CN106554405B - 一种多肽及其用途、制备方法 - Google Patents
一种多肽及其用途、制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽及其用途、制备方法。该多肽具有(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：(Ⅰ)、普兰林肽的第1位、第9位、第20位、第30位、第34位和/或第36位的氨基酸被修饰的氨基酸序列；(Ⅱ)、具有如(Ⅰ)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)具有至少70％同源性的序列。本发明普兰林肽衍生物具有延长的药代动力学性质及较优的药效学性质。因此，本发明胰岛淀粉样多肽衍生物无须与现有的醋酸普兰林肽一样频繁地注射。本发明方法新颖、合成条件温和、工艺简单且工艺稳定。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽及其用途、制备方法。
背景技术
胰淀素是由β细胞分泌的一种多肽类激素，其参与餐后血糖的控制，能减缓食物在小肠吸收速度。普兰林肽(Pramlintide)则是一种人工合成的胰淀素类似物，它将胰淀素25位的丙氨酸、28位和29位的丝氨酸用脯氨酸代替，充分保留了胰淀素的生理作用，改变了人胰淀素易于聚集的物理性质，避免了淀粉样沉积的形成。普兰林肽(结构如式Ⅰ所示)最早由美国Amylin公司研制，2005年3月获得FDA批准，适用于使用胰岛素但血糖控制不佳患者的辅助治疗。
式Ⅰ
随着生活条件的改善，越来越多的人患有糖尿病和肥胖症。糖尿病为其中利用葡萄糖的能力部分或全部丧失的代谢病症。临床研究发现，当普兰林肽与胰岛素合用时，可能导致患者体重适度减轻。普兰林肽可用作1型和2型糖尿病的辅助治疗药物，主要用于单用胰岛素，以及联合应用胰岛素和磺脲类药物和/或二甲双胍仍无法取得预期疗效的糖尿病患者。普兰林肽可与胰岛素合用，但不能取代胰岛素。
当前，关于普兰林肽修饰衍生物的制备报道较少。专利CN103596973A介绍了普兰林肽类似物的氨基酸序列的多肽、包含这些多肽的药物组合物以及用作药物的这些多肽，其采用碳14、碳16、碳18以及碳20二酸等作为取代基修饰达到药效延长的目的；专利CN102197049A则以17-羧基十七烷酰基氨基、19-羧基十九烷酰基及19-羧基十七烷酰基氨基等作为修饰手段。
现有产品技术制备的醋酸普兰林肽，皮下单剂量注射的绝对生物利用度为30～40％，皮下注射27分钟达峰浓度。半衰期较短，需每日注射2～3次(主餐前给药)，给药频率较高，患者须承受每日2～3次的注射痛苦，不易接受。
因此，提供一种经修饰的普兰林肽，延长其半衰期，降低给药频率，增强患者的顺应性具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种多肽及其用途、制备方法。本发明提供的一种经修饰的普兰林肽，延长起半衰期，降低了给药频率，增强了患者顺应性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种多肽，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)、普兰林肽的第1位、第9位、第20位、第30位、第34位和/或第36位的氨基酸被修饰的氨基酸序列；
(Ⅱ)、具有如(Ⅰ)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)具有至少70％同源性的序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述修饰包括连接头和/或脂肪酸。
在本发明的一些具体实施方案中，所述连接头选自γGlu、Arg、γGlu-Arg、γGlu-His、γGlu-His、Glu-Lys、Glu-Glu、Glu-Arg、γGlu-His-His、γGlu-Arg-His、γGlu-His-Arg、γGlu-Glu-Arg、Glu-Glu-Arg、Glu-Lys-Arg、γGlu-Glu-His-His、γGlu-Glu-His-Arg、Glu-Glu-Arg-Glu或Glu-Glu-Glu-Glu。其中，γ(如式Ⅲ所示)意为反应位点为γ位的羧基与相应氨基酸连接；最优选的，接头“Con”选自γGlu；
式Ⅲ。
在本发明的一些具体实施方案中，所述(Ⅰ)具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
所述(Ⅰ)结构如式Ⅱ所示：
式Ⅱ
其中，R1～R7修饰连接物，包括连接头和脂肪酸。
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；
所述缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；
所述添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。
本发明还提供了所述多肽在制备治疗糖尿病或肥胖症的药物中的应用。
本发明还提供了一种编码所述多肽的DNA分子。
本发明还提供了一种重组载体，其含有所述DNA分子。
本发明还提供了一种宿主细胞，包含所述的重组载体。
本发明还提供了一种治疗糖尿病和/或肥胖症的药物制剂，由所述多肽及药学上可接受的辅料组成。
所述药物制剂的剂型可以为凝胶剂、粉针剂、气雾剂、喷剂、擦剂、膜剂、贴剂、膏剂、软膏剂、橡胶膏剂、水剂、汤剂、冲剂、片剂、丸剂、缓释剂、控释剂、粉剂、糊剂、搽剂、洗剂、涂膜剂、离子透入剂、滴眼剂、滴鼻剂、含漱剂、舌下片、吹入剂、栓剂、气雾剂、吸入剂、烟剂、口服液、口服片、注射液、糖浆剂、煎膏剂、酒剂、散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、灌肠剂或栓剂。任何可行的剂型都在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。
本发明还提供了一种所述多肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取Tyr与树脂连接制备Tyr-树脂；
步骤2：按照普兰林肽肽序，顺次偶联其余36个氨基酸；
步骤3：将Thr36、Ser34、Thr30、Ser20、Thr9的侧链和/或Lys1脱保护，暴露相应官能团羟基或氨基酸；
步骤4：将所述连接头与所述官能团羟基或氨基酸缩合，形成酯键或酰胺键连接；
步骤5：将所述脂肪酸与所述连接头缩合，形成酰胺键连接；
步骤6：将第2位和第7位半胱氨酸环化后，裂解、纯化、转盐，即得。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤1中，制备得到Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin的替代度为0.2～0.3mmol/g，优选0.25mmol/g。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤2中，顺次偶联36个氨基酸采用的偶联剂为HOBT/DIPCDI的组合。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤2中，顺次偶联的36个氨基酸中，原料：Thr36选用Fmoc-Thr(TBDPS)-OH，Ser34选用Fmoc-Ser(TBDPS)-OH，Thr30选用Fmoc-Thr(TBDPS)-OH，Ser20选用Fmoc-Ser(TBDPS)-OH，Thr9选用Fmoc-Thr(TBDPS)-OH，Lys1选用Boc-Lys(Fmoc)-OH或Fmoc-Lys(Boc)-OH；其中TBDMS可替代TBDPS；
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤2中，肽序偶联Thr36、Ser34、Thr30、Ser20、Thr9或Lys1时，可任选上述氨基酸(任选一个，或同时几个)，最优的，以只选其中任一个为佳；
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤2中，肽序偶联Thr36、Thr30或Thr9时，若不选用Fmoc-Thr(TBDPS)-OH则选用Fmoc-Thr(OtBu)-OH；偶联Ser34和Ser20时若不选用Fmoc-Ser(TBDPS)-OH，则选用Fmoc-Ser(tBu)-OH。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤2中，除Thr36、Ser34、Thr30、Ser20、Thr9及Lys1外，顺次偶联的其它原料氨基酸为：Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH和Fmoc-Cys2(Trt)-OH。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤3具体为脱除Thr36、Ser34、Thr30、Ser20、Thr9侧链保护的TBDPS(或TBDMS)或脱除Lys1的保护基Fmoc，使相应官能团(羟基或氨基)暴露。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤3中，脱除TBDPS采用的试剂为TBAF(2～5倍量)/THF，优选地采用TBAF(3倍量)/THF。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤3中，脱除Fmoc采用的试剂为20％六氢吡啶/DMF溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤4中，接头“Con”选自γGlu、Arg、γGlu-Arg、γGlu-His、γGlu-His、Glu-Lys、Glu-Glu、Glu-Arg、γGlu-His-His、γGlu-Arg-His、γGlu-His-Arg、γGlu-Glu-Arg、Glu-Glu-Arg、Glu-Lys-Arg、γGlu-Glu-His-His、γGlu-Glu-His-Arg、Glu-Glu-Arg-Glu和Glu-Glu-Glu-Glu，其中γ(如式Ⅲ所示)意为反应位点为γ位的羧基与相应氨基酸连接；最优选的，接头“Con”选自γGlu；
式Ⅲ
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤4中，采用HOBT(1.2倍量)/DIPCDI(1.2倍量)/DMAP(0.1倍量)作为偶联剂；
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤5中，脂肪酸“FA”选自硬脂酸、月桂酸或棕榈酸，最优选为棕榈酸；
