树叶美丽，树姿清幽，夏日黄花满树，芳香馥郁，为著名的绿荫树种和优良的蜜源植物。椴树植物在西方是很著名的草药，在民间作为药茶饮用，具有利尿、健胃、治疗神经痛和镇定等功能，含有多种活性物质。我们在研究中也发现南京椴含有多种天然活性成分，其中包括萜类化合物，许多萜类化合物具有很好的药理活性，是中药的主要成分。南京椴目前资源越来越贫乏，但其潜在经济和药用价值是巨大的。

近年来，对许多植物材料的萜类化合物次生代谢的研究证明，HMGR是甲羟戊酸途径中一个关键酶。在甲羟戊酸途径中3-羟基-3-甲基戊二酸单酰CoA(HMGCoA)在HMGR的作用下生成甲羟戊酸(MVA)。由于该反应是一个不可逆过程，因此HMGR被认为是该途径中第一个限速酶。通过提高3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性或含量，可以间接的提高南京椴中萜类化合物次生代谢产物或其前体的含量。近代科学研究发现，萜类化合物次生代谢产物是天然活性物质，是解决目前世界面临的西药毒副作用大，癌症、艾滋病等疑难疾病无法医治等难题的一条新途径。

在对现有文献的分析中，“Plant Cell(植物细胞)，1992，4(10)：1333-1344”报道了从马铃薯中克隆了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，NCBI网站上公布了橡胶树等的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶还原酶基因的序列。但至今尚未有南京椴tm-Hmgr蛋白序列及其核酸序列报道。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的南京椴tm-Hmgr蛋白序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种南京椴tm-Hmgr蛋白编码序列。使其包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有显著提高的萜类化合物次生代谢产物含量。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有南京椴tm-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ IDNO.3中从核苷酸第131-1888位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第131-1888位的核苷酸序列杂交。

较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第131-1888位的核苷酸序列。

本发明分离出的南京椴tm-Hmgr蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。

本发明所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

本发明用上述载体。在实例中该宿主细胞是烟草。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“南京椴tm-Hmgr蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有南京椴tm-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第131-1888位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第131-1888位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第131-1888位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第131-1888位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第131-1888位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的南京椴tm-Hmgr蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“南京椴tm-Hmgr蛋白或多肽”指具有南京椴tm-Hmgr蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然南京椴tm-Hmgr蛋白相同功能的SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括南京椴tm-Hmgr蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的南京椴tm-Hmgr蛋白多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与南京椴tm-Hmgr蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用南京椴tm-Hmgr蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“南京椴tm-Hmgr蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe

表2

85％ identity in 910nt overlap

Query：207 attccaccaaagcctccgacgcactacctcctcctttgtatataatgaatgcggtgttct 266

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Sbjct：825 attccaccaaagcttctgacgcattgccacttcctttgtatttaacgaatgctgtgttct 884

Query：267 tcacgctcttcttctcggtggtttattttcttctttcccgttggcgtgaaaagatccgaa 326

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Sbjct：885 tcactctctttttctcggcggtttatttccttctttgccgttggcgggaaaagatccgat 944

Query：327 tctccacgcctctccacatcgtcaccttttccgagatcgttgcggttctcgctttagttg 386

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Sbjct：945 cctctacgcctctccatgtcgtcaccttttccgagatcgttgcgattcttgcttccgttg 1004

Query：387 cctcgtttatatatcttttgggattcttcgggattgactttgttcagtctttgattctcc 446

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Sbjct：1005 cgtcgtttatttaccttttggggttctttggtatcgatttcgttcaatctttggttctcc 1064

Query：447 gaccatcaactgacatttggaattccgaggaagaagaagaggaaaatgaagttttgctcc 506

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Sbjct：1065 ggccatcggctgacgtttgggctactgaagatgatgaagtggaaagtgaagttttgcttc 1124

Query：507 gtaaagaagattcgcgtaaagtcccttgcggccaagctctcgattgctcgtttcctcctt 566

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Sbjct：1125 gtaatgaagatgctcgtcacgttccttgtggacaagcacttgatcggtcgattcgatctt 1184

Query：567 tgcctccttcggcaccgattgtaactgcccagaaagttttcgatgaaaagcttgtggaag 626

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Sbjct：1185 tgcaacctccggaacctattgtaactgctgagaaagtgttcgatgaaatgcctgtgacag 1244

Query：627 ttacaaccgaggaagacgaagaaataattaaatccgtagtggctggaacaaccccttcat 686

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Sbjct：1245 ttatgactgaggaagacgaagaaataattagatccgttgtttgtggaatgactccttcat 1304

