CN107337715B - 一种抗肿瘤环肽及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
一种抗肿瘤环肽及其制备与应用,属于生物制药领域。所述抗肿瘤环肽由13个氨基酸组成,序列为
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域,具体涉及一种具有抗肿瘤活性的环肽及其制备方法和医药应用。
背景技术
随着社会人口老龄化及环境污染日益加重,肿瘤的发病率逐年上升,已成为威胁人类健康的头号杀手。抗肿瘤药物的研发已成为医药领域的研究热点。传统化学药物因其具有选择性差及潜在的毒副作用,以及开发难度不断增大等缺陷,,制约化学药物的进一步发展。
与传统化疗药物相比,多肽作为抗肿瘤化合物具有高特异性和低毒性的优点,有希望成为肿瘤治疗的新兴药物之一。目前全球获批上市的多肽药物已经超过了60个,处于临床前研发阶段中的多肽类药物达到600个,多肽类药物的发展成果令人瞩目。新型抗肿瘤多肽具有亲和力高、特异性强和毒副作用低的特点,已广泛应用于肿瘤的预防、诊断和治疗,具有重要的临床价值及潜在的应用前景。
发明内容
该抗肿瘤环肽的分子量为1394.65,可以通过反相高效液相色谱法进行纯化,并且通过该方式纯化可以使其纯度达到95.62%。
本发明提供了一种抗肿瘤组合物,所述抗肿瘤组合物包含本发明所述的抗肿瘤环肽。
本发明进一步公开了所述抗肿瘤环肽的制备方法,本发明方法采用固相合成法来制备所述抗肿瘤环肽。所述固相合成法可通过以下措施达到:
采取Fmoc方案,选取CTC高分子树脂,将所述抗肿瘤环肽的C端即羧基端采用Fmoc-Gly-OH以共价键形式连接到CTC树脂上,洗涤,然后脱掉Fmoc保护基团,以结合在CTC树脂上的Gly的氨基作为合成起点,然后按照所述抗肿瘤环肽从C端即羧基端到N端即氨基端的氨基酸序列CGHIKFGYVRCG的顺序,分别依次进行缩合反应形成肽键,脱Fmoc保护,缩合反应形成肽键,不断重复循环上述步骤,直到序列全部偶联完全,脱Fmoc保护;之后切割CTC树脂得多肽粗品,利用反相高效液相色谱法进一步纯化,经过处理使两个Cys形成二硫键成环;再用反相高效液相色谱法纯化得到纯度高达95.62%的目标环肽。
本发明提供了所述抗肿瘤环肽在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤包括肝癌和宫颈癌。所述抗肿瘤环肽在5-500μM浓度范围内对肝癌细胞HepG-2和宫颈癌细胞Hela的增殖抑制率分别为2.4%-98.6%和1.7%-96.7%。其IC50值分别为59.30μM,75.87μM。
与现有技术相比,本发明具有以下的优点和技术效果:本发明首次合成了该抗肿瘤环肽,并且采用CCK-8方法测定了该环肽的抗肿瘤活性,所述抗肿瘤环肽具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的能力。
附图说明
具体实施方式
本发明的具体实施方式结合以下实施例来说明,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1抗肿瘤环肽的固相合成
在本发明所述的抗肿瘤环肽的固相合成过程中,采用Fmoc方案,选取CTC树脂,经过处理使树脂暴露出活性位点,将Fmoc-Gly-OH以共价键形式连接到CTC树脂上,用DMF洗涤树脂。再加入体积浓度为25%的哌啶/DMF溶液脱掉Fmoc保护基团。利用标准的固相合成过程(SPPS),加入HBTU、N-甲基吗啉和Fmoc-Cys(Trt)-OH,使Fmoc-Cys(Trt)-OH与已经连接在CTC树脂上的Gly发生脱水缩合反应通过肽键连接在一起,茚三酮检测反应是否完全。再加入体积浓度为25%哌啶/DMF溶液脱掉Fmoc保护基团。不断重复上面的过程,按照氨基酸序列CGHIKFGYVRCG的顺序依次连接上去,直到序列全部偶联完全,脱Fmoc保护基团。树脂用甲醇洗涤待切割。将树脂转移到切割管中,加入现有技术中包括TFA、H2O、苯酚、EDT、苯甲硫醚等一种溶液或多种溶液的混合溶液,乙醚沉淀,切割完树脂得多肽粗品。利用反相高效液相色谱法进一步纯化,然后溶于纯水中,将1%的I2/MeOH溶液(即每1gI2溶解对应于100ml的MeOH)缓慢滴加到溶液中,使两个Cys形成二硫键成环。用二氯甲烷萃取水溶液,用反相高效液相色谱法纯化得到纯度为95.62%的抗肿瘤环肽。
实施例2采用CCK-8法测定环肽对肝癌细胞HepG-2增殖的抑制作用
将肝癌细胞HepG-2细胞悬液(1.5×104个/mL)按照每孔200μL的体积加入96孔板内,于37℃恒温CO2培养箱培养。24h之后细胞贴壁生长,吸出旧的培养液,将抗肿瘤环肽配制成浓度为5-500μM的溶液,加入96孔板内,并设置阴性对照和空白对照,于37℃恒温CO2培养箱培养。48h后,吸出药液,加入CCK-8溶液,继续于37℃恒温CO2培养箱培养。2h后,在酶标仪上测其在450nm波长处的吸光度值。由表1可知,抗肿瘤环肽在5-500μM浓度的作用下对肝癌细胞HepG-2的增殖抑制率为2.4%-98.6%,其IC50值为59.30μM。
表1抗肿瘤环肽对肿瘤细胞HepG-2细胞增殖的抑制作用
实施例3采用CCK-8法测定环肽对宫颈癌细胞Hela增殖的抑制作用
将宫颈癌细胞Hela细胞悬液(2×104个/mL)按照每孔200μL的体积加入96孔板内,于37℃恒温CO2培养箱培养。24h之后细胞贴壁生长,吸出旧的培养液,将抗肿瘤环肽配制成浓度为5-500μM的溶液,加入96孔板内,并设置阴性对照和空白对照,于37℃恒温CO2培养箱培养。48h后,吸出药液,加入配制好的CCK-8溶液,继续于37℃恒温CO2培养箱培养。2h后,在酶标仪上测其在450nm波长处的吸光度值。由表2可知,抗肿瘤环肽在5-500μM浓度的作用下对宫颈癌细胞Hela细胞的抑制率为1.7%-97.4%,其IC50值为75.87μM。
表2抗肿瘤环肽对宫颈癌细胞Hela细胞增殖的抑制作用
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