CN104136455A

CN104136455A - 抗hiv-1多肽及其用途

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Publication number: CN104136455A
Application number: CN201380010499.8A
Authority: CN
Inventors: 蔡利锋; 刘克良; 郑保华; 王昆; 贾启燕; 张贵英; 姜喜凤
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2012-02-27
Filing date: 2013-02-01
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2033-02-01
Also published as: WO2013127288A1; CN104136455B

Abstract

本发明涉及一类多肽，其可以抑制HIV或其他相关包膜类病毒与靶细胞的融合，所述多肽具有SEQ ID NO：1～42所示序列。本发明还提供了所述多肽在制备HIV融合抑制剂中的用途，在制备用于治疗或预防HIV感染相关疾病尤其是艾滋病的药物中的用途，以及在制备用于治疗或预防其它相关包膜类病毒感染的药物中的用途。

Description

抗 H I V- 1多肽及其用途技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一类多肽，特别是一类抗 HIV-1或其它相关包膜类病毒的多肽，以及所述多肽在制备 HIV融合抑制剂中的用途，在制备用于治疗或预防 HIV感染相关疾病尤其是艾滋病的药物中的用途，以及在制备用于治疗或预防其它相关包膜类病毒感染药物中的用途。背景技术

I型人免疫缺陷病毒 ( HIV-1 )是艾滋病的病原体，现全球有超过 3000 万感染者，每年导致约 200万人死亡，并且每年还有新增约 200万感染者，是一种严重威胁人类健康的全球性感染疾病。 HIV-1通过其包膜糖蛋白（ Env ) 介导的病毒-细胞膜融合感染宿主细胞。 Env包含表面亚基 gpl20和跨膜亚基 gp41, 三个 Env形成非共价复合体镶嵌在病毒表面。表面亚基 gpl20负责病毒感染细胞过程中的分子识别以找到和接近耙细胞，同时起着稳定跨膜亚基 gp41的功能，并在适当时机释放出 gp41以启动融合；跨膜亚基 gp41是病毒 -细胞膜融合的直接功能分子。病毒细胞融合过程中有一由 gp41 N-端螺旋区和 C-端螺旋区（NHR和 CHR )形成的六螺旋结构；该结构的形成为病毒- 细胞膜融合提供能量，对病毒-细胞融合至关重要。阻止六螺旋形成的药物可有效抑制艾滋病毒-细胞膜融合，从而阻止病毒感染和体内传播，用于艾滋病治疗，因此称为融合抑制剂。

晶体结构显示在六螺旋中，三个由 NHR形成的螺旋结构构成内核，形成三个沟槽，三个 CHR反平行结合在沟槽中。外源 CHR多肽可结合在 HR 靶点中形成无活性的六螺旋结构，阻止内源的活性六螺旋体生成，抑制病毒- 细胞融合和病毒感染，从而用作融合抑制剂。典型的 C-肽融合抑制剂包括 C34( US 6,150,088 )及其改进多肽、首个上市融合抑制剂 T20( US 5,464,933 )、以及后来发现的 CP32 ( CN1793170, CN1955190 ) 。这些 C-肽融合抑制剂通过与其对应 NHR 靶点结合阻止病毒感染；典型的靶点包括 N36 ( US 6,150,088 )和 DP107 ( US 5,656,480 ) ，分别与 C34和 CP32结合形成六螺旋结构，其中 N36 和 DP107 中含有一个共同的结合口袋，与 CHR 的 WaaWaaal (其中 a为氨基酸）模板 (又称 WWI模板 )有关键相互作用，也是小分子融合抑制剂的热门靶点。

尽管有上市的融合抑制剂 T20 和其它临床研究中的融合抑制剂如 Sifuvirtide ( CN1334122 ) , 但由于抗药病毒株的快速出现，使得针对抗性病毒的融合抑制剂研发成为当务之急，尤其是序列来源与已有融合抑制剂明显不同的融合抑制剂。发明内容

基于以上原因，本发明人提出了从其它类似包膜病毒对应包膜糖蛋白序列设计抗 HIV-1活性肽的设计思想。我们根据包膜病毒融合机制的相似性，从其它包膜病毒包膜糖蛋白跨膜亚基的 CHR序列连续截取约 36个氨基酸的肽序列 , 设计出抗 HIV-1多肽，测定其抗 HIV介导的细胞-细胞融合活性，同时研究其与 HIV-1 gp41 NHR的结合，确定其作用靶点，探索研究 HIV-1 融合抑制剂设计的新思路。由此完成了本发明。

本发明的第一方面涉及选自式（1 ) ~式（42 ) 所示的多肽，

式（1 ) ：

1 ) -Z; ―

式（2 ) ：

X-WIDWSIELNKAKSDLEESKEWIERSNGKLDSIGNWH ( SEQ ID NO: 2 ) -Z;

式（3 ) ：

3 ) -Z;

式（4 ) ：

X-WLDISQNLAAVNKSLSDALQHLAQSDTYLSAI ( SEQ ID NO: 4 )

-Z;

式 ( 5 ) ：

X-WLDWSQNLAAVNKSLSDALQHLAQSDTYLSAK SEQ ID NO: 5 )

-Z;

式（6 ) ：

X-PLDISQNLAAVNKSLSDALQHLAQSDTYLSAI ( SEQ ID NO: 6 )

-Z; •

5

CS vs2S0vosS0V aiSIHZaAlz3I3¾A3AZa¾l:HAx - 5 ai

αΐ αι

αι

CS αιS

卜

οεζ ί—

ί

) 9ε ί

) ε卜

) 8ε 式（ 39 ) ：

X- YLNLTGEIDDLEFRSEKLHNTTVELAILIDNINNTL( SEQ ID NO:

39 ) -Z;

式（ 40 ) :

40 ) -Z;

式（41 ) :

X- WLNWTSEISTLENKSAELNYTVQKLQTLIDNINSTL ( SEQ ID NO: 41 ) -Z;

式（ 42 ) :

X- ILNLTSEISTLENKSAELNYTVQKLQTLIDNINSTL ( SEQ ID NO: 42 ) -Z;

或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐；其中，

X为乙酰基、寡肽序列、亲脂性基团、聚乙二醇或缺失；在本发明的实施方案中， X为乙酰基 ( CH₃-CO- ) ；

Z为酰胺基、寡肽序列、亲脂性基团、聚乙二醇或缺失；在本发明的实施方案中， Z为酰胺基（ -CO-NH₂ ) 。

其中，所述寡肽序列为 1 ~ 10个氨基酸序列，例如可以为 EEE、 KKK、 GKK、或 GQAV。

其中所述亲脂性基团为脂肪酸和甾醇，例如可以为正辛酸酯 ( C₇H₁₅-CO-0- )、月桂酸酯（ C₁₃H₂₇-CO-0- )、棕榈酸酯（ C₁₅H₃₁-CO-0- )、或胆固醇 (C₂₇H₄₆0)。

其中 X与 Z基团用于改善多肽的水溶性、二级结构及稳定性、增强与细胞膜的结合使之更靠近靶点、或改善药物的药代性质。

以上式（1 ) ~ ( 42 )的序列均来自于包膜类病毒的融合糖蛋白跨膜亚基的 CHR序列，其中一些序列在多肽氨基末端的关键位点引入一个色氨酸 ( W ) 残基，首选为 1位，或者同时在 4位。

其中式（1 ) ~ ( 3 ) 来自于人副流感病毒 3型 HPIV3, 式（4 ) ~ ( 6 ) 来自于猴副流感病毒 SV5, 式（7 ) ~ ( 9 )来自于严重急性呼吸综合征 SARS 病毒，式（ 10 ) ~ ( 12 ) 来自于小鼠肝炎病毒 MHV, 式（ 13 ) ~ ( 15 ) 来自于新城疫病毒 DV,式（ 16 ) ~ ( 18 )来自于人偏肺病毒 hMPV,式（ 19 ) ~ ( 21 )来自于呼吸道合胞病毒 RSV, 式（22 ) ~ ( 24 )来自于戊型肝炎病毒 HeV, 式（25) ~ (27)来自于尼帕病毒 iV, 式（ 28 ) ~ (30)来自于麻疹病毒 MeV, 式（31) ~ (33)来自于仙台病毒 SeV, 式（ 34 ) ~ ( 36 )来自于禽肺病毒 APV, 式（37) ~ (39)来自于猫传染性腹膜炎病毒 FIPV, 式（40) ~ (42)来自于人冠状病毒 229E HCoV-229E。以上病毒株均为具有晶体结构的标准株。

根据本发明第一方面的多肽，其选自以下多肽：

(l)SEQ ID NO: 1 - 42中的任一序列在 N端和 /或 C端有 1-10、 1-5、 1-2个氨基酸的截短；

( 2 )SEQ ID NO: 1 - 42中的任一序列在 N端和 /或 C端有 1-10、 1-5、 1-2个氨基酸的延伸；优选地，所述延伸是在该序列来源病毒的融合糖蛋白跨膜亚基的 CHR序列基础上的延伸；

( 3 ) SEQ ID NO: 1~ 42中的任一序列有 1-10、 1-5、 1-2个氨基酸的替换，或上述（1) 和（2) 的序列中有 1-10、 1-5、 1-2个氨基酸的替换；优选地，所述替换是根据该序列来源病毒的不同病毒株之间由于融合糖蛋白跨膜亚基的 CHR序列不同而进行的替换；

( 4 ) SEQ ID NO: 1 ~ 42中的任一多肽经过末端和 /或侧链化学修饰得到的多肽，或上述（1) ~ (3) 的多肽经过末端和 /或侧链化学修饰得到的多肽。

(5) 上述（1) ~ (4) 的多肽，第一位氨基酸和 /或第四位氨基酸用色氨酸残基替换，和 /或第八位氨基酸用疏水氨基酸残基替换后得到的多肽。

其中所述末端和 /或侧链化学修饰包括在氨基末端、羧基末端或侧链修饰，修饰基团包括寡肽、乙酰基、酰胺基，亲脂性基团、亲水性基团等，其作用是提高多肽的稳定性、改善药代动力学或提高与细胞膜的结合。

根据本发明第一方面的多肽，其为选自本发明第一方面任一项所述多肽中的一种或数种。

在本发明中，所述多肽既包括直接由 10-100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物，也包括在该化合物上经过上述修饰后得到的含有修饰基团的化合物。

在本发明中，所述多肽的长度优选为含有 30-40个氨基酸，例如为 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40。

以上所述多肽在经过截短、延伸、替换和 /或修饰后仍具有抗 HIV-1 或其它包膜类病毒与靶细胞例如人体细胞融合的活性。在本发明中，所述疏水氨基酸残基包括色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸。

本发明的多肽可以采用本领域公知的方法直接合成，也可以利用分子生物学手段通过将多肽所对应的核苷酸序列克隆入重组载体中，在重组细胞中表达后得到。

因此本发明还涉及核酸分子，其含有编码本发明第一方面所述多肽的核苷酸序列。

本发明还涉及重组载体，其含有本发明所述的核酸分子；以及重组细胞，其含有本发明所述的重组载体。

本发明的第四方面涉及包含本发明第一方面所述多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐的融合蛋白，或所述多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐与其他蛋白或毒素或脂类等载体（如大分子载体或重组载体）偶联或融合而得到的复合物，或者展示上述多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐的类病毒颗粒。

