CN114249799B - 一种抗冠状病毒多肽及其应用 - Google Patents

一种抗冠状病毒多肽及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114249799B
CN114249799B CN202010995877.4A CN202010995877A CN114249799B CN 114249799 B CN114249799 B CN 114249799B CN 202010995877 A CN202010995877 A CN 202010995877A CN 114249799 B CN114249799 B CN 114249799B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
seq
coronavirus
amino acid
fmoc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010995877.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114249799A (zh
Inventor
陈龙
裴鹏飞
罗施中
秦宏博
范华昊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing University of Chemical Technology
Original Assignee
Beijing University of Chemical Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing University of Chemical Technology filed Critical Beijing University of Chemical Technology
Priority to CN202010995877.4A priority Critical patent/CN114249799B/zh
Publication of CN114249799A publication Critical patent/CN114249799A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114249799B publication Critical patent/CN114249799B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了一种抗冠状病毒多肽及其应用，制备了抗冠状病毒的合成多肽(SI1、SI1‑b、SI2、SI2‑b、SI2‑1、SI2‑1‑b、SI2‑2、SI2‑2‑b、SI3、SI3‑b、SI3‑1、SI3‑1‑b、SI4‑1、SI4‑1‑b)。其中，SI4‑1、SI4‑1‑b多肽抗冠状病毒的EC50分别为2.46μM和2.03μM，在100μM浓度下均能抑制冠状病毒入侵细胞90％以上，还能有效抑制SARS‑CoV‑2假病毒侵入细胞，并且具有很好的安全性，可以在研发抗新型冠状病毒多肽药物上推广使用。

Description

一种抗冠状病毒多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抗冠状病毒多肽及其应用。
背景技术
新型严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是引起新型严重急性呼吸综合征(COVID-19)的病原体，也是继SARS-CoV、MERS-CoV之后引起人类严重疾病的第三种重要的冠状病毒，属于冠状病毒科，β冠状病毒属。尽管对该病毒的感染过程已经有一定认识，但截至目前仍然没有针对COVID-19的特效药。自新冠病毒疫情爆发以来，多项基于小分子药物的临床试验积极开展，但由于小分子特效药的研发通常需要较长的时间，且易受到病毒耐药性问题的困扰，想要在短时间内找到具有特异性抗病毒活性的小分子药物仍极具挑战。
然而，随着近期取得的有关SARS-CoV-2的研究结果，发现抗病毒多肽可能是另一种具有潜力的候选药物。抗病毒多肽可以来源于天然产物，也可以基于生物信息学的设计人工合成。后者成本低廉、制造快捷，是短期内有可能获得的抗病毒武器；而且多肽药物具有高特异性、低毒性等优点，通过计算机辅助药物设计等方法，可以大幅缩短研发周期。因此，亟需研究和开发抗冠状病毒的多肽，作为治疗COVID-19的药物或制剂的重要组成部分，有效地抑制SARS-CoV-2等冠状病毒。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明旨在提供一种抗冠状病毒多肽，具有明显的抗冠状病毒活性。
一种抗冠状病毒多肽，所述多肽含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的任意一种氨基酸序列或如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的任意一种氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。
进一步地，所述多肽还含有如SEQ ID No.3～SEQ ID No.14所示的任意一种氨基酸序列或如SEQ ID No.3～SEQ ID No.14所示的任意一种氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。
进一步地，所述SEQ ID No.1～SEQ ID No.14抗冠状病毒多肽对GX_P2V冠状病毒或SARS-CoV-2假病毒侵染细胞具有抑制作用。
本发明所述SEQ ID No.1～SEQ ID No.14抗冠状病毒多肽以固相合成树脂为起始原料，通过Fmoc化学合成制备；所述SEQ ID No.1～SEQ ID No.14抗冠状病毒多肽作为抗冠状病毒的活性成份，可用于制备抗冠状病毒的药物或制剂中。
本发明设计并制备了抗冠状病毒多肽，研究其与病毒蛋白或关键宿主因子的相互作用；利用与SARS-CoV-2具有较高同源性的穿山甲冠状病毒GX_P2V和SARS-CoV-2假病毒作为模型，验证其抑制病毒入侵的效果，并探究病毒侵入细胞的机制；制备的所述SI1、SI1-b、SI2、SI2-b、SI2-1、SI2-1-b、SI2-2、SI2-2-b、SI3、SI3-b、SI3-1、SI3-1-b、SI4-1、SI4-1-b多肽在100μM浓度下均能抑制冠状病毒侵染细胞。其中，所述SI2-1多肽、SI2-2多肽、SI2-2-b多肽、SI3多肽、SI4-1多肽和SI4-1-b多肽在100μM浓度下能有效抑制病毒入侵细胞90％以上；且所述SI4-1和SI4-1-b多肽还能有效抑制SARS-CoV-2假病毒侵入细胞。所述抗冠状病毒多肽在抗新型冠状病毒多肽药物的研发上具有重要的应用前景。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.1，SI4-1的HPLC分析图。
图2示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.1，SI4-1的质谱分析图。
图3示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.2，SI4-1-b的HPLC分析图。
图4示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.2，SI4-1-b的质谱分析图。
图5示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.3，SI1的HPLC分析图。
图6示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.3，SI1的质谱分析图。
