CN111675752B - 一种冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种冠状病毒膜融合抑制剂。本发明所述冠状病毒膜融合抑制剂，用于制备预防和治疗冠状病毒所致疾病的药物组合物，所述药物组合物在预防和治疗冠状病毒所致疾病的用途。

Description

一种冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途

技术领域

本发明涉及一种冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途。

背景技术

冠状病毒(CoV)是具有包膜的单股正链RNA病毒，分为α，β，γ和δ四个属，其中α与β属CoV只感染哺乳动物，而γ与δ属CoV主要感染禽类。目前知道有7种CoV感染人类(HCoV)，包括α属的229E和NL63，β属的OC43、HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV以及最近出现的2019-nCoV(SARS-CoV-2)。前4种HCoV是常见的全球性流行病原体，通常只引起普通的感冒症状，约占成人上呼吸道感染的10％至30％，但对儿童、老年人和免疫功能低下的患者仍可以造成严重甚至致命的疾；SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV则属于高致病病原体，能导致严重的肺部疾病，病死率高。

SARS-CoV病毒迅速蔓延到全世界29个国家和地区，累计确诊SARS病例超过8000人，患者死亡率大10％左右。基于2019-nCoV与SARS-CoV和蝙蝠冠状病毒SL-CoV-RaTG13分别具有79.5％和96％的序列同源性并使用相同的细胞受体(ACE2)，国际病毒分类委员会(ICTV)已将新冠病毒命名为SARS-CoV-2。该病毒比SARS-CoV具有更强的传播能力，截至2020年3月15日，国内已报告累计确诊病例81059人，其中3204例患者死亡；国外累计确诊病例已达64784人，死亡2641例，而且疫情呈现日益严重的局面。由于目前尚无针对冠状病毒的治疗药物和预防疫苗，给疫情防控带来巨大困难。

研究表明，位于冠状病毒表面的刺突状包膜糖蛋白(S蛋白)介导病毒对靶细胞的侵染过程，其S1亚基负责与细胞表面的受体结合，S2亚基则发挥病毒与细胞膜融合的功能。S2亚基在序列结构上依次含有融合肽(FP)、七肽重复域1(HR1)、七肽重复域2(HR2)和跨膜区(TM)等重要功能区。在病毒膜融合过程中，S2蛋白发生剧烈的构象变化，首先是FP暴露出来并插入到靶细胞膜，紧接着HR1形成三聚体螺旋，而HR2则反向折叠于HR1三聚体所形成的沟槽中，导致一个六螺旋束结构(6HB)以拉近病毒膜和细胞膜发生融合反应，从而使病毒的基因物质通过融合孔进入到靶细胞内。

研究发现，来源于众多病毒HR1和HR2区域的多肽可以作为病毒膜融合抑制剂，其作用机制就是竞争性地与处于融合前状态的融合蛋白结合，从而阻断6HB结构的形成。目前，艾滋病病毒(HIV)治疗药物T20(恩夫韦肽)是唯一一个美国FDA批准用于临床的病毒膜融合抑制剂，但针对该靶点的抗病毒药物研发一直备受重视。本发明科研团队一直致力于病毒膜融合抑制剂药物的研究与开发。为抗击新冠病毒疫情，发明人在2019-nCoV基因组序列公布的第一时间即开始膜融合抑制剂的设计与筛选工作。经过不懈努力，本发明最终研发出一组对2019-nCoV具有很强抑制活性的多肽类膜融合抑制剂，并且它们也能有效抑制SARS-CoV的感染。因此，本发明为进一步开发高致病性HCoV治疗药物提供了先导化合物。自2002年以来，自然界中广泛存在的冠状病毒已先后三次跨过宿主屏障感染人类，导致严重疾病，引起世界性流行，因此本发明成果可以为将来可能的新发疫情作战略储备。除SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV外，另外的四种HCoV虽然一般情况下致病性较低，但它们对儿童、老年人和免疫功能低下者仍会造成严重甚至致命的疾病，但目前临床上尚无特异性抗病毒药物。

发明内容

本发明提供了一种新的冠状病毒膜融合抑制剂及其用途。

为实现上述目的，本发明首先提供了一种结构I所示的化合物，该化合物所成的可药用的盐、溶剂化物、螯合物或非共价复合物，基于该化合物基础上的药物前体，或上述形式的任意混合物。

Ac-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-AA10-AA11-AA12-

AA13-AA14-Ile-AA16-AA17-Leu-AA19-AA20-AA21-Ala-AA23-AA24-

Leu-AA26-AA27-AA28-Leu-Ile-AA31-AA32-AA33-AA34-AA35-AA36-

AA37-AA38-AA39-AA40-AA41-AA42-AA43(R1)-AA44(R2)-AA45

结构I

结构I中的AA1为Ile，或为不存在；

结构I中的AA2为Ser，或为不存在；

结构I中的AA3为Gly，或为不存在；

结构I中的AA4为Ile，或为不存在；

结构I中的AA5为Asn，或为不存在；

结构I中的AA6为Ala，或为不存在；

结构I中的AA7为Ser，或为不存在；

结构I中的AA8为Val，或为不存在；

结构I中的AA9为Val，或为不存在；

结构I中的AA10为Asn，或为不存在；

结构I中的AA11为Ile，或为不存在；

结构I中的AA12为Gln，或为不存在；

结构I中的AA13为Lys，或为不存在；

结构I中的AA14为Glu，或为不存在；

结构I中的AA16为Asp，或为Lys，或为Glu；结构I中的AA17为Arg，或为Lys，或为Glu；结构I中的AA19为Asn，或为Glu；

结构I中的AA20为Glu，或为Lys；

结构I中的AA21为Val，或为Lys；

结构I中的AA23为Lys，或为Glu；

结构I中的AA24为Asn，或为Lys，或为Glu；结构I中的AA26为Asn，或为Glu；

结构I中的AA27为Glu，或为Lys；

结构I中的AA28为Ser，或为Lys；

结构I中的AA31为Asp，或为不存在结构I中的AA32为Leu，或为不存在结构I中的AA33为Gln，或为不存在结构I中的AA34为Glu，或为不存在结构I中的AA35为Leu，或为不存在结构I中的AA36为Gly，或为不存在；

结构I中的AA37为Lys，或为不存在；

结构I中的AA38为Tyr，或为不存在；

结构I中的AA39为Glu，或为不存在；

结构I中的AA40为Gln，或为不存在；

结构I中的AA41为Tyr，或为不存在；

结构I中的AA42为Ile，或为不存在；

结构I中的AA43为Lys，或为Dap，或为Orn，或为Dab，或为Dah，或为不存在；

结构I中的AA44为Cys，或为不存在；

结构I中的AA45为NH₂，或为OH。

结构I中的R1为丁二酸胆固醇单酯，或为2-胆固醇乙酸，或为2-胆固醇丙酸，或为3-胆固醇丙酸，或2-胆固醇丁酸，或为2-胆固醇异丁酸，或为3-胆固醇丁酸，或为3-胆固醇异丁酸，4-胆固醇丁酸，或为2-胆固醇戊酸，或为2-胆固醇异戊酸，或为3-胆固醇戊酸，或为5-胆固醇戊酸，或为2-胆固醇己酸，或为6-胆固醇己酸，或为2-胆固醇庚酸，或为7-胆固醇庚酸，或为2-胆固醇辛酸，或为8-胆固醇辛酸，或为CH₃(CH₂)_n1CO-(γGlu)_n2-，或为HO₂C(CH₂)_n1CO-(γGlu)_n2-(PEG_n3(CH2)_n4CO)_n5-,或为不存在；

其中：n1为10至20的整数；

n2为1至5的整数；

n3为1至30的整数；

n4为1至5的整数；

n5为1至5的整数。

结构I中的R2为2-乙酸胆固醇酯，或为2-丙酸胆固醇酯，或为3-丙酸胆固醇酯，2-丁酸胆固醇酯，或为2-异丁酸胆固醇酯，或为3-胆固醇丁酸胆固醇酯，或为3-异丁酸胆固醇酯，4-丁酸胆固醇酯，或为2-戊酸胆固醇酯，或为2-异戊酸胆固醇酯，或为3-戊酸胆固醇酯，或为5-戊酸胆固醇酯，或为2-己酸胆固醇酯，或为6-己酸胆固醇酯，或为2-庚酸胆固醇酯，或为7-庚酸胆固醇酯，或为2-辛酸胆固醇酯，或为8-辛酸胆固醇酯，或为不存在。

结构I中的R1和R2不能同时存在。

本发明提供了含本发明化合物在预防和治疗冠状病毒所致疾病的方法。

本发明还提供了包括根据本发明化合物的用于制备预防和治疗冠状病毒所致疾病的药物组合物。

作为优选，所述药物组合物在预防和治疗冠状病毒所致疾病的用途。

本发明所述的冠状病毒为包括但不限于SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCoV和普通HCoV(例如229E，OC43和NL63)等冠状病毒。

本发明所涉及到的更多内容在以下有详细描述，或者有些也可以在本发明的实施例中体会。

除非另有所指，本文中所用来表示不同成分的数量、反应条件，在任意情况下都可解读为“大致的”、“大约的”意思。相应的，除有明确的特指外，在下述以及权利要求中所引用的数字参数都是大致的参数，在各自的实验条件下由于标准误差的不同，有可能会得到不同的数字参数。

本文中，当一个化合物的化学结构式和化学名称有分歧或疑义时，以化学结构式确切定义此化合物。本文所描述的化合物有可能含有一个或多个手性中心，和/或者双键以及诸如此类的结构，也可能存在立体异构体，包括双键的异构体(比如几何异构体)、旋光对映异构体或者非对映异构体。相应的，在本文描述范围内的任意化学结构，无论是部分或整体结构中含有上述类似结构，都包括了此化合物的所有可能的对映异构体和非对映异构体，其中也包括了单纯的任一种立体异构体(如单纯的几何异构体、单纯的对映异构体或者单纯的非对映异构体)以及这些异构体的任意一种混合物。这些消旋异构体和立体异构体的混合物由本领域技术人员利用不停的分离技术或手性分子合成的方法也可进一步被拆分成其组成成分的对映异构体或立体异构体。

结构式I的化合物包含了，但并不仅限于，这些化合物的光学异构体、消旋体和/或其他的混合物。上述情况下，其中单一的对映异构体或非对映异构体，如有旋光的异构体，可以用不对称合成的方法或消旋体拆分的方法获得。消旋体的拆分可用不同的方法实现，如常规的用助拆分的试剂重结晶，或用色谱方法。另外，结构式I的化合物也包含了带双键的顺式和/或反式的异构体。

本发明所述化合物包含但不限于，结构式I所示化合物以及他们所有的在药学上可用的不同形式。这些化合物的药学上可用的不同形式包括各种可药用的盐、溶剂化物、络合物、螯合物、非共价的复合物、基于上述物质基础上的药物前体和上述这些形式的任意混合物。

上述所述药物前体包括含在所述化合物内，如结构式I所示化合物的酯或者酰胺衍生物。

本发明提供的结构I所示的化合物性质稳定，是一种长效的冠状病毒膜融合抑制剂，用于制备预防和治疗冠状病毒所致疾病的药物组合物，所述药物组合物用于预防和治疗冠状病毒所致疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2IPB01和IPB02对2019-CoV假病毒感染的抑制作用图；

图2为实施例3IPB01和IPB02对2019-CoV-S蛋白介导细胞-细胞膜融合的抑制作用图；

图3为实施例4IPB01和IPB02及其与靶序列复合物的二级结构特征和热稳定性图。

具体实施方式

本发明公开了一种冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进相关参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中涉及的英文缩写所对应的中文名称见下表所示：

实施例1多肽的合成

制备方法，包括：采用固相多肽合成法制备肽树脂，肽树脂再经酸解得到粗品，最后粗品经过纯化得到纯品；其中固相多肽合成法制备肽树脂的步骤为在载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，制备肽树脂：

上述制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～3.5倍。

上述制备方法中，所述的载体树脂取代值为0.2～1.0mmol/g树脂，优选的取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。

作为本发明优选的方案，所述固相偶联合成法为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应。所述的去Fmoc保护的脱保护时间为10～60分钟，优选的为15～25分钟。所述的偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。

所述的偶联反应需添加缩合试剂，缩合试剂选自DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)、N,N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯中的一种；优选的为N,N-二异丙基碳二亚胺。所述缩合试剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选为2.5～3.5倍。

所述的偶联反应需添加活化试剂，活化试剂选自1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑，优选的为1-羟基苯并三唑。活化试剂的用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选的为2.5～3.5倍。

作为本发明优选的方案，所述的脱去Fmoc保护的试剂为PIP/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)混合溶液，混合溶液中含哌啶为10～30％(V)。去Fmoc保护试剂的用量为每克氨基树脂5～15mL，优选的为每克氨基树脂8～12mL。

优选的，肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到粗品：

进一步优选的，所述肽树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)和水的混合溶剂，混合溶剂的体积配比为：TFA为80～95％，EDT为1～10％，余量为水。

更进一步优选的，混合溶剂的体积配比为：TFA为89～91％、EDT为4～6％，余量为水。最优的，混合溶剂的体积配比为：TFA为90％、EDT为5％，余量为水。

所述酸解剂用量为每克肽树脂需要4～15mL酸解剂；优选的，每克肽树脂需要7～10mL酸解剂。

使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～6小时，优选的为3～4小时。

进一步的，粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到纯品，具体方法为：

取粗品，加水搅拌，调pH值至完全溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得纯化中间体浓缩液；

取纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到纯品醋酸水溶液，冷冻干燥后得纯品。

1、肽树脂的合成

使用Rink Amide BHHA树脂为载体树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与多肽氨基酸序列相应的保护氨基酸偶联，制得肽树脂。

(1)接入主链第1个保护氨基酸

取0.03mol第1个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

取0.01mol的Rink amide MBHA树脂(取代值约0.4mmol/g)，采用20％ PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应60～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。

(2)接入主链第2～36个保护氨基酸

采用上述接入主链第1个保护氨基酸同样方法，依次接入上述对应的第2～36个保护氨基酸，得含主链36个氨基酸的树脂。

(3)接入侧链第1个保护氨基酸

取0.03mol侧链第1个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03molDIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。

取2.5mmol四三苯基膦钯和25mmol苯硅烷，用适量二氯甲烷溶解，去保护4小时，过滤洗涤，得到去Alloc的树脂备用。

将加入活化后的侧链第1个保护氨基酸液加入到已去Alloc的树脂，偶联反应60～300分钟，过滤洗涤，得含侧链第1个保护氨基酸的树脂。

(4)其他侧链的接入

采用上述接入主链第1个保护氨基酸同样方法，依次接相应的入侧链，得到肽树脂。

2、粗品的制备

取上述肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为粗品。

3、纯品的制备

取上述粗品，加水搅拌溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用。采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，30mm*250mm的色谱柱流速为20mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得纯化中间体浓缩液；

纯化中间体浓缩液用0.45μm滤膜滤过备用，采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，30mm*250mm的色谱柱流速为20mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到纯品醋酸水溶液，冷冻干燥得纯品。

用上述方法合成了以下新型脂肽化合物：

同时合成了用于对比研究的EK1及其修饰化合物EK1-Chol:

实施例2抗2019新冠病毒多肽的设计及活性验证

通过对2019-nCoV的S蛋白的序列结构分析，确定了位于S2亚基在病毒膜融合中起重要作用的功能区HR1和HR2位置。基于HR2序列，本发明首先设计了IPB01多肽，并通过对其C末端进行胆固醇分子修饰，得到脂肽IPB02。通过利用2019-nCoV假病毒感染实验，首先对IPB01和IPB02的抗病毒活性进行了测试。

1、实验材料与方法

表达2019-nCoV病毒S蛋白的质粒(2019-CoV-S)由本单位王建伟教授实验室构建并无偿提供使用；HIV骨架质粒pNL4-3.luc.RE由美国国立卫生研究院艾滋病试剂和参照物项目提供(目录号3418)；293T细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC，目录号CRL-3216)；靶细胞293T/ACE2由本实验室制备并保存(Cao et al.Potent and persistent antibodyresponses against the receptor-binding domain of SARS-CoVspikeprotein inrecovered patients.Virology Journal,2010,7:299)。抗病毒实验的基本步骤如下：

