CN1709912A

CN1709912A - 一种抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN1709912A
Application number: CN 200510064469
Authority: CN
Inventors: 田波; 高福; 倪凌
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2005-04-18
Filing date: 2005-04-18
Publication date: 2005-12-21
Anticipated expiration: 2025-04-18
Also published as: CN100339396C

Abstract

本发明公开了一种抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白，是所述囊膜病毒I类融合蛋白七肽重复序列HR1和HR2通过连接肽Linker1和Linker2连接得到的三螺旋蛋白或五螺旋蛋白；所述三螺旋蛋白的排列顺序为NH₂HR1－Linker1－HR2－linker2－HR1COOH或NH₂HR2－Linker2－HR1－linker1－HR2COOH；所述五螺旋蛋白的排列顺序为NH₂HR1－Linker1－HR2－linker2－HR1－Linker1－HR2－linker2－HR1COOH；所述连接肽Linker1和Linker2为5－7个氨基酸残基组成的多肽。以上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其衍生物为活性成分的药物将在预防和/或治疗具有I类融合蛋白的囊膜病毒感染中起到重要作用。

Description

一种抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

囊膜病毒侵染细胞时，首先必须将病毒的囊膜和宿主细胞膜融合才能将其自身的遗传物质释放到细胞中。囊膜病毒的膜融合过程是由病毒囊膜上的融合蛋自介导完成的。融合蛋白根据蛋白的结构特点可以分为I类融合蛋白和II类融合蛋白，其中含I类融合蛋白的病毒较为常见，包括正粘病毒，副粘病毒，冠状病毒，反转录病毒以及纤丝病毒等。I类融合蛋白在结构上都有两段称为七肽重复(heptad repeat，HR)序列的区域，N端的七肽重复序列为HR1，C端的七肽重复序列为HR2。这两段序列在I类融合蛋白发挥膜融合活性时起重要作用。在融合过程中，三个HR2以反向平行的方式附着到三个HR1所形成的中心三聚体的沟槽中，形成一种稳定的六螺旋束或称发卡三聚体的结构，这种结构的形成标志着膜融合的发生。目前许多研究还表明外源加入的HR1和HR2多肽都能竞争性地和病毒融合蛋白上的HR2或HR1结合从而阻断了病毒融合蛋白自身的HR1和HR2之间的相互作用，使得病毒融合蛋白的发卡三聚体结构不能形成，即抑制了病毒囊膜和细胞膜的融合，达到阻止病毒进入细胞的目的。囊膜病毒包括了许多引起人类重大疾病的病毒，如引起艾滋病的I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)，SARS冠状病毒(SARS-CoV)、人呼吸道合胞病毒(HRSV)、麻疹病毒(measles virus)和Menangle病毒等。目前，HIV-1融合蛋白gp41上的HR2多肽T-20已于2003年3月通过美国食品和药物检验局(FDA)“快通道”批准，成为第一个阻止HIV-1进入细胞的抗艾滋病的多肽药物，其治疗效果良好。然而这类多肽药物人工合成成本很高，在美国注射T-20一年要花费两万美元，在欧洲一年要花费两万五千美元，昂贵的药费使得T-20的应用受到了限制。因此，寻找一种具有这种多肽抑制活性，但制备成本低廉的药物是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其编码基因。

本发明所提供的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白，是所述囊膜病毒I类融合蛋白七肽重复(heptad repeat，HR)序列HR1和HR2通过连接肽Linker1和Linker2连接得到的三螺旋蛋白或五螺旋蛋白；

所述三螺旋蛋白的排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH(H121)或NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH(H212)；

所述五螺旋蛋白的排列顺序为NHHR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH(H12121)；

所述连接肽Linker1和Linker2为由5-7个氨基酸残基组成的多肽。

所述连接肽Linker1和Linker2由甘氨酸和丝氨酸酸残基组成。

所述Linker1和Linker2的氨基酸序列可以相同，也可以不同。

所述Linker1优选为具有序列表中序列1的氨基酸残基序列，所述Linker2优选为具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。

所述囊膜病毒为I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)；所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白(HIV-1-H121)是具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白质；所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白(HIV-1-H212)是具有序列表中序列4的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白质；所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白(HIV-1-H12121)是具有序列表中序列5的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白质。

所述囊膜病毒为人呼吸道合胞病毒(HRSV)；所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白(HRSV-H121)是具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白质；所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白(HRSV-H212)是具有序列表中序列7的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列7的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白质；所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白(HRSV-H12121)是具有序列表中序列8的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列8的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白质。

所述囊膜病毒为新城疫病毒(NDV)；所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白(NDV-H121)是具有序列表中序列9的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列9的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白质；所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2CO0H的三三螺旋蛋白(NDV-H212)是具有序列表中序列10的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列10的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白质；所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白(NDV-H12121)是具有序列表中序列11的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列11的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过十氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。如取代和/或缺失和/或添加所述连接肽Linker1和Linker2中的氨基酸残基。

上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白编码基因也属于本发明的保护范围。

当所述囊膜病毒为I型人免疫缺陷病毒时：

所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列12的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No：3蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID No：12限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列13的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No：4蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：13限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID No：13限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列14的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No：5蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：14限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID No：14限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

当所述囊膜病毒为人呼吸道合胞病毒时：

所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列15的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No：6蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：15限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID No：15限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列16的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No：7蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：16限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID No：16限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列17的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No：8蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：17限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID No：17限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

当所述囊膜病毒为新城疫病毒时：

所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列18的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No：9蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：18限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID No：18限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列19的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No：10蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：19限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID No：19限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为

NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列20的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No：11蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ IDNo：20限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID No：20限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

含有上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白编码基因的表达载体，细胞系和宿主菌也属于本发明的保护范围。

上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的衍生物也属于本发明的保护范围。

所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的衍生物可为所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白与GST形成的融合蛋白。

可利用任何一种可引导外源基因在大肠杆菌或酵母中表达的载体，将上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白编码基因或上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白衍生物的编码基因导入大肠杆菌或酵母中，筛选得到可表达本发明的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白或其衍生物的工程菌，培养工程菌，得到抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其衍生物。

本发明的另一个目的是提供一种抑制囊膜病毒感染的药物。

本发明所提供的抑制囊膜病毒感染的药物，它的活性成分是上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其衍生物。

其中，所述囊膜病毒为I型人免疫缺陷病毒或人呼吸道合胞病毒或新城疫病毒。所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的衍生物可为所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白与GST的融合蛋白。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明的药物可以制成注射液，药物可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为100-800mg/kg体重/天，疗程为10至20天。

本发明分别利用HIV-1，HRSV和NDV这三种病毒融合蛋白上的两段七肽重复(heptadrepeat，HR)序列1和2(HR1和HR2)设计并构建了两种三螺旋蛋白-HR121和HR212和一种五螺旋蛋白-HR12121。其中HR121和HR212的结构和在溶液中的构象示意图如图1a和图1b所示，HR121和HR212在溶液中一般聚集成三聚体，形成一种含有游离的HR1或HR2多肽的六螺旋束结构。HR121和HR212不但能形成六螺旋束结构，而且还含有游离的HR1或HR2。这种特性使得HR121具有类似HR1的活性，HR212类似于HR2的活性。但由于这些游离的HR1和HR2连接在六螺旋束结构上，所以稳定性很高。HR12121(图1C)和六螺旋束结构相比，少了一个HR2多肽。这种特性使得HR12121能特异性地结合一个HR2多肽，具有类似HR1的活性。这种设计策略也适用于其他具有I类融合蛋白的囊膜病毒。

实验证明，HIV-1的三种多螺旋蛋白均能够在纳摩尔浓度范围内阻断病毒进入细胞，其它二种病毒的三种多螺旋蛋白亦能在微摩尔浓度范围内阻断病毒进入细胞，这些结果说明人工构建的七肽重复序列多螺旋蛋白能够阻断囊膜病毒对细胞的感染。本发明的以上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其衍生物(如与GST所形成的融合蛋白)为活性成分的药物将在预防和/或治疗具有I类融合蛋白的囊膜病毒感染中起到重要作用。

本发明的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白在大肠杆菌和酵母中即可表达，且表达量较高，在大肠杆菌中的表达量可达50mg/L培养液。其制备成本远低于化学合成的HR多肽且具有更高的稳定性。

附图说明

图1A为多螺旋蛋白HR12121，HR121和HR212的结构示意图

图1B为多螺旋蛋白HR121和HR212在溶液中的构象示意图

图1C为多螺旋蛋白HR12121在溶液中的结构示意图

图2为HIV-1的HR12121，HR121和HR212基因的引物设计

图3为利用搭桥PCR方法扩增HIV-1的HR12121、HR121和HR212基因的过程示意图

图4为HIV-1-HR12121、HIV-1-HR121和HIV-1-HR212抑制HIV-1侵染细胞活性的测定曲线

图5A-图5F为HRSV的多螺旋蛋白抑制HRSV侵染细胞活性的测定照片

图6A为NDV-HR212或NDV-GST-HR212在高浓度时能够完全抑制NDV F48E9强毒株对Hela细胞的感染照片

图6B为NDV-HR121或NDV-HR12121不能抑制NDV F48E9强毒株对Hela细胞的感染照片

图6C为NDV-HR121，NDV-HR212或NDV-HR12121在高浓度时抑制NDV clone30感染Hela细胞的照片

图6D为未加任何蛋白样品处理的NDV F48E9所介导形成的合胞体照片

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、HIV-1多螺旋蛋白的构建及融合抑制活性的测定

1、HIV-1多螺旋蛋白的表达

(1)HIV-1多螺旋蛋白编码基因的构建

根据HIV-1的HR1和HR2的氨基酸序列：

HR1：SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQAR

HR2：WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL

设计了如图2所示的10条引物，R1，P1，A2，B1，B2，A1，P2，R2，D1和C2用于构建三螺旋蛋白HR121和HR212的基因，以及五螺旋蛋白HR12121基因。其中R1和R2分别是从长引物P1和P2上截取的与HR基因无关的序列。

P1：5’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCAGAATTCTCTGGTATAGTGCAGCAG3’

A2：5’ACCTCCAGAGGAACCTCTTGCCTGGAGCTGCTT3’

B1：5’GGTTCCTCTGGAGGTTGGATGGAGTGGGACAGA3’

B2：5’TCCACCAGAACCACCCAATAATTCTTGTTCATT3’

A1：5’GGTGGTTCTGGTGGATCTGGTATAGTGCAGCAG3’

P2：5’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTATCTTGCCTGGAGCTGCTT3’

D1：5’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCAGAATTCTGGATGGAGTGGGACAGA3’

C2：5’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTACAATAATTCTTGTTCATT3’

R1：5’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCA3’

R2：5’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCA3’

如图3所示，利用搭桥PCR方法扩增HR121、HR212和HR12121基因。以P1、A2为引物，编码HIV-1融合蛋白env的质粒pMT3-HXB-2(该质粒的构建参照文献Ferrer，etal.Nature structural biology，1999(6)：953-960)为模板扩增得到R1HR1linker1基因①；以B1、B2为引物，pMT3-HXB-2为模板扩增得到linker1HR2linker2基因②；以A1、A2为引物pMT3-HXB-2为模板扩增得到linker2HR1linker1基因③；以A1、P2为引物，pMT3-HXB-2为模板扩增得到linker2HR1R2基因④；以B1、C2为引物，pMT3-HXB-2为模板扩增得到linker1HR2R2基因⑤；以D1、B2为引物，pMT3-HXB-2为模板扩增得到R1HR2linker2基因⑥；以R1、B2为引物，R1HR1linker1①和linker1HR2linker2②为模板扩增得到R1HR1linker1HR2linker 2⑦；以B1、R2为引物，linker1HR2linker2②和linker2HR1R2④为模板扩增得到linker1HR2linker2HR1R2⑧；以A1、R2为引物，linker2HR1linker1③和linker1HR2R2⑤为模板扩增得到linker2HR1linker1HR2R2⑨；以R1、A2为引物，R1HR1linker1HR2linker2⑦和linker2HR1linker1③为模板扩增得到R1HR1linker1HR2linker2HR1linker1⑩；以R1、R2为引物，R1HR2linker2⑥和linker2HR1linker1HR2R2⑨为模板扩增得到R1HR2linker2HR1linker1HR2R2，即HR212基因片段；以R1、R2为引物，R1HR1linker1①和1inker1HR2linker2HR1R2⑧为模板扩增得到R1HR1linker1HR2linker2HR1R2，即HR121基因片段。以R1、R2为引物，R1HR1linker1HR2linker2HR1linkerl⑩和linker1HR2linker2HR1R2⑧为模板扩增得到R1HR1linker1HR2linker2HR1linker1HR2linker2HR1R2，即HR12121基因片段，在这一PCR反应中有许多非特异产物，同样根据目的产物的分子量用琼脂糖电泳回收目的片段。

其中，上述PCR扩增的温度条件为94℃，3分钟，一个循环。94℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，2分钟，30个循环。72℃，10分钟，一个循环。

