CN1223605C - 抑制sars冠状病毒的多肽药物及其衍生物和其应用 - Google Patents
抑制sars冠状病毒的多肽药物及其衍生物和其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1223605C CN1223605C CNB031362206A CN03136220A CN1223605C CN 1223605 C CN1223605 C CN 1223605C CN B031362206 A CNB031362206 A CN B031362206A CN 03136220 A CN03136220 A CN 03136220A CN 1223605 C CN1223605 C CN 1223605C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- sars
- sars coronavirus
- coronavirus
- albumen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 59
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 title claims abstract description 41
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title abstract 2
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 17
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 abstract description 3
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 abstract 1
- 101100071394 Arabidopsis thaliana HR2 gene Proteins 0.000 description 49
- 101100071393 Arabidopsis thaliana HR1 gene Proteins 0.000 description 45
- 101100220069 Homo sapiens CDCA7L gene Proteins 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 12
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 6
- 101150093250 HR1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101150036375 HR2 gene Proteins 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CFBILACNYSPRPM-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(CO)(CO)NCC(O)=O CFBILACNYSPRPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 2
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 2
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 description 2
- 108010046845 tryptones Proteins 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010003757 Atypical pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241001643857 Menangle virus Species 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 102220369445 c.668T>C Human genes 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 102220023257 rs387907546 Human genes 0.000 description 1
- 102220023256 rs387907547 Human genes 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种利用多肽及其衍生物阻断SARS冠状病毒感染细胞的方法，其中多肽的氨基酸序列来自SARS冠状病毒spike(S)蛋白的两个七肽重复区(heptad repeat，HR)HR1和HR2。本发明还提供了一种设计HR1和HR2多肽功能类似物的方法。本发明还提供了一种利用融合表达制备SARS冠状病毒S蛋白HR多肽或其衍生物的方法。这种通过表达纯化或人工合成方法获得的HR多肽及其衍生物都对SARS病毒感染细胞有抑制活性，可开发成防治SARS疾病的多肽药物。
Description
发明领域：
本发明属于病毒的分子生物学领域。具体的讲，涉及利用SARS冠状病毒spike(S)蛋白的七肽重复(heptad repeat，HR)HR1和HR2多肽及其衍生物进行对SARS冠状病毒感染的防治。
背景技术：
最近在全世界范围内爆发了一种传染性的重症急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)或称“非典型肺炎”，其病原目前已初步确定为一种新型冠状病毒(Coronavirus)。冠状病毒是一种带囊膜的RNA病毒，同其它囊膜病毒相似，它需要通过病毒囊膜与细胞膜的融合将遗传物质释放到细胞内而完成对细胞的感染。对大多数囊膜病毒的融合机制研究发现，它们都是利用囊膜融合糖蛋白通过构象变化介导病毒囊膜和宿主细胞膜的融合，这些囊膜糖蛋白(如流感病毒的HA、HIV的gp120/gp41、埃博拉病毒的Gp以及呼吸道合胞病毒的F蛋白)有着相似的结构特征，它们都有两段称为七肽重复(heptad repeat，HR)的区域-HR1和HR2，这两段区域在蛋白发挥融合活性时会形成一种稳定的六螺旋束或称发卡三聚体结构，这种结构对蛋白通过构象变化发挥融合功能至关重要，许多研究表明外源加入HR1或HR2多肽能够阻断蛋白本身的HR1和HR2间形成发卡三聚体，从而抑制了病毒囊膜和细胞膜的融合，最终阻止了病毒对细胞的感染。然而，至今还未见报道根据这种特性设计多肽或其类似物作为防治冠状病毒感染的药物。目前仅在艾滋病的治疗上已有报道进入三期临床试验的药物-T-20(HR2多肽衍生物)，就是这类药物的代表，其治疗作用效果很好。
发明内容：
在称为七肽重复(Heptad Repeat，HR)的研究上，本研究小组已经在多种病毒中作了相关工作，如人呼吸道合胞体病毒(Wang，E.，Sun，X.，Qian，Y.，Zhao，L.，Tien，P.and Gao，G.F.，BBRC.2003，302：469-475.)，麻疹病毒(Zhu，J.，Zhang，C.W-H.，Qi，Y.，Tien，P.and Gao，G.F.，BBRC.2002，299：897-902.；Zhu，J.，Ding，Y.，Gao，F.，Wu，T.，Zhang，C.W-H.，Tien，P.，Rao，Z.and Gao，G.F.ActaCrystallogr Biol Crystallogr.2003，D59：587-590.)，新出现的Menangle病毒(Zhu，J.，Zhang，C.W-H.，Rao，Z.Tien，P.and Gao，G.F.Archives of Virology2003，in press)等，鸡新城疫病毒(Yu，M.，Wang，E.，Liu，Y.，Cao，D.，Jin，N.，Zhang，C.W-H.，Bartlam，M.，Rao，Z.，Tien，P.and Gao，G.F.Journal of General Virology 2002，83(Pt3)：623-629；Zhu，J.，Li，P.，Wu，T.，Zhang，C.W-H.，Bartlam，M.，Rao，Z.，Gao，G.F and Tien，P.Protein Engineering 2003，inpress)等。证实了它们的六螺旋束结构和病毒融合入侵的抑制试验。我们在这方面的技术平台已经建立。
参与冠状病毒融合的囊膜糖蛋白为spike(S)蛋白，在SARS冠状病毒的全序列完成后(加拿大)，本发明对其编码的蛋白质进行了系统分析，发现Spike蛋白上也有两段特征性的七肽重复(Heptad Repeat，HR1和HR2)，它在S蛋白中的位置请参看图1，图中还比较了艾滋病病毒这一区域在囊膜蛋白(GP160)中的位置，这暗示SARS冠状病毒可能与HIV等有相似的融合机制。我们还进一步比较了所有在基因库(GenBank)中的SARS冠状病毒序列，包括来自美国，加拿大，香港，北京，广东等的病毒基因组序列，发现HR1和HR2这一区域是高度保守的，因此，用它们作为药物靶点可以避免SARS冠状病毒变异引起的耐药性。为此，本发明的目的在于提供了一种利用HR1和HR2多肽及其衍生物阻断SARS冠状病毒感染细胞的方法，其中多肽的氨基酸序列来自SARS冠状病毒spike(S)蛋白的两个七肽重复区(heptad repeat，HR)HR1和HR2，本发明提供了SARS冠状病毒spike蛋白HR1和HR2区在蛋白上的位置及氨基酸序列，其中HR1具有如Seq ID：No.1所示的氨基酸序列；HR2具有如Seq ID：No.2所示的氨基酸序列；应当指出的是，对上述序列进行一个或多个氨基酸的替换、插入和/或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。本发明的另外一个目的还在于提供一种设计HR1和HR2多肽功能类似物的方法；本发明还提供了一种利用融合表达制备SARS冠状病毒S蛋白HR多肽或其衍生物的方法。这种通过表达纯化或人工合成方法获得的HR多肽及其衍生物都对SARS病毒感染细胞有抑制活性，可开发成防治SARS疾病的多肽药物。
本发明提供了下列两种方法获得HR多肽或其衍生物：
1.人工合成多肽
根据本发明提供的SARS冠状病毒spike蛋白的HR1和HR2序列，人工合成了对应于HR1和HR2的多肽，经HPLC鉴定，纯度大于90％。
2.基因工程方法
(1)与GST融合表达制备HR1和HR2多肽或其衍生物
根据SARS病毒S蛋白HR1和HR2的氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子，对HR1和HR2基因进行人工拼接，利用BamH I/Xho I酶切位点克隆到GST融合表达载体pGEX-6p-1中，经DNA序列测定确定所得基因序列是正确的。