(1)假病毒的制备：将2019-CoV-S质粒和pNL4-3.luc.RE按1:1共转染293T细胞，在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养48小时后收取含有假病毒的上清液，过滤后于-80℃保存备用。

(2)采用去离子水或二甲基亚砜(DMSO)溶解待测多肽并测定浓度，然后用DMEM培养基将多肽稀释到起始浓度，在96细胞培养板孔中进行3倍倍比稀释，多肽溶液终体积为50μL/孔，设3个复孔、9个稀释梯度。不加多肽的DMEM培养基作为对照。

(3)按每孔50μL将假病毒加入药物稀释板孔中，然后于室温孵育30分钟。

(4)将预先培养的293T/ACE2细胞调整浓度为10×10⁴/mL悬液，并加入终浓度为15μg/mL的DEAE-dextran，然后将细胞加到含有病毒的96孔板中，100μL/孔。于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养48小时。

(5)弃除上清后按30μL/孔加入细胞裂解液，于室温裂解15分钟后加入荧光素酶底物(Promega公司)，用微孔板光度计测定相对荧光单位(RLU)，并计算制作抑制率曲线和药物半数抑制浓度(IC₅₀)。

3、实验结果与分析

结果见图1

实验结果表明：IPB01抑制2019-CoV假病毒感染293T/ACE2靶细胞的活性较低，三次重复实验的平均IC₅₀为33.7μM。然而，胆固醇修饰的多肽抗病毒活性则显著提高，具体表现在脂肽IPB02的IC₅₀降低到0.08μM，相较于IPB01活性提高421倍。

实施例3IPB01和IPB02抑制2019-CoV-S介导细胞-细胞膜融合的作用

1、实验材料与方法

为进一步评价多肽的抗2019-CoV活性，本发明进行了基于DSP的细胞-细胞融合抑制实验。该实验中所用pDSP1-7和pDSP8-11荧光报告质粒由日本东京大学Zene Matsuda教授提供，发明人实验室常规使用和保存(Zhuetal.Design and characterization ofcholesterylatedpeptide HIV-1/2fusion inhibitors with extremely potent andlong-lasting antiviral activity.Journal ofVirololy.2019；93(11):e02312-18)。实验具体步骤如下：

(1)将293T效应细胞悬液(1.5×10⁴个/100μL/孔)铺于96孔板中，同时将293T/ACE2靶细胞悬液(15×10⁴个/mL)铺于10-cm细胞培养皿中，置于37℃和5％CO₂条件下进行培养。

(2)培养16小时后，将2019-CoV-S质粒和pDSP1-7质粒共转染293T效应细胞，同时将pDSP8-11质粒转染293T/ACE2靶细胞，然后继续培养细胞。

(3)于24小时后，将多肽在96孔板中进行3倍梯度稀释，设置3个复孔和9个稀释梯度。将稀释的多肽加到效应细胞，于37℃、5％ CO₂细胞培养箱中孵育1小时。

(4)将DMEM完全培养基预热并按1：4000比例加入EnduRen活细胞底物(Promega公司)，然后用于重悬离心收集的293T/ACE2靶细胞，调整细胞浓度为30×10⁴/mL，于37℃、5％CO₂条件下孵育30分钟。

(5)将293T/ACE2靶细胞按100μL/孔加入到293T效应细胞中，然后在400xg离心3分钟以便效应细胞和靶细胞充分接触，然后培养混合后的细胞2小时。

(6)于微孔板光度计中读取其荧光素酶活性(RLU)，并计算抑制率和IC₅₀值。

2、实验结果与分析

结果见图2

实验结果表明：IPB01和IPB02均能较好地抑制2019-CoV-S蛋白介导的细胞-细胞膜融合效应，二者活性相当，其IC₅₀值分别为0.022μM和0.026μM。该结果提示，IPB02多肽在假病毒系统中可能与病毒颗粒相互作用，从而直接灭活病毒或在后来的病毒细胞膜融合中发挥作用。脂肽抑制剂与假病毒的直接结合活性在发明人以前的研究中已被证明(Zhu etal.Design and characterization of cholesterylatedpeptide HIV-1/2fusioninhibitors with extremely potent and long-lasting antiviral activity.JournalofVirololy.2019；93(11):e02312-18)。在本实验中，DSP方法有可能不能反映脂肽病毒膜融合抑制剂与2019-CoV假病毒直接作用的优势。

实施例4IPB01和IPB02的结构特征及其与靶序列的结合能力分析

为分析IPB01和IPB02多肽的结构特征及探讨其作用机制，我们采用圆二色谱(CD)技术测定了多肽单肽自身及其与靶序列复合物的二级结构(α-螺旋)以及热稳定性。

1、实验材料与方法

(1)首先合成来自于对应于2019-CoV-S蛋白HR1序列的多肽NP45作为多肽抑制剂的模拟靶标，NP45的序列为：

Ac-LIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQL-NH2。

(2)CD测定方法：将游离多肽或多肽混合物溶于pH 7.2的磷酸缓冲液(PBS)中，多肽终浓度为10μM，于37℃水浴锅中放置30分钟，随后将多肽溶液移至相应比色皿中，使用Jasco分光偏振仪(型号J-815)扫描195-270nm波长范围内多肽溶液摩尔椭圆率[θ]_λ的变化情况，典型α-螺旋结构可在208nm和222nm处出现最大负峰，减去PBS空白对照来校正谱值，计算过程中以峰值为-33000degree.cm₂.dmol_-1作为α-螺旋含量100％的标准，根据多肽溶液在222nm处的摩尔椭圆率计算多肽α-螺旋含量的百分比。随后将该多肽溶液加入相应检测热稳定性的比色皿中，调整CD温控模块以每分钟2℃的速度扫描20-98℃时多肽溶液[θ]₂₂₂随温度变化情况。对熔解曲线进行平滑处理，利用Origin软件计算热解离转变的中点温度值(T_m)以反映螺旋热稳定程度。

2、实验结果与分析

结果见图3

实验结果表明：单独的HR1多肽NP45自身呈现典型的α-螺旋结构(见A)，α-螺旋含量为66.2％，其T_m值为48℃(见B)；单独的IPB01多肽计算的α-螺旋含量为24.8％，可以认为其螺旋性很低或者呈无规则卷曲状。然而，IPB01和NP45复合物则含有58.6％的α-螺旋，T_m高达75.1℃，说明二者可以相互作用形成符合六螺旋结构(6HB)的CD光谱。更为明显的是，单独IPB02的α-螺旋含量明显增加(42.4％)，且T_m为60℃；IPB02和NP45复合物的α-螺旋含量为59.6％，其T_m值则进一步提高到89℃(见C和D)。结果表明胆固醇修饰是增强新冠病毒HR2多肽抑制剂螺旋性和稳定性的一个重要策略。

实施例5新型脂肽膜融合抑制剂的结构与功能分析

为明确基于脂肽的2019-nCoV膜融合抑制剂的结构与功能关系以及获得成药性更高的多肽化合物，本发明进一步合成了一组新的多肽IPB03～IPB10，利用上述实施例2中的2019-nCoV假病毒抑制实验、实施例3中的新冠病毒S蛋白介导的细胞融合实验以及实施例4中的CD技术对新合成多肽的抗病毒活性以及与模拟靶序列NP45的结合螺旋稳定性进行了分析。据最近报道EK1多肽对HCoV具有广谱抑制活性(Xia et al.A pan-coronavirusfusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike.SciAdv.2019；5:eaav4580)，在实验中用EK1及EK1-Chol作为对照。

实验结果表明：在N端截短的多肽IPB03(由34个氨基酸组成)、IPB04(由31个氨基酸组成)、IPB07(由33个氨基酸组成)对2019-nCoV假病毒感染性及其S蛋白介导的细胞膜融合仍保留较强的抑制活性，说明可以通过减少N端氨基酸残基对多肽进行序列优化。值得注意的发现是，IPB03与NP45复合物的螺旋稳定性显著下降(48.1℃)，而进一步截短的IPB04则反而更加稳定，说明IPB03的N端氨基酸基序构象可能会影响抑制剂与靶序列之间的螺旋相互作用。

本实施例另一发现是，IPB05在最高检测浓度没有显示明显的抗病毒活性，但当其C端进一步向S2跨膜区(TM)延伸6个氨基酸，所产生的IPB07多肽则有较强的病毒抑制作用，特别在抑制细胞膜融合上显示强效活性，说明添加紧邻TM的序列对设计2019-nCoV脂肽抑制剂亦有重要帮助。

IPB08多肽是在IPB02的C端截短5个氨基酸，抗病毒活性下降比较明显，说明C端氨基酸对抑制剂设计的重要性。

IPB10和IPB11多肽在其核心螺旋部位进行了可以促进“盐桥”结构形成的“EK”或“KE”替换，以期改善抑制剂的螺旋稳定性和水溶性；序列改造后的多肽仍具有较强的抗病毒活性。

总之，本发明正是通过多轮设计和筛选的不懈努力，最终确认多个具有潜在成药价值的强效抑制2019-nCoV的多肽化合物。

新型脂肽2019-nCoV膜融合抑制剂的结构与功能分析

实施例6新型膜融合抑制剂对SARS-CoV的交叉抑制作用

同介导受体结合的S1亚基相比，冠状病毒S2的序列相对保守，但发明人的研究通过比较发现，以上述NP45多肽为代表的HR1序列在2019-nCoV和SARS-CoV之间存在明显的氨基酸差异(9个残基)。为评价本发明所述新型膜融合抑制可能的广谱抑制作用，本实施例测试了抑制剂对SARS-CoV假病毒的抑制活性。制备SARS-CoV假病毒的S蛋白表达质粒由本发明人实验室保存和使用(Cao et al.Potent and persistent antibody responsesagainst the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recoveredpatients.Virology Journal,2010,7:299)。作为实验对照，本实施例还同时测定了抑制剂对水泡性口炎病毒假病毒(VSV-G)的抑制作用。假病毒的制备及抗病毒实验方法同实施例2所述。

实验结果表明：IPB02、IPB03、IPB04、IPB07、IPB08、IPB10和IPB11七个脂肽能够有效抑制SARS-CoV假病毒感染293T/ACE2细胞，这些多肽对VSV-G假病毒没有抑制活性，说明它们对冠状病毒作用的特异性。EK1-Chol抑制SARS-CoV假病毒的IC₅₀是2.08μM，但意外的是它对VSV-G亦有较弱的抑制活性(IC₅₀＝12.15μM)。

新型膜融合抑制剂对SARS-CoV假病毒的抑制作用

序号	代码	抑制SARS-CoV的IC50(μM)	抑制VSV-G的IC50(μM)
				化合物1	IPB01	>50	>50
化合物2	IPB02	0.25	>50
				化合物3	IPB03	1.32	>50
化合物4	IPB04	1.05	>50
				化合物5	IPB05	>25	>50
化合物6	IPB06	>25	>50
				化合物7	IPB07	1.04	>50
化合物8	IPB08	1.13	>50
				化合物9	IPB09	>25	>50
化合物10	IPB10	0.33	>50
				化合物11	IPB11	0.40	>50
化合物16	EK1	>50	>50
				化合物17	EK1-Chol	2.08	12.15

Claims (3)

1.一种如下结构所示的化合物：

AC-ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELK(丁二酸胆固醇单酶)-NH₂；

AC-INASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGK(丁二酸胆固醇单酯)-NH₂；

AC-SVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGK(丁二酸胆固醇单酯)-NH₂；

AC-IQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIK(丁二酸胆固醇单酯)-NH₂；

AC-ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIK(丁二酸胆固醇单酯)-NH₂；

AC-SVVNIQKEIEELNKKAEELNKKLIDLQELGK(丁二酸胆固醇单酯)-NH₂；

AC-SVVNIQKEIKKLEEVAKKLEESLIDLQELGK(丁二酸胆固醇单酯)-NH₂。

2.一种权利要求1所述的化合物所成的可药用的盐、溶剂化物。

3.一种权利要求1所述的化合物在制备预防和治疗冠状病毒所致疾病的药物中的用途，所述冠状病毒为SARS-CoV和2019-nCoV。

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