CN103974971B - 用于抑制hiv的多肽、其药物组合物及其用途 - Google Patents

用于抑制hiv的多肽、其药物组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于抑制HIV的多肽、包含所述多肽的药物组合物及其用途。所述多肽包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的序列。虽然所述多肽不含目前公认的高活性多肽融合抑制剂必需的口袋结合区或脂膜结合区，且所述多肽长度较短，但所述多肽却显示了较高的抗HIV活性。

Description

用于抑制HIV的多肽、其药物组合物及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及用于抑制HIV的多肽、其药物组合物及其用途。
背景技术
1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)是艾滋病的病原体，目前全球有超过3000万感染者，每年导致约200万人死亡，并且每年还新增约200万感染者，严重威胁人类的健康。
HIV-1通过其包膜糖蛋白(Env)介导的病毒-细胞膜融合感染宿主细胞。Env包含表面亚基gp120和跨膜亚基gp41，三个Env形成非共价复合体镶嵌在病毒表面。表面亚基gp120负责病毒感染细胞过程中的分子识别以找到和接近靶细胞，同时起着稳定跨膜亚基gp41功能，并在适当时机释放出gp41以启动融合；跨膜亚基gp41是病毒-细胞膜融合的直接功能分子。
病毒细胞融合过程中有一由gp41N-端螺旋区(NHR)和C-端螺旋区(CHR)形成的六螺旋结构；该结构的形成为病毒-细胞膜融合提供能量，对病毒-细胞融合至关重要。能够阻止六螺旋形成的药物则可以有效地抑制艾滋病毒-细胞膜融合从而阻止病毒感染和体内传播，用于艾滋病治疗，称为融合抑制剂。
晶体结构显示，在六螺旋中，三个由NHR形成的螺旋结构构成内核，形成三个沟槽，三个CHR反平行结合在沟槽中。外源CHR多肽可结合在NHR靶点中形成无活性的六螺旋结构，阻止内源的活性六螺旋体生成，抑制病毒-细胞融合和病毒感染，从而用作融合抑制剂。晶体结构揭示NHR中含有一个较深的口袋，与CHR的相应功能区有关键相互作用。这个CHR关键结合区称为口袋结合区，其中含有Try-Try-Ile结合模板，被认为是维持高活性多肽融合抑制剂的关键(Chan,D.C.,C.T.Chutkowski,and P.S.Kim,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,1998.95(26):p.15613-15617.)。
典型的C-肽融合抑制剂包括C34(US6,150,088)及其改进多肽、首个上市融合抑制剂T20(US5,464,933)、以及后来发现的CP32(CN1793170，CN1955190)。这些C-肽融合抑制剂通过与其对应NHR靶点结合阻止病毒感染；典型的靶点包括N36(US6,150,088)和DP107(US5,656,480)，分别与C34和CP32结合形成六螺旋结构，其中N36和DP107中含有一个共同的结合口袋，也是小分子融合抑制剂的热门靶点。关于T20的作用机理，目前认为其C-端的8个残基形成的功能区与脂膜结合是保障T20高活性的关键，被称为脂膜结合区(Liu,S.W.,et al.,Journal of Biological Chemistry,2007.282(13):p.9612-9620.)。自此，普遍接受的观点是高活性多肽融合抑制必需至少含有口袋结合区或脂膜结合区之一，在加上一些螺旋间相互作用才能保障高活性。
尽管有上市的融合抑制剂T20和其它临床研究中的融合抑制剂如Sifuvirtide(CN1334122)，但由于抗药病毒株的快速出现，使得针对抗性病毒的融合抑制剂研发成为当务之急。同时由于目前获得的高活性多肽融合抑制剂均为约36个氨基酸残基的多肽，其合成成本比较高，因此获得序列较短的，保持高抗HIV活性的多肽药物有重要意义。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，出乎意料地得到了与NHR结合非常强的多肽，从而开发出一类与已有融合抑制剂作用机制不同的高活性融合抑制剂。该类融合抑制剂不含公认的保持高活性必需的口袋结合区或脂膜结合区，却通过螺旋结构间的相互作用保持高活性。此外，本发明的融合抑制剂(多肽)的长度小于31个残基，具有明显的成本优势。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种(分离的)多肽、其衍生物或其可药用盐，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。在本发明中，包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9是指多肽的序列包括或者为SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9本身。在本发明的一个实施方案中，所述多肽不包括SEQ ID NO：3本身。在本发明的一个实施方案中，所述多肽不包括SEQ ID NO：9本身。
根据本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐，其中，所述多肽的长度为小于或等于31个氨基酸残基；优选地，所述多肽还大于或等于22个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，所述多肽的长度为小于或等于31个氨基酸残基并且大于或等于26个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，所述多肽的长度为小于或等于29个氨基酸残基并且大于或等于26个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，所述多肽的长度为小于或等于31个氨基酸残基并且大于或等于22个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，所述多肽的长度为小于或等于29个氨基酸残基并且大于或等于22个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，所述多肽的长度为小于或等于26个氨基酸残基并且大于或等于22个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，所述多肽的长度为小于或等于31个氨基酸残基并且大于或等于29个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，所述多肽的长度为31、30、29、28、27、26、25、24、23或22个氨基酸。优选地，所述多肽的长度为26个氨基酸。
根据本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐，其中，所述多肽能够与HIV－1的NHR结合。优选地，所述多肽的序列分别均包含在HIV－1的CHR中。
根据本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐，其中，所述多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1－2、4－8、10－12中的任一序列所示。多肽序列见下面的表1。
表1：多肽序列
其中，表1中编号为3和9的多肽在本发明中作为对照样品。
其中氨基酸是缩写具有本领域公知的含义，例如：W为色氨酸、N为天冬酰胺、A为丙氨酸、S为丝氨酸、K为赖氨酸、L为亮氨酸、E为谷氨酸、Q为谷氨酰胺、I为异亮氨酸、H为组氨酸、M为甲硫氨酸、T为苏氨酸、D为天冬氨酸、R为精氨酸、Y为酪氨酸、F为苯丙氨酸。
表1中的多肽在本发明中有时也分别称为多肽1、多肽2、多肽3、……多肽12；或者分别称为序列1、序列2、序列3、……序列12。其中，序列3为天然序列，其含义是指从HIV-1gp41CHR中截取的一段天然多肽序列。
不拘于理论的限制，序列4、序列5、序列6、序列10是序列7的基础上，通过取代或添加1或2或3个氨基酸得到。
不拘于理论的限制，序列11、序列12中的谷氨酸-赖氨酸对形成了多肽链内盐桥，可能有利于提高多肽的抗HIV活性。
根据本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐，其中，所述多肽的N末端连接乙酰基、寡肽序列、或亲脂性基团，和/或
C末端连接酰胺基、寡肽序列例如1－10个氨基酸残基的寡肽序列(例如EEE、KKK、GQAV、GEEE等)、或亲脂性基团(例如含有3到20个碳原子的脂肪酸链，其中优选含8-16个碳原子的脂肪酸链)、胆固醇等。
根据本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐，其中，所述多肽的N末端乙酰化，和/或C末端酰胺化。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。优选地，所述药物组合物为注射剂。
通常本发明药物组合物含有0.1－90重量％的本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明的多肽、其衍生物或其可药用盐与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明的多肽、其衍生物或其可药用盐或者本发明的药物组合物可以以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明的多肽、其衍生物或其可药用盐与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明的多肽、其衍生物或其可药用盐制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
本发明的多肽、其衍生物或其可药用盐或者本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体活性成分，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。
本文所用的术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。
可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性成分的量能有效针对具体患者，并且组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体活性成分的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗包膜类病毒感染的药物中的用途。具体地，所述包膜类病毒感染为HIV感染所致疾病或艾滋病。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或辅助治疗包膜类病毒感染的方法，包括给与受试者有效量的本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐的步骤。具体地，所述包膜类病毒感染为HIV感染所致疾病或艾滋病。
当用于上述治疗和/或预防或辅助治疗时，治疗和/或预防有效量的本发明的多肽、其衍生物或其可药用盐可以以纯形式应用，或者以药学可接受的酯或前药形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，可以以含有本发明的多肽、其衍生物或其可药用盐与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。但应认识到，本发明的多肽、其衍生物或其可药用盐或者本发明的药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体活性成分的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体活性成分的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体活性成分组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明的多肽、其衍生物或其可药用盐用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001－1000mg/kg体重/天，例如介于0.01－100mg/kg体重/天，例如介于0.01－10mg/kg体重/天。
本发明的多肽、其衍生物或其可药用盐或者本发明的药物组合物可以有效地预防和/或治疗和/或辅助治疗本发明所述的各种疾病或病症。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐在制备或作为HIV融合抑制剂或者抗HIV药物中的用途。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制HIV的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐的步骤。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制HIV-1Env介导的细胞融合的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐的步骤。
本发明的再一方面涉及编码本发明中任一项所述多肽的核苷酸序列。
一种核酸构建体，其包含本发明任一项所述的核苷酸序列；具体地，所述核酸构建体为重组载体；更具体地，所述重组载体为重组表达载体。
本发明还涉及包含本发明所述核酸序列及与之可操作连接的1或多个调控序列的核酸构建体，所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中进行表达。表达应理解为包括多肽生产中所涉及的任何步骤，包括，但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
“核酸构建体”在文中定义为单链或双链核酸分子，它们分离自天然基因，或者经修饰而含有以非天然方式组合和并列的核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明所述编码序列必需的所有调控序列时，术语核酸构建体与表达盒同义。术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
可以以多种方式操作编码本发明所述肽的分离的核酸序列，使其表达所述肽。可能期望或必须在插入载体之前对核酸序列进行加工，这取决于表达载体。应用重组DNA方法修饰核酸序列的技术为本领域所熟知。
本文中术语“控制序列”定义为包括表达本发明肽所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。
调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。
调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。
调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在多肽氨基端的氨基酸序列，能引导编码多肽进入细胞分泌途径。核酸序列编码区的5’端可能天然含有翻译读框一致地与分泌多肽的编码区片段自然连接的信号肽编码区。或者，编码区的5’端可含有对编码序列是外来的信号肽编码区。当编码序列在正常情况下不含有信号肽编码区时，可能需要添加外来信号肽编码区。或者，可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽分泌。但是，任何能引导表达后的多肽进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。
调控序列还可以是肽原编码区，该区编码位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被称为酶原或多肽原。多肽原通常没有活性，可以通过催化或自我催化而从多肽原切割肽原而转化为成熟的活性多肽。
在多肽的氨基末端即有信号肽又有肽原区时，肽原区紧邻多肽的氨基末端，而信号肽区则紧邻肽原区的氨基末端。
添加能根据宿主细胞的生长情况来调节多肽表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码多肽的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。
本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括1或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。
重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。
载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。
优选本发明所述载体含有1或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。
优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。
就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变。
可以向宿主细胞插入1个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少1个附加拷贝插入宿主细胞基因组中，或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。
