CN107033239A

CN107033239A - 一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗肿瘤肽及其应用

Info

Publication number: CN107033239A
Application number: CN201710427798.1A
Authority: CN
Inventors: 章跃陵; 刘尚杰; 王帆; 黄河; 郑莉媛
Original assignee: Shantou University
Current assignee: Shantou University
Priority date: 2017-06-08
Filing date: 2017-06-08
Publication date: 2017-08-11

Abstract

本发明公开了一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗肿瘤短肽B1。本发明的短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的短肽能够抑制子宫颈癌细胞（HeLa）的生长，因此该短肽可能成为良好的低副作用的抗癌药物。

Description

一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗肿瘤肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抑制肿瘤的短肽及其编码基因与应用。

背景技术

在全球范围内，癌症都有着较高的发病率和致死率。近几十年来，人类为治疗癌症付出了不懈的努力，对癌症的研究主要集中在开发新的治疗方法和减轻治疗方法对病人的副作用。现在常用的治疗癌症的方法主要是手术或者化疗，但是很多情况下不仅不能高效的治疗病人，并且还具有很高的并发症的风险，一些治疗癌症的药物不仅有多种副作用，而且还可能会引起多重耐药。

抗肿瘤肽作为一种新型的治疗癌症的药物，因为它具有对肿瘤细胞有选择性，不易引起耐药性等特点，正越来越受到人们的关注。

许多抗肿瘤肽是从自然界生物内获得的。这种直接来源于生物体内的抗肿瘤肽一般肽链较长，很难用化学法合成，难以纯化，且具有结构不稳定，易失活等缺点。

发明内容

本发明人对自然界生物内的多种天然多肽进行特异性选择和改变，通过大量的实验，最终获得了一种能够抑制肿瘤细胞生长且结构稳定不易失活的短肽，其仅由15个氨基酸组成，容易用化学法合成，具体氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示（Asp-Val-Asn-Phe-Leu-Leu-His-Lys-Ile-Tyr-Gly-Asn-Ile-Arg-Tyr）。该短肽来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白。虽然近年来有研究发现血蓝蛋白除了具有输氧功能外，还具有一定的抗肿瘤活性，但是凡纳滨对虾血蓝蛋白包括分子量为77KD左右的大亚基和75KD的小亚基，一般以六聚体形式存在，难以用化学法合成，而且在体外结构不稳定，易失活。本申请发明人选择地缩短了该蛋白的肽链长度并进行了多次优化和实验，最终得到了本发明的抗肿瘤短肽。本发明抗肿瘤短肽具有广谱性，对多种癌细胞具有抑制和杀伤作用，肽链长度短，抗肿瘤活性高，而且稳定不易失活

本发明还提供了上述抗肿瘤短肽的编码基因。

本发明还提供了上述编码基因的表达盒。

本发明还提供了上述编码基因的重组菌。

本发明还提供了上述编码基因的重组载体。

本发明还提供了上述编码基因的转基因细胞系。

本发明还提供了上述多肽、编码基因、重组载体或转基因细胞系在制备抑制肿瘤的制剂中的用途。

作为对上述用途技术方案的进一步限定，所述肿瘤为宫颈癌。

本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的制剂，其含有上述多肽、编码基因、重组载体或转基因细胞系。

作为对上述制剂技术方案的进一步限定，所述肿瘤为宫颈癌。

本发明的抗肿瘤短肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行纯化，例如高效液相色谱法。本发明的抗肿瘤短肽具有广谱性，对多种癌细胞具有抑制和杀伤作用，不仅抗肿瘤活性更高，而且稳定不易失活。

附图说明

图1为本发明抑制肿瘤的短肽的高效液相色谱图。

图2为本发明抑制肿瘤的短肽的质谱图。

图3为本发明抑制肿瘤的短肽和凡纳滨对虾血蓝蛋白中其他短肽片段的抗肿瘤活性比较。

图4为本发明抑制肿瘤的短肽和凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗肿瘤活性比较。

图5为本发明抑制肿瘤的短肽对肿瘤细胞形态的影响。

图6为本发明抑制肿瘤的短肽诱导肿瘤细胞凋亡图。

图7为本发明抑制肿瘤的短肽使肿瘤细胞膜穿孔从而诱导肿瘤细胞凋亡图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：抑制肿瘤的短肽B1的固相合成、切割、纯化及鉴定

本发明利用多肽合成仪采用固相合成法合成所述抑制肿瘤的短肽：

1) 以 DMF 为溶剂，各种α-氨基被 Fmoc 保护的氨基酸溶液的浓度为 0.25M，HBTU溶液、HOBt 溶液的浓度为 0.33M，哌啶溶液的浓度为 200ml/L，DIEA 溶液的浓度为174.2ml/L。

2) 称取 0.05mmol Fmoc-Ala-Wang 树脂 ( 官能团含量 0.33mmol/g) 置于固相反应器中，加 8ml DCM 溶胀过夜，减压抽去溶剂。加入浓度为 200ml/L 的哌啶溶液8ml，室温下反应 5min，抽干；再加入浓度为 200ml/L 的哌啶溶液 8ml，室温下反应20min，抽干；依次用 8ml 的 DMF 洗涤 3 次，每次 1min。准确量取 0.2mmol 的 α-氨基被Fmoc 保护的氨基酸溶液、0.2mmol 的 HBTU 溶液、0.195mmol 的 HOBt 溶液加入固相反应器中，反应 5min 后加入0.4mmol 的 DIEA，室温下氮气气泡振荡反应 2h。依次用 8ml 的DMF 洗涤 3 次，每次 1min。加入浓度为 200ml/L 的哌啶溶液 8ml，室温下反应 5min，抽干；再加入浓度为 200ml/L 的哌啶溶液 8ml，室温下反应 20min，抽干；依次以 8ml 的DMF 洗涤 3 次，每次 1min。按照如上步骤从肽链的碳端到氮端逐一连续合成了本发明的抑制肿瘤的短肽Asp-Val-Asn-Phe-Leu-Leu-His-Lys-Ile-Tyr-Gly-Asn-Ile-Arg-Tyr。

3)待合成完毕后，分别用 DMF和 DCM先后清洗连有多肽链的树脂，后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。

抑制肿瘤的短肽的切割：

1) 待树脂干燥后，用刮刀将树脂尽量打散，转移至鸡心瓶中，加入磁子，在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的切割液 10ml (切割液中 TFA ：纯水：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇比例为 82.5:5:5:5:2.5)，冰水浴下反应 2h。

2) 待反应完成，将反应液连同树脂一同转移至过滤器中，用水泵抽滤，将得到的滤液置于圆底烧瓶中，并在氮气流下吹干。

3) 待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气管，在圆底烧瓶中倒入约 20ml 的 4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷冻离心机内，4℃下 8000r/min 离心 15min，弃上清，再于20ml的 4℃冰乙醚中打散，离心；如此重复操作 3次，将沉淀再次真空干燥，即得抑制肿瘤的短肽的粗品。

抑制肿瘤的短肽的纯化及鉴定：

用反向高效液相色谱法对抗肿瘤肽进行纯化鉴定。采用 C18 半制备柱，流动相：A 相( 水相 ) ：去离子水 ( 含 0.1％ TFA(m/v)) ；B 相 ( 有机相 ) ：80％乙腈水溶液 ( 含0.1％ TFA(m/v)) ；流速：6ml/min ；洗脱梯度：A 相以每分钟 1％的变化从 55％降到10％，B 相以每分钟 1％的变化从 45％升到 90％。

根据高效液相色谱图 ( 见图 1) 采集16-18min 的洗脱液，采用旋转蒸发仪除去洗脱液中的有机相乙腈，之后将剩余的抗肿瘤肽水溶液放入冰箱冷冻成冰块，最后用冷冻干燥机除去水分，得到蓬松固体粉末，为抑制肿瘤的短肽纯品。图 2 为其质谱图。

实施例2：抑制肿瘤的短肽B1的抗肿瘤活性测定

（1）使用处于生长对数期的人子宫颈癌细胞（HeLa），对细胞进行消化、重悬得到细胞悬液，将细胞稀释到50,000个/mL。在96孔板中每孔加入100µL，将铺好的96孔板放入培养箱中，在37℃、5%CO₂条件下培养过夜（>8小时）。

（2）使用0.01M pH7.4 PBS溶解所述短肽为1mg/mL。用完全培养基稀释短肽样品至50µg/mL。将培养过夜的细胞培养基弃去，每孔加入50µg/mL的多肽100µL，每孔4个平行，重复3次。同时，用等体积的50μg/ml的5-FU和0.01M pH7.4 PBS作为阳性和阴性对照，在5%37^oC条件下分别培养18 h。

（3）接着，吸弃培养液晾干，每孔加冰冷500g/L三氯醋酸50μL（终浓度为100 g/L），固定60 min后去离子水洗4~5次,干燥。

（4）之后，每孔加4 g/L SRB 100 μL作用30 min, 10 mL/L醋酸轻洗4 次，甩干。

（5）最后，每孔加10 mmol/L Tris-base 200μL在平板振荡器上振荡5min, 酶联免疫检测仪测定OD值，按如下公式计算抑制率：抑制率(%)=(OD_0h/OD_18h-1)×100%

结果为对HeLa细胞抑制率有39%。

由上述结果可知，本发明的多肽对肿瘤细胞有显著的抗肿瘤活性。

实施例3：抑制肿瘤的短肽B1和血蓝蛋白中其他短肽片段的抗肿瘤活性比较

（1）合成7条不同血蓝蛋白短肽片段，并分别命名为（B1，B2，B3，B13，B14，S8，S9，），本发明的短肽为B1。

（2）使用处于生长对数期的人子宫颈癌细胞（HeLa），对细胞进行消化、重悬得到细胞悬液，将细胞稀释到50,000个/mL。在96孔板中每孔加入100µL，将铺好的96孔板放入培养箱中，在37℃、5%CO₂条件下培养过夜（>8小时）。

（3）使用0.01M pH7.4 PBS溶解所述短肽为1mg/mL。用完全培养基稀释不同的短肽样品至50µg/mL。将培养过夜的细胞培养基弃去，每孔加入50µg/mL的多肽100µL，每孔4个平行，重复3次。同时，用等体积的50μg/ml的5-FU和0.01M pH7.4 PBS作为阳性和阴性对照，在5%37^oC条件下分别培养18 h。

（4）接着，吸弃培养液晾干，每孔加冰冷500g/L三氯醋酸50μL（终浓度为100 g/L），固定60 min后去离子水洗4~5次,干燥。

（5）之后，每孔加4 g/L SRB 100 μL作用30 min, 10 mL/L醋酸轻洗4 次，甩干。

（6）最后，每孔加10 mmol/L Tris-base 200μL在平板振荡器上振荡5min, 酶联免疫检测仪测定OD值，按如下公式计算抑制率：抑制率(%)=(OD_0h/OD_18h-1)×100%

结果为本发明的短肽（B1）对HeLa细胞抑制作用最强。图3为抑制肿瘤的短肽和血蓝蛋白中其他短肽片段的抗肿瘤活性比较。

实施例4：抑制肿瘤的短肽B1和血蓝蛋白的抗肿瘤活性比较

（2）使用0.01M pH7.4 PBS溶解所述短肽为1mg/mL。用完全培养基稀释短肽（B1）样品至50µg/mL，将血蓝蛋白（HMC）稀释成50µg/mL。将培养过夜的细胞培养基弃去，每孔加入50µg/mL的多肽或血蓝蛋白100µL，每孔4个平行，重复3次。同时，用等体积的50μg/ml的5-FU和0.01M pH7.4 PBS作为阳性和阴性对照，在5%37^oC条件下分别培养18 h。

结果为本发明的肽（B1）比血蓝蛋白（HMC）对HeLa细胞有更强的生长抑制作用。图4为抑制肿瘤的短肽和血蓝蛋白的抗肿瘤活性比较。

实施例5：抑制肿瘤的短肽B1对肿瘤细胞形态的影响

（2）使用0.01M pH7.4 PBS溶解所述短肽为1mg/mL。用完全培养基稀释短肽样品至50µg/mL。将培养过夜的细胞培养基弃去，每孔加入50µg/mL的多肽100µL，每孔4个平行，重复3次。同时，用等体积的50μg/ml的5-FU和0.01M pH7.4 PBS作为阳性和阴性对照，在5%37^oC条件下分别培养24 h。

（3）利用普通倒置显微镜观察拍照记录细胞形态。结果为与阴性对照相比，其中短肽样品组HeLa细胞发生明显的皱缩，破裂现象。图5显示了抑制肿瘤的短肽对肿瘤细胞（HeLa）形态的影响。

实施例6：抑制肿瘤的短肽B1可诱导肿瘤细胞凋亡

（1）凋亡检测采用流式细胞仪，使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（北京，碧云天）。简要如下：

（2）使用处于生长对数期的人子宫颈癌细胞（HeLa），对细胞进行消化、重悬得到细胞悬液，将细胞稀释到100,000个/mL。在24孔板中每孔加入1mL，将铺好的24孔板放入培养箱中，在37℃、5%CO₂条件下培养过夜（>8小时）。

（3）使用0.01M pH7.4 PBS溶解所述短肽为1mg/mL。用完全培养基稀释短肽样品至50µg/mL。将培养过夜的细胞培养基弃去，每孔加入50µg/mL的多肽1mL。同时，用等体积的50μg/ml的0.01M pH7.4 PBS作为阴性对照，细胞凋亡阳性对照试剂盒（碧云天，上海）作为阳性对照在5%37^oC条件下分别培养4-24 h。

（4）接着，收集细胞，用PBS洗涤3次，用195µL结合液重悬细胞，加入5μl annexinV-FITC和10μl PI 在室温下避光染色15min。

（5）用BD生物公司C6流式细胞仪进行分析。

结果为短肽样品可诱导肿瘤细胞（HeLa）发生凋亡。图6显示抑制肿瘤的短肽诱导肿瘤细胞凋亡。

实施例7：抑制肿瘤的短肽B1可造成细胞膜穿孔从而诱导细胞凋亡

（1）使用处于生长对数期的人子宫颈癌细胞（HeLa），对细胞进行消化、重悬得到细胞悬液，将细胞稀释到100,000个/mL。细胞加入在含有用多聚赖氨酸包被的载玻片的24孔板中，每孔加入1mL，将铺好的24孔板放入培养箱中，在37℃、5%CO₂条件下培养过夜（>8小时）。

（2）使用0.01M pH7.4 PBS溶解所述短肽为1mg/mL。用完全培养基稀释短肽样品至50µg/mL。将培养过夜的细胞培养基弃去，每孔加入50µg/mL的多肽1mL。同时，用等体积的0.01M pH7.4 PBS作为阴性对照，在5%37^oC条件下培养24 h。

（3）接着，吸弃培养液，用PBS洗涤2遍，用2.5%戊二醛4^oC固定2h。用PBS漂洗2次，每次10min。然后样品用乙醇脱水处理，即依次用30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%处理，每个浓度处理2次，每次15分钟。

（4）然后，样品用乙腈干燥处理，即依次用50%，70%，80%，90%，95%，100%处理，每个处理15分钟，之后真空干燥，然后喷金，并用JSM6360LA扫描电镜观察。结果为短肽样品可造成肿瘤细胞膜穿孔。图7显示抑制肿瘤的短肽可造成细胞膜穿孔。

序列表

<110>汕头大学

<120>一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗肿瘤肽B1

<160> 1

<210> 1

<160> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Asp-Val-Asn-Phe-Leu-Leu-His-Lys-Ile-Tyr-Gly-Asn-Ile-Arg-Tyr

1 5 10 15

Claims

1.一种抑制肿瘤的短肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种如权利要求 1 所述短肽的编码基因。

3.含有如权利要求 2 所述编码基因的表达盒。

4.含有如权利要求 2 所述编码基因的重组菌。

5.含有权利要求 2 所述编码基因的重组载体。

6.含有如权利要求 2 所述编码基因的转基因细胞系。

7.如权利要求 1 所述的多肽、权利要求 2所述的编码基因、权利要求5 所述的重组载体或权利要求 6 所述的转基因细胞系在制备抑制肿瘤的制剂中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌。

9.一种用于治疗肿瘤的制剂，其特征在于，含有权利要求 1 所述的多肽、权利要求 2所述的编码基因、权利要求5 所述的重组载体或权利要求 6 所述的转基因细胞系。

10.如权利要求9所述的产品，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌。