CN102321170A - 利拉鲁肽变构体及其缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利拉鲁肽变构体及其制备方法，利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为：X1-Ala-Glu-X2-Thr-Phe-X3-X4-Asp-Val-X5-X6-Tyr-Leu-X7-Gly-Gln-Ala-X8-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-X9-Trp-X10-Val-Arg-Gly-Arg-X11；其中：X1为His或Cys；X2为Gly或Cys；X3为Thr或Cys；X4为Ser或Cys；X5为Ser或Cys；X6为Ser或Cys；X7为Glu或Cys；X8为Ala或删除；X9为Ala或Cys；X10为Leu或Cys或D-Ala；X11为Gly或Cys或Gly-Gly。本发明还提供一种利拉鲁肽变构体缀合物及其制备方法。本发明提供的利拉鲁肽变构体及其缀合物保留了利拉鲁肽的生物学活性，延长了半衰期，有利于患者负担的减轻。

Description

利拉鲁肽变构体及其缀合物
技术领域
本发明涉及利拉鲁肽变构体及其缀合物。
背景技术
利拉鲁肽是由丹麦诺和诺德公司研制的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂，在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原性等方面与GLP-1相似。利拉鲁肽的分子结构与GLP-1(7-36)类似，不同之处在于：利拉鲁肽将GLP-1的第34位赖氨酸替换为精氨酸，并在第26位增加了一个棕榈酰脂肪酸侧链。
多肽类药物普遍存在体内半衰期较短，物理、化学稳定性较差，易被体内各种蛋白酶降解的特性。利拉鲁肽作为一种皮下注射制剂，半衰期约12~14h，需每天一次使用，能起到良好的降低血糖作用，但给患者身体、心理和经济带来较大的负担，限制了患者用药依从性。因此，对利拉鲁肽进行结构改造及开发新的剂型，从而延长其血浆周期和增加其系统性药物暴露，具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种利拉鲁肽变构体及其缀合物，延长了半衰期，可有效地降低血糖浓度。
本发明首先提供一种利拉鲁肽变构体，其氨基酸序列为：X1-Ala-Glu-X2-Thr-Phe-X3-
X4-Asp-Val-X5-X6-Tyr-Leu-X7-Gly-Gln-Ala-X8-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-X9-Trp-X10-Val-Arg-Gly-Arg-X11；其中：X1为His或Cys；X2为Gly或Cys；X3为Thr或Cys；X4为Ser或Cys；X5为Ser或Cys；X6为Ser或Cys；X7为Glu或Cys；X8为Ala或删除；X9为Ala或Cys；X10为Leu或Cys或D-Ala；X11为Gly或Cys或Gly-Gly。
采用上述技术方案，利拉鲁肽变构体保留了利拉鲁肽的生物学活性，可有效地降低血糖，且延长了半衰期，为患者提供了更多的药物选择余地。
作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Cys-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-
glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，所述X5为Cys。
作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，所述X8删除。
作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-
glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-D-Ala-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，所述X10为D-Ala。
作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-
glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly，所述X11为Gly-Gly。
相应的，本发明还提供一种利拉鲁肽变构体的制备方法，包括如下步骤：
A）2-CTC树脂用DMF洗涤2~3次，用DMF溶胀30分钟；
B）称取N端Fmoc保护的氨基酸，加入有机碱DIEA，活化3~5分钟，加入反应柱反应1~3小时；
C）用体积比为1:4的哌啶和DMF混合液（DBLK）脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除；
D）重复上述步骤A、B和C，按照所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列，逐个偶联相应的氨基酸，其中，赖氨酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH，直到序列中最后一个氨基酸偶联结束；
E）脱除赖氨酸Alloc侧链保护基，偶联上Palmitoyl-Glu-OtBu，得到的肽树脂用DCM洗3次，加入12eq 苯基硅烷，反应5分钟，加入0.8eq Pd(PPh3)4，反应60分钟，用茚三酮检测，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除；加入5eq Palmitamide-Glu-OtBu，5eq HOAt，5eq HATU，10eq TMP，偶联2小时，收缩，抽干得到利拉鲁肽变构体树脂；
F）将得到的利拉鲁肽变构体树脂用TFA裂解，反应1~3小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链保护基；
G）对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到粗肽，然后用C8色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到所需要的利拉鲁肽变构体；
H）用HPLC方法检测其纯度和含量，用二级质谱和Edman降解分析其序列。
本发明还提供所述利拉鲁肽变构体在制备用于降低血糖的药物中的用途。
本发明还提供所述利拉鲁肽变构体在制备用于降低体重的药物中的用途。
本发明还提供一种利拉鲁肽变构体缀合物，包含所述PEG修饰基团和所述利拉鲁肽变构体。
采用上述技术方案，通过PEG修饰基团的修饰，提供的利拉鲁肽变构体缀合物，在保留利拉鲁肽生物学活性的同时，大大延长了半衰期，不易被体内的蛋白酶降解，提高了稳定性，可以减少患者的用药次数。
作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团的分子量在2 kDa~20 kDa之间。
作为本发明的进一步改进，一个或者多个PEG修饰基团缀合到利拉鲁肽变构体上，所述PEG修饰基团可以相同，也可以不同。所述PEG修饰基团可以修饰的利拉鲁肽变构体位点包括：
1）Cys的修饰：PEG修饰基团可以通过Cys残基缀合到利拉鲁肽变构体上，以硫醚的形式实现特异性修饰；
2）N端氨基的修饰：采用的PEG修饰基团为mPEG-丙醛，mPEG-丙醛的一个重要特性就是在酸性条件（pH=5.0）下，与α-氨基的耦合具有很高的选择性；
3）侧链羧基的修饰：利拉鲁肽变构体含有谷氨酸、天冬氨酸，谷氨酸和天冬氨酸是很有活性的修饰位点。第一种方法是以mPEG-NH2为原料修饰谷氨酸或天冬氨酸侧链，得到Fmoc-Asp(mPE-NH)-OH或Fmoc-Glu(mPE-NH)-OH，再以这种氨基酸PEG修饰物为原料直接合成利拉鲁肽PEG侧链修饰物；第二种方法是选用烯丙酯保护的谷氨酸和天冬氨酸，肽链组装完毕后直接脱除烯丙酯，再与mPEG-NH2偶联，得到PEG修饰产物；
4）C端羧基的修饰：采用的PEG修饰基团为PEG-NH2，用PEG-NH2在二环己基碳二亚胺或者1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐作用下与C端羧基偶联，得到PEG修饰产物；
5）组氨酸侧链咪唑基的修饰。
作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团选自以下结构：
(CH3)2CH-(OCH2CH2)n- ，CH3(CH2)m-(OCH2CH2)n-，R-(OCH2CH2)n- ，Lys-PEG2 ，
Glu-PEG2 ，Tris-PEG3 ，Biotin-PEG11 。其中，m表示1~6之间的整数；n表示40~120之间的整数；R选自H、（C1~C30）烷基、环（C6~C30）烷基或苯基（C6~C30）烷基；
Lys-PEG2表示以赖氨酸为核的二分支型PEG；Glu-PEG2表示以谷氨酸为核的二分支型PEG；Tris-PEG3表示三分支型PEG；Biotin-PEG11表示末端连接生物素的11个单元PEG。
作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团选自PEG或mPEG。
相应的，本发明还提供一种制备所述利拉鲁肽变构体缀合物的方法，包括如下步骤：
A）称取一定量的所述利拉鲁肽变构体，溶于适当的缓冲溶液中；
B）按一定的PEG修饰基团与利拉鲁肽变构体摩尔比，称取PEG修饰基团，加入上述缓冲溶液中，适当摇匀使PEG修饰基团溶解并与利拉鲁肽变构体反应；
C）用过量的Cys溶液终止反应，RP-HPLC检测反应并纯化得到目标化合物。
作为本发明的进一步改进，所述缓冲溶液选自醋酸-醋酸钠缓冲溶液、磷酸钠盐缓冲溶液、碳酸氢钠、EDTA-NH4Ac缓冲溶液或EDTA-磷酸钠盐缓冲溶液。
作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的摩尔比为3~5；所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的反应时间为0.5~12小时。
本发明还提供所述利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低血糖的药物中的用途。
本发明还提供所述利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低体重的药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的利拉鲁肽变构体保留了利拉鲁肽的生物学活性，延长了半衰期，为患者提供了更多的药物选择余地；本发明在提供利拉鲁肽变构体的基础上，通过PEG修饰基团的修饰，提供的利拉鲁肽变构体缀合物，在保留利拉鲁肽生物学活性的同时，延长了半衰期，不易被体内的蛋白酶降解，提高了稳定性，可以减少患者的用药次数；本发明提供的利拉鲁肽变构体及其缀合物的制备方法简便，降血糖和降体重的效果好，为降低血糖药物和降低体重药物的制备提供了更多的选择，延长了半衰期，提高了稳定性，降低了生产成本，有利于患者负担的减轻。
附图说明
图1为本发明利拉鲁肽变构体的固相合成工艺流程图。
图2为本发明利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5在体外对细胞内cAMP活性的影响。
图3为本发明利拉鲁肽变构体5及其缀合物在体外对细胞内cAMP活性的影响。
图4为本发明利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5降血糖作用实效试验。
图5为本发明利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5缀合物降血糖作用实效试验。
图6为本发明利拉鲁肽变构体5及其缀合物对体重的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中。
Figure 2011102713438100002DEST_PATH_IMAGE001
本文中使用的术语“缀合物”是指多肽或多肽变体与本文所述的修饰基团共价或非共价连接后形成的产物，所述修饰基团包括但不限于上文所述的例子。本文中使用的术语“PEG修饰基团”包括一般意义上所说的PEG（聚乙二醇）和聚乙二醇衍生物。由于PEG是聚合物，是由一定分布范围内的不同聚合度的分子构成，一般用平均分子量来表示聚合物的分子量，具体来说可以是数均分子量或重均分子量。Biotin-PEG11-MAL和MAL-PEG(4)-[PEG(4)-OMe]3购自康肽德生物医药技术有限公司，PEG5000、mPEG10000-MAL、mPEG20000-MAL、PEG30000-MAL、Biotin-PEG30000-MAL、Lys-PEG2-MAL、Tris-PEG3-MAL、PEG40000-MAL、mPEG5000-CH2CH2CHO、SC-mPEG10000和mPEG5000-NH2均购自派格生物医药（苏州）有限公司。
实施例一  利拉鲁肽变构体的固相合成。
使用2-氯三苯甲基氯树脂（2-CTC树脂）类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成利拉鲁肽巯基变体，其步骤为：第一步：2-CTC树脂用DMF洗涤2~3次，用DMF溶胀30分钟；第二步：称取N端Fmoc保护的氨基酸， DIEA为激活剂，活化3~5分钟，加入反应柱反应1~3小时；第三步：用体积比为1：4的哌啶和DMF混合液脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除；第四步：重复第一步至第三步的过程，按照所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列，逐个偶联相应的氨基酸，其中，赖氨酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH，直到序列中最后一个氨基酸偶联结束；第五步：脱除赖氨酸Alloc侧链保护基，偶联上Palmitoyl-Glu-OtBu；得到的肽树脂用DCM洗3次，加入12eq 苯基硅烷，反应5分钟，加入0.8eq Pd(PPh3)4，反应60分钟，用茚三酮方法检测，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除；加入5eq Palmitoyl-Glu-OtBu，5eq PyBOP，6eq HOBt，10eq DIEA，偶联2小时，收缩，抽干得到利拉鲁肽变构体肽树脂；第六步：得到的利拉鲁肽变构体肽树脂用TFA裂解，反应1~3小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链保护基；第七步：对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到粗肽，然后用C8色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到所需要的利拉鲁肽巯基变体；第八步：用HPLC方法检测其纯度和含量，用二级质谱和Edman降解分析其序列。
采用上述方法合成的利拉鲁肽变构体有：
1）N端第1位为Cys的利拉鲁肽变构体1，氨基酸序列为：
Cys-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-
Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
2）N端第4位为Cys的利拉鲁肽变构体2，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Cys-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-
Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
3）N端第7位为Cys的利拉鲁肽变构体3，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Cys-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-
Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
4）N端第8位为Cys的利拉鲁肽变构体4，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Cys-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
5）N端第11位为Cys的利拉鲁肽变构体5，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Cys-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
6）N端第12位为Cys的利拉鲁肽变构体6，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Cys-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
7）C端第1位为Cys的利拉鲁肽变构体7，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-
Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Cys-OH；
8）N端第15位为Cys的利拉鲁肽变构体8，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Cys-Gly-Gln-Ala-Ala-
Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
9）C端第6位为Cys的利拉鲁肽变构体9，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-
Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Cys-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
10）C端第8位为Cys的利拉鲁肽变构体10，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-
Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Cys-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
11）C末端添加Gly的利拉鲁肽变构体11，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-OH；
12）C端第6位为D-Ala的利拉鲁肽变构体12，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-D-Ala-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
13）C端第13位缺失Ala的利拉鲁肽变构体13，氨基酸序列为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。
实施例二  利拉鲁肽变构体1的PEG5000缀合物的制备。
取5 mg 利拉鲁肽变构体1溶解于8 mL 20 mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG5000与利拉鲁肽变构体1摩尔比为3：1的量称取20 mg PEG5000，加入到上述溶液中，适当摇匀而使PEG5000溶解并与利拉鲁肽变构体1混合均匀，在25℃条件下反应2小时，然后用过量的0.5 M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用。用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。PEG5000与利拉鲁肽变构体1摩尔比为3：1是根据多次实验结果总结出来的，可以使利拉鲁肽变构体1修饰完全。
实施例三  利拉鲁肽变构体2的PEG5000缀合物的制备。
取5 mg 利拉鲁肽变构体2溶解于8 mL 20 mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG5000与利拉鲁肽变构体2摩尔比为3：1的量称取20 mg PEG5000，加入到上述溶液中，适当摇匀而使PEG5000溶解并与利拉鲁肽变构体2混合均匀，在25℃条件下反应2小时，然后用过量的0.5 M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用。用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。
实施例四  利拉鲁肽变构体3的mPEG10000缀合物的制备。
称取10 mg 利拉鲁肽变构体3溶解到水中，用碳酸氢钠调pH=7~8，加入3当量的mPEG10000-MAL,在室温下搅拌1~5小时，然后用过量的0.5 M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用；用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物，纯度为98.5%。最终产物以MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）确定分子量。
实施例五  利拉鲁肽变构体4的mPEG20000缀合物的制备。
称取10 mg 利拉鲁肽变构体4溶解到EDTA-NH4Ac缓冲溶液中，调pH=6.9，加入5当量的mPEG20000-MAL，在室温下搅拌1~5小时，然后用过量的0.5 M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用；用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDI-TOF-MS确定分子量。
实施例六  利拉鲁肽变构体4的PEG30000缀合物的制备。
取10 mg利拉鲁肽变构体4溶解于5 mL的磷酸钠盐缓冲液(pH=6.5)，按PEG30000-MAL与PEG30000-MAL摩尔比为4：1的量称取40 mg PEG30000-MAL，加入上述溶液中，适当摇匀而使PEG30000-MAL溶解并与利拉鲁肽变构体4混合均匀，在20℃条件下反应2.5小时，然后用过量的0.5 M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于-20 ℃,然后分离纯化。用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDI-TOF-MS确定分子量。
实施例七  利拉鲁肽变构体4的Biotin-PEG 30000 缀合物的制备。
取10 mg利拉鲁肽变构体4溶解于5 mL的磷酸钠盐缓冲液(pH=6.5)，按Biotin-PEG30000-MAL与利拉鲁肽变构体4摩尔比为4：1的量称取40 mg Biotin-PEG30000-MAL，加入上述溶液中，适当摇匀而使Biotin-PEG30000-MAL溶解并与利拉鲁肽变构体4混合均匀，在20℃条件下反应2.5小时，然后用过量的0.5 M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于-20 ℃,然后分离纯化。用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDI-TOF-MS确定分子量。
实施例八  利拉鲁肽变构体4的Biotin-PEG 11 缀合物的制备。
取10 mg利拉鲁肽变构体4溶解于5mL的磷酸钠盐缓冲液(pH=6.5)，按Biotin-PEG11-MAL与利拉鲁肽变构体4摩尔比为4：1的量称取20 mg Biotin-PEG11-MAL，加入上述溶液中，适当摇匀而使Biotin-PEG11-MAL溶解并与利拉鲁肽变构体4混合均匀，在20℃条件下反应2.5小时，然后用过量的0.5 M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于-20 ℃,然后分离纯化。用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDI-TOF-MS确定分子量为4689.2。
实施例九  利拉鲁肽变构体6的二分支型 PEG 2 缀合物的制备。
称取10 mg 利拉鲁肽变构体6溶解到EDTA-磷酸盐缓冲溶液中，调pH=6.5，加入5当量的Lys-PEG2-MAL（分子量为20kDa）,在室温下搅拌1~5小时，用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应，反应结束后，加入过量的0.5 M半胱氨酸溶液以终止反应，并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDI-TOF-MS确定分子量。
实施例十  利拉鲁肽变构体7三分支型 PEG 3 缀合物的制备。
称取10 mg 利拉鲁肽变构体7溶解到EDTA-磷酸盐缓冲溶液中，调pH=6.5，加入5当量的Tris-PEG3-MAL（分子量为30kDa），在室温下搅拌1~5小时，用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应，反应结束后，加入过量的0.5 M半胱氨酸溶液以终止反应，并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDI-TOF-MS确定分子量。
实施例十一  利拉鲁肽变构体7的PEG(4)-[PEG(4)-OMe] 3 缀合物的合成。
取10 mg利拉鲁肽变构体7溶解于15 mL的磷酸钠盐缓冲液(pH=6.5)，按MAL-PEG(4)-[PEG(4)-OMe]3与肽摩尔比为5：1的量称取40 mg MAL-PEG(4)-[PEG(4)-OMe]3，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀，在20℃条件下反应3.0小时，然后用过量的0.5 M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于-20℃,然后分离纯化。用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDI-TOF-MS确定分子量为5100.6。
实施例十二  利拉鲁肽变构体8的PEG40000缀合物的制备。
称取10 mg 利拉鲁肽变构体8溶解到EDTA-磷酸盐缓冲溶液中，调pH=6.5，加入5当量的PEG40000-MAL，在室温下搅拌1~5小时，用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应，反应结束后，加入过量的0.5 M半胱氨酸溶液以终止反应，用RP-HPLC纯化得到目标化合物。最终产物以MALDI-TOF-MS确定分子量。