用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。
本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其包含本发明任一项所述的核酸构建体。
本发明还涉及包含可用来重组生产多肽的本发明所述核酸序列的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。
宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌(如大肠杆菌细胞)或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。
本发明的多肽可以人工化学合成，也可以通过重组宿主细胞进行蛋白质的表达，例如，包括：(a)在适于产生所述肽的条件下，培养含有核酸构建体的宿主细胞，该核酸构建体包含编码所述肽的核酸序列；和(b)回收该肽。
在本发明所述制备方法中，用本领域已知方法在合适多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物中回收。
可以用本领域已知方法回收所产生的多肽。例如，可以通过常规操作(包括，但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收多肽。
可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述多肽，这些操作包括，但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳(例如，制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如，蛋白质纯化，J.C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers,New York,1989)。
本发明中，
术语“多肽”具有本领域人员公知的一般含义，并且还包括多肽的衍生物、修饰物等等。
术语“HIV融合抑制剂”包括但不限于：抑制HIV(例如抑制HIV增殖、感染、传播等)或者抑制HIV-1Env介导细胞融合的药物或者试剂。
术语“有效量”包括可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐或者本发明任一项所述的药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
发明的有益效果
本发明人系统地考察了HIV-1gp41CHR和NHR的相互作用，发现经过改进的36个氨基酸长度左右的gp41CHR多肽与NHR具有非常强的相互作用，但其抗HIV活性没有相应的提高。进一步的研究发现这源于其自身的聚集从而降低了与短期暴露的NHR靶点的结合速度(Cai,L.,et al.,Faseb Journal,2012.26.)。
本发明涉及的多肽的长度均小于30个氨基酸残基，最短的只有22肽，但活性与当前临床使用的T20相当。这些多肽作为药物，其合成成本将大有降低，从而具有非常好的开发前景。同时，这些多肽既不含稳定六螺旋结构必需的口袋结合区，也不含与磷脂膜结合的脂膜结合区(目前公认高活性多肽融合抑制剂必需具有口袋结合区或脂膜结合区)，作用机制明显异于已有的融合抑制剂C36或T20，因此是一种新型融合抑制剂。
附图说明
图1：CHR多肽与对应CHR靶点相互作用的CD谱。其中：
图1(A)是多肽1与多肽N46相互作用的CD谱，其中方块表示多肽4的CD谱，圆圈表示多肽N46的CD谱，上三角N46/4表示多肽N46和多肽4混合后的CD谱，下三角N46+4表示多肽N46和多肽4单独扫描的CD谱叠加；
图1(B)多肽2与多肽N46相互作用的CD谱，其中的图例的含义与图1(A)中做类似理解；
图1(C)多肽4与多肽N46相互作用的CD谱，其中的图例的含义与图1(A)中做类似理解；
图1(D)多肽5与多肽N46相互作用的CD谱，其中的图例的含义与图1(A)中做类似理解。
图1(E)多肽7与多肽N46相互作用的CD谱，其中的图例的含义与图1(A)中做类似理解。
图1(F)多肽8与多肽N46相互作用的CD谱，其中的图例的含义与图1(A)中做类似理解。
图1(G)多肽9与多肽N46相互作用的CD谱，其中的图例的含义与图1(A)中做类似理解。
图1(H)多肽10与多肽N46相互作用的CD谱，其中的图例的含义与图1(A)中做类似理解。
图1(I)多肽11与多肽N46相互作用的CD谱，其中的图例的含义与图1(A)中做类似理解。
图1(J)多肽12与多肽N46相互作用的CD谱，其中的图例的含义与图1(A)中做类似理解。
图2：CHR多肽(多肽1、2、3、5、7、8、9、10)与N38b相互作用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
图3：荧光共振能量转移检测方法研究CHR多肽1、7、8与NHR靶点疏水口袋区的相互作用的结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明中使用的缩写具有下面的意义：
AIDS(Acquired Immure Deficiency Syndrome)艾滋病，获得
性免疫缺陷综合症。
Ala(Alanine，A)丙氨酸
Arg(Arginine，R)精氨酸
Asn(Asparagine，N)天冬酰胺
Asp(Asparticacid，D)天冬氨酸
CD(Cycurlar Dicroism)圆二色性
DCM(Dichloromethane)二氯甲烷
DMF(N,N-Dimethyl malonate)二甲基甲酰胺
DMSO二甲亚砜
Env(Envelope glycoprotein)包膜糖蛋白
ESI-MS(Electronic spray ion mass spectroscopy)电喷质谱
Fmoc(Fluorenylmethoxycarbonyl)芴甲氧羰基
Gly(Glycine，G)甘氨酸
Gln(Glutamine，Q)谷酰胺
Glu(Glutamic acid，E)谷氨酸
6-HB(six-helix bundle)六螺旋体
HBTU2-(1H-1-羟基苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸
His(Histidine，H)组氨酸
HoBt(1-Hydroxyl benzotiazole anhydrous)1-羟基苯并三氮唑
ITC(Isothermal Titration Calorimetry)等温滴定量热
NHR(N-terminal heptad repeat)N-端七联重复序列
CHR(C-terminal heptad repeat)C-端七联重复序列
HIV(Human immunodeficiency virus)人免疫缺陷病毒
HIV-11型人免疫缺陷病毒
HPLC(high performance liquid chromatography)高效液相色谱
Ile(Isoleucine，I)异亮氨酸
Leu(Leucine，L)亮氨酸
Met(Methionine，M)甲硫氨酸
Nal正亮氨酸
Lys(Lysine，K)赖氨酸
Phe(Phenylalanine，F)苯丙氨酸
Ser(Serine，S)丝氨酸
TFA(Trifluoroacetic acid)三氟乙酸
Thr(Threonie，T)苏氨酸
Tyr(Tyrosine，Y)酪氨酸
Val(Valine，V)缬氨酸
实施例所用固相合成载体Rink酰胺树脂为天津南开合成责任有限公司产品；HBTU、HOBt、DIEA及Fmoc保护的天然氨基酸和D型的非天然氨基酸为上海吉尔生化公司及成都诺新技术责任公司产品。N-甲基吡咯烷酮(NMP)为ACROS公司产品；TFA为北京博迈科技有限公司产品；DMF、DCM为博迈杰公司产品；色谱纯乙腈为Fisher公司产品。其它试剂如无说明均为国产分析纯产品。
实施例1：多肽1的制备
采用标准的Fmoc固相多肽合成方法。所有多肽序列均按照多肽合成的常规将C-端酰胺化，N-端乙酰化(本领域人员知晓，这些修饰对多肽活性没有根本性影响)。选用RinkAmide树脂，肽类由C-端向N-端延长。缩合剂为HBTU/HOBt/DIEA。脱保护剂为哌啶/DMF溶液。裂解剂为TFA，粗肽水溶解后冻干保存。用中压液相色谱法或HPLC进行分离纯化，纯肽含量>95％。基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)确定多肽分子量。
微波多肽合成条件如下：
氨基酸：0.2M的DMF溶液；活化剂：0.45M HBTU/HOBt的DMF溶液；活化碱：2M DIEA的NMP溶液；脱保护剂：20％v/v哌啶的DMF溶液；封闭试剂：20％v/v乙酸酐的DMF溶液。
称取Rink Amide树脂0.5g(0.25mmol)置入CEM微波多肽合成仪的反应器中，然后将氨基酸、活化剂、活化碱、脱保护试剂、封闭试剂按上述条件配好后，用CEM微波全自动多肽合成仪进行合成。完成后肽树脂用DMF洗涤3遍后用无水甲醇收缩，室温真空干燥，得肽树脂2.05g。
肽树脂的裂解：将上述合成好的肽树脂称量后放入250ml茄形瓶中，冰浴，电磁搅拌。按1g肽树脂加入10ml的量配置裂解液(体积比：三氟乙酸：乙二硫醇：间苯酚：水＝95:1:2:2)。TFA需预先冰浴降温30min或者预先放于冰箱中使用。将配制好的裂解液加入到冰浴条件下的肽树脂中，电磁搅拌，树脂变橙红色，冰浴条件下反应30min，然后撤冰浴，室温下再继续反应90min使反应完成。剧烈搅拌下向反应器中加入冷乙醚200ml，析出白色沉淀，继续搅拌30min；用G4的砂芯抽滤漏斗滤出析出物，用冷乙醚反复洗涤3遍，晾干。加入双蒸水50ml，乙腈10ml使固体充分溶解，抽滤，滤液冻干得粗肽1.03g。
所得粗肽用中压或高压色谱进行纯化。色谱柱为C8柱，洗脱液为乙腈，水及少量乙酸。具体操作步骤：称取粗肽1g，加水20ml，乙腈5ml溶解，3000转/分钟下离心10min，取上清液上样。色谱柱预先用15％乙腈/水/0.1％冰乙酸溶液200ml平衡，上样后继续用200ml同样洗脱液平衡，高效液相检测洗脱液成分。根据检测结果逐步升高乙腈含量，直至所纯化的多肽峰被洗脱出来。合并同组分洗脱液，旋转蒸发除去大部分溶剂，冻干得纯肽，HPLC检测含量>95％。
纯肽经MALDI-TOF-MS质谱确定其分子量(见下面的表2)。
表2：多肽的分子量和纯度
编号 MW 纯度(％) 名称
SEQ ID NO：1 3340.2 96.8 CP29C
SEQ ID NO：2 3584.3 99.5 CP31C
SEQ ID NO：3 3499.6 99.7 CP29CW
SEQ ID NO：4 3302.4 95.9 CP5b
SEQ ID NO：5 3200.3 98.1 CP5b1
SEQ ID NO：6 3209.9 93.4 267229
SEQ ID NO：7 3027.8 99.1 CP26C
SEQ ID NO：8 2665.7 96.0 CP22C
SEQ ID NO：9 2252.3 97.9 CP19C
SEQ ID NO：10 3001.1 98.7 CP26C1
SEQ ID NO：11 3648.2 99.7 CP29CEK
SEQ ID NO：12 2755.7 99.6 CP22CEK
实施例2－12：多肽2－12的制备
参照实施例1中的方法进行制备，具体氨基酸的序列分别如表1中所示。其分子量和纯度如上面的表2所示。
下面的实施例13－18所用多肽样品为实施例1－12所合成的多肽1－12。
实施例13：多肽的抗HIV-1细胞-细胞融合活性检测
本发明人用HIV-1Env介导的细胞-细胞融合模型对设计的多肽进行活性测定。靶细胞为TZM-bl细胞(美国NIH艾滋病试剂和参照物项目提供，目录号为8129)，其表面表达CD4T-细胞受体和趋化因子辅助受体CCR5和CXCR4，可被HIV-1Env识别，同时细胞内还转录荧光素酶报告基因，但不含该基因的启动子，因此单独细胞的荧光素酶背景表达量很低。效应细胞为HL2/3细胞(美国NIH艾滋病试剂和参照物项目提供，目录号为1294)，其表面表达HIV-1Env，由Env进攻靶细胞，完成细胞融合，同时细胞内还转录荧光素酶报告基因的启动子。两种细胞先在含有氨苄/链霉素双抗的含10％胎牛血清的DMEM中，37度下在含有5％CO2的培养箱中单独培养。两种细胞均为贴壁细胞，细胞用胰酶/EDTA消化后收获或传代。细胞用细胞计数板计数。
将TZM-bl靶细胞用培养基调整到浓度为75万/ml，以每孔50μl加入96孔细胞培养板中(3.75万/孔)，5％CO2，37度下培养24小时。
将多肽或阳性对照样品(T20或C34)溶于磷酸缓冲溶液生理盐水(PBS)中，或加入适量DMSO使充分溶解，用紫外光谱仪在280nm处测定多肽浓度。然后将多肽溶液稀释到适当的浓度，在96孔酶标板(Corning)中等比稀释。
配制150万/ml的HL2/3效应细胞。
将20μl/孔的等比稀释的抑制剂加入前一天培养的TZM-bl细胞中，然后加入50μl/孔的配制好的HL2/3效应细胞；96孔细胞培养板的其中一排用PBS替代抑制剂用于测定饱和融合信号，另一排用DMEM培养基替代HL2/3细胞用于测定背景信号。5％CO2，37度下培养6-8小时使之充分融合。
将荧光素酶报告基因的试剂盒(Promega)从冰箱中取出，将5x细胞裂解液根据用量用双蒸水稀释至1x裂解液，室温下放置；用底物缓冲液溶解底物，室温下放置；同时将酶标仪(Molcular Devices M5多功能酶标仪)检测条件设置好备用。
将融合好的细胞取出，弃去培养基，用200μl/孔PBS洗两次，尽量去除清洗液；然后以50μl/孔加入平衡到室温的裂解液，轻轻震动下反应5min使细胞充分裂解；将裂解液以40μl/孔加入96孔化学发光检测用酶标板板(Corning)中，加样时尽量避免引入气泡；避光下将底物以40μl/孔迅速加入化学发光用酶标板中，立即在酶标仪上测定化学发光。
根据饱和融合信号和背景信号的比值确定靶细胞和效应细胞融合的有效性，比值>5表明有效融合。根据样品的浓度-化学发光信号曲线确定其半抑制剂浓度(IC50)，阳性对照样品的IC50值应稳定在一定范围；理想的抑制曲线中高浓度抑制剂下信号应接近背景信号，最低浓度抑制剂下信号应接近饱和融合信号。
多肽1－12的细胞融合抑制活性列于表3，阳性对照T20的IC50为11.6±4.0nM，与文献报道相符(Wild,C.T.,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America,1994.91(21):p.9770-9774.)。
表3：多肽的细胞-细胞融合抑制活性
编号 IC50/nM 名称
SEQ ID NO：1 4.6±0.9 CP29C
SEQ ID NO：2 5.9±1.6 CP31C
SEQ ID NO：3 430±24 CP29CW
SEQ ID NO：4 13.1 CP5b
SEQ ID NO：5 21.9 CP5b1
SEQ ID NO：6 681 267229
SEQ ID NO：7 116±37 CP26C
SEQ ID NO：8 30±4.9 CP22C
SEQ ID NO：9 5400 CP19C
SEQ ID NO：10 28 CP26C1
SEQ ID NO：11 1.37 CP29CEK
SEQ ID NO：12 186 CP22CEK
11.6±4.0 T20
结果显示，本发明的大于22个氨基酸残基多肽具有良好的HIV-1Env介导的细胞融合抑制活性，能够作为HIV融合抑制剂，而天然序列SEQ ID NO：3和小于22残基的SEQ IDNO：9活性差。
实施例14：多肽的实验室适应病毒株HIV-1 IIIB 感染抑制实验
1.实验用品
多肽1－9；其中选择活性较好的多肽1、2、7、8作为待测样品，并以多肽3和9作对照。
实验室适应病毒株HIV-1IIIB(参见文献Pan,C.,L.Cai,et al.(2009)."Combinations of the First and Next Generations of Human ImmunodeficiencyVirus(HIV)Fusion Inhibitors Exhibit a Highly Potent Synergistic Effectagainst Enfuvirtide-Sensitive and-Resistant HIV Type1Strains."Journal ofVirology83(16):7862-7872.亦可使用其它可获得的HIV-1病毒株，可得到与本实施例类似的结果)
2.实验方法
用实验室适应病毒株HIV-1IIIB感染抑制实验考察了多肽1-9的活性。在200ul的RPMI1640培养基中，用100TCID50(50％组织培养感染量)的HIVIIIB毒株去感染104/mlMT-2细胞，同时加入呈浓度梯度的不同抑制剂，过夜培养之后弃去培养上清液，换上新鲜的培养基。感染后第四天，从每个孔中取出100ul培养上清液，加入等体积的5％Triton X-100，用ELISA方法定量检测p24抗原。具体实验方法亦可参考Jiang,S.,et al.,AntimicrobialAgent and Chemotherapy,2004.48(11):p.4349-4359.
3.实验结果
如下面的表4所示。
表4：多肽的HIV病毒感染抑制活性
编号 IC50(nM)
SEQ ID NO：1 3.5±0.2
SEQ ID NO：2 26±1.6
SEQ ID NO：3 >2000
SEQ ID NO：7 34±0.9
SEQ ID NO：8 1160±460
SEQ ID NO：9 >2000
T20 68±22
结果显示：1、2、7的HIV-1抑制活性均优于临床药物T20，而22肽8的活性相对较低一些，对照3和9无活性，与细胞-细胞融合活性一致。
实施例15：圆二色谱研究多肽1-12与NHR靶点作用
1.实验目的
用圆二色谱(CD)研究1-12与gp41NHR靶点的相互作用。
2.实验材料
多肽1－12；
选用N46作为靶点，根据HIV-1gp41的核心晶体结构，N46是构成HIV-1gp41六螺旋内核的组成部分，与包含多肽3的六螺旋外围多肽紧密结合(Lu，M.,et al.NatureStructural Biology(1995)2(12):1075-1082)，是融合抑制剂的核心靶点，其序列如下：
Ac-TLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGI KQLQARIL-CONH2，(其中除了C-端酰胺化和N-端乙酰化，其余的氨基酸序列部分表示为SEQ ID NO：13)
上述多肽的制备方法可以参考Pan,C.,et al.,Journal of Virology,2009.83(16):p.7862-7872.；也可以委托多肽合成的公司合成。
圆二色谱仪为Biologic MOS450谱仪。
3.实验方法
将测定CHR多肽溶于PBS中，N46溶于双蒸水中，根据280nm下紫外吸收确定浓度；然后配制20μM的多肽PBS溶液。
配制要检测的多肽样品：将N46和多肽1-12以1：1体积比混合得二者混合样品；如果是单独多肽样品，将20μM的样品与缓冲溶液以1:1混合。样品在37度下放置30min使充分反应。上述实验步骤可确保样品中的多肽浓度保持一致。
将配制好的样品在圆二色谱仪上测定，仪器扫描波长范围为190-260nm，波长间隔为1nm，扫描速度为100nm/min，扫描4次进行平均。先用缓冲溶液扫描得到空白，然后扫描样品信号，将空白信号从样品信号中扣除得到CD信号。
通过比较CHR和NHR多肽混合前和混合后的CD信号变化来确定二者的相互作用。
此外，本发明人还通过CD温度扫描测定1-12与N46形成的六螺旋稳定性。具体方法如下：将样品稀释到1μM，加入样品池，将CD仪器程序设为温度扫描，检测波长220nm，扫描范围20-90摄氏度，搅拌下进行程序温度扫描和检查得到CD信号随温度变化曲线。根据曲线计算一次微分，根据一次微分曲线的峰值确定Tm值，及样品的热转变温度。
3.实验结果
(1)CD信号变化表明两者具有相互作用。多肽1-12与N46混合后都出现CD信号变化，表明它们均作用于gp41NHR，通过与NHR形成无活性的六螺旋结构抑制HIV与人体细胞的融合(图1，A－J)。
(2)Tm值如下面的表4所示。
表4：多肽的Tm值
编号 Tm(℃)
SEQ ID NO：1 77.0
SEQ ID NO：2 79.2
SEQ ID NO：3 59.8
SEQ ID NO：4 63.4
SEQ ID NO：5 60.0
SEQ ID NO：7 65.6
SEQ ID NO：8 60.6
SEQ ID NO：10 67.0
SEQ ID NO：11 74.5
SEQ ID NO：12 46.0
由表4可见，本发明的多肽与N46形成的六螺旋的热稳定性均高于天然序列3，显示这些多肽能与NHR结合形成稳定结构从而阻止病毒蛋白活性中间体的形成，阻断病毒-细胞膜融合，达到抑制病毒感染而用于治疗艾滋病。
实施例16：等温滴定量热研究多肽1-12与NHR靶点作用
1.实验目的
用等温滴定量热法分析了多肽1-12和N46的作用热力学。
2.实验材料
多肽1－12。
3.实验方法
等温滴定量热分析在MicroCal iTC200(GE公司)上完成。将多肽1-12溶于Tris-Ac缓冲液中，然后滴入用完全一样缓冲溶液溶解的N46中，每一滴2μl，间隔120s，共滴定20滴。测定后用仪器所带软件计算二者结合的热力学和常数包括结合当量比N、结合常数、摩尔结合焓，摩尔结合熵。
4.实验结果
测定结果列于表5。
表5：多肽与NHR靶点作用数据
结果显示，本发明的多肽与NHR靶点具有良好的结合能力。
实施例17：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)研究多肽1-12与NHR靶点的相互 作用
1.实验目的
用N-PAGE研究多肽1-12和N38b的作用，N38b是根据HIV-1gp41晶体结构，从N46中优化得到的多肽序列。N38b比N46少一个带正电荷的氨基酸残基，更容易与我们设计的多肽作用形成带负电的复合物从而用于非变性电泳分析。下面给出了N38b的氨基酸序列。
2.实验材料
多肽1－12；
N38b，序列如下：
Ac-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQ-CONH2，(其中除了C-端酰胺化和N-端乙酰化，其余的氨基酸序列部分表示为SEQ ID NO：14)。
2.实验方法
N-PAGE使用BG-Power3500多用电泳仪(北京百晶生物技术有限公司)完成。
将多肽1-12溶于PBS中，N38b溶于双蒸水中，根据280nm下紫外吸收确定浓度；然后配制200μM的多肽溶液。将N38b和多肽1-12以1：1体积比混合得二者混合样品；如果是单独多肽样品，将200μM的样品与缓冲溶液以1:1混合。样品在37度下放置30min使充分反应。结束后，每个样品中加入等体积的N-PAGE2X上样缓冲液(Invitrogen公司)，混匀后待用。
配制分离胶(16％)：30％丙烯酰胺溶液8ml，4X分离胶缓冲液3.75ml，水3.1ml，10％AP溶液100μl，TEMED10μl，震荡混合。小心将上述溶液，两层玻璃板之间，上层留有1-2cm的空间以便灌制浓缩胶，再使用注射器小心加入水饱和正丁醇。凝胶在30分钟左右完成聚合。
配制浓缩胶(4％)：将正丁醇层弃去，用去离子水小心清洗凝胶上层，用滤纸吸干水。加入30％丙烯酰胺溶液1ml，4X浓缩胶缓冲液2ml，水4.8ml，加入10％AP溶液100μl，TEMED10μl，震荡混合。用上述溶液注满玻璃板，插入上样梳子。
等待凝胶聚合后将上样梳子拔出，按照电泳装置说明安装，上槽为负极，下槽为正极。将10X Tris-Gly电泳缓冲液稀释到1X，注满电容槽。电压约150V，电流约为25mA，预电泳20min，关掉电源。使用缓冲液清洗上样槽，使用加样枪或微量注射器将所配样品溶液缓慢地注入加样槽底部，打开电源，开始电泳，约2小时后，完成电泳(可视溴酚蓝的条带为前沿，距离上样孔一定距离后停止)。
取下凝胶，用双蒸水洗三遍，各5分钟。加入BioRad G250染色液覆盖凝胶，染色1小时。弃去染色液，加入双蒸水脱色三遍，各10分钟。使用平板扫描仪或者凝胶成像系统扫描染色后的凝胶。
4.实验结果
如图2所示。
结果显示：多肽序列1、2、3、5、8、10均可以和靶点肽N38b结合形成新的条带，多肽7、9与N38b结合后可以使原C肽条带消失，说明这些多肽均可以N38b相互作用。
实施例18：荧光共振能量转移检测方法研究多肽1-12与NHR靶点疏水口袋区的相 互作用
1.实验目的
通过荧光共振能量转移检测方法(FRET)研究1-12与gp41NHR靶点的相互作用。
2.实验材料
选用涵盖口袋结合区域的探针肽CP2-LY和靶点肽env2.0结合对，来检测多肽1-12竞争结合于靶点肽的强度。CP2-LY和env2.0的序列如下所示：
Ac-MTWBEWDREIBNYTSLIC-CONH2(CP2，其中除了C-端酰胺化和N-端乙酰化，其余的氨基酸序列部分表示为SEQ ID NO：15)
Ac-MTWBEWDREIBNYTSLIC(LY)-CONH2(CP2-LY，其中除了C-端酰胺化和染料荧光黄碘乙酰胺二钾盐以及N-端乙酰化，其余的氨基酸序列部分表示为SEQ ID NO：16)
Bpy-GQAVEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVEKK-CONH2(env2.0，其中除了C-端酰胺化和N-端Bpy化，其余的氨基酸序列部分表示为SEQ ID NO：17)
其中B为α-氨基异丁酸，LY指染料荧光黄碘乙酰胺二钾盐(Lucifer yellowiodoacetamide dipotassium salt)，Bpy为2,2‘-二吡啶-5’-羧酸。CP2-LY和env2.0的制备方法可以参考Cai,L.,et al.,Antimicrobial Agent and Chemotherapy,2007.51(7):p.2388-2395.
实验中所使用的缓冲液为含有0.01％tween20的Tris-Ac(pH7.0)缓冲液。将env2.0溶于缓冲液中，根据290nm下的紫外吸收确定其浓度。用缓冲液配制2mM的硫酸亚铁铵溶液；将env2.0与硫酸亚铁铵溶液以3:1当量混合配制成Fe(Env2.0)3溶液待用。将CP2-LY溶于缓冲液中，根据425nm下的紫外吸收确定其浓度。
3.实验方法
实验中将不同样品溶液在96孔圆底板(Costar3799，Corning Incorporation，USA)中混合，然后转移至384孔黑色板(Greiner Bio-one781096)中，用Spectra Max M5酶标仪(Molecular Devices，USA)，以激发光425nm发射光540nm测定荧光信号强度。
CP2-LY和env2.0结合强度(Kd)的测定：使384孔板中最终每孔含缓冲液10μL、1μM的CP2-LY溶液10μL和起始浓度为100μM的逐级2倍稀释的Fe(Env2.0)3溶液10μL。重复三次检测。
多肽竞争结合于靶点肽强度(Ki)的测定：使384孔板中最终每孔含1μM的CP2-LY溶液10μL，10μM的Fe(Env2.0)3溶液10μL，起始浓度为100μM的逐级2倍稀释的抑制剂多肽10μL。以CP2为对照，每个样品重复三次检测。
4.实验结果
如图3所示。
结果显示：不同于对照多肽CP2，多肽1、7、8对CP2-LY和env2.0的结合没有表现出抑制作用。由于CP2-LY和env2.0的结合主要是代表了口袋结合区域的NHR-CHR间的相互作用，因此证明多肽1、7、8的活性作用位点不是NHR上的疏水口袋区。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (15)

1.一种分离的多肽、其衍生物或其可药用盐，其中，所述多肽的氨基酸序列分别如SEQID NO：1－2、4－6、10－11中的任一序列所示；
其中，所述衍生物是指所述多肽的N末端连接乙酰基或亲脂性基团，和/或
C末端连接酰胺基或亲脂性基团；
其中，所述亲脂性基团是含有3到20个碳原子的脂肪酸链或者胆固醇。
2.根据权利要求1所述的多肽、其衍生物或其可药用盐，其中，所述多肽的N末端乙酰化，和/或C末端酰胺化。
3.一种药物组合物，其包含权利要求1至2中任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的辅料。
6.权利要求1至2中任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗包膜类病毒感染的药物中的用途，其中，所述包膜类病毒感染为HIV感染所致疾病。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述HIV感染所致疾病为艾滋病。
8.权利要求1至2中任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐在制备或作为HIV融合抑制剂或者抗HIV药物中的用途。
9.一种在体外抑制HIV的方法，包括使用有效量的权利要求1至2中任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐的步骤。
10.一种在体外抑制HIV-1Env介导的细胞融合的方法，包括使用有效量的权利要求1至2中任一项所述的多肽、其衍生物或其可药用盐的步骤。
11.编码权利要求1至2中任一项所述多肽的核苷酸序列。
12.一种核酸构建体，其包含权利要求9所述的核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的核酸构建体，其为重组载体。
14.根据权利要求13所述的核酸构建体，其中，所述重组载体为重组表达载体。
15.一种重组宿主细胞，其包含权利要求12至14中任一项所述的核酸构建体。
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