CN117186187B

CN117186187B - 一种抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂及其药物用途

Info

Publication number: CN117186187B
Application number: CN202310850485.2A
Authority: CN
Inventors: 何玉先; 朱园美
Original assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2023-07-12
Filing date: 2023-07-12
Publication date: 2024-05-31
Anticipated expiration: 2043-07-12
Also published as: CN117186187A

Abstract

本发明属于生物医药领域，本发明具体提供一种抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂及其药物用途。本发明所述的抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂化合物性质稳定，用于制备预防和治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物组合物，所述药物组合物用于预防和治疗呼吸道合胞病毒所致疾病。

Description

一种抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂及其药物用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及高效抑制呼吸道合胞病毒的膜融合抑制剂、其衍生物及其药物用途。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是引起人类呼吸道感染的重要病原体。RSV是婴幼儿和儿童中急性上呼吸道感染和下呼吸道感染的主要原因，几乎所有的儿童在两岁以下都至少感染过一次RSV。在成人和老年人群中，RSV主要引起鼻炎、咽喉炎等上呼吸道感染。RSV传染性强，易引起重症，可能反复感染，是导致全球婴幼儿、老年人及免疫缺陷人群高住院率和死亡率的主要因素。2019年，全球5岁以下儿童中因感染RSV引起的住院病例超过360万，死亡病例超过10万，1～6月龄婴儿中有36％的死亡与RSV感染相关。根据有关预测，2032年全球5岁以下儿童RSV严重感染发病人数将达到3707万人，2022年至2032年全球5岁以下儿童RSV严重感染发病人数复合年增长率预计为1.1％，死亡率约占3％左右，是导致儿童死亡的重要原因。RSV同样也给免疫缺陷人群和老年人群带来了极大的疾病负担。因此，与RSV相关的呼吸道感染成为了全世界主要的公共卫生问题之一，为全球各国的卫生保健系统带来了极大的负担。有效的预防和治疗是控制RSV感染的关键，但尽管从20世纪60年代人们就开始开发RSV疫苗和治疗药物，但遗憾的是，到目前为止，仅有一款RSV疫苗于2023年5月3日经FDA批准上市，而针对RSV感染的抗病毒治疗药物更是非常的有限。其中利巴韦林(Ribavirin)和帕利珠单抗(Palivizumab)两种药物分别因副作用大和价格昂贵等固有缺陷而极大的限制了其临床应用，临床上迫切需要对于RSV感染安全且有效的治疗方案，因此，开发有效的抗RSV感染的药物尤为重要。

RSV是一种有包膜的单股负链RNA病毒，其基因组全长约15.2kb，含10个基因，可编码11种蛋白质。其中嵌入病毒包膜的黏附蛋白G和融合蛋白F在病毒进入过程中起着重要的作用。RSV感染宿主细胞时，首先在G蛋白的吸附作用下吸附于宿主细胞表面，随后在F蛋白介导的融合作用下，与宿主细胞融合，使RSV基因组进入细胞造成感染。病毒膜融合抑制剂通过阻断病毒进入靶细胞在病毒复制的早期阶段发挥作用，在治疗和预防上具有明显的优势。早在1996年，美国公司Trimeris根据RSV的HR2序列设计了一组抗RSV多肽膜融合抑制剂，在细胞模型具有较强的抗RSV活性，其中最为突出的是含有35个氨基酸残基的T118和T108，后来的研究相继开发了一些多肽类RSV融合抑制剂，但抗RSV活性很难得到明显的提高，尤其是相对较短的多肽，往往具有显著降低的活性。目前，还没有RSV融合抑制剂获批上市。也就是说，本领域存在研发高效RSV病毒抑制剂的需求。

发明内容

本发明提供了一种新的抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂及其药物用途。

为实现上述目的，本发明首先提供了一种抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂，该膜融合抑制剂为式I所示的化合物，所述式I为：

X1-Ser-X2-X3-Gln-Val-Asn-X4-Lys-Ile-X5-Gln-Ser-Leu-X6-Phe-Ile-X7-Lys-Ser-Asp-X8-Leu-Leu-X9-Asn-X10-Lys(R)-X11；在所述式I中，所述X1为氨基端保护基团；所述X2为Ile，或为Leu；所述X3为Ser，或为Glu；所述X4为Glu，或为Lys；所述X5为Asn，或Glu；所述X6为Ala，或为Lys；所述X7为Arg，或为Glu；所述X8为Glu，或为Lys；所述X9为His，或为Glu；所述X10为柔性接头(GSGSG)n，或为刚性接头(EAAAK)n，或为不存在；其中，n为5以下的自然数，表示GSGSG或EAAAK序列的重复次数；所述R为修饰于Lys上的亲脂性化学基团；所述X11为羧基端保护基团。

示例性的，X1为乙酰基(Ac)、氨基(NH₂)、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基或苄氧或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。

示例性的，X11为氨基(NH₂)、羧基、羟基、酰胺基或叔丁氧羰基或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。

示例性的，所述亲脂性化合物为胆固醇琥珀酸单酯、2-胆固醇乙酸、2-胆固醇丙酸、3-胆固醇丙酸、2-胆固醇丁酸、2-胆固醇异丁酸、3-胆固醇丁酸、3-胆固醇异丁酸、4-胆固醇丁酸、2-胆固醇戊酸、2-胆固醇异戊酸、3-胆固醇戊酸、5-胆固醇戊酸、2-胆固醇己酸、6-胆固醇己酸、2-胆固醇庚酸、7-胆固醇庚酸、2-胆固醇辛酸、8-胆固醇辛酸、溴乙酸胆固醇酯、含8到20个碳原子的脂肪酸、二氢(神经)鞘氨醇、维生素E等脂类化合物。其中，含8到20个碳原子的脂肪酸包括十八烷酸。

本发明还提供了包括根据本发明化合物的药物组合物，以及提供了本发明化合物的药物组合物用于制备治疗疾病的药物用途。

作为优选，所述药物组合物应用于治疗和预防呼吸道合胞病毒所致疾病。

本发明所涉及到的更多内容在以下有详细描述，或者有些也可以在本发明的实施例中体现。

除非另有所指，本文中所用来表示不同成分的数量、反应条件，在任意情况下都可解读为“大致的”、“大约的”意思。相应的，除有明确的特指外，在下述以及权利要求中所引用的数字参数都是大致的参数，在各自的实验条件下由于标准误差的不同，有可能会得到不同的数字参数。

本文中，当一个化合物的化学结构式和化学名称有分歧或疑义时，以化学结构式确切定义此化合物。本文所描述的化合物有可能含有一个或多个手性中心，和/或者双键以及诸如此类的结构，也可能存在立体异构体，包括双键的异构体(比如几何异构体)、旋光对映异构体或者非对映异构体。相应的，在本文描述范围内的任意化学结构，无论是部分或整体结构中含有上述类似结构，都包括了此化合物的所有可能的对映异构体和非对映异构体，其中也包括了单纯的任一种立体异构体(如单纯的几何异构体、单纯的对映异构体或者单纯的非对映异构体)以及这些异构体的任意一种混合物。这些消旋异构体和立体异构体的混合物由本领域技术人员利用不同的分离技术或手性分子合成的方法也可进一步被拆分成其组成成分的对映异构体或立体异构体。

结构式I的化合物包含了，但并不仅限于，这些化合物的光学异构体、消旋体和/或其他的混合物。上述情况下，其中单一的对映异构体或非对映异构体，如有旋光的异构体，可以用不对称合成的方法或消旋体拆分的方法获得。消旋体的拆分可用不同的方法实现，如常规的用助拆分的试剂重结晶，或用色谱方法。另外，结构式I的化合物也包含了带双键的顺式和/或反式的异构体。

本发明所述化合物包含但不限于，结构式I所示化合物以及他们所有的在药学上可用的不同形式。这些化合物的药学上可用的不同形式包括各种可药用的盐、溶剂化物、络合物、螯合物、非共价的复合物、基于上述物质基础上的药物前体和上述这些形式的任意混合物。

上述所述药物前体包括含在所述化合物内，如结构式I所示化合物的酯或者酰胺衍生物。

本发明还提供一种药物组合物，包括如上述的抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

在实际应用中，可以将本发明的药物直接给予病人、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人，以达到治疗和/或预防呼吸道合胞病毒感染的目的。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射、雾化吸入、鼻喷或滴鼻给药。

本发明的药物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体活性成分，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

本发明也提供如上述的药物组合物在预防和治疗呼吸道合胞病毒中的应用。

本发明的药物可以直接单独用于呼吸道合胞病毒感染者的治疗和预防，也可以与一种或多种其他抗病毒药物联合使用，以达到提高整体治疗效果的目的。这些抗病毒药物包括但不限于核苷类药物、中和抗体、进入抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂等。上述的核苷类药物可以是利巴韦林(ribavirin)；所述的中和抗体可以是帕利珠单抗(palivizumab)、尼塞韦单抗(nirsevimab/MED18897)、MK-1654等的一种或几种；所述进入抑制剂可以是JNJ-53718678、齐瑞索韦(ziresovir/AK-0529)、普沙托韦(presatovir/GS-5806)、Sisunatovir(RV521)等的一种或几种；所述蛋白酶抑制剂可以是ALN-RSV01、EDP-938等的一种或几种；所述聚合酶抑制剂可以为卢米西他滨(lumicitabline/ALS-008176)、PC786等的一种或几种。

对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体活性成分的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体活性成分的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体活性成分组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明提供的结构I所示的化合物性质稳定，是一种高效的，新型的抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂，用于制备预防和治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物组合物，所述药物组合物用于预防和治疗呼吸道合胞病毒所致疾病。

附图说明

图1是RSV膜融合抑制剂的序列结构及其对RSV-luc感染的抑制活性；

图2是本发明所述RSV膜融合抑制剂的体外细胞毒性和治疗指数分析；

图3是本发明所述RSV膜融合抑制剂的稳定性；

图4是本发明所述RSV膜融合抑制剂脂肽及其与靶序列复合物的α-螺旋含量和热稳定性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进相关参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明范围内。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、多肽的合成

本实施例合成了图1所示的脂肽或多肽。脂肽的胆固醇修饰均通过胆固醇琥珀酸单酯与肽链C末端的赖氨酸(K)侧链的氨基进行酰胺化反应实现，为本领域发明人实验室常规方法。

1、制备过程中所需的化学试剂

所有脂肽的氨基末端均连接乙酰基(Ac)作为氨基端保护基，羧基末端均连接氨基(NH₂)作为羧基端保护基。所有的化学试剂如各种Fmoc氨基酸、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、哌啶(PIPE)、茚三酮、乙酸酐(Ac₂O)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、水合肼、胆固醇琥珀酸单酯、三氟乙酸(TFA)、乙二硫醇(EDT)、苯甲硫醚(TA)、三异丙基硅烷(TIPS)、苯酚等均从主要化学试剂供应商购买，使用前未经过进一步的提纯。多肽合成过程中使用的保护氨基酸原料包括Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH。其中的缩写具有公知的定义，例如：Fmoc为9-芴甲氧羰基，tBu为叔丁基，Dde为1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基，Boc为叔丁氧羰酰基，OtBu为叔丁氧基，Trt为三苯甲基，Pbf为(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基。

2、肽树脂的合成

使用RinkAmide MBHA树脂为载体树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与多肽氨基酸序列相应的保护氨基酸偶联，制得肽树脂。

(1)接入主链第1个保护氨基酸

取0.3mmol第1个保护氨基酸Fmoc-Lys(Dde)-OH和0.3mmol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3mmol DIC，振荡下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中振荡反应5分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

取0.1mmol的RinkAmide MBHA树脂(0.35mmol/g×0.3g)，采用25％PIPE/DMF溶液(体积比)去保护20分钟(两次)，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应60分钟，过滤洗涤，得含第1个保护氨基酸Fmoc-Lys(Dde)的树脂。

(2)接入主链其他保护氨基酸

采用上述接入主链第1个保护氨基酸同样的方法，依次接入多肽对应的其他保护氨基酸，得含主链氨基酸的树脂。最后用0.3mmolAc₂O+0.6mmol DIEA对N端进行乙酰化封端，完成主链的合成。以上每步反应后都通过Kaiser Test检测对反应进行控制，若某个氨基酸缩合反应不完全，则重复缩合一次，直至得到所需的目标肽段。

(3)赖氨酸侧链的胆固醇接入

用尽量小体积的2％水合肼/DMF溶液(体积比)处理树脂去除C端赖氨酸侧链的Dde保护基(10分钟，两次)，过滤洗涤，得到去Dde的树脂备用。取0.3mmol胆固醇琥珀酸单酯和0.3mmol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3mmol DIC，慢慢加入至含胆固醇琥珀酸单酯和HOBt的溶液中，于室温环境中振荡反应5分钟。将制备的含胆固醇琥珀酸单酯、HOBt和DIC溶液加入到获得的去Dde的树脂中，偶联反应60分钟，过滤、洗涤和干燥，得到肽树脂。

3、粗品的制备

取上述肽树脂，加入裂解试剂(裂解试剂15mL/克树脂)，混合均匀后于30℃下振荡反应3小时，将目标多肽从树脂上裂解下来并除去侧链保护基。收集反应混合物滤液，树脂再用少量TFA/DCM洗涤3次，合并滤液后加入无水乙醚沉淀，离心。滤饼再用冷的无水乙醚洗涤沉淀2次，抽干得类白色粉末即为脂肽粗品。裂解试剂的组成如下：三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：苯甲硫醚：苯酚：H₂O：三异丙基硅烷＝68.5:10:10:5:3.5:1(体积比)。

4、纯品的制备

取上述脂肽粗品，加水/乙腈搅拌溶解，离心除去不溶物后备用。采用反相高效液相色谱法进行纯化。所用色谱柱型号为Agela C18(10μm，50mm×250mm)，流动相由流动相A(0.05％TFA和2％乙腈的水溶液)和流动相B(90％乙腈/水溶液)组成。流动相流速为每分钟25mL。紫外检测波长为220纳米。取粗品溶液上样于色谱柱中，进行梯度洗脱，收集对应纯化组分，直接冷冻干燥除去溶剂，即得到蓬松状态的三氟乙酸盐多肽纯品。

将三氟乙酸盐多肽纯品用水和乙腈重新溶解，加入大量的阴离子交换树脂(醋酸根形式)后搅拌3个小时。过滤并用水/乙腈混合溶剂冲洗离子交换树脂后，合并滤液冻干，得到蓬松状态的多肽醋酸盐纯品。

所合成脂肽的化学结构由MALDI-TOF质谱进行表征，其纯度则由分析型高效液相色谱仪(Agela C18-4.6×250mm，流速每分钟1mL)给出。结果表明，所合成脂肽的纯度均大于95％。

实施例2、RSV膜融合抑制剂的设计及活性验证

通过对RSV F蛋白的序列结构分析，确定了位于F蛋白F1亚基在病毒膜融合中起重要作用的功能区HR1和HR2的位置，本发明以来源于HR2原始序列的多肽T108为模板，在其C端延长一个氨基酸“L”，并通过对其C端进行胆固醇分子修饰，得到脂肽R01，首先对其抗病毒活性进行了测试。

1、实验材料与方法

供试多肽为R01，T108和T118为对照多肽。所用病毒为荧光素酶报告基因标记的重组RSV病毒(RSV-luc)，由北京交通大学何金生教授实验室馈赠；靶细胞Hep-2为为国家实验细胞资源共享服务平台产品。抗病毒实验的基本步骤如下：

(1)用去离子水或二甲基亚枫(DMSO)溶解供试多肽，然后用DMEM培养基将多肽稀释到起始浓度，然后在96孔细胞培养板中将多肽进行3倍倍比稀释，得到多肽稀释液。每种供试多肽设置9个稀释度。

(2)在96孔细胞培养板中，药物孔加入多肽稀释液(50μL/孔)，对照孔加入DMEM培养基(50μL/孔)，均设置3个复孔。然后加入1000TCID50的RSV-luc病毒液(调整为50μL/孔)，于室温孵育30分钟。

(3)将预先培养的靶细胞Hep-2用DMEM培养基重悬，调整细胞浓度至10×10⁴个细胞/mL，然后加入DEAE-dextran，使得DEAE-dextran终浓度为15μg/mL。最后将细胞(100μL/孔)加到含有病毒&多肽复合物的96孔板中，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养48小时。

(4)弃除细胞培养上清，每孔加入30μL细胞裂解液(Promega公司，货号E1531)，室温裂解15分钟，然后加入荧光素酶检测底物试剂(Promega公司，货号E1501)，用微孔板光度计测定相对荧光单位(RLU)，制作抑制率曲线并计算药物半数抑制浓度(IC₅₀)。

2、实验结果与分析结果如图1所示，对照多肽T108和T118抑制RSV-luc病毒感染Hep-2的活性较低，IC₅₀值分别为655.9nM和613.86nM。然而，胆固醇修饰的多肽R01抗病毒活性则明显提高，其IC₅₀值为136.2nM，比T108和T118的抗病毒活性提高约5倍。

实施例3、新型脂肽膜融合抑制剂的鉴定

为进一步明确基于脂肽的抗RSV膜融合抑制剂的结构与功能的关系以获得成药性更高的多肽化合物，本发明进一步对R01的N端序列进行逐步截短得到脂肽R02、R03和R04；并在其多肽序列和胆固醇修饰基团之间分别引入柔性接头“GSGSG”和刚性接头“EAAAK”得到R05和R06；进一步地，本发明以R04、R05和R06为模板，引入了容易促进盐桥结构形成的“E”、“K”突变，得到R07、R08和R09。最后，本发明通过对R09 C端序列的延长进一步合成了脂肽R10、R11、R12和R13。利用上述实施例2中的抗病毒实验对新合成多肽的抗病毒活性进行分析。

实验结果见图1。在N端截短的脂肽R02对RSV仍然保持较强的抑制活性，进一步截短的脂肽R03的抗病毒活性则表现出进一步的提高。R04在对N端序列进一步截短的同时，在其C端延伸了两个氨基酸，其IC50值为28.56nM，比R01的活性提高约5倍。说明可以通过减少N端氨基酸残基对多肽进行序列优化。

R05和R06是在R04的基础上在其序列结构和胆固醇修饰基团之间加入柔性接头“GSGSG”和刚性接头“EAAAK”，其IC50值分别为24.95nM和20.55nM，接头的引入对脂肽的抗病毒活性未产生明显影响。

进一步地，R07、R08和R09多肽在其核心螺旋部位引入了可以促进“盐桥”结构形成的“E”、“K”突变，以期改善抑制剂的螺旋稳定性和水溶性。结果显示，R07、R08和R09的抗病毒活性分别为11.57nM、9.11nM和14.79nM，较其模板R04、R05和R06的活性表现出一定的提高。同时，这三个脂肽的水溶性得到显著的改善。

鉴于T118多肽序列在C端的延长，在此，本发明合成的脂肽R10、R11、R12和R13在R09的C端逐步延长，发现C短延长多肽的抗病毒活性未得到改善，反而表现出活性下降的趋势。

总之，本发明通过多轮设计和筛选的不懈努力，最终确认多个潜在成药价值的高效抑制RSV的新型脂肽化合物。

实施例4、本发明所述六个新型脂肽抑制剂的体外细胞毒性和治疗指数分析

1、实验材料与方法

供试多肽为实施例1中所合成的脂肽R04-R09。供试细胞Hep-2为国家实验细胞资源共享服务平台产品。供试脂肽的体外细胞毒性检测采用CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒(厂家：Abbkine，货号：KTC011001)进行具体实验步骤如下：

(1)在96孔细胞培养板中将供试脂肽进行3倍梯度稀释，设置9个稀释度，每个稀释度3个复孔，最终每个孔中含有100μL脂肽溶液；设置DMEM培养基(每孔100μL)对照孔。

(2)将约10×10⁴个细胞/mL的供试细胞Hep-2悬液加入到步骤(1)的96孔细胞培养板中，100μL/孔，于37℃、5％CO₂条件下培养48小时。

(3)每孔加入20μL CCK-8溶液，继续将培养板在培养箱孵育2小时，然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD450)。采用GraphPad Prism软件制作抑制率曲线和计算药物半数细胞毒性浓度(CC₅₀)。

2、实验结果与分析

结果见图2。衍生于RSV病毒原始序列的三个脂肽R04、R05和R06对Hep-2细胞的CC₅₀值分别是3254.83nM、2585.50nM和890.49nM。以CC₅₀/IC₅₀分析可知，三个脂肽的选择治疗指数(TI)分别为114、104和43。而脂肽R07、R08和R09对Hep-2细胞的CC₅₀值分别是5483.67nM、2794.84nM和4083.17nM。以CC₅₀/IC₅₀分析三个脂肽的选择治疗指数(TI)分别为474、307和276。R07、R08和R09和其模板肽相比，体外细胞毒性均有所降低，特别是R09的细胞毒性比其模板肽R06降低了约5倍，相应地其治疗指数也比其模板肽提高了约6倍。结果表明，R07、R08和R09脂肽抑制剂均具有较高的治疗指数和成药性。

实施例5、本发明所述六个新型脂肽抑制剂的稳定性研究

1、实验材料与方法

本实施例中，发明人从多个角度比较分析了六个脂肽R04-R09的稳定性，包括室温或37℃长期放置、与人血清的孵育及使用蛋白酶消化处理，然后通过检测脂肽的抗病毒活性变化情况来判断它们的稳定性。供试多肽为实施例1中所合成的脂肽R04-R09。靶细胞Hep-2为国家实验细胞资源共享服务平台产品。所用病毒为荧光素酶报告基因标记的重组RSV病毒(RSV-luc)。

具体实验方法如下：

温度稳定性实验：将浓度为400μM的脂肽的水溶液置于室温或37℃不同时间，然后检测其抑制RSV-luc病毒感染Hep-2细胞的活性，方法同实施例2。

人血清稳定性实验：将含有20％人血清和终浓度为300μM的脂肽混合，于37℃分别孵育0、5、30、60、120、180或240分钟，然后检测其抑制RSV-luc病毒感染Hep-2细胞的活性，方法同实施例2。

蛋白酶的消化：将脂肽与蛋白酶K、胰蛋白酶或α-胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich产品，货号分别为P2308、T4799和C4129)按20:1比例混合(终浓度分别为2mg/mL和0.1mg/mL)，于37℃分别孵育0、30、60、120、180或240分钟后，然后检测其抑制RSV-luc病毒感染Hep-2细胞的活性，方法同实施例2。

2、实验结果与分析

结果如图3所示。R04和R05对蛋白酶K、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的处理比较敏感，特别是在蛋白酶K或胰蛋白酶处理5min后，R04和R05的抗病毒活性就显著下降。而R06、R07、R08和R09对单一酶的处理并不敏感，其抗病毒活性均未表现出明显的下降。

20％人血清处理后，R04、R05、R06和R07的抗病毒活性随着处理时间的延长发生缓慢的下降，当人血清处理240min时，与未处理的脂肽(即孵育时间为0时刻的处理组)相比，R04、R05、R06和R07的IC₅₀值分别升高了4倍、3倍、7倍和4倍。而R08和R09对人血清表现出明显的抗性，在人血清处理后其抗病毒活性没有明显变化。

R04、R05和R06对高温表现出一定的敏感性，R04、R05和R06在室温和37℃分别放置3、7、14、21、28天后抗病毒活性随着时间延长逐渐下降，尤其在37℃放置28天后，R04、R05和R06的抗病毒活性分别下降了54倍、48倍和23倍。相较而言，R07、R08和R09的抗病毒活性在同样放置条件下则变化小得多，尤其是R08和R09在37℃高温放置28天后，其抗病毒活性基本不受影响，更长期的脂肽的温度稳定性有待进一步研究。

整体来说，相比模板肽R04、R05和R06，三个新脂肽R07、R08和R09抑制剂的稳定性都表现出显著的提高。尤其是R08和R09经过不同时间的温度、人血清及三种蛋白酶处理后，其抗病毒活性都没有明显的变化，说明R08和R09非常稳定，具有明显的成药优势。

实施例6、本发明所述六个新型脂肽抑制剂的螺旋结构特征及结合稳定性分析

为分析本发明的RSV膜融合抑制剂的结构特征及探讨其作用机制，采用圆二色谱(CD)技术测定了R04、R05、R06、R07、R08和R09自身及其与靶序列多肽RN48形成的复合物的二级结构(α-螺旋含量)以及热稳定性。

1、实验材料与方法

采用圆二色谱(CD)技术测定供试多肽的二级结构(α-螺旋)和热稳定性以及供试脂肽与靶序列模拟多肽之间的相互作用。靶序列模拟多肽RN48，源自于RSV F1亚基的HR1序列，RN48的序列如下：

Ac-LEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIV-NH₂

具体实验步骤为：

(1)使用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2)将供试脂肽(或供试复合物)配制成10μM的溶液(对于供试复合物来说，10μM指的是供试脂肽和RN48的浓度均为10μM)，于37℃水浴锅中放置30分钟。

(2)将步骤1得到的溶液移至相应比色皿中，使用Jasco分光偏振仪(型号J-815)扫描195-270nm波长范围内溶液摩尔椭圆率[θ]λ的变化情况，典型α-螺旋结构可在208nm和222nm处出现最大负峰，减去PBS空白对照来校正谱值，计算过程中以峰值为-33000degree.cm².dmol^-1作为α-螺旋含量100％的标准，根据溶液在222nm处的摩尔椭圆率计算α-螺旋含量的百分比。

(3)将步骤1得到的溶液加入热稳定性检测比色皿中，调整CD温控模块以每分钟2℃的速度扫描2-98℃时溶液[θ]222随温度变化情况。对熔解曲线进行平滑处理，利用Origin软件计算热解离转变的中点温度值(Tm)以反映螺旋热稳定程度。

2、实验结果与分析

结果如图4A所示，单独的R04、R05、R06、R07、R08和R09计算的α-螺旋含量分别为25％、13％、28％、32％、15％或17％，除R07螺旋含量大于30％外，其他的单肽可以认为螺旋性很低或呈无规则卷曲状，且熔解曲线不能准确计算出其Tm值。

图4B中，R04、R05、R06、R07、R08和R09与RN48复合物的α-螺旋含量分别为32％、31％、34％、35％、30％或31％，其Tm值分别对应于74℃、66℃、72℃、73℃、70℃或72℃，说明脂肽抑制剂能与RN48相互作用形成更加稳定的α-螺旋结构。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.一种抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂，其特征在于，该融合抑制剂为下式所示的化合物中的一种：

Ac-Ser-Ile-Ser-Gln-Val-Asn-Glu-Lys-Ile-Asn-Gln-Ser-Leu-Ala-Phe-Ile-Arg-Lys-Ser-Asp-Glu-Leu-Leu-His-Asn-Lys(R)-NH2

Ac-Ser-Ile-Ser-Gln-Val-Asn-Glu-Lys-Ile-Asn-Gln-Ser-Leu-Ala-Phe-Ile-Arg-Lys-Ser-Asp-Glu-Leu-Leu-His-Asn-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Lys(R)-NH2

Ac-Ser-Ile-Ser-Gln-Val-Asn-Glu-Lys-Ile-Asn-Gln-Ser-Leu-Ala-Phe-Ile-Arg-Lys-Ser-Asp-Glu-Leu-Leu-His-Asn-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys(R)-NH2

Ac-Ser-Leu-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Lys(R)-NH2

Ac-Ser-Leu-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Lys(R)-NH2

Ac-Ser-Leu-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys(R)-NH2

Ac-Ser-Leu-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys(R)-NH2

Ac-Ser-Leu-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys(R)-NH2

Ac-Ser-Leu-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys(R)-NH2

Ac-Ser-Leu-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Lys-Gly-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys(R)-NH2

所述R为修饰于Lys上的胆固醇。

2.一种抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂，其特征在于，包含权利要求1所述化合物所成的可药用的盐、溶剂化物、螯合物或非共价复合物，基于该化合物基础上的药物前体，或上述形式的任意混合物。

3.如权利要求1或2所述的抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂在制备预防和治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物组合物中的应用。

4.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括一种或多种其他抗病毒药物；其中，所述其他抗病毒药物包括核苷类药物、中和抗体、进入抑制剂、蛋白酶抑制剂或聚合酶抑制剂。