实施例十三  利拉鲁肽变构体11的mPEG5000缀合物的制备（N端修饰）。
称取5 mg利拉鲁肽变构体11溶解到水中，加入到醋酸-醋酸钠缓冲溶液调pH=5.0，加入3当量的mPEG5000-CH2CH2CHO，在室温下搅拌2.5小时，然后用过量的0.5 M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用；用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。最终产物以MALDI-TOF-MS确定分子量。
实施例十四  利拉鲁肽变构体12的mPEG10000缀合物的制备（N端修饰）。
称取8 mg利拉鲁肽变构体12溶解到水中，用0.2 M PBS调pH=6.8，加入5当量SC-mPEG10000（mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯）50mg，在室温反应3小时，然后用过量的0.5 M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用，2小时后用HiPrep 26/10脱盐柱脱盐处理，所用缓冲液体系为pH为8.5的25 mM Tris。脱盐以后采用Waters 2695型高效液相色谱仪纯化得到目标化合物。
实施例十五  利拉鲁肽变构体13的mPEG5000缀合物的制备（C端修饰）。
取5 mg 利拉鲁肽变构体13溶解于10 mL 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.0)，按mPEG5000-NH2与利拉鲁肽变构体摩尔比为4：1的量称取20 mg mPEG5000-NH2，加入到上述溶液，适当摇匀而使mPEG5000-NH2溶解并与利拉鲁肽变构体13混合均匀，在室温条件下反应3.5小时，然后用过量的0.5 M半胱氨酸溶液终止反应，最后放置于-20 ℃下为分离纯化备用。用Waters 2695型高效液相色谱仪检测反应并纯化得到目标化合物。
实施例十六  利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5在体外对细胞内cAMP活性的影响。
根据实施例一中提供的合成方法，按照利拉鲁肽的氨基酸序列合成利拉鲁肽。利拉鲁肽的氨基酸序列为：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；将PC-12细胞（肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）培养48小时，弃去培养液，并用缓冲液清洗2~3次，加入1 mL含有1%牛血清蛋白的缓冲液，将利拉鲁肽和利拉鲁肽变构体5分别与浓度为100 μM 的 IBMX共同孵育半小时，弃去培养基，加入盐酸终止酶对cAMP（环腺苷酸）的降解。收集细胞，超声裂解细胞，按BCA检测法测定细胞蛋白含量。按cAMP酶联免疫试剂盒说明进行操作，设立不同浓度的标准品组以建立标准曲线，反应完成后在酶标仪于450 nm波长下测定光吸收值，用该光吸收值在标准曲线上读出对应的cAMP浓度，最后计算样品中cAMP浓度。
所得结果如图2所示，利拉鲁肽呈剂量依赖式地增加PC-12细胞内cAMP含量，增加cAMP最大值（Emax）为161.2±7.2 pmol/100 μg（蛋白），EC50值为1.7×10-9 M。利拉鲁肽变构体5在体外对PC-12细胞内cAMP的影响与利拉鲁肽非常相似。其中利拉鲁肽变构体5增加cAMP最大值（Emax）为152.4±7.8 pmol/100 μg（蛋白）；EC50值为2.1×10-9 M。说明在N端第11位引入半胱氨酸（巯基）的利拉鲁肽变构体5保留了利拉鲁肽本身的生物学活性。 
实施例十七利拉鲁肽变构体5及其缀合物在体外对细胞内cAMP活性的影响。
将PC-12细胞培养48小时，弃去培养液，并用缓冲液清洗2~3次，加入1 mL含有1%牛血清蛋白的缓冲液，将利拉鲁肽变构体5、利拉鲁肽变构体5的PEG2000缀合物、利拉鲁肽变构体5的PEG5000缀合物、利拉鲁肽变构体5的PEG20000缀合物分别与浓度为100 μM 的 IBMX共同孵育半小时，弃去培养基，加入盐酸终止酶对cAMP的降解。收集细胞，超声裂解细胞，按BCA检测法测定细胞蛋白含量。按cAMP酶联免疫试剂盒说明进行操作，设立不同浓度的标准品组以建立标准曲线，反应完成后在酶标仪于450 nm波长下测定光吸收值，用该光吸收值在标准曲线上读出对应的cAMP浓度，最后计算样品中cAMP浓度。
所得结果如图3所示 ，实验结果表明，利拉鲁肽变构体5剂量依赖式地增加PC12细胞内cAMP含量，其增加cAMP最大值（Emax）为103.9±1.5 pmol/100 μg（蛋白），EC50值为1.3x10-9 M。PEG化修饰呈分子量（2000-20000）-依赖式地平行右移量效关系曲线，降低利拉鲁肽变构体5生物活性。随着PEG分子量的增大，它们EC50值分别为1.1x10-9, 1.2x10-8,和1.3x10-7 M。其中PEG2000 到PEG5000  PEG化修饰几乎不影响利拉鲁肽变构体5的活性，而PEG20000则降低了利拉鲁肽变构体5的生物活性约20%。
实施例十八利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5降血糖作用时效试验。
雄性昆明小鼠（体重27~32 g），实验前小鼠不禁食禁水,随机分为3组,每组6只。分别皮下单次注射等体积的生理盐水（10 mL/kg）、利拉鲁肽（0.6 mg/kg）和利拉鲁肽变构体5（0.6 mg/kg）。注射后0，1， 4，8，12，14，16小时尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以不同时间点的血糖值为纵坐标，时间为横坐标，建立降血糖作用的时效曲线，计算出利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5降血糖作用的生物半衰期。经半胱氨酸置换后的利拉鲁肽变构体与利拉鲁肽的生物半衰期分别为11.5±0.2小时和11.0±0.2小时。表明利拉鲁肽变构体5与利拉鲁肽具有相当的生物半衰期，略有延长。
实施例十九利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5缀合物降血糖作用时效试验。
取雄性昆明小鼠（体重22~25 g），实验前小鼠不禁食禁水,随机分为4组，每组6只。分别皮下单次注射利拉鲁肽变构体5（10 μg/kg）、利拉鲁肽变构体5的PEG2000缀合物（10 μg/kg）、利拉鲁肽变构体5的PEG5000缀合物（10 μg/kg）和利拉鲁肽变构体5的PEG20000缀合物（12 μg/kg）。注射后0, 1，2，4，8，12，18，24，36，48，72，96，120，148小时尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以不同时间点的血糖值为纵坐标，时间为横坐标，建立降血糖作用的时效曲线，计算出利拉鲁肽变构体5和利拉鲁肽变构体5的三种PEG缀合物降血糖作用的生物半衰期。结果如图5所示，利拉鲁肽变构体5、利拉鲁肽变构体5的PEG2000缀合物、利拉鲁肽变构体5的PEG5000缀合物和利拉鲁肽变构体5的PEG20000缀合物的生物半衰期分别为11.5±0.2小时、20.4 ±0.5小时、48.3 ±0.8小时和121.1±4.0小时(P > 0.05)。等效剂量的时效关系研究结果表明，聚乙二醇化（PEG20000）利拉鲁肽变构体5延长利拉鲁肽变构体5降血糖作用时间达11倍左右。
实施例二十利拉鲁肽变构体5及其缀合物对体重的影响。
雄性健康豚鼠20只，每只体重300 g左右，分5组，即生理盐水组、利拉鲁肽变构体5、利拉鲁肽变构体PEG2000缀合物、利拉鲁肽变构体5 PEG5000缀合物和利拉鲁肽变构体5 PEG20000缀合物。隔天分别对相应组别的豚鼠皮下注射生理盐水 (1 mL/kg)、利拉鲁肽变构体5 (0.6 mg/kg)、利拉鲁肽变构体PEG2000缀合物(0.6 mg/kg)、利拉鲁肽变构体5 PEG5000缀合物(0.6 mg/kg)和利拉鲁肽变构体5 PEG20000缀合物(0.6 mg/kg) ，以时间为横坐标，豚鼠体重为纵坐标作图，如图6所示，期间生理盐水组豚鼠体重持续增长。与生理盐水组比较，连续2次给予同等剂量的利拉鲁肽变构体5、利拉鲁肽变构体5 PEG2000缀合物、利拉鲁肽变构体5 PEG5000缀合物和利拉鲁肽变构体5 PEG20000缀合物5周后，豚鼠体重降低分别为约3%、5%、9%和12%、。结果可以看出给予同等剂量的利拉鲁肽变构体5 PEG缀合物后，其降低豚鼠体重作用效果比利拉鲁肽变构体5强，其中以利拉鲁肽变构体5 PEG20000缀合物降低豚鼠体重作用效果最显著。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (18)

1.一种利拉鲁肽变构体，其特征在于：氨基酸序列为：X1-Ala-Glu-X2-Thr-Phe-X3-X4-
Asp-Val-X5-X6-Tyr-Leu-X7-Gly-Gln-Ala-X8-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-X9-Trp-X10-Val-Arg-Gly-Arg-X11；
其中：X1为His或Cys；X2为Gly或Cys；X3为Thr或Cys；X4为Ser或Cys；X5为Ser或Cys；X6为Ser或Cys；X7为Glu或Cys；X8为Ala或删除；X9为Ala或Cys；X10为Leu或Cys或D-Ala；X11为Gly或Cys或Gly-Gly。
2.根据权利要求1所述的利拉鲁肽变构体，其特征在于：氨基酸序列为：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Cys-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，所述X5为Cys。
3.根据权利要求1所述的利拉鲁肽变构体，其特征在于：氨基酸序列为：His-Ala-Glu-Gly-
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-
glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，所述X8删除。
4.根据权利要求1所述的利拉鲁肽变构体，其特征在于：氨基酸序列为：His-Ala-Glu-Gly-
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-
glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-D-Ala-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，所述X10为D-Ala。
5.根据权利要求1所述的利拉鲁肽变构体，其特征在于：氨基酸序列为：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly，所述X11为Gly-Gly。
6.一种制备权利要求1所述的利拉鲁肽变构体的方法，其特征在于：包括如下步骤：
A）2-CTC树脂用DMF洗涤2~3次，用DMF溶胀30分钟；
B）称取N端Fmoc保护的氨基酸，加入有机碱DIEA，活化3~5分钟，加入反应柱反应1~3小时；
C）用体积比为1:4的哌啶和DMF混合液脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮法检测Fmoc是否脱除完全；
D）重复上述步骤A、B和C，按照所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列，逐个偶联相应的氨基酸，其中，赖氨酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH，直到序列中最后一个氨基酸偶联结束；
E）脱除赖氨酸Alloc侧链保护基，偶联上Palmitoyl-Glu-OtBu，得到利拉鲁肽变构体树脂；
F）将得到的利拉鲁肽变构体树脂用TFA裂解，反应1~3小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链保护基；
G）对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到粗肽，然后用C8色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到所需要的利拉鲁肽变构体；
H）用HPLC方法检测其纯度和含量，用二级质谱和Edman降解分析其序列。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的利拉鲁肽变构体在制备用于降低血糖的药物中的用途。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的利拉鲁肽变构体在制备用于降低体重的药物中的用途。
9.一种利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于：包含PEG修饰基团和权利要求1至5中任一项所述的利拉鲁肽变构体。
10.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于：所述PEG修饰基团通过Cys、N端氨基、侧链羧基、C端羧基或组氨酸侧链咪唑基缀合到利拉鲁肽变构体上。
11.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于：所述PEG修饰基团的分子量在2 kDa~20 kDa之间。
12.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于：所述PEG修饰基团选自以下结构：(CH3)2CH-(OCH2CH2)n- ，CH3(CH2)m-( OCH2CH2)n- ，R-(OCH2CH2)n- ，
Lys-PEG2 ，Glu-PEG2 ，Tris-PEG3 ，Biotin-PEG11 ；
其中，m表示1~6之间的整数；n表示40~120之间的整数；R选自H、（C1~C30）烷基、环（C6~C30）烷基或苯基（C6~C30）烷基；Lys-PEG2表示以赖氨酸为核的二分支型PEG；Glu-PEG2表示以谷氨酸为核的二分支型PEG；Tris-PEG3表示三分支型PEG；Biotin-PEG11表示末端连接生物素的11个单元PEG。
13.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于：所述PEG修饰基团选自PEG或mPEG。
14.一种制备权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物的方法，其特征在于：包括如下步骤：
A）称取一定量的所述利拉鲁肽变构体，溶于适当的缓冲溶液中；
B）按一定的PEG修饰基团与利拉鲁肽变构体摩尔比，称取PEG修饰基团，加入上述缓冲溶液中，适当摇匀使PEG修饰基团溶解并与利拉鲁肽变构体反应；
C）用过量的Cys溶液终止反应，RP-HPLC检测反应并纯化得到目标化合物。
15.根据权利要求14所述的利拉鲁肽变构体缀合物的方法，其特征在于：所述缓冲溶液选自醋酸-醋酸钠缓冲溶液、磷酸钠盐缓冲溶液、碳酸氢钠、EDTA-NH4Ac缓冲溶液或EDTA-磷酸钠盐缓冲溶液。
16.根据权利要求14所述的利拉鲁肽变构体缀合物的方法，其特征在于：所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的摩尔比为3~5；所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的反应时间为0.5~12小时。
17.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低血糖的药物中的用途。
18.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低体重的药物中的用途。
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