Query：687 attctttggaatcgaaattaggtgattgcaagagagcgactgcgatcaggcgtgaggcgc 746

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Sbjct：1305 attctttggaatctaaattagatgattgcaagagagcagctgcgatcaggcgtgaggctt 1364

Query：747 tgcagagattaacgggaaagtcattatcaggattgcccttggatggatttgattatgcgt 806

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Sbjct：1365 tgcagagaataacagggaagtcattatcaggattgcccttggatggttttgattatgagt 1424

Query：807 cgattttagggcagtgttgtgagatgccggttgggtacgtgcaaattcccgtgggaattg 866

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Sbjct：1425 cgatattgggacagtgttgtgagatgccggttggttacgagcagattcccgtgggcattg 1484

Query：867 ctgggccgttgttgcttaatggaagagaatacacggttcctatggcaaccacggagggga 926

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Sbjct：1485 ctgggcctttgttgcttaatggaagagaatactcggttcccatggcaaccaccgaaggat 1544

Query：927 ccttggtggctagcactaataggggatgtaaggctattcatttgtctggtggagctacaa 986

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Sbjct：1545 gcttggtagctagcactaatagaggctgtaaggctattcatttgtctggtggagctacaa 1604

Query：987 gtgttcttttgaaagatgggtgactagagctcctgtggttaggttcagtactgcgaaaa 1046

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Sbjct：1605 gtgttctattgagagatgggatgactagagctcctgttgtgaggttcggtaccgcaaaaa 1664

Query：1047 gagcagctgatctgaagttttatttggaggatcctgaaaatttcgagaccttggctgttg 1106

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Sbjct：1665 gggcggctgatctgaagttgtatttggaagatcctgaaaatttcgagaccttggcttgtg 1724

Query：1107 tttttaacag 1116

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Sbjct：1725 tttttaacag 1734

90％ identity in 350nt overlap

Query：1298 ggaaacttctgttcggacaaaaagccagctgcagtaaattggattgaaggacgtggcaaa 1357

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Sbjct：2364 ggaaacttctgttccgacaaaaagccagctgcagtaaattggattgaaggccgaggcaaa 2423

Query：1358 tctgttgtctgcgaggccatcattaaggatgatgtggtgaggaaggtcttgaagactggt 1417

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Sbjct：2424 tctgtcgtctgtgaggccatcattaatggtgatgtagtgacgaaggtcttgaagacaagt 2483

Query：1418 gtggaatctctcgtggagcttaacatgcttaagaaccttactggatctgctatggctgga 1477

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Sbjct：2484 gtagaatctctcgtggagcttaacatgcttaagaaccttactggttctgccatggctgga 2543

Query：1478 gctctgggtggatttaatgcctatgccggtaacattgtgtctgctgtctacatagctacc 1537

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Sbjct：2544 gctctgggtggatttaatgctcatgccagtaacattgtcactgctgtctatatagccact 2603

Query：1538 ggtcaagatccggctcaaaatgtcgagagctctcattgcataacgatgatggaagctgtt 1597

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Sbjct：2604 ggccaagatcctgcccaaaatgtcgagagctctcattgcatcaccatgatggaagctgtt 2663

Query：1598 aatgatggcaaggaccttcacatctctgttacaatgccttccatcgaggt 1647

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Sbjct：2664 aatggcggcaaggaccttcatgtctctgtcacaatgccttccattgaggt 2713

88％ identity in 244nt overlap

Query：1644 aggttggcactgttggtggtggaactcagcttgcatctcagtcagcgtgtttgaacctgc 1703

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Sbjct：3553 aggttggcactgttggtggtggaactcagcttgcatcacaatcagcttgtttgaaccttc 3612

Query：1704 tcggtgtcaagggtgcaagcaaagaatcacctggagaaaactctagaatgcttgcaacca 1763

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Sbjct：3613 ttggtgtcaagggtgcaagcaaagaatcccctggagcaaactcaatactccttgcgacta 3672

Query：1764 ttgtagccggtgctgtccttgctggggagctgtcactcatgtctgcacttgcagctgggc 1823

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Sbjct：3673 tcgtagccggtgctgtccttgccggcgagctgtcactgatgtcagcacttgctgccgggc 3732

Query：1824 aactaattaacagccatatgaagtacaataggtcaaataaggacgtgtccaaggcttctt 1883

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Sbjct：3733 aactagtgaaaagccatatgaagtacaataggtctagcaaggatgtttccaaggtttctt 3792

Query：1884 ccta 1887

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Sbjct：3793 ccta 3796

91％ identity in 183nt overlap

Query：1114 cagatcaagtagatttgctaggcttcaaggtatcaaatgtgcaattgctgggaagaatct 1173

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Sbjct：1829 cagatcaagcagatttgctaggcttcaaagcatcaaatgtgcaattgcagggaagaatct 1888

Query：1174 ctatttgagattcacttgcagtactggtgatgctatggggatgaacatggtttccaaggg 1233

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Sbjct：1889 gtatttaagattctcatgctttactggtgatgctatggggatgaacatggtttccaaggg 1948

Query：1234 agtccaaaacgtattggatttccttcaaactgatttctctgacatggatgtcattggcat 1293

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Sbjct：1949 agttcaaaacgttttagatttccttcaaaccgatttccctgacatggatgtcattggcat 2008

Query：1294 ctc 1296

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Sbjct：2009 ctc 2011

96％ identity in 30nt overlap

Query：1983 catcatctctttgtaataagctaagtagac 2012

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Sbjct：3877 catcatctcttagtaataagctaagtagac 3906

Query：南京椴tm-Hmgr的核酸序列

Sbjct：陆地棉gh-Hmgr1的核酸序列(AF038045.1)

表2为本发明的南京椴tm-Hmgr与陆地棉(upland cotton)gh-Hmgr1的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。

表3

83％ identity in 585 aa overlap，87％ similarity in 585 aa overlap

Query：1 MEARRRSSTKPIQSLKTTKTVSLEENSTKASDALPPPLYIMNAVFFTLFFSVVYFLLSRW 60

ME RRSST I+S K + ++LE++STKASDALP PLY+ NAVFFTLFFS VYFLL RW

Sbjct：1 METHRRSSTNSIRSHKPARPIALEDDSTKASDALPLPLYLTNAVFFTLFFSAVYFLLCRW 60

Query：61 REKIRISTPLHIVTFSEIVAVLALVASFIYLLGFFGIDFVQSLILRPSTDIWNSXXXXXX 120

REKIR STPLH+VTFSEIVA+LA VASFIYLLGFFGIDFVQSL+LRPS D+W +

Sbjct：61 REKIRSSTPLHVVTFSEIVAILASVASFIYLLGFFGIDFVQSLVLRPSADVWATEDDEVE 120

Query：121 XXVLLRKEDSRKVPCGQALDCSFPPLPPSAPIVTAQKVFXXXXXXXXXXXXXXXXXSVVA 180

VLLR ED+R VPCGQALD S L P PIVTA+KVF SVV

Sbjct：121 SEVLLRNEDARHVPCGQALDRSIRSLQPPEPIVTAEKVFDEMPVTVMTEEDEEIIRSVVC 180

Query：181 GTTPSYSLESKLGDCKRATAIRREALQRLTGKSLSGLPLDGFDYASILGQCCEMPVGYVQ 240

G TPSYSLESKL DCKRA AIRREALQR+TGKSLSGLPLDGFDY SILGQCCEMPVGY Q

Sbjct：181 GMTPSYSLESKLDDCKRAAAIRREALQRITGKSLSGLPLDGFDYESILGQCCEMPVGYEQ 240

Query：241 IPVGIAGPLLLNGREYTVPMATTEGTLVASTNRGCKAIHLSGGATSVLLKDGMTRAPVVR 300

IPVGIAGPLLLNGREY+VPMATTEG LVASTNRGCKAIHLSGGATSVLL+DGMTRAPVVR

Sbjct：241 IPVGIAGPLLLNGREYSVPMATTEGCLVASTNRGCKAIHLSGGATSVLLRDGMTRAPVVR 300

Query：301 FSTAKRAADLKFYLEDPENFETLAVVFNRSSRFARLGGIKCAIAGKNLYLRFTCSTGDAM 360

F TAKRAADLK YLEDPENFETLA VFNRSSRFARLQ IKCAIAGKNLYLRF+C TGDAM

Sbjct：301 FGTAKRAADLKLYLEDPENFETLACVFNRSSRFARLQSIKCAIAGKNLYLRFSCFTGDAM 360

Query：361 GMNMVSKGVQNVLDFLQTDFSDMDVIGISGNFCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAIIKDD 420

GMNMVSKGVQNVLDFLQTDF DMDVIGISGNFCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAII D

Sbjct：361 GMNMVSKGVQNVLDFLQTDFPDMDVIGISGNFCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAIINGD 420

Query：421 VVRKVLKTGVESLVELNMLKNLTGSAMAGALGGFNAYAGNIVSAVYIATGQDPAQNVESS 480

VV KVLKT VESLVELNMLKNLTGSAMAGALGGFNA+A NIV+AVYIATGQDPAQNVESS

Sbjct：421 VVTKVLKTSVESLVELNMLKNLTGSAMAGALGGFNAHASNIVTAVYIATGQDPAQNVESS 480

Query：481 HCITMMEAVNDGKDLHISVTMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLNLLGVKGASKESPGENSR 540

HCITMMEAVN GKDLH+SVTMPSIEVGTVGGGTGLASQSACLNLLGVKGASKESPG NS

Sbjct：481 HCITMMEAVNGGKDLHVSVTMPSIEVGTVGGGTGLASQSACLNLLGVKGASKESPGANSI 540

Query：541 MLATIVAGAVLAGELSLMSALAAGQLINSHMKYNRSNKDVSKASS 585

+LATIVAGAVLAGELSLMSALAAGQL+ SHMKYNRS+KDVSK SS

Sbjct：541 LLATIVAGAVLAGELSLMSALAAGQLVKSHMKYNRSSKDVSKVSS 585

Query：南京椴tm-Hmgr氨基酸序列

Sbjct：陆地棉gh-Hmgr1氨基酸序列(GenBank Accession No.AAC05088.1)

表3为本发明的南京椴tm-Hmgr蛋白的氨基酸序列与陆地棉gh-Hmgr1的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

发明还包括南京椴tm-Hmgr蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的南京椴tm-Hmgr蛋白多肽时，可以将南京椴tm-Hmgr蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成南京椴tm-Hmgr蛋白表达载体。

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法技术分析南京椴tm-Hmgr蛋白基因产物的表达，即分析南京椴tm-Hmgr蛋白的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有南京椴tm-Hmgr蛋白核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码南京椴tm-Hmgr蛋白的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在南京椴tm-Hmgr蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于南京椴tm-Hmgr蛋白核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的南京椴tm-Hmgr蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选南京椴tm-Hmgr蛋白同源基因或同源蛋白。

为了得到与南京椴tm-Hmgr蛋白基因相关的杜仲cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选南京椴cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对南京椴tm-Hmgr蛋白的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自南京椴的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与南京椴tm-Hmgr蛋白的基因家族的核苷酸序列。

本发明的南京椴tm-Hmgr蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的南京椴tm-Hmgr蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与南京椴tm-Hmgr蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。本发明的南京椴tm-Hmgr蛋白基因可通过基因工程技术用来提高南京椴中萜类化合物次生代谢产物或其前体的含量，而这些次生代谢产物在临床上具有巨大的应用价值，对保护人民的健康生长有所帮助。因而本发明具有很大的应用前景。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

南京椴tm-Hmgr蛋白基因的克隆

1.组织分离(isolation)

南京椴幼嫩叶片来源于江苏省药用植物生物技术重点实验室，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据一些植物Hmgr的氨基酸保守序列，设计兼并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)3’-RACE

PCR(UPM+F2)得到TMF2’(936bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的陆地棉(Gossypiumhirsutum)等的Hmgr基因的同源性很高，故初步认为它是一个Hmgr基因。

(2)5’-RACE

根据3’RACE结果，设计反向特异引物R2，经PCR(UPM+R2)得到TMR2’(1358bp)(过程同(1))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。

(3)将5’RACE测序结果与3’RACE测序结果比序并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增tm-Hmgr编码区(DF1+DR1)得到tm-Hmgr编码区(1758bp)(过程同(1)。

BLAST的结果证明从南京椴中新得到的基因确为一个植物Hmgr基因。通过组合使用上述3种方法，获得了候选的南京椴TmHMGR的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物TmHMGRF1：5’-ACTCAACCCCCGAAAACCG-3’(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸TmHMGRR1：5’-ACAATTCTGTCATTTTACC-3’(SEQ ID NO.2)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，TmHMGRF1/TmHMGRR2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、55℃1分钟和72℃2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为2107bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.3所示的序列。

实施例2

南京椴tm-Hmgr蛋白基因的序列信息与同源性分析

本发明新的南京椴tm-Hmgr蛋白全长cDNA的长度为2160bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于131-1888位核苷酸。根据全长cDNA推导出南京椴tm-Hmgr蛋白的氨基酸序列，共585个氨基酸残基，分子量62956.49，pI为6.11。详细序列见SEQ ID NO.4。

