CN116444644A - 一种广谱病毒膜融合抑制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，其是一种广谱病毒膜融合抑制剂，能够强效抑制艾滋病病毒以及其他多种病毒，从而可以用于治疗艾滋病毒感染及其他多种病毒感染以及由所述感染所导致的疾病。

Description

一种广谱病毒膜融合抑制剂及其制备方法和用途

技术领域

本公开属于生物医药领域，涉及一种脂肽(或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药)，还涉及一种多肽(或其变体)，所述脂肽(或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药)或所述多肽(或其变体)是一种广谱病毒膜融合抑制剂，能够强效抑制艾滋病病毒以及其他多种病毒，从而可以用于治疗艾滋病毒感染及其他多种病毒感染以及由所述感染所导致的疾病。

背景技术

病毒感染严重危害人类健康和社会稳定，如人免疫缺陷病毒(HIV)、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)、埃博拉病毒(EBOV)、马尔堡病毒(MARV)、乙型肝炎病毒(HBV)、流感病毒(IAV)、狂犬病毒(RABV)、水疱性口炎病毒(VSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)等等。全球范围内非常缺乏有效的抗病毒药物，尤其是具有广谱抗病毒作用的药物。膜融合是极其重要的生物学现象，如受精卵的形成和细胞内物质的运输与释放等。众多病毒，包括上述几种病毒，也是通过膜融合途径感染宿主细胞的。针对病毒膜融合的共性机制，研发特效或广谱抗病毒药物具有重大的科学意义和应用价值。

HIV感染导致艾滋病(AIDS)。目前既无有效的HIV预防疫苗，也无可以根治感染的药物。现有的抗HIV药物有逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、病毒进入抑制剂、整合酶抑制剂等，它们通过阻断病毒复制的不同阶段而发挥作用，对治疗和预防艾滋病起着重大作用。广泛使用的高效抗病毒治疗方案(即鸡尾酒疗法)主要由3-4种逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂组成。但由于HIV感染的持续性，病人需要长期给药，容易导致耐药产生，严重地影响临床治疗效果，研发新的抗HIV药物一直是艾滋病防控的重大需求。

HIV进入宿主细胞由其表面的三聚体包膜(Env)糖蛋白介导，该蛋白包含表面亚基gp120和跨膜亚基gp41。在HIV感染过程中，gp120先后与受体CD4和辅助受体(如CCR5或CXCR4)结合，诱发gp120发生构象变化，从而暴露并激活gp41的细胞膜融合功能。首先是gp41的N末端融合肽(FP)插入靶细胞膜内，然后C端螺旋区(CHR)与N端螺旋区(NHR)反向折叠形成一个六聚体螺旋(6-HB)结构，从而拉近病毒膜和细胞膜进行融合，使HIV基因组进入细胞造成感染。晶体结构显示^[1]，在NHR螺旋的C末端含有一个比较深的疏水口袋(pocket)，一直被认为是重要的抗病毒药物靶点；而CHR螺旋N末端的序列“WMEWDREI”则为NHR口袋结合区(pocket-binding domain,PBD)，其8个氨基酸分别处于CHR螺旋的a，b，c，d，e，f，g和a位置，其中处于a，d位置的两个W(色氨酸)和a位置的I(异亮氨酸)为疏水氨基酸，它们插入NHR口袋介导广泛的疏水作用，是病毒融合蛋白6-HB形成和发挥功能的关键所在。

病毒膜融合抑制剂通过阻断病毒进入靶细胞在病毒复制的早期阶段发挥作用，在治疗和预防上具有明显的优势。然而，目前仅有一个病毒膜融合抑制剂被美国FDA批准用于临床，即HIV膜融合抑制剂恩夫韦肽(enfuvirtide,又名T20)。如图1所示，T20是衍生于gp41CHR的一个不含PBD序列的多肽，由36个氨基酸组成，通过与NHR竞争结合阻断病毒6-HB的形成而发挥抗病毒作用。由于T20抑制病毒的活性相对较低，生物半衰期较短，它需要每天大剂量给药(每天2次，每次90mg)；T20也容易诱导耐药产生，使临床治疗失败。因此，开发新的HIV膜融合抑制剂一直备受国内外关注。

目前HIV膜融合抑制剂的研发大多聚焦于PBD的作用，尤其是利用早年公开发表的C34多肽作为设计模板^[2]。C34含有PBD，其氨基酸序列被认为是CHR的核心序列。继T20之后，原研药企进一步设计了第二代抑制剂T1249和第三代抑制剂T2635^[3]，它们都含有PBD序列(见图1)。国内研发的西夫韦肽(SFT)和艾博卫泰(ABT)都是基于C34序列设计^[4][5]。SFT通过对C34的14个氨基酸进行突变，并在N末端和C末端分别加上丝氨酸(S)和谷氨酸(E)以增加多肽的稳定性和靶点结合能力。ABT仅对C34的三个氨基酸进行了突变，通过在第13位赖氨酸(K)侧链连接3-马来酰亚胺基丙酸(MPA)，使其具有与血清白蛋白结合的能力。虽然SFT和ABT的抗病毒活性与T20和C34相比没有实质性提高，但其生物半衰期得到延长，从而可以减少给药频次。通过在C34多肽的C末端进行胆固醇分子修饰，形成C34-Chol脂肽(lipopeptide),可以显著改善抗病毒活性和生物半衰期^[6]。

本发明人团队长期从事HIV膜融合抑制剂研究与开发，根据gp41结构与功能关系设计了多种基于CHR多肽的HIV膜融合抑制剂^[7]。其中，LP-11含有PBD基序，C末端由棕榈酸分子修饰；而LP-98不含PBD基序，C末端由胆固醇修饰。相较而言，LP-98比LP-11抗病毒活性显著提高，但发明人也发现LP-98对T20耐药性HIV毒株的抑制活性明显下降，使其成药性受到影响。因此，本领域需要坚持不懈地研发新型病毒膜融合抑制剂药物，以满足临床需求。

上述列举的T20、C34、T1249、T2635、SFT、ABT、C34-Chol、LP-11和LP-98的序列结构示意图见图1。

发明内容

本公开所要解决的技术问题是如何有效抑制艾滋病病毒及其他一些具有膜融合功能的病毒。本公开的发明人长期致力于开发强效、广谱、且长效的病毒膜融合抑制剂。在研究中，发明人惊讶地发现，基于HIV的CHR序列，通过“刚性接头”的引入和PBD中部分氨基酸的替代，能够明显提高多肽的抗病毒活性。

因此，本公开的一个方面，提供一种脂肽或其药学上可接受的盐，该脂肽是一种病毒膜融合抑制剂，能够抑制HIV、SARS-CoV-2及其突变株、MERS-CoV、EBOV、MARV、IAV、RABV、VSV等病毒。

本公开的另一个方面，提供一种多肽或其变体，以及包含所述多肽或其变体的缀合物。

本公开的另一个方面，提供编码所述多肽或其变体的分离的核酸，包含所述分离的核酸的载体，以及包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。

本公开的另一方面，提供所述脂肽或其药学上可接受的盐或多肽或其变体形成的多聚体。

本公开的另一方面，提供包含所述脂肽或其药学上可接受的盐、所述多肽或其变体、所述缀合物、所述分离的核酸、所述载体、所述宿主细胞或所述多聚体的组合物，以及包含所述脂肽或其药学上可接受的盐或所述多肽或其变体的药物组合物。

本公开的另一方面，提供所述脂肽或其药学上可接受的盐或所述多肽或其变体在制备药物或治疗疾病中的用途。

发明详述

下面就本公开的目的和实施做进一步阐述。

在设计基于脂肽的病毒膜融合抑制剂技术中，通常需要在多肽序列和脂类基团(如脂肪酸和胆固醇等)之间加入一个接头(linker)起到连接臂的作用。脂类基团的预期结合位点为病毒膜或细胞膜，使多肽在靶点区富集，显著提高多肽的抗病毒活性。由于多肽倾向于形成稳定的二级结构，具有较强的结构刚性，因此多肽和脂类基团之间通常选用柔性接头(flexible linker)连接，使多肽和脂类基团能够分别形成合适的构象，结合到各自的结合位点，同时，在充分发挥各自作用的同时，避免因空间位阻等原因而相互影响。常见柔性接头有甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的组合，如(GGGGS)n或(GSGSG)n等，通过改变n的大小可以将结构域之间的距离放大和减小；另一常见的柔性接头为小分子聚乙二醇(PEG)n，其中n多在2至24之间。目前文献报道的病毒膜融合抑制剂脂肽都是采用柔性接头，如HIV膜融合抑制剂C34-Chol采用GSG，LP-11采用PEG₈；又如SARS-CoV-2膜融合抑制剂IPB02V3为PEG₈，IPB24～IPB27分别为PEG₄、PEG₅、PEG₆和PEG₈ ^[8]，EKL1C为GSG^[9]，EK1C4为串联的GSGSG和PEG₄ ^[8]，[SARS_HRC-PEG₄]₂-chol为PEG₄ ^[10]等。

能够形成α-螺旋的(EAAAK)n序列是制备融合蛋白常见的刚性接头(rigidlinker)，其具有内部氢键和密切联系肽链骨干，刚性且稳定，从而有效分离结构域，但目前制备的脂肽类HIV膜融合抑制剂尚无采用刚性接头的先例。本公开使用刚性接头EAAAK序列制备了脂肽，令人惊讶地发现该刚性接头赋予了多肽显著的螺旋结构和强效的抗病毒活性。在本公开的具体实施例中，首先以C34多肽为设计模板，通过GSGSG柔性接头和EAAAK刚性接头分别制备脂肽C34-LP1和C34-LP2，结果显示EAAAK刚性接头有助于改善脂肽的抗HIV活性。进一步地，设计了三个使用EAAAK作为接头的新型脂肽LP-121、LP-122和LP-123，它们在使用EAAAK的同时，也在对应于CHR螺旋的b，c和f，g位置分别引入EE和KK氨基酸对子，以促使在所谓的i与i+4位置形成“盐桥”结构。通过实验意外发现，含有较短序列的LP-123脂肽反而具有最优的抗HIV活性。

gp41的CHR螺旋N末端的氨基酸序列WMEWDREI为NHR口袋结合区(PBD)，其中处于CHR螺旋a和d位置的两个W以及a位置的I插入NHR口袋介导广泛的疏水作用，对融合蛋白6-HB的形成至关重要，因此新一代HIV膜融合抑制剂的研发大多聚焦于PBD的作用，尤其是利用含有PBD的C34多肽作为设计模板，例如本领域代表性抑制剂T1249、T2635、SFT、ABT、C34-Chol等。尽管氨基酸替代是优化多肽抑制剂的一种常用策略，但目前文献报道的HIV膜融合抑制剂其PBD序列的两个W无一例外地都被采用，尚无将W替代为其他氨基酸的先例。为进一步提高抑制剂的抗病毒活性，本公开令人惊讶地发现将PBD两个疏水的W用亲水性且分子量较小的酪氨酸(Y)取代可以明显提高HIV膜融合抑制剂的抗病毒活性。在具体的实施过程中，以上述LP-122和LP-123脂肽为模板，分别制备出LP-124和LP-125，通过实验验证了W到Y的取代可以明显提高抑制剂的抗病毒活性。这一具有颠覆性的技术策略使PBD与NHR口袋的相互作用由疏水作用向亲水作用转变，为本领域进行HIV膜融合抑制剂的设计提供了一个全新的思路。

进一步地，本公开在LP-125的基础上制备了脂肽LP-126，其N端的第一位氨基酸由T替换为带负电荷的氨基酸E，以进一步促使脂肽N端的亲水作用及稳定性；更进一步地，将LP-126的第8位氨基酸还原为E，并同时将a位置的I替换为疏水性相对较低的氨基酸L(亮氨酸)，从而产生脂肽LP-127；将LP-127的N端三个氨基酸去掉后，制备了仅含有一个Y的LP-128。这些新型抑制剂的共同特点是含有EAAAK接头、PBD基序的W变成Y、富含EE-KK盐桥形成氨基酸。从氨基酸序列上，仅有8个氨基酸保留了原始CHR序列的氨基酸。通过具体的实验发现，这些新型抑制剂具有强效的抗HIV活性。更为意外的发现是，LP-127和LP-128能够有效抑制SARS-CoV-2、MERS-CoV、EBOV、MARV、IAV、RABV等假病毒的感染，体现了它们的广谱抗病毒活性。

上述的LP-121、LP-122、LP-123、LP-124、LP-125、LP-126、LP-127和LP-128的序列结构示意图见图2。在图2所示脂肽的结构式中，Ac代表乙酰基，为多肽氨基端保护基团，Chol代表修饰于多肽C末端的胆固醇分子，其修饰在多肽C末端的氨基酸K侧链上。NH₂代表氨基，是多肽羧基端保护基团。

本公开至少部分基于发明人的上述出人意料的发现。因此，在一个方面，本公开提供了一种脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，其包含多肽或其变体和通过接头连接至所述多肽或其变体C端的修饰部分，以及任选的多肽末端保护基团，

(X₁X₂X₃)mX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄X₂₅N(EX₂₆)n

式I

其中，所述多肽如式I所示，所述修饰部分为亲脂性化合物，所述接头为-(EAAAK)n₁-、-(XP)n₂-、-(EAAAK)n₁-X₂₇-或-(XP)n₂-X₂₇-，

X₁为T、E、S；X₂为W或亲水性氨基酸；X₃为E、M或Q；m为0或1；X₄为E、A或T；X₅为W或亲水性氨基酸；X₆为E或D；X₇为R、K或Q；X₈为E、K或A；X₉为L或I；X₁₀为E、N或A；X₁₁为E或N；X₁₂为L或Y；X₁₃为E、T或A；X₁₄为K、S、R或A；X₁₅为K、L、R或Q；X₁₆为E、H、T或Y；X₁₇为E、S、R或A；X₁₈为L或I；X₁₉为K、E或R；X₂₀为K、E、Q或A；X₂₁为A或S；X₂₂为E或Q；X₂₃为E、N或I；X₂₄为K、E或D；X₂₅为K或R；X₂₆为Q、E、R、A或Y；n为0或1；

X为任意一种氨基酸；X₂₇为K或C；n₁为1至5之间的自然数；n₂为1至5之间的自然数，

并且，所述变体与其所源自的多肽相异仅在于1个或几个(例如，1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸残基的置换(例如，保守置换或非保守置换)，且保留了其所源自的多肽的生物学功能。

在某些实施方案中，X₁为T或E。在某些实施方案中，X₁为T。在某些实施方案中，X₁E。

在某些实施方案中，X₂为W、D、E、H、K、Q、R、S、T或Y。在某些实施方案中，X₂为W或Y。在某些实施方案中，X₂为Y。在某些实施方案中，X₂为W。

在某些实施方案中，X₃为E或M。在某些实施方案中，X₃为E。在某些实施方案中，X₃为M。

在某些实施方案中，X₄为E。

在某些实施方案中，X₅为W、D、E、H、K、Q、R、S、T或Y。在某些实施方案中，X₅为W或Y。在某些实施方案中，X₅为Y。在某些实施方案中，X₅为W。

在某些实施方案中，X₆为E。

在某些实施方案中，X₇为R或K。在某些实施方案中，X₇为R。在某些实施方案中，X₇为K。

在某些实施方案中，X₈为E或K。在某些实施方案中，X₈为E。在某些实施方案中，X₈为K。

在某些实施方案中，X₁₀为E或N。在某些实施方案中，X₁₀为E。在某些实施方案中，X₁₀为N。

在某些实施方案中，X₁₁为E。

在某些实施方案中，X₁₂为L。

在某些实施方案中，X₁₃为E或T。在某些实施方案中，X₁₃为E。在某些实施方案中，X₁₃为T。

在某些实施方案中，X₁₄为K或S。在某些实施方案中，X₁₄为K。在某些实施方案中，X₁₄为S。

在某些实施方案中，X₁₅为K或L。在某些实施方案中，X₁₅为K。在某些实施方案中，X₁₅为L。

在某些实施方案中，X₁₆为E或H。在某些实施方案中，X₁₆为E。在某些实施方案中，X₁₆为H。

在某些实施方案中，X₁₇为E或S。在某些实施方案中，X₁₇为E。在某些实施方案中，X₁₇为S。

在某些实施方案中，X₁₈为L。

在某些实施方案中，X₁₉为K或E。在某些实施方案中，X₁₉为K。在某些实施方案中，X₁₉为E。

在某些实施方案中，X₂₀为K或E。在某些实施方案中，X₂₀为K。在某些实施方案中，X₂₀为E。

在某些实施方案中，X₂₁为A。

在某些实施方案中，X₂₂为E。

在某些实施方案中，X₂₃为E或N。在某些实施方案中，X₂₃为E。在某些实施方案中，X₂₃为N。

在某些实施方案中，X₂₄为K或E。在某些实施方案中，X₂₄为K。在某些实施方案中，X₂₄为E。

在某些实施方案中，X₂₅为K。

在某些实施方案中，X₂₆为Q。

在某些实施方案中，X为A、K或E。

在某些实施方案中，m为0。在某些实施方案中，m为1。

在某些实施方案中，n为0。在某些实施方案中，n为1。

在某些实施方案中，X₂₇为K。在某些实施方案中，X₂₇为C。

在某些实施方案中，n₁为1至4之间的自然数。在某些实施方案中，n₁为1至3之间的自然数。在某些实施方案中，n₁为1或2。在某些实施方案中，n₁为1。在某些实施方案中，n₁为2。在某些实施方案中，n₁为3。在某些实施方案中，n₁为4。在某些实施方案中，n₁为5。

在某些实施方案中，n₂为1至4之间的自然数。在某些实施方案中，n₂为1至3之间的自然数。在某些实施方案中，n₂为1或2。在某些实施方案中，n₂为1。在某些实施方案中，n₂为2。在某些实施方案中，n₂为3。在某些实施方案中，n₂为4。在某些实施方案中，n₂为5。

在某些实施方案中，X₂₅为K，所述多肽如式II所示，

(X₁X₂X₃)mX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄KN(EX₂₆)n

式II

其中X₁、X₂、X₃、m、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₆、n的定义如本公开任意实施方案中所述。

在某些实施方案中，X₄为E，X₂₅为K，所述多肽如式III所示，

(X₁X₂X₃)m-EX₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄KN(EX₂₆)n

式III

其中X₁、X₂、X₃、m、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₆、n的定义如本公开任意实施方案中所述。

在某些实施方案中，X₄为E，X₁₀为E，X₁₁为E，X₁₂为L，X₁₃为E，X₁₄为K，X₁₅为K，X₁₆为E，X₁₇为E，X₁₈为L，X₁₉为K，X₂₀为K，X₂₁为A，X₂₂为E，X₂₃为E，X₂₄为K，X₂₅为K，所述多肽如式IV所示，

(X₁X₂X₃)m-EX₅X₆X₇X₈X₉EELEKKIEELLKKAEEQQKKN(EX₂₆)n

式IV

其中X₁、X₂、X₃、m、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₂₆、n的定义如本公开任意实施方案中所述。

在某些实施方案中，X₄为E，X₆为E，X₇为K，X₁₀为E，X₁₁为E，X₁₂为L，X₁₃为E，X₁₄为K，X₁₅为K，X₁₆为E，X₁₇为E，X₁₈为L，X₁₉为K，X₂₀为K，X₂₁为A，X₂₂为E，X₂₃为E，X₂₄为K，X₂₅为K，所述多肽如式V所示，

(X₁X₂X₃)m-EX₅EKX₈X₉EELEKKIEELLKKAEEQQKKN(EX₂₆)n

式V

其中X₁、X₂、X₃、m、X₅、X₈、X₉、X₂₆、n的定义如本公开任意实施方案中所述。

在某些实施方案中，所述多肽末端保护基团为N端(氨基端)保护基团和/或C端(羧基端)保护基基团。在某些实施方案中，本公开所述脂肽包含N端保护基团和C端保护基团。公知的，N端保护基团可以为乙酰基(Ac)、氨基(NH₂)、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基、苄氧或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。公知的，C端保护基团可以为氨基(NH₂)、羧基、羟基、酰胺基、叔丁氧羰基或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。在某些实施方案中，所述N端保护基团为乙酰基(Ac)。在某些实施方案中，所述C端保护基团为氨基(NH₂)。

本公开所述多肽中的氨基酸的缩写具有本领域公知的含义，例如，W为色氨酸、M为蛋氨酸、E为谷氨酸、D为天冬氨酸、R为精氨酸、I为异亮氨酸、N为天冬酰胺、Y为酪氨酸、T为苏氨酸、S为丝氨酸、L为亮氨酸、H为组氨酸、Q为谷氨酰胺、K为赖氨酸、A为丙氨酸、G为甘氨酸等。在某些实施方案中，所述氨基酸为L型氨基酸，多肽中的一个或多个(如2-5个、2-4个或2-3个)氨基酸也可以被化学性质接近的L型氨基酸或构象为D型的氨基酸、人工修饰的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸等进行替换，以提高多肽的生物利用度、稳定性和/或抗病毒活性。其中D型氨基酸是指与组成蛋白质的L型氨基酸相对应的氨基酸；人工修饰的氨基酸指经过甲基化、磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见L型氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、γ氨基丁酸、高丝氨酸等。

在某些实施方案中，所述亲脂性化合物为胆固醇(cholesterol,Chol)、脂肪酸(fatty acid)、二氢(神经)鞘氨醇(dihydrosphingosine，DHS)或维生素E(tocopherol，Toc)等。在某些实施方案中，所述胆固醇包括：胆固醇琥珀酸单酯、2-胆固醇乙酸、2-胆固醇丙酸、3-胆固醇丙酸、2-胆固醇丁酸、2-胆固醇异丁酸、3-胆固醇丁酸、3-胆固醇异丁酸、4-胆固醇丁酸、2-胆固醇戊酸、2-胆固醇异戊酸、3-胆固醇戊酸、5-胆固醇戊酸、2-胆固醇己酸、6-胆固醇己酸、2-胆固醇庚酸、7-胆固醇庚酸、2-胆固醇辛酸、8-胆固醇辛酸、溴乙酸胆固醇酯等。在某些实施方案中，所述脂肪酸包括含8到20个碳原子的脂肪酸，例如十八烷酸或棕榈酸(又名软脂酸)。

所述亲脂性化合物可以连接在接头末端氨基酸的侧链上，也可直接连接在接头上。其中，脂肪酸、二氢鞘氨醇和维生素E可通过与接头中的赖氨酸(Lys)侧链的氨基进行酰胺化反应，实现对多肽的修饰；胆固醇可通过与接头中的赖氨酸(Lys)侧链的氨基进行酰胺化反应，也可通过与接头中的半胱氨酸(Cys)侧链的巯基与进行成硫醚反应，实现对多肽的修饰。在某些具体实施方案中，所述胆固醇为胆固醇琥珀酸单酯，其通过与接头中的K侧链氨基进行酰胺化反应实现对多肽的修饰。本领域公知的，溴乙酸胆固醇酯作为多肽的修饰部分也可以通过和接头中的半胱氨酸(C)侧链的巯基进行成硫醚反应实现对多肽的修饰。

在某些实施方案中，所述脂肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:11-19。

本领域公知，通过对多肽进行脂类化学修饰，得到所谓的“脂肽”(lipopeptide)，能提高多肽的细胞膜靶向性和抗病毒活性，同时又能显著改善多肽的稳定性和生物半衰期。因此，本领域公知，本公开所述多肽也具有与所述脂肽类似的抗病毒活性。在此基础上，在另一个方面，本公开还提供一种多肽或其变体，其为本公开前述任意实施方案中所述的多肽或其变体。具体地，所述多肽包含式I、式II、式III、式IV或式V所示的序列，或由式I、式II、式III、式IV或式V所示的序列组成：

(X₁X₂X₃)mX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄X₂₅N(EX₂₆)n

式I

(X₁X₂X₃)mX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄KN(EX₂₆)n

式II

(X₁X₂X₃)m-EX₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄KN(EX₂₆)n

式III

(X₁X₂X₃)m-EX₅X₆X₇X₈X₉EELEKKIEELLKKAEEQQKKN(EX₂₆)n

式IV

(X₁X₂X₃)m-EX₅EKX₈X₉EELEKKIEELLKKAEEQQKKN(EX₂₆)n

式V

其中，X₁，X₂，X₃，m，X₄，X₅，X₆，X₇，X₈，X₉，X₁₀，X₁₁，X₁₂，X₁₃，X₁₄，X₁₅，X₁₆，X₁₇，X₁₈，X₁₉，X₂₀，X₂₁，X₂₂，X₂₃，X₂₄，X₂₅，X₂₆，n的定义如本公开任意实施方案中所述。

在某些实施方案中，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:21-29。

本领域公知：对应于CHR螺旋的a和d位置的氨基酸，是CHR与NHR靶序列结合形成6-HB结构的关键氨基酸，在序列上比较保守而不易被其他氨基酸取代；相对地，对应于CHR螺旋b，c，f和g位置的氨基酸不与或少与NHR直接相互作用，容易被其他氨基酸取代而不影响或不明显影响多肽的抗病毒活性。因此，所述多肽中氨基酸可以被一个或多个其他氨基酸取代、添加或缺失，而多肽仍具有抑制HIV和/或其他病毒的活性。氨基酸的取代是指在多肽序列某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸所取代，优选的是保守氨基酸的置换，即保守置换；氨基酸的添加是指在多肽序列的N端或C端或某个适当的位置插入其他氨基酸残基，插入的氨基酸残基可以全部或部分彼此相邻，或不彼此相邻；氨基酸的缺失是指在多肽序列中删除一个或多个氨基酸残基，只要多肽具有抑制病毒的活性。

所谓的保守氨基酸或氨基酸的保守性，具有本领域公知的含义。例如，根据氨基酸分子中所含氨基和羧基数目的不同将氨基酸分为酸性氨基酸、碱性氨基酸和中性氨基酸，其中酸性氨基酸是指E和D，碱性氨基酸是指K、R和H(组氨酸)，中性氨基酸是指A、L、I、V、C、Y、G、M、S、T、F(苯丙氨酸)、W和P(脯氨酸)。又例如，按氨基酸的亲水性和疏水性可分为亲水性氨基酸(D、E、H、K、Q、R、S、T、Y)和疏水性氨基酸(A、F、I、L、M、P、V、W)。又例如，亲水不带电荷的氨基酸是指N、Q、S和T；脂肪族不带电荷的氨基酸是指A、L、I、V和G；非极性不带电荷的氨基酸是指C、M和P；芳香族氨基酸是指Y、F和W。又例如，含有醇基团的氨基酸有S和T；脂肪族氨基酸有L、I、V和M；环烯基相关的氨基酸有F、H、W和Y。这些具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力的氨基酸通常被认为是保守氨基酸。

本公开中，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，保守置换通常是指，用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的。

本发明人团队十几年来的研究经验已经表明，由多肽中氨基酸的取代、添加或缺失而衍生的多肽，其序列同一性可达到约30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，但抑制剂仍可保留强效的抗病毒活性。例如上述LP-126、LP-127、LP-128脂肽，仅有8个氨基酸保留了原型CHR的氨基酸，LP-126和LP-127与原型CHR的氨基酸的同一性仅为26.7％，LP-128与原型CHR的氨基酸的同一性仅为29.6％。因此，任一所述多肽为具有约27％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有抗病毒活性的多肽。

制备融合蛋白常见的刚性接头除了能够形成α-螺旋的(EAAAK)n₁序列，另一种常见的刚性接头类型是富含脯氨酸(P)的序列(XP)n₂，其中X可指定任何氨基酸，优选丙氨酸，赖氨酸或谷氨酸。(XP)n₂序列没有螺旋结构，但其中脯氨酸可以增加骨架硬度，并且有效分离结构域。因此，本公开中，(EAAAK)n₁接头也可以被(XP)n接头替代而明显不影响其抗病毒活性。所以，本公开所述接头可以是(EAAAK)n₁，也可以是(XP)n₂。进一步地，为了与亲脂性化合物进行连接，所述接头还可以包含一个或多个赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)。

本公开所述的脂肽有可能含有一个或多个手性中心，和/或者双键以及诸如此类的结构，也可能存在立体异构体，包括双键的异构体(比如几何异构体)、旋光对映异构体或者非对映异构体。相应的，在本文描述范围内的任意化学结构，无论是部分或整体结构中含有上述类似结构，都包括了此脂肽的所有可能的对映异构体和非对映异构体，其中也包括了单纯的任一种立体异构体(如单纯的几何异构体、单纯的对映异构体或者单纯的非对映异构体)以及这些异构体的任意一种混合物。这些消旋异构体和立体异构体的混合物由本领域技术人员利用不停的分离技术或手性分子合成的方法也可进一步被拆分成其组成成分的对映异构体或立体异构体。所述脂肽包括但不限于各种光学异构体、消旋体和/或其他的混合物。上述情况下，其中单一的对映异构体或非对映异构体，如有旋光的异构体，可以用不对称合成的方法或消旋体拆分的方法获得。消旋体的拆分可用不同的方法实现，如常规的用助拆分的试剂重结晶，或用色谱方法。另外，脂肽也包含了带双键的顺式和/或反式的异构体。

本公开所述脂肽包含但不限于所述脂肽所有的在药学上可用的不同形式。这些药学上可用的不同形式包括各种药学上可用的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物、基于上述物质基础上的前药和上述这些形式的任意混合物。

本公开所述药学上可用的盐，包括醋酸盐、乳糖醛酸盐、苯磺酸盐、月桂酸酯、安息香酸盐、苹果酸盐、重碳酸盐、马来酸盐、硫酸氢盐、扁桃酸盐、酒石酸氢盐、甲磺酸盐、硼酸盐、溴甲烷、溴化物、硝酸甲酯、依地酸钙、甲基硫酸盐、右旋樟脑磺酸、粘酸盐、碳酸盐、萘磺酸盐、氯化物、硝酸盐、棒酸盐、N-甲葡糖胺、柠檬酸盐、铵盐、二氢氯化物、油酸盐、乙二胺四乙酸盐、草酸盐、乙二磺酸盐、扑酸盐、双羟萘酸盐、丙酸酯月桂硫酸酯、棕榈酸盐、乙磺酸酯、泛酸盐、延胡索酸盐、磷酸盐/二磷酸,葡庚糖酸盐、聚半乳糖醛酸盐、葡(萄)糖酸盐、水杨酸盐、谷氨酸盐,硬脂酸盐,对羟乙酰氨基苯胂酸、硫酸盐、羟基苯甲酸盐、碱式乙酸盐、海巴、琥珀酸盐、氢溴酸盐、丹宁酸盐、氢氯化物、酒石酸盐、羟萘酸盐、8-氯茶碱盐、碘化物、甲苯磺酸盐、三乙基碘、乳酸、戊酸盐等。取决于用途，药用盐可以由阳离子如钠、钾、铋等所形成，也可由碱如氨、乙二胺、N-甲基-谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇氨、普鲁卡因、二乙胺、哌嗪、三羟甲基氨基甲烷和羟化四甲铵等所形成。这些盐可以采用标准方法制备，例如通过游离酸与有机或无机碱的反应。在一个碱性基团如氨基存在的情况下，酸性盐如氢氯化物、氢溴化物、醋酸盐、扑酸盐等可用作剂型；在一个酸性基团或醇基存在的情况下，可药用的酯如醋酸酯、马来酸酯、三甲基乙酸氯甲酯等、以及文献中公知的用于改善可溶性和水解性的酯可以用作持续释放和前体药制剂。

在另一个方面，本公开还提供一种分离的核酸，其编码如上所述的多肽或其变体。

在另一个方面，本公开还提供一种载体，其包含所述分离的核酸。可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。

在另一个方面，本公开还提供一种包含如上所述分离的核酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系。

在另一个方面，本公开还提供一种由如上所述脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，或如上所述多肽或其变体形成的多聚体。

在另一个方面，本公开还提供一种缀合物，其包含如上所述的多肽或其变体和修饰部分。在某些实施方案中，所述修饰部分任选地通过接头连接至所述多肽或其变体的N端或C端。在某些实施方案中，所述修饰部分为末端保护基团。所述多肽末端保护基团包括N端保护基团和/或C端保护基基团。公知的，N端保护基团可以为乙酰基(Ac)、氨基(NH₂)、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基、苄氧或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。公知的，C端保护基团可以为氨基(NH₂)、羧基、羟基、酰胺基、叔丁氧羰基或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。

在另一个方面，本公开还提供一种组合物，其包含如上所述的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，或如上所述的多肽或其变体，或如上所述的缀合物，或如上所述的分离的核酸，或如上所述的载体，或如上所述的宿主细胞，或如上所述的多聚体。

在另一个方面，本公开还提供一种药物组合物，其包含如上所述的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。在某些实施方案中，所述脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药以治疗病毒感染或由病毒感染所导致的疾病的有效量存在。

在另一个方面，本公开还提供一种药物组合物，其包含如上所述的多肽或其变体，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。在某些实施方案中，所述多肽或其变体以治疗病毒感染或由病毒感染所导致的疾病的有效量存在。

在某些实施方案中，所述病毒感染为由选自由HIV及其耐药株、SARS-CoV-2及其突变株、MERS-CoV、EBOV、MARV、IAV、RABV和VSV组成的组中的病毒引起的感染。

在某些实施方案中，所述病毒感染为HIV及其耐药株引起的感染。

在另一个方面，本公开还提供一种治疗病毒感染或由病毒感染所导致的疾病的方法，其包括将有效量的如上所述的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药或如上所述的多肽或其变体或如上所述的药物组合物施用给有需要的受试者。在另一个方面，本公开还提供一种抑制病毒膜融合的方法，其包括将有效量的如上所述的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药或如上所述的多肽或其变体或如上所述的药物组合物施用给有需要的受试者。在某些实施方案中，所述病毒感染为由选自由HIV及其耐药株、SARS-CoV-2及其突变株、MERS-CoV、EBOV、MARV、IAV、RABV和VSV组成的组中的病毒引起的感染。在某些实施方案中，所述病毒感染为HIV及其耐药株引起的感染。

在另一个方面，本公开还提供如上所述的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药或如上所述的多肽或其变体在制备药物组合物的用途，所述药物组合物作为病毒膜融合抑制剂或用于治疗病毒感染或由病毒感染所导致的疾病。在某些实施方案中，所述病毒感染为由选自由HIV及其耐药株、SARS-CoV-2及其突变株、MERS-CoV、EBOV、MARV、IAV、RABV和VSV组成的组中的病毒引起的感染。在某些实施方案中，所述病毒感染为HIV及其耐药株引起的感染。

在另一个方面，本公开还提供如上所述的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，其用作病毒膜融合抑制剂或用于治疗病毒感染或由病毒感染所导致的疾病。在另一个方面，本公开还提供如上所述的多肽或其变体，其用作病毒膜融合抑制剂或用于治疗病毒感染或由病毒感染所导致的疾病。在某些实施方案中，所述病毒感染为由选自由HIV及其耐药株、SARS-CoV-2及其突变株、MERS-CoV、EBOV、MARV、IAV、RABV和VSV组成的组中的病毒引起的感染。在某些实施方案中，所述病毒感染为HIV及其耐药株引起的感染。

在另一个方面，本公开还提供一种用于抑制病毒膜融合的药物组合物或用于治疗病毒感染或由病毒感染所导致的疾病的药物组合物，其包含如上所述的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药或如上所述的多肽或其变体。在某些实施方案中，所述病毒感染为由选自由HIV及其耐药株、SARS-CoV-2及其突变株、MERS-CoV、EBOV、MARV、IAV、RABV和VSV组成的组中的病毒引起的感染。在某些实施方案中，所述病毒感染为HIV及其耐药株引起的感染。

在某些实施方案中，所述SARS-CoV-2的突变株包括Alpha突变株、Beta突变株、Gamma突变株、Epsilon突变株、Delta突变株、Omicron突变株等。在某些实施方案中，所述SARS-CoV-2的突变株包括SARS-CoV-2D614G和奥密克戎BA4/5突变株。在某些实施方案中，所述IAV包括甲型流感病毒(Influenza Avirus)，乙型流感病毒(Influenza B virus)，丙型流感病毒(Influenza C virus)。在某些实施方案中，所述甲型流感病毒包括H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亚型。在某些实施方案中，所述甲型流感病毒为H7N9。

在实际应用中，可以将本公开所述的脂肽或多肽作为药物直接给予病人、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人，以达到治疗和/或预防HIV等病毒感染或由病毒感染所导致的疾病的目的。所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药。

本公开的脂肽或多肽的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体活性成分，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

本公开的脂肽或多肽可以直接单独用于HIV等病毒感染或由病毒感染所导致的疾病的治疗和预防，也可以与一种或多种抗病毒药物联合使用，以达到提高整体治疗效果的目的。这些抗病毒药物包括但不限于逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、侵入抑制剂、整合抑制剂和成熟抑制剂等。上述的逆转录酶抑制剂可以是AZT、3TC、ddI、d4T、ddT、TDF、Abacavir、Nevirapine、Efavirenz、Delavirdine、阿兹夫定、艾诺韦林等的一种或几种；上述的蛋白酶抑制剂可以是Saquinavir mesylate、Idinavir、Ritonavir、Amprenavir、Kaletra和Nelfinavir mesylate等的一种或几种；上述的侵入抑制剂可以是Maraviroc、TAK-779、T20、T2635、西夫韦肽、艾博卫肽等的一种或几种；上述的整合抑制剂可以是Raltegravir、Dolutegravir和Elvitegravi等的一种或几种。

对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体活性成分的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体活性成分的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体活性成分组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本公开的试剂用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001-1000mg/kg体重/天，例如介于0.01-100mg/kg体重/天，又例如介于0.1-10mg/kg体重/天。

附图说明

图1示出了T20、C34、T1249、T2635、SFT、ABT、C34-Chol、LP-11和LP-98的序列结构示意图，其中A为HIV-1融合蛋白gp41结构与功能示意图；B为多肽示意图，其中下划线序列为PBD，三个NHR口袋插入氨基酸被标为红色，突变氨基酸被标为绿色；Chol表示胆固醇分子,C₁₆表示棕榈酸分子。

图2示出了本公开实施例提供的病毒膜融合抑制剂(包括LP-121、LP-122、LP-123、LP-124、LP-125、LP-126、LP-127和LP-128)的序列结构示意图，其中下划线序列为PBD，三个NHR口袋插入氨基酸被标为红色，突变氨基酸被标为绿色；括号中Chol表示胆固醇分子。

图3示出了本公开实施例提供的病毒膜融合抑制剂的抗HIV活性，其中A示出了C34-LP1和C34-LP2的抗HIV活性比较；B示出了LP-121、LP-122和LP-123的抗HIV活性比较，所用HIV-1毒株NL4-3和JRFL为假病毒，SG3.1为复制性病毒；所用靶细胞为TZM-bl细胞。

图4示出了本公开实施例提供的病毒膜融合抑制剂的抗HIV活性，其中A示出了LP-122和LP-124的抗HIV活性比较；B示出了LP-123和LP-125的抗HIV活性比较；C示出了LP-126、LP-127和LP-128的抗HIV活性，所用HIV-1毒株NL4-3和JRFL为假病毒，SG3.1为复制性病毒；所用靶细胞TZM-bl细胞。

图5示出了本公开实施例提供的LP-127和LP-128与T20的抗HIV活性比较，其中A示出了它们对复制性HIV-1毒株SG3.1、JR-CSF和89.6感染TZM-bl细胞的抑制活性；B示出了它们对复制性HIV-1毒株SG3.1、LAI.2和89.6感染MT-4细胞的抑制活性。

图6示出了T20与本公开实施例提供的LP-123、LP-125、LP-127、LP-128对国际代表性流行HIV-1毒株假病毒的抑制活性。

图7示出了T20与本公开实施例提供的LP-123、LP-125、LP-127、LP-128对国际代表性流行HIV-1毒株介导细胞融合的抑制活性。

图8示出了LP-98与本公开实施例提供的LP-123、LP-125、LP-127、LP-128对HIV-1耐药性毒株的抑制活性。

图9示出了本公开实施例提供的LP-127和LP-128的广谱抗病毒活性鉴定结果，其中对SARS-CoV-2、MERS-CoV、EBOV、MARV、IAV(H7N9)、RABV、VSV的抑制活性均是采用假病毒系统评价。

图10示出了本公开实施例提供的LP-127和LP-128的体外细胞毒性评价结果。

图11示出了本公开实施例提供的LP-127和LP-128的稳定性分析结果。

图12示出了应用圆二色谱(CD)检测本公开实施例提供的膜融合抑制剂的二级结构及热稳定性，其中A示出了单独脂肽的α-螺旋含量(左图)和热稳定性(左图)；B示出了脂肽与靶序列多肽N44形成的复合物的α-螺旋含量(左图)和热稳定性(右图)。

序列信息

本公开涉及的序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

注：下划线序列为PBD，三个NHR口袋插入氨基酸标记为加粗，突变氨基酸标记为斜体；Chol表示胆固醇分子,C₁₆表示棕榈酸分子。

实施例

下面结合具体实施方式对本公开进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本公开，而不是为了限制本公开的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本公开的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进相关参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本公开范围内。本公开的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本公开内容、精神和范围内对本文所述的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本公开技术。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1病毒膜融合抑制剂脂肽的制备

本公开实施例制备的10个脂肽(C34-LP1、C34-LP2、LP-121、LP-122、LP-123、LP-124、LP-125、LP-126、LP-127和LP-128)的胆固醇修饰均通过胆固醇琥珀酸单酯与肽链C末端的赖氨酸(K)侧链的氨基进行酰胺化反应实现，具体的方法可参见本发明人实验室发表的文献^[7]。本公开实施例制备的所有脂肽的氨基末端均连接乙酰基(Ac)作为氨基端保护基，羧基末端均连接氨基(NH₂)作为羧基端保护基。

一、制备过程中所需的化学试剂

所有的化学试剂如各种Fmoc氨基酸、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、哌啶(PIPE)、茚三酮、乙酸酐(Ac₂O)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、水合肼、胆固醇琥珀酸单酯、三氟乙酸(TFA)、乙二硫醇(EDT)、苯甲硫醚(TA)、三异丙基硅烷(TIPS)、苯酚等均从主要化学试剂供应商购买，使用前未经过进一步的提纯。多肽合成过程中使用的保护氨基酸原料包括Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH。其中的缩写具有公知的定义，例如：Fmoc为9-芴甲氧羰基，Dde为1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基，Boc为叔丁氧羰酰基,tBu为叔丁基，OtBu为叔丁氧基，Trt为三苯甲基，Pbf为(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基。

二、肽树脂的合成

使用Rink Amide MBHA树脂为载体树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与多肽氨基酸序列相应的保护氨基酸偶联，制得肽树脂。

1、接入主链第1个保护氨基酸

取0.3mmol第1个保护氨基酸Fmoc-Lys(Dde)-OH和0.3mmol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3mmol DIC，振荡下慢慢加入至保护氨基酸的DMF溶液中，于室温环境中振荡反应5分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

取0.1mmol的Rink Amide MBHA树脂(0.35mmol/g×0.3g)，采用25％ PIPE/DMF溶液(体积比)去保护20分钟(两次)，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应60分钟，过滤洗涤，得含第1个保护氨基酸Fmoc-Lys(Dde)的树脂。

2、接入主链其他保护氨基酸

采用上述接入主链第1个保护氨基酸同样的方法，依次接入多肽对应的其他保护氨基酸，得含主链氨基酸的树脂。最后用0.3mmol Ac₂O+0.6mmol DIEA对N端进行乙酰化封端，完成主链的合成。以上每步反应后都通过Kaiser Test检测对反应进行控制，若某个氨基酸缩合反应不完全，则重复缩合一次，直至得到所需的目标肽段，即为本公开所述的多肽。

3、赖氨酸侧链的胆固醇接入：

用尽量小体积的2％水合肼/DMF溶液(体积比)处理树脂去除C端赖氨酸侧链的Dde保护基(10分钟，两次)，过滤洗涤，得到去Dde的树脂备用。取0.3mmol胆固醇琥珀酸单酯和0.3mmol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3mmol DIC，慢慢加入至含胆固醇琥珀酸单酯和HOBt的溶液中，于室温环境中振荡反应5分钟。将制备的含胆固醇琥珀酸单酯、HOBt和DIC溶液加入到获得的去Dde的树脂中，偶联反应60分钟，过滤、洗涤和干燥，得到肽树脂。

三、粗品的制备

取上述肽树脂，加入裂解试剂(裂解试剂15mL/克树脂)，混合均匀后于30℃下振荡反应3小时，将目标多肽从树脂上裂解下来并除去侧链保护基。收集反应混合物滤液，树脂再用少量TFA/DCM洗涤3次，合并滤液后加入无水乙醚沉淀，离心。滤饼再用冷的无水乙醚洗涤沉淀2次，抽干得类白色粉末即为脂肽粗品。裂解试剂的组成如下：三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：苯甲硫醚：苯酚：H₂O：三异丙基硅烷＝68.5:10:10:5:3.5:1(体积比)。

四、纯品的制备

取上述脂肽粗品，加水/乙腈搅拌溶解，离心除去不溶物后备用。采用反相高效液相色谱法进行纯化。所用色谱柱型号为Agela C18(10μm,50×250mm)，流动相由流动相A(0.05％TFA和2％乙腈的水溶液)和流动相B(90％乙腈/水溶液)组成。流动相流速为每分钟25mL。紫外检测波长为220纳米。取粗品溶液上样于色谱柱中，进行梯度洗脱，收集对应纯化组分，直接冷冻干燥除去溶剂，即得到蓬松状态的三氟乙酸盐脂肽纯品。

将三氟乙酸盐脂肽纯品用水和乙腈重新溶解，加入大量的阴离子交换树脂(醋酸根形式)后搅拌3个小时。过滤并用水/乙腈混合溶剂冲洗离子交换树脂后，合并滤液冻干，得到蓬松状态的脂肽醋酸盐纯品。

所合成脂肽的化学结构由MALDI-TOF质谱进行表征，其纯度则由分析型高效液相色谱仪(Agela C18-4.6×250mm,流速每分钟1mL)给出。结果表明，所合成脂肽的纯度均大于95％。

实施例2EAAAK刚性接头对膜融合抑制剂的抗HIV活性的影响

本实施例比较了C34-LP1(含有GSGSG柔性接头)与C34-LP2(含有EAAAK刚性接头)的抗HIV活性，所用材料与方法可参见本发明人实验室发表的文献^[7]，其中所用病毒为HIV-1毒株NL4-3和JRFL的假病毒以及HIV-1毒株SG3.1的复制性病毒(活病毒)。

1、实验方法

(1)病毒的制备：将表达NL4-3或JRFL包膜蛋白(Env)的质粒与HIV-1骨架质粒pSG3Δenv共转染HEK293T细胞；将编码SG3.1的分子克隆转染HEK293T细胞。将转染的细胞置于37℃、5％ CO₂细胞培养箱中培养48小时，然后收取上清液，过滤并收集滤液，即为含有NL4-3假病毒或JRFL假病毒或SG3.1活病毒的病毒液，滴定后置于-80℃保存备用。

(2)用去离子水溶解供试脂肽，然后用DMEM培养基进行3倍倍比稀释，得到脂肽稀释液。每种供试脂肽设置9个稀释度。

(3)在96孔细胞培养板中，药物孔加入脂肽稀释液(50μL/孔)，对照孔加入DMEM培养基(50μL/孔)，均设置3个复孔。然后加入100TCID₅₀病毒液(调整为50μL/孔)，于室温孵育30分钟。

(4)用DMEM培养基重悬TZM-bl细胞并加入DEAE-dextran，使得细胞浓度为约10×10⁴个细胞/mL且DEAE-dextran浓度为15μg/mL。完成步骤3后，在96孔板中加入TZM-bl细胞悬液(100μL/孔)，然后于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养48小时。

(5)弃除细胞培养上清，每孔加入30μL细胞裂解液(Promega公司，货号E1531)，室温裂解15分钟，然后加入荧光素酶检测底物试剂(Promega公司，货号E1501)，用微孔板光度计测定相对荧光单位(RLU)，制作抑制率曲线并计算药物半数抑制浓度(IC₅₀)。

2、实验结果及分析

结果如图3中的A所示。结果显示，C34-LP1抑制NL4-3假病毒和JRFL假病毒感染TZM-bl细胞的平均IC₅₀值分别为55pM和69.4pM，而C34-LP2抑制NL4-3假病毒和JRFL假病毒感染TZM-bl细胞的平均IC₅₀值分别为20.23pM和19.9pM；C34-LP1抑制SG3.1活毒感染TZM-bl细胞的平均IC₅₀值为15.44pM，而C34-LP2抑制SG3.1活毒感染MT-4细胞的平均IC₅₀值为3.2pM。相比之下，C34-LP2抑制NL4-3和JRFL假病毒的活性比C34-LP1分别高约3倍和4倍；C34-LP2抑制SG3.1活毒的活性比C34-LP1高约5倍。这个实验结果证明EAAAK刚性接头有助于改善膜融合抑制剂的抗HIV活性。

实施例3膜融合抑制剂的设计及抗病毒活性鉴定

通过直接比较C34-LP1与C34-LP2的抗HIV活性，明确了EAAAK刚性接头的使用能够改善脂肽膜融合抑制剂的抗病毒作用。本公开实施例进一步制备了LP-121、LP-122和LP-123脂肽，它们除了使用EAAAK作为接头，同时在对应于CHR螺旋的b，c和f，g位置分别引入EE和KK氨基酸对子，以促使“盐桥”结构的形成。利用实施例2中的方法，对LP-121、LP-122和LP-123的抗HIV活性进行了检测。结果如图3中的B所示。结果显示，LP-121抑制NL4-3和JRFL假病毒及SG3.1活毒的IC₅₀值分别为51.98pM、42.39pM和9.88pM；LP-122抑制NL4-3和JRFL假病毒及SG3.1活毒的IC₅₀值分别为22.45pM、41.55pM和9.05pM；LP-123抑制NL4-3和JRFL假病毒及SG3.1活毒的IC₅₀值分别为18.05pM、14.59pM和3.68pM。通过比较可以发现，含有较短序列的LP-123脂肽具有最优的抗HIV活性，而N端延长的LP-121脂肽和C端延长的LP-122脂肽的抗HIV活性反而有所下降。这个意外结果揭示了膜融合抑制剂的结构与功能关系。

实施例4进一步优化膜融合抑制剂的技术策略

为进一步提高膜融合抑制剂的抗病毒活性，本公开实施例创造性地制备了膜融合抑制剂脂肽LP-124和LP-125，将LP-122和LP-123的多肽序列中N端口袋结合区(PBD)的二个疏水性氨基酸W替换成具有亲水性且分子量较小的氨基酸Y，以促使抑制剂与NHR靶点在口袋区的相互作用由高度疏水性向亲水性转变。

同样，利用实施例2中的实验方法，对LP-124和LP-125的抗HIV活性进行了检测和比较分析。

结果如图4中的A和B所示。结果显示，LP-124抑制NL4-3和JRFL假病毒及SG3.1活毒的IC₅₀值分别为2.07pM、5.93pM和1.06pM，比其模板LP-122抑制三个病毒的活性分别提高了约11倍、7倍和9倍。LP-125抑制NL4-3和JRFL假病毒及SG3.1活毒的IC₅₀值分别为3.43pM、5.78pM和1.11pM，比其模板LP-123抑制三个病毒的活性分别提高了约5倍、3倍和3倍。

进一步地，本公开实施例制备了LP-126、LP-127和LP-128三个脂肽，并采用上述同样方法检测了它们的抗HIV活性。结果如图4中的C所示。结果显示，LP-126、LP-127和LP-128抑制NL4-3假病毒的IC₅₀值分别为3.85pM、5.01pM和3.27pM；LP-126、LP-127和LP-128抑制JRFL假病毒的IC₅₀值分别为6.08pM、5.63pM和4.97pM；LP-126、LP-127和LP-128抑制SG3.1活毒的IC₅₀值分别为1.65pM、2.31pM和1.75pM。

这些结果表明：膜融合抑制剂的PBD序列中，W到Y氨基酸的替换能够显著提高抗病毒活性。

实施例5LP-127、LP-128与T20抗HIV活性的比较分析

T20是目前美国FDA批准临床应用的唯一一个病毒膜融合抑制剂，用于HIV-1感染的治疗。本实施例采用多个复制性HIV-1毒株进一步评价了LP-127和LP-128的抗HIV活性，并与T20的抑制活性相比较。

1、实验方法

复制性HIV-1毒株SG3.1、JRCSF、89.6和LAI.2的制备方法同实施例2中的制备方法，通过将分子克隆质粒转染HEK293T细胞而获得，具体方法可参见本发明人实验室发表的文献^[7]。本公开实施例不但检测了膜融合抑制剂对病毒感染TZM-bl细胞的抑制活性(方法同实施例2)，同时还检测了膜融合抑制剂对复制性HIV-1毒株感染MT-4细胞的抑制活性，具体实验方法如下：

(1)将脂肽在96孔细胞培养板进行梯度稀释，设置3个复孔和9个梯度，然后每孔依次加入200TCID₅₀病毒和约4×10⁴MT-4细胞；

(2)将培养板置于37℃、5％ CO₂孵箱4小时后，于室温200g离心5分钟后吸弃上清，再用200μl/孔RPMI-1640培养基洗涤细胞一次，然后加入200μl/孔RPMI-1640完全培养基进行培养。

(3)于第4天将96孔培养板室温200g离心5min，按30μl/孔取上清移至新的96孔板中，加入120μl/孔1％ Triton-X100溶液灭活病毒。取阳性对照孔和首浓度进行P24抗原定量检测，以确定稀释倍数。P24定量按试剂盒说明书操作方法进行，使用96孔酶标检测仪进行测定。然后将各培养上清稀释至合适浓度进行P24定量检测。采用非线性回归分析中四参数S形剂量方程绘制每种药物的抑制曲线并计算IC₅₀值。

2、实验结果与分析

结果如图5所示。

在TZM-bl细胞中，LP-127、LP-128和T20抑制SG3.1的IC₅₀分别为2.04pM、0.68pM和2911.83pM，抑制JR-CSF的IC₅₀分别为10.38pM、7.47pM和5599pM，抑制89.6的IC₅₀分别为9.09pM、8.56pM和15841.67pM(图5中A)。相比之下，LP-127和LP-128抑制SG3.1的活性分别比T20高1427倍和4282倍，抑制JR-CSF的活性分别比T20高539倍和750倍，抑制89.6的活性分别比T20高1743倍和1851倍。

在MT-4细胞中，LP-127、LP-128和T20抑制SG3.1的IC₅₀分别为0.69pM、0.4pM和1133.7pM，抑制LAI.2的IC₅₀分别为0.27pM、0.08pM和745.77pM，抑制89.6的IC₅₀分别为1.45pM、0.83pM和4801.5pM(图5中B)。相比之下，LP-127和LP-128抑制SG3.1的活性分别比T20高1643倍和2834倍，抑制LAI.2的活性分别比T20高2762倍和9322倍，抑制89.6的活性分别比T20高3311倍和5785倍。

实施例6本公开的膜融合抑制剂的广谱抗HIV活性

HIV具有高度变异性，在进化中产生了许多亚型和重组型病毒，其中HIV-1的A、B和C亚型是引起世界艾滋病流行的主要病毒，而在中国则是以A/E和B/C重组病毒为主。本实施例采用一组12个国际流行代表性HIV-1毒株(global panel)的假病毒和细胞融合实验进一步评价本公开的膜融合抑制剂的广谱抗HIV活性，并与T20的抑制活性进行比较分析。

1、实验方法

所用材料与方法可参见本发明人实验室发表的文献^[7]。HIV-1假病毒的制备方法及抗病毒实验与实施例2中的方法相同。HIV-1包膜蛋白(Env)介导的细胞-细胞融合抑制活性的检测采用基于DSP荧光报告系统的细胞融合实验，基本步骤如下：

(1)将293T细胞(效应细胞)铺于96孔板培养中(约1.5×10⁴个/孔)，同时将稳定表达CXCR4/CCR5和DSP_8-11的靶细胞293FT(约1.5×10⁴个/mL)铺于10cm细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂条件下进行培养。

(2)培养16小时后，将HIV-1Env表达质粒与DSP_1-7质粒1:1共转染293T效应细胞。

(3)转染24小时后，将膜融合抑制剂用去离子水溶解并用DMEM培养基将抑制剂稀释到起始浓度，按3倍倍比稀释加入到96孔培养板的效应细胞中(50μL/孔)，设9个稀释梯度，3个复孔。不加抑制剂的用DMEM培养基作为对照。将培养板于37℃、5％ CO₂细胞培养箱中孵育1小时。

(4)将293FT细胞重悬，调整细胞浓度为约30×10⁴个/mL，按1：4000比例加入EnduRen活细胞底物(Promega公司)，混匀，于37℃、5％ CO₂条件下孵育30分钟。

(5)将293FT细胞按每孔100μL加入到HIV-1效应细胞孔中，300g离心1分钟以使效应细胞和靶细胞充分接触，放置37℃培养1小时后，测定荧光素酶活性(相对荧光单位，RLU)，制作抑制率曲线并计算药物半数抑制浓度(IC₅₀)。

2、实验结果与分析

本公开的膜融合抑制剂对国际代表性HIV-1毒株假病毒感染的抑制结果如图6所示。T20多肽抑制12个假病毒的平均IC₅₀值为20052.09pM，而LP-123、LP-125、LP-127和LP-128四个脂肽抑制12个假病毒的平均IC₅₀值分别为27.39pM、4.22pM、4.89pM和3.19pM。相比之下，LP-123、LP-125、LP-127和LP-128抑制12个假病毒的活性分别比T20高732倍、4752倍、4101倍和6286倍。

本公开的膜融合抑制剂对国际代表性HIV-1毒株Env介导的细胞融合的抑制结果如图7所示。T20多肽抑制12个病毒膜融合的平均IC₅₀值为11214.53pM，而LP-123、LP-125、LP-127和LP-128四个脂肽抑制12个病毒膜融合的平均IC₅₀值分别为24.04pM、11.9pM、4.97pM和4.02pM。相比之下，LP-123、LP-125、LP-127和LP-128抑制12个病毒膜融合的活性分别比T20高466倍、942倍、2256倍和2790倍。

实施例7本公开的膜融合抑制剂对T20耐药毒株的抑制活性

HIV另一重要的生物学特征是容易产生耐药，导致治疗失败，是药物研发需要重点解决的问题。本实施例采用一组T20高度耐药性突变毒株，对本公开的膜融合抑制剂的抗病毒活性进行了评价，并与脂肽LP-98的抑制活性进行对比分析。

1、实验方法

基于HIV-1毒株NL4-3构建一组12个携带单点突变、双突变或三突变的T20耐药性突变毒株(L33S、I37T、V38A、V38M、Q40H、N43K、L33S/I37T、G36S/V38M、I37T/N43K、V38A/N42T、L33S/V38A/N42T、N43K/E49A/N126K)，构建方法可参见本发明人实验室发表的文献^[7][11][12]。突变株假病毒的制备方法及抗病毒实验与实施例2中的方法相同。

2、实验结果与分析

结果如图8所示。结果显示，LP-98抑制12个耐药突变株的平均IC₅₀值为2663.27pM，而LP-123、LP-125、LP-127和LP-128四个脂肽抑制12个耐药突变株的平均IC₅₀值分别为55.51pM、6.29pM、7.02pM和9.13pM。相比之下，LP-123、LP-125、LP-127和LP-128抑制12个耐药突变株的活性分别比LP-98高48倍、423倍、379倍和292倍。因此，本公开的膜融合抑制剂对T20耐药毒株具有强效的抑制活性，体现出明显的成药性优势。

实施例8本公开的膜融合抑制剂对其他病毒的广谱抑制活性

本实施例利用假病毒系统评价了LP-127和LP-128对SARS-CoV-2以及其他多种病毒的抑制活性。

1、实验方法

假病毒的制备方法是本领域成熟的技术，本领域技术人员可常规使用。SARS-CoV-2D614G和BA4/5突变株、MERS-CoV、IAV(H7N9)、VSV假病毒的制备及抗病毒实验方法可参见本发明人实验室发表的文献^[13][14][15]。EBOV、MARV和RABV假病毒的制备也可参考上述文献，将编码病毒包膜蛋白的质粒与HIV-1骨架质粒pNL4-3.luc.R共转染HEK293T细胞而获得，抗病毒实验步骤与本公开实施例2中的方法基本一致，区别在于靶细胞的种类和假病毒的用量不同。SARS-CoV-2假病毒的靶细胞为293T/ACE2；MERS-CoV、EBOV和MARV三个假病毒的靶细胞为Huh-7；H7N9假病毒的靶细胞为MDCK；RABV和VSV二个假病毒的靶细胞为HEK293T。各种假病毒的用量均为1000TCID₅₀。

2、实验结果与分析

结果如图9所示。发明人惊奇地发现，LP-127和LP-128脂肽能够有效抑制两个SARS-CoV-2突变株的感染，其中LP-127和LP-128抑制D614G突变株的IC₅₀值分别为27.4nM和25.12nM，抑制奥密克戎BA4/5突变株的IC₅₀值分别为26.56nM和23.51nM。LP-127和LP-128抑制MERS-CoV的IC₅₀分别为382.72nM和455.67nM，抑制EBOV的IC₅₀分别为61.68nM和274.47nM，抑制MARV的IC₅₀分别为143.98nM和534.44nM，抑制H7N9的IC₅₀分别为414.87nM和352.6nM，抑制RABV的IC₅₀分别为1731nM和1130nM，抑制VSV的IC₅₀分别为1509nM和1490nM。

上述实验结果表明，LP-127和LP-128不但能够强效抑制各种HIV-1亚型及T20耐药株，也能够有效抑制多种其他病毒，是一种广谱的抗病毒候选药物。

实施例9LP-127和LP-128脂肽的体外细胞毒性分析

为明确本公开的膜融合抑制剂LP-127和LP-128抗病毒活性的特异性及成药性，本实施例进一步检测了它们的体外细胞毒性。

1、实验方法

采用CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒(厂家：Abbkine，货号：KTC011001)进行体外细胞毒性的检测。具体步骤：(1)在96孔细胞培养板中将供试脂肽进行3倍梯度稀释，设置9个稀释度，每个稀释度3个复孔，最终每个孔中含有100μL脂肽溶液；设置DMEM培养基(每孔100μL)对照孔；(2)将约10×10⁴个细胞/mL的供试细胞(TZM-bl、MT-4、MDCK、Huh-7、Hep-2、HEK293T、293T/ACE2)悬液加入到步骤(1)的96孔细胞培养板中，100μL/孔，于37℃、5％ CO₂条件下培养48小时；(3)每孔加入20μLCCK-8溶液，继续将培养板在培养箱孵育2小时，然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD450)。采用GraphPad Prism软件制作抑制率曲线和计算药物半数细胞毒性浓度(CC₅₀)。

2、实验结果与分析

结果如图10所示。结果显示，LP-127对七种供试细胞的平均CC₅₀为15.68μM，其中在TZM-bl细胞的CC₅₀为10.21μM，在MT-4细胞的CC₅₀为15.45μM，在MDCK细胞的CC₅₀为12.89μM，在Huh-7细胞的CC₅₀为31.28μM，在Hep-2细胞的CC₅₀为16.46μM，在HEK293T细胞的CC₅₀为9.07μM，在293T/ACE2细胞的CC₅₀为14.42μM。LP-128在七种供试细胞的平均CC₅₀为19.91μM，其中在TZM-bl细胞的CC₅₀为7.49μM，在MT-4细胞的CC₅₀为28.22μM，在MDCK细胞的CC₅₀为18.05μM，在Huh-7细胞的CC₅₀为40.28μM，在Hep-2细胞的CC₅₀为12.48μM，在HEK293T细胞的CC₅₀为8.72μM，在293T/ACE2细胞的CC₅₀为24.1μM。

通过CC₅₀/IC₅₀分析，可知LP-127和LP-128均具有极高的治疗选择指数(SI)。

实施例10LP-127和LP-128脂肽的稳定性研究

为进一步考证本公开的膜融合抑制剂的成药性，本实施例将LP-127和LP-128于室温或37℃长期放置、与人血清的孵育及使用蛋白酶消化处理，然后通过检测脂肽的抗病毒活性变化情况来判断它们的稳定性。

1、实验方法

温度稳定性实验：将浓度为300μM的LP-127或LP-128水溶液置于室温或37℃不同时间，然后检测其抑制NL4-3假病毒感染TZM-bl细胞的活性，方法同实施例2。

人血清稳定性实验：将含有20％人血清和终浓度为150μM的LP-127或LP-128混合，于37℃分别孵育0、5、30、60、120、180或240分钟，然后检测其抑制NL4-3假病毒感染TZM-bl细胞的活性，方法同实施例2。

蛋白酶的消化：将LP-127或LP-128与蛋白酶K、胰蛋白酶或α-胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich产品，货号分别为P2308、T4799和C4129)按20:1比例混合(终浓度分别为2mg/mL和0.1mg/mL)，于37℃分别孵育0、30、60、120、180或240分钟后，检测其抑制NL4-3假病毒感染TZM-bl细胞的活性，方法同实施例2。

2、实验结果与分析

结果如图11所示。与未处理的脂肽(孵育时间为0时)相比，经过不同时间的温度、人血清及三种蛋白酶处理，LP-127和LP-128的抗病毒活性没有明显的变化，说明它们非常稳定。

实施例11本公开的膜融合抑制剂的螺旋结构特征及结合稳定性分析

为分析本公开的膜融合抑制剂的结构特征及探讨其作用机制，采用圆二色谱(CD)技术测定了LP-121、LP-122、LP-123、LP-124、LP-125、LP-126、LP-127和LP-128自身及其与靶序列多肽N44形成的复合物的二级结构(α-螺旋含量)以及热稳定性。

一、实验方法

CD测定方法以及来源于gp41 NHR序列作为抑制剂模拟靶标的多肽N44(Ac-TVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH₂)的合成制备可参见发明人发表的文献^[16]。

将待测脂肽及N44和脂肽的混合物分别溶于pH 7.2的磷酸缓冲液(PBS)中，其中脂肽、N44多肽终浓度均为10μM的溶液，将每种溶液于37℃水浴锅中放置30分钟，随后移至相应比色皿中，使用Jasco分光偏振仪(型号J-815)扫描195-270nm波长范围内溶液摩尔椭圆率[θ]λ的变化情况，典型α-螺旋结构可在208nm和222nm处出现最大负峰，减去PBS空白对照来校正谱值，计算过程中以峰值为-33000degree.cm².dmol^-1作为α-螺旋含量100％的标准，根据溶液在222nm处的摩尔椭圆率计算多肽α-螺旋含量的百分比。随后将该溶液加入相应检测热稳定性的比色皿中，调整CD温控模块以每分钟2℃的速度扫描20-98℃时多肽溶液[θ]222随温度变化情况。绘制熔解曲线并对其进行平滑处理，利用Origin软件计算热解离转变的中点温度值(Tm)以反映螺旋热稳定程度。

二、实验结果与分析

结果见图12。

如图12中A所示，单独的LP-121、LP-122、LP-123、LP-124、LP-125、LP-126、LP-127或LP-128的α-螺旋含量分别为69％、65％、56％、64％、78％、51％、57％或66％，说明每个脂肽抑制剂本身即具有很高的螺旋性，其中LP-125最高，但熔解曲线不能准确计算出其Tm值。

如图12中B所示，LP-121、LP-122、LP-123、LP-124、LP-125、LP-126、LP-127或LP-128与N44的混合物的α-螺旋含量分别为81％、81％、79％、79％、89％、66％、68％或84％，其Tm值分别对应于>98℃、>98℃、>98℃、86℃、91℃、92℃、92℃或90℃，说明脂肽抑制剂能与N44相互作用形成更加稳定的α-螺旋结构，尤其是三个PBD含有氨基酸W的脂肽(LP-121、LP-122、LP-123)。结果也提示由W到Y的替换可能降低PBD的结合能力，但含有Y的脂肽仍具有相对极高的结合稳定性(Tm>86℃)。

以上对本公开进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本公开的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本公开。虽然本公开给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本公开作进一步的改进。总之，按本公开的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本公开的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

参考文献：

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Claims (20)

1.脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，其包含多肽或其变体和通过接头连接至所述多肽或其变体C端的修饰部分，以及任选的多肽末端保护基团，

(X₁X₂X₃)mX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄X₂₅N(EX₂₆)n

式I

其中，所述多肽如式I所示，所述修饰部分为亲脂性化合物，所述接头为-(EAAAK)n₁-、-(XP)n₂-、-(EAAAK)n₁-X₂₇-或-(XP)n₂-X₂₇-，

X₁为T、E、S；

X₂为W或亲水性氨基酸；

X₃为E、M或Q；

m为0或1；

X₄为E、A或T；

X₅为W或亲水性氨基酸；

X₆为E或D；

X₇为R、K或Q；

X₈为E、K或A；

X₉为L或I；

X₁₀为E、N或A；

X₁₁为E或N；

X₁₂为L或Y；

X₁₃为E、T或A；

X₁₄为K、S、R或A；

X₁₅为K、L、R或Q；

X₁₆为E、H、T或Y；

X₁₇为E、S、R或A；

X₁₈为L或I；

X₁₉为K、E或R；

X₂₀为K、E、Q或A；

X₂₁为A或S；

X₂₂为E或Q；

X₂₃为E、N或I；

X₂₄为K、E或D；

X₂₅为K或R；

X₂₆为Q、E、R、A或Y；

n为0或1；

X为任意一种氨基酸；

X₂₇为K或C；

n₁为1至5之间的自然数；

n₂为1至5之间的自然数，

并且，所述变体与其所源自的多肽相异仅在于1个或几个(例如，1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸残基的置换(例如，保守置换或非保守置换)，且保留了其所源自的多肽的生物学功能。

2.权利要求1的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，其特征在于一下特征中的一项或多项：

-X₁为T或E；

-X₂为W、D、E、H、K、Q、R、S、T或Y；

-X₃为E或M；

-X₄为E；

-X₅为W、D、E、H、K、Q、R、S、T或Y；

-X₆为E；

-X₇为R或K；

-X₈为E或K；

-X₁₀为E或N；

-X₁₁为E；

-X₁₂为L；

-X₁₃为E或T；

-X₁₄为K或S；

-X₁₅为K或L；

-X₁₆为E或H；

-X₁₇为E或S；

-X₁₈为L；

-X₁₉为K或E；

-X₂₀为K或E；

-X₂₁为A；

-X₂₂为E；

-X₂₃为E或N；

-X₂₄为K或E；

-X₂₅为K；

-X₂₆为Q；

-X为A、K或E。

3.权利要求1的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，其特征在于一下特征中的一项或多项：

-X₂为W或Y，优选为Y；

-X₃为E；

-X₅为W或Y，优选为Y；

-X₇为K；

-X₁₀为E；

-X₁₃为E；

-X₁₄为K；

-X₁₅为K；

-X₁₆为E；

-X₁₇为E；

-X₁₉为K；

-X₂₀为K；

-X₂₃为E；

-X₂₄为K。

4.权利要求1至3中任意一项的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，其中所述多肽如式II、式III、式IV或式V所示，

(X₁X₂X₃)mX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄KN(EX₂₆)n

式II

(X₁X₂X₃)m-EX₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄KN(EX₂₆)n

式III

(X₁X₂X₃)m-EX₅X₆X₇X₈X₉EELEKKIEELLKKAEEQQKKN(EX₂₆)n

式IV

(X₁X₂X₃)m-EX₅EKX₈X₉EELEKKIEELLKKAEEQQKKN(EX₂₆)n

式V

其中X₁、X₂、X₃、m、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₆、n的定义如权利要求1至3中任意一项所述。

5.权利要求1至3中任意一项的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，其中所述亲脂性化合物为胆固醇(例如胆固醇琥珀酸单酯、2-胆固醇乙酸、2-胆固醇丙酸、3-胆固醇丙酸、2-胆固醇丁酸、2-胆固醇异丁酸、3-胆固醇丁酸、3-胆固醇异丁酸、4-胆固醇丁酸、2-胆固醇戊酸、2-胆固醇异戊酸、3-胆固醇戊酸、5-胆固醇戊酸、2-胆固醇己酸、6-胆固醇己酸、2-胆固醇庚酸、7-胆固醇庚酸、2-胆固醇辛酸、8-胆固醇辛酸、溴乙酸胆固醇酯)、脂肪酸(例如含8到20个碳原子的脂肪酸)、二氢(神经)鞘氨醇或维生素E。

6.权利要求5的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，其中所述含8到20个碳原子的脂肪酸为棕榈酸或十八烷酸。

7.权利要求1至3中任意一项的脂肽或其药学上可接受的盐，其中所述脂肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:11-19。

8.多肽或其变体，其包含式I所示的序列，或由式I所示的序列组成：

(X₁X₂X₃)mX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄X₂₅N(EX₂₆)n

式I

其中，

X₁为T、E、S；

X₂为W或亲水性氨基酸；

X₃为E、M或Q；

m为0或1；

X₄为E、A或T；

X₅为W或亲水性氨基酸；

X₆为E或D；

X₇为R、K或Q；

X₈为E、K或A；

X₉为L或I；

X₁₀为E、N或A；

X₁₁为E或N；

X₁₂为L或Y；

X₁₃为E、T或A；

X₁₄为K、S、R或A；

X₁₅为K、L、R或Q；

X₁₆为E、H、T或Y；

X₁₇为E、S、R或A；

X₁₈为L或I；

X₁₉为K、E或R；

X₂₀为K、E、Q或A；

X₂₁为A或S；

X₂₂为E或Q；

X₂₃为E、N或I；

X₂₄为K、E或D；

X₂₅为K或R；

X₂₆为Q、E、R、A或Y；

n为0或1；

并且，所述变体与其所源自的多肽相异仅在于1个或几个(例如，1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸残基的置换(例如，保守置换或非保守置换)，且保留了其所源自的多肽的生物学功能。

9.权利要求8的多肽或其变体，其特征在于一下特征中的一项或多项：

-X₁为T或E；

-X₂为W、D、E、H、K、Q、R、S、T或Y；

-X₃为E或M；

-X₄为E；

-X₅为W、D、E、H、K、Q、R、S、T或Y；

-X₆为E；

-X₇为R或K；

-X₈为E或K；

-X₁₀为E或N；

-X₁₁为E；

-X₁₂为L；

-X₁₃为E或T；

-X₁₄为K或S；

-X₁₅为K或L；

-X₁₆为E或H；

-X₁₇为E或S；

-X₁₈为L；

-X₁₉为K或E；

-X₂₀为K或E；

-X₂₁为A；

-X₂₂为E；

-X₂₃为E或N；

-X₂₄为K或E；

-X₂₅为K；

-X₂₆为Q。

10.权利要求8的多肽或其变体，其特征在于一下特征中的一项或多项：

-X₂为W或Y，优选为Y；

-X₃为E；

-X₅为W或Y，优选为Y；

-X₇为K

-X₈为E或K；

-X₁₀为E

-X₁₃为E

-X₁₄为K

-X₁₅为K

-X₁₆为E

-X₁₇为E

-X₁₉为K

-X₂₀为K

-X₂₃为E

-X₂₄为K。

11.权利要求8至10中任意一项的多肽或其变体，其中所述多肽如式II、式III、式IV或式V所示，

(X₁X₂X₃)mX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄KN(EX₂₆)n

式II

(X₁X₂X₃)m-EX₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅IX₁₆X₁₇LX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃QQX₂₄KN(EX₂₆)n

式III

(X₁X₂X₃)m-EX₅X₆X₇X₈X₉EELEKKIEELLKKAEEQQKKN(EX₂₆)n

式IV

(X₁X₂X₃)m-EX₅EKX₈X₉EELEKKIEELLKKAEEQQKKN(EX₂₆)n

式V

其中X₁、X₂、X₃、m、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₆、n的定义如权利要求8至10中任意一项所述。

12.权利要求8至10中任意一项的多肽或其变体，其中所述脂肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:21-29。

13.缀合物，其包含权利要求8至12中任意一项的多肽或其变体和修饰部分；

例如，所述修饰部分任选地通过接头连接至所述多肽或其变体的N端或C端；

例如，所述修饰部分为末端保护基团。

14.分离的核酸，其编码权利要求8至12中任意一项的多肽或其变体。

15.包含权利要求14的分离的核酸的载体。

16.包含权利要求14的分离的核酸和/或权利要求15所述的载体的宿主细胞。

17.由权利要求1至7中任意一项的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药或权利要求8至10中任意一项的多肽或其变体形成的多聚体。

18.组合物，其包含权利要求1至7中任意一项的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药，或8至12中任意一项的多肽或其变体，或权利要求13的缀合物，或权利要求14的分离的核酸，或权利要求15的载体，或权利要求16的宿主细胞，或权利要求17的多聚体。

19.药物组合物，其包含权利要求1至7中任意一项的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药或权利要求8至10中任意一项的多肽或其变体，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂，

优选地，所述脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药或所述多肽或其变体以治疗病毒感染或由病毒感染所导致的疾病的有效量存在；

优选地，所述病毒感染为由选自由HIV及其耐药株、SARS-CoV-2及其突变株、MERS-CoV、EBOV、MARV、IAV、RABV和VSV组成的组中的病毒引起的感染；

优选地，所述病毒感染为HIV及其耐药株引起的感染。

20.权利要求1至7中任意一项的脂肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、络合物、螯合物、非共价的复合物或前药或权利要求8至10中任意一项的多肽或其变体在制备药物组合物的用途，所述药物组合物作为病毒膜融合抑制剂或用于治疗病毒感染或由病毒感染所导致的疾病；

优选地，所述病毒感染为由选自由HIV及其耐药株、SARS-CoV-2及其突变株、MERS-CoV、EBOV、MARV、IAV、RABV和VSV组成的组中的病毒引起的感染；

优选地，所述病毒感染为HIV及其耐药株引起的感染。