CN113817026A - 靶向刺突蛋白hr1的订书肽、制备方法及抗新型冠状病毒应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靶向刺突蛋白HR1的订书肽、制备方法及抗新型冠状病毒应用，以SEQ ID NO.1所示的直链肽Ac‑DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL‑NH2为肽链模板，将第i位以及第i+4位氨基酸被2‑氨基‑2‑甲基‑6‑庚烯酸替换并环合得到，其中，i为1～32中的任意整数。本发明通过对covHR2‑0进行修饰，合成一系列订书肽，增强其螺旋度和稳定性，从而表现出对新冠病毒更有效的融合抑制活性，实验结果证实了其可显著抑制新型冠状病毒的生长和繁殖，在预防和治疗新型冠状病毒方面具有潜在应用价值。

Description

靶向刺突蛋白HR1的订书肽、制备方法及抗新型冠状病毒应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种多肽药物，具体涉及一种靶向刺突蛋白HR1的订书肽、制备方法及应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是指由一种传染性强、致病性强的冠状病毒SARS-CoV-2感染导致的肺炎疾病，感染后常见伴有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。从2019年起就对全世界的经济和社会造成了不可估量的损失，感染人数和因其导致的死亡人数，使公共卫生面临前所未有的压力，也对全球公共安全构成重大威胁。尤其最近局部地区的疫情反弹，至今人们还生活在恐慌和不安中，因此全球开发针对新冠的疗法的研发工作的十分重要，研发新型抗冠状病毒药物刻不容缓。
正如我们所知，开发SARS-CoV-2疫苗是一种方法。尽管针对新型冠状病毒的疫苗已经研发出来了。目前的疫苗只能用于在没有感染的情况下防止SARS-CoV-2感染，一旦患者被感染，不能用做治疗药物。治疗2019冠状病毒病有效药物的市场还相对空缺。另外，相对来说，接种疫苗后，感染SARS-CoV-2也不是绝对不可能的，目前有些感染者中就已经全程接种了疫苗。多肽分子具有亲和力高、选择性好、毒性低的优点，在抗病毒药物的开发中也发挥着重要作用，去寻找抑制SARS-CoV-2感染的多肽药也是一个手段。
SARS-CoV-2Spike蛋白首先通过与hACE2受体结合而侵入细胞，然后在宿主细胞中复制。SARS-CoV-2Spike蛋白由S1亚基和S2亚基组成。S1亚基与细胞受体结合，诱导S2亚基的构象变化；然后，S2亚基中的HR1区域与HR2区域结合，促进SARS-CoV-2融合和进入。宿主细胞与SARS-CoV-2之间的蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)是抑制SARS-CoV-2复制的重要靶点。因此，寻找抑制SARS-CoV-2与细胞受体结合的肽融合抑制剂是一项重要的策略和挑战。
现有技术披露的众多信息中到，有文献报道36个氨基酸残基的covHR2-0直连肽可以通过与新型冠状病毒的S蛋白HR1区域结合，从而抑制病毒与受体细胞结合(Xia,S.,etal.,Fusion mechanism of 2019-nCoV and fusion inhibitors targeting HR1 domainin spike protein.Cell Mol Immunol,2020.17(7):p.765-767)。尽管多肽有高结合力、低毒性等优势，但也存在一定缺陷，直链肽的透膜能力较差，它在生理环境下多肽稳定性也较差，容易被降解，导致它们失去相关的生物构象，结合选择性低。
在直链肽的基础上适当优化可得到活性更好，稳定性更高的多肽药物。订书肽是近年来获得广泛关注的一类稳定性强、透膜性好的多肽模拟物，利用订书肽策略能够有效地提高多肽的螺旋性、稳定性。因此，本申请发明人推测将covHR2-0进行修饰，设计合成一系列的订书肽，有助于提高它的稳定性，螺旋度和抗病毒活性。实验结果也表明一些covHR2-0的订书肽的研究有一定的意义，可能是未来抗新型冠状病毒药物开发优良的先导化合物。
发明内容
本发明依托上述研究进行，针对目前新型冠状病毒药物治疗缺乏的现状，提供一种具有抑制新型冠状病毒生长繁殖的订书肽及其制备方法和应用。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了靶向刺突蛋白HR1的订书肽，以SEQ ID NO.1所示的直链肽Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，将第i位以及第i+4位氨基酸被S5(2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸)替换并环合得到；其中，i为1～32中的任意整数，共32条订书肽，编号依次为SCH2-1-1～SCH2-1-32。具体如下：
1)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中1D和5I被S5替换并环合；
2)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中2I和6N被S5替换并环合；
3)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中3S和7A被S5替换并环合；
4)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中4G和8S被S5替换并环合；
5)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中5I和9V被S5替换并环合；
6)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中6N和10V被S5替换并环合；
7)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中7A和11N被S5替换并环合；
8)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中8S和12I被S5替换并环合；
9)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中9V和13Q被S5替换并环合；
10)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中10V和14K被S5替换并环合；
11)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中11N和15E被S5替换并环合；
12)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中12I和16I被S5替换并环合；
13)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中13Q和17D被S5替换并环合；
14)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中14K和18R被S5替换并环合；
15)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中15E和19L被S5替换并环合；
16)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中16I和20N被S5替换并环合；
17)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中17D和21E被S5替换并环合；
18)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中18R和22V被S5替换并环合；
19)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中19L和23A被S5替换并环合；
20)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中20N和24K被S5替换并环合；
21)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中21E和25N被S5替换并环合；
22)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中22V和26L被S5替换并环合；
23)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中23A和27N被S5替换并环合；
24)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中24K和28E被S5替换并环合；
25)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中25N和29S被S5替换并环合；
26)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中26L和30L被S5替换并环合；
27)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中27N和31I被S5替换并环合；
28)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中28E和32D被S5替换并环合；
29)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中29S和33L被S5替换并环合；
30)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中30L和34Q被S5替换并环合；
31)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中31I和35E被S5替换并环合；
32)以Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，其中32D和36L被S5替换并环合。
上述32条订书肽的结构示意图如图1和图2所示。
本发明的第二方面，提供靶向刺突蛋白HR1的订书肽肽的制备方法，包括如下步骤：
A、在缩合剂作用下使首个氨基酸的C端与固相载体偶联；
B、使用脱保护试剂脱去氨基酸上的Fmoc保护基；
C、在缩合剂作用下连接下一个氨基酸；
D、重复进行脱保护-耦合操作，依照氨基酸序列合成肽链；其中，环合位点以S5分别替代i和i+4位氨基酸；
E、最后一个氨基酸脱保护后乙酰化；
F、在环合剂作用下使i和i+4位S5氨基酸发生烯烃复分解反应，环合肽链；
G、使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得相应订书肽。
优选的，步骤A中，采用的缩合剂为DIC-Oxyme缩合体系，活化剂为DIC，以NMP为溶剂；氨基酸、Oxyme、DIC的比例为1:1:1:6(mol/mol/mol/ml)或1:0.9:0.9:6(mol/mol/mol/ml)。
进行固相合成时，树脂的载样量为0.3mmol/g；偶联反应的温度为50～60℃，优选55℃；偶联反应的时间为20-30min，优选20min。
优选的，步骤B中，所述脱保护试剂为Oxyme、哌啶及DMF的混合溶液，比例为71:2:4(m/v/v)。
脱Fmoc保护是采用保护试剂作用5min后，再次作用5min；脱除Fmoc基团的反应温度为20～30℃，更优选为25℃。
优选的，步骤D中，S5后所接的第一个氨基酸反应时间为2h并按相同条件重复反应一次再进行下一步操作。
优选的，步骤E中，使用的乙酰化试剂为DIEA、醋酸酐与DMF的混合液，投料比为1:1:8(v/v/v)；所述乙酰化是采用树脂在乙酰化试剂中反应20min；反应温度为20～30℃，更优选为25℃。
优选的，步骤F中，所述环合剂为GrubbsⅠ试剂的二氯乙烷的溶液，投料比为树脂载样量:GrubbsⅠ试剂:二氯乙烷＝0.3:58:6(mmol/mg/ml)。所述环合是树脂在环合试剂中震荡两次，每次2h；反应温度为20～30℃，更优选为25℃。
优选的，步骤G中，切割试剂为TIPS、TFA、H2O和苯酚的混合溶液，体积比为2:88:5:5，所述切割试剂与直链肽的体积质量比为1:10mL/mg；切割的温度为20～30℃，更优选为25℃；切割的时间为4h。
采用的纯化方法为反向高效液相色谱法，条件如下：色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ柱；流动相：流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈；梯度洗脱程序：39％B洗脱0～5min，39％～59％B洗脱5～60min；流速为20ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
本发明的第三方面，提供了上述靶向刺突蛋白HR1的订书肽的用途，具体为在制备抗病毒药物中的用途。该抗病毒药物优选为抗能够与ACE2蛋白结合的病毒的药物，通过阻断病毒与细胞ACE2蛋白结合，实现抗病毒。
进一步优选，该抗病毒药物为抗SARS-CoV-2病毒的药物，实现新型冠状病毒治疗。
本发明的第四方面，提供了一种抗病毒药物组合物，包括活性组分以及药学上可接受的辅料。活性组分以上述靶向刺突蛋白HR1的订书肽为唯一活性组分，或者包含上述靶向刺突蛋白HR1的订书肽。
本发明的药物或药物组合物可以和药学上常用的辅料制成多种剂型，例如其可以是为汤剂、散剂、丸剂、静脉乳剂、脂质体制剂、气雾剂、前体药制剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂等。给药方式不限于口服、注射等。
本发明有益效果说明如下：
制备方面，本发明以氨基树脂为载体，按照模板肽covHR2-0：Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2氨基酸序列在DIC-Oxime缩合体系中，通过Fmoc固相合成法，合成得到肽链，其间在保留关键氨基酸残基的基础上，于特定位置以S5代替原有氨基酸，连接在树脂上直链肽在GrubbsⅠ试剂的二氯乙烷溶液中进行烯烃复分解反应环合后从树脂切下得到目标订书肽，所得化合物经纯化后，采用HPLC及MS等光谱进行表征分析。该方法简便易行，HPLC图可见所得订书肽纯度大于90％。
肽稳定性方面，稳定性实验验证，订书肽形式的多肽能够至少30小时维持活性，直链形式的多肽活性只能维持不足25小时；活性强度方面，维持12后，订书肽形式的多肽活性依然保持80％以上，而直链形式的多肽活性则降低至不足20％。
效果方面，通过真假病毒实验，本发明的订书肽能够有效抑制新型冠状病毒的生长和繁殖，并且部分订书肽较直链肽covHR2-0相比活性高，且呈剂量依赖的方式有效抑制新型冠状病毒的感染和复制。
本申请发明人基于丰富的研究经验，认识到对covHR2-0进行修饰，合成一系列订书肽，增强其螺旋度和稳定性，从而表现出对新冠病毒更有效的融合抑制活性，实验结果证实了其可显著抑制新型冠状病毒的生长和繁殖，在预防和治疗新型冠状病毒方面具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明中订书肽SCH2-1-1～SCH2-1-16的结构示意图。
图2为本发明订书肽SCH2-1-17～SCH2-1-32的结构示意图；
图3为本发明订书肽的合成路线图；
图4～图7为纯化后covHR2-0、SCH2-1-1～SCH2-1-32的高效液相色谱图；
图8～图15为纯化后covHR2-0、SCH2-1-1～SCH2-1-32的目标化合物质谱图。
图16为订书肽抗假病毒实验结果，其中(a)直链肽covHR2-0与32条订书肽抗病毒效果对比；(b)订书肽SCH2-1-20的剂量依赖实验结果；
图17为膜融合实验结果，其中，(a)为直链肽covHR2-0对细胞融合抑制实验结果；(b)为订书肽SCH2-1-20对细胞融合抑制实验结果。
图18为订书肽抗真病毒实验结果，其中(a)直链肽covHR2-0与32条订书肽抗病毒效果对比；(b)订书肽SCH2-1-20及SCH2-1-27的预防剂量依赖实验；(c)订书肽SCH2-1-20及SCH2-1-27的治疗剂量依赖实验。
图19为肽的稳定性实验结果，其中(a)订书肽SCH2-1-20及SCH2-1-27与直链肽covHR2-0肽活性比对；(b)直链肽covHR2-0不同时间的肽残余量；(c)订书肽SCH2-1-20不同时间的肽残余量；(d)订书肽SCH2-1-27不同时间的肽残余量。
图20为肽的螺旋度实验结果，其中，(a)SCH2-1-1～SCH2-1-8螺旋度；(b)SCH2-1-9～SCH2-1-16螺旋度；(c)SCH2-1-17～SCH2-1-25螺旋度；(d)SCH2-1-26～SCH2-1-32螺旋度。
具体实施方式
下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例，涉及的缩略词解释如下：
Fmoc：芴甲氧羰基
DCM：二氯甲烷
DCE：二氯乙烷
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
Oxyme：Ethyl Cyanoglyoxylate-2-Oxime肟基氰乙酸乙酯
DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺
NMP：N-甲基吡咯烷酮
S5：2-amino-2-methylhept-6-enoic acid，2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸
TFA：三氟乙酸
TIPs：三异丙基硅烷
GrubbsⅠ：苯基亚甲基双(三环已基磷)二氯化钌
涉及的实验材料来源如下：
氨基酸、氨基树脂购自上海吉尔生化有限公司；N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、Ethyl Cyanoglyoxylate-2-Oxime、三氟乙酸(TFA)、乙腈(色谱纯)购自北京百灵威科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、无水乙醚、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、哌啶、苯酚均为分析纯，购自国药集团化学试剂北京有限公司。
实施例1本发明抗新冠病毒订书肽的制备
1、订书肽结构
按照如SEQ ID NO.1所示模板直连肽covHR2-0：Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2，氨基酸序列设计并合成32条订书肽，具体结构如图1和图2所示。
2、订书肽的合成
合成线路图如图3所示，具体如下：
(1)化合物1的制备
取氨基树脂333mg(载样量为0.30mmol·g-1)加入到固相合成反应管中，用DCM浸泡20min使树脂充分溶胀，抽干待用；
加20％哌啶-DMF溶液(0.1M Oxyme)至树脂完全淹没，25℃下振荡5min×2脱去树脂上的Fmoc，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
(2)化合物2的制备
将序列中首个氨基酸(1mmol)、Oxyme(142mg，1mmol)和DIC(155.0μL，1mmol)混溶于7ml NMP中，加入到树脂中60℃下振荡20min(S5后的一个氨基酸反应2h)，依次用DMF、DCM、DMF依次洗涤树脂5、5、2次。
(3)化合物3的制备
重复(1)、(2)步骤的做法，根据多肽序列依次将Fmoc氨基酸(0.5mmol)、Oxyme(71mg)和DIC(75μl)混溶于7ml NMP，加入到树脂中，于60℃下振荡20min，重复脱保护→缩合→脱保护，直至所有氨基酸连接完成。最后一个氨基酸脱保护后，加入DIEA:乙酸酐:DMF(1:1:8)混合液10ml在25℃下震荡20min，依次用DMF、DCM、DMF洗涤树脂5、5、2次。
(4)化合物4的制备
加入GrubbsⅠ(58mg)试剂的二氯乙烷溶液(6ml)，25℃下震荡反应两次，每次2h，反应完成后依次用DCM、DMF、无水乙醚洗涤树脂各3次，抽真空干燥树脂。
(5)目标化合物的制备
将树脂洗净抽干，加入TIPS、TFA、H2O和苯酚的混合溶液，体积比为2:88:5:5(V/V/V/V)10mL，常温下振荡4h，过滤，用少许TFA洗涤树脂，收集滤液。氮气鼓泡吹走多余TFA，倒入冰乙醚沉淀离心后，弃掉上清液，继续用冰乙醚反复洗涤离心三次，氮气吹干得订书肽粗品。设计的32条订书肽中，除SCH2-1-21其余全部成功得到。
3、目标订书肽的纯化
将粗肽用乙腈和水溶解，通过制备型RP-HPLC纯化。分离条件如下：
仪器：Pre-HPLC SD-1VARIAN高效液相色谱仪；
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ(250×20mml.D，S-5μm，12nm)；
流动相：流动相A为体积分数为0.1％TFA的水溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液；
步骤与参数：39％B洗脱0～5min，39％～59％B洗脱5～60min；流速为20ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
实施例2产物的鉴别与结构分析
将实施例1所得产物通过HPLC进行鉴别以及HR-Q-TOF-MS(高分辨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)进行结构分析，色谱流动相为乙腈和水。流动相A为体积分数为0.1％TFA的水溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液，梯度洗脱(0～5min，流动相B：5％；5-30min，流动相B：5％～65％)；流速1mL·min-1；检测波长214nm和254nm，进样量20μL。
经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备订书肽纯度>90％(图4-7)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图8-15所示。
实施例3假病毒实验
本研究采用荧光素酶报告基因法测定实施例1所得产物的抗假病毒感染细胞活性。
待测样品用DMSO溶解，配成10mM母液，Huh-7细胞六孔板每孔转染ACE2(3μg)，293T细胞六孔板每孔转染NCovS(1μg)及PNL4-3(2μg)，Huh-7于96孔板铺板，取293T上清加药，用含假病毒培养基(上清：纯培养基：完全培养基＝2:2:1)将对应药物稀释成最终药物浓度为10mM。
实验分成三组：A:含假病毒培养基加药B：含假病毒培养基不加药C：对照(正常培养基+DMSO)，加入含各浓度药物的含假病毒培养基培养48h，吸去培养基，PBS洗两次，加入裂解液，冰上裂解30min，转移各孔液体至酶标板，加入100μL底物，用酶标仪测强度，读数后用Cell infection％＝[(A-C)/(B-C)]×100％计算病毒感染率。
实验结果见图16a，本发明的订书肽可以抑制新型冠状病毒的生长和繁殖，并且部分订书肽较直连肽covHR2-0相比活性稍高。筛选出活性稍高的药物SCH2-1-16，SCH2-1-20，SCH2-1-24，SCH2-1-25，改变药物浓度(0.097、0.39、1.56、6.25和5μM)，重复上述操作，实验结果发现SCH2-1-20可以以剂量依赖的方式有效抑制新型冠状病毒的感染和复制，SCH2-1-20(IC50:4.18μM)较直链肽covHR2-0(IC50:16.47μM)稍有提高(图16b)。
实施例4细胞与细胞融合实验
应用高内涵细胞药物筛选和分析系统(PerkinElmer High Content AnalysisSystem Operetta CLS,Harmony 4.9)去测定实施例1所得产物对表达NCovS 293T细胞和表达ACE2的Huh-7细胞融合的影响。
待测样品用DMSO溶解，配成30mM母液。293T细胞分别转染pAAV-Hncovs-CAG-RFP或pAAV-CAG-RFP，转染后培养72h，消化。稳定表达ACE2-GFP的Huh-7提前4小时铺96孔板，1×104个/孔，消化后的293T细胞加入不同浓度的药物按5×104个/孔，加入已铺huh-7细胞的孔板中，培养5h，得到在30、15、7.5、3.75，0mM浓度下两种293T分别与Huh7的融合情况。
统计方法：A:各孔293T红色荧光细胞总数；B:加入转染pAAV-CAG-RFP 293T细胞各孔的红色和绿色荧光双阳性细胞数量；C：加入转染pAAV-Hncovs-CAG-RFP 293T细胞各孔的红色和绿色荧光双阳性细胞数量。Cell fusion％＝(C-B)/A×100％计算细胞融合率。
实验结果见图17，多肽对于细胞融合的抑制作用，呈剂量依赖，随着直链肽或订书肽浓度的增加，细胞融合程度降低；相同浓度下，订书肽的抑制效果远高于直链肽，如在30μM订书肽SCH2-1-20浓度条件下，细胞融合率约为10％，而相同浓度直链肽条件下，细胞融合率则高达60％。
实施例5真病毒实验
将实施例1所得产物用DMSO溶解，配成10mM母液，将Vero E6细胞96孔板铺板，培养过夜，向培养板中加入稀释为50μM浓度的肽样品的维持液，37℃，2h，然后向培养板中加入SARS-CoV-2(MOI＝0.1、0.01、0.001)，培养24h，然后将细胞固定，利用患者血清做免疫荧光，检测细胞中病毒感染比例。
实验结果见图18a，根据实验结果筛选出活性相对较好的两条肽SCH2-1-20和SCH2-1-27。改变药物浓度(1.25、2.5、5、10、20、40和80μM)，一组先加药，再向培养板中加入SARS-CoV-2，重复上述实验操作，得到预防组剂量依赖性数据见图18b，SCH2-1-20(IC50:15.48μM)和SCH2-1-27(IC50:22.84μM)较直链肽covHR2-0(IC50:27.15μM)均略有提高；另一组先向培养板中加入SARS-CoV-2，再加不同浓度的药物(1.25、2.5、5、10、20、40和80μM)培养24h，重复上述实验操作，得到治疗组剂量依赖性数据见图18c，SCH2-1-20(IC50:9.08μM)和SCH2-1-27(IC50:18.27μM)较直链肽covHR2-0(IC50:19.36μM)均略有提高。
实施例6产物稳定性实验
将实施例5筛选出来的SCH2-1-20，SCH2-1-27和对照肽covHR2-0溶于DMSO，配成1mM的储备液，取一定量的糜蛋白酶溶于含2mM CaCl2的磷酸盐缓冲液至糜蛋白酶的浓度为100ng/μl，取含糜蛋白酶的磷酸盐缓冲液840μl加280μl 1mM的肽储备液进行酶消化反应，于0h 1h 6h 8h 12h时间点的130ul反应液，加入30ul 1mM的HCl淬灭糜蛋白酶活性，使用HPLC分析不同时间点肽残余量。
实验结果参见图19，订书肽形式的多肽活性至少能够维持30小时，直链形式的多肽活性只能维持不足25小时；活性强度方面，维持12后，订书肽形式的多肽活性依然保持80％以上，而直链形式的多肽活性则降低至不足20％。
实施例7产物圆二色谱实验
将实施例1所得产物溶于磷酸盐缓冲溶液中，配成最终浓度为50uM，在Jasco-715分光偏光仪上用1nm石英比色管在25°条件下获得CD光谱。测量参数设置为:波长，190～255nm；速度，20nm min-1；步进分辨率，1.0nm；累计2次。所有光谱数据经过背景减除后转换为摩尔椭圆度的均匀尺度。用标准参数对曲线进行平滑处理。根据肽在222nm处的椭圆度和肽序列中氨基酸的数量，利用文献方程计算了各肽的螺旋度。
结果如图20所示，32条订书肽的螺旋度普遍高于直链肽，最高可达70.9％，抗病毒多肽螺旋度的增强可以提高多肽对病毒的选择性，即表现为对病毒的高抑杀活性与对真核细胞的低毒性。
以上实施例表明，本发明成功制备得到基于covHR2-0的订书肽，且证明了该系列大部分订书肽较直连肽而言，有相对较高的螺旋度，且筛选出来的两条肽有相对高的稳定性和相对较好的抑制新型冠状病毒感染的活性，这些肽可能作为进一步优化新型冠状病毒治疗剂的先导化合物，具有良好的前景。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军海军军医大学
<120> 靶向刺突蛋白HR1的订书肽、制备方法及抗新型冠状病毒应用
<130> 权利要求书、说明书
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 1
Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile
1 5 10 15
Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp
20 25 30
Leu Gln Glu Leu
35

Claims (10)

1.一种靶向刺突蛋白HR1的订书肽，其特征在于：以SEQ ID NO.1所示的直链肽Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL-NH2为肽链模板，将第i位以及第i+4位氨基酸被2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸替换并环合得到，
其中，i为1～32中的任意整数。
2.权利要求1所述的靶向刺突蛋白HR1的订书肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、在缩合剂作用下使首个氨基酸的C端与固相载体偶联；
B、使用脱保护试剂脱去氨基酸上的Fmoc保护基；
C、在缩合剂作用下连接下一个氨基酸；
D、重复进行脱保护-耦合操作，依照氨基酸序列合成肽链；其中，环合位点以S5分别替代i和i+4位氨基酸；
E、最后一个氨基酸脱保护后乙酰化；
F、在环合剂作用下使i和i+4位S5氨基酸发生烯烃复分解反应，环合肽链；
G、使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得相应订书肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
其中，步骤A中，缩合剂为DIC-肟基氰乙酸乙酯缩合体系，以N-甲基吡咯烷酮为溶剂；氨基酸、肟基氰乙酸乙酯、DIC的摩尔比为1:1:1:6～1:0.9:0.9:6；固相载体的载样量为0.3mmol/g；偶联反应过程中，反应温度为50～60℃，偶联反应时间为20-30min，
步骤B中，所述脱保护试剂为肟基氰乙酸乙酯、哌啶及DMF的混合溶液，肟基氰乙酸乙酯的质量与哌啶及DMF体积的比例为71:2:4；
脱Fmoc保护基的操作条件如下：采用脱保护试剂连续两次作用5min，反应温度为20～30℃。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
其中，步骤D中，连接S5后所接的第一个氨基酸反应时间为2h，并按相同条件重复反应一次后再进行下一步操作；
步骤E中，使用的乙酰化试剂为DIEA、醋酸酐与DMF的混合液，投料体积比为1:1:8；采用固相载体在乙酰化试剂中反应20min，反应温度为20～30℃。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
其中，步骤F中，环合剂为Grubbs Ⅰ试剂的二氯乙烷的溶液，固相载体量:Grubbs Ⅰ试剂:二氯乙烷＝0.3mmol:58mg:6mL；环合时，将固相载体在环合试剂中震荡两次，每次2h，反应温度为20～30℃，
步骤G中，切割试剂为TIPS、TFA、H2O和苯酚的混合溶液，体积比为2:88:5:5，所述切割试剂与直链肽的体积质量比为1:10mL/mg，切割的温度为20～30℃，切割的时间为4h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
其中，步骤G中，采用的纯化方法为反向高效液相色谱法，条件如下：色谱柱：YMC-PackODS-AQ柱；流动相：流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈；梯度洗脱程序：39％B洗脱0～5min，39％～59％B洗脱5～60min；流速为20mL/min，进样量为5mL，检测波长214nm。
7.权利要求1所述的靶向刺突蛋白HR1的订书肽在制备抗病毒药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述抗病毒药物为抗能够与ACE2蛋白结合的病毒的药物。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述抗病毒药物为抗SARS-CoV-2病毒的药物。
10.一种抗病毒药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学上可接受的辅料，所述活性组分以权利要求1所述的靶向刺突蛋白HR1的订书肽为唯一活性组分，或者包含权利要求1所述的靶向刺突蛋白HR1的订书肽。
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