CN112625094B

CN112625094B - 一种广谱冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途

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Publication number: CN112625094B
Application number: CN202110070935.7A
Authority: CN
Inventors: 何玉先; 朱园美; 于丹葳; 周述靓
Original assignee: Chengdu Aoda Biotechnology Co ltd; Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Chengdu Aoda Biotechnology Co ltd; Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2041-01-19
Also published as: CN112625094A; WO2022156620A1

Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种广谱冠状病毒膜融合抑制剂。本发明所述广谱冠状病毒膜融合抑制剂，用于制备预防和治疗冠状病毒所致疾病的药物组合物，所述药物组合物在预防和治疗冠状病毒所致疾病的用途。

Description

一种广谱冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途

技术领域

本发明涉及一种广谱冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途。

背景技术

冠状病毒(CoV)是具有包膜的单股正链RNA病毒，分为α，β，γ和δ四个属，其中α与β属CoV只感染哺乳动物，而γ与δ属CoV主要感染禽类。目前知道有7种CoV感染人类(HCoV)，包括α属的HCoV-229E和HCoV-NL63，β属的HCoV-OC43、CoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV以及最近出现的2019新冠病毒SARS-CoV-2。前4种HCoV是常见的全球性流行病原体，通常只引起普通的感冒症状，约占成人上呼吸道感染的10％至30％，但对儿童、老年人和免疫功能低下的患者仍可以造成严重甚至致命的疾；SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2则属于高致病病原体，能导致严重的肺部疾病，病死率高。

本发明科研团队一直致力于病毒膜融合抑制剂药物的研究与开发，研发出一系列对SARS-CoV-2具有很强抑制活性的多肽类膜融合抑制剂，并且它们也能有效抑制SARS-CoV的感染，详见中国专利CN202010181328.3。由于该发明的目的为进一步开发高致病性HCoV治疗药物提供了先导化合物，本发明的目的就是在上述专利的基础上进一步研究出一种具有广谱性的、高活性的抗冠状病毒病毒膜融合抑制剂，以期满足临床需求。

发明内容

本发明提供了一种新的冠状病毒膜融合抑制剂及其用途。

为实现上述目的，本发明首先提供了一种结构I所示的化合物，该化合物所成的可药用的盐、溶剂化物、螯合物或非共价复合物，基于该化合物基础上的药物前体，或上述形式的任意混合物。

Ac-Ser-Val-Val-Asn-Ile-Gln-Lys-Glu-Ile-Asp-Arg-Leu-Asn-Glu-Val-Ala-

Lys-Asn-Leu-Asn-Glu-Ser-Leu-Ile-Asp-Leu-Gln-Glu-Leu-Gly-Lys-Tyr-

Glu-Gln-Tyr-Ile-AA1-AA2(R)-AA3

结构I

结构I中的AA1为((PEG_n1(CH₂)_n2CO)_n3)_n4-，

其中：

n1为1至30的整数；

n2为1至5的整数；

n3为1至5的整数；

n4为1至5的整数。

结构I中的AA2为Lys，或为Dap，或为Orn，或为Dab，或为Dah；

结构I中的AA3为NH₂，或为OH。

结构I中的R为丁二酸胆固醇单酯，或为2-胆固醇乙酸，或为2-胆固醇丙酸，或为3-胆固醇丙酸，或2-胆固醇丁酸，或为2-胆固醇异丁酸，或为3-胆固醇丁酸，或为3-胆固醇异丁酸，4-胆固醇丁酸，或为2-胆固醇戊酸，或为2-胆固醇异戊酸，或为3-胆固醇戊酸，或为5-胆固醇戊酸，或为2-胆固醇己酸，或为6-胆固醇己酸，或为2-胆固醇庚酸，或为7-胆固醇庚酸，或为2-胆固醇辛酸，或为8-胆固醇辛酸。

本发明提供了含本发明化合物在预防和治疗冠状病毒所致疾病的方法。

本发明还提供了包括根据本发明化合物的用于制备预防和治疗冠状病毒所致疾病的药物组合物。

作为优选，所述药物组合物在预防和治疗冠状病毒所致疾病的用途。

本发明所述的冠状病毒为包括但不限于SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCoV和普通HCoV(例如229E，OC43和NL63)等冠状病毒。

本发明所涉及到的更多内容在以下有详细描述，或者有些也可以在本发明的实施例中体会。

除非另有所指，本文中所用来表示不同成分的数量、反应条件，在任意情况下都可解读为“大致的”、“大约的”意思。相应的，除有明确的特指外，在下述以及权利要求中所引用的数字参数都是大致的参数，在各自的实验条件下由于标准误差的不同，有可能会得到不同的数字参数。

本文中，当一个化合物的化学结构式和化学名称有分歧或疑义时，以化学结构式确切定义此化合物。本文所描述的化合物有可能含有一个或多个手性中心，和/或者双键以及诸如此类的结构，也可能存在立体异构体，包括双键的异构体(比如几何异构体)、旋光对映异构体或者非对映异构体。相应的，在本文描述范围内的任意化学结构，无论是部分或整体结构中含有上述类似结构，都包括了此化合物的所有可能的对映异构体和非对映异构体，其中也包括了单纯的任一种立体异构体(如单纯的几何异构体、单纯的对映异构体或者单纯的非对映异构体)以及这些异构体的任意一种混合物。这些消旋异构体和立体异构体的混合物由本领域技术人员利用不停的分离技术或手性分子合成的方法也可进一步被拆分成其组成成分的对映异构体或立体异构体。

结构式I的化合物包含了，但并不仅限于，这些化合物的光学异构体、消旋体和/或其他的混合物。上述情况下，其中单一的对映异构体或非对映异构体，如有旋光的异构体，可以用不对称合成的方法或消旋体拆分的方法获得。消旋体的拆分可用不同的方法实现，如常规的用助拆分的试剂重结晶，或用色谱方法。另外，结构式I的化合物也包含了带双键的顺式和/或反式的异构体。

本发明所述化合物包含但不限于，结构式I所示化合物以及他们所有的在药学上可用的不同形式。这些化合物的药学上可用的不同形式包括各种可药用的盐、溶剂化物、络合物、螯合物、非共价的复合物、基于上述物质基础上的药物前体和上述这些形式的任意混合物。

本发明提供的结构I所示的化合物性质稳定，是一种高效的、广谱的新型冠状病毒膜融合抑制剂，用于制备预防和治疗冠状病毒所致疾病的药物组合物，所述药物组合物用于预防和治疗冠状病毒所致疾病。

附图说明

图1新型抑制剂与靶序列多肽复合物α-螺旋含量

图2新型抑制剂与靶序列多肽复合物热稳定性T_m值

具体实施方式

本发明公开了一种广谱冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进相关参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中涉及的英文缩写所对应的中文名称见下表所示：

实施例1多肽的合成

制备方法，包括：采用固相多肽合成法制备肽树脂，肽树脂再经酸解得到粗品，最后粗品经过纯化得到纯品；其中固相多肽合成法制备肽树脂的步骤为在载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，制备肽树脂：

上述制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～3.5倍。

上述制备方法中，所述的载体树脂取代值为0.2～1.0mmol/g树脂，优选的取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。

作为本发明优选的方案，所述固相偶联合成法为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应。所述的去Fmoc保护的脱保护时间为10～60分钟，优选的为15～25分钟。所述的偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。

所述的偶联反应需添加缩合试剂，缩合试剂选自DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)、N,N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯中的一种；优选的为N,N-二异丙基碳二亚胺。所述缩合试剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选为2.5～3.5倍。

所述的偶联反应需添加活化试剂，活化试剂选自1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑，优选的为1-羟基苯并三唑。活化试剂的用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选的为2.5～3.5倍。

作为本发明优选的方案，所述的脱去Fmoc保护的试剂为PIP/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)混合溶液，混合溶液中含哌啶为10～30％(V)。去Fmoc保护试剂的用量为每克氨基树脂5～15mL，优选的为每克氨基树脂8～12mL。