将pGEX-6p-1/HR1和pGEX-6p-1/HR2分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆接种含氨卞青霉素(100μg/ml)的适量2×YTA液体培养基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，水1000ml)，37℃摇振培养过夜作为种子液；将种子液按1/100接种量接种新鲜2×YTA液体培养基，37℃摇振培养至OD590为0.8-1.0左右，加诱导物IPTG至终浓度1mM，37℃或28℃继续培养4h；5000rpm离心15min收集菌体，加适量PBS缓冲液(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重悬菌体，超声波裂解菌体，超声波裂解后加入终浓度为1％的TritonX-100，冰浴30min，12000rpm，4℃离心15min，取上清；将超声波裂解上清通过经PBS平衡的Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱，再用PBS洗涤亲和柱至少十个柱体积；用至少三个柱体积的还原型谷胱甘肽溶液(10mM reduced glutathione，50mM Tris-HCl pH8.0)洗脱，收集洗脱液得到GST-HR蛋白，用Superdex G50脱盐柱(Pharmacia公司)或超滤浓缩再稀释的方法换成酶切缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.0；150mM NaCl；1mM DTT；1mM EDTA，pH8.0)，加入过量的GST-3C蛋白酶5℃酶切16h；酶切产物再换成PBS缓冲液，用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱亲和除去酶切下的GST和GST-3C，收集穿透液得到HR1或HR2蛋白，用截流分子量为3K的超滤管浓缩至适当浓度，利用反向HPLC进一步纯化，-70℃冻存备用。蛋白样品用12％SDS-PAGE或Tris-tricine SDS-PAGE鉴定。蛋白浓度用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce公司)确定。
(2)与人GST蛋白融合表达制备HR1和HR2多肽或其衍生物
将人GST蛋白基因与SARS冠状病毒spike蛋白HR1和HR2或其衍生物融合，融合蛋白直接用于抑制SARS冠状病毒对细胞的感染。
本发明提供了设计SARS冠状病毒spike蛋白HR1和HR2多肽功能类似物的方法。由于HR1多肽的疏水性较强，很易发生自身聚集，稳定性不好，这就影响了其功能的发挥。本发明用氨基酸连接子将HR1、HR2、HR1串联起来(称为HR121)进行表达和纯化，同时将HR1、HR2、HR1、HR2、HR1五个多肽串联起来(称为5-Helix)进行表达和纯化，所得HR121和5-Helix稳定性高于单独的HR1多肽，而功能与其相同。本发明还将HR2、HR1、HR2三个多肽串联起来(称为HR212)进行表达和纯化，所得HR212蛋白同样比单独的HR2多肽稳定且便于纯化，而功能与其相似。
本发明提供了应用SARS冠状病毒spike蛋白HR1和HR2多肽或其衍生物阻断SARS病毒感染细胞的方法。将以上人工合成或基因工程方法获得的HR多肽或与GST或其他蛋白融合的HR蛋白倍比稀释与固定浓度的SARS冠状病毒混合，而后共同吸附Vero等培养细胞，观察HR多肽或GST-HR对SARS冠状病毒产生细胞病变(CPE)的影响，结果表明HR多肽或GST-HR能够在nM浓度范围内抑制CPE的产生，说明HR多肽能够阻断SARS冠状病毒对细胞的感染，本发明所提供的HR多肽或其衍生物可以用于开发防治SARS病毒感染的药物。
附图简要说明：
图1SARS冠状病毒spike(S)蛋白结构示意图。图示可能的S1和S2两个亚单位及跨膜区(transmembrane domain)和胞质区(cytoplamicdomain)。计算机程序预测的HR1和HR2在S蛋白的相应位置，同时与HIV-1gp160的HR1及HR2预测结果进行比较，说明它们有相似的结构特征。
图2构建HR1和HR2多肽功能类似物示意图。5-Helix为HRllinker1HR2linker2HR1linker1HR2linker2HR1，HR121为HR1linker1HR2linker2HR1，HR212为HR2linker2HR1linker1HR2，其中linker1的氨基酸序列为SGGRGG(字母表示氨基酸的英文缩写)，linker2的氨基酸序列为GGSGG(字母表示氨基酸的英文缩写)。5-Helix和HR121与HR1多肽的功能类似，HR212与HR2多肽的功能类似。
具体实施方式：
实施例
1.SARS冠状病毒spike(S)蛋白HR1和HR2区的预测所用SARS冠状病毒S蛋白序列来自Toronto分离株，基因库收录号码为：NC_004718。利用计算机程序对S蛋白进行分析，表明SARS冠状病毒S蛋白具有两个典型的七肽重复序列，同时利用其它不同的程序进行分析，结果HR1和HR2的位置相似，最后确定HR1序列为Seq ID：No.1；HR2序列为Seq ID：No.2。
2.SARS冠状病毒S蛋白HR1和HR2多肽的人工合成
根据实施例1所提供的HR1和HR2氨基酸序列，人工合成了HR2多肽，同时合成了三段不同长度的HR1多肽，经HPLC鉴定纯度为90％以上，并且所合成的肽可溶性很好。
3.SARS冠状病毒S蛋白HR1基因的人工拼接
根据实施例1所提供的HR1序列和大肠杆菌偏爱密码子设计了下列十条引物用于拼接HR1基因：
S(hr1)1：5’gat gga tcc gag aac cag aaa cag atc gcc aac cag ttc aac aag gcg atc 3’
S(hr1)2：5’tga ggt cgt ggt aag tga ttc ttg aat ttg act gat cgc ctt gtt gaa ctg 3’
S(hr1)3：5’tca ctt acc acg acc tca act gca ttg ggc aag ctg cag gac gtt gtt aac 3’
S(hr1)4：5’ttt cac cag cgt gtt cag tgc ttg agc att ctg gtt aac aac gtc ctg cag 3’