图7示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.4，SI1-b的HPLC分析图。
图8示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.4，SI1-b的质谱分析图。
图9示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.5，SI2的HPLC分析图。
图10示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.5，SI2的质谱分析图。
图11示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.6，SI2-b的HPLC分析图。
图12示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.6，SI2-b的质谱分析图。
图13示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.7，SI2-1的HPLC分析图。
图14示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.7，SI2-1的质谱分析图。
图15示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.8，SI2-1-b的HPLC分析图。
图16示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.8，SI2-1-b的质谱分析图。
图17示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.9，SI2-2的HPLC分析图。
图18示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.9，SI2-2的质谱分析图。
图19示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.10，SI2-2-b的HPLC分析图。
图20示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.10，SI2-2-b的质谱分析图。
图21示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.11，SI3的HPLC分析图。
图22示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.11，SI3的质谱分析图。
图23示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.12，SI3-b的HPLC分析图。
图24示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.12，SI3-b的质谱分析图。
图25示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.13，SI3-1的HPLC分析图。
图26示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.13，SI3-1的质谱分析图。
图27示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.14，SI3-1-b的HPLC分析图。
图28示出了根据本发明实施例的SEQ ID No.14，SI3-1-b的质谱分析图。
图29示出了根据本发明实施例的100μM多肽抑制GX_P2V冠状病毒侵染细胞的效果分析图。
图30示出了根据本发明实施例的不同浓度的多肽抑制GX_P2V冠状病毒侵染细胞的效果分析图。
图31示出了根据本发明实施例的不同浓度的多肽对Vero E6细胞的毒性结果分析图。
图32示出了根据本发明实施例的采用含有S蛋白的SARS-CoV-2假病毒和表达hACE2的COS7细胞检测抗病毒多肽SI4-1和SI4-1-b抑制病毒侵入细胞的作用分析图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种抗冠状病毒多肽，所述多肽序列及来源序列信息如下表：
表1抗冠状病毒多肽的氨基酸序列
(1)SEQ ID No.1的信息
(a)序列特征
长度：7氨基酸；
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.1
QAKTFLD
(2)SEQ ID No.2的信息
(a)序列特征
长度：7氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.2
Ac-QAKTFLD-NH2
其中，Ac-表示氨基酸Q的氨基被乙酰化；-NH2表示氨基酸D的羧基被乙酰化。
(3)SEQ ID No.3的信息
(a)序列特征
长度：22氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.3
MQAKTFLDKFNHEAEDLFYQKR
(4)SEQ ID No.4的信息
(a)序列特征
长度：22氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.4
Ac-MQAKTFLDKFNHEAEDLFYQKR-NH2
其中，Ac-表示氨基酸M的氨基被乙酰化；-NH2表示氨基酸R的羧基被乙酰化。
(5)SEQ ID No.5的信息
(a)序列特征
长度：20氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.5
MQAKTFLDKFNHEAEDLFYQ
(6)SEQ ID No.6的信息
(a)序列特征
长度：20氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.6
Ac-MQAKTFLDKFNHEAEDLFYQ-NH2
其中，Ac-表示氨基酸M的氨基被乙酰化；-NH2表示氨基酸Q的羧基被乙酰化。
(7)SEQ ID No.7的信息
(a)序列特征
长度：14氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.7
MQAKTFLDKFNHEA
(8)SEQ ID No.8的信息
(a)序列特征
长度：14氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.8
Ac-MQAKTFLDKFNHEA-NH2
其中Ac-表示氨基酸M的氨基被乙酰化；-NH2表示氨基酸A的羧基被乙酰化。
(9)SEQ ID No.9的信息
(a)序列特征
长度：20氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.9
QAKTFLDKFNHEAEDLFYQM
(10)SEQ ID No.10的信息
(a)序列特征
长度：20氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.10
Ac-QAKTFLDKFNHEAEDLFYQM-NH2
其中Ac-表示氨基酸Q的氨基被乙酰化；-NH2表示氨基酸M的羧基被乙酰化。
(11)SEQ ID No.11的信息
(a)序列特征
长度：9氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.11
MQAKTFLDK
(12)SEQ ID No.12的信息
(a)序列特征
长度：9氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.12
Ac-MQAKTFLDK-NH2
其中，Ac-表示氨基酸M的氨基被乙酰化；-NH2表示氨基酸K的羧基被乙酰化。
(13)SEQ ID No.13的信息
(a)序列特征
长度：9氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.13
MQAKTFLDH
(14)SEQ ID No.14的信息
(a)序列特征
长度：9氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.14
Ac-MQAKTFLDH-NH2
其中，Ac-表示氨基酸M的氨基被乙酰化；-NH2表示氨基酸H的羧基被乙酰化。
所述抗冠状病毒多肽的制备及纯化方法具体为：
实施例1：SEQ ID No.1，SI4-1多肽的制备
本发明SI4-1多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其步骤如下：
(1)活化树脂：将连接Fmoc保护的天门冬氨酸的Wang树脂(购自吉尔生化上海有限公司)称好，倒入干净无水的固相反应器中，加入5ml DCM(二氯甲烷)溶解活化，过夜；
(2)清洗树脂：抽干反应器中的液体，加入4ml DMF(N,N-二甲基甲酰胺)充分震荡1min，抽干，如此反复操作8次；收集少量活化后的树脂留待做Kaiser检测；
(3)脱Fmoc保护：抽干溶剂后，加入4ml含有20％哌啶的DMF溶液，置于摇床，震荡5min后抽干溶剂；再加入4ml含20％哌啶的DMF溶液，置于摇床，震荡20min；
(4)清洗树脂、除去哌啶：抽干溶剂后，加入4ml DMF溶液，置于摇床，震荡1min，后抽干；如此反复，重复8次直至哌啶被完全除去；
(5)电子天平称取待接入的氨基酸(即Fmoc保护的亮氨酸)和耦合试剂：将4倍量的氨基酸、3.9倍的HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)、4倍量的HOBT(1-羟基苯并三唑)溶于4ml DMF中，混合至完全溶解后，加入到固相反应器中与树脂充分混合，摇床振荡五分钟；
(6)到时后，加入摩尔量为树脂的8倍的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，充分混合后，置于摇床中，计时反应2h；
(7)后续依次接入Fmoc保护的苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺(购自吉尔生化上海有限公司)，每接一个氨基酸需重复操作步骤2-6；
(8)Kaiser检测，茚三酮与氨或一级胺产生紫红色络合物，Kaiser试剂包括：6％的茚三酮乙醇溶液；80％的苯酚乙醇溶液；2％0.001M的KCN吡啶溶液，取少量步骤(6)中反应完成时的树脂，和步骤(2)中的树脂，加Kaiser试剂中的三种成分各2-3滴，100℃加热1-2min，若呈现蓝色或红褐色表明还有游离的氨基，相反则表示连接完全；
(9)肽链接合完毕时，清洗树脂后，用哌啶脱保护两次；
(10)用DMF清洗树脂10次，每次4ml；再用DCM清洗树脂10次，每次4ml；
(11)真空干燥样品；
(12)待样品干燥完毕之后，将树脂转移到鸡心瓶中，装好磁力搅拌器，将鸡心瓶固定好，缓慢加入混合好的切割试剂(三氟乙酸：超纯水：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇＝82.5:5:5:5:2.5)，加入磁子进行充分搅拌，室温下反应12h；
(13)待反应完成，将反应物转移至固相反应器中，以反应固相反应器中未转移的树脂，如此静置10min，用TFA(三氟乙酸)冲洗鸡心瓶，将所有树脂和溶液倒入固相反应器中，后将混合物在氮气流下过滤，滤液置于圆底烧瓶中，在氮气流下吹干；
(14)待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气，在圆底烧瓶中倒入约20ml冰乙醚沉淀多肽，将不溶物充分打散，然后配平，置于冷冻离心机内，4℃下8000rpm/min离心15min，弃上清，再溶于20ml冰乙醚中打散，离心；如此重复操作离心3次，将沉淀真空干燥，得到多肽粗品；
(15)多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，纯化后再用分析型HPLC进行纯度分析，其HPLC图如图1所示；
(16)对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图2所示，由图测得所合成的SI4-1多肽的分子量为821.8，说明其氨基酸序列如本发明SEQ ID No.1所示。
实施例2：SEQ ID No.2，SI4-1-b多肽的制备
本发明SI4-1-b多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其步骤如下：
(1)活化树脂：将Fmoc保护的Rink Amide MBHA树脂(购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司)称好，倒入干净无水的固相反应器中，加入5ml DCM(二氯甲烷)溶解活化，过夜；
(2)清洗树脂：抽干反应器中的液体，加入4ml DMF(N,N-二甲基甲酰胺)充分震荡1min，抽干，如此反复操作8次；收集少量活化后的树脂留待做Kaiser检测；
(3)脱Fmoc保护：抽干溶剂后，加入4ml含有20％哌啶的DMF溶液，置于摇床，震荡5min后抽干溶剂；再加入4ml含20％哌啶的DMF溶液，置于摇床，震荡20min；
(4)清洗树脂、除去哌啶：抽干溶剂后，加入4ml DMF溶液，置于摇床，震荡1min，后抽干；如此反复，重复8次直至哌啶被完全除去；
(5)电子天平称取待接入的氨基酸(即Fmoc保护的天门冬氨酸)和耦合试剂：将4倍量的氨基酸、3.9倍的HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)、4倍量的HOBT(1-羟基苯并三唑)溶于4ml DMF中，混合至完全溶解后，加入到固相反应器中与树脂充分混合，摇床振荡五分钟；
(6)到时后，加入摩尔量为树脂的8倍的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，充分混合后，置于摇床中，计时反应2h；
(7)后续依次接入Fmoc保护的亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺(购自吉尔生化上海有限公司)，每接一个氨基酸需重复操作步骤2-6；
(8)Kaiser检测，茚三酮与氨或一级胺产生紫红色络合物，Kaiser试剂包括：6％的茚三酮乙醇溶液；80％的苯酚乙醇溶液；2％0.001M的KCN吡啶溶液，取少量步骤(6)中反应完成时的树脂，和步骤(2)中的树脂，加Kaiser试剂中的三种成分各2-3滴，100℃加热1-2min，若呈现蓝色或红褐色表明还有游离的氨基，相反则表示连接完全；
(9)肽链接合完毕时，清洗树脂后，用哌啶脱保护两次，用步骤(4)中方法除去哌啶；
(10)将步骤(9)中得到的产物溶于4ml DMF，再加入50倍的乙酸酐和10倍的DIEA，置于摇床中反应1h；收集少量产物进行Kaiser检测，确定反应是否完全；
(11)用DMF清洗树脂10次，每次4ml；再用DCM清洗树脂10次，每次4ml；
(12)真空干燥样品；
(13)待样品干燥完毕之后，将树脂转移到鸡心瓶中，装好磁力搅拌器，将鸡心瓶固定好，缓慢加入混合好的切割试剂(三氟乙酸：超纯水：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇＝82.5:5:5:5:2.5)，加入磁子进行充分搅拌，室温下反应12h；
(14)待反应完成，将反应物转移至固相反应器中，以反应固相反应器中未转移的树脂，如此静置10min，用TFA(三氟乙酸)冲洗鸡心瓶，将所有树脂和溶液倒入固相反应器中，后将混合物在氮气流下过滤，滤液置于圆底烧瓶中，在氮气流下吹干；