本发明多肽的给药方式以针剂为主，可直接注射，或制成緩释针剂；也可以通过提高代谢稳定性，包括物理的、化学的修饰，使之成为可口服使用的药物；也包括外用或粘膜给药等。

本发明的另一方面涉及组合物（例如药物组合物），其含有至少一种本发明第一方面所述的多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐，或者本发明第四方面所述的融合蛋白、复合物或类病毒颗粒，以及任选的药学上可接受的载体或辅料。

在本发明中，所述组合物中可以包含至少一种多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐，或者本发明第四方面所述的融合蛋白、复合物或类病毒颗粒，例如可以为两种或两种以上，以进一步提高融合抑制效果；或者所述组合物中可以包含本发明的多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐、本发明所述的融合蛋白、复合物或类病毒颗粒，以及其它融合抑制剂，例如 C34、 T20或 CP32。

本发明的另一方面涉及本发明第一方面所述的多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐、第四方面所述的融合蛋白、复合物或类病毒颗粒在制备 HIV融合抑制剂中的用途。

在本发明中，所述融合抑制剂是指可以阻止 HIV-1 自身的活性六螺旋结构的形成进而抑制病毒 -细胞膜融合的化合物或组合物，即是指通过形成无活性的六螺旋结构阻止病毒 -细胞膜融合的化合物或组合物。在本发明的实施方案中，所述融合抑制剂是指多肽或经过修饰的多肽，或者包含多肽或经过修饰的多肽的组合物。

本发明还涉及本发明第一方面所述的多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐、第四方面所述的融合蛋白、复合物或类病毒颗粒在制备用于治疗或预防 HIV感染相关疾病例如艾滋病的药物或者其它包膜类病毒感染引起的疾病中的用途。

在本发明中，所述 HIV包括 HIV-1和 HIV-2型病毒，在本发明的实施方案中，所述 HIV为 HIV-1型病毒。

在本发明的实施方案中，所述其它包膜类病毒是指利用第一类融合蛋白作为融合工具的病毒，包括但不限于人副流感病毒 3型 HPIV3,猴副流感病毒 SV5,严重急性呼吸综合征 SARS病毒，小鼠肝炎病毒 MHV,新城疫病毒 NDV, 人偏肺病毒 hMP V , 呼吸道合胞病毒 RSV,戊型肝炎病毒 HeV,尼帕病毒 NiV , 麻疹病毒 MeV, 仙台病毒 SeV, 禽肺病毒 APV, 猫传染性腹膜炎病毒 FIPV或人冠状病毒 229E HCoV-229E。

本发明还涉及一种预防或治疗 HIV感染相关疾病例如艾滋病或者其它包膜类病毒感染引起的疾病的方法，所述方法包括给有需要的受试者以预防或治疗有效量的本发明第一方面所述的多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐、第四方面所述的融合蛋白、复合物或类病毒颗粒的步骤。

根据融合机理， HIV用第一类融合蛋白（ Class I fusion Protein )作为病毒 -细胞膜融合的工具分子，利用这类融合蛋白的还有其它多种病毒，包括一些严重威胁人类健康的病毒。第一类融合蛋白有下列共性：都含有跨膜亚基和表面亚基，其中跨膜亚基直接参与融合；跨膜亚基细胞膜外部分一般含有融合肽、 NHR和 CHR等功能区；融合过程中 NHR三聚形成内核， CHR反平行折叠到 NHR形成的沟槽中，形成六螺旋结构，形成过程中放出的能量促使病毒和细胞膜融合使病毒完成感染 ^[1]。根据这些原理，发明人针对利用第一类融合蛋白作为融合工具的病毒，根据其融合糖蛋白跨膜亚基的 CHR, 设计 HIV融合抑制剂。这类病毒的包膜糖蛋白的氨基酸序列已知，功能区也得到了确定，发明人从其中 CHR序列中截取适当的多肽片段，根据融合机理的相似性，预测这些多肽片段可以反平行折叠到 NHR形成的沟槽中，形成无活性的六螺旋结构 , 并用融合抑制活性实验进行验证。

因此本发明还涉及一种获得抑制 HIV 与靶细胞融合的融合抑制剂的方法，该方法包括从除 HIV以外的病毒的 CHR功能区序列上截取适当长度的多肽片段，所述多肽片段能够和 NHR功能区结合形成无活性的六螺旋结构。需要加以说明的是，由于 CHR—般的长度约为 40个氨基酸残基，因此截取 30-40个残基片段用作 HIV融合抑制剂相当直观，无需特别地技术，但不排除进行计算机模拟以求得最好截取效果。另外，根据直观的逻辑，将这些截取片段用于 HIV 以外的与所截取病毒相同或不同病毒的融合抑制剂也应在本发明的保护范围内。

其中所述除 HIV 以外的病毒是指利用第一类融合蛋白作为融合工具的病毒，例如为包膜类病毒；在本发明的一个实施方案中，所述病毒为人副流感病毒 3型 HPIV3^[2], 猴副流感病毒 SV5^[3], 严重急性呼吸综合征 SARS病毒^[4], 小鼠肝炎病毒 MHV^[4], 新城疫病毒 NDV^[5], 人偏肺病毒 hMPV^[6], 呼吸道合胞病毒 RSV^[3] , 戊型肝炎病毒 HeV^[2], 尼帕病毒 NiV^[7] , 麻疹病毒 MeV^[7], 仙台病毒 SeV^[7], 禽肺病毒 APV^[8], 猫传染性腹膜炎病毒 FIPV^[9]或人冠状病毒 229E HCoV-229E^[9]。

其中所述适当长度是指包含 30-40个氨基酸，例如为 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40。

本发明还涉及根据本发明所述的上述方法获得的抑制 HIV 与靶细胞融合的融合抑制剂。

在本发明的实施方案中，所述融合抑制剂选自上述式（1 ) ~ ( 42 )所示的多肽。

在本发明的实施方案中，所述融合抑制剂是指多肽或经过修饰的多肽，或者包含多肽或经过修饰的多肽的组合物。

在本发明中， X为乙酰基、 Z为酰胺基的式（1 ) ~式（42 )所示的多肽也分别称为多肽 1 ~ 42。发明的有益效果

本发明的多肽显示出明显的抗 HIV活性，靶点作用实验显示，所述多肽作用于 gp41 NHR区，通过与 NHR形成无活性的六螺旋结构，破坏 HIV NHR结构，抑制 HIV与靶细胞的融合。同时，活性实验结果表明，本发明多肽的作用机制与含有 WWI 结构模板口袋结合区的已知多肽融合抑制剂不同。说明书附图

图 1显示了本发明多肽与 N46的相互作用

其中横坐标 wave为扫描波长，单位为 nm; 纵坐标为 CD信号，单位为 mdeg。每个小图中有四条曲线，例如 seql、 N46分别为多肽 1， N46单独的 CD谱， Seql/N46为多肽 1和 N46混合后测得的 CD谱， Seql+N46 为二者单独 CD谱的叠加，用于和 Seql/N46比较以确定二者是否有相互作用。其它小图标注的含义以此类推；

其中 A为多肽 1， B为多肽 4， C为多肽 7， D为多肽 10， E为多肽 13 , F为多肽 16， G为多肽 19， H为多肽 22。具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在本发明中使用的缩写具有下面的意义：

AIDS ( Acquired Immure Deficiency Syndrome )艾滋病, 获得性免疫缺陷综合症。

Ala ( Alanine , Α ) 丙氛酸

Arg ( Arginine , R ) 精氛酸

Asn ( Asparagine, N ) 天冬醜胺

Asp ( Asparticacid , D ) 天冬氣酸

DCM ( Dichloromethane ) 二氯曱烷

DMF ( Ν,Ν-Dimethyl malonate ) 二曱基曱酰胺

Env ( Envelope glycoprotein ) 包膜糖蛋白

ESI-MS ( Electronic spray ion mass spectroscopy ) 电喷质 i普

Fmoc ( Fluorenylmethoxycarbonyl ) 药曱氧羧基

Gly ( Glycine, G ) 甘氨酸

Gin ( Glutamine, Q ) 谷酰胺

Glu ( Glutamic acid, E ) 谷氨酸 6-HB ( six-helix bundle ) 六螺旋体

HBTU 2- ( 1H-1-羟基苯并三唑） -1,1,3,3-四曱基六氟磷酸

His ( Histidine, H )组氨酸

HoBt ( 1-Hydroxyl benzotiazole anhydrous ) 1-幾基苯并三氮峻

NHR ( N-terminal heptad repeat ) N-端七联重复序列

CHR ( C-terminal heptad repeat ) C-端七联重复序列

HIV ( Human immunodeficiency virus ) 人免疫缺陷病毒

HIV-1 1型人免疫缺陷病毒

HPLC ( high performance liquid chromatography ) 高效液相色 i普

He ( Isoleucine, I ) 异亮氛酸

Leu ( Leucine, L ) 亮氛酸

Met ( Methionine, M ) 曱疏氨酸

Nal 正亮氨酸

Lys ( Lysine , K ) 赖氛酸

Phe ( Phenylalanine , F )笨丙氛酸

Ser ( Serine, S ) 丝氨酸

TFA ( Trifluoroacetic acid ) 三氟乙酸

Thr ( Threonie, T ) 苏氛酸

Tyr ( Tyrosine, Y ) 酷氛酸

Val ( Valine, V ) 缬氨酸

W为色氨酸、 N为天冬酰胺、 A为丙氨酸、 S为丝氨酸、 K为赖氨酸、 L为亮氨酸、 E为谷氨酸、 Q为谷氨酰胺、 I为异亮氨酸、 H为组氨酸、 M 为曱硫氨酸、 T为苏氨酸、 D为天冬氨酸、 R为精氨酸、 Y为酪氨酸、 F为苯丙氨酸， V为缬氨酸， P为脯氨酸， G为甘氨酸。实施例所用固相合成载体 Rink酰胺树脂为天津南开合成责任有限公司产品； HBTU、 HOBt、 DIEA及 Fmoc保护的天然氨基酸和 D型的非天然氨基酸为上海吉尔生化公司及成都诺新技术责任公司产品。 N-曱基吡咯烷酮

( MP )为 ACROS公司产品； TFA为北京博迈科技有限公司产品； DMF、 DCM为韩国三星公司产品；色谱纯乙腈为 Fisher公司产品。其它试剂如无说明均为国产分析纯产品。实施例 1 抗 HIV-1多肽 1-42的设计

发明人系统考察了包膜类病毒的融合原理及其抑制特性，从多个包膜类病毒（人副流感病毒 3型 HPIV3^[2], 猴副流感病毒 SV5^[3] , 严重急性呼吸综合征 SARS病毒 ^[4], 小鼠肝炎病毒 MHV^[4], 新城疫病毒 NDV^[5], 人偏肺病毒 hMPV^[6], 呼吸道合胞病毒 RSV^[3], 戊型肝炎病毒 HeV^[2],尼帕病毒 NiV^[7],麻疹病毒 MeV^[7] ,仙台病毒 SeV^[7] ,貪肺病毒 APV^[8] ,猫传染性腹膜炎病毒 FIPV^[9] 和人冠状病毒 229E HCoV-229E^[9] ) 的融合糖蛋白跨膜亚基的 CHR序列中，截取对应的长度约为 36个氨基酸的多肽。设计的多肽序列 SEQ ID NO: 1-42 见表 1 , 同时标明了其来源病毒。为方便浓度测定，我们首先在多肽氨基末端关键位点引入一个色氨酸（W ) 残基，首选为 1位，或者 4位。然后我们根据 HIV-1 gp41 CHR 多肽序列，在 1、 4位点再引入一个色氨酸，形成 WaaWaaaX (其中 a为氨基酸）模板，其中 X为疏水氨基酸残基，使其具有和 gp41 CHR相同的结合区模板，考察活性。在 Seql6, Seql7中 4位引入 W时，我们同时将 3位 F突变为 E，以保证该段序列的整体疏水性保持不变。活性验证结果参见实施例 3。实施例 2 抗 HIV-1多肽 1-42的制备

采用标准的 Fmoc固相多肽合成方法。将实施例 1设计的抗 HIV-1多肽序列 SEQ ID NO: 1-42的 C-端酰胺化， N-端乙酰化，得到多肽 1-42。选用 Rink Amide树脂，肽类由 C-端向 N-端延长。缩合剂为 HBTU/HOBt/DIEA。脱保护剂为哌啶 /DMF溶液。裂解剂为 TFA, 粗肽水溶解后冻干保存。用中压液相色谱法或 HPLC进行分离纯化，纯肽含量>95%。基质辅助激光解析飞行时间质谱 ( MALDI-TOF-MS )确定多肽分子量。

具体微波多肽合成条件如下：

氨基酸： 0.2 M的 DMF溶液；活化剂： 0.45M HBTU/HOBt的 DMF溶液；活化碱： 2M DIEA的 NMP溶液；脱保护剂： 20% v/v哌啶的 DMF溶液；封闭试剂： 20% v/v乙酸酐的 DMF溶液。

称取 Rink Amide树脂 0.5g ( 0.25 mmol )置入 CEM微波多肽合成仪的反应器中，然后将氨基酸、活化剂、活化碱、脱保护试剂、封闭试剂按上述条件配好后，用 CEM微波全自动多肽合成仪进行合成。完成后肽树脂用 DMF 洗涤 3遍后用无水曱醇收缩，室温真空干燥，得肽树脂 2.05g。

肽树脂的裂解：将上述合成好的肽树脂称量后放入 250ml茄形瓶中，冰浴，电磁搅拌。按 lg肽树脂加入 10ml的量配置裂解液（体积比：三氟乙酸：乙二硫醇：间苯酚：水 =82.8:10:5:2.5 ) 。 TFA需预先冰浴降温 30min或者预先放于冰箱中使用。将配制好的裂解液加入到冰浴条件下的肽树脂中，电磁搅拌，树脂变橙红色，冰浴条件下反应 30min, 然后撤冰浴，室温下再继续反应 90min使反应完成。剧烈搅拌下向反应器中加入冷乙醚 200ml，析出白色沉淀，继续搅拌 30min; 用 G4的砂芯抽滤漏斗滤出析出物，用冷乙醚反复洗涤 3遍，晾干。加入双蒸水 50ml，乙腈 5ml使固体充分溶解，抽滤，滤液冻干得粗肽 1.03g。

所得粗肽用中压或高压色谱进行纯化。色 i普柱为 C18柱，洗脱液为乙腈，水及少量乙酸。具体操作步骤：称取粗肽 lg, 加水 20ml，乙腈 5ml溶解， 3000转 /分钟下离心 lOmin,取上清液上样。色 i普柱预先用 15%乙腈 /水 /0.1% 冰乙酸溶液 200ml平衡，上样后继续用 200ml同样洗脱液平衡，高效液相检测洗脱液成分。根据检测结果逐步升高乙腈含量，直至所纯化的多肽峰被洗脱出来。合并同组分洗脱液，旋转蒸发除去大部分溶剂，冻干得纯肽， HPLC 检测含量>90%。

纯肽经 MALDI-TOF-MS质 i瞽确定其分子量。采用以上方法分别合成多肽 1-42 (见表 1 ) 。多肽序列、来源及分子量

¾VA3NlHaia¾0INAASVN DS

88ZLZI/£10Z OAV VFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDY

27 LKC132 NiV 4158.7 95.0

IKEAQRLLDTV ( SEQ ID NO: 27 )

WSLERLDVGTNLGNAIAKLEDAK

28 LKC163 MeV 4057.5 90.0

ELLESSDQILRSM ( SEQ ID NO: 28 )

WSLEWLDVGTNLGNAIAKLEDAK

29 LKC153 MeV 4087.5 95.0

ELLESSDQILRSM ( SEQ ID NO: 29 )

ISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKE

30 LKC133 MeV 3985.4 99.1

LLESSDQILRSM ( SEQ ID NO: 30 )

WVDISLNLADATNFLQDSKAELEK

31 LKC164 SeV 4222.3 91.0

ARKILSEVGRWY ( SEQ ID NO: 31 )

WVDWSLNLADATNFLQDSKAELE

32 LKC154 SeV KARKILSEVGRWY ( SEQ ID NO: 4295.1 97.8

32 )

PVDISLNLADATNFLQDSKAELEK

33 LKC134 SeV 4133.8 99.0

ARKILSEVGRWY ( SEQ ID NO: 33 )

WDQFNVALDQVFESVEKSQNLIDQ

34 LKC165 APV 4194.0 97.0

SNKILDSIEKGN ( SEQ ID NO: 34 )

WDQWNVALDQVFESVEKSQNLID

35 LKC155 APV 4233.5 95.0

QSNKILDSIEKGN ( SEQ ID NO: 35 )

EDQFNVALDQVFESVEKSQNLIDQ

36 LKC135 APV 4137.6 97.7

SNKILDSIEKGN ( SEQ ID NO: 36 )

WLNLTGEIDDLEFRSEKLHNTTVE

37 LKC167 FIPV 4210.4 97.6

LAILIDNINNTL ( SEQ ID NO: 37 )

WLNWTGEIDDLEFRSEKLHNTTV

38 LKC157 FIPV 4284.1 94.0

ELAILIDNINNTL ( SEQ ID NO: 38 )

YLNLTGEIDDLEFRSEKLHNTTVE

39 LKC137 FIPV 4187.5 98.9

LAILIDNINNTL ( SEQ ID NO: 39 )

HCoV WLNLTSEISTLENKSAELNYTVQK

40 LKC168 4149.5 90.8

-229E LQTLIDNINSTL ( SEQ ID NO: 40 )

HCoV WLNWTSEISTLENKSAELNYTVQK

41 LKC158 4223.8 95.4

-229E LQTLIDNINSTL ( SEQ ID NO: 41 )

HCoV ILNLTSEISTLENKSAELNYTVQKL

42 LKC138 4077.2 90.0

-229E QTLIDNINSTL ( SEQ ID NO: 42 ) 实施例 3: 多肽的抗 HIV-1融合活性检测。

我们用 HIV-1 Env介导的细胞-细胞融合模型对实施例 2制备的多肽 1-42 进行活性测定。靶细胞为 TZM-bl细胞（美国 NIH艾滋病试剂和参照物项目提供，目录号为 8129 ) , 其表面表达 CD4 T-细胞受体和趋化因子辅助受体 CCR5和 CXCR4, 可被 HIV-1 Env识别 , 同时细胞内还转录荧光素酶报告基因，但不含该基因的启动子，因此单独细胞的荧光素酶背景表达量很低。效应细胞为 HL2/3细胞（美国 NIH艾滋病试剂和参照物项目提供，目录号为 1294 ) , 其表面表达 HIV-1 Env, 由 Env进攻靶细胞，完成细胞融合，同时细胞内还转录荧光素酶报告基因的启动子。两种细胞先在含有氨苄 /链霉素双抗的含 10%胎牛血清的 DMEM中 , 37°C下在含有 5% C0₂的培养箱中单独培养。两种细胞均为贴壁细胞，细胞胰酶 /EDTA消化后收获传代。细胞用细胞计数板计数。

将 TZM-bl靶细胞用培养基调整到浓度为 75万 /ml,以每孔 50μ1加入 96 孔细胞培养板中（3.75万 /孔） , 5% C0₂, 37度下培养 24小时。

将多肽 1-42或阳性对照样品 T20溶于磷酸緩冲溶液生理盐水 ( PBS )中，或加入适量 DMSO使充分溶解，用紫外光 i普仪在 280nm处测定多肽浓度。然后将多肽溶液稀释到适当的浓度，在 96孔酶标板（ Corning ) 中等比稀释 (浓度为 1200、 300、 75、 19、 5、 1.25 μΜ ) 。

配制 150万 /ml的 HL2/3效应细胞。

将 20μ1/孔的等比稀释的多肽 1-42加入前一天培养的 TZM-bl细胞中，然后加入 50μ1/孔的配制好的 HL2/3效应细胞； 96孔细胞培养板的其中一排用 PBS替代抑制剂用于测定饱和融合信号，另一排用 DMEM培养基替代 HL2/3细胞用于测定背景信号。 5% C0₂, 37°C下培养 6-8小时使之充分融合。

将荧光素酶报告基因的试剂盒（Promega )从冰箱中取出，将 5x细胞裂解液根据用量用双蒸水稀释至 lx裂解液，室温下放置；用底物緩冲液溶解底物，室温下放置；同时将酶标仪 ( Molcular Devices M5多功能酶标仪）检测条件设置好备用。

将融合好的细胞取出，弃去培养基，用 200μ1/孔 PBS洗两次，尽量去除清洗液；然后以 50μ1/孔加入平衡到室温的裂解液，轻轻震动下反应 5min使细胞充分裂解；将裂解液以 40μ1/孔加入 96 孔化学发光检测用酶标板板 ( Corning ) 中，加样时尽量避免引入气泡；避光下将底物以 40μ1/孔迅速加入化学发光用酶标板中，立即在酶标仪上测定化学发光。

根据饱和融合信号和背景信号的比值确定靶细胞和效应细胞的有效融合, 比值 >5 表明有效融合。根据样品的浓度-化学发光信号曲线确定其半抑制剂浓度（IC₅。），阳性对照样品的 IC₅。值应稳定在一定范围；理想的抑制曲线中高浓度抑制剂下信号应接近背景信号，最低浓度抑制剂下信号应接近饱和融合信号。

多肽 1-42的细胞融合抑制活性列于表 2, 阳性对照 T20的 IC₅。为 2±0.5 nM, 与文献报道相符^[1()]。表 2: 多肽 1-42的细胞融合抑制活性

多肽

名称来源病毒序列 IC₅₀( M)

编号

1 LKC066 HPIV3 SEQ ID NO: 1 21.6±3.9

2 LKC076 HPIV3 SEQ ID NO: 2 4.5±0.6

3 LKC107 HPIV3 SEQ ID NO: 3 >166.7

4 LKC067 SV5 SEQ ID NO: 4 34±15.5

5 LKC077 SV5 SEQ ID NO: 5 21.9±5.7

6 LKC108 SV5 SEQ ID NO: 6 63±25

7 LKC068 SARS SEQ ID NO: 7 22±1.5

8 LKC078 SARS SEQ ID NO: 8 38±10.4

9 LKC109 SARS SEQ ID NO: 9 9.8±3.5

10 LKC069 MHV SEQ ID NO: 10 14.8±9.1

11 LKC079 MHV SEQ ID NO: 11 4.4±0.5

12 LKC110 MHV SEQ ID NO: 12 10.5±1.1

13 LKC070 NDV SEQ ID NO: 13 1.38±0.16

14 LKC080 NDV SEQ ID NO: 14 46±3.7

15 LKC095 NDV SEQ ID NO: 15 »183

16 LKC072 hMPV SEQ ID NO: 16 2.2±0.9,

17 LKC081 hMPV SEQ ID NO: 17 17.0±3.1

18 LKC096 hMPV SEQ ID NO: 18 1.8±0.01

19 LKC074 RSV SEQ ID NO: 19 39±11

20 LKC082 RSV SEQ ID NO: 20 44±5

21 LKC111 RSV SEQ ID NO: 21 »200

22 LKC075 HeV SEQ ID NO: 22 94±24

23 LKC084 HeV SEQ ID NO: 23 1.07±0.3

24 LKC112 HeV SEQ ID NO: 24 92±18.3

25 LKC162 NiV SEQ ID NO: 25 26±11

26 LKC152 NiV SEQ ID NO: 26 3.9±1.2

27 LKC132 NiV SEQ ID NO: 27 43±6.1

28 LKC163 MeV SEQ ID NO: 28 136±37

29 LKC153 MeV SEQ ID NO: 29 19.9±3.1 30 LKC133 MeV SEQ ID NO: 30 40±20

31 LKC164 SeV SEQ ID NO: 31 16.7±2.7

32 LKC154 SeV SEQ ID NO: 32 5.5±1.1

33 LKC134 SeV SEQ ID NO: 33 18.9±8.9

34 LKC165 APV SEQ ID NO: 34 340±67

35 LKC155 APV SEQ ID NO: 35 66±8.4

36 LKC135 APV SEQ ID NO: 36 43±14.1

37 LKC167 FIPV SEQ ID NO: 37 41±10.5

38 LKC157 FIPV SEQ ID NO: 38 34±9.6

39 LKC137 FIPV SEQ ID NO: 39 66±42

40 LKC168 HCoV-229E SEQ ID NO: 40 13.2±3.7

41 LKC158 HCoV-229E SEQ ID NO: 41 14.5±1,7

42 LKC138 HCoV-229E SEQ ID NO: 42 »200 根据表 2的活性检测结果，多肽 1-42除 3、 15、 21、 42外均显示出明显抗 HIV活性，半抑制浓度 IC₅。从 1到数十 μΜ不等，而所有研究的病毒中都含有活性多肽序列，且活性都有改进空间，符合药物先导化合物的活性标准。同时还可看出，活性与我们引入的色氨酸残基有些关系，但没有明显的规律，因此其作用机制与含有 WWI结构模板口袋结合区的已知多肽融合抑制剂不同。但以上结果表明我们可以通过改变氨基酸残基进行活性改进。例如化合物 21仅通过引入一个色氨酸残基，活性得到约 7倍提高。实施例 4: 多肽的实验室适应病毒株 HIV-1_IIIB感染抑制实验

1. 实验用品

实验室适应病毒株 HIV-1IIIB、 MT-2细胞（通过美国国立健康研究院 ( NIH ) 艾滋病研究参考试剂计划获得）。

2. 实验方法

用实验室适应病毒株 HIV-1IIIB感染抑制实验考察了部分活性较好多肽的活性。在 200ul的 RPMI1640培养基中，用 100 TCID50 ( 50%组织培养感染量）的 HIVIIIB毒株去感染 10⁴/ml MT-2细胞，同时加入呈浓度梯度的不同抑制剂，过夜培养之后弃去培养上清液，换上新鲜的培养基。感染后第四天，从每个孔中取出 lOOul培养上清液，加入等体积的 5% Triton X-100,用 ELISA方法定量检测 p24抗原。具体实验方法亦可参考 Jiang, S., et al., Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 2004. 48(11): p. 4349-4359. 3. 实验结果

如下面的表 3所示。

表 3: 多肽的 HIV病毒感染抑制活性

我们选择细胞融合活性中活性较好的多肽，测定其抗病毒感染活性。结果显示，这些测试多肽显示与细胞融合活性相似的 IC50值，可以用作先导化合物开发新型融合抑制剂。实施例 5: 抗 HIV-1多肽 1-42与 NHR靶点的作用

我们用圆二色谱（CD )研究实施例 2制备的多肽 1、 4、 7、 10、 13、 16、 19、 22 与 gp41 NHR 靶点的相互作用，我们选用 N46 (序列： Ac-TLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARI L-CONH₂ ) 作为 gp41 NHR 靶点，其中序列 TLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL为 SEQ ID NO: 43ο 圓二色 i普仪为 Biologic MOS450谱仪。将待测定 CHR多肽 1、 4、 7、 10、 13、 16、 19、 22分别溶于 PBS中， N46溶于双蒸水中，根据 280nm下紫外吸收确定浓度；然后配制 20 μΜ的多肽 PBS溶液。

配制要检测的多肽样品：将 N46和多肽 1、 4、 7、 10、 13、 16、 19、 22 分别以 1: 1体积比混合得二者混合样品；如果是单独多肽样品，将 20 μΜ 的样品与緩冲溶液以 1:1混合。样品在 37°C下放置 30min使充分反应。上述实验步骤可确保样品中的多肽浓度保持一致。

将配制好的样品在圓二色 i普仪上测定，仪器扫描波长范围为 190-260nm , 波长间隔为 lnm, 扫描速度为 100nm/min, 扫描 4次进行平均。先用緩冲溶液扫描得到空白，然后扫描样品信号，将空白信号从样品信号中扣除得到 CD 信号

者的相互作用。 CD信号变化表明两者具有相互作用。多肽 1、 4、 7、 10、 13、 16、 19、 22分别与 N46混合后都出现 CD信号变化，表明它们均作用于 gp41 NHR，通过与 NHR形成无活性的六螺旋结构抑制 HIV与人体细胞的融合（图 1 ) 。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。参考文献

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Claims

5

) CSOVsvsoOSSV aiS XZAZHllaaxHLilzMSZAIasax - n o ) CS SVsvsCSSV αΐSZAZ313a¾H¾lzI:H3ZA>I3x , S

CSSVSOCsoSSOSS αιS AlsMWMIAOnzIMIICLSalAx- I η ε

CSovSOCsoSS&SS αιS AlclxaxIAOMnsMICLSlχ -

S

ι

CSδόν888 αιS ΊζΙζαΙΊΊ:ΗΛ1ΛΖΊ3:ΗΖ3Ί1Ι3ζ¾χ -. 2 42 ) -Z;

或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐；其中，

X为乙酰基、寡肽序列、亲脂性基团、聚乙二醇或缺失；

Z为酰胺基、寡肽序列、亲脂性基团、聚乙二醇或缺失。

2. 权利要求 1的多肽，其选自以下多肽：

( l )SEQ ID NO: 1 - 42中的任一序列在 N端和 /或 C端有 1-10、 1-5、 1-2个氨基酸的截短；

( 2 )SEQ ID NO: 1 - 42中的任一序列在 N端和 /或 C端有 1-10、 1-5、 1-2个氨基酸的延伸；

( 3 ) SEQ ID NO: 1 ~ 42中的任一序列有 1-10、 1-5、 1-2个氨基酸的替换，或上述（1 ) 和（2 ) 的序列中有 1-10、 1-5、 1-2个氨基酸的替换；

( 4 )权利要求 1 的多肽经过末端和 /或侧链化学修饰得到的多肽，或上述（1 ) ~ ( 3 ) 的多肽经过末端和 /或侧链化学修饰得到的多肽。

( 5 ) 上述（1 ) ~ ( 4 ) 的多肽，第一位氨基酸和 /或第四位氨基酸用色氨酸残基替换，和 /或第八位氨基酸用疏水氨基酸残基替换后得到的多肽。

3. 核酸分子，其含有编码权利要求 1或 2所述多肽的核苷酸序列。

4. 重组载体，其含有权利要求 3所述的核酸分子。

5. 重组细胞，其含有权利要求 4所述的重组载体。

6. 包含权利要求 1或 2所述多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐的融合蛋白，或所述多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐与其他蛋白或毒素或脂类等载体（如大分子载体或重组载体）偶联或融合而得到的复合物，或者展示上述多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐的类病毒颗粒。

7. 组合物（例如药物组合物），其含有至少一种权利要 1或 2所述的多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐，或者权利要求 6所述的融合蛋白、复合物或类病毒颗粒，以及任选的药学上可接受的载体或辅料。

8. 权利要 1或 2所述的多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐、权利要求 6所述的融合蛋白、复合物或类病毒颗粒在制备 HIV融合抑制剂中的用途。

9. 权利要 1或 2所述的多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐、权利要求 6所述的融合蛋白、复合物或类病毒颗粒在制备用于治疗或预防 HIV感染相关疾病例如艾滋病或者其它包膜类病毒感染引起的疾病的药物中的用途。

10. 一种预防或治疗 HIV感染相关疾病例如艾滋病或者其它包膜类病毒感染引起的疾病的方法，所述方法包括给有需要的受试者以预防或治疗有效量的权利要 1或 2所述的多肽或其衍生物、立体异构体、无生理毒性的盐、权利要求 6所述的融合蛋白、复合物或类病毒颗粒的步骤。

11. 一种获得抑制 HIV与靶细胞融合的融合抑制剂的方法，该方法包括从除 HIV以外的病毒的 CHR功能区序列上截取适当长度的多肽片段，所述多肽片段能够和 NHR功能区结合形成无活性的六螺旋结构。

12. 权利要求 11的方法，其中所述除 HIV以外的病毒是指利用第一类融合蛋白作为融合工具的病毒，例如为包膜类病毒；所述病毒例如为人副流感病毒 3型 HPIV3, 猴副流感病毒 SV5, 严重急性呼吸综合征 SARS病毒，小鼠肝炎病毒 MHV, 新城疫病毒 NDV, 人偏肺病毒 hMPV, 呼吸道合胞病毒 RSV，戊型肝炎病毒 He V,尼帕病毒 NiV，麻疹病毒 MeV,仙台病毒 SeV, 貪肺病毒 APV,猫传染性腹膜炎病毒 FIPV或人冠状病毒 229E HCoV-229E。

13. 权利要求 11的方法，其中所述适当长度是指包含 30-40个氨基酸。

14. 根据权利要求 11-13所述方法获得的抑制 HIV与靶细胞融合的融合抑制剂。