S(hr1)5：5’ctg aac acg ctg gtg aaa caa ctt agc tct aat ttt ggt gcg att tca agt gtg 3’
S(hr1)6：5’gac ttt atc cag acg cga aag gat atc att cag cac act tga aat cgc acc 3’
S(hr1)7：5’tcg cgt ctg gat aaa gtc gag gcg gag gta caa atc gac cgt ctg atc acc 3’
S(hr1)8：5’tgt cac ata ggt ctg cag gct ttg aag acg gcc ggt gat cag acg gtc gat 3’
S(hr1)9：5’ctg cag acc tat gtg aca caa caa ctg atc cgt gct gct gaa atc cgt gct 3’
S(hr1)10：5’gac ctc gag tca agc aag att agc aga agc acg gat ttc agc agc 3’
其中每两条相邻引物都有18个碱基的互补序列，同时设计有BamH I和Xho I酶切位点以及终止密码。引物人工合成。按下列方法拼接HR1基因：第一步，混合S(hr1)1-S(hr1)10十条引物(0.2OD/μl)，按下列PCR条件进行扩增：94℃变性5min，而后进行94℃ 1.5min，55℃ 2min，72℃ 1min，25个循环；第二步，以S(hr1)1和S(hr1)10为引物，第一步PCR产物为模板，按同样的条件进行PCR扩增。无水乙醇沉淀法回收PCR产物，1％琼脂糖电泳鉴定。对所得基因用BamH I和Xho I双酶切，与同样经双酶切的pGEX-6p-1载体连接，通过酶切鉴定的方法筛选阳性克隆，最后经DNA序列测定证明所得HR1基因完全正确。
4.SARS冠状病毒S蛋白HR2基因的拼接
根据实施例1所提供的HR2序列和大肠杆菌偏爱密码子设计了下列四条引物用于拼接HR2基因：
S(hr2)1：5’gac gga tcc ggc gac att tca ggc att aac gct tct gtc gtc aac att 3’
S(hr2)2：5’gac ctc att gag acg atc aat ttc ttt ttg aat gtt gac gac aga agc 3’
S(hr2)3：5’gat cgt ctc aat gag gtc gct aaa aat tta aac gaa tca ctg atc gac 3’
S(hr2)4：5’gta ctc gag tca gcc caa ttc ttg cag gtc gat cag tga ttc g 3’
其中每两条相邻引物都有18个碱基的互补序列，同时设计有BamH I和Xho I酶切位点以及终止密码。引物人工合成。按下列方法拼接HR2基因：第一步，混合S(hr2)1-S(hr2)4四条引物(0.2OD/μl)，按下列PCR条件进行扩增：94℃变性5min，而后进行94℃ 1min，55℃ 2min，72℃ 1min，25个循环；第二步，以S(hr2)1和S(hr2)4为引物，第一步PCR产物为模板，按同样的条件进行PCR扩增。无水乙醇沉淀法回收PCR产物，1％琼脂糖电泳鉴定。对所得基因用BamH I和Xho I双酶切，与同样经双酶切的pGEX-6p-1载体连接，通过酶切鉴定的方法筛选阳性克隆，最后经DNA序列测定证明所得HR2基因完全正确。
5.SARS冠状病毒HR1和HR2多肽的融合表达
将经DNA测序pGEX-6p-1/HR1和pGEX-6p-1/HR2分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆接种含氨卞青霉素(100μg/ml)的适量2×YTA液体培养基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，水1000ml)，37℃摇振培养过夜作为种子液；将种子液按1/100接种量接种新鲜2×YTA液体培养基，37℃摇振培养至OD590为0.8-1.0左右，加诱导物IPTG至终浓度1mM，37℃或28℃继续培养4h；5000rpm离心15min收集菌体，加适量PBS缓冲液(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重悬菌体，超声波裂解菌体，超声波裂解后加入终浓度为1％的TritonX-100，冰浴30min，12000rpm，4℃离心15min，取上清；将超声波裂解上清通过经PBS平衡的Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱，再用PBS洗涤亲和柱至少十个柱体积；用至少三个柱体积的还原型谷胱甘肽溶液(10mM reduced glutathione，50mM Tris-HCl pH8.0)洗脱，收集洗脱液得到GST-HR蛋白，经12％SDS-PAGE鉴定所得蛋白分子量与预期相符，其中GST-HR1为38kDa左右，GST-HR2为30kDa左右；用Superdex G50脱盐柱(Pharmacia公司)或超滤浓缩再稀释的方法将GST-HR换成酶切缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.0；150mM NaCl；1mMDTT；1mM EDTA，pH8.0)，加入过量的GST-3C蛋白酶5℃酶切16h；酶切产物再换成PBS缓冲液，用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱亲和除去酶切下的GST和GST-3C，收集穿透液得到HR1或HR2蛋白，用截流分子量为3K的超滤管浓缩至适当浓度，利用反向HPLC进一步纯化，-70℃冻存备用。蛋白样品用12％Tris-tricine SDS-PAGE鉴定，结果所得HR1多肽为12kDa左右，HR2多肽为4kDa左右，与预期大小相符。蛋白浓度用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce公司)确定。
