CN109432394B - 醋酸奥曲肽注射液药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及醋酸奥曲肽注射液药物组合物及其用途。具体的,本发明涉及的醋酸奥曲肽注射液药物组合物其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇40~50g、乳酸3~4g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml等。本发明还涉及醋酸奥曲肽产品及其制备方法。本发明还涉及测定醋酸奥曲肽或其组合物中的杂质例如氧化降解杂质的方法。本发明呈现如说明书所述优异技术效果,例如,本发明原料药在制备过程中生产效率显著的比现有方法更高,注射液的制备过程中药物损失量显著更少,并且在长期稳定性留样中杂质增长速度显著的比现有技术方法更低。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,更具体地,本发明公开了一种醋酸奥曲肽注射液药物组合物和醋酸奥曲肽,以及该醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制法,本发明还涉及所述醋酸奥曲肽注射液的制药用途。本发明制备的醋酸奥曲肽注射液药物组合物和醋酸奥曲肽具有优异的性质。
背景技术
醋酸奥曲肽(Octreotide Acetate)是由八个氨基酸组成的合成多肽,其化学名为:D-苯丙氨酰-L-半 胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-N-[(1R,2R)-2-羟基-1-(羟甲基)丙基]-L-半胱氨酰胺环 (2→7)-二硫键醋酸盐,其英文化学名为:L-Cysteinamide,D-phenylalanyl-L-cysteinyl-L-phenylalanyl-D- tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-N-[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)propyl]-,cyclic(2→7)-disulfide;[R-(R*, R*)]acetate salt,CAS:83150-76-9。
自1973年Brazeau等从羊下丘脑中分离出生长抑素(Somatostatin,ST)以来,研究者对ST的产生、 分布及生物活性作了大量研究,并测定了它的一级结构。
随着放射免疫检测和免疫细胞化学的进展,发现ST族激素在体内广泛分布。如中枢神经系统、下丘脑、周围神经系统、胰岛D细胞、胃肠道上皮腺上皮和轴突细胞等。在垂体前叶,ST抑制生长激素和促甲状腺激素的释放。在胰腺,ST抑制胰岛和胰高血糖素的分泌。ST对胃肠道系统影响广泛,抑制激素,如胃泌素、胰泌素、血管活性肠肽和其它激素的释放,抑制胃酸、胃蛋白酶的分泌,降低内脏血流量和肠活动,降低碳水化合物吸收,增加大肠对水和电解质的吸收。ST还具有细胞保护作用等。因而被认为能够用于治疗某些胃肠道及外科疾病。但ST的体内半衰期非常短,仅有2-3min,需连续静注,并且ST无器官特异性,停药后易引起生长激素等过度分泌,长期应用ST可导致肠道吸收不良和葡萄糖耐受性降低。因此ST的临床应用一直受到限制。
在1982年,瑞士Sandoz药厂(现为Novartis Co.)合成了新一代长效型生长抑素类似物醋酸奥曲肽(Octreotide,Sandostatin,SMS201-995,以下简称奥曲肽)。它是一个与ST相似,并除去了ST中的6个氨基酸的肽链。它可与广泛存在于中枢神经系统、垂体和胰腺β细胞等处的ST受体结合产生生物学效应,而且抑制生长激素(GH)、胰岛素、胰高血糖素、胃酸分泌的能力均比ST强,特异性也较高。同时,由于1,4位L-氨基酸分别被相应D-氨基酸取代,8位为氨基L醇,故奥曲肽不易被蛋白酶迅速水解,并延长了体内半衰期,t1/2为80-160min,使用时不需连续静注。
因此,奥曲肽除具有ST类似物的抑制功能外,还具有下列特点:
(1)对内分泌的抑制作用更强,对生长激素,胰离糖素和胰岛素的抑制作用分别是ST的45倍、11倍和1.3倍。
(2)半衰期长:皮下注射半衰期为2h。
(3)停药后不发生反跳性高分泌。
所以奥曲肽近年来被用于多种疾病的治疗,且副作用相对减少,已广泛应用于消化道肿瘤、上消化道出血、急性胰腺炎、转移性类癌、肢端肥大症等病的治疗。
奥曲肽于1988年在新西兰首先上市,上市剂型为注射剂,1989年美国FDA批准在美国上市。醋酸奥曲肽注射液,临床使用可静脉注射、皮下注射、静脉滴注(滴注给药时间可达12小时以上),其储存方式为2~8℃,避光保存,在室温中(20~30℃)可保存14天,由此可见醋酸奥曲肽溶液稳定性是其产品质量优劣的重要衡量标准。
有一些文献公开了醋酸奥曲肽的制备方法。例如,
CN103965291A(专利申请号201410228795.1)公开了奥曲肽、奥曲肽醋酸盐的制备方法。该奥曲肽的制备方法包括下述步骤:采用高效液相反相色谱法将奥曲肽粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐,即可;高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。本发明将反相纯化和反相脱盐联用,设计出聚合物填料苯乙烯-二乙烯基苯的最新应用,可以大批量制备奥曲肽和奥曲肽醋酸盐。
CN103965291A(专利申请号201010165270.X)公开了一种采用固相合成法制备奥曲肽的方法,包括如下步骤:(1)、将N-芴甲氧羰基-O-叔丁基苏氨醇连接到作为载体的树脂上获得N-芴甲氧羰基-O-叔丁基苏氨醇树脂;(2)、按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法,根据奥曲肽的序列,将保护氨基酸按C端至N端的顺序逐个偶联到步骤(1)所得树脂上获得奥曲肽八肽树脂;(3)、使用裂解剂将八肽从所述奥曲肽八肽树脂上切下,得到线性粗肽;(4)、步骤(3)所得线性粗肽经氧化反应形成二硫键,经制备高效液相色谱纯化即得所述奥曲肽,其特征在于:步骤(4)中,所述氧化反应在pH=7.0~7.5以及氧化剂H2O2的存在下进行,其中H2O2与线性粗肽的投料摩尔比为7~9∶1。据信该发明采用双氧水来氧化线性粗肽获得奥曲肽,仅需1~3小时氧化反应即完全,与传统的空气氧化法相比,反应时间大大缩短,且奥曲肽产品收率大幅提高,适于大规模生产奥曲肽及其盐。
CN103102390A(专利申请号201110352635.4)公开了一种奥曲肽的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤1:获得氨基酸序列为D-Phe-Cys的二肽;以树脂为载体,按照固相法合成六肽树脂;所述六肽树脂中氨基酸残基序列为Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol;在碱性条件下,取所述二肽与所述六肽树脂发生缩合反应,切肽制得线性八肽;所述线性八肽的氨基酸残基序列为D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol;步骤2:取所述线性八肽溶于过量的N,N-二甲基甲酰胺的水溶液中,调整pH值为6.8~8.0,加入过量的氧化剂,在18~30℃环化2~3h,调整pH值为3.5~5.0,纯化后,制得结构如式Ⅰ所示的奥曲肽;其中,Thr-ol是苏氨醇,Cys是半胱氨酸,Thr是苏氨酸,Lys是赖氨酸,D-Trp是D型色氨酸,Phe是苯丙氨酸,D-Phe是D型苯丙氨酸。据信该发明提高了奥曲肽的收率及纯度。
CN1355173A(专利申请号00134258.4)公开了制备醋酸奥曲肽的方法,其包括:a).将下式三肽R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-OH与下式五肽R3-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-NH-CH(CH2-OR6)- CH(OR5)-CH3反应生成下式八肽R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)- NH-CH(CH2-OR6)- CH(OR5)-CH3在上述三肽、五肽及八肽中,R1=BOC;R2=Bzl、4-Me-Bzl或4-MeO-Bzl;R3=Fmoc;R4=Z或2-Cl-Z;R5=Bzl;R6=CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-或CH3CH2CH2CH2-。b).用无水氟化氢脱除a)中所得八肽上所有侧链保护基,得到下式还原型奥曲肽,D-Phe-Cys-Phe-D-Try-Lys-Thr-Cys-Thr-Ol;c)将b)中所得八肽的水溶液在空气中搅拌自然氧化,得到奥曲肽,经过纯化后,奥曲肽水溶液用碱性水溶液调pH值至7.0-8.0;d)将c)中pH值为7.0-8.0的奥曲肽溶液注入非极性柱中,用乙腈水溶液洗脱,合并洗脱液,加入适量冰醋酸,得醋酸奥曲肽,如需要,所得醋酸奥曲肽经冷冻干燥,得醋酸奥曲肽干粉。
CN1490330A(专利申请号02137521.6)公开了一种醋酸奥曲肽生产工艺,其特征在于:由下列工艺步骤组成,取Boc-Thr(Ac)-Wang树脂装入反应容器中,加入TFA与二氯甲烷的混合液反应,洗涤后加三乙胺与二氯甲烷混合液反应,加入Fmoc-Cys(Trt)-OH,TBTU,HOBt,用接肽试剂溶解,卡氏法检测氨基为阳性用接肽试剂补接后至卡氏法检测氨基为阴性,加入封头试剂、脱帽试剂,洗涤,加Fmoc-Thr(tBu)-OH,TBTU,HOBt,加Fmoc-Lys(Boc)-OH,TBTU,HOBt,溶解,加Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,TBTU,HOBt,接肽试剂溶解,加Fmoc-Phe-OH,TBTU,HOBt,加入反应容器,洗涤抽干,加Fmoc-Cys(Trt)-OH,TBTU,HOBt,加Fmoc-D-Phe-OH,TBTU,HOBt,干燥得八肽树脂,八肽树脂中加入脱侧链试剂,乙醇,硼氢化钠和乙醇溶液,乙醇洗涤,加醋酸及滴加NHOH至pH值7.8,用冰醋酸调至pH值5.5,滤液分批经纯化后冻干得白色疏松块状成品。据信该发明的优点利用硼氢化钠还原取代价格昂贵的L-Thr(ol),可大大降低醋酸奥曲肽生产合成的成本。
CN1569890A(专利申请号200410010833.2)公开了一种醋酸奥曲肽的固相合成方法,过程是:合成八肽;将八肽制成水溶液在空气中自然氧化后制成奥曲肽;向奥曲肽水溶液中加入冰醋酸后冻干,制成醋酸奥曲肽冻干粉;其特征在于,所说的合成八肽的过程是:将芴甲氧羰基苏胺醇与对羧基苯甲醛反应生成芴甲氧羰基苏胺醇对羧基苯缩醛,将其键合在高分子树脂载体上,然后按顺序与保护氨基酸残基依次键合后得到八肽树脂,将八肽从树脂上切落。据信该发明合成工艺简单,容易操作,工艺时间缩短,反应配比小,节约原料,降低了成本,而且产率和纯度提高,副反应和副产物少,便于纯化,有益于大批量生产。
CN1810829A(专利申请号200510002874.1)公开了一种醋酸奥曲肽的制备方法,该方法,包括以下步骤:1)用固相合成法合成具有D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr氨基酸残基序列的直链八肽;2)氧化直链八肽,得到氧化型奥曲肽;3)将氧化型奥曲肽在醋酸盐溶液中经转盐和纯化后,得到醋酸奥曲肽。本发明的醋酸奥曲肽的制备方法中,全部采用DMF,HOBT/HBTU和DIEA进行接肽反应,具有操作简便,副反应少的优点,用此方法可达到最小保护策略,并可进行大量的合成。据信该发明具有成本低,收率高的优点,在醋酸奥曲肽的工业化生产中将具有广阔的应用前景。
CN1923849A(专利申请号200510029221.2)公开了一种固相多肽合成奥曲肽的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:以2-氯-三苯甲基树脂、三苯甲基树脂作树脂、4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂为起始原料,按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸,获得保护八肽树脂,其间依次脱去Fmoc-保护基团,用TBTU或HBTU及HOBT为缩合剂进行接肽反应,得保护的还原型八肽树脂后,同步进行脱侧链保护基团及切肽,获得还原型奥曲肽,并在pH7-11的条件下用空气氧化,获得奥曲肽粗品,再经C18(或C8)柱分离纯化,冷冻干燥后,制得奥曲肽精品。据信该发明的方法,具备规模化生产能力,工艺稳定,原辅材料来源方便,生产周期短,收率高,质量稳定,生产成本低,接肽收率高,避免使用氟化氢等剧毒试剂,三废污染少,采用C18(或C8)柱进行分离纯化。
CN103351426A(专利申请号201310333598.1)公开了一种醋酸奥曲肽的多肽合成方法,其特征在于,包括如下步骤:以氯甲基树脂为起始原料,将Boc-Thr(tBu)-OH制备成铯盐,按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸,依次为:Boc-Cys(Trt)-OH、Boc-Thr(tBu)-OH、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Boc-D-Trp-OH、Boc-Phe-OH、Boc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH,获得保护八肽树脂,其间依次用HCl/异丙醇脱去Boc-保护基团,用DIC、HOBT进行接肽反应,用钯碳/氢气还原,同时将肽链切落,获得还原型奥曲肽,在pH7.8-9的条件下通空气使二硫键成环,获得奥曲肽粗品,再采用独特的流动相经C18柱分离纯化,制得醋酸奥曲肽精品。据信该发明方法不采用苏氨醇、Fmoc-苏氨醇,生产成本极低,具备规模化生产能力,工艺稳定,原辅料来源方便,生产周期短,接肽收率高,质量稳定,避免使用氟化氢,三氟乙酸等剧毒试剂,三废污染少。
CN106543269A(专利申请号201610938844.X)公开了一种奥曲肽工业化生产的合成方法,其特征在于:该合成方法依次包括以下步骤:第一步,以氨甲基树脂为起始树脂,将原料Fmoc-Thr-x利用缩合试剂HOBT与DIC偶联到树脂上,生成Fmoc-Thr-x-AM Resin,其中,所述氨甲基树脂的替代度为0.55~0.65mmol/g,投入的所述Fmoc-Thr-x、HOBT以及DIC的摩尔量均为所需合成的奥曲肽的摩尔量的2~3倍;然后按照顺序依次将氨基酸Cys、Thr、Lys、D-Trp、Phe、Cys、D-Phe逐个偶联到Fmoc-Thr-x-AM Resin上,得到奥曲肽肽树脂;所述Fmoc-Thr-x的化学结构式为;第二步,向所述奥曲肽肽树脂中加入裂解液,搅拌均匀裂解2~3h,其中,奥曲肽肽树脂与裂解液的配比为向每1g奥曲肽肽树脂中加入10ml裂解液;裂解完成后,过滤,将滤液缓慢加入预先冰冻的无水乙醚中沉降20~40min后离心得到奥曲肽线性粗肽;第三步,将所述奥曲肽线性粗肽溶解到TFA/水混合溶液中,然后放入35℃~38℃的水浴或加热套中加热2~3h,使得奥曲肽线性粗肽在HPLC图谱中的峰型单一,其中,所述奥曲肽线性粗肽与TFA/水混合溶液的配比为向每1g奥曲肽线性粗肽中加入300ml的TFA/水混合溶液,TFA/水混合溶液中TFA的体积百分含量为5‰;第四步,向所述第三步加热后的溶解有奥曲肽线性粗肽的TFA/水混合溶液中加入DMSO后氧化1~1.5h,加入的DMSO的体积占溶解有奥曲肽线性粗肽的TFA/水混合溶液的总体积5~8%,然后,HPLC检测环化终点,纯化分离得到奥曲肽精制品。
另外,有一些文献公开了醋酸奥曲肽药物组合物的制备方法。例如,
CN104667258A A(专利申请号201510124285.4)公开了一种醋酸奥曲肽片剂及其制备方法,其由醋酸奥曲肽纳米粒与药学上可接受的片剂辅料制成,所述醋酸奥曲肽纳米粒中包含醋酸奥曲肽、酶抑制剂以及高分子材料。本发明的醋酸奥曲肽片剂可以显著的延长药物作用时间、且相对于注射剂型其用药方便,提高了患者的顺应性,同时由于包覆了高分子化合物并以固体形式存在,醋酸奥曲肽的保质期限显著延长。
CN102525927A(专利申请号201110456620.2)公开了一种醋酸奥曲肽脂质体前体及制备方法。该前体脂质体中含有醋酸奥曲肽、负电磷脂、冻干保护剂,尚可以含有适量其它脂质,包括磷脂酰胆碱、胆固醇,也可以根据需要加入抗氧剂、pH调节剂等成分醋酸奥曲肽与负电磷脂的摩尔比小于1:1,负电磷脂与冻干保护剂的质量之比为1:1~1:10。发明所采用的工艺为叔丁醇-水共溶剂冷冻干燥法。将冻干品水化后得到的醋酸奥曲肽脂质体/胶束的包封率可达50%以上,并且冻干品和水化所得的醋酸奥曲肽脂质体/胶束都具有良好的稳定性,解决了蛋白质多肽类药物在制备成脂质体/胶束制剂时难以包载的问题。据信该制备方法简单易行,适合工业化大生产。
CN101647773A(专利申请号200910074427.5)公开了一种醋酸奥曲肽注射液,含有醋酸奥曲肽、甘露醇、吐温-80和柠檬酸,其中醋酸奥曲肽、甘露醇、吐温-80和柠檬酸的用量按重量比为1.2∶8~12∶0.001~0.0015∶0.1~0.5。据信该发明公开的醋酸奥曲肽注射液具有稳定性好的优点,可以在常温下放置6个月,不需避光。
CN102526700A(专利申请号201110458284.5)公开了一种注射用醋酸奥曲肽冻干组合物,包括醋酸奥曲肽、甘露醇和适量的缓冲物质,所述醋酸奥曲肽、甘露醇的质量比为1:450-500。所述的缓冲物质为乳酸和碳酸氢钠也可以为酒石酸和酒石酸钠。本发明还提供该组合物的制备方法。本发明提供的组合物采用无菌技术生产,通过药液配置过程最佳pH范围以及配制最佳温度的技术攻关提高了产品稳定性,最后制备为冻干品,采用速冻方式进行预冻,成品有关物质含量低、复溶性好、室温保存时间长达2个月,冷藏有效期2年,方便产品运输配送,临床配伍使用溶液稳定性好,局部注射刺激性低,为临床提供了安全、有效、质量优质可控的供注射用醋酸奥曲肽冻干组合物。
CN104689297A(专利申请号201510124765.0)公开了一种醋酸奥曲肽冻干粉针剂及其制备方法。所述醋酸奥曲肽冻干粉针剂由醋酸奥曲肽、叔丁醇、甘露醇、右旋糖苷以及维生素C制成。其制备方法包括如下步骤:1)将维生素C、甘露醇、右旋糖酐、叔丁醇以及醋酸奥曲肽依次加入纯化水中,搅拌使其完全溶解;2)将制得的药液灌装于安瓿瓶中,冻干。本发明获得的醋酸奥曲肽冻干粉针剂的保质期大大延长,稳定性增高,制备方法简单。
CN102416001A(专利申请号201110409545.4)公开了注射用醋酸奥曲肽冻干粉针剂,其由醋酸奥曲肽为活性成分,甘露醇为冻干赋形剂,柠檬酸为调节剂,其特征在于,所述注射用醋酸奥曲肽冻干粉针剂的pH值为5.5~5.7。据信该发明制备的醋酸奥曲肽冻干粉针剂能够迅速溶解,溶解度好。
CN103932996A(专利申请号201410206599.4)公开了一种注射用醋酸醋酸奥曲肽冻干组合物及其制备方法,所述的冻干组合物中含有醋酸奥曲肽、氨丁三醇和马来酸;制备方法为:称取醋酸奥曲肽、氨丁三醇,加入冷至10-20℃的注射用水中,搅拌溶解,采用马来酸调节药液pH=4.0~5.0,过滤,灌装,冻干。与现有技术相比,本发明质量稳定,辅料种类少,制备工艺简单。
在国内上市的醋酸奥曲肽注射液原研产品是诺华的善宁®(Sandostatin®),其药品说明书上记载的组成成分为醋酸奥曲肽、乳酸、甘露醇、碳酸氢钠、注射用水,以例如CN102526700B所载实施例6配方制成溶液型注射液。
此外,CN106860854A(中国专利申请号2017102598954)公开了一种醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇40~50g、乳酸3~4g、蔗糖1~3g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml,据信该发明制得的醋酸奥曲肽注射液药物组合物呈现如说明书所述优异技术效果。
然而,已经发现,在奥曲肽产品特别是其溶液型注射液仍然存在一些期待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种制备醋酸奥曲肽或其注射液药物组合物的方法并能够克服现有技术存在的相关技术问题。本发明的另一目的在于提供一种制备醋酸奥曲肽药物组合物的方法。已经出人意料的发现,使用本发明方法和配方制备得到的本发明醋酸奥曲肽及其药物组合物,能够获得一种或者多种技术效果,本发明基于此类发现而得以完成。
为此,本发明第一方面提供了一种制备醋酸奥曲肽的方法,包括如下步骤:
(a)以氯甲基树脂为起始原料,将Boc-Thr(tBu)-OH制备成铯盐,按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸,依次为:Boc-Cys(Trt)-OH、Boc-Thr(tBu)-OH、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Boc-D-Trp-OH、Boc-Phe-OH、Boc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH,获得保护八肽树脂,其间依次用HCl/异丙醇脱去Boc-保护基团,用DIC、HOBT为缩合剂进行接肽反应;
(b)用钯碳/氢气还原,同时将肽链切落,获得还原型奥曲肽;
(c)在pH7.8-9的条件下通空气使二硫键成环,获得奥曲肽粗品;
(d)奥曲肽粗品经C18柱分离纯化,制得醋酸奥曲肽精品。
根据本发明第一方面任一实施方案所述方法,其中步骤(c)中,二硫键成环的操作步骤为:将还原型奥曲肽粗品溶于水,在搅拌下滴加2mol/L氨水至pH7.8-9,室温通空气24-36小时使二硫键成环,加冰醋酸,加活性碳,过滤,得奥曲肽粗品。
根据本发明第一方面任一实施方案所述方法,其中在进行二硫键成环的过程中,所用的空气预先依次通过饱和氢氧化钙溶液和2.5M硫酸溶液处理。
根据本发明第一方面任一实施方案所述方法,其中步骤(c)中,二硫键成环的操作步骤为:将还原型奥曲肽用3~6倍的50%冰醋酸溶解,然后用纯化水稀释至含冰醋酸25%,搅拌均匀后过滤,得滤液;在搅拌下向该滤液中滴加饱和I2(碘,其量为还原型奥曲肽的1.5~2.0摩尔倍)/冰醋酸溶液,至溶液呈红棕色,继续搅拌30min,再加入用焦亚硫酸钠和碳酸氢钠两者共同饱和的水溶液(其中焦亚硫酸钠的量为还原型奥曲肽的0.02~0.03摩尔倍)至红棕色消失;减压浓缩得到经二硫键形成环的奥曲肽。已经出人意料地发现,在酸性条件下采用碘对还原型奥曲肽进行二硫键成环氧化,并在此过程中添加辅助剂焦亚硫酸钠和碳酸氢钠后,可使产物中的氧化降解杂质的含量显著降低。并且,与原有的在氨水环境中采用空气氧化所得产物在各个技术指标方面未变劣甚至更优,特别是反应时间显著缩短,生产效率显著提高。
根据本发明第一方面任一实施方案所述方法,其中,依次连接具有保护基团的氨基酸,获得保护八肽树脂,其间依次脱去Boc-保护基团的方法包括如下步骤:
(1)Boc-Thr(tBu)-OCs的制备
使Boc-Thr(tBu)-OH溶于甲醇与水中,另取碳酸铯加水溶解至澄清,搅拌下加入上述Boc-Thr(tBu)-OH溶液,溶液pH7.5,减压浓缩至干,得糖浆状残留物为Boc-Thr(tBu)-OCs;[在本步骤的一个实施方案中,碳酸铯的摩尔数为Boc-Thr(tBu)-OH的1~5倍]
(2)Boc-Thr(tBu)-O-树脂的制备
取氯甲基树脂,用DMF浸泡使树脂溶胀,加上述糖浆状残留物Boc-Thr(tBu)-OCs和DMF使进行反应;过滤,树脂用DMF洗涤二次,纯化水洗涤,无水乙醇洗涤,减压干燥,得Boc-Thr(tBu)-O-树脂[在本步骤的一个实施方案中,Boc-Thr(tBu)-OCs的摩尔数为树脂的1~3倍;在一个实施方案中,氯甲基树脂与Boc-Thr(tBu)-OCs的反应温度:40-65℃,反应时间:36-72小时];
(3)Boc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备:
在步骤(2)的Boc-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇溶液与DCM,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干,再加10%三乙胺的DCM溶液(体积比)反应,抽干,DCM洗涤;加入Boc-Cys(Trt)-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤,抽干,即得[在一个实施方案中,脱除Boc-基采用2mol/L HCl/异丙醇溶液,HCl浓度为1mol/L~9mol/L;2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍,例如2.5~5.5倍];
(4)Boc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(3)的Boc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇溶液与DCM,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Boc-Thr(tBu)-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干,即得[在一个实施方案中,脱除Boc-基采用2mol/L HCl/异丙醇溶液,HCl浓度为1mol/L~9mol/L;2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍,例如2.5~5.5倍];
(5)Boc-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(4)的Boc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇溶液与DCM,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤,抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Boc-Lys(Fmoc)-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤,抽干,即得[在一个实施方案中,脱除Boc-基采用2mol/L HCl/异丙醇溶液,HCl浓度为1mol/L~9mol/L;2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍,例如2.5~5.5倍];
(6)Boc-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(5)的Boc-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇溶液与DCM,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM洗涤二抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Boc-D-Trp-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次,抽干,即得[在一个实施方案中,脱除Boc-基采用2mol/L HCl/异丙醇溶液,HCl浓度为1mol/L~9mol/L;2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍,例如2.5~5.5倍];
(7)Boc-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(6)的Boc-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇与DCM与乙二硫醇的混合溶液,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM洗涤,抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Boc-Phe-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤,抽干,即得[在一个实施方案中,脱除Boc-基采用2mol/L HCl/异丙醇溶液与乙二硫醇的混合溶液,HCl浓度为1mol/L~9mol/L;2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍,例如2.5~5.5倍];
(8)Boc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys((tBu)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(7)的Boc-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇与DCM与乙二硫醇的混合溶液,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM洗涤,抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Boc-Cys(Trt)-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,DMF、无水甲醇、DMF洗涤,抽干,即得[在一个实施方案中,脱除Boc-基采用2mol/L HCl/异丙醇溶液与乙二硫醇的混合溶液,HCl浓度为1mol/L~9mol/L;2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍,例如2.5~5.5倍];
(9)Fmoc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(8)Boc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys((tBu)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇与DCM与乙二硫醇的混合溶液,反应,抽干,用DCM、无水甲醇、DCM洗涤,抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Fmoc-D-Phe-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,DMF、无水甲醇、DMF洗涤,抽干,即得[在一个实施方案中,脱除Boc-基采用2mol/L HCl/异丙醇溶液与乙二硫醇的混合溶液,HCl浓度为1mol/L~9mol/L;2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍,例如2.5~5.5倍];
(10)Fmoc-D-Phe-Cys(SH)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr-Cys(SH)-Thr-O-树脂的制备
在步骤(9)的Fmoc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇与DCM与乙二硫醇的混合溶液,反应,抽干,用DCM、无水甲醇、DCM洗涤,抽干;再用无水甲醇洗涤十次,抽干后,放入真空干燥器中干燥,得八肽树脂[在一个实施方案中,脱除Boc-基采用2mol/L HCl/异丙醇溶液与乙二硫醇的混合溶液,HCl浓度为1mol/L~9mol/L;2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍,例如2.5~5.5倍]。
根据本发明第一方面任一实施方案所述方法,其中,用钯/碳,氢气还原,同时将肽链切落,获得还原型奥曲肽(即D-Phe-Cys(SH)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(SH)-Thr-ol),其方法包括如下步骤:
取所述八肽树脂加无水甲醇、5%钯/碳,通入氢气,密闭,搅拌,过滤,除去碳粉和树脂,无水甲醇洗涤,减压浓缩至油状物,加入六氢吡啶的无水甲醇溶液,使反应,减压浓缩至油状物,DMF溶解,加无水乙醚沉淀,过滤收集沉淀得还原型奥曲肽粗品[在一个实施方案中,5%钯/碳用量为树脂的1/10至5/10(质量比)]。
根据本发明第一方面任一实施方案所述方法,其中,粗品经C18柱分离纯化的方法包括如下步骤:滤液分批经C18柱纯化,流动相:0.25-0.5mol/L醋酸钾:乙腈=7-8:3-2;流速为:600-1000ml/min;检测波长为:280nm;样品峰合并后去盐、冻干,得醋酸奥曲肽成品。
进一步的,本发明第二方面涉及一种醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇45g、乳酸3.4g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。该注射液每瓶装量可以是1ml。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其中所述醋酸奥曲肽是本发明第一方面任一实施方案所述方法制备得到的。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其是照包括如下步骤的方法制备得到的:
取处方量的甘露醇、7/10处方量的乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至30℃,加入碳酸氢钠调pH至3.7~4.7例如4.0,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽和余量的乳酸,加30℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至3.7~4.7例如4.0;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至3.7~4.7例如4.0,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。
再进一步的,本发明第三方面提供了一种醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇40~50g、乳酸3~4g、蔗糖1~3g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。该注射液每瓶装量可以是1ml。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇42~48g、乳酸3.2~3.6g、蔗糖1.5~2.5g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇45g、乳酸3.4g、蔗糖2g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其是照包括如下步骤的方法制备得到的:
取处方量的甘露醇、2/3~3/4处方量的乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至15~30℃,加入碳酸氢钠调pH至3.7~4.7,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽、蔗糖和余量的乳酸,加15~30℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至3.7~4.7;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至3.7~4.7,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。已经出人意料的发现,在特定的操作步骤中添加适量蔗糖,能够避免活性药物的过滤损失。
再进一步的,本发明第四方面提供了一种醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇40~50g、乳酸3~4g、麦芽糖醇3~5g、枸橼酸0.2~0.4g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。该注射液每瓶装量可以是1ml。
根据本发明第四方面任一实施方案所述的醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇42~48g、乳酸3.2~3.6g、麦芽糖醇3.5~4.5g、枸橼酸0.25~0.35g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。
根据本发明第四方面任一实施方案所述的醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇45g、乳酸3.4g、麦芽糖醇4g、枸橼酸0.3g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。
根据本发明第四方面任一实施方案所述的醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其是照包括如下步骤的方法制备得到的:
取处方量的甘露醇、2/3~3/4处方量的乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至15~30℃,加入碳酸氢钠调pH至3.7~4.7,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽、麦芽糖醇、枸橼酸和余量的乳酸,加15~30℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至3.7~4.7;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至3.7~4.7,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。已经出人意料的发现,在特定的操作步骤中添加适量麦芽糖醇和枸橼酸,能够避免活性药物的过滤损失,并且能够抑制注射液在长期留样过程中的典型降解杂质的增长。
进一步的,本发明第五方面提供了测定醋酸奥曲肽或其组合物中的杂质例如氧化降解杂质的方法,该方法包括如下操作:
取醋酸奥曲肽或其组合物适量,加水溶解和/或稀释制成每1ml中约含醋酸奥曲肽0.5mg的溶液,作为供试品溶液;精密量取供试品溶液1ml,置100ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液;
照髙效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512的规范进行)测定,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以四甲基氢氧化铵溶液(取10%四甲基氢氧化铵溶液20ml、三乙氨1ml,加水880ml,用10%磷酸溶液调pH 值至5.4) -乙腈(900:100)作为流动相A,以四甲基氢氧化铵溶液(取10%四甲基氢氧化铵溶液20ml、三乙氨1ml,加水380ml,用10%磷酸溶液调pH值至5.4)-乙腈(400:600)作为流动相B;流速为每分钟1ml;检测波长为210nm;按以下方式进行梯度洗脱:0分钟时至30分钟时由流动相A76%-流动相B24%梯度转变至流动相A63%-流动相B37%,30分钟时至40分钟时由流动相A63%-流动相B37%梯度转变至流动相A40%-流动相B60%,40分钟时至41分钟时由流动相A40%-流动相B60%梯度转变至流动相A76%-流动相B24%,41分钟时至54分钟时维持在等度流动相A76%-流动相B24%;
取醋酸奥曲肽对照品约10mg,置10ml量瓶中,加30%过氧化氢溶液1ml,放置1小时,加水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液20µl,注入液相色谱仪,理论板数按奥曲肽峰(保留时间约18分钟)计算不低于3000,奥曲肽峰与其相对保留时间约为1.45的氧化降解物峰的分离度应不小于3.0;
精密量取供试品溶液和对照溶液各20µl,分别注入液相色谱仪,记录供试品溶液的色谱图,读取各色谱峰的峰面积,与对照溶液主峰面积比较计算各杂质的含量,如果存在RRT1.45杂质则同样计算其含量。
根据本发明第五方面的方法,其中所述醋酸奥曲肽是本发明第一方面任一项所述方法制备得到的醋酸奥曲肽。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案,只要它们不会相互矛盾,当然在相互之间适用时,必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献,它们的全部内容通过引用并入本文,并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时,以本发明的表述为准。此外,本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义,即便如此,本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释,提及的术语和短语如有与公知含义不一致的,以本发明所表述的含义为准。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:本发明采用氯甲基树脂为固相载体,将第一个氨基酸Boc-Thr(tBu)-OH制备成铯盐,以DIC,HOBT为缩合剂,逐个接上保护的氨基酸,最后一个肽链采用Fmoc-D-Phe-OH,获得保护八肽树脂,不采用苏氨醇、Fmoc-苏氨醇,生产成本极低,具备规模化生产能力,工艺稳定,原辅料来源方便,生产周期短,接肽收率高,质量稳定,用HCl/异丙醇脱去Boc-保护基团,用钯/碳加氢还原,同时将肽链切落切肽,条件温和,避免使用氟化氢,三氟乙酸等剧毒试剂,三废污染少。
另外,与现有技术相比,本发明的有益效果在于:本发明制备奥曲肽的方法在进行环合氧化时以更加高效的方式进行,并且因反应过程中过度氧化而造成的氧化降解杂质的量亦显著减少。而且,本发明制备得到的奥曲肽药物组合物呈现比之于现有技术更优的效果。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述,然而,本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的,但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明,而不是限制本发明。
在本发明的具体实例中,制备各物料的投料量是示意性的,其可以按比例的放大或者增加操作次数。在本发明的具体实例中,采用的原料均是可通过商业途径获得的,例如,使用的部分原料及其来源如下:
Boc-Thr(tBu)-OH,吉尔生化(上海)公司
Boc-Cys(Trt)-OH,吉尔生化(上海)公司
Boc-Thr(tBu)-OH,吉尔生化(上海)公司
Boc-Lys(Fmoc)-OH,吉尔生化(上海)公司
Boc-D-Trp-OH,吉尔生化(上海)公司
Boc-Phe-OH,吉尔生化(上海)公司
Fmoc-D-Phe-OH,吉尔生化(上海)公司
HOBt(N-Hydroxybenzotriazole),吉尔生化(上海)公司
下文中使用的2mol/L HCl/异丙醇(氯化氢/异丙醇)溶液制备方法如下:将工业用的浓硫酸滴入食用粗盐(已烘干)中,产生HCl气体,通过二个硫酸洗气瓶,通至盛有1000毫升(约重1050克)异丙醇吸收瓶中(先称好毛重和净重),待其重量增加至1123克左右即停止,装入试剂瓶内,盖紧内塞放入冰箱。
实施例1:醋酸奥曲肽的制备
一、合成肽链
(1)Boc-Thr(tBu)-OCs的制备
取Boc-Thr(tBu)-OH(FW:275.3,110mmol)30.3g,溶于250ml甲醇与250ml水中,pH2.5。另取24g碳酸铯(147mmol)加水100ml溶解至澄清,搅拌下缓缓加入上述Boc-Thr(tBu)-OH溶液,有二氧化碳气体产生。溶液pH7.5。40-50℃水溶减压浓缩至干,得糖浆状残留物Boc-Thr(tBu)-OCs,计54.2g。
(2)Boc-Thr(tBu)-O-树脂的制备
取氯甲基树脂100克(100-200目,1.0mmol/g,100mmol),用DMF浸泡30分钟,使树脂充分溶胀,加入步骤(1)所得糖浆状残留物107g以及700ml的DMF,50-55℃反应48小时。
过滤,树脂用DMF洗涤二次,纯化水洗涤20次,无水乙醇洗涤6次。50-55℃减压干燥,得124.4g的Boc-Thr(tBu)-O-树脂。
(3)Boc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
上一步骤所得树脂加入350ml的2mol/L HCl/异丙醇溶液与350ml的DCM,25℃反应30分钟。抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干。加700ml的10%三乙胺的DCM溶液25℃反应5分钟,抽干,DCM洗涤7次。
加入Boc-Cys(Trt)-OH(MW:463.6,200mmol)92.7g、DIC(MW:126.2,200mmol)25.2g,HOBT(MW:153,200mmol)30.6g,DMF 600ml,将混合物于25℃反应3小时。抽干。DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干,即得。
(4)Boc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
上一步骤所得树脂加入2mol/L HCl/异丙醇溶液350ml(2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的3.5倍)与DCM 350ml,25℃反应30分钟。抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干。加10%三乙胺700ml的DCM溶液,25℃反应5分钟,抽干,DCM洗涤7次。
加55.1g(FW:275.3,200mmol)Boc-Thr(tBu)-OH、DIC(MW:126.2,200mmol)25.2g,HOBT(MW:153,200mmol)30.6g,DMF600ml,将混合物25℃反应3小时。抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干,即得。
(5)Fmoc-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
上一步骤所得树脂加入2mol/L HCl/异丙醇溶液350ml(2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的4倍)与DCM 350ml,25℃反应30分钟。抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干。加10%三乙胺700ml的DCM溶液25℃反应5分钟,抽干,DCM洗涤7次。
加93.7g(FW:468.6,200mmol)Boc-Lys(Fmoc)-OH、DIC(MW:126.2,200mmol)25.2g,HOBT(MW:153,200mmol)30.6g,600mlDMF,将混合物25℃反应l小时。抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干,即得。
(6)Boc-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
上一步骤所得树脂加入2mol/L HCl/异丙醇溶液350ml(2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的5.5倍)与DCM 350ml,25℃反应30分钟。抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干。加10%三乙胺700ml的DCM溶液25℃反应5分钟,抽干,DCM洗涤7次。
加60.9g(FW:304.4,200mmol)Boc-D-Trp-OH、DIC(MW:126.2,200mmol)25.2g,HOBT(MW:153,200mmol)30.6g,600mlDMF,将混合物25℃反应l小时。抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干,即得。
(7)Boc-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-脂的制备
上一步骤所得树脂加入2mol/L HCl/异丙醇315ml(2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的3倍)与DCM 315ml与70ml乙二硫醇的混合溶液,25℃反应30分钟。抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干。加10%三乙胺700ml的DCM溶液25℃反应5分钟,抽干,DCM洗涤7次。
加53.1g(FW:265.3,200mmol)Boc-Phe-OH、DIC(MW:126.2,200mmol)25.2g,HOBT(MW:153,200mmol)30.6g,600mlDMF,将混合物25℃反应l小时。抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干,即得。
(8)Boc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys((tBu)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
上一步骤所得树脂加入2mol/L HCl/异丙醇315ml(2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的3.5倍)与DCM 315ml与70ml乙二硫醇的混合溶液,25℃反应30分钟。抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干。加10%三乙胺700ml的DCM溶液25℃反应5分钟,抽干,DCM洗涤7次。
加92.7g(FW:463.6,200mmol)Boc-Cys(Trt)-OH、DIC(MW:126.2,200mmol)25.2g,HOBT(MW:153,200mmol)30.6g,600mlDMF,将混合物25℃反应l小时。抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干。
(9)Fmoc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
上一步骤所得树脂加入2mol/L HCl/异丙醇315ml(2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的3倍)与DCM 315ml与70ml乙二硫醇的混合溶液,25℃反应30分钟。抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干。加10%三乙胺700ml的DCM溶液25℃反应5分钟,抽干,DCM洗涤7次。
加53.1g(FW:265.3,200mmol)Fmoc-D-Phe-OH、DIC(MW:126.2,200mmol)25.2g,HOBT(MW:153,200mmol)30.6g,600ml DMF,将混合物25℃反应l小时。抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干。
(10)Fmoc-D-Phe-Cys(SH)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr-Cys(SH)-Thr-O-树脂的制备
上一步骤所得树脂加入2mol/L HCl/异丙醇630ml(2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的4.5倍)与70ml乙二硫醇的混合溶液,25℃搅拌30分钟。抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干。
再用无水甲醇洗涤十次。抽干后,放入真空干燥器中干燥,称重,得八肽树脂约190.7g,接肽总收率约为84%。
(11)还原型奥曲肽D-Phe-Cys(SH)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(SH)-Thr-ol的制备
取190g八肽树脂加无水甲醇,加10克5%钯/碳,通入氢气,密闭,25℃搅拌4小时以上。过滤,除去碳粉和树脂,无水甲醇洗涤三次,减压浓缩至油状物。加入300毫升20%的六氢吡啶的无水甲醇溶液(体积比),25℃反应30分钟。减压浓缩至油状物。DMF溶解,加无水乙醚沉淀,过滤收集沉淀得92g还原型奥曲肽粗品。
二、二硫键成环
将90g还原型奥曲肽粗品溶于90L水,在搅拌下慢慢滴加2M氨水至pH7.8,室温下向该溶液中通入空气,以使二硫键进行成环反应约24-36小时(已经发现,此成环反应在24~36小时范围内对于醋酸奥曲肽成品的收率没有明显影响,成品摩尔收率均在31~33%范围内),加冰醋酸调至pH5.5,加活性碳搅拌30分钟,过滤。
三、分离纯化
二硫键成环时所得全部滤液分批经C18柱纯化,流动相:0.25mol/L醋酸钾:乙腈(7.2:2.8);流速为:800ml/min;用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液,检测波长为:280nm;样品峰合并后,去盐、冻干,白色疏松块状物为醋酸奥曲肽成品,从还原型奥曲肽到醋酸奥曲肽成品的收率为31.2~32.7%(以摩尔百分数计,涉及二硫键成环以及分离纯化两部分操作中的不同操作条件例如二硫键成环时的成环反应时间约24-36小时的收率范围,下同)。
实施例2:醋酸奥曲肽的制备
一、合成肽链
同实施例1。
二、二硫键成环
将90g还原型奥曲肽粗品溶于90L水,在搅拌下慢慢滴加2M氨水至pH7.8,室温下向该溶液中通入空气(所用的空气预先依次通过饱和氢氧化钙溶液和2.5M硫酸溶液),以使二硫键进行成环反应约24-36小时,加冰醋酸调至pH5.5,加活性碳搅拌30分钟,过滤。
三、分离纯化
二硫键成环时所得全部滤液分批经C18柱纯化,流动相:0.25mol/L醋酸钾:乙腈(7.2:2.8);流速为:800ml/min;用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液,检测波长为:280nm;样品峰合并后,去盐、冻干,白色疏松块状物为醋酸奥曲肽成品,从还原型奥曲肽到醋酸奥曲肽成品的收率为57.7~59.4%(以摩尔百分数计)。
实施例3:醋酸奥曲肽的制备
一、合成肽链
同实施例1。
二、二硫键成环
将90g还原型奥曲肽粗品溶于90L水,在搅拌下慢慢滴加2M氨水至pH7.8,室温下向该溶液中通入空气(所用的空气预先依次通过2.5M硫酸溶液和饱和氢氧化钙溶液),以使二硫键进行成环反应约24-36小时,加冰醋酸调至pH5.5,加活性碳搅拌30分钟,过滤。
三、分离纯化
二硫键成环时所得全部滤液分批经C18柱纯化,流动相:0.25mol/L醋酸钾:乙腈(7.2:2.8);流速为:800ml/min;用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液,检测波长为:280nm;样品峰合并后,去盐、冻干,白色疏松块状物为醋酸奥曲肽成品,从还原型奥曲肽到醋酸奥曲肽成品的收率为29.6~31.2%(以摩尔百分数计)。
实施例4:醋酸奥曲肽的制备
一、合成肽链
同实施例1。
二、二硫键成环
将90g还原型奥曲肽粗品溶于90L水,在搅拌下慢慢滴加2M氨水至pH7.8,室温下向该溶液中通入空气(所用的空气通过2.5M硫酸溶液),以使二硫键进行成环反应约24-36小时,加冰醋酸调至pH5.5,加活性碳搅拌30分钟,过滤。
三、分离纯化
二硫键成环时所得全部滤液分批经C18柱纯化,流动相:0.25mol/L醋酸钾:乙腈(7.2:2.8);流速为:800ml/min;用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液,检测波长为:280nm;样品峰合并后,去盐、冻干,白色疏松块状物为醋酸奥曲肽成品,从还原型奥曲肽到醋酸奥曲肽成品的收率为25.2~27.3%(以摩尔百分数计)。
实施例5:醋酸奥曲肽的制备
一、合成肽链
同实施例1。
二、二硫键成环
将90g还原型奥曲肽粗品溶于90L水,在搅拌下慢慢滴加2M氨水至pH7.8,室温下向该溶液中通入空气(所用的空气通过饱和氢氧化钙溶液),以使二硫键进行成环反应约24-36小时,加冰醋酸调至pH5.5,加活性碳搅拌30分钟,过滤。
三、分离纯化
二硫键成环时所得全部滤液分批经C18柱纯化,流动相:0.25mol/L醋酸钾:乙腈(7.2:2.8);流速为:800ml/min;用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液,检测波长为:280nm;样品峰合并后,去盐、冻干,白色疏松块状物为醋酸奥曲肽成品,从还原型奥曲肽到醋酸奥曲肽成品的收率为29.3~29.8%(以摩尔百分数计)。
实施例11:醋酸奥曲肽的制备
一、合成肽链
同实施例2。
二、二硫键成环
将90g还原型奥曲肽用5倍量的50%冰醋酸溶解,然后用纯化水稀释至含冰醋酸25%,搅拌均匀后过滤,得滤液;在搅拌下向该滤液中滴加饱和I2(碘,其量为还原型奥曲肽的1.75摩尔倍)/冰醋酸溶液,至溶液呈红棕色,继续搅拌30min,再加入用焦亚硫酸钠和碳酸氢钠两者共同饱和的水溶液(其中焦亚硫酸钠的量为还原型奥曲肽的0.025摩尔倍)至红棕色消失;减压浓缩得到经二硫键形成环的奥曲肽。
三、分离纯化
二硫键成环时所得全部滤液分批经C18柱纯化,流动相:0.25mol/L醋酸钾:乙腈(7.2:2.8);流速为:800ml/min;用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液,检测波长为:280nm;样品峰合并后,去盐、冻干,白色疏松块状物为醋酸奥曲肽成品,从还原型奥曲肽到醋酸奥曲肽成品的收率为63.7%(以摩尔百分数计)。
实施例12:醋酸奥曲肽的制备
一、合成肽链
同实施例2。
二、二硫键成环
将90g还原型奥曲肽用3倍量的50%冰醋酸溶解,然后用纯化水稀释至含冰醋酸25%,搅拌均匀后过滤,得滤液;在搅拌下向该滤液中滴加饱和I2(碘,其量为还原型奥曲肽的2.0摩尔倍)/冰醋酸溶液,至溶液呈红棕色,继续搅拌30min,再加入用焦亚硫酸钠和碳酸氢钠两者共同饱和的水溶液(其中焦亚硫酸钠的量为还原型奥曲肽的0.03摩尔倍)至红棕色消失;减压浓缩得到经二硫键形成环的奥曲肽。
三、分离纯化
二硫键成环时所得全部滤液分批经C18柱纯化,流动相:0.25mol/L醋酸钾:乙腈(7.2:2.8);流速为:800ml/min;用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液,检测波长为:280nm;样品峰合并后,去盐、冻干,白色疏松块状物为醋酸奥曲肽成品,从还原型奥曲肽到醋酸奥曲肽成品的收率为61.2%(以摩尔百分数计)。
实施例13:醋酸奥曲肽的制备
一、合成肽链
同实施例2。
二、二硫键成环
将90g还原型奥曲肽用6倍量的50%冰醋酸溶解,然后用纯化水稀释至含冰醋酸25%,搅拌均匀后过滤,得滤液;在搅拌下向该滤液中滴加饱和I2(碘,其量为还原型奥曲肽的1.5摩尔倍)/冰醋酸溶液,至溶液呈红棕色,继续搅拌30min,再加入用焦亚硫酸钠和碳酸氢钠两者共同饱和的水溶液(其中焦亚硫酸钠的量为还原型奥曲肽的0.02摩尔倍)至红棕色消失;减压浓缩得到经二硫键形成环的奥曲肽。
三、分离纯化
二硫键成环时所得全部滤液分批经C18柱纯化,流动相:0.25mol/L醋酸钾:乙腈(7.2:2.8);流速为:800ml/min;用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液,检测波长为:280nm;样品峰合并后,去盐、冻干,白色疏松块状物为醋酸奥曲肽成品,从还原型奥曲肽到醋酸奥曲肽成品的收率为64.4%(以摩尔百分数计)。
实施例11至实施例13的二硫键成环反应可以在2小时之内完全。
醋酸奥曲肽粗品或精制品或组合物中的氧化降解杂质测定采用如下【HPLC法】进行:
【HPLC法】——
取醋酸奥曲肽粗品或精制品或组合物适量,加水溶解和/或稀释制成每1ml中约含醋酸奥曲肽0.5mg的溶液,作为供试品溶液;精密量取供试品溶液1ml,置100ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液;
照髙效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以四甲基氢氧化铵溶液(取10%四甲基氢氧化铵溶液20ml、三乙氨1ml,加水880ml,用10%磷酸溶液调pH 值至5.4) -乙腈(900:100)作为流动相A,以四甲基氢氧化铵溶液(取10%四甲基氢氧化铵溶液20ml、三乙氨1ml,加水380ml,用10%磷酸溶液调pH值至5.4)-乙腈(400:600)作为流动相B;流速为每分钟1ml;检测波长为210nm;按以下方式进行梯度洗脱:0分钟时至30分钟时由流动相A76%-流动相B24%梯度转变至流动相A63%-流动相B37%,30分钟时至40分钟时由流动相A63%-流动相B37%梯度转变至流动相A40%-流动相B60%,40分钟时至41分钟时由流动相A40%-流动相B60%梯度转变至流动相A76%-流动相B24%,41分钟时至54分钟时维持在等度流动相A76%-流动相B24%(此等度洗脱阶段用于平衡色谱柱,通常10分钟足够);
取醋酸奥曲肽对照品约10mg,置10ml量瓶中,加30%过氧化氢溶液1ml,放置1小时,加水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液20µl,注入液相色谱仪,理论板数按奥曲肽峰(保留时间约18分钟)计算不低于3000,奥曲肽峰与其相对保留时间约为1.45的氧化降解物(在本发明中其亦可称为RRT1.45杂质)峰的分离度应不小于3.0;(该RRT1.45杂质随奥曲肽在过氧化氢溶液中放置的时间延长而呈现显著的升高,并且该RRT1.45杂质区别于李茜文献(李茜,等,药物分析杂志,2017,37(3):492)记载的21种杂质;另外,如果上述流动相中不添加三乙胺,尽管参照该李茜文献方法其它典型杂质的保留时间基本不变,但是该RRT1.45杂质会与保留时间约28分钟处的杂质13重叠,添加少量三乙胺后RRT1.45杂质出峰时间提前至RRT1.45处,约26分钟,由此可以准确测定该氧化杂质的量);
精密量取供试品溶液和对照溶液各20µl,分别注入液相色谱仪,记录供试品溶液的色谱图,读取各色谱峰的峰面积,如果RRT1.45杂质即氧化降解物存在时读取该RRT1.45杂质的峰面积,与对照溶液主峰面积比较计算杂质的含量。
本发明所制得的各种原料,特别是其中二硫键成环步骤中的醋酸奥曲肽粗品以及精制纯化所得醋酸奥曲肽精制品,由于还原型醋酸奥曲肽在经环合转化成醋酸奥曲肽的过程需要使用过量氧化剂进行反应,过量氧化剂又可能造成氧化环合后的醋酸奥曲肽进一步被氧化形成氧化降解杂质,该氧化降解杂质在本发明中可称为RRT1.45杂质,其可以通过本发明【HPLC法】进行测定并进行定量。
经测定,本发明上文实施例1~实施例5的步骤二之二硫键成环所得醋酸奥曲肽(粗品)中的RRT1.45杂质含量均在0.143~0.164%范围内,经历步骤三之分离纯化的精制过程所得醋酸奥曲肽(精品)中的RRT1.1杂质含量均在0.119~0.128%范围内,各实施例醋酸奥曲肽从粗品至精品的纯化过程中RRT1.45杂质的降幅均在17~21%范围内;例如,实施例1步骤二产物中的RRT1.45杂质含量为0.154%,经历步骤三的产物中的RRT1.45杂质含量为0.122%,该实施例1产物从粗品至精品的纯化过程中RRT1.45杂质的降幅约20.8%。
本发明上文实施例11~实施例13的步骤二之二硫键成环所得醋酸奥曲肽(粗品)中的RRT1.45杂质含量均在0.011~0.015%范围内,经历步骤三从粗品至精品的纯化过程中RRT1.45杂质的降幅均在18~21%范围内;例如,实施例11步骤二产物中的RRT1.45杂质含量为0.013%,该实施例11步骤二产物从粗品至精品的纯化过程中RRT1.45杂质的降幅约19.4%。
以上结果表明,各种试验条件下步骤三从粗品至精品的纯化过程中RRT1.45杂质的降幅均基本相同,然而步骤二之二硫键成环过程中方法不同则其中存在的氧化降解RRT1.45杂质含量不同。
在一个补充实施例中(其在本发明可称为实施例14),参照实施例11,不同的仅是在步骤二中,不使用碳酸氢钠、或者不使用焦亚硫酸钠;所得两种精制品从还原型奥曲肽到醋酸奥曲肽成品的收率为41.3%和38.7%(以摩尔百分数计);终产物的比旋度、氨基酸比值、醋酸含量、有关物质、含量测定等结果与实施例1产物基本相同;本实施例14步骤二之二硫键成环所得醋酸奥曲肽(粗品)中的RRT1.45杂质含量均在0.136~0.143%范围内,经历步骤三从粗品至精品的纯化过程中RRT1.45杂质的降幅均在17~21%范围内。上述结果表明,已经出人意料的发现,在从还原型醋酸奥曲肽生成环合态奥曲肽的过程中,采用碘为氧化剂并添加焦亚硫酸钠和碳酸氢钠组合的助剂,可以显著降低氧化反应过程中氧化降解杂质的生成,降低倍数达约12倍之多,并且产率显著高于现有技术;然而,单独使用焦亚硫酸钠或者碳酸氢钠作为反应助剂时的效果不能接受。
另外,对于本发明涉及的醋酸奥曲肽合成步骤二采用碘的反应,其所得醋酸奥曲肽粗品和精制品中碘以及焦亚硫酸钠和/或碳酸氢钠均无法检测到,表明这些反应物在终产物中均已被除尽。
以下各组合物例,如未另外说明,使用实施例2所得醋酸奥曲肽作为原料药。
组合物例1:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备
醋酸奥曲肽注射液处方:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇45g、乳酸3.4g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。
制法:
取处方量的甘露醇、7/10处方量的乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至30℃,加入碳酸氢钠调pH至4.0,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽和余量的乳酸,加30℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至4.0;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至4.0,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。
在本组合物例1的补充试验中,已经发现,用碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7的整个范围内,例如pH至3.7、pH至4.2、pH至4.6时,所得注射液在检测例2中的结果与上述组合物例1注射液相同。
组合物例2:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备
醋酸奥曲肽注射液处方:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇45g、乳酸3.4g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。
制法:
取处方量的甘露醇和乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至30℃,加入碳酸氢钠调pH至4.0,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽加30℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至4.0;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至4.0,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。
组合物例3:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备(#700BE6)
醋酸奥曲肽注射液处方:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇45g、乳酸3.4g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。
制法:取处方量的甘露醇、乳酸加注射用水800ml,搅拌溶解后,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至15℃,加入处方量的醋酸奥曲肽,搅拌溶解后,加入碳酸氢钠调pH至4.6,加注射用水至1000ml。经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。
在本组合物例3的补充试验中,已经发现,用碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7的整个范围内,例如pH至3.7、pH至4.0时,所得注射液在检测例2中的结果与上述组合物例3注射液相同。
组合物例4:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备
分别参照上述组合物例1的配方和制法,不同的仅是改用实施例11所得醋酸奥曲肽作为原料药,得到注射液。
组合物例11:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备
醋酸奥曲肽注射液处方:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇45g、乳酸3.4g、蔗糖2g、碳酸氢钠适量调pH至4.0、注射用水适量加至1000ml。
方法制备得到的:
取处方量的甘露醇、7/10处方量的乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至25℃,加入碳酸氢钠调pH至4.0,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽、蔗糖和余量的乳酸,加25℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至4.0;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至4.0,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。
组合物例12:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备
醋酸奥曲肽注射液处方:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇40g、乳酸4g、蔗糖1g、碳酸氢钠适量调pH至3.7、注射用水适量加至1000ml。
方法制备得到的:
取处方量的甘露醇、2/3处方量的乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至30℃,加入碳酸氢钠调pH至3.7,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽、蔗糖和余量的乳酸,加30℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至3.7;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至3.7,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。
组合物例13:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备
醋酸奥曲肽注射液处方:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇50g、乳酸3g、蔗糖3g、碳酸氢钠适量调pH至4.7、注射用水适量加至1000ml。
方法制备得到的:
取处方量的甘露醇、3/4处方量的乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至15℃,加入碳酸氢钠调pH至4.7,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽、蔗糖和余量的乳酸,加15℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至4.7;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至4.7,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。
组合物例14:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备
分别参照上述组合物例11~13的配方和制法,不同的仅是改用实施例11所得醋酸奥曲肽作为原料药,得到三批注射液。
组合物例21:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备
醋酸奥曲肽注射液处方:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇45g、乳酸3.4g、麦芽糖醇4g、枸橼酸0.3g、碳酸氢钠适量调pH至4.0、注射用水适量加至1000ml。
方法制备得到的:
取处方量的甘露醇、7/10处方量的乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至25℃,加入碳酸氢钠调pH至4.0,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽、麦芽糖醇、枸橼酸和余量的乳酸,加25℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至4.0;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至4.0,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。
组合物例22:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备
醋酸奥曲肽注射液处方:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇40g、乳酸4g、麦芽糖醇3g、枸橼酸0.4g、碳酸氢钠适量调pH至3.7、注射用水适量加至1000ml。
方法制备得到的:
取处方量的甘露醇、2/3处方量的乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至30℃,加入碳酸氢钠调pH至3.7,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽、麦芽糖醇、枸橼酸和余量的乳酸,加30℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至3.7;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至3.7,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。
组合物例23:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备
醋酸奥曲肽注射液处方:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇50g、乳酸3g、麦芽糖醇5g、枸橼酸0.2g、、碳酸氢钠适量调pH至4.7、注射用水适量加至1000ml。
方法制备得到的:
取处方量的甘露醇、3/4处方量的乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至15℃,加入碳酸氢钠调pH至4.7,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽、麦芽糖醇、枸橼酸和余量的乳酸,加15℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至4.7;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至4.7,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物。
组合物例24:醋酸奥曲肽注射液药物组合物的制备
分别参照上述组合物例21~23的配方和制法,不同的仅是改用实施例11所得醋酸奥曲肽作为原料药,得到三批注射液。
对于以上组合物例1、组合物例2、组合物例11、组合物例12、组合物例13、组合物例14、组合物例21、组合物例22、组合物例23、组合物例24,测定其第二步骤即醋酸奥曲肽与乳酸等混合并经炭处理前后活性成分的损失情况,即醋酸奥曲肽与乳酸等混合物经针用炭处理并经脱炭后所得混合液除以理论投料量再乘以100%所得百分数,作为活性成分残余百分数,此残余百分数越大表示活性成分在炭处理过程中的损失越小。
经测定,组合物例1、组合物例2以及组合物例1在不同pH值设计的补充试验所得组合物注射液,它们的残余百分数均在92.0~93.6%范围内,显示有明显的药物损失,这种损失是由于炭吸附造成的(原因在于,经考察,在本发明各种组合物例中,在未经炭吸附处理的情况下药液经钛棒或者微孔滤膜过滤时的药物损失均小于0.5%即残余百分数均大于99.5%,例如组合物例3活性成分未与炭一起处理所得注射液的残余百分数为99.7%);
组合物例11、组合物例12、组合物例13、组合物例14、组合物例21、组合物例22、组合物例23、组合物例24所得各组合物注射液,它们的残余百分数均在99.4~100.3%范围内,显示这些实例中无活性成分的损失。
补充试验例:参照组合物例1,不同的是将小部分甘露醇即2g甘露醇在第二步骤中添加与活性药物一起与炭处理,结果显示此时残余百分数为93.3%,表明甘露醇不能获得蔗糖的效果。
检测例1:对醋酸奥曲肽进行质量检测
照《中国药典》2015年版二部第1544页所收载的醋酸奥曲肽中的有关物质检查方法和含量测定方法以及其它检测指标,测定本发明实施例1-5以及实施例11~13所得终产物醋酸奥曲肽成品。经测定,实施例1-5和实施例11~13所得8批醋酸奥曲肽成品:
比旋度均在-69.2°~-73.6°范围内,各样品无明显区别且均符合标准规定;
各氨基酸的相对比值分别在如下范围内:半胱氨酸1.93~2.13,苏氨酸0.88~1.08,苯丙氨酸1.90~2.12,赖氨酸0.94~1.05,且均能检出苏氨醇,各样品无明显区别且均符合标准规定;
醋酸含量均在7.5%~9.6%范围内,各样品无明显区别且均符合标准规定;
有关物质检查结果显示,最大单个杂质均在0.15~0.29%范围内,总杂质均在0.63~0.75%范围内,各样品无明显区别且均符合标准规定;
含量测定结果显示,按无水、无醋酸物计,含醋酸奥曲肽以奥曲肽(C49H66N10O10S2)计均在97.4~100.6%范围内,各样品无明显区别且均符合标准规定。
检测例2:注射液药物组合物的性质考察:
使组合物例1-4、组合物例11-14和组合物例21-24所得全部批次的注射液照《中国药典》2015年版二部第1545页所收载的醋酸奥曲肽注射液项下的各项检测方法进行检测,结果显示全部注射液均匀符合标准规定。并且全部注射液的澄明度(其照《中国药典》2015年版二部第1544页所收载的醋酸奥曲肽原料药的溶液的澄清度与颜色项下的方法检查)均匀符合规定,均为无色澄明液体。
使组合物例1-3、组合物例11-14和组合物例21-24所得全部批次的注射液置4°C温度环境下放置7天、再在28°C温度环境下放置7天,如此完成一个循环;进行四个此循环共56天,在第0天以及第56天各注射液照《中国药典》2015年版二部第1545页所收载的醋酸奥曲肽注射液项下的各项检测方法进行检测,以考察药物在高低温交替条件下的物理稳定性。结果显示,全部注射液的含量和有关物质在0天和56天均符合标准规定,除了澄明度外的其它各项指标在0天和56天亦均符合标准规定。但是注射液在56天的澄明度出现不同的变化,即,组合物例1、组合物例11-14和组合物例21-24的注射液在56天的澄明度符合标准规定,为无色澄明液体;而组合物例2和组合物例3注射液在56天的澄明度均不符合标准规定,均呈现白色混浊物。这表明,即使采用相同处方,不同方法制得的注射液呈现不同的物理稳定性。
检测例3:注射液药物组合物中的典型降解杂质脱苏氨醇8奥曲肽的变化
如李茜文献记载的,脱苏氨醇8奥曲肽是奥曲肽的高温高湿降解产物,并且是奥曲肽注射液的主要杂质;注射液需要经历长时间的贮藏,这相当于药物暴露于高温环境下;注射液是水溶液,这相当于药物暴露于高湿环境下,因此注射液中脱苏氨醇8奥曲肽的变化可以典型的反映注射液的稳定性。
注射液中的杂质脱苏氨醇8奥曲肽的含量测定可以参照《中国药典》2015年版二部第1544页所收载的醋酸奥曲肽及其注射液的有关物质和含量测定的HPLC法测定,并以其相对于活性药物奥曲肽的相对百分数表示。
稳定性考察方法:使注射液在避光条件下于8°C保存,测定每个注射液在0月、18月时其中脱苏氨醇8奥曲肽的含量(相对于活性药物奥曲肽的百分数),分别记为C0和C18,以下式计算每个注射液在经历此18个月长期留样后脱苏氨醇8奥曲肽的增加百分数△C,以此△C比较/评判注射液中杂质脱苏氨醇8奥曲肽的增长速度:△C=[(C18-C0) 18个月÷C0]×100%。另外测定制备注射液所用原料药中脱苏氨醇8奥曲肽的含量(相对于活性药物奥曲肽的百分数),记为Cc,以C0÷Cc所得倍数表示原料药在经历注射液制剂工艺前、后杂质脱苏氨醇8奥曲肽的增长倍数。
组合物例11-14所得全部注射液的△C均在441~518%范围内,组合物例21-24所得全部注射液的△C均在53~87%范围内;全部注射液中,原料药在经历注射液制剂工艺前、后杂质脱苏氨醇8奥曲肽的增长倍数均在1.17~1.24范围内,表明制剂工艺过程中上述典型杂质增长很小,并且增长幅度基本相同。
组合物例25:参照组合物例21,不同的仅是不添加麦芽糖醇或者不添加枸橼酸,制得两批注射液;两批注射液照上述18个月的稳定性试验方法测试,△C值分别为496%和468%;两批注射液照上文所述测定其制备过程中的第二步骤即醋酸奥曲肽与乳酸等混合并经炭处理前后活性成分的损失情况,活性成分残余百分数分别为93.4%和91.6%。这些结果表明,将处方的蔗糖改为麦芽糖醇和枸橼酸组合不但能够避免药物配制过程中的损失,而且能够使注射液保持显著更好的稳定性,注射液在长期留样过程中典型杂质增长速度比之于使用蔗糖显著更小,而麦芽糖醇或枸橼酸单独使用时无此技术效果。在《中国药典》收载的醋酸奥曲肽及其注射液中规定有关物质的测定方法及要求,其中规定了原料药的单个杂质小于1%,注射液的单个杂质小于2%;由于制备上述各种注射液的醋酸奥曲肽原料药中脱苏氨醇8奥曲肽杂质的含量较低(0.1~0.15%),原料药经注射液制备工艺以后、以及注射液经历18个月长期贮藏以后,注射液中的脱苏氨醇8奥曲肽杂质的含量仍然低于上述药典关于小于2%的规定限度。尽管组合物例11-14和组合物例21-24所得注射液经历18个月长期贮藏以后其中的脱苏氨醇8奥曲肽杂质均未超出药典规定范围,然而本领域技术人员仍然期待脱苏氨醇8奥曲肽这种典型杂质具有低的增长速度,如上文实验记载的。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (29)
1.一种醋酸奥曲肽注射液药物组合物,其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇40~50g、乳酸3~4g、麦芽糖醇3~5g、枸橼酸0.2~0.4g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml;
该药物组合物是照包括如下步骤的方法制备得到的:
取处方量的甘露醇、2/3~3/4处方量的乳酸加注射用水700ml,搅拌溶解,加0.1%活性炭,加热至80℃搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液冷却至15~30℃,加入碳酸氢钠调pH至3.7~4.7,备用;
另取处方量的醋酸奥曲肽、麦芽糖醇、枸橼酸和余量的乳酸,加15~30℃注射用水100ml,加0.1%活性炭搅拌30分钟,经钛棒循环脱炭,滤液加入碳酸氢钠调pH至3.7~4.7;
使两种滤液合并,必要时用碳酸氢钠调pH至3.7~4.7,加注射用水至1000ml;经蠕动泵送至无菌室中,经0.22µm的微孔滤膜过滤至澄明并除菌,按每瓶1 ml的装量灌装于玻璃瓶中,密封,即得醋酸奥曲肽注射液药物组合物;
所述醋酸奥曲肽是照包括如下步骤的方法制备得到的:
以氯甲基树脂为起始原料,将Boc-Thr(tBu)-OH制备成铯盐,按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸,依次为:Boc-Cys(Trt)-OH、Boc-Thr(tBu)-OH、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Boc-D-Trp-OH、Boc-Phe-OH、Boc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH,获得保护八肽树脂,其间依次用HCl/异丙醇脱去Boc-保护基团,用DIC、HOBT为缩合剂进行接肽反应;
用钯碳/氢气还原,同时将肽链切落,获得还原型奥曲肽;
将还原型奥曲肽用3~6倍的50%冰醋酸溶解,然后用纯化水稀释至含冰醋酸25%,搅拌均匀后过滤,得滤液;在搅拌下向该滤液中滴加饱和碘/冰醋酸溶液,其中碘量为还原型奥曲肽的1.5~2.0摩尔倍,至溶液呈红棕色,继续搅拌30min,再加入用焦亚硫酸钠和碳酸氢钠两者共同饱和的水溶液至红棕色消失,焦亚硫酸钠的量为还原型奥曲肽的0.02~0.03摩尔倍;减压浓缩得到经二硫键形成环的奥曲肽粗品;
奥曲肽粗品经C18柱分离纯化,制得醋酸奥曲肽精品。
2.根据权利要求1的药物组合物,其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇42~48g、乳酸3.2~3.6g、麦芽糖醇3.5~4.5g、枸橼酸0.25~0.35g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。
3.根据权利要求1的药物组合物,其包含:醋酸奥曲肽以奥曲肽计0.1g、甘露醇45g、乳酸3.4g、麦芽糖醇4g、枸橼酸0.3g、碳酸氢钠适量调pH至3.7~4.7、注射用水适量加至1000ml。
4.根据权利要求1的药物组合物,在制备醋酸奥曲肽时,依次连接具有保护基团的氨基酸,获得保护八肽树脂,其间依次脱去Boc-保护基团的方法包括如下步骤:
(1)Boc-Thr(tBu)-OCs的制备
使Boc-Thr(tBu)-OH溶于甲醇与水中,另取碳酸铯加水溶解至澄清,搅拌下加入上述Boc-Thr(tBu)-OH溶液,溶液pH7.5,减压浓缩至干,得糖浆状残留物为Boc-Thr(tBu)-OCs;
(2)Boc-Thr(tBu)-O-树脂的制备
取氯甲基树脂,用DMF浸泡使树脂溶胀,加上述糖浆状残留物Boc-Thr(tBu)-OCs和DMF使进行反应;过滤,树脂用DMF洗涤二次,纯化水洗涤,无水乙醇洗涤,减压干燥,得Boc-Thr(tBu)-O-树脂;
(3)Boc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备:
在步骤(2)的Boc-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇溶液与DCM,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干,再加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加入Boc-Cys(Trt)-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤,抽干,即得;
(4)Boc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(3)的Boc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇溶液与DCM,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤二次,抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Boc-Thr(tBu)-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干,即得;
(5)Boc-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(4)的Boc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇溶液与DCM,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM各洗涤,抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Boc-Lys(Fmoc)-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤,抽干,即得;
(6)Boc-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(5)的Boc-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/LHCl/异丙醇溶液与DCM,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM洗涤二抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Boc-D-Trp-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次,抽干,即得;
(7)Boc-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(6)的Boc-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇与DCM与乙二硫醇的混合溶液,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM洗涤,抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Boc-Phe-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤,抽干,即得;
(8)Boc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys((tBu)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(7)的Boc-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇与DCM与乙二硫醇的混合溶液,反应,抽干,分别用DCM、无水甲醇、DCM洗涤,抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Boc-Cys(Trt)-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,DMF、无水甲醇、DMF洗涤,抽干,即得;
(9)Fmoc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂的制备
在步骤(8)Boc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys((tBu)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇与DCM与乙二硫醇的混合溶液,反应,抽干,用DCM、无水甲醇、DCM洗涤,抽干,加10%三乙胺的DCM溶液反应,抽干,DCM洗涤;加Fmoc-D-Phe-OH、DIC、HOBT、DMF,将混合物反应,抽干,DMF、无水甲醇、DMF洗涤,抽干,即得;
(10)Fmoc-D-Phe-Cys(SH)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr-Cys(SH)-Thr-O-树脂的制备
在步骤(9)的Fmoc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Fmoc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-树脂中,加入2mol/L HCl/异丙醇与DCM与乙二硫醇的混合溶液,反应,抽干,用DCM、无水甲醇、DCM洗涤,抽干;再用无水甲醇洗涤十次,抽干后,放入真空干燥器中干燥,得八肽树脂。
5.根据权利要求4的方法,步骤(1)中,碳酸铯的摩尔数为Boc-Thr(tBu)-OH的1~5倍。
6.根据权利要求4的方法,步骤(2)中,Boc-Thr(tBu)-OCs的摩尔数为树脂的1~3倍。
7.根据权利要求4的方法,步骤(2)中,氯甲基树脂与Boc-Thr(tBu)-OCs的反应温度:40-65℃,反应时间:36-72小时。
8.根据权利要求4的方法,步骤(3)中,HCl浓度为1mol/L~9mol/L。
9.根据权利要求4的方法,步骤(3)中,2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍。
10.根据权利要求4的方法,步骤(4)中,HCl浓度为1mol/L~9mol/L。
11.根据权利要求4的方法,步骤(4)中,2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍。
12.根据权利要求4的方法,步骤(5)中,HCl浓度为1mol/L~9mol/L。
13.根据权利要求4的方法,步骤(5)中,2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍。
14.根据权利要求4的方法,步骤(6)中,HCl浓度为1mol/L~9mol/L。
15.根据权利要求4的方法,步骤(6)中,2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍。
16.根据权利要求4的方法,步骤(7)中,HCl浓度为1mol/L~9mol/L。
17.根据权利要求4的方法,步骤(7)中,2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍。
18.根据权利要求4的方法,步骤(8)中,HCl浓度为1mol/L~9mol/L。
19.根据权利要求4的方法,步骤(8)中,2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍。
20.根据权利要求4的方法,步骤(8)中,2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2.5~5.5倍。
21.根据权利要求4的方法,步骤(9)中,HCl浓度为1mol/L~9mol/L。
22.根据权利要求4的方法,步骤(9)中,2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍。
23.根据权利要求4的方法,步骤(9)中,2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2.5~5.5倍。
24.根据权利要求4的方法,步骤(10)中,HCl浓度为1mol/L~9mol/L。
25.根据权利要求4的方法,步骤(10)中,2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2~8倍。
26.根据权利要求4的方法,步骤(10)中,2mol/L HCl/异丙醇用量为树脂重量的2.5~5.5倍。
27.根据权利要求1的方法,其中,用钯/碳,氢气还原,同时将肽链切落,获得还原型奥曲肽,其包括如下步骤:取所述八肽树脂加无水甲醇、5%钯/碳,通入氢气,密闭,搅拌,过滤,除去碳粉和树脂,无水甲醇洗涤,减压浓缩至油状物,加入六氢吡啶的无水甲醇溶液,使反应,减压浓缩至油状物,DMF溶解,加无水乙醚沉淀,过滤收集沉淀得还原型奥曲肽粗品。
28.根据权利要求27的方法,其中,5%钯/碳用量为树脂的1/10至5/10,以质量比计。
29.根据权利要求1的方法,粗品经C18柱分离纯化的方法包括如下步骤:滤液分批经C18柱纯化,流动相:0.25-0.5mol/L醋酸钾:乙腈=7-8:3-2;流速为:600-1000ml/min;检测波长为:280nm;样品峰合并后去盐、冻干,得醋酸奥曲肽成品。
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