(15)待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气，在圆底烧瓶中倒入约20ml冰乙醚沉淀多肽，将不溶物充分打散，然后配平，置于冷冻离心机内，4℃下8000rpm/min离心15min，弃上清，再溶于20ml冰乙醚中打散，离心；如此重复操作离心3次，将沉淀真空干燥，得到多肽粗品；
(16)多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，后用分析型HPLC进行纯度分析，结果如图3所示；
(17)对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图4所示，由图测得所合成的SI4-1-b多肽的分子量为862.3，说明其氨基酸序列如本发明SEQ ID No.2所示。
实施例3：SEQ ID No.3，SI1多肽的制备
本发明SI1多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其制备流程参照实施例1，具体区别如下：
步骤(1)中为连接Fmoc保护的精氨酸的Wang树脂(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(5)中所述待接入的氨基酸为Fmoc保护的赖氨酸；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、天门冬酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、天门冬酰胺、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(15)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，纯化后再用分析型HPLC进行纯度分析，其HPLC图如图5所示；
步骤(16)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图6所示，由图测得所合成的SI1多肽的分子量为2759.1，说明其氨基酸序列如本发明SEQ IDNo.3所示。
实施例4：SEQ ID No.4，SI1-b多肽的制备
本发明SI1-b多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其制备流程参照实施例2，具体区别如下：
步骤(5)中所述待接入的氨基酸为Fmoc保护的精氨酸；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的赖氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、天门冬酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、天门冬酰胺、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(16)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，后用分析型HPLC进行纯度分析，结果如图7所示；
步骤(17)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图8所示，由图测得所合成的SI1-b多肽的分子量为2800.4，说明其氨基酸序列如本发明SEQ IDNo.4所示。
实施例5：SEQ ID No.5，SI2多肽的制备
本发明SI2多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其制备流程参照实施例1，具体区别如下：
步骤(1)中为连接Fmoc保护的谷氨酰胺的Wang树脂(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(5)中所述待接入的氨基酸为Fmoc保护的酪氨酸；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的苯丙氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、天门冬酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、天门冬酰胺、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(15)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，纯化后再用分析型HPLC进行纯度分析，其HPLC图如图9所示；
步骤(16)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图10所示，由图测得所合成的SI2多肽的分子量为2475.3，说明其氨基酸序列如本发明SEQ IDNo.5所示。
实施例6：SEQ ID No.6，SI2-b多肽的制备
本发明SI2-b多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其制备流程参照实施例2，具体区别如下：
步骤(5)中所述待接入的氨基酸为Fmoc保护的谷氨酰胺；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、天门冬酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、天门冬酰胺、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(16)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，后用分析型HPLC进行纯度分析，结果如图11所示；
步骤(17)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图12所示，由图测得所合成的SI2-b多肽的分子量为2516.1，说明其氨基酸序列如本发明SEQ IDNo.6所示。
实施例7：SEQ ID No.7，SI2-1多肽的制备
本发明SI2-1多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其制备流程参照实施例1，具体区别如下：
步骤(1)中为连接Fmoc保护的丙氨酸的Wang树脂(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(5)中待接入的氨基酸为Fmoc保护的谷氨酸；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的组氨酸、天门冬酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(15)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，纯化后再用分析型HPLC进行纯度分析，其HPLC图如图13所示；
步骤(16)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图14所示，由图测得所合成的SI2-1多肽的分子量为1679.4，说明其氨基酸序列如本发明SEQ IDNo.7所示。
实施例8：SEQ ID No.8，SI2-1-b多肽的制备
本发明SI2-1-b多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其制备流程参照实施例2，具体区别如下：
步骤(5)中待接入的氨基酸为Fmoc保护的丙氨酸；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的谷氨酸、组氨酸、天门冬酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(16)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，后用分析型HPLC进行纯度分析，结果如图15所示；
步骤(17)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图16所示，由图测得所合成的SI2-1-b多肽的分子量为1720.8，说明其氨基酸序列如本发明SEQID No.8所示。
实施例9：SEQ ID No.9，SI2-2多肽的制备
本发明SI2-2多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其制备流程参照实施例1，具体区别如下：
步骤(1)中为连接Fmoc保护的甲硫氨酸的Wang树脂(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(5)中所述待接入的氨基酸为Fmoc保护的谷氨酰胺；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、天门冬酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、天门冬酰胺、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(15)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，纯化后再用分析型HPLC进行纯度分析，其HPLC图如图17所示；
步骤(16)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图18所示，由图测得所合成的SI2-2多肽的分子量为2475.6，说明其氨基酸序列如本发明SEQ IDNo.9所示。
实施例10：SEQ ID No.10，SI2-2-b多肽的制备
本发明SI2-2-b多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其制备流程参照实施例2，具体区别如下：
步骤(5)中所述待接入的氨基酸为Fmoc保护的甲硫氨酸；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、天门冬酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、天门冬酰胺、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(16)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，后用分析型HPLC进行纯度分析，结果如图19所示；
步骤(17)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图20所示，由图测得所合成的SI2-2-b多肽的分子量为2516.4，说明其氨基酸序列如本发明SEQID No.10所示。
实施例11：SEQ ID No.11，SI3多肽的制备
本发明SI3多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其制备流程参照实施例1，具体区别如下：
步骤(1)中为连接Fmoc保护的赖氨酸的Wang树脂(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(5)中所述待接入的氨基酸为Fmoc保护的天门冬氨酸；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(15)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，纯化后再用分析型HPLC进行纯度分析，其HPLC图如图21所示；
步骤(16)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图22所示，由图测得所合成的SI3多肽的分子量为1081.0，说明其氨基酸序列如本发明SEQ IDNo.11所示。
实施例12：SEQ ID No.12，SI3-b多肽的制备
本发明SI3-b多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其制备流程参照实施例2，具体区别如下：
步骤(5)中所述待接入的氨基酸为Fmoc保护的赖氨酸；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的天门冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(16)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，后用分析型HPLC进行纯度分析，结果如图23所示；
步骤(17)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图24所示，由图测得所合成的SI3-b多肽的分子量为1122.4，说明其氨基酸序列如本发明SEQ IDNo.12所示。
实施例13：SEQ ID No.13，SI3-1多肽的制备
本发明SI3-1多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其步骤参照实施例1，具体区别如下：
步骤(1)中为连接Fmoc保护的组氨酸的Wang树脂(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(5)中所述待接入的氨基酸为Fmoc保护的天门冬氨酸；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(15)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，纯化后再用分析型HPLC进行纯度分析，其HPLC图如图25所示；
步骤(16)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图26所示，由图测得所合成的SI3-1多肽的分子量为1090.0，说明其氨基酸序列如本发明SEQ IDNo.13所示。
实施例14：SEQ ID No.14，SI3-1-b多肽的制备
本发明SI3-1-b多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其制备流程参照实施例2，具体区别如下：
步骤(5)中所述待接入的氨基酸为Fmoc保护的组氨酸；
步骤(7)中后续依次接入Fmoc保护的天门冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸(购自吉尔生化上海有限公司)；
步骤(16)中多肽粗品利用制备型HPLC进行纯化，后用分析型HPLC进行纯度分析，结果如图27所示；
步骤(17)中对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图28所示，由图测得所合成的SI3-1-b多肽的分子量为1131.0，说明其氨基酸序列如本发明SEQID No.14所示。
所述抗冠状病毒多肽的生物活性分析方法具体为：
实施例15：多肽抗冠状病毒GX_P2V感染的筛选