6.SARS冠状病毒HR1和HR2多肽与人GST的融合表达
将人GST与HR1或HR2多肽按与实施例5同样的方法融合表达和纯化，得到的GST-HR蛋白直接用于检测其对抑制SARS冠状病毒感染细胞的活性。
7.SARS冠状病毒S蛋白HR1和HR2多肽的体外结合
将按实施例5方法纯化的GST-HR1与表达纯化的HR2或人工合成的HR2多肽混合，室温作用1小时，再与适量Glutathione-Sepharose 4B亲和填料混合，室温作用30分钟后用PBS缓冲液洗涤三次，而后用还原型谷胱甘肽溶液洗脱，最后进行12％Tris-tricine SDS-PAGE鉴定，结果表明GST-HR1能够与表达纯化或人工合成的HR2多肽特异性结合，说明HR1或HR2多肽及其衍生物是通过与病毒S蛋白上的相应HR区结合而发挥抑制活性。
8.实施例2、5和6方法得到的HR多肽或其衍生物对SARS病毒感染培养细胞的抑制
Vero E6细胞培养于DMEM培养基(含100U/ml青链霉素，10％胎牛血清)中，37℃，5％CO2培养箱中培养至生长成单层。将实施例2、5和6方法得到的HR多肽及其衍生物(溶于PBS缓冲液中)过滤除菌，倍比稀释(起始浓度为100μM)后与固定浓度的SARS冠状病毒混(病毒TCID50为5)合共同吸附上述细胞，37℃1小时后，吸弃病毒和肽的混合物，加入DMEM维持液(含100U/ml青链霉素，2％胎牛血清)，37℃，5％CO2培养箱中继续培养，每个稀释度做8个重复，每隔12小时观察细胞病变(CPE)情况。SARS冠状病毒在Vero细胞上产生的CPE为细胞变圆、萎缩、折光性强，最后细胞脱落。计算每个稀释度CPE被抑制的孔的数量，进行统计分析，最后计算IC50值。结果表明HR2多肽或GST-HR2都能抑制SARS冠状病毒在Vero细胞产生CPE，IC50在nM范围内，说明HR2多肽及其衍生物能够抑制SARS病毒感染细胞，可用于开发防治SARS病毒的药物。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>抑制SARS冠状病毒的多肽药物和其衍生物及其应用
<130>田波
<160>2
<170>PatentIn Version 3.1
<210>1
<211>108
<212>PRT
<213>Coronavirus
<400>1
Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile
1 5 10 15
Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly Lys
20 25 30
Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val
35 40 45
Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp
50 55 60
Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg
65 70 75 80
Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln
85 90 95
Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
100 105
<210>2
<211>38
<212>PRT
<213>Coronavirus
<400>2
Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu
1 5 10 15
Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile
20 25 30
Asp Leu Gln Glu Leu Gly
35
Claims (1)
1.一种阻断SARS冠状病毒感染细胞的多肽，其特征在于所述多肽是来自SARS冠状病毒spike蛋白两个七肽重复区HR1或HR2的多肽，其中所述HR1具有Seq ID No：1所示的氨基酸序列，所述HR2具有Seq ID No：2所示的氨基酸序列。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB031362206A CN1223605C (zh) | 2003-05-16 | 2003-05-16 | 抑制sars冠状病毒的多肽药物及其衍生物和其应用 |
| AU2003246143A AU2003246143A1 (en) | 2003-05-16 | 2003-06-12 | Polypeptide agent for inhibiting sars coronavirus and its derivatives and use thereof |
| PCT/CN2003/000457 WO2005080419A1 (fr) | 2003-05-16 | 2003-06-12 | Agent polypeptide d'inhibition du coronavirus sars et ses derives et utilisations |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB031362206A CN1223605C (zh) | 2003-05-16 | 2003-05-16 | 抑制sars冠状病毒的多肽药物及其衍生物和其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1488641A CN1488641A (zh) | 2004-04-14 |