将南京椴tm-Hmgr蛋白的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redunoant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与陆地棉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1基因(AF038045.1)在核苷酸水平上具有较高的同源性(附表2)；在氨基酸水平上，它与陆地棉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1(GenBank Accession No.AAC05088.1)有78％的相同性和86％的相似性(见表3)。由此可见，南京椴tm-Hmgr蛋白与陆地棉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为南京椴tm-Hmgr蛋白在功能上也相似。

实施例3

南京椴tm-Hmgr蛋白在大肠杆菌中进行原核表达及提纯

在该实施例中，将全长的南京椴tm-Hmgr蛋白编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

将南京椴tm-Hmgr蛋白多肽以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。

原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌

根据南京椴tm-Hmgr蛋白的氨基酸序列，设计蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将南京椴tm-Hmgr蛋白基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl₂方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶表达载体的工程菌BL22-pET32a(+)-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶。

表达Trx-tm-Hmgr重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-eu-Hmgr工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-3-tm-Hmgr融合蛋白的工程菌。

Trx-3-tm-Hmgr融合蛋白的提取纯化

按上述方法诱导表达Trx-tm-Hmgr融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-tm-Hmgr，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mM CAPS，pH11.0，0.3％ N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mM Tris-HCl，pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗脱来收集Trx-tm-Hmgr融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20℃酶切16小时后即可分离获得tm-Hmgr的表达蛋白。

纯化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活力测定

按Thorsness等(Mol.Cell.Biol，1989，9：5702～5712)的方法对表达纯化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶进行酶活力的测定，研究在其作用下3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成甲羟戊酸的能力。反应体系含有0.05MTris-HCL(pH＝7.5)，5mM DTT，200mM NADPH，300mM ¹⁴C标记的乙酰辅酶A(1mCi/mmol)及20mM磷酸葡萄糖，每毫升9.75mU磷酸葡萄糖脱氢酶用于NADPH的再生，总体积为100ul。反应流程如下：首先加入400mg蛋白质37℃水浴5分钟。然后加入20ml 6N的HCL终止反应，混合物再37℃水浴15分钟，使3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化成甲羟戊酸。反应终产物和酶作用物在Bio-Rex 5柱子上分离，反应终产物可从柱子中水洗下来。可用液体闪烁记数器测定¹⁴C标记的反应终产物的含量。结果表明，表达的蛋白的确具有催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成甲羟戊酸的酶活性。

实施例4

南京椴tm-Hmgr蛋白在烟草中进行真核细胞表达

将含目的基因(南京椴tm-Hmgr蛋白基因)的表达载体的构建，根据南京椴tm-Hmgr蛋白的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将南京椴tm-Hmgr蛋白基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。

利用叶盘法转化烟草

1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2ml YEB液体(Sm⁺，Kan⁺)，28度，200rpm振荡培养24-36小时；

2.室温下4,000g离心10min；

3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；

4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；

5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；

7.将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；

8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；

9.等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

利用Northern blotting检测tm-Hmgr蛋白在转基因烟草植株中的表达

1.RNA的提取：待转基因烟草叶片长到2-3片叶时抽取烟草叶的RNA。以正常生长的植株作为对照(条件同上)，利用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。

2.RNA的定量：参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD₂₆₀；RNA含量计算：1 OD₂₆₀＝40μg/ml。

3 总RNA脂糖凝胶电泳分离：1)取6ml 25*(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2ul 10*上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。

4.RNA尼龙膜上转移：1)转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤2小时。

5.膜上杂交信号的检出：1)将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时。2)将用Gene Images^TM Contents CDP-Star^TMlabelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。4)用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明；转基因烟草的tm-HMGR转录水平比未转基因的对照材料的表达水平明显高得多。

含南京椴3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(tmhmgr)的转基因烟草植株中的tm-Hmgr蛋白活性测定

1.蛋白的提取：a)取500mg叶片，加入1000ul 1*PBS(KH₂PO₄ 0.2g/l，Na₂HPO₄1.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于50ml eppondorf管中研磨；b)13000，4℃离心10分钟；c)取上清，备用。注：以上过程于冰上进行。

2.蛋白的定量：参考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白样品，加入1mlBradford试剂，混匀后，分光光度计测OD₅₉₅；蛋白含量计算：1 OD₅₉₅＝28.57μg。

3.tm-Hmgr蛋白活性测定参考Thorsness等(Mol.Cell.Biol，1989，9：5702～5712)的方法(详细操作过程同实例3)。结果表明，转基因烟草植株的中的tm-Hmgr蛋白酶活性比没有转基因的对照明显高得多(P＜0.05)。从而再次证明所克隆的南京椴3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的确具有催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成甲羟戊酸的酶活性，将可用于利用转基因技术来提高植物的萜类化合物次生代谢产物的研究和产业化中。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：19bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii).分子类型：寡核苷酸

(iii).序列描述：SEQ ID NO.1

ACTCAACCCCCGAAAACCG

(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：19bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

ACAATTCTGTCATTTTACC

(3)SEQ ID NO.3的信息

(i)序列特征：

(A)长度：2160bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.3

(4)SEQ ID NO.4的信息

(i)序列特征：

(A)长度：585氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii).分子类型：多肽

(iii).序列描述：SEQ ID NO.4

<210>1

<211>2160

<212>DNA

<213>南京椴(Tilia miqueliana Maxim)

<220>

<221>CDS

<222>(131)..(1888)

<223>

<400>1

acgcggggac tcaacccccg aaaaccgttt ttcccgaaac gaacctgaat cgtcttttca 60

ttcttgtact cttctcctcc accgctctat tcgccgacgg cttcctctgc catcgccacc 120

aacatacaaa atg gag gcc cgg cgg cga tca tcg act aaa cct att caa 169

Met Glu Ala Arg Arg Arg Ser Ser Thu Lys Pro Ile Glu

1 5 10

tct ctc aag aca aca aaa act gtt tct tta gag gaa aat tcc acc aaa 217

Ser Leu Lys Thr Thr Lys Thr Val Ser Leu Glu Glu Asn Ser Thr Lys

15 20 25

gcc tcc gac gca cta cct cct cct ttg tat ata atg aat gcg gtg ttc 265

Ala Ser Asp Ala Leu Pro Pro Pro Leu Tyr Ile Met Asn Ala Val Phe

30 35 40 45

ttc acg ctc ttc ttc tcg gtg gtt tat ttt ctt ctt tcc cgt tgg cgt 313

Phe Thr Leu Phe Phe Ser Val Val Tyr Phe Leu Leu Ser Arg Trp Arg

50 55 60

gaa aag atc cga atc tcc acg cct ctc cac atc gtc acc ttt tcc gag 361

Glu Lys Ile Arg Ile Ser Thr Pro Leu His Ile Val Thr Phe Ser Glu

65 70 75

atc gtt gcg gtt ctc gct tta gtt gcc tcg ttt ata tat ctt ttg gga 409

Ile Val Ala Val Leu Ala Leu Val Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly

80 85 90

ttc ttc ggg att gac ttt gtt cag tct ttg att ctc cga cca tca act 457

Phe Phe Gly Ile Asp Phe Val Glu Ser Leu Ile Leu Arg Pro Ser Thr

95 100 105

gac att tgg aat tcc gag gaa gaa gaa gag gaa aat gaa gtt ttg ctc 505

Arg Ile Trp Asn Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asn Glu Val Leu Leu

110 115 120 125

cgt aaa gaa gat tcg cgt aaa gtc cct tgc ggc caa gct ctc gat tgc 553

Leu Lys Glu Asp Ser Arg Lys Val Pro Cys Gly Glu Ala Leu Asp Cys

130 135 140

tcg ttt cct cct ttg cct cct tcg gca ccg att gta act gcc cag aaa 601

Ser Phe Pro Pro Leu Pro Pro Ser Ala Pro Ile Val Thr Ala Arg Lys

145 150 155

gtt ttc gat gaa aag ctt gtg gaa gtt aca acc gag gaa gac gaa gaa 649

Val Phe Asp Glu Lys Leu Val Glu Val Thr Thr Glu Glu Asp Glu Glu

160 165 170

ata att aaa tcc gta gtg gct gga aca acc cct tca tat tct ttg gaa 697

Ile Ile Lys Ser Val Val Ala Gly Thr Thr Pro Ser Tyr Ser Leu Glu

175 180 185

tcg aaa tta ggt gat tgc aag aga gcg act gcg atc agg cgt gag gcg 745

Ser Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Thr Ala Ile Arg Arg Glu Ala

190 195 200 205

ctg cag aga tta acg gga aag tca tta tca gga ttg ccc ttg gat gga 793

Leu Glu Arg Leu Thr Gly Lys Ser Leu Ser Gly Leu Pro Leu Asp Gly

210 215 220

ttt gat tat gcg tcg att tta ggg cag tgt tgt gag atg ccg gtt ggg 841

Phe Asp Tyr Ala Ser Ile Leu Gly Glu Cys Cys GLu Met Pro Val Gly

225 230 235

tac gtg caa att ccc gtg gga att gct ggg ccg ttg ttg ctt aat gga 889

Tyr Val Glu Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asn Gly

240 245 250

aga gaa tac acg gtt cct atg gca acc acg gag ggg acc ttg gtg gct 937

Arg Glu Tyr Thr Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Thr Leu Val Ala

255 260 265

agc act aat agg gga tgt aag gct att cat ttg tct ggt gga gct aca 985

Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile His Leu Ser Gly Gly Ala Thr

270 275 280 285

agt gtt ctt ttg aaa gat ggg atg act aga gct cct gtg gtt agg ttc 1033

Ser Val Leu Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe

290 295 300

agt act gcg aaa aga gca gct gat ctg aag ttt tat ttg gag gat cct 1081

Ser Thr Ala Lys Arg Ala Ala Asp Leu Lys Phe Tyr Leu Glu Asp Pro

305 310 315

gaa aat ttc gag acc ttg gct gtt gtt ttt aac aga tca agt aga ttt 1129

Glu Asp Phe Glu Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe

320 325 330

gct agg ctt caa ggt atc aaa tgt gca att gct ggg aag aat ctc tat 1177

Ala Arg Leu Glu Gly Ile Lys Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr

335 340 345

ttg aga ttc act tgc agt act ggt gat gct atg ggg atg aac atg gtt 1225

Leu Arg Phe Thr Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val

350 355 360 365

tcc aag gga gtc csa aac gta ttg gat ttc ctt caa act gat ttc tct 1273

Ser Lys Gly Val Glu Asn Val Leu Asp Phe Leu Glu Thr Asp Phe Ser

370 375 380

gac atg gat gtc att ggc atc tct gga aac ttc tgt tcg gac aaa aag 1321

Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys

385 390 395

cca gct gca gta aat tgg att gaa gga cgt ggc aaa tct gtt gtc tgc 1369

Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys

400 405 410

gag gcc atc att aag gat gat gtg gtg agg aag gtc ttg aag act ggt 1417

Glu Ala Ile Ile Lys Asp Asp Val Val Arg Arg Val Leu Lys Thr Gly

415 420 425

gtg gaa tct ctc gtg gag ctt aac atg ctt aag aac ctt act gga tct 1465

Val Glu Ser Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser

430 435 440 445

gct atg gct gga gct ctg ggt gga ttt aat gcc tat gcc ggt aac att 1513

Ala Met Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala Tyr Ala Gly Asn Ile

450 455 460

gtg tct gct gtc tac ata gct acc ggt caa gat ccg gct caa aat gtc 1561

Val Ser Ala Val Tyr Ile Ala Thr Gly Glu Asp Pro Ala Glu Asn Val

465 470 475

gag agc tct cat tgc ata acg atg atg gaa gct gtt aat gat ggc aag 1609

Glu Ser Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys

480 485 490

gac ctt cac atc tct gtt aca atg cct tcc atc gag gtt ggc act gtt 1657

Asp Lys His Ile Ser yal Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val

495 500 505

ggt ggt gga act cag ctt sca tct cag tca gcg tgt ttg aac ctg ctc 1705

Gly Gly Gly Thr Glu Leu Ala Ser Glu Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu

510 515 520 525

ggt gtc aag ggt gca agc aaa gaa tca cct gga gaa aac tct aga atg 1753

Gly Val Lys Gly Ala Ser Lys Glu Ser Pro Gly Glu Asn Ser Arg Met

530 535 540

ctt gca acc att gta gcc ggt gct gtc ctt gct ggg gag ctg tca ctc 1801

Leu Ala Thr Ile Val Ala Gly Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu

545 550 555

atg tct gca ctt gca gct ggg caa cta att aac agc cat atg aag tac 1849

Met Ser Ala Leu Ala Ala Gly Glu Leu Ile Asn Ser His Met Lys Tyr

560 565 570

aat agg tca aat aag gac gtg tcc aag gct tct tcc tag agaacacgta 1898

Asn Arg Ser Asn Lys Asp Val Ser Lys Ala Ser Ser *

575 580

atgatattga tgaggctttg tcaagcctgg aatttgtgta aacttgcaag ttccacggta 1958

taaatgtatc gaatcttaag gagacatcat ctctttgtaa taagctaagt agacgtaatc 2018

tctttgtatt ttgttctttt ctttcttact tttcatattt aaggaaaaaa aaaaacaagc 2078

catgtaatct gagaattggg taaaatgaca gaattgtaaa ttaacctctt ttaaaaaaaa 2138

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2160

<210>2

<211>585

<212>PRT

<213>南京椴(Tilia miqueliana Maxim)

<400>2

Met Glu Ala Arg Arg Arg Ser Ser Thu Lys Pro Ile Glu Ser Leu Lys

1 5 10 15

Thr Thr Lys Thr Val Ser Leu Glu Glu Asn Ser Thr Lys Ala Ser Asp

20 25 30

Ala Leu Pro Pro Pro Leu Tyr Ile Met Asn Ala Val Phe Phe Thr Leu

35 40 45

Phe Phe Ser Val Val Tyr Phe Leu Leu Ser Arg Trp Arg Glu Lys Ile

50 55 60

Arg Ile Ser Thr Pro Leu His Ile Val Thr Phe Ser Glu Ile Val Ala

65 70 75 80

Val Leu Ala Leu Val Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly

85 90 95

Ile Asp Phe Val Glu Ser Leu Ile Leu Arg Pro Ser Thr Arg Ile Trp

100 105 110

Asn Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asn Glu Val Leu Leu Leu Lys Glu

115 120 125

Asp Ser Arg Lys Val Pro Cys Gly Glu Ala Leu Asp Cys Ser Phe Pro

130 135 140

Pro Leu Pro Pro Ser Ala Pro Ile Val Thr Ala Arg Lys Val Phe Asp

145 150 155 160

Glu Lys Leu Val Glu Val Thr Thr Glu Glu Asp Glu Glu Ile Ile Lys

165 170 175

Ser Val Val Ala Gly Thr Thr Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys Leu

180 185 190

Gly Asp Cys Lys Arg Ala Thr Ala Ile Arg Arg Glu Ala Leu Glu Arg

195 200 205

Leu Thr Gly Lys Ser Leu Ser Gly Leu Pro Leu Asp Gly Phe Asp Tyr

210 215 220

Ala Ser Ile Leu Gly Glu Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr Val Glu

225 230 235 240

Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asn Gly Arg Glu Tyr

245 250 255

Thr Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Thr Leu Val Ala Ser Thr Asn

260 265 270

Arg Gly Cys Lys Ala Ile His Leu Ser Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu

275 280 285

Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ser Thr Ala

290 295 300

Lys Arg Ala Ala Asp Leu Lys Phe Tyr Leu Glu Asp Pro Glu Asp Phe

305 310 315 320

Glu Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu

325 330 335

Glu Gly Ile Lys Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Arg Phe

340 345 350

Thr Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly

355 360 365

Val Glu Asn Val Leu Asp Phe Leu Glu Thr Asp Phe Ser Asp Met Asp

370 375 380

Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala

385 390 395 400

Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Ile

405 410 415

Ile Lys Asp Asp Val Val Arg Arg Val Leu Lys Thr Gly Val Glu Ser

420 425 430

Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala Met Ala

435 440 445

Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala Tyr Ala Gly Asn Ile Val Ser Ala

450 455 460

Val Tyr Ile Ala Thr Gly Glu Asp Pro Ala Glu Asn Val Glu Ser Ser

465 470 475 480

His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Lys His

485 490 495

Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly

500 505 510

Thr Glu Leu Ala Ser Glu Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val Lys

515 520 525

Gly Ala Ser Lys Glu Ser Pro Gly Glu Asn Ser Arg Met Leu Ala Thr

530 535 540

Ile Val Ala Gly Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser Ala

545 550 555 560

Leu Ala Ala Gly Glu Leu Ile Asn Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser

565 570 575

Asn Lys Asp Val Ser Lys Ala Ser Ser *

580 585

Claims

1、一种南京椴tm-Hmgr蛋白编码序列，其特征在于，所分离出的DNA分子包括：编码具有南京椴tm-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第131-1888位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第131-1888位的核苷酸序列杂交。

2、根据权利要求1所述的南京椴tm-Hmgr蛋白编码序列，其特征是，分离出的南京椴tm-Hmgr蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

3、根据权利要求1或2所述的南京椴tm-Hmgr蛋白编码序列，其特征是，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第131-1888位的核苷酸序列。

4、根据权利要求1所述的南京椴tm-Hmgr蛋白编码序列，其特征是，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

5、根据权利要求4所述的南京椴tm-Hmgr蛋白编码序列，其特征是，所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。