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤5中，采用HOBT(1.2倍量)/DMAP(0.1倍量)/DIPCDI(1.2倍量)作为偶联剂；
在本发明的一些具体实施方案中，步骤6具体为采用碘单质的DMF溶液将第2及第7位半胱氨酸环化。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤6中，具体的，环化条件为碘单质(5～10倍量)、1～3小时，最优选地为碘单质(8倍量)、2小时。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤6中裂解、纯化、转盐具体为：采用裂解液将肽链切下，并用乙醚沉淀、洗涤，干燥后得到普兰林肽衍生物粗肽；采用反相高效液相方法纯化分离、转盐，经冻干得到普兰林肽衍生物精肽。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤6中，所用裂解液为TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V)，用量为1g树脂对应10ml裂解液，反应时间为2小时。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤6中，分离纯化采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，A相为0.1％三氟乙酸的水溶液，B相为纯乙腈，梯度为5％～95％(A相比例)，60分钟。转盐流动相为采用0.1mol/L醋酸铵水溶液/乙腈体系。
特别的，所述硬脂酸、月桂酸或棕榈酸，分别具有式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ所示结构：
硬脂酸
式Ⅳ
月桂酸
式Ⅴ
棕榈酸
式Ⅵ
最终，经过冻干获得的普兰林肽衍生物精肽，可以是但不仅限于以下示意结构：
硬脂酸-(γGlu)-[Thr36]-普兰林肽；如式Ⅶ所示：
式Ⅶ
硬脂酸-(γGlu)-[Ser34]-普兰林肽；如式Ⅷ所示：
式Ⅷ
硬脂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽；如式Ⅸ所示：
式Ⅸ
硬脂酸-(γGlu)-[Ser20]-普兰林肽；如式Ⅹ所示：
式Ⅹ
硬脂酸-(γGlu)-[Thr9]-普兰林肽；如式Ⅺ所示：
式Ⅺ
硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式Ⅻ所示：
式Ⅻ
硬脂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽；如式XIII所示：
式XIII
月桂酸-(γGlu)-[Thr36]-普兰林肽；如式XIV所示：
式XIV
月桂酸-(γGlu)-[Ser34]-普兰林肽；如式XV所示：
式XV
月桂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽；如式XVI所示：
式XVI
月桂酸-(γGlu)-[Ser20]-普兰林肽；如式XVII所示：
式XVII
月桂酸-(γGlu)-[Thr9]-普兰林肽；如式XVIII所示：
式XVIII
月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式XIX所示：
式XIX
月桂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽；如式XX所示：
式XX
棕榈酸-(γGlu)-[Thr36]-普兰林肽；如式XXI所示：
式XXI
棕榈酸-(γGlu)-[Ser34]-普兰林肽；如式XXII所示：
式XXII
棕榈酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽；如式XXIII所示：
式XXIII
棕榈酸-(γGlu)-[Ser20]-普兰林肽；如式XXIV所示：
式XXIV
棕榈酸-(γGlu)-[Thr9]-普兰林肽；如式XXV所示：
式XXV
棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式XXVI所示：
式XXVI
棕榈酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽；如式XXVII所示：
式XXVII
硬脂酸-(γGlu-Arg)-[Thr36]-普兰林肽；如式XXVIII所示：
式XXVIII
硬脂酸-(γGlu-Arg)-[Ser34]-普兰林肽；如式XXIX所示：
式XXIX
硬脂酸-(γGlu-Arg)-[Thr30]-普兰林肽；如式XXX所示：
式XXX
硬脂酸-(γGlu-Arg)-[Ser20]-普兰林肽；如式XXXI所示：
式XXXI
硬脂酸-(γGlu-Arg)-[Thr9]-普兰林肽；如式XXXII所示：
式XXXII
硬脂酸-(γGlu-Arg)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式XXXIII所示：
式XXXIII
硬脂酸-(γGlu-Arg)-[Lys1主链]-普兰林肽；如式XXXIV所示：
式XXXIV
月桂酸-(γGlu-Arg)-[Thr36]-普兰林肽；如式XXXV所示：
式XXXV
月桂酸-(γGlu-Arg)-[Ser34]-普兰林肽；如式XXXVI所示：
式XXXVI
月桂酸-(γGlu-Arg)-[Thr30]-普兰林肽；如式XXXVII所示：
式XXXVII
月桂酸-(γGlu-Arg)-[Ser20]-普兰林肽；如式XXXVIII所示：
式XXXVIII
月桂酸-(γGlu-Arg)-[Thr9]-普兰林肽；如式XXXIX所示：
式XXXIX
月桂酸-(γGlu-Arg)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式XL所示：
式XL
月桂酸-(γGlu-Arg)-[Lys1主链]-普兰林肽；如式XLI所示：
式XLI
棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Thr36]-普兰林肽；如式XLII所示：
式XLII
棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Ser34]-普兰林肽；如式XLIII所示：
式XLIII
棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Thr30]-普兰林肽；如式XLIV所示：
式XLIV
棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Ser20]-普兰林肽；如式XLV所示：
式XLV
棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Thr9]-普兰林肽；如式XLVI所示：
式XLVI
棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式XLVII所示：
式XLVII
棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Lys1主链]-普兰林肽；如式XLVIII所示：
式XLVIII
棕榈酸-(Arg)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式XLIX所示：
式XLIX
棕榈酸-(γGlu-His)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式L所示：
式L
棕榈酸-(Glu-Lys)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LI所示：
式LI
棕榈酸-(Glu-Glu)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LII所示：
式LII
棕榈酸-(Glu-Arg)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LII所示：
式LII
棕榈酸-(γGlu-His-His)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LIII所示：
式LIII
棕榈酸-(γGlu-Arg-His)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LIV所示：
式LIV
棕榈酸-(γGlu-His-Arg)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LV所示：
式LV
棕榈酸-(γGlu-Glu-Arg)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LVI所示：
式LVI
棕榈酸-(Glu-Glu-Arg)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LVII所示：
式LVII
棕榈酸-(Glu-Lys-Arg)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LVIII所示：
式LVIII
棕榈酸-(γGlu-Glu-His-His)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LIX所示：
式LIX
棕榈酸-(γGlu-Glu-His-Arg)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LX所示：
式LX
棕榈酸-(Glu-Glu-Arg-Glu)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LXI所示：
式LXI
棕榈酸-(Glu-Glu-Glu-Glu)-[Lys1侧链]-普兰林肽；如式LXII所示：
式LXII
硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽-[Thr30]-(γGlu)-硬脂酸；如式LXIII所示：
式LXIII
月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽-[Thr30]-(γGlu)-月桂酸；如式LXIV所示：
式LXIV
棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽-[Thr30]-(γGlu)-棕榈酸；如式LXV所示：
式LXV
其中，括号“()”内为连接头，其内左边第1个氨基酸活性官能团与相应普兰林肽上的特定氨基酸活性官能团连接，γ表示连接位点为γ羧基。其内右边第1个氨基酸与硬脂酸、月桂酸或棕榈酸羧基缩合；中括号“[]”内为普兰林肽上的指定氨基酸，其活性官能团与接头缩合。
优选地，制备所得普兰林肽衍生物为：
硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽；
硬脂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽；
月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽；
月桂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽；
棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽；
棕榈酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽；
最优选地，制备所得普兰林肽衍生物为：
硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽；
月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽；
棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽。
本发明提供了一种多肽，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：(Ⅰ)、普兰林肽的第1位、第9位、第20位、第30位、第34位和/或第36位的氨基酸被修饰的氨基酸序列；(Ⅱ)、具有如(Ⅰ)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)具有至少70％同源性的序列。本发明普兰林肽衍生物具有延长的药代动力学性质及较优的药效学性质。因此，本发明胰岛淀粉样多肽衍生物无须与现有的醋酸普兰林肽一样频繁地注射。本发明方法新颖、合成条件温和、工艺简单且工艺稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2制备的硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽精肽图；
图2示实施例3制备的月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽精肽图；
图3示实施例4制备的棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽精肽图；
图4示实施例5制备的硬脂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽精肽图；
图5示实施例6制备的月桂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽精肽图；
图6示实施例7制备的棕榈酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽精肽图；
图7示实施例8制备的硬脂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽精肽图；
图8示实施例9制备的月桂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽精肽图；
图9示实施例10制备的棕榈酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽精肽图；
图10示实施例11制备的棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Thr30]-普兰林肽精肽图；
图11示实施例12制备的棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽-[Thr30]-(γGlu)-棕榈酸精肽图；
图12示实施例14中皮下注射本发明提供的普兰林肽及Symlin2达到25分钟的胃内容物残留率；
图13示实施例15中普兰林肽、本发明提供的Symlin1及本发明提供的Symlin2降糖时效曲线图。
具体实施方式
本发明公开了一种多肽及其用途、制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的多肽及其用途、制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
缩写及英文含义见表1。
表1缩写及英文含义
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1替代度约为0.25mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin的制备
取2.5kg替代度为0.4mmol/g的RinkAmideMBHAResin树脂(共1.0mol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(0.8eq，0.8mol，g)、HOBt(0.96eq，0.96mol，130g)和DIPCDI(0.96eq，0.96mol，121g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤2次，DCM洗2次。然后加入吡啶(5eq，5mol，396g)和乙酸酐(5eq，5mol，505g)混合液封闭树脂6h(添加适当DMF使之能搅拌分散均匀)。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂，检测替代度为0.251mmol/g，重为2950g。
实施例2硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽的制备
2.1氨基酸的偶联
取398g，0.1mol实施例1制备的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Thr(tBu)-OH(5eq，0.5mol，199g)、HOBt(6eq，0.6mol，81g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。
按照上述偶联方式，依照普兰林肽肽序，依次偶联Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Ser34(tBu)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Thr30(tBu)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser20(tBu)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Thr9(tBu)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH、Fmoc-Cys2(Trt)-OH和Boc-Lys1(Fmoc)-OH。
偶联完毕，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次，经此处理，Boc-Lys1(Fmoc)-OH侧链氨基裸露出来。
2.2侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu与普兰林肽(未环化)的连接
将侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu(5eq，0.5mol，213g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述2.1固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
2.3硬脂酸的偶联
将硬脂酸(5eq，0.5mol，142g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述2.2固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。
2.4二硫键的形成
将碘单质(8eq，0.8mol，203g)溶解于4.0LDMF中，加入到上述2.3固相反应柱中，25℃反应2h，反应结束后，用5％六氢吡啶/DMF溶液洗涤6次，最后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到903g的硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽肽树脂。
2.5硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽粗肽制备
以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂(TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V))，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽粗肽531.2g。重量收率为106.2％，HPLC纯度为56.2％。
2.6硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽的制备
称取由2.5制备得到的531.2g硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽粗肽用16L水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。再经过醋酸铵/乙腈体系转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到硬脂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽精肽212.5g，HPLC纯度99.93％，见图1。
实施例3月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽的制备
3.1氨基酸的偶联
取398g，0.1mol实施例1制备的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Thr(tBu)-OH(5eq，0.5mol，199g)、HOBt(6eq，0.6mol，81g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。
按照上述偶联方式，依照普兰林肽肽序，依次偶联Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Ser34(tBu)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Thr30(tBu)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser20(tBu)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Thr9(tBu)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH、Fmoc-Cys2(Trt)-OH和Boc-Lys1(Fmoc)-OH。
偶联完毕，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次，经此处理，Boc-Lys1(Fmoc)-OH侧链氨基裸露出来。
3.2侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu与普兰林肽(未环化)的连接
将侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu(5eq，0.5mol，213g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述3.1固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
3.3月桂酸的偶联
将月桂酸(5eq，0.5mol，100g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述3.2固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。
3.4二硫键的形成
将碘单质(8eq，0.8mol，203g)溶解于4.0LDMF中，加入到上述2.3固相反应柱中，25℃反应2h，反应结束后，用5％六氢吡啶/DMF溶液洗涤6次，最后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到895g的月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽肽树脂。
3.5月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽粗肽制备
以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂(TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V))，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽粗肽516.9g。重量收率为103.4％，HPLC纯度为57.1％。
3.6月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽的制备
称取由3.5制备得到的516.9g月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽粗肽用16L水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。再经过醋酸铵/乙腈体系转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到月桂酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽精肽209.2g，HPLC纯度99.92％，见图2。
实施例4棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽的制备
4.1氨基酸的偶联
取398g，0.1mol实施例1制备的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Thr(tBu)-OH(5eq，0.5mol，199g)、HOBt(6eq，0.6mol，81g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。
按照上述偶联方式，依照普兰林肽肽序，依次偶联Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Ser34(tBu)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Thr30(tBu)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser20(tBu)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Thr9(tBu)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH、Fmoc-Cys2(Trt)-OH和Boc-Lys1(Fmoc)-OH。
偶联完毕，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次，经此处理，Boc-Lys1(Fmoc)-OH侧链氨基裸露出来。
4.2侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu与普兰林肽(未环化)的连接
将侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu(5eq，0.5mol，213g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述4.1固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
4.3棕榈酸的偶联
将棕榈酸(5eq，0.5mol，128g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述4.2固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。
4.4二硫键的形成
将碘单质(8eq，0.8mol，203g)溶解于4.0LDMF中，加入到上述4.3固相反应柱中，25℃反应2h，反应结束后，用5％六氢吡啶/DMF溶液洗涤6次，最后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到903g的棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽肽树脂。
4.5棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽粗肽制备
以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂(TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V))，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽粗肽526.7g。重量收率为105.3％，HPLC纯度为56.7％。
4.6棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽的制备
称取由2.5制备得到的526.7g棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽粗肽用16L水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。再经过醋酸铵/乙腈体系转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽精肽219.5g，HPLC纯度99.65％，见图3。
实施例5硬脂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽
5.1氨基酸的偶联
取398g，0.1mol实施例1制备的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Thr(tBu)-OH(5eq，0.5mol，199g)、HOBt(6eq，0.6mol，81g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。
按照上述偶联方式，依照普兰林肽肽序，依次偶联Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Ser34(tBu)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Thr30(tBu)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser20(tBu)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Thr9(tBu)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH、Fmoc-Cys2(Trt)-OH和Fmoc-Lys1(Boc)-OH。
偶联完毕，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次，经此处理，Fmoc-Lys1(Boc)-OH主链氨基裸露出来。
5.2侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu与普兰林肽(未环化)的连接
将侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu(5eq，0.5mol，213g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述5.1固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
5.3硬脂酸的偶联
将硬脂酸(5eq，0.5mol，142g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述5.2固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。
5.4二硫键的形成
将碘单质(8eq，0.8mol，203g)溶解于4.0LDMF中，加入到上述2.3固相反应柱中，25℃反应2h，反应结束后，用5％六氢吡啶/DMF溶液洗涤6次，最后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到907g的硬脂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽肽树脂。
5.5硬脂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽粗肽制备
以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂(TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V))，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即硬脂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽粗肽530.2g。重量收率为106.0％，HPLC纯度为56.8％。
5.6硬脂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽的制备
称取由5.5制备得到的530.2g硬脂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽粗肽用16L水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。再经过醋酸铵/乙腈体系转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到硬脂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽精肽213.2g，HPLC纯度99.2％。
实施例6月桂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽的制备
6.1氨基酸的偶联
取398g，0.1mol实施例1制备的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Thr(tBu)-OH(5eq，0.5mol，199g)、HOBt(6eq，0.6mol，81g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。
按照上述偶联方式，依照普兰林肽肽序，依次偶联Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Ser34(tBu)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Thr30(tBu)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser20(tBu)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Thr9(tBu)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH、Fmoc-Cys2(Trt)-OH和Fmoc-Lys1(Boc)-OH。
偶联完毕，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次，经此处理，Fmoc-Lys1(Boc)-OH主链氨基裸露出来。
6.2侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu与普兰林肽(未环化)的连接
将侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu(5eq，0.5mol，213g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述6.1固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
6.3月桂酸的偶联
将月桂酸(5eq，0.5mol，100g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述6.2固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。
6.4二硫键的形成
将碘单质(8eq，0.8mol，203g)溶解于4.0LDMF中，加入到上述6.3固相反应柱中，25℃反应2h，反应结束后，用5％六氢吡啶/DMF溶液洗涤6次，最后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到896g的月桂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽肽树脂。
6.5月桂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽粗肽制备
以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂(TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V))，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即月桂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽粗肽512.2g。重量收率为102.4％，HPLC纯度为56.1％。
6.6月桂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽的制备
称取由6.5制备得到的512.2g月桂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽粗肽用16L水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。再经过醋酸铵/乙腈体系转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到月桂酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽精肽206g，HPLC纯度99.3％。
实施例7棕榈酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽的制备
7.1氨基酸的偶联
取398g，0.1mol实施例1制备的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Thr(tBu)-OH(5eq，0.5mol，199g)、HOBt(6eq，0.6mol，81g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。
按照上述偶联方式，依照普兰林肽肽序，依次偶联Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Ser34(tBu)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Thr30(tBu)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser20(tBu)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Thr9(tBu)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH、Fmoc-Cys2(Trt)-OH和Fmoc-Lys1(Boc)-OH。
偶联完毕，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次，经此处理，Fmoc-Lys1(Boc)-OH主链氨基裸露出来。
7.2侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu与普兰林肽(未环化)的连接
将侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu(5eq，0.5mol，213g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述7.1固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
7.3棕榈酸的偶联
将棕榈酸(5eq，0.5mol，128g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述7.2固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。
7.4二硫键的形成
将碘单质(8eq，0.8mol，203g)溶解于4.0LDMF中，加入到上述6.3固相反应柱中，25℃反应2h，反应结束后，用5％六氢吡啶/DMF溶液洗涤6次，最后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到912.1g的棕榈酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽肽树脂。
7.5棕榈酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽粗肽制备
以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂(TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V))，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即棕榈酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽粗肽527.2g。重量收率为105.4％，HPLC纯度为57.1％。
7.6棕榈酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽的制备
称取由7.5制备得到的512.2g棕榈酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽粗肽用16L水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。再经过醋酸铵/乙腈体系转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到棕榈酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽精肽217g，HPLC纯度99.4％。
实施例8硬脂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽的制备
8.1氨基酸的偶联
取398g，0.1mol实施例1制备的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Thr(tBu)-OH(5eq，0.5mol，199g)、HOBt(6eq，0.6mol，81g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。
按照上述偶联方式，依照普兰林肽肽序，依次偶联Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Ser34(tBu)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Thr30(TBDPS)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser20(tBu)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Thr9(tBu)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH、Fmoc-Cys2(Trt)-OH和Boc-Lys1(Boc)-OH。
8.2肽链中Thr30的侧链保护基TBDPS的脱除
将TBAF(3eq，0.3mol，78g)溶解于1.0L的THF中，并将其加入到上述8.1固相反应柱中，鼓气搅拌反应3小时。反应结束后用DMF洗涤3次。
8.3侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu与普兰林肽(未环化)的连接
将侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu(5eq，0.5mol，213g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述8.2固相反应柱中，室温反应3h。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
8.4硬脂酸的偶联
将硬脂酸(5eq，0.5mol，142g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述8.3固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。
8.5二硫键的形成
将碘单质(8eq，0.8mol，203g)溶解于4.0LDMF中，加入到上述8.4固相反应柱中，25℃反应2h，反应结束后，用5％六氢吡啶/DMF溶液洗涤6次，最后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到938.7g的硬脂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽肽树脂。
8.6硬脂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽粗肽制备
以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂(TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V))，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即硬脂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽粗肽537.3g。重量收率为107.4％，HPLC纯度为57.2％。
8.7硬脂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽的制备
称取由8.6制备得到的537.3g硬脂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽粗肽用16L水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。再经过醋酸铵/乙腈体系转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到硬脂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽精肽227g，HPLC纯度99.4％。
实施例9月桂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽的制备
9.1氨基酸的偶联
取398g，0.1mol实施例1制备的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Thr(tBu)-OH(5eq，0.5mol，199g)、HOBt(6eq，0.6mol，81g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。
按照上述偶联方式，依照普兰林肽肽序，依次偶联Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Ser34(tBu)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Thr30(TBDPS)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser20(tBu)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Thr9(tBu)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH、Fmoc-Cys2(Trt)-OH和Boc-Lys1(Boc)-OH。
9.2肽链中Thr30的侧链保护基TBDPS的脱除
将TBAF(3eq，0.3mol，78g)溶解于1.0L的THF中，并将其加入到上述9.1固相反应柱中，鼓气搅拌反应3小时。反应结束后用DMF洗涤3次。
9.3侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu与普兰林肽(未环化)的连接
将侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu(5eq，0.5mol，213g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述9.2固相反应柱中，室温反应3h。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
9.4月桂酸的偶联
将月桂酸(5eq，0.5mol，100g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述9.3固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。
9.5二硫键的形成
将碘单质(8eq，0.8mol，203g)溶解于4.0LDMF中，加入到上述9.4固相反应柱中，25℃反应2h，反应结束后，用5％六氢吡啶/DMF溶液洗涤6次，最后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到921.2g的月桂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽肽树脂。
9.6月桂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽粗肽制备
以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂(TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V))，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即月桂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽粗肽527.3g。重量收率为105.4％，HPLC纯度为56.8％。
9.7月桂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽的制备
称取由9.6制备得到的527.3g月桂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽粗肽用16L水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。再经过醋酸铵/乙腈体系转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到月桂酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽精肽217g，HPLC纯度99.3％。
实施例10棕榈酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽的制备
10.1氨基酸的偶联
取398g，0.1mol实施例1制备的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Thr(tBu)-OH(5eq，0.5mol，199g)、HOBt(6eq，0.6mol，81g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。
按照上述偶联方式，依照普兰林肽肽序，依次偶联Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Ser34(tBu)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Thr30(TBDPS)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser20(tBu)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Thr9(tBu)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH、Fmoc-Cys2(Trt)-OH和Boc-Lys1(Boc)-OH。
10.2肽链中Thr30的侧链保护基TBDPS的脱除
将TBAF(3eq，0.3mol，78g)溶解于1.0L的THF中，并将其加入到上述10.1固相反应柱中，鼓气搅拌反应3小时。反应结束后用DMF洗涤3次。
10.3侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu与普兰林肽(未环化)的连接
将侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu(5eq，0.5mol，213g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述10.2固相反应柱中，室温反应3h。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
10.4棕榈酸的偶联
将棕榈酸(5eq，0.5mol，124g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述10.3固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。
10.5二硫键的形成
将碘单质(8eq，0.8mol，203g)溶解于4.0LDMF中，加入到上述10.4固相反应柱中，25℃反应2h，反应结束后，用5％六氢吡啶/DMF溶液洗涤6次，最后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到928.7g的棕榈酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽肽树脂。
10.6棕榈酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽粗肽制备
以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂(TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V))，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即棕榈酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽粗肽529.3g。重量收率为105.8％，HPLC纯度为57.1％。
10.7棕榈酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽的制备
称取由10.6制备得到的529.3g棕榈酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽粗肽用16L水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。再经过醋酸铵/乙腈体系转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到棕榈酸-(γGlu)-[Thr30]-普兰林肽精肽223g，HPLC纯度99.3％。
实施例11棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Thr30]-普兰林肽的制备
11.1氨基酸的偶联
取398g，0.1mol实施例1制备的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Thr(tBu)-OH(5eq，0.5mol，199g)、HOBt(6eq，0.6mol，81g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。
按照上述偶联方式，依照普兰林肽肽序，依次偶联Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Ser34(tBu)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Thr30(TBDPS)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser20(tBu)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Thr9(tBu)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH、Fmoc-Cys2(Trt)-OH和Boc-Lys1(Boc)-OH。
11.2肽链中Thr30的侧链保护基TBDPS的脱除
将TBAF(3eq，0.3mol，78g)溶解于1.0L的THF中，并将其加入到上述11.1固相反应柱中，鼓气搅拌反应3小时。反应结束后用DMF洗涤3次。
11.3接头“γGlu-Arg”与普兰林肽(未环化)的连接
将侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu(5eq，0.5mol，213g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述11.2固相反应柱中，室温反应3h。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
按上述偶联方式将偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH，并用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
11.4棕榈酸的偶联
将棕榈酸(5eq，0.5mol，124g)，HOBt(6eq，0.6mol，81g)，DMAP(0.5eq，0.05mol，6.1g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述11.3固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。
11.5二硫键的形成
将碘单质(8eq，0.8mol，203g)溶解于4.0LDMF中，加入到上述11.4固相反应柱中，25℃反应2h，反应结束后，用5％六氢吡啶/DMF溶液洗涤6次，最后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到940.7g的棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Thr30]-普兰林肽肽树脂。
11.6棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Thr30]-普兰林肽粗肽制备
以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂(TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V))，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Thr30]-普兰林肽粗肽532.3g。重量收率为106.4％，HPLC纯度为57.2％。
11.7棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Thr30]-普兰林肽的制备
称取由11.6制备得到的532.3g棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Thr30]-普兰林肽粗肽用16L水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。再经过醋酸铵/乙腈体系转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到棕榈酸-(γGlu-Arg)-[Thr30]-普兰林肽精肽219g，HPLC纯度99.4％。
实施例12棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽-[Thr30]-(γGlu)-棕榈酸的制备
12.1氨基酸的偶联
取398g，0.1mol实施例1制备的Fmoc-Tyr(tBu)-MBHAResin树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。取Fmoc-Thr(tBu)-OH(5eq，0.5mol，199g)、HOBt(6eq，0.6mol，81g)和DIPCDI(6eq，0.6mol，76g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂无色透明。反应结束后用DMF洗涤3次。
按照上述偶联方式，依照普兰林肽肽序，依次偶联Fmoc-Asn35(Trt)-OH、Fmoc-Ser34(tBu)-OH、Fmoc-Gly-33OH、Fmoc-Val32-OH、Fmoc-Asn31(Trt)-OH、Fmoc-Thr30(TBDPS)-OH、Fmoc-Pro29-OH、Fmoc-Pro28-OH、Fmoc-Leu27-OH、Fmoc-Ile26-OH、Fmoc-Pro25-OH、Fmoc-Gly24-OH、Fmoc-Phe23-OH、Fmoc-Asn22(Trt)-OH、Fmoc-Asn21(Trt)-OH、Fmoc-Ser20(tBu)-OH、Fmoc-Ser19(tBu)-OH、Fmoc-His18(Trt)-OH、Fmoc-Val17-OH、Fmoc-Leu16-OH、Fmoc-Phe15-OH、Fmoc-Asn14(Trt)-OH、Fmoc-Ala13-OH、Fmoc-Leu12-OH、Fmoc-Arg11(Pbf)-OH、Fmoc-Gln10(Trt)-OH、Fmoc-Thr9(tBu)-OH、Fmoc-Ala8-OH、Fmoc-Cys7(Trt)-OH、Fmoc-Thr6(tBu)-OH、Fmoc-Ala5-OH、Fmoc-Thr4(tBu)-OH、Fmoc-Asn3(Trt)-OH、Fmoc-Cys2(Trt)-OH和Boc-Lys1(Fmoc)-OH。
偶联完毕，采用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次，经此处理，Boc-Lys1(Fmoc)-OH侧链氨基裸露出来。
12.2肽链中Thr30的侧链保护基TBDPS的脱除
将TBAF(3eq，0.3mol，78g)溶解于1.0L的THF中，并将其加入到上述12.1固相反应柱中，鼓气搅拌反应3小时。反应结束后用DMF洗涤3次。
12.3侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu与普兰林肽(未环化)的连接
将侧链羧基裸露的Fmoc-Glu-OtBu(10eq，1.0mol，426g)，HOBt(12eq，1.2mol，162g)，DMAP(1.0eq，0.1mol，12.2g)和DIPCDI(12eq，1.2mol，152g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述12.2固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。用20％DBLK溶液分两次脱除Fmoc，每次10分钟，再将树脂用DMF洗涤6次。
12.4棕榈酸的偶联
将棕榈酸(10eq，1.0mol，256g)，HOBt(12eq，1.2mol，162g)，DMAP(1.0eq，0.1mol，12.2g)和DIPCDI(12eq，1.2mol，152g)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入上述12.3固相反应柱中，室温反应3h，用5％茚三酮/乙醇溶液检测树脂透明无色。反应结束后用DMF洗涤3次。
12.5二硫键的形成
将碘单质(8eq，0.8mol，203g)溶解于4.0LDMF中，加入到上述12.4固相反应柱中，25℃反应2h，反应结束后，用5％六氢吡啶/DMF溶液洗涤6次，最后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到956g的棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽-[Thr30]-(γGlu)-棕榈酸肽树脂。
12.6棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽-[Thr30]-(γGlu)-棕榈酸粗肽制备
以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂(TFA/EDT/TIS/H2O＝90：5：3：2(V/V))，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽-[Thr30]-(γGlu)-棕榈酸553.7g。重量收率为108.4％，HPLC纯度为55.7％。
12.7棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽-[Thr30]-(γGlu)-棕榈酸的制备
称取由12.6制备得到的553.7g棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽-[Thr30]-(γGlu)-棕榈酸粗肽用18L水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为150×250mm反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。再经过醋酸铵/乙腈体系转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽-[Thr30]-(γGlu)-棕榈酸精肽232.5g，HPLC纯度99.2％。
实施例13普兰林肽及本发明提供的普兰林肽修饰物的体外活性的检测
采用经分化诱导的L6细胞糖吸收模型测定普兰林肽和其衍生物对培养上清中葡萄糖的变化情况的影响。
将L6细胞经分化诱导形成肌管，去除培养基，孔板加入0.4ml高糖DMEM培养基(含2％FBS)饥饿培养2h，去除培养基，同等方法共同时进行制备三组。其中两组分别精密加入400μL普兰林肽及棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽(为易于描述，令为Symlin2)标准液(均为1x10-6M，溶剂为11mM的葡萄糖的KHHbuffer)；另外一组为对照组，不含有药物，仅含有11mM的葡萄糖的KHHbuffer。每组分别在4h，8h，16h，24h和48h，每孔取200μL培养液上清，离心后取上清测定葡萄糖含量，计算细胞的糖吸收增加量及增加率。结果表2所示：
表2普兰林肽1和Symlin2糖吸收增量及糖吸收增加率结果表
结果表明，与对照组相比，从4h到48h，普兰林肽和Symlin2都能促进L6细胞对葡萄糖的吸收作用，而且吸收量随着时间的增加而增加，特别的，在T＝16h时细胞糖吸收增加速度最快，作用时间短，也说明普兰林肽和Symlin2具有明显的体外活性。同时，在T＝48小时时，Symlin2的糖吸收增加率为63.27±1.205％，较普兰林肽45.25±2.215％高，具有极显著差异(P＜0.01)，表明Symlin2的发挥的活性时长相对较长。
特别的，采用本法，将按本发明制备得到的部分普兰林肽衍生物进行了体外活性的检测，并将T＝48小时时，各衍生物的糖吸收增加率列于表3：
表3普兰林肽衍生物体外活性数据表
因此，从糖吸收增加率数据可以得出，经本发明修饰的普兰林肽衍生物发挥体外活性的时长极显著(P＜0.01)优于普兰林肽。
实施例14普兰林肽及本发明提供的普兰林肽修饰物的体内活性的检测
研究资料表明，普兰林肽能通过延缓胃排空从而起到降低餐后血糖的作用。本发明实施例利用高分子材料甲基纤维素能亲水溶胀并在肠道内部被吸收亦无局部刺激作用的特点，制备半流动性粘稠胶体溶液，同时以酚红为指示剂来间接反映胃内容物残留量。
14.1配制灌胃液
配制添加有酚红的15mg/ml的甲基纤维素溶液100ml备用；
14.2实验大鼠
准备体重225±10g的雄性健康大鼠并饲喂一周，实验前禁食不禁水20h，并将其分为以下组：
空白对照组：16只
阳性对照组：普兰林肽剂量为0.15、0.75、1.5、15、150μg，每组8只
给药组：Symlin2剂量为0.15、0.75、1.5、15、150μg，每组8只
14.3给药
按照0.15、0.75、1.5、15、150μg的剂量(各0.5ml)，将阳性对照组及给药组的大鼠分别注射普兰林肽及Symlin2，空白对照组给药等体积0.9％生理盐水。5分钟后，每只大鼠采用灌胃液灌胃1.5ml。
14.4内容物收集
取8只阳性对照组大鼠，灌胃后立即麻醉并解剖收集胃内容物；其余大鼠在灌胃20分钟后，再麻醉并解剖收集胃内容物。
14.5胃内容物残留率测定
将经过0.5M氢氧化钠(0.5ml)处理、并经离心取得的上清液，在560nm下测量吸收值，并按照公式：胃内容物残留率＝(20分钟时的吸收值)/(0分钟时的吸收值)，进行计算胃内容物残留率。结果如图4所示。列表如表4：
表4胃内容物残留率测定表
| 组别 | 胃内容物残留率(％) |
| 空白对照组 | 57.1±0.2 |
| 阳性对照组(普兰林肽组) | 93.5±1.5 |
| 试验组(Symlin2组) | 92.4±1.8 |
由图4及表4可见，普兰林肽及Symlin2组的胃内容物残留率均远大于空白对照组，具有极显著差异(P＜0.01)，同时Symlin2组的胃内容物残留率与普兰林肽组相当，差异较小，无显著差异(P＞0.05)，表明Symlin2抑制胃排空的效果明显，即Symlin2体内活性明显。
特别的，采用本法，将按本发明制备得到的部分普兰林肽衍生物进行了体内活性的检测，并将结果列于表5：
表5普兰林肽衍生物体内活性数据表
实施例15普兰林肽及本发明提供的普兰林肽修饰物的降糖时效的试验
取雄性健康大鼠(体重200～250g)，实验前小鼠禁食不禁水，随机分为4组，每组6只。每组大鼠均注射胰岛素(0.7U/kg)，随之将其中的一组大鼠皮下单次注射等体积的生理盐水(10ml/kg)，其余三组分别皮下注射普兰林肽(0.5mg/kg)、棕榈酸-(γGlu)-[Lys1主链]-普兰林肽(令为Symlin1，0.6mg/kg)和棕榈酸-(γGlu)-[Lys1侧链]-普兰林肽(令为Symlin2，0.6mg/kg)。注射后0，0.5，1，2，4，8，12，18，24，36，48小时尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以不同时间点的血糖值为纵坐标，时间为横坐标，建立降血糖作用的时效曲线(见图5)，计算各组药物作用的生物半衰期。结果表6所示：
表6普兰林肽、Symlin1及Symlin2降糖时效表
| 样品组别 | 半衰期(h) |
| 胰岛素+生理盐水 | 2.1±0.4 |
| 胰岛素+普兰林肽 | 2.5±0.5 |
| 胰岛素+Symlin1 | 13.2±0.4 |
| 胰岛素+Symlin2 | 12.9±0.6 |
结果显示，胰岛素+Symlin1和胰岛素+Symlin2的药物组合半衰期均比胰岛素+生理盐水和胰岛素+普兰林肽极显著增加(P＜0.01)，表明经修饰的普兰林肽衍生物Symlin1及Symlin2降糖时效均较普兰林肽显著。
特别的，采用本法，将按本发明制备得到的部分普兰林肽衍生物分别与胰岛素组合，进行了降糖时效的试验，并将相应半衰期列于表7：
表7普兰林肽衍生物+胰岛素降糖时效结果表
上述列表数据表明，所列化合物即经修饰的普兰林肽的降糖时效均极显著优于(P＜0.01)普兰林肽。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种多肽，其特征在于，其具有如下所示的氨基酸序列：
(Ⅰ)、普兰林肽的第1位、第9位、第20位、第30位、第34位或第36位的氨基酸被修饰的氨基酸序列；
所述修饰包括连接头和/或脂肪酸；
所述(Ⅰ) 具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述(Ⅰ)结构如式Ⅱ所示：
其中，R1~R7修饰连接物，包括连接头和脂肪酸；
所述脂肪酸选自硬脂酸、月桂酸或棕榈酸。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述连接头选自γGlu、Arg、γGlu-Arg、γGlu-His、γGlu-His、Glu-Lys、Glu-Glu、Glu-Arg、γGlu-His-His、γGlu-Arg-His、γGlu-His-Arg、γGlu-Glu-Arg、Glu-Glu-Arg、Glu-Lys-Arg、γGlu-Glu-His-His、γGlu-Glu-His-Arg、Glu-Glu-Arg-Glu 或Glu-Glu-Glu-Glu。
3.根据权利要求1或2所述的多肽在制备治疗糖尿病或肥胖症的药物中的应用。
4.一种编码如权利要求1或2所述的多肽的DNA分子。
5.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求4所述的DNA分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求5所述的重组载体。
7.一种治疗糖尿病和/或肥胖症的药物制剂，其特征在于，由如权利要求1所述的多肽及药学上可接受的辅料组成。
8.一种如权利要求1或2所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取Tyr与树脂连接制备Tyr-树脂；
步骤2：按照普兰林肽肽序，顺次偶联其余36个氨基酸；
步骤3：将Thr36、 Ser34 、Thr30 、Ser20 、Thr9 的侧链或Lys1脱保护，暴露相应官能团羟基或氨基；
步骤4：将所述连接头与所述官能团羟基或氨基缩合，形成酯键或酰胺键连接；
步骤5：将所述脂肪酸与所述连接头缩合，形成酰胺键连接；
步骤6：将第2位和第7位半胱氨酸环化后，裂解、纯化、转盐，即得。
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