| CN1223605C true CN1223605C (zh) | 2005-10-19 |
Family
ID=34154758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB031362206A Expired - Fee Related CN1223605C (zh) | 2003-05-16 | 2003-05-16 | 抑制sars冠状病毒的多肽药物及其衍生物和其应用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1223605C (zh) |
| AU (1) | AU2003246143A1 (zh) |
| WO (1) | WO2005080419A1 (zh) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7491489B2 (en) * | 2004-11-22 | 2009-02-17 | The University Of Hong Knog | Synthetic peptide targeting critical sites on the SARS-associated coronavirus spike protein responsible for viral infection and method of use thereof |
| CN100339396C (zh) * | 2005-04-18 | 2007-09-26 | 中国科学院微生物研究所 | 抑制i型人免疫缺陷病毒感染的三螺旋蛋白及其编码基因与应用 |
| CN101186637B (zh) * | 2007-11-14 | 2011-09-14 | 中国科学院微生物研究所 | 抑制流感病毒感染的方法及其药物 |
| US8470771B2 (en) | 2007-11-14 | 2013-06-25 | Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences | Method and medicament for inhibiting the infection of influenza virus |
| CN107245095B (zh) * | 2017-06-15 | 2020-05-26 | 武汉大学 | 用于抑制十种冠状病毒的多肽抑制剂 |
| CN113264990B (zh) * | 2020-02-14 | 2022-09-27 | 深圳大学 | 抑制新型冠状病毒(sars-cov-2)的多肽和其应用 |
| CN111349150B (zh) * | 2020-03-24 | 2021-02-09 | 北京中科微盾生物科技有限责任公司 | 一种抑制新型冠状病毒的多肽及其用途 |
| CN111518163B (zh) * | 2020-04-08 | 2022-04-12 | 大连百奥泰科技有限公司 | 一类脂肽化合物在抗新型冠状病毒中的应用 |
| US20220323537A1 (en) * | 2020-06-22 | 2022-10-13 | Kunming Institute Of Zoology, Chinese Acadamy Of Sciences | USE OF INTERFERENCE PEPTIDE IN PREPARATION OF ANTI-SARS-CoV-2 MEDICAMENT |
| CN111647048B (zh) * | 2020-06-22 | 2021-04-02 | 中国科学院昆明动物研究所 | 干扰多肽在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用 |
| US10906944B2 (en) * | 2020-06-29 | 2021-02-02 | The Scripps Research Institute | Stabilized coronavirus spike (S) protein immunogens and related vaccines |
| US11479582B2 (en) | 2020-10-16 | 2022-10-25 | King Faisal University | Anti-SARS-CoV-2 fusion peptides |
| KR20240052851A (ko) * | 2021-09-08 | 2024-04-23 | 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. | 항바이러스성의 구조적으로 스테이플링된 SARS-CoV-2 펩티드-콜레스테롤 접합체 및 이의 용도 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2282601B (en) * | 1993-09-16 | 1998-04-15 | Solvay | Antigenically-active proteins/polypeptides and coronavirus vaccines containing the same |
| AU7350798A (en) * | 1997-04-29 | 1998-11-24 | Universiteit Utrecht | Corona virus-like particles as tools for vaccination and therapy |