优选的，肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到粗品：

进一步优选的，所述肽树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)和水的混合溶剂，混合溶剂的体积配比为：TFA为80～95％，EDT为1～10％，余量为水。

更进一步优选的，混合溶剂的体积配比为：TFA为89～91％、EDT为4～6％，余量为水。最优的，混合溶剂的体积配比为：TFA为90％、EDT为5％，余量为水。

所述酸解剂用量为每克肽树脂需要4～15mL酸解剂；优选的，每克肽树脂需要7～10mL酸解剂。

使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～6小时，优选的为3～4小时。

进一步的，粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到纯品，具体方法为：

取粗品，加水搅拌，调pH值至完全溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得纯化中间体浓缩液；

取纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到纯品醋酸水溶液，冷冻干燥后得纯品。

1、肽树脂的合成

使用Rink Amide BHHA树脂为载体树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与多肽氨基酸序列相应的保护氨基酸偶联，制得肽树脂。

(1)接入主链第1个保护氨基酸

取0.03mol第1个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

取0.01mol的Rink amide MBHA树脂(取代值约0.4mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应60～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。

(2)接入主链其他保护氨基酸

采用上述接入主链第1个保护氨基酸同样方法，依次接入上述对应的其他保护氨基酸，

得含主链氨基酸的树脂。

(3)侧链的接入

取0.03mol丁二酸胆固醇单酯和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03molDIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟。

取2.5mmol四三苯基膦钯和25mmol苯硅烷，用适量二氯甲烷溶解，进入到含主链氨基酸的树脂中，搅拌去保护4小时，过滤洗涤，得到去Alloc的树脂备用。

将加入活化后的丁二酸胆固醇单酯溶液加入到已去Alloc的树脂，偶联反应60～300分钟，过滤、洗涤和干燥，得到肽树脂。

2、粗品的制备

取上述肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为粗品。

3、纯品的制备

取上述粗品，加水搅拌溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用。采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，30mm*250mm的色谱柱流速为20mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得纯化中间体浓缩液；

纯化中间体浓缩液用0.45μm滤膜滤过备用，采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，30mm*250mm的色谱柱流速为20mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到纯品醋酸水溶液，冷冻干燥得纯品。

用上述方法合成了以下脂肽化合物：

同时合成了研究用对照化合物：

实施例2对病毒感染的抑制作用

1、实验材料与方法

表达SARS-CoV-2病毒S蛋白的质粒(定义为pCoV2-S)，参见发明人公开发表的论文(Zhu et al.Cross-reactive neutralization of SARS-CoV-2by serum antibodiesfrom recovered SARS1 patients and immunized animals.Sci Adv.2020；6(45):eabc9999和Zhu et al.Design of Potent Membrane Fusion Inhibitors Against SARS-CoV-2,an Emerging Coronavirus with High Fusogenic Activity.J Virol.2020；94(14):00653-20)。HIV骨架质粒pNL4-3.luc.RE由美国国立卫生研究院艾滋病试剂和参照物项目提供(目录号3418)；293T细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC，目录号CRL-3216)；靶细胞Huh-7购自国家实验细胞资源共享服务平台(编号3111C0001CCC000679)；靶细胞293T/ACE2由本实验室制备并保存(Cao et al.Potent and persistent antibody responsesagainst the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recoveredpatients.Virology Journal,2010,7:299)。基于S蛋白假病毒的抗病毒实验的基本步骤如下：

(1)假病毒的制备：将pCoV2-S质粒和pNL4-3.luc.RE按1:1共转染293T细胞，在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养48小时后收取含有假病毒的上清液，过滤后于-80℃保存备用。

(2)采用去离子水或二甲基亚砜(DMSO)溶解待测多肽并测定浓度，然后用DMEM培养基将多肽稀释到起始浓度，在96细胞培养板孔中进行3倍倍比稀释，多肽溶液终体积为50μL/孔，设3个复孔、9个稀释梯度。不加多肽的DMEM培养基作为对照。

(3)按每孔50μL将假病毒加入药物稀释板孔中，然后于室温孵育30分钟。

(4)将预先培养的293T/ACE2细胞或Huh-7细胞调整浓度为10×10⁴/mL悬液，并加入终浓度为15μg/mL的DEAE-dextran，然后将细胞加到含有病毒的96孔板中，100μL/孔。于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养48小时。

(5)弃除上清后按30μL/孔加入细胞裂解液，于室温裂解15分钟后加入荧光素酶底物(Promega公司)，用微孔板光度计测定相对荧光单位(RLU)，并计算制作抑制率曲线和药物半数抑制浓度(IC₅₀)。

2、实验结果与分析

实验结果表明：新型膜融合抑制剂IBP24～IPB27对抑制SARS-CoV-2假病毒(PV)感染293T/ACE2或Huh-7靶细胞的活性三次实验的平均IC50值见下表，可见新型膜融合抑制剂较于IPB20活性提高12～25倍。

实施例3对病毒细胞膜融合的抑制作用

1、实验材料与方法

为进一步评价多肽抑制剂的抗SARS-CoV-2活性，本发明进行了基于DSP的细胞-细胞融合抑制实验(方法参加Zhu et al.Design of Potent Membrane Fusion InhibitorsAgainst SARS-CoV-2,an Emerging Coronavirus with High Fusogenic Activity.JVirol.2020；94(14):00653-20)，具体步骤如下：

(1)将293T效应细胞悬液(1.5×10⁴个/100μL/孔)铺于96孔板中，同时将293T/ACE2靶细胞悬液(15×10⁴个/mL)铺于10-cm细胞培养皿中，置于37℃和5％CO₂条件下进行培养。

(2)培养16小时后，将pCoV2-S质粒和pDSP1-7质粒共转染293T效应细胞，同时将pDSP8-11质粒转染293T/ACE2靶细胞，然后继续培养细胞。

(3)于24小时后，将多肽在96孔板中进行3倍梯度稀释，设置3个复孔和9个稀释梯度。将稀释的多肽加到效应细胞，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育1小时。

(4)将DMEM完全培养基预热并按1：4000比例加入EnduRen活细胞底物(Promega公司)，然后用于重悬离心收集的293T/ACE2靶细胞，调整细胞浓度为30×10⁴/mL，于37℃、5％CO₂条件下孵育30分钟。

(5)将293T/ACE2靶细胞按100μL/孔加入到293T效应细胞中，然后在400xg离心3分钟以便效应细胞和靶细胞充分接触，然后培养混合后的细胞2小时。

(6)于微孔板光度计中读取其荧光素酶活性(RLU)，并计算抑制率和IC₅₀值。

2、实验结果与分析

实验结果见下，表明新型膜融合抑制剂IBP24～IPB27对SARS-CoV-2S蛋白介导细胞-细胞融合能力的抑制活性较于IPB20活性提高4～5倍。

实施例4对其他冠状病毒的抑制作用

SARS-CoV和MERS-CoV等假病毒(PV)的制备及抗病毒实验方法同实施例2所述。

实验结果表明，新型膜融合抑制剂同时对SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-NL63和HCoV-229E人冠状病毒具有良好的抑制作用，抑制活性较于IPB20活性提高1.5～5倍。

实施例5新型抑制剂与靶序列的相互作用分析

采用圆二色谱(CD)技术测定了本发明抑制剂与靶序列模拟多肽的相互作用，包括所形成复合物的二级结构(α-螺旋)及热稳定性。实验中所用靶序列模拟多肽源自于SARS-CoV-2刺突蛋白S2亚基的HR1序列，如下：

Ac-Phe-Asn-Gly-Ile-Gly-Val-Thr-Gln-Asn-Val-Leu-Tyr-Glu-

Asn-Gln-Lys-Leu-Ile-Ala-Asn-Gln-Phe-Asn-Ser-Ala-Ile-Gly-

Lys-Ile-Gln-Asp-Ser-Leu-Ser-Ser-Thr-Ala-Ser-Ala-Leu-Gly-

Lys-Leu-Gln-Asp-Val-Val-Asn-Gln-Asn-Ala-Gln-NH₂

1、实验材料与方法

将抑制剂及靶序列模拟多肽溶于pH 7.2的磷酸缓冲液(PBS)中并混合，每一多肽终浓度为10μM，于37℃水浴锅中放置30分钟，随后将多肽溶液移至相应比色皿中，使用Jasco分光偏振仪(型号J-815)扫描195-270nm波长范围内多肽溶液摩尔椭圆率[θ]_λ的变化情况，典型α-螺旋结构可在208nm和222nm处出现最大负峰，减去PBS空白对照来校正谱值，计算过程中以峰值为-33000degree.cm₂.dmol_-1作为α-螺旋含量100％的标准，根据多肽溶液在222nm处的摩尔椭圆率计算多肽α-螺旋含量的百分比。随后将该多肽溶液加入相应检测热稳定性的比色皿中，调整CD温控模块以每分钟2℃的速度扫描20-98℃时多肽溶液[θ]₂₂₂随温度变化情况。对熔解曲线进行平滑处理，利用Origin软件计算热解离转变的中点温度值(T_m)以反映螺旋热稳定程度。

2、实验结果与分析

实验结果表明：各脂肽抑制剂可以与靶序列模拟多肽相互作用形成复合物，具有典型的α螺旋结构(见图1)。比较突出的是，复合物具有极高的热稳定性T_m值(见图2)，说明抑制剂结合靶标比较稳定。

Claims

1.具有如下结构式的冠状病毒膜融合抑制剂：

化合物1

Ac-Ser-Val-Val-Asn-Ile-Gln-Lys-Glu-Ile-Asp-Arg-Leu-Asn-Glu-Val-Ala-Lys-Asn-Leu-Asn-Glu-Ser-Leu-Ile-Asp-Leu-Gln-Glu-Leu-Gly-Lys-Tyr-Glu-Gln-Tyr-Ile-PEG₄CH₂CO-Lys(丁二酸胆固醇单酯)-NH2；

化合物2

Ac-Ser-Val-Val-Asn-Ile-Gln-Lys-Glu-Ile-Asp-Arg-Leu-Asn-Glu-Val-Ala-Lys-Asn-Leu-Asn-Glu-Ser-Leu-Ile-Asp-Leu-Gln-Glu-Leu-Gly-Lys-Tyr-Glu-Gln-Tyr-Ile-PEG₅CH₂CO-Lys(丁二酸胆固醇单酯)-NH2；

化合物3

Ac-Ser-Val-Val-Asn-Ile-Gln-Lys-Glu-Ile-Asp-Arg-Leu-Asn-Glu-Val-Ala-Lys-Asn-Leu-Asn-Glu-Ser-Leu-Ile-Asp-Leu-Gln-Glu-Leu-Gly-Lys-Tyr-Glu-Gln-Tyr-Ile-PEG₆CH₂CO-Lys(丁二酸胆固醇单酯)-NH2；

化合物4

Ac-Ser-Val-Val-Asn-Ile-Gln-Lys-Glu-Ile-Asp-Arg-Leu-Asn-Glu-Val-Ala-Lys-Asn-Leu-Asn-Glu-Ser-Leu-Ile-Asp-Leu-Gln-Glu-Leu-Gly-Lys-Tyr-Glu-Gln-Tyr-Ile-PEG₈CH₂CO-Lys(丁二酸胆固醇单酯)-NH2。

2.一种权利要求1所述的冠状病毒膜融合抑制剂所成的可药用的盐。

3.一种包含权利要求1所述的冠状病毒膜融合抑制剂的药物组合物。

4.一种权利要求1所述的冠状病毒膜融合抑制剂在制备预防和治疗冠状病毒所致疾病的药物中的用途，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-NI63、HCoV-229E。