将所构建的HR121，HR212，HR12121基因片段用EcoR I和Xho I双酶切后无水乙醇沉淀回收，向酶切产物中加入1/10酶切产物体积的3mol/L醋酸钠，2.5倍酶切产物体积的无水乙醇，-20℃沉淀30-60分钟，12000rpm离心10分钟，再用75％乙醇洗涤一次，12000rpm离心10分钟，自然干燥，然后与相同的双酶切后琼脂糖电泳回收的pGEX-6p-1(Amersham Biosciences)载体连接，在16℃连接12h后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；随机挑选转化菌单菌落接种液体培养基，提取质粒用EcoR I和Xho I双酶切鉴定，能够获得与目的片段分子量一致的质粒为候选阳性克隆，对所得候选阳性质粒进行DNA测序筛选出阳性克隆：含有HR121基因的pGEX-6p-1/HIV-1-HR121，该HR121基因具有序列表中序列12的核苷酸序列，编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的三螺旋蛋白HIV-1-HR121；含有HR212基因的pGEX-6p-1/HIV-1-HR212，该HR212基因具有序列表中序列13的核苷酸序列，编码具有序列表中序列4的氨基酸残基序列的三螺旋蛋白HIV-1-HR212；含有HR12121基因的pGEX-6p-1/HIV-1-HR12121，该HR12121基因具有序列表中序列14的核苷酸序列，编码具有序列表中序列5的氨基酸残基序列的五螺旋蛋白HIV-1-HR12121。

按照常规方法将HIV-1的HR1和HR2的基因分别克隆到pET-30a的BamH I和Xho I多克隆位点间，筛选得到含有HR1基因的质粒pET-HIV-1-HR1和含有HR2基因的质粒pET-HIV-1-HR2。

(2)多螺旋蛋白HIV-1-HR121，HIV-1-HR212，HIV-1-HR12121与GST形成的融合蛋白的表达

将经DNA测序的pGEX-6p-1/HIV-1-HR121，pGEX-6p-1/HIV-1-HR212和pGEX-6p-1/HIV-1-HR12121分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆，接种含氨卞青霉素(100μg/ml)的2×YT液体培养基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，水1000ml)中，37℃摇振培养12h作为种子液；将种子液按1/100(V/V)接种量接种新鲜2×YT液体培养基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，水1000ml)，37℃摇振培养至OD600为0.8-1.0，加诱导物IPTG至终浓度1mM，37℃继续培养4小时；5000rpm离心15分钟收集菌体，用PBS缓冲液(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)悬浮菌体，超声波裂解菌体，超声波裂解后加入终浓度为1％的TritonX-100，冰浴30min，12000rpm，4℃离心15min，取上清；将超声波裂解上清通过经PBS平衡的谷胱甘肽4B亲和层析柱，再用PBS洗涤亲和柱至少十个柱体积；用至少三个柱体积的还原型谷胱甘肽reduced glutathione溶液(10mM还原型谷胱甘肽，50mMTris-HCl pH8.0)洗脱，收集洗脱液得到GST-HR蛋白，经12％SDS-PAGE鉴定所得蛋白分子量与预期相符，其中GST-HIV-1-HR121为39kDa，GST-HIV-1-HR212为39kDa，GST-HIV-1-HR12121为48kDa；用Superdex G50脱盐柱(Pharmacia公司)将GST-HR溶解在酶切缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.0；150mM NaCl；1mM DTT；1mM EDTA，pH8.0)，加入过量的PreScission^TM蛋白酶(Pharmacia)5℃酶切16h；酶切产物再用谷胱甘肽4B亲和层析柱亲和除去酶切下的GST和PreScission^TM，收集穿透液得到HIV-1-HR121或HIV-1-HR212或HIV-1-H12121，用截流分子量为10kDa的超滤管浓缩至适当浓度，利用分子筛进一步纯化，-70℃冻存备用。所用蛋白样品均用12％SDS-PAGE鉴定，浓度用Bio-Rad DC蛋白试剂盒来确定。结果表明HIV-1-HR121的表达量为40mg/L培养液；HIV-1-HR212的表达量为50mg/L培养液；HIV-1-H12121的表达量为40mg/L培养液。

pET-HIV-1-HR1和pET-HIV-1-HR2分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆，接种含硫酸卡那霉素(100μg/m1)的2×YT液体培养基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，水1000ml)中，37℃摇振培养12h作为种子液；将种子液按1/100(V/V)接种量接种新鲜2×YT液体培养基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，水1000ml)，37℃摇振培养至0D600为0.8-1.0，加诱导物IPTG至终浓度1mM，37℃继续培养4小时；5000rpm离心15分钟收集菌体，用PBS缓冲液(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)悬浮菌体，超声波裂解菌体，超声波裂解后加入终浓度为1％的TritonX-100，冰浴30min，12000rpm，4℃离心15min，取上清，按照文献(Wang et al.Biochemical and Biophysical Research Communications，302(2003)：469-475)的方法纯化，得到在HIV-1的HR1的N端添加了pET-30a载体上的50个氨基酸的HIV-1-HR1-30a和HR2的N端添加了pET-30a载体上的50个氨基酸残基的HIV-1-HR2-30a(HR1和HR2在大肠杆菌中以His-tag融合的方式表达，在它们的N端均添加了pET-30a载体上的50个氨基酸，分别命名为HIV-1-HR1-30a和HIV-1-HR2-30a)。

将经分子筛纯化的HR121、HR212或HR12121蛋白用PBS缓冲液将蛋白浓度调整到约10μM。用Jasco J-715分光光度计进行圆二色谱分析，结果表明这三种多螺旋蛋白均富含α螺旋结构。

2、HIV-1七肽重复序列的多螺旋蛋白HIV-1-HR121，HIV-1-HR212和HIV-1-H12121体外结合活性的测定

分别将亲和层析纯化的GST-HIV-1-HR121或GST-HIV-1-H12121蛋白与纯化的HIV-1的HIV-1-HR2-30a蛋白混合，GST-HIV-1-HR212蛋白与HIV-1的HIV-1-HR1-30a蛋白混合后，加入经PBS平衡的谷胱甘肽4B亲和填料，轻轻震荡混匀，室温作用1小时，中间不断震荡以防止填料沉淀；500g离心15分钟，弃上清，填料用PBS至少洗涤三次，最后用二倍填料体积的还原型谷胱甘肽溶液(10mM还原型谷胱甘肽，50mM Tris-HCl pH8.0)洗涤填料，500g离心15分钟，取上清进行12％SDS-PAGE分析，同时设阴性对照(将GST-HIV-1-HR121蛋白与HIV-1-HR1-30a混合，GST-HIV-1-H12121蛋白与HIV-1-HR1-30a混合，GST-HIV-1-H212蛋白与HIV-1-HR2-30a混合，进行上述相同处理，作为阴性对照)。结果表明GST-HIV-1-HR121或GST-HIV-1-H12121能特异性地结合HIV-1-HR2-30a蛋白，而GST-HIV-1-HR212则能特异性地结合HIV-1-HR1-30a蛋白，说明GST-HIV-1-HR121或GST-HIV-1-H12121能特异性地结合HR2，而GST-HIV-1-HR212则能特异性地结合HR1。

3、HIV-1七肽重复序列的多螺旋蛋白及其衍生物抑制HIV-1假病毒感染细胞抑制活性的测定

接毒前24小时，消化GHOST-CXCR4细胞(Mckesson BioServices Corporation)并传至24孔板中。将纯化得到的HIV-1-HR121，HIV-1-HR212和HIV-1-HR12121分别溶于PBS缓冲液中，过滤除菌，5倍梯度稀释后分别与等量的HIV-1假病毒(HIV-1假病毒的制备参照文献Deng，et al.Nature，388(1997)：296-300)混合。同时以GST作为阴性对照，以HIV-1-HR2-30a为阳性对照。然后将这种蛋白病毒混合物分别加入到细胞中(80％铺满)，待病毒吸附细胞2h后，吸弃病毒和蛋白的混合物，加入新鲜培养基(DMEM，90％；胎牛血清，10％；G418，500μg/ml；潮霉素，100μg/ml；嘌呤霉素，1μg/ml。其中的百分含量为质量百分含量)继续培养，每个稀释度做8个重复，48-72后收获并裂解细胞，通过测定细胞上清中萤火虫荧光酶的活性来计算这三种多螺旋蛋白阻断HIV-1gp41介导的膜融合。结果表明，HIV-1的三种多螺旋蛋白均能够在nM浓度范围内阻断病毒进入细胞。其中HIV-1-HR121、HIV-1-HR212和HIV-1-HR12121的抑制活性如图4所示，HIV-1多螺旋蛋白HIV-1-HR121，HIV-1-HR212和HIV-1-HR12121的半数抑制浓度分别是16.2±2.76，2.3±0.62和7.2±1.6nmol/L。

实施例2、HRSV七肽重复序列的多螺旋蛋白的构建及融合抑制活性的测定

1、HRSV多螺旋蛋白的表达

(1)HRSV多螺旋蛋白编码基因的构建

根据HRSV的HR1和HR2的氨基酸序列：

HR1：KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLHLKNYIDKQFL

HR2：SDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTN

设计如下10条引物，用于构建三螺旋蛋白HRSV-HR121和HRSV-HR212的基因，以及五螺旋蛋白HRSV-HR12121的基因。其中R1和R2分别是从长引物P1和P2上截取的与HR基因无关的序列。

R1：5’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCA3’

R2：5’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCA3’

P1：5’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCAGAATTCAAGGTCCTACACCTAGAA3’

P2：5’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTATAAGAACTGTTTATC3’

A1：5’GGTGGTTCTGGTGGA AAGGTCCTACACCTAGAA3’

A2：5’ACCTCCAGAGGAACCTAAGAACTGTTTATC3’

B1：5’GGTTCCTCTGGAGGTTCTGATGAATTTGATGCA3’

B2：5’TCCACCAGAACCACCATTTGTGGTGGATTTACC3’

D1：5’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCATCTGATGAATTTGATGCA3’

C2：5’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTAATTTGTGGTGGATTTACC3’

按照实施例1中的PCR扩增HR121，HR212，HR12121基因片段的方法扩增得到HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121基因片段。其中，扩增R1HR1linker1基因①，linker1HR2linker2基因②，linker2HR1linker1基因③，linker2HR1R2基因④，linker1HR2R2基因⑤，R1HR2linker2基因⑥的模板均为编码HRSV融合蛋白F的质粒pTZ18R-F(该质粒的构建方法参照文献孙晓鸥等.中华微生物学与免疫学杂志，1998，18：295-300)。

将所构建的HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121基因片段用EcoR I和Xho I双酶切后无水乙醇沉淀回收，向酶切产物中加入1/10酶切产物体积的3mol/L醋酸钠，2.5倍酶切产物体积的无水乙醇，-20℃沉淀30-60分钟，12000rpm离心10分钟，再用75％乙醇洗涤一次，12000rpm离心10分钟，自然干燥，然后与相同的双酶切后琼脂糖电泳回收的pGEX-6p-1载体连接，在16℃连接12h后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；随机挑选转化菌单菌落接种液体培养基，提取质粒用EcoR I和Xho I双酶切鉴定，能够获得与目的片段分子量一致的质粒为候选阳性克隆，对所得候选阳性质粒进行DNA测序筛选出阳性克隆：含有HRSV-HR121基因的pGEX-6p-1/HRSV-HR121，该HRSV-HR121基因具有序列表中序列15的核苷酸序列，编码具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的三螺旋蛋白HRSV-HR121；含有HRSV-HR212基因的pGEX-6p-1/HRSV-HR212，该HRSV-HR212基因具有序列表中序列16的核苷酸序列，编码具有序列表中序列7的氨基酸残基序列的三螺旋蛋白HRSV-HR212；含有HRSV-HR12121基因的pGEX-6p-1/HRSV-HR12121，该HRSV-HR12121基因具有序列表中序列17的核苷酸序列，编码具有序列表中序列8的氨基酸残基序列的五螺旋蛋白HRSV-HR12121。

(2)GST融合的HRSV多螺旋蛋白的表达和HRSV多螺旋蛋白的纯化

HRSV多螺旋蛋白HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121的表达纯化方法同实施例1的步骤1(2)。经12％SDS-PAGE鉴定所得蛋白分子量与预期相符，其中GST-HRSV-HR121为43kDa，GST-HRSV-HR212为42kDa，GST-HRSV-HR12121为54kDa。用PreScission^TM蛋白酶切除GST，得到HRSV-HR121或HRSV-HR212或HRSV-HR12121。结果表明HRSV-HR121的表达量为5mg/L培养液；HRSV-HR212的表达量为50mg/L培养液；HRSV-H12121的表达量为10mg/L培养液。

Jasco J-715分光光度计的圆二色谱分析结果表明这三种多螺旋蛋白均富含α螺旋结构。

2、HRSV多螺旋蛋白及其衍生物体外结合活性的测定

分别将亲和层析纯化的GST-HRSV-HR121或GST-HRSV-H12121蛋白与纯化的HRSV的HR2-30a蛋白(蛋白的构建和纯化参照文献Wang et al.Biochemical and BiophysicalResearch Communications，302(2003)：469-475)混合，GST-HRSV-HR212蛋白与HRSV的HR1-30a蛋白(蛋白的构建和纯化参照文献Wang et al.Biochemical and BiophysicalResearch Communications，302(2003)：469-475)混合；同时设阴性对照(将GST-HRSV-HR121蛋白与HRSV的HR1-30a混合，GST-HRSV-H12121蛋白与HRSV的HR1-30a混合，GST-HRSV-H212蛋白与HRSV的HR2-30a混合，作为阴性对照)按照实施例1步骤2的方法测定它们的体外结合活性，结果表明GST-HRSV-HR121或GST-HRSV-H12121能特异性地结合HRSV的HR2-30a蛋白，而GST-HRSV-HR212则能特异性地结合HRSV的HR1-30a蛋白，说明GST-HRSV-HR121或GST-HRSV-H12121能特异性地结合HRSV的HR2，而GST-HRSV-HR212则能特异性地结合HRSV的HR1。

3、HRSV七肽重复序列的多螺旋蛋白及其衍生物抑制HRSV感染Hep-2细胞抑制活性的测定

接毒前24小时，消化Hep-2细胞(人喉上皮细胞癌细胞系)并传至24孔板中。将纯化得到的HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121分别溶解于PBS缓冲液中，过滤除菌；将HRSV的HR2-30a和HRSV的HR1-30a也分别溶解于PBS缓冲液中，过滤除菌。分别将HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121倍比稀释后与100倍空斑形成单位(PFU)的HRSV B65株(北京首都儿科研究所)混合。将等摩尔浓度(均为10μmol/L)的HRSV-HR121和HRSV的HR2-30a的混合物、等摩尔浓度(均为10μmol/L)的HRSV-HR12121和HRSV的HR2-30a的混合物、等摩尔浓度(均为10μmol/L)的HRSV-HR212和HRSV的HR1-30a的混合物分别与100PFU的HRSV B65株混合。同时以GST作为阴性对照。然后将这种蛋白病毒混合物加入到细胞中(80％铺满)，待病毒吸附细胞2h后，吸弃病毒和蛋白的混合物，加入新鲜培养基(DMEM，90％(质量百分含量)；胎牛血清，10％(质量百分含量))继续培养，每个稀释度做8个重复，72h后结晶紫染色观察，通过合胞体的数量计算其抑制活性。计算这三种多螺旋蛋白阻断HRSV F蛋白介导的膜融合。结果表明三种多螺旋蛋白能够在μmol/L浓度水平抑制HRSV B65株进入Hep-2细胞。HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121的半数抑制浓度分别是3.74μmol/L、7.95μmol/L和3.36μmol/L。

等摩尔浓度的HRSV-HR121和HRSV的HR2-30a的混合物、等摩尔浓度的HRSV-HR12121和HRSV的HR2-30a的混合物、等摩尔浓度的HRSV-HR212和HRSV的HR1-30a的混合物均不能抑制HRSV B65株进入Hep-2细胞；各种浓度的GST均不能抑制HRSV B65株进入Hep-2细胞。其中，作为空白对照的未接种HRSV的Hep-2细胞如图5A所示；HRSV-HR121、HRSV-HR212和HRSV-HR12121抑制合胞体的形成的结果如图5B所示；作为阴性对照的GST的抑制活性结果如图5C所示，它不能抑制合胞体的形成；等摩尔浓度的HRSV-HR121和HRSV的HR2-30a的混合物或HRSV-HR12121和HRSV的HR2-30a的混合物不能抑制HRSV侵染细胞(图5D)；等摩尔的HRSV-HR212和HRSV的HR1-30a的混合物也不能抑制合胞体的形成(图5E)；未经上述任何蛋白处理的HRSV侵染Hep-2细胞后所形成的合胞体如图5F所示。

实施例3、NDV七肽重复序列的多螺旋蛋白的构建及融合抑制活性的测定

1、NDV多螺旋蛋白的表达

(1)NDV多螺旋蛋白编码基因的构建

根据NDV的HR1和HR2的氨基酸序列：

HR1：ALIQANQNAANILRLKESIAATNEAVHEVTDGLSQLAV

HR2：LGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTGTSALI

设计如下10条引物，用于构建三螺旋蛋白NDV-HR121和NDV-HR212的基因，以及五螺旋蛋白NDV-HR12121的基因。其中R1和R2分别是从长引物P1和P2上截取的与HR基因无关的序列。

P1：5’CTG GGT ACC TTG GAA GTT CTA TTC CAG GGT CCA GGA TCC ATG GCT CTG ATACAA GCC AAC CA 3’

R1：5’CTG GGT ACC TTG GAA GTT CTATTC CAG GGT CCA 3’

A2：5’ACC TCC TCG TCC ACC AGA CAC TGC TAG TTG CGA TAA TC 3’

B1：5’TCT GGT GGA CGA GGA GGT CTT GGG AAT GTC AAC AAC CTC 3’

B2：5’TAT CAG AGC TCC GCC AGA ACC GCC AAT GAG AGC AGA CGT 3’

A1：5’CT CTC ATT GGC GGT TCT GGC GGA GCT CTG ATA CAA GCC AA 3’

C2：5’TGG TGA TGG TGG TGA TGC TCG AGT CA AAT GAG AGC AGA CGT GCC G 3’

D1：5’CTG GGT ACC TTG GAA GTT CTA TTC CAG GGT CCA GGA TCC ATG GGC AAT CTCAAT ATC TCA ACT GAA C 3’

P2：5’TGG TGA TGG TGG TGA TGC TCG AGT CA AAT GAG AGC AGA CGT GCC G 3’

R2：5’TGG TGA TGG TGG TGA TGC TCG AGT CA 3’

按照实施例1中的PCR扩增HR121，HR212，HR12121基因片段的方法扩增得到NDV-HR121，NDV-HR212和NDV-HR12121基因片段。其中，扩增R1HR1linker1基因①，linker1HR2linker2基因②，linker2HR1linker1基因③，linker2HR1R2基因④，linker1HR2R2基因⑤，R1HR2linker2基因⑥的模板均为编码NDV融合蛋白F的质粒pGEM-5f(该质粒的构建参照文献，梁荣等.中国预防兽医学报，2000(5)：351-354)

将所构建的NDV-HR121，NDV-HR212和NDV-HR12121基因片段用EcoR I和Xho I双酶切后无水乙醇沉淀回收，向酶切产物中加入1/10酶切产物体积的3mol/L醋酸钠，2.5倍酶切产物体积的无水乙醇，-20℃沉淀30-60分钟，12000rpm离心10分钟，再用75％乙醇洗涤一次，12000rpm离心10分钟，自然干燥，然后与相同的双酶切后琼脂糖电泳回收的pGEX-6p-1载体连接，在16℃连接12h后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；随机挑选转化菌单菌落接种液体培养基，提取质粒用EcoR I和Xho I双酶切鉴定，能够获得与目的片段分子量一致的质粒为候选阳性克隆，对所得候选阳性质粒进行DNA测序筛选出阳性克隆：含有NDV-HR121基因的pGEX-6p-1/NDV-HR121，该NDV-HR121基因具有序列表中序列18的核苷酸序列，编码具有序列表中序列9的氨基酸残基序列的三螺旋蛋白NDV-HR121；含有NDV-HR212基因的pGEX-6p-1/NDV-HR212，该NDV-HR212基因具有序列表中序列19的核苷酸序列，编码具有序列表中序列10的氨基酸残基序列的三螺旋蛋白NDV-HR212；含有NDV-HR12121基因的pGEX-6p-1/NDV-HR12121，该NDV-HR12121基因具有序列表中序列20的核苷酸序列，编码具有序列表中序列11的氨基酸残基序列的五螺旋蛋白NDV-HR12121。

按照常规方法将NDV的HR1和HR2的基因分别克隆到pET-30a的BamH I和Xho I多克隆位点间，筛选得到含有HR1基因的质粒pET-NDV-HR1和含有HR2基因的质粒pET-NDV-HR2。

(2)NDV多螺旋蛋白及其衍生物的表达

NDV多螺旋蛋白NDV-HR121，NDV-HR212和NDV-HR12121的表达纯化方法同实施例1的步骤1(2)。经12％SDS-PAGE鉴定所得蛋白分子量与预期相符，其中GST-NDV-HR121为39kDa，GST-NDV-HR212为39kDa，GST-NDV-HR12121为47kDa。用PreScission^TM蛋白酶切除GST，得到NDV-HR121或NDV-HR212或NDV-H12121。NDV-HR121的表达量为5mg/L培养液；NDV-HR212的表达量为50mg/L培养液；NDV-H12121的表达量为10mg/L培养液。

按照实施例1中HIV-1-HR1-30a和HIV-1-HR2-30a的表达纯化方法，将pET-NDV-HR1和pET-NDV-HR2分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到在NDV的HR1的N端添加了pET-30a载体上的50个氨基酸的NDV-HR1-30a和HR2的N端添加了pET-30a载体上的50个氨基酸残基的NDV-HR2-30a。

2、NDV多螺旋蛋白及其衍生物体外结合活性的测定

分别将亲和层析纯化的GST-NDV-HR121或GST-NDV-H12121蛋白与纯化的NDV-HR2-30a蛋白混合，GST-NDV-HR212蛋白与NDV-HR1-30a蛋白混合；同时设阴性对照(将GST-NDV-HR121蛋白与NDV-HR1-30a混合，GST-NDV-H12121蛋白与NDV-HR1-30a混合，GST-NDV-H212蛋白与NDV-HR2-30a混合，作为阴性对照)，按照实施例1步骤2的方法测定它们的体外结合活性，结果表明GST-NDV-HR121或GST-NDV-H12121能特异性地结合NDV-HR2-30a蛋白，而GST-NDV-HR212则能特异性地结合NDV-HR1-30a蛋白，这说明GST-NDV-HR121或GST-NDV-H12121能特异性地结合NDV的HR2，而GST-NDV-HR212则能特异性地结合NDV的HR1。

3、NDV七肽重复序列的多螺旋蛋白及其衍生物抑制NDV感染Hela细胞抑制活性的测定

(1)NDV F48E9合胞体形成抑制试验

NDV F48E9(从中国兽药监察所购买)接种9-10日龄SPF鸡胚制备新鲜的病毒液，将病毒接种在48孔板上生长成单层的Hela T4细胞，接种量为100PFU，同时分别加入倍比稀释的NDV-HR212、GST-NDV-HR212、NDV-HR121或NDV-H12121蛋白(均50μl/孔)，以GST蛋白作为对照，37℃，CO₂温箱孵育1h，吸弃病毒和蛋白的混合液，加入0.3ml含2％(V/V)FCS的DMEM营养液，继续培养12h后用0.5％结晶紫甲醇溶液染色1-2min，水洗后镜检，计算每孔合胞体的数目，每个试验每次做6孔重复，至少重复3次。结果表明NDV-HR212或NDV-GST-HR212在高浓度(＞25μmol/L)时能够完全抑制NDV F48E9强毒株对Hela细胞的感染(图6A)，而NDV-HR121或NDV-HR12121则没有抑制活性(图6B)。作为空白对照，未加任何蛋白样品处理的NDV F48E9所介导形成的合胞体如图6D所示。

(2)NDV clone30合胞体形成抑制试验

NDV clone30(从中国兽药监察所购买)接种9-10日龄SPF鸡胚制备新鲜的病毒液，将病毒接种在24孔细胞培养板生长成单层的Hela T4细胞，接种量为100PFU，37℃作用1h后吸弃病毒，加入含2％(V/V)FCS的DMEM继续培养12h，同时分别加入倍比稀释的NDV-HR212、NDV-HR212或NDV-H12121蛋白，以GST蛋白对照，每隔3h换一次含蛋白样品(NDV-HR121、NDV-HR212、NDV-H12121或GST蛋白)的DMEM维持液，感染12h后用无血清DMEM洗涤三次，加入含10ug/ml乙酰化胰蛋白酶的无血清DMEM室温作用10min后用含20ug/ml胰蛋白酶抑制剂的DMEM洗涤三次，再加入含蛋白样品(NDV-HR212、NDV-HR212、NDV-H12121或GST蛋白)的DMEM维持液继续培养12h后结晶紫染色并计算每孔合胞体的数目。结果表明NDV-HR121，NDV-HR212，NDV-HR12121分别在50,60和70μmol/L浓度时，能够完全抑制合胞体的形成(图6C)。

上述结果说明NDV-HR212能够抑制NDV强毒株的细胞融合，而NDV-HR121NDV-HR12121则没有抑制NDV强毒株的细胞融合活性(NDV的HR1多肽本身不具有抑制活性)；但NDV-HR212或NDV-HR121或NDV-HR12121如果在F0蛋白裂解前加入都能够抑制NDV弱毒株介导的细胞融合。

序列表

<160>20

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Gly Ser Ser Gly Gly

1 5

<210>2

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Gly Gly Ser Gly Gly

1 5

<210>3

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala

1 5 10 15

Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln

20 25 30

Ala Arg Gly Ser Ser Gly Gly Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn

35 40 45

Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu G1u Ser Gln Asn Gln

50 55 60

Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

65 70 75 80

Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln

85 90 95

His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg

100 105 110

<210>4

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His

l 5 10 15

Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu

20 25 30

Leu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn

35 40 45

Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val

50 55 60

Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Gly Ser Ser Gly Gly Trp Met

65 70 75 80

Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu

85 90 95

Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu

100 105 110

<210> 5

<211>190

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala

1 5 10 15

Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln

20 25 30

Ala Arg Gly Ser Ser Gly Gly Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn

35 40 45

Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln

50 55 60

Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

65 70 75 80

Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln

85 90 95

His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg

100 105 110

Gly Ser Ser Gly Gly Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr

115 120 125

Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu

130 135 140

Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ile Val

145 150 155 160

Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu

165 l70 175

Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg

180 185 190

<210>6

<211>148

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu

1 5 10 15

Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val

20 25 30

Leu Thr Ser Lys Val Leu His Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Phe

35 40 45

Leu Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln

50 55 60

Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp

65 70 75 80

Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Gly Gly

85 90 95

Ser Gly Gly Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys

100 105 110

Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly

115 120 125

Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu His Leu Lys Asn Tyr Ile Asp

130 135 140

Lys Gln Phe Leu

145

<210>7

<211>139

<212>PRT

<213>工序列

<220>

<223>

<400>7

Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn

1 5 10 15

Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val

20 25 30

Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Gly Gly Ser Gly Gly Lys Val Leu

35 40 45

His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr

50 55 60

Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser

65 70 75 80

Lys Val Leu His Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Phe Leu Gly Ser

85 90 95

Ser Gly Gly Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu

100 105 110

Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu

115 120 125

His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn

130 135

<210>8

<211>247

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu

1 5 10 15

Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val

20 25 30

Leu Thr Ser Lys Val Leu His Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Phe

35 40 45

Leu Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln

50 55 60

Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp

65 70 75 80

Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Gly Gly

85 90 95

Ser Gly Gly Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys

100 105 110

Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly

115 120 125

Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu His Leu Lys Asn Tyr Ile Asp

130 135 140

Lys Gln Phe Leu Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser

145 150 155 160

Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg

165 170 175

Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr

180 185 190

Asn Gly Gly Ser Gly Gly Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn

195 200 205

Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu

210 215 220

Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu His Leu Lys Asn

225 230 235 240

Tyr Ile Asp Lys Gln Phe Leu

245

<210>9

<211>122

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys

1 5 10 15

Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly

20 25 30

Leu Ser Gln Leu Ala Val Gly Ser Ser Gly Gly Leu Gly Asn Val Asn

35 40 45

Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Lys Leu Glu Glu Ser Asn Ser Lys

50 55 60

Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr Gly Thr Ser Ala Leu Ile Gly

65 70 75 80

Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile

85 90 95

Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val His Glu

100 105 110

Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val

115 120

<210>10

<211>120

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Lys Leu Glu

1 5 10 15

Glu Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr Gly Thr

20 25 30

Ser Ala Leu Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln

35 40 45

Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn

50 55 60

Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val Gly

65 70 75 80

Ser Ser Gly Gly Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu

85 90 95

Asp Lys Leu Glu Glu Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys

100 105 110

Leu Thr Gly Thr Ser Ala Leu Ile

115 120

<210>11

<211>206

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys

1 5 10 15

Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly

20 25 30

Leu Ser Gln Leu Ala Val Gly Ser Ser Gly Gly Leu Gly Asn Val Asn

35 40 45

Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Lys Leu Glu Glu Ser Asn Ser Lys

50 55 60

Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr Gly Thr Ser Ala Leu Ile Gly

65 70 75 80

Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile

85 90 95

Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val His Glu

100 105 110

Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val Gly Ser Ser Gly Gly Leu

115 120 125

Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Lys Leu Glu Glu

130 135 140

Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr Gly Thr Ser

145 150 155 160

Ala Leu Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn

165 170 175

Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu

180 185 190

Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val

195 200 205

<210>12

<211>339

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg 60

ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaggttcctc tggaggttgg 120

atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa 180

tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg gtggttctgg tggatctggt 240

atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg gctattgagg cgcaacagca tctgttgcaa 300

ctcacagtct ggggcatcaa gcagctccag gcaagatag 339

<210>13

<211>339

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

tggatggagt gggacagaga aattaacaat tacacaagct taatacactc cttaattgaa 60

gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa caagaattat tgggtggttc tggtggatct 120

ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg 180

caactcacag tctggggcat caagcagctc caggcaagag gttcctctgg aggttggatg 240

gagtgggaca gagaaattaa caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg 300

caaaaccagc aagaaaagaa tgaacaagaa ttattgtag 339

<210>14

<211>573

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg 60

ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaggttcctc tggaggttgg 120

atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa 180

tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg gtggttctgg tggatctggt 240

atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg gctattgagg cgcaacagca tctgttgcaa 300

ctcacagtct ggggcatcaa gcagctccag gcaagaggat cctctggagg ttggatggag 360

tgggacagag aaattaacaa ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa 420

aaccagcaag aaaagaatga acaagaatta ttgggtggtt ctggtggatc tggtatagtg 480

cagcagcaga acaatttgct gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca 540

gtctggggca tcaagcagct ccaggcaaga tag 573

<210>15

<211>447

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>15

aaggtcctac acctagaagg ggaagtgaac aaaatcaaaa gtgctctact atccacaaac 60

aaggctgtag tcagcttatc aaatggagtc agtgtcttaa ccagcaaagt gttacatctc 120

aaaaactata tagataaaca gttcttaggt tcctctggag gttctgatga atttgatgca 180

tcaatatctc aagtcaatga gaagattaac cagagtctag catttattcg taaatcagat 240

gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa tccaccacaa atggtggatc cggtggaaag 300

gtcctacacc tagaagggga agtgaacaaa atcaaaagtg ctctactatc cacaaacaag 360

gctgtagtca gcttatcaaa tggagtcagt gtcttaacca gcaaagtgtt acatctcaaa 420

aactatatag ataaacagtt cttatag 447

<210>16

<211>420

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>16

tctgatgaat ttgatgcatc aatatctcaa gtcaatgaga agattaacca gagtctagca 60

tttattcgta aatcagatga attattacat aatgtaaatg ctggtaaatc caccacaaat 120

ggtggttctg gtggaaaggt cctacaccta gaaggggaag tgaacaaaat caaaagtgct 180

ctactatcca caaacaaggc tgtagtcagc ttatcaaatg gagtcagtgt cttaaccagc 240

aaagtgttac atctcaaaaa ctatatagat aaacagttct taggttcctc tggaggttct 300

gatgaatttg atgcatcaat atctcaagtc aatgagaaga ttaaccagag tctagcattt 360

attcgtaaat cagatgaatt attacataat gtaaatgctg gtaaatccac cacaaattag 420

<210>17

<211>744

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>17

aaggtcctac acctagaagg ggaagtgaac aaaatcaaaa gtgctctact atccacaaac 60

aaggctgtag tcagcttatc aaatggagtc agtgtcttaa ccagcaaagt gttacatctc 120

aaaaactata tagataaaca gttcttaggt tcctctggag gttctgatga atttgatgca 180

tcaatatctc aagtcaatga gaagattaac cagagtctag catttattcg taaatcagat 240

gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa tccaccacaa atggtggatc cggtggaaag 300

gtcctacacc tagaagggga agtgaacaaa atcaaaagtg ctctactatc cacaaacaag 360

gctgtagtca gcttatcaaa tggagtcagt gtcttaacca gcaaagtgtt acatctcaaa 420

aactatatag ataaacagtt cttaggttcc tctggaggtt ctgatgaatt tgatgcatca 480

atatctcaag tcaatgagaa gattaaccag agtctagcat ttattcgtaa atcagatgaa 540

ttattacata atgtaaatgc tggtaaatcc accacaaatg gtggttctgg tggaaaggtc 600

ctacacctag aaggggaagt gaacaaaatc aaaagtgctc tactatccac aaacaaggct 660

gtagtcagct tatcaaatgg agtcagtgtc ttaaccagca aagtgttaca tctcaaaaac 720

tatatagata aacagttctt atag 744

<210>18

<211>369

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>18

gctctgatac aagccaacca gaatgctgcc aacatcctcc ggcttaaaga gagcattgct 60

gcaactaatg aagctgtaca tgaagtcact gacggattat cgcaactagc agtgggttcc 120

tctggaggtc ttgggaatgt caacaactcg ataagtaatg ctttggataa gttagaggaa 180

agcaatagca aacttgacaa agtcaatgtc aagctgaccg gcacgtctgc tctcattggt 240

ggatccggtg gagctctgat acaagccaac cagaatgctg ccaacatcct ccggcttaaa 300

gagagcattg ctgcaactaa tgaagctgta catgaagtca ctgacggatt atcgcaacta 360

gcagtgtga 369

<210>19

<211>363

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>19

cttgggaatg tcaacaactc gataagtaat gctttggata agttagagga aagcaatagc 60

aaacttgaca aagtcaatgt caagctgacc ggcacgtctg ctctcattgg tggatccggt 120

ggagctctga tacaagccaa ccagaatgct gccaacatcc tccggcttaa agagagcatt 180

gctgcaacta atgaagctgt acatgaagtc actgacggat tatcgcaact agcagtgggt 240

tcctctggag gtcttgggaa tgtcaacaac tcgataagta atgctttgga taagttagag 300

gaaagcaata gcaaacttga caaagtcaat gtcaagctga ccggcacgtc tgctctcatt 360

tga 363

<210>20

<211>621

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>20

gctctgatac aagccaacca gaatgctgcc aacatcctcc ggcttaaaga gagcattgct 60

gcaactaatg aagctgtaca tgaagtcact gacggattat cgcaactagc agtgggttcc 120

tctggaggtc ttgggaatgt caacaactcg ataagtaatg ctttggataa gttagaggaa 180

agcaatagca aacttgacaa agtcaatgtc aagctgaccg gcacgtctgc tctcattggt 240

ggatccggtg gagctctgat acaagccaac cagaatgctg ccaacatcct ccggcttaaa 300

gagagcattg ctgcaactaa tgaagctgta catgaagtca ctgacggatt atcgcaacta 360

gcagtgggtt cctctggagg tcttgggaat gtcaacaact cgataagtaa tgctttggat 420

aagttagagg aaagcaatag caaacttgac aaagtcaatg tcaagctgac cggcacgtct 480

gctctcattg gtggatccgg tggagctctg atacaagcca accagaatgc tgccaacatc 540

ctccggctta aagagagcat tgctgcaact aatgaagctg tacatgaagt cactgacgga 600

ttatcgcaac tagcagtgtg a 621

Claims

1、一种抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白，是所述囊膜病毒I类融合蛋白七肽重复序列HR1和HR2通过连接肽Linker1和Linker2连接得到的三螺旋蛋白或五螺旋蛋白；

所述三螺旋蛋白的排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH或NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH；

所述五螺旋蛋白的排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH；

所述连接肽Linker1和Linker2为由5-7个氨基酸残基组成的多肽。

2、根据权利要求1所述的多螺旋蛋白，其特征在于：所述连接肽Linker1和Linker2由甘氨酸和丝氨酸酸残基组成；

所述囊膜病毒为I型人免疫缺陷病毒；

所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白质；

所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列4的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白质；

所述排列顺序为NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白是具有序列表中序列5的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白质。

3、根据权利要求1所述的多螺旋蛋白，其特征在于：所述连接肽Linker1和Linker2由甘氨酸和丝氨酸酸残基组成；

所述囊膜病毒为人呼吸道合胞病毒；

所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白质；

所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列7的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列7的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白质；

所述排列顺序为NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白是具有序列表中序列8的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列8的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白质。

4、根据权利要求1所述的多螺旋蛋白，其特征在于：所述连接肽Linker1和Linker2由甘氨酸和丝氨酸酸残基组成；

所述囊膜病毒为新城疫病毒；

所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列9的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列9的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白质；

所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列10的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列10的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白质；

所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白是具有序列表中序列11的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列11的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白质。

5、权利要求1-4中任一所述的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的编码基因。

6、根据权利要求5所述的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的编码基因，其特征在于：所述囊膜病毒为I型人免疫缺陷病毒；

所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列12的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №：12限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列13的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：4蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：13限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №：13限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列14的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：5蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：14限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID№：14限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

7、根据权利要求5所述的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的编码基因，其特征在于：所述囊膜病毒为人呼吸道合胞病毒；

所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列15的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：6蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：15限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №：15限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列16的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：7蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：16限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №：16限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列17的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：8蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：17限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №：17限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

8、根据权利要求5所述的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的编码基因，其特征在于：所述囊膜病毒为新城疫病毒；

所述排列顺序为NH₂HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列18的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：9蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：18限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID No：18限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为NH₂HR2-Linker2-HR1-1inker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列19的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：10蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：19限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №：19限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述排列顺序为NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)具有序列表中序列20的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：11蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：20限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №：20限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

9、一种以权利要求1-4中任一所述的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其衍生物为活性成分的抑制囊膜病毒感染的药物。

10、根据权利要求9所述的药物，其特征在于：所述囊膜病毒为I型人免疫缺陷病毒或人呼吸道合胞病毒或新城疫病毒；所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的衍生物为所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白与GST形成的融合蛋白。