| US6623741B1 (en) * | 2000-02-29 | 2003-09-23 | Trimeris, Inc. | Methods and compositions for inhibition of membrane fusion-associated events including RSV transmission |
| AU2001249692A1 (en) * | 2000-03-31 | 2001-10-15 | The Cleveland Clinic Foundation | Phospholipid scramblases and methods of use thereof |
-
2003
- 2003-05-16 CN CNB031362206A patent/CN1223605C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-12 AU AU2003246143A patent/AU2003246143A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-12 WO PCT/CN2003/000457 patent/WO2005080419A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2003246143A1 (en) | 2005-09-05 |
| WO2005080419A1 (fr) | 2005-09-01 |
| CN1488641A (zh) | 2004-04-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1223605C (zh) | 抑制sars冠状病毒的多肽药物及其衍生物和其应用 | |
| CN101415723A (zh) | 具有改良生物学特性的hiv融合抑制肽 | |
| Krajewski et al. | Synthesis and HIV-1 integrase inhibitory activity of dimeric and tetrameric analogs of indolicidin | |
| CN111728963A (zh) | 葡萄糖酸铜在制备用于预防或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用 | |
| CN102336815A (zh) | 病毒感染的治疗 | |
| CA2285673C (en) | Cyclic analogs of histatins | |
| CN1980952A (zh) | 多聚化hiv融合抑制物 | |
| CN103974971B (zh) | 用于抑制hiv的多肽、其药物组合物及其用途 | |
| CN102311487A (zh) | 抗hiv感染的多肽、组合物以及用途 | |
| CN112430588B (zh) | 一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用 | |
| CN108484749A (zh) | 一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其制备方法 | |
| CN101705241A (zh) | 重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法及应用 | |
| CN114539426A (zh) | 一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法 | |
| WO2013075594A1 (zh) | 人工设计的抗hiv感染多肽、组合物以及用途 | |
| Lee et al. | Structure-activity relationships of anti-HIV-1 peptides with disulfide linkage between D-and L-cysteine at positions i and i+ 3, respectively, derived from HIV-1 gp41 C-peptide | |
| CN104311644B (zh) | 多肽、提高多肽稳定性的方法、药物组合物以及多肽在制备药物中的用途 | |
| CN110343164A (zh) | 一种高活性7位点突变的猪干扰素α突变体及其制备方法和应用 | |
| CN1793170A (zh) | 抑制hiv病毒融合的多肽及其用途 | |
| CN1840544A (zh) | Esc42蛋白及其制备方法和用途 | |
| US20010043931A1 (en) | Human respiratory syncytial virus | |
| CN1176946C (zh) | 一种新型α干扰素 | |
| RU2492178C1 (ru) | Противовирусный пептид, подавляющий репликацию вируса гриппа | |
| CN1165521A (zh) | 苯基肽，该肽及含有所述肽的药物组合物的制备方法 | |
| CN1324046C (zh) | 一种具有抗hiv活性的蛋白和糖结合蛋白 | |
| Engelbrecht et al. | Sequence note: Variation in HIV type 1 V3 region env sequences from Mozambique |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20051019 Termination date: 20170516 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |