CN108976298A - 一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码基因如SEQ ID NO：2所示。本发明的短肽LvHcS52不管在动物水平还是在体外细胞水平，均能显著抑制WSSV极早期基因wsv069和晚期基因wsv421的转录，同时在体内还能显著抑制WSSV的增殖；能激活对虾血细胞内的STAT信号通路，引发该信号通路下游抗菌肽的转录从而发挥抗WSSV的功能。本发明的抗WSSV肽LvHcS52可以作为抑制WSSV的制剂，可作为添加剂添加到饲料中，以期提高对虾的抗WSSV能力。

Description

一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52及其 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抑制白斑综合症病毒(WSSV)的短肽LvHcS52及其编码基因与应用。

背景技术

对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是对虾养殖业中危害最大的一种病毒，该病毒传染力强、致死率高，对虾感染WSSV后，7-10天死亡率可达100％，在过去二十多年来给全球范围内对虾养殖业造成了巨大的经济损失。至今仍未得到完全控制，成为对虾养殖业发展的主要障碍之一。

目前，对虾生产上均采用养殖抗病能力强的种类及切断WSSV传播途径等方法防止WSSV病害的传播。同时，多年来国内外许多学者试图通过增强对虾体质，提高抗病能力等对对虾WSSV进行防治。有研究表明，一些富含多糖、生物碱、有机酸等多种成分的天然免疫物质给虾口服或注射后，既有抗菌作用，又有免疫刺激作用，它们能增强虾类机体的细胞免疫和体液免疫的功能，提高对虾的抗病力。

因此，通过寻找具有抑制WSSV增殖的活性物质，添加到饲料中增强对虾体质，提高抗病能力等，不失为一种可行的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52，以解决现有技术存在的问题。

从凡纳滨对虾的血淋巴中，通过大量的实验，最终获得了一种能够抑制WSSV增殖的多肽LvHcS52，由55个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52的编码基因，如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供一种含上述编码基因的表达盒。

本发明还提供一种含上述编码基因的重组菌。

本发明还提供一种含上述编码基因的重组载体。

本发明还提供含上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52、上述编码基因或上述重组载体制备抑制WSSV的制剂中的用途。

本发明还提供一种用于抗WSSV的制剂，包含上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52、上述编码基因、上述重组载体中的一种或者多种混合。

一种含有上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52的饲料添加剂。

一种含有上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52的饲料。

本发明的抗WSSV短肽LvHcS52可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行原核表达和纯化。

与现有技术相比，本发明对自然界生物内的多种天然多肽进行特异性选择，通过大量的实验，获得了一种能够抑制WSSV增殖的约5.8kDa，来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的肽段LvHcS52，并可用化学法合成。根据LvHcS52的氨基酸序列相对应的核苷酸，设计引物，克隆得到LvHcS52的核苷酸组成，并构建到原核表达载体中，转化到大肠杆菌中，通过诱导表达并纯化得到重组的LvHcS52。并在体内和体外原代培养的血细胞中验证LvHcS52的活性，结果表明该肽段不管在动物水平还是在体外细胞水平，均能显著抑制WSSV极早期基因wsv069和晚期基因wsv421的转录，同时在体内还能显著抑制WSSV的增殖。通过进一步的实验研究，发现LvHcS52能激活对虾血细胞内的STAT信号通路，引发该信号通路下游抗菌肽的转录从而发挥抗WSSV的功能。本发明的抗WSSV短肽可以作为添加剂添加到饲料中，以期提高对虾的抗WSSV能力。

附图说明

图1为本发明抑制WSSV的短肽LvHcS52的高效液相色谱图；

图2为本发明抑制WSSV的短肽LvHcS52的质谱图；

图3为本发明抑制WSSV的LvHcS52短肽和对照GST的SDS-PAGE图；

图4为本发明抑制WSSV的短肽LvHcS52在动物体内水平的WSSV极早期基因wsv069基因的转录变化情况；

图5为本发明抑制WSSV的短肽LvHcS52在动物体内水平的WSSV晚期基因wsv421基因的转录变化情况；

图6为本发明抑制WSSV的短肽LvHcS52在动物体内水平的WSSV copy数的变化情况；

图7为本发明抑制WSSV的短肽LvHcS52在体外细胞水平的WSSV极早期基因wsv069基因的转录变化情况；

图8为本发明抑制WSSV的短肽LvHcS52在体外细胞水平的wsv421基因的转录变化情况；

图9为本发明抑制WSSV的短肽LvHcS52在体外细胞水平验证STAT信号通路STAT基因的转录变化情况；

图10为本发明抑制WSSV的短肽LvHcS52在体外细胞水平验证STAT信号通路ALF1基因的转录变化情况；

图11为本发明抑制WSSV的短肽LvHcS52在体外细胞水平验证STAT信号通路ALF3基因的转录变化情况。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法

实施例1：抑制WSSV的短肽LvHcS52的固相合成、切割、纯化及鉴定

先从凡纳滨对虾的血淋巴中，通过大量的实验，最终获得了一种能够抑制WSSV增殖的多肽LvHcS52，再利用多肽合成仪采用固相合成法合成所述抑制WSSV的短肽，具体固相合成方法如下：

(1)以DMF为溶剂，各种α-氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液的浓度为0.25M，HBTU溶液、HOBt溶液的浓度为0.33M，哌啶溶液的浓度为200ml/L，DIEA溶液的浓度为174.2ml/L。

(2)称取0.05mmol Fmoc-Ala-Wang树脂(官能团含量0.33mmol/g)置于固相反应器中，加8ml DCM溶胀过夜，减压抽去溶剂。加入浓度为200ml/L的哌啶溶液8ml，室温下反应5min，抽干；再加入浓度为200ml/L的哌啶溶液8ml，室温下反应20min，抽干；依次用8ml的DMF洗涤3次，每次1min。准确量取0.2mmol的α-氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液、0.2mmol的HBTU溶液、0.195mmol的HOBt溶液加入固相反应器中，反应5min后加入0.4mmol的DIEA，室温下氮气气泡振荡反应2h。依次用8ml的DMF洗涤3次，每次1min。加入浓度为200ml/L的哌啶溶液8ml，室温下反应5min，抽干；再加入浓度为200ml/L的哌啶溶液8ml，室温下反应20min，抽干；依次以8ml的DMF洗涤3次，每次1min。按照如上步骤从肽链的碳端到氮端逐一连续合成了本发明的抑制WSSV的短肽LvHcS52，Lys-Gly-Gly-Lys-Thr-Ser-Ile-Glu-Arg-Lys-Ser-Thr-Glu-Ser-Ser-Val-Thr-Val-Pro-Asp-Val-Pro-Ser-Ile-His-Asp-Leu-Phe-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Leu-Ala-Lys-Phe-Glu-Ser-Ala-Thr-Gly-Leu-Pro-Asn-Arg-Phe-Leu-Leu-Pro-Lys。

(3)待合成完毕后，分别用DMF和DCM先后清洗连有多肽链的树脂，后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。

(4)抑制WSSV的短肽的切割：

(a)待树脂干燥后，用刮刀将树脂尽量打散，转移至鸡心瓶中，加入磁子，在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的切割液10ml(切割液中TFA：纯水：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇比例为82.5:5:5:5:2.5)，冰水浴下反应2h。

(b)待反应完成，将反应液连同树脂一同转移至过滤器中，用水泵抽滤，将得到的滤液置于圆底烧瓶中，并在氮气流下吹干。

(c)待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气管，在圆底烧瓶中倒入约20ml的4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷冻离心机内，4℃下8000r/min离心15min，弃上清，再于20ml的4℃冰乙醚中打散，离心；如此重复操作3次，将沉淀再次真空干燥，即得抑制WSSV的短肽的粗品。

(5)抑制WSSV短肽的纯化及鉴定：

用反向高效液相色谱法对抗WSSV肽进行纯化鉴定。采用C18半制备柱，流动相：A相(水相)：去离子水(含0.1％TFA(m/v))；B相(有机相)：80％乙腈水溶液(含0.1％TFA(m/v))；流速：6ml/min；洗脱梯度：A相以每分钟1％的变化从55％降到10％，B相以每分钟1％的变化从45％升到90％。

根据高效液相色谱图，见图1采集5.6-6min的洗脱液，采用旋转蒸发仪除去洗脱液中的有机相乙腈，之后将剩余的抗WSSV肽水溶液放入冰箱冷冻成冰块，最后用冷冻干燥机除去水分，得到蓬松固体粉末，为抑制WSSV的短肽纯品。图2为抑制WSSV的短肽LvHcS52的质谱图。

实施例2：基因克隆与原核表达该与抑制WSSV有关的对虾血蓝蛋白降解肽段

(1)根据多肽的N端和C端序列，定位至血蓝蛋白氨基酸序列中，结合核苷酸序列：AAGGGTGGAAAAACTTCAATTGAACGCAAGTCCACGGAATCTTCAGTAACTGTACCGGACGTGCCAAGCATACATGACCTGTTTGCAGAAGCCGAGGCAGGCGGCGCTGGCCTTGCCAAATTCGAGAGTGCAACAGGCCTACCAAACAGGTTCCTTCTCCCCAAG，设计PCR引物，用肝胰腺的cDNA为模板进行PCR扩增。目的条带使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(上海生工)回收纯化，方法参见试剂盒说明手册，并测浓度，用于下一步实验。

(2)纯化后的PCR产物和pGEX-6p-1用限制性内切酶进行酶切，胶回收后测浓度，并用T4连接酶于16℃过夜酶连。连接产物转化大肠杆菌菌株Rosetta中，并在含有100μg/mL氨苄青霉素(AMP)的LB固体培养基上，于37℃倒置培养。

(3)挑取单菌落，于含100μg/mL Amp的LB液体培养基37℃中培养。并进行菌液PCR验证，根据验证结果，部分送至华大科技测序验证序列的正确性。并依据测序结果，保留序列正确的菌种。在菌液中加入终浓度为15％的甘油，-20℃保存备用。

(4)将测序正确的菌株用于诱导表达。测序正确的菌株按1：100的比例加入液体LB培养基中(含Amp 100μg/mL)；37℃，200rpm摇床培养至OD600到0.6左右时加入IPTG，终浓度为0.5mM，同时取出1mL菌液作为未诱导对照；诱导4h后的菌液转移至离心管中，4℃，5000g离心20min，收集菌体；加入适量超声破碎缓冲液(含50mM Tris，5mM EDTA，100mM NaCl，pH8.0，现加1mM PMSF)重悬浮菌体；置于冰上超声破碎菌体；4℃，20000g离心30min，分别收集上清和沉淀；进行SDS-PAGE分析，验证是否有诱导表达。

(5)尽可能将目的片段表达于上清，利于下一步的纯化。

(6)采用GST柱材(GE Heathercare，US)纯化GST标签的血蓝蛋白降解肽段。

(7)采用PreScission Protease(GE Healthcare，US)将GST标签去除，获得抗WSSV的血蓝蛋白降解肽段LvHcS52。

(8)按照上述步骤将转化了pGEX-6P-1质粒的大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达，用GST柱材纯化GST标签蛋白，采用10mM的还原性谷胱甘肽将GST从柱材上特异性洗脱下来，用于下一步实验。

图3的SDS-PAGE结果表明，得到重组表达的GST(rGST)和LvHcS52(rLvHcS52)。

实施例3：抑制WSSV短肽的动物体内水平活性验证

(1)将重组表达的短肽用灭菌的0.01M PBS(pH7.4)稀释至10μM(阴性对照为重组表达的GST)，加入10²copy/μl的WSSV，阳性对照为0.01M PBS(pH7.4)稀释的10²copy/μlWSSV，均于室温中孵育2h。

(2)用无菌的1ml注射器取100μl混合溶液从对虾第3腹节进行肌肉注射。

(3)于0、2、6、12和24hpi取对虾全血细胞，分别用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(Tiangen生化)和总RNA抽提试剂盒(上海飞捷生物有限公司)提取对虾基因组DNA和总RNA。

(4)用反转录试剂盒(全式金生物科技有限公司)将mRNA反转录成cDNA，并根据模板浓度稀释5-10倍；用无菌水将基因组DNA浓度调成一致。

(5)WSSV copy数的计算。以基因组DNA为模板，wsv421的qPCR引物检测对虾血细胞基因组DNA中的WSSV copy数。

(6)WSSV极早期基因wsv069和晚期基因wsv421转录水平的qPCR检测。用wsv069、wsv421和内参基因EF-1α进行qPCR分析，检测其转录情况。

图4-图6为LvHcS52在动物体内水平的抗WSSV活性验证，图4为wsv069基因的转录变化情况；图5为wsv421基因的转录变化情况；图6为WSSV copy数的变化情况。可以得出，与对照相比LvHcS52在WSSV感染后2h显著提高wsv069的转录，在12h显著抑制wsv069的转录，同时在6h和12h显著抑制wsv421的转录，同时可以显著的抑制WSSV的增殖。

实施例4：抑制WSSV短肽的体外细胞水平活性验证

(1)用抗凝剂(pH 6.0)收集对虾全血细胞，并用昆虫培养基INSERT XPRESS稀释，细胞计数后，细胞培养板中的每个孔接种10⁶个全血细胞，待细胞贴壁后更换含3％双抗的培养基，于27℃细胞培养箱中培养24h。

(2)将化学固相合成的短肽用昆虫培养基稀释至10μΜ[阴性对照为化学固相合成的绿色荧光蛋白(GFP)片段]，加入10⁶copy的WSSV，阳性对照为昆虫培养基稀释的10⁶copyWSSV，均于27℃细胞培养箱中孵育2h。

(3)将细胞培养板取出，小心吸出培养基，用0.01M PBS(pH7.4)洗细胞三次，每孔加入含有10μΜ短肽和10⁶copy WSSV的培养基混合液处理细胞。

(4)于处理后的0、2、6和12h用总RNA抽提试剂盒(上海飞捷生物有限公司)提取细胞的总RNA，再用反转录试剂盒(全式金生物科技有限公司)将mRNA反转录成cDNA，并根据模板浓度稀释5-10倍。

(5)WSSV极早期基因wsv069和晚期基因wsv421转录水平的qPCR检测。

图7-8为LvHcS52在体外细胞水平的抗WSSV活性验证，图7为wsv069基因的转录变化情况；图8为wsv421基因的转录变化情况。结果表明，与对照相比LvHcS52在WSSV感染体外原代培养的血细胞2h后可显著提高wsv069的转录，在12h显著抑制wsv069的转录，同时在6h和12h显著抑制wsv421的转录，与体内动物水平的结果相似。

实施例5：抑制WSSV短肽激活STAT信号通路，引发下游抗菌肽基因的表达

(1)按实施例4进行对虾血细胞的原代培养，处理细胞时只用含10μΜ短肽的培养基，对照为合成的GFP肽段和溶解多肽的H₂O。

(2)按上述实施例，于0、2、6和12h提取细胞总RNA并进行cDNA的反转录，将浓度调成一致。

(3)利用qPCR技术检测STAT信号通路相关重要基因以及下游抗菌肽基因的转录变化情况。

图9-11为LvHcS52在体外细胞水平验证STAT信号通路相关基因的转录变化情况，图9为STAT基因的转录情况；图10为ALF1基因的转录变化情况；图11为ALF3基因的转录变化情况。结果表明，与对照相比LvHcS52能显著提高STAT基因的转录；同时在多肽处理细胞2和6h后，其可以显著抑制下游抗菌肽基因ALF1和ALF3的转录，而在12h显著提高这两个抗菌肽基因的转录。

SEQUENCE LISTING

<110> 汕头大学

<120> 一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52及其应用

<130> 2018

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Gly Gly Lys Thr Ser Ile Glu Arg Lys Ser Thr Glu Ser Ser Val

1 5 10 15

Thr Val Pro Asp Val Pro Ser Ile His Asp Leu Phe Ala Glu Ala Glu

20 25 30

Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala Lys Phe Glu Ser Ala Thr Gly Leu Pro

35 40 45

Asn Arg Phe Leu Leu Pro Lys

50 55

<210> 2

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagggtggaa aaacttcaat tgaacgcaag tccacggaat cttcagtaac tgtaccggac 60

gtgccaagca tacatgacct gtttgcagaa gccgaggcag gcggcgctgg ccttgccaaa 120

ttcgagagtg caacaggcct accaaacagg ttccttctcc ccaag 165

Claims (9)

1.一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种根据权利要求1所述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52的编码基因，如SEQ ID NO：2所示。

3.一种含有根据权利要求2所述编码基因的表达盒。

4.一种含有根据权利要求2所述编码基因的重组菌。

5.一种含有根据权利要求2所述编码基因的重组载体。

6.根据权利要求1所述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52、权利要求2所述编码基因或权利要求5所述重组载体制备抑制WSSV的制剂中的用途。

7.一种用于抗WSSV的制剂，其特征在于，包含根据权利要求1所述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52、权利要求2所述编码基因、权利要求5所述重组载体中的一种或者多种混合。

8.一种含有根据权利要求1所述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52的饲料添加剂。

9.一种含有根据权利要求1所述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52的饲料。