本实施例使用与SARS-CoV-2高度同源的从穿山甲中分离出来的一株冠状病毒GX_P2V作为筛选模型。该病毒的S蛋白与SARS-CoV-2的S蛋白基因相似度达83.6％，氨基酸序列相似度达92.6％(详见参考文献：Identifying SARS-CoV-2-related coronaviruses inMalayan pangolins.Nature.2020Mar 26.Doi:10.1038/s41586-020-2169-0.Onlineahead of print.PMID:32218527.)，并且已有文献报道用于抗SARS-CoV-2药物的筛选(详见参考文献：Repurposing of clinically approved drugs for treatment ofcoronavirus disease 2019in a 2019-novel coronavirus-related coronavirusmodel.Version 2.Chin Med J(Engl).2020May 5；133(9):1051-1056.Doi:10.1097/CM9.0000000000000797.PMID:32149769.)。
(1)细胞准备：本实验所用细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero E6细胞)。实验开始前一天将Vero E6细胞均匀铺至24孔细胞培养板里，并放入5％CO2培养箱中37℃培养12h，使细胞密度达到90％；
(2)病毒处理：本实施例中使用的GX_P2V病毒储液的感染滴度为106PFU/mL；
(3)多肽配制：用二甲基亚砜(DMSO)将SI1、SI1-b、SI2、SI2-b、SI2-1、SI2-1-b、SI2-2、SI2-2-b、SI3、SI3-b、SI3-1、SI3-1-b、SI4-1、SI4-1-b多肽溶解为10mM储液备用。开始实验前，用含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗的细胞培养基将10mM多肽储液稀释，配制浓度为200μM的多肽溶液(准备两份)；
(4)将病毒GX_P2V用细胞培养基稀释至104PFU/mL，即MOI＝0.01。将步骤(3)中已稀释的多肽溶液与GX_P2V病毒各取250μL混合，加入24孔板中，使多肽的终浓度为100μM。只加GX_P2V病毒，不加多肽的样品作为阳性对照，既不加GX_P2V病毒也不加多肽的样品作为阴性对照；
(5)将所述24孔板放入5％CO2培养箱中37℃培养2h；
(6)将步骤(3)中的多肽两倍稀释，获得浓度为100μM的多肽溶液500μL(准备两份)；
(7)将步骤(5)中的24孔板从培养箱中取出，吸去上清液然后用PBS缓冲液清洗1-2遍。将步骤(6)中准备的多肽稀释液按每孔500μL加到24孔板中，然后放到5％CO2培养箱中37℃培养48-60h，最后用荧光相差显微镜观察细胞病变效应(CPE)，提取细胞核酸进行实时荧光定量PCR实验(qPCR实验)，检测感染病毒RNA水平。
通过检测侵入细胞的病毒RNA水平，确定多肽对病毒的抑制效果。结果表明，在100μM浓度下，所述SI1、SI1-b、SI2、SI2-b、SI2-1、SI2-1-b、SI2-2、SI2-2-b、SI3、SI3-b、SI3-1、SI3-1-b、SI4-1、SI4-1-b多肽均能抑制冠状病毒侵染细胞。通过检测侵入细胞的病毒RNA水平，所述SI2-1多肽、SI2-2多肽、SI2-2-b多肽、SI3多肽、SI4-1多肽和SI4-1-b多肽在100μM浓度下能有效抑制病毒入侵细胞90％以上，其它多肽在该浓度下抑制病毒入侵细胞约65％～90％。说明上述多肽具有明显的抗冠状病毒GX_P2V的活性。100μM多肽抑制GX_P2V冠状病毒侵染细胞的效果如图29所示。
实施例16：SI4-1、SI4-1-b、SI3和SI3-b多肽抗冠状病毒GX_P2V的半最大效应浓度(EC50)测定
(1)细胞准备：本实施例所用细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero E6细胞)。实验开始前一天将Vero E6细胞均匀铺至24孔细胞培养板里，并放入5％CO2培养箱中37℃培养12h，使细胞密度达到90％；
(2)病毒处理：本实施例中使用的GX_P2V病毒储液的感染滴度为106PFU/mL；
(3)多肽配制：用二甲基亚砜(DMSO)将SI4-1、SI4-1-b、SI3和SI3-b多肽溶解为10mM储液备用。开始实验前，用含10％FBS、1％双抗的细胞培养基将10mM多肽储液稀释为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM七个浓度梯度(准备两份)；
(4)将病毒GX_P2V用细胞培养基稀释至104PFU/mL，即MOI＝0.01。将步骤(3)中已稀释的多肽溶液与GX_P2V病毒各取250μL混合，加入24孔板中，使多肽的终浓度依次为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM。只加GX_P2V病毒，不加多肽的样品作为阳性对照。既不加GX_P2V病毒也不加多肽的样品作为阴性对照；
(5)将所述24孔板放入5％CO2培养箱中37℃培养2h；
(6)将步骤(3)中的多肽两倍稀释，获得浓度为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM的多肽溶液，每个浓度500μL(准备两份)；
(7)将步骤(5)中的24孔板从培养箱中取出，吸去上清液然后用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗1-2遍，将步骤(6)中的多肽溶液按每孔500μL加到24孔板对应的孔中，然后放到5％CO2培养箱中37℃培养48h-60h，最后用荧光相差显微镜观察细胞病变效应(CPE)，提取细胞核酸进行qPCR实验，检测感染病毒RNA水平，分析数据得出多肽抗病毒感染的EC50。
通过检测侵入细胞的病毒RNA水平，确定多肽对病毒的抑制效果。结果表明，所述SI4-1多肽、SI4-1-b多肽和SI3多肽均具有较强的抗病毒活性，其EC50值分别为2.46μM、2.03μM和3.26μM；所述SI3-b多肽的抗病毒活性稍弱，其EC50值为21.60μM。不同浓度的所述多肽抑制GX_P2V冠状病毒侵染细胞的效果如图30所示。
实施例19：SI4-1、SI4-1-b、SI3和SI3-b多肽对细胞的毒性
(1)细胞准备：本实施例所用细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero E6细胞)。实验开始前一天将Vero E6细胞均匀铺至96孔细胞培养板里，并放入5％CO2培养箱中37℃培养12h，使细胞密度达到90％；
(2)多肽配制：用二甲基亚砜(DMSO)将SI4-1、SI4-1-b、SI3和SI3-b多肽溶解为10mM储液备用。开始实验前，用含10％FBS、1％双抗的细胞培养基将10mM多肽储液稀释为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM七个浓度梯度(每个浓度稀释液准备300μL)；
(3)将铺有Vero E6的96孔板从培养箱取出，吸去上清液，每孔加100μL的多肽(每个浓度重复3个孔)，放入5％CO2培养箱中，在37℃培养48h；
(4)48h后取出96孔，每个加药孔中加入20μL刃天青(终浓度2mg/mL)，在120min检测吸光度，计算SI4-1、SI4-1-b、SI3和SI3-b多肽抑制细胞增殖的活性。
采用刃天青染色法检测细胞活性，确定多肽对细胞活性的抑制效果。结果表明，所述SI4-1、SI4-1-b、SI3和SI3-b多肽均具有较低的细胞毒性，在100μM浓度下，仅引起20％左右的细胞毒性。因此，四个抗病毒多肽具有很好的安全性。不同浓度的所述多肽对Vero E6细胞的毒性结果如图31所示。
实施例20：SI4-1和SI4-1-b多肽抑制SARS-CoV-2假病毒入侵细胞
(1)采用转染了人血管紧张素转换酶2(ACE2)的COS7细胞(即经SV40病毒基因转化的非洲绿猴肾成纤维细胞)进行实验。在含有10％FBS，105U/L青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养基(一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，Dulbecco's Modified Eagle Medium，简称DMEM)中，将细胞置于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中培养；
(2)将密码子优化的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S蛋白)基因克隆到具有C末端19-aa缺失的pcDNA3.1(+)中(32221306)，构建pcDNA-SARS2-S质粒。合成Luc2基因，并将其克隆到pcDH-EF1-MCS-IRES-puro载体(30557852)中，构建pcDH-EF1-luc2-IRES-puro质粒。为了产生HIV-luc2/SARS-CoV-2假病毒，在含有X-treme GENE HP(购自瑞士罗氏公司)的T25培养瓶中，将pcDH-EF1-luc2-IRES-puro(2μg)、pLP1(2μg)、pLP2(2μg)和pcDNA-SARS2-S(5μg)共转染到2.5×106 293T细胞中。转染16小时后，将培养基替换为含有5％FBS的DMEM。转染后48小时后收集上清液，用0.45μm滤器(购自美国密理博公司)过滤，分装并在-70℃冷冻；
(3)为了进行抑制试验，将含有假病毒的上清液用完全培养基稀释100倍，并与100μM SI4-1和SI4-1-b多肽在37℃孵育30分钟。然后，将病毒/多肽混合物转移至接种有COS7-hACE2细胞(7.5×103/孔)的96孔板中。孵育2小时后，将培养基替换为新鲜的培养基，并将样品再孵育46小时。裂解细胞，并使用萤光素酶测定系统(购自普洛麦格公司)通过多模式读取器(购自瑞士帝肯公司)测量萤光素酶活性。
SARS-CoV-2通过S蛋白与细胞表面的人血管紧张素转换酶2(ACE2)相互作用进入细胞的受体，从而感染细胞。本发明的多肽就是根据S蛋白与ACE2相互作用氨基酸位点进行设计合成的。其中，SI4-1和SI4-1-b多肽是抗病毒活性最好的多肽。结果表明，所述SI4-1和SI4-1-b多肽均可以抑制SARS-CoV-2假病毒侵入细胞(P<0.05)。采用含有S蛋白的SARS-CoV-2假病毒和表达hACE2的COS7细胞检测抗病毒SI4-1和SI4-1-b多肽抑制病毒侵入细胞的实验结果如图32所示。
本发明实施例设计并制备了抗冠状病毒多肽，研究其与病毒蛋白或关键宿主因子的相互作用；利用与SARS-CoV-2具有较高同源性的穿山甲冠状病毒GX_P2V和SARS-CoV-2假病毒作为模型，验证其抑制病毒入侵的效果，并探究病毒侵入细胞的机制；制备的所述SI1、SI1-b、SI2、SI2-b、SI2-1、SI2-1-b、SI2-2、SI2-2-b、SI3、SI3-b、SI3-1、SI3-1-b、SI4-1、SI4-1-b多肽在100μM浓度下均能抑制冠状病毒侵染细胞。其中，所述SI2-1多肽、SI2-2多肽、SI2-2-b多肽、SI3多肽、SI4-1多肽和SI4-1-b多肽在100μM浓度下能有效抑制病毒入侵细胞90％以上；且所述SI4-1和SI4-1-b多肽还能有效抑制SARS-CoV-2假病毒侵入细胞。本发明实施例所述抗冠状病毒多肽在抗新型冠状病毒多肽药物的研发上具有重要的应用前景。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 一种抗冠状病毒多肽及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp
1 5
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala Glu Asp
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Gln Lys Arg
20
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala Glu Asp
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Gln Lys Arg
20
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala Glu Asp
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Gln
20
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala Glu Asp
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Gln
20
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala Glu Asp Leu
1 5 10 15
Phe Tyr Gln Met
20
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala Glu Asp Leu
1 5 10 15
Phe Tyr Gln Met
20
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp His
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp His
1 5

Claims (7)

1.一种抗冠状病毒多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为如下SEQ ID No.1～SEQ ID No.14所示的任意一种；
SEQ ID No.1：QAKTFLD；
SEQ ID No.2：Ac-QAKTFLD-NH2；
SEQ ID No.3：MQAKTFLDKFNHEAEDLFYQKR；
SEQ ID No.4：Ac-MQAKTFLDKFNHEAEDLFYQKR-NH2；
SEQ ID No.5：MQAKTFLDKFNHEAEDLFYQ；
SEQ ID No.6：Ac-MQAKTFLDKFNHEAEDLFYQ-NH2；
SEQ ID No.7：MQAKTFLDKFNHEA；
SEQ ID No.8：Ac-MQAKTFLDKFNHEA-NH2；
SEQ ID No.9：QAKTFLDKFNHEAEDLFYQM；
SEQ ID No.10：Ac-QAKTFLDKFNHEAEDLFYQM-NH2；
SEQ ID No.11：MQAKTFLDK；
SEQ ID No.12：Ac-MQAKTFLDK-NH2；
SEQ ID No.13：MQAKTFLDH；
SEQ ID No.14：Ac-MQAKTFLDH-NH2。
2.多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1所述抗冠状病毒多肽。
3.含有权利要求2所述多核苷酸的载体。
4.含有权利要求2所述多核苷酸或含有权利要求3所述载体的宿主细胞。
5.权利要求1所述抗冠状病毒多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法以固相合成树脂为起始原料，通过Fmoc化学合成制备。
6.权利要求1所述的抗冠状病毒多肽或权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体在制备用于抗GX_P2V冠状病毒的制剂中的应用。
7.权利要求1所述的抗冠状病毒多肽或权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体在制备用于抗SARS-CoV-2假病毒的制剂中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的任意一种。
CN202010995877.4A 2020-09-21 2020-09-21 一种抗冠状病毒多肽及其应用 Active CN114249799B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010995877.4A CN114249799B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种抗冠状病毒多肽及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010995877.4A CN114249799B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种抗冠状病毒多肽及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114249799A CN114249799A (zh) 2022-03-29
CN114249799B true CN114249799B (zh) 2023-08-29

Family

ID=80789019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010995877.4A Active CN114249799B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种抗冠状病毒多肽及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114249799B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471088A (zh) * 2020-04-21 2020-07-31 北京中科微盾生物科技有限责任公司 一种抑制sars-cov-2感染的多肽、组合物及其用途
CN111560076A (zh) * 2020-05-15 2020-08-21 广州百暨基因科技有限公司 一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用
CN111560054A (zh) * 2020-06-16 2020-08-21 哈尔滨吉象隆生物技术有限公司 抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471088A (zh) * 2020-04-21 2020-07-31 北京中科微盾生物科技有限责任公司 一种抑制sars-cov-2感染的多肽、组合物及其用途
CN111560076A (zh) * 2020-05-15 2020-08-21 广州百暨基因科技有限公司 一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用
CN111560054A (zh) * 2020-06-16 2020-08-21 哈尔滨吉象隆生物技术有限公司 抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Computational analysis on the ACE2-derived peptides for neutralizing the ACE2 binding to the spike protein of SARS-CoV-2;Cecylia S. Lupala等;bioRxiv;第1-16页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114249799A (zh) 2022-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107022008B (zh) 广谱地抑制人类冠状病毒感染的多肽及其应用
US6841657B2 (en) Inhibitors of HIV membrane fusion
Cui et al. Stapled peptide-based membrane fusion inhibitors of hepatitis C virus
KR100949310B1 (ko) 세포 영상 기법을 이용한 ｈｂｖ 캡시드 단백질과 표면단백질 간 상호작용 측정 방법과 이를 이용한 ｈｂｖ 증식억제물질의 검색방법
CN102245625A (zh) 制备有生物活性的α-β肽的方法
CN111647048A (zh) 干扰多肽在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用
CA2338022C (en) Inhibitors of hiv membrane fusion
CN111875709A (zh) 一种融合蛋白及其在构建筛选冠状病毒3cl蛋白酶抑制剂的系统中的应用
CN111675752A (zh) 一种冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途
Shu et al. Identification and functional characterization of miiuy croaker IRF3 as an inducible protein involved regulation of IFN response
US6818740B1 (en) Inhibitors of HIV membrane fusion
CN111150833A (zh) Ltx-315在制备抑制冠状病毒的产品中的应用
CN114249799B (zh) 一种抗冠状病毒多肽及其应用
CN112625094A (zh) 一种广谱冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途
Xiao et al. Characterization of two thymosins as immune-related genes in common carp (Cyprinus carpio L.)
CN116693622A (zh) 基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物、制备方法及应用
Barazza et al. Bioactive N‐terminal undecapeptides derived from parathyroid hormone: the role of α‐helicity
CN103974971B (zh) 用于抑制hiv的多肽、其药物组合物及其用途
CN108976298A (zh) 一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52及其应用
CN112430588B (zh) 一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用
CN104136455A (zh) 抗hiv-1多肽及其用途
CN114478707A (zh) 一种构象锁定蜂毒肽衍生物、偶联物及其制备和用途
CN113817026A (zh) 靶向刺突蛋白hr1的订书肽、制备方法及抗新型冠状病毒应用
JP2022014707A (ja) キャリアペプチドフラグメントおよびその利用
US7960504B2 (en) Inhibitors of HIV membrane fusion

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant