CN114478701B - 具有抗肿瘤活性的七肽及其制备方法和应用 - Google Patents
具有抗肿瘤活性的七肽及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供具有抗肿瘤活性的七肽及其制备方法和应用，属于制药技术领域。七肽为具有式(Ⅰ)结构的化合物或其对映异构体或其药物上可接受的盐或前药。七肽采用Fmoc化学的固相合成法以较高的收率及效率合成得到，其中脱Fmoc保护为20％哌啶DMF溶液，缩合试剂为HATU，缩合过程中所用的碱为DIPEA。通过MTT法筛选了该类七肽对结肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞的细胞毒活性，它们的IC50值为0.18‑22.16μM，具有较好的抗肿瘤活性，在相应药物的研制上有一定的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及属于制药技术领域，具体涉及具有抗肿瘤活性的七肽及其制备方法和应用。
背景技术
癌症，又称恶性肿瘤，已成为严重威胁世界各国人民身心健康的重大疾病之一。世界卫生组织2019年的报告显示，在183个国家中，70岁之前由于癌症死亡的人数在其中112个国家排名第一或第二，在其中23个国家排名第三或第四。根据GLOBOCAN2020估计，2020年全球新增癌症病例和死亡病例分别约为1930万和1000万(不包括非黑色素瘤皮肤癌)，癌症新增病例逐年增加，预计2040年全球新增癌症病例将达2840万，比2020年增加47％。由于癌症治疗的严峻形势，迫切需要开发更加高效、低毒的抗癌新药。
多肽是由氨基酸分子以肽键相连的有机化合物，其分子质量一般为1-10kDa，介于小分子和生物大分子之间。由于多肽具有高度的识别特异性、亲和力及水溶性好等优点，多肽的研究越来越受科研工作者的重视。七肽是指含有七个氨基酸残基的多肽。在合成天然环肽mavacyocines的合成过程中，我们发现了一类含环丙基氨基酸残基且具有良好抗肿瘤活性的新颖七肽，因此特出本发明。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供具有抗肿瘤活性的七肽及其制备方法和应用，该类七肽对结肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞具有细胞毒活性。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
具有抗肿瘤活性的七肽，所述七肽为具有式(I)结构的化合物或其对映异构体或其药物上可接受的盐或前药，
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、三氟甲基、磺酸基、巯基、烷氧基、任何碳链、任何碳环及任何杂环、-(CH2)k-杂环基；其中k是1到6的整数；L1、L2、L3、L4、L5、L6和L7各自独立地选自氢或甲基。
优选地，所述七肽为下述七肽1-10或其药物上可接受的盐或前药。
本发明还提供具有抗肿瘤活性的七肽的制备方法，采用Fmoc化学的固相合成方法合成，包括以下步骤：
(1)将第一个氨基酸AA-Fmoc与CTC树脂偶联：将氨基酸AA-Fmoc、碱collidine溶于DCM中得混合反应液，将混合反应液加入到CTC树脂中并振荡1～2h，滤掉反应液，再分别用DMF、DCM各洗涤树脂两次，得到Fmoc-AA-CTC树脂；
(2)脱Fmoc保护基团：将Fmoc-AA-CTC树脂用体积浓度为20％的哌啶DMF溶液振荡3～10min，滤掉反应液，再分别用DMF、DCM各洗两次，得AA-CTC树脂；
(3)偶联反应：将下一个氨基酸、HATU、DIPEA溶于DMF中得混合液，然后将混合液加入到AA-CTC树脂中并振荡1～2h，滤掉液体，再分别用DMF、DCM各洗两次，得含二肽的CTC树脂；
(4)按照步骤(2)和(3)等同的脱Fmoc保护基团、偶联反应操作方法，将含二肽的CTC树脂与其它氨基酸按照七肽的连接顺序依次偶联，即可得到七肽树脂；
(5)脱Fmoc保护，接着用CF3CO2H将七肽从树脂上切下，如果氨基酸侧链有保护基，则先脱侧链保护再从树脂上切下，除去溶剂获得粗产品，经HPLC纯化得目标七肽。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明充分结合环丙基环及多肽的优点，通过筛选获得了一类含环丙基环氨基酸残基且具有良好抗肿瘤活性的新颖七肽。该类七肽可以经Fmoc化学的固相合成法以较高的收率及效率合成得到，其中脱Fmoc保护为20％哌啶DMF溶液，缩合试剂为HATU，缩合过程中所用的碱为DIPEA。通过MTT法筛选了该类七肽对结肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞的细胞毒活性，它们的IC50值为0.18-22.16μM，具有较好的抗肿瘤活性，在相应药物的研制上有一定的应用前景。
具体实施方式
为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明提供一类具有抗肿瘤活性的七肽，该类七肽为具有式(I)结构的化合物或其对映异构体或其药物上可接受的盐或前药，
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、三氟甲基、磺酸基、巯基、烷氧基、任何碳链、任何碳环及任何杂环、-(CH2)k-杂环基；其中k是1到6的整数；L1、L2、L3、L4、L5、L6和L7各自独立地选自氢或甲基。
上述化合物中，性能尤其突出的为下述化合物1-10或其药物上可接受的盐或前药，化合物1-10的具体结构式如下：
以下通过具体实施例详细说明七肽的制备方法。
一、制备实施例
实施例1：七肽1的制备
(1)按照七肽1的氨基酸连接顺序，将第一个氨基酸Fmoc-L-leucine与CTC树脂偶联：将0.54mmol Fmoc-L-leucine、0.9mmol collidine溶于5ml DCM中，然后将混合反应液加入到0.45mmol CTC树脂中，振荡1h，滤掉混合反应液，再分别用DMF、DCM各洗两次，得到Fmoc-L-leucine-CTC树脂；
(2)脱Fmoc保护基团：用体积浓度为20％的哌啶DMF溶液振荡3min，滤掉反应液，树脂分别用DMF、DCM各洗两次获得L-leucine-CTC树脂；
(3)偶联反应：0.9mmol Fmoc-L-alanine、0.9mmol HATU、9mmol DIPEA溶于5mlDMF中得混合液，然后将混合液加入到L-leucine-CTC树脂中并振荡2h，滤掉液体，再分别用DMF、DCM各洗两次，可得含二肽的CTC树脂；
(4)按照步骤(2)和(3)等同的脱Fmoc保护基团和偶联反应操作方法，将含二肽的CTC树脂依次与Fmoc-L-phenylalanine、Fmoc-L-cyclopropylglycine、Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-cyclopropylglycine偶联，可得含七肽1的CTC树脂；
(4)脱Fmoc保护，用CF3CO2H从将七肽从CTC树脂上切下，除去溶剂获得粗产品，经HPLC纯化得目标七肽1(HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝3:7)，总收率29.3％，HRESITOFMS：m/z 750.4158[M+Na]+(calcd forC37H57N7NaO8，750.4166)。
七肽1的合成路线如下所示，实施例2-7的合成路线类同于实施例1。
实施例2：七肽2的制备
(1)按照七肽2的氨基酸连接顺序，将第一个氨基酸Fmoc-D-leucine与CTC树脂偶联：将0.54mmol Fmoc-L-leucine、0.9mmol collidine溶于5ml DCM中得混合反应液，然后将混合反应液加入到0.45mmol CTC树脂中，振荡1h，滤掉反应液，再分别用DMF、DCM各洗两次，得到Fmoc-D-leucine-CTC树脂；
(2)脱Fmoc保护基团：用体积浓度为20％的哌啶DMF溶液振荡10min，滤掉反应液，树脂分别用DMF、DCM各洗两次获得D-leucine-CTC树脂；
(3)偶联反应：将0.9mmol Fmoc-D-alanine、0.9mmol HATU、9mmol DIPEA溶于5mlDMF中得混合液，然后将混合液加入到D-leucine-CTC树脂中并振荡2h，滤掉液体，再分别用DMF、DCM各洗两次，可得含二肽的CTC树脂；
(4)按照步骤(2)和(3)等同的脱Fmoc保护基团和偶联反应操作方法，将含二肽的CTC树脂依次与Fmoc-D-phenylalanine、Fmoc-D-cyclopropylglycine、Fmoc-D-leucine、Fmoc-D-alanine、Fmoc-D-cyclopropylglycine偶联，可得含七肽2的CTC树脂；
(5)脱Fmoc保护，用CF3CO2H从将七肽从树脂上切下，除去溶剂获得粗产品，经HPLC纯化得目标七肽2(HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝3:7)，总收率29.3％，HRESITOFMS：m/z 750.4178[M+Na]+(calcd forC37H57N7NaO8，750.4166)。
实施例3：七肽3的制备
采用与实施例1相同的方法合成七肽3，氨基酸的偶联顺序为Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-cysteine、Fmoc-L-cyclopropylglycine、Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-cyclopropylglycine，HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝3:7，总收率21.9％，HRESITOFMS：m/z 706.3570[M+Na]+(calcd for C31H53N7NaO8S，706.3574)。
实施例4：七肽4的制备
采用与实施例1相同的方法合成七肽4，氨基酸的偶联顺序为Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-serine、Fmoc-L-cyclopropylglycine、Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-cyclopropylglycine，HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝3:7，总收率21.9％，HRESITOFMS：m/z 690.3802[M+Na]+(calcd for C31H53N7NaO9，690.3802)。
实施例5：七肽5的制备
采用与实施例1相同的方法合成七肽5，氨基酸的偶联顺序为Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-glutamine、Fmoc-L-cyclopropylglycine、Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-cyclopropylglycine，HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝2:8，总收率25.8％，HRESITOFMS：m/z 731.4075[M+Na]+(calcd for C33H56N8NaO9，731.4068)。
实施例6：七肽6的制备
采用与实施例1相同的方法合成七肽6，氨基酸的偶联顺序为Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-aspartic acid、Fmoc-L-cyclopropylglycine、Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-cyclopropylglycine，HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝2:8，总收率20.6％，HRESITOFMS：m/z 718.3760[M+Na]+(calcd for C32H53N7NaO10，718.3752)。
实施例7：七肽7的制备
采用与实施例1相同的方法合成七肽7，氨基酸的偶联顺序为Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-histidine、Fmoc-L-cyclopropylglycine、Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-cyclopropylglycine，HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝2:8，总收率24.1％，HRESITOFMS：m/z 740.4080[M+Na]+(calcd for C34H55N9NaO8，740.4071)。
实施例8：七肽8的制备
采用与实施例1相同的方法合成七肽8，但在该实施例中，每个氨基酸的偶联反应进行两次，之后再进行下一个循环，氨基酸的偶联顺序为Fmoc-N-methyl-L-leucine、Fmoc-N-methyl-L-alanine、Fmoc-N-methyl-L-phenylalanine、Fmoc-N-methyl-L-cyclopropylglycine、Fmoc-N-methyl-L-leucine、Fmoc-N-methyl-L-alanine、Fmoc-N-methyl-L-cyclopropylglycine，HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝3:7，总收率26.4％，HRESITOFMS：m/z 848.5281[M+Na]+(calcdfor C44H71N7NaO8，848.5262)。
七肽8的合成路线如下所示：
实施例9：七肽9的制备
采用与实施例8相同的方法合成七肽9，氨基酸的偶联顺序为Fmoc-N-methyl-L-leucine、Fmoc-N-methyl-L-alanine、Fmoc-N-methyl-L-aspartic acid、Fmoc-N-methyl-L-cyclopropylglycine、Fmoc-N-methyl-L-leucine、Fmoc-N-methyl-L-alanine、Fmoc-N-methyl-L-cyclopropylglycine，HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝2:8，总收率27.8％，HRESITOFMS：m/z 816.4838[M+Na]+(calcdfor C39H67N7NaO10，816.4847)。
实施例10：七肽10的制备
采用与实施例8相同的方法合成七肽10，氨基酸的偶联顺序为Fmoc-N-methyl-L-leucine、Fmoc-N-methyl-L-alanine、Fmoc-N-methyl-L-histidine、Fmoc-N-methyl-L-cyclopropylglycine、Fmoc-N-methyl-L-leucine、Fmoc-N-methyl-L-alanine、Fmoc-N-methyl-L-cyclopropylglycine进行偶联，HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝2:8，总收率22.9％，HRESITOFMS：m/z 838.5175[M+Na]+(calcd for C41H69N9NaO8，838.5167)。
对比例1：七肽11的制备
采用与实施例1相同的方法合成七肽11，氨基酸的偶联顺序为Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-cyclopropylglycine、Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-leucine，HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝3:7，总收率28.4％，HRESITOFMS：m/z 766.4490[M+Na]+(calcd forC38H61N7NaO8，766.4479)。
七肽11的合成路线如下所示：
对比例2：七肽12的制备
采用与实施例1相同的方法合成七肽12，氨基酸的偶联顺序为Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-phenylalanine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-leucine、Fmoc-L-alanine、Fmoc-L-leucine，HPLC纯化条件为：YMC-Pack ODS-A半制备柱，5μm，250×10mm，洗脱剂为乙腈：水＝2:8，总收率27.4％，HRESITOFMS：m/z 740.4332[M+Na]+(calcd forC36H59N7NaO8，740.4323)。
七肽12的合成路线如下所示：
二、抗肿瘤活性试验
采用MTT法对合成的七肽1-12在细胞水平进行体外抗肿瘤活性筛选，选用的肿瘤细胞包括结肠癌细胞系(HCT116)、肺癌细胞系(A549)、前列腺癌细胞系(LNCap)、黑色素瘤细胞系(A375)、乳腺癌细胞系(MCF7)。具体实验步骤如下：
(1)取状态良好的对数生长期的细胞，PBS缓冲液洗涤2-3次后，取适量0.25％的胰蛋白酶消化细胞，加入培养基进行吹打，移取一定量对数生长期的细胞均匀稀释于培养基中，每孔180μL细胞悬浮液(约4500-5000个细胞)接种于96孔培养板中，四周用200μL PBS缓冲液液封。
(2)待细胞贴壁后，生长至孔面积的2/3左右时，每行按每孔20μL准确加入实施例1-10以及对比例1-2制备的一定浓度梯度的七肽溶液，平行设置10个复孔，并同时设置相应的空白对照组，阳性对照组加入紫杉醇。
(3)继续放在培养箱中培养48h后，每孔再加入10μL MTT试剂(浓度为5mg/mL)。
(4)继续孵育4h后，取出96孔培养板并弃去每孔中的上清液，再向每孔中加入100μL DMSO，轻微振荡反应5～8min，使甲瓒结晶颗粒溶解完全。
(5)空白对照组调零，使用酶标仪测定490nm波长处的吸光度值，并用5个浓度梯度的吸光度值得出化合物对各肿瘤细胞系的IC50值，所有实验均重复3次后取平均值。结果如
表1所示：
实验结果如表1所示，七肽1-10具有良好的抗肿瘤活性。减少含环丙基氨基酸残基后，对比例11的七肽的抗肿瘤活性迅速降低，对比例12的七肽没有抗肿瘤活性，表明环丙基结构对该类七肽的抗肿瘤活性起着较重要的作用。对比七肽1和七肽2抗肿瘤活性可以看出，改变七肽旋光性，它们的抗肿瘤活性基本没有变化，表明旋光性对它们的抗肿瘤活性基本没有影响。对比七肽1、七肽6、七肽7及七肽8、七肽9、七肽10的抗肿瘤活性可以看出，当肽键被甲基化之后，它们的抗肿瘤活性减小。其中七肽6、七肽7的抗肿瘤活性最好，七肽7对肺癌细胞的活性达到0.18μM，说明在肽链中引入大极性的羧基及杂环，可以增加该类多肽的抗肿瘤活性。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (3)
1.具有抗肿瘤活性的七肽，其特征在于：所述七肽选自下述化合物：
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的七肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将第一个氨基酸AA-Fmoc与CTC树脂偶联：将氨基酸AA-Fmoc、碱collidine溶于DCM中得混合反应液，将混合反应液加入到CTC树脂中并振荡1～2h，滤掉反应液，再分别用DMF、DCM各洗涤树脂两次，得到Fmoc-AA-CTC树脂；
(2)脱Fmoc保护基团：将Fmoc-AA-CTC树脂用体积浓度为20％的哌啶DMF溶液振荡3～10min，滤掉反应液，再分别用DMF、DCM各洗两次，得AA-CTC树脂；
(3)偶联反应：将下一个氨基酸、HATU、DIPEA溶于DMF中得混合液，然后将混合液加入到AA-CTC树脂中并振荡1～2h，滤掉液体，再分别用DMF、DCM各洗两次，得含二肽的CTC树脂；
(4)按照与步骤(2)和(3)等同的脱Fmoc保护基团、偶联反应操作方法，将含二肽的CTC树脂与其它氨基酸按照七肽的连接顺序依次偶联，即可得到七肽树脂；
(5)脱Fmoc保护，接着用CF3CO2H将七肽从树脂上切下，如果氨基酸侧链有保护基，则先脱侧链保护再从树脂上切下，除去溶剂获得粗产品，经HPLC纯化得目标七肽。
3.根据权利要求1所述的七肽的应用，其特征在于：是指在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物是指抗结肠癌药物、抗肺癌药物、抗前列腺癌药物、抗黑色素瘤药物、抗乳腺癌药物。
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