CN115286687A - 一种基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂及其制备方法和应用 Download PDF

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CN115286687A CN202211009665.XA CN202211009665A CN115286687A CN 115286687 A CN115286687 A CN 115286687A CN 202211009665 A CN202211009665 A CN 202211009665A CN 115286687 A CN115286687 A CN 115286687A
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张�杰
司茹
潘晓艳
卢闻
单媛媛
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Abstract

本发明公开一种基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂及其制备方法和应用，通过使用链接体将靶蛋白配体Linifanib或S5和生物正交基团降冰片烯连接，获得带有降冰片烯基团的靶蛋白配体；通过连接链将四嗪基团修饰在E3泛素连接酶配体上，得到带有四嗪的E3泛素连接酶配体；通过分步给药的方法，使带有降冰片烯基团的靶蛋白配体分子和带有四嗪的E3泛素连接酶配体先后进入细胞，在细胞内发生生物正交反应自组装，形成蛋白降解剂。本发明构建的细胞内自组装蛋白降解剂的制备方法简单，易于实现，并且收率较高，能够用于制备治疗癌症的药物中，尤其用于制备以PDGFR‑β为靶点的抗肿瘤药物中。

Description

一种基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，涉及一种基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂及其制备方法和应用。
背景技术
Linifanib(利尼伐尼)是一种结构新颖的受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，是血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)受体家族成员的有效抑制剂，抑制KDR，Flt-1，PDGFRβ和FLT3的IC50值分别为3，4，66，4nM。在体内实验中对于VEGF和PDGF受体家族的成员，Linifanib显示IC50值为4nM(KDR)至190nM(FLT4)，但对不相关的RTK如可溶性酪氨酸激酶或丝氨酸/苏氨酸激酶的活性较差。
蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis Targeting Chimera，PROTAC)是一种能够同时结合靶蛋白和E3泛素连接酶的双功能分子，通过同时结合靶蛋白和E3泛素连接酶，拉近靶蛋白和E3连接酶之间的距离，从而诱导靶蛋白的泛素化，泛素化的靶蛋白能够被26S蛋白酶体识别并降解，达到彻底清除疾病相关蛋白的目的。与小分子抑制剂相比，PROTAC具有用量少，不易产生耐药性等优点，所以在新药研发领域呈现出蓬勃发展的态势。但蛋白降解靶向嵌合体固有的特性——分子量大导致其理化性质及细胞渗透性差，限制了其进一步发展，因此亟需对其药代动力学性质进行优化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂及其制备方法和应用，带有生物正交基团(降冰片烯)的靶蛋白配体分子与带有生物正交基团(四嗪)的E3泛素连接酶配体分子先后进入细胞，在细胞内发生生物正交反应自组装形成蛋白降解靶向嵌合体，最终利用泛素-蛋白酶体系统对靶蛋白进行降解。本发明构建的靶向识别分子能够自组装形成蛋白降解靶向嵌合体，经自组装形成的蛋白降解靶向嵌合体具有诱导PDGFR-β蛋白降解的功能，能够用于制备抗肿瘤药物。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂，该降解剂的结构式如下：
Figure BDA0003809485900000021
其中X＝1～6，Y＝2～10，R1＝CH3或Cl，R2＝F或H，R3＝CH3或H，R4＝Ph或CH2。
一种如上所述的基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂的制备方法，包括以下步骤：
通过使用链接体将靶蛋白配体Linifanib和降冰片烯连接，或通过使用链接体将靶蛋白配体S5和降冰片烯连接，获得带有降冰片烯基团的靶蛋白配体；其中，靶蛋白配体S5结构式如下：
Figure BDA0003809485900000031
通过连接链将四嗪基团修饰在E3泛素连接酶配体上，得到带有四嗪的E3泛素连接酶配体；
使带有降冰片烯基团的靶蛋白配体分子和带有四嗪的E3泛素连接酶配体先后进入细胞，在细胞内发生生物正交反应自组装，形成基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂。
进一步的，所述带有降冰片烯基团的靶蛋白配体的结构式如下：
Figure BDA0003809485900000032
其中，X＝1～6，R1＝CH3或Cl，R2＝F或H。
进一步的，所述带有降冰片烯基团的靶蛋白配体通过以下过程制得：
将靶蛋白配体Linifanib或靶蛋白配体S5与链接体经酰胺缩合反应，得到带有Boc保护基化合物，然后经氯化氢的乙酸乙酯作用脱除Boc保护基，再与5-降冰片烯-2-羧酸经酰胺缩合反应，得到带有降冰片烯基团的靶蛋白配体。
进一步的，所述带有四嗪的E3泛素连接酶配体的结构式如下：
Figure BDA0003809485900000033
其中，Y＝2～10，R3＝CH3或H，R4＝Ph或CH2。
进一步的，所述带有四嗪的E3泛素连接酶配体通过以下过程制得：
将乙腈、氰基化合物以及水合肼在三氟甲磺酸锌或三氟甲磺酸镍的作用下，或者将醋酸甲脒、氰基化合物以及水合肼在三氟甲磺酸锌的作用下，经环化反应，氧化脱氢形成1,2,4,5-四嗪类化合物，然后在三氟乙酸的作用下脱去Boc保护基，再通过二酸与E3泛素连接酶配体VH032连接，形成带有四嗪的E3泛素连接酶配体。
进一步的，所述蛋白降解剂具体通过以下过程制得：
将带有降冰片烯基团的靶蛋白配体溶液加入到含有细胞的培养皿中孵育，再加入带有四嗪的E3泛素连接酶配体，孵育，在细胞内经自组装形成蛋白降解剂。
一种如上所述的基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，抗肿瘤药物为能够选择性诱导PDGFR-β蛋白的降解的药物。
进一步的，抗肿瘤药物为抗神经胶质瘤药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过构建一类带有生物正交基团的靶向识别分子，通过分步给药使其能够在细胞内自组装形成蛋白降解剂，相比于整体型蛋白降解靶向嵌合体，本发明构建的细胞内自组装型蛋白降解剂，不仅能够利用蛋白降解剂的作用机制降解疾病相关蛋白，还能够以自组装的方式减小化合物的分子量，解决整体蛋白降解剂分子量大的问题，增加细胞渗透性，优化其理化性质，增强作用效果。本发明构建的细胞内自组装形成蛋白降解剂的制备方法简单，易于实现，并且收率较高。
本发明的小分子蛋白降解靶向降解剂能够用于制备治疗抗肿瘤的药物中，尤其用于制备以PDGFR-β为靶点的抗肿瘤药物中。
附图说明
图1为本发明构建的靶向识别分子LN与TzB生物正交反应过程(10-240min)的高效液相色谱图；
图2为本发明构建的靶向识别分子S5N与TzB生物正交反应过程(10-240min)的高效液相色谱图；
图3为本发明构建的靶向识别分子LN与TzB自组装形成的蛋白降解剂对U87细胞的蛋白降解效果考察；其中，A为LN，B为TzB。
图4为本发明构建的靶向识别分子S5N与TzB自组装形成的蛋白降解剂对U87细胞的蛋白降解效果考察。其中，A为S5N，B为TzB。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
生物正交反应是指能够在活体细胞或组织中发生的、并且能够不干扰生物自身生化反应条件下可以进行的一类化学反应，具有简单、高效、高特异性的特点。研究表明，四嗪可以在无需催化剂的条件下与环状烯烃或炔烃快速高效地发生生物正交反应生成稳定的产物，且此反应对细胞无损害。因此拟将蛋白降解靶向嵌合技术与生物正交反应结合起来，构建带有生物正交基团的、分别靶向靶蛋白和E3泛素连接酶的化合物分子，两部分先后进入细胞，在细胞内发生生物正交反应自组装形成蛋白降解剂，进而发挥降解靶蛋白的作用。基于该策略，可以降低PROTAC分子量，优化其药动药代性质，增加细胞渗透性，以期提高其作用效果。
本发明通过使用不同长度的Linker将靶蛋白配体Linifanib或S5和生物正交基团降冰片烯连接获得带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体分子；通过不同类型的连接链将四嗪基团修饰在E3泛素连接酶配体上得到带有生物正交基团四嗪的E3泛素连接酶配体。通过分步给药的方法，使得这二者能够先后进入细胞，在细胞内发生生物正交反应自组装形成蛋白降解剂，从而达到减小分子量，增加细胞渗透性，优化传统蛋白降解剂固有缺陷的目的。本发明中在细胞内自组装形成的蛋白降解剂能够在治疗癌症中应用。本发明涉及的蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)，即降解剂，能够选择性诱导PDGFR-β蛋白的降解。
其中，S5为实验室前期构建的具有抗血管生成活性的候选化合物，前期研究表明，具有与索拉菲尼相当的VEGFR-2抑制活性。S5结构式如下：
Figure BDA0003809485900000061
本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的自组装型蛋白降解剂，该蛋白降解剂在体外具有抗肿瘤活性，可应用于抗肿瘤药物的制备。
抗肿瘤药物为抗神经胶质瘤药物。
细胞内自组装蛋白降解剂，包括带有生物正交基团(降冰片烯)的靶蛋白配体分子和带有生物正交基团(四嗪)的E3泛素连接酶配体分子；
所述带有生物正交基团(降冰片烯)的靶蛋白配体分子具有如下结构式：
Figure BDA0003809485900000062
其中，X＝1～6，R1＝CH3/Cl，R2＝F/H。
所述带有生物正交基团(四嗪)的E3泛素连接酶配体分子具有如下结构式：
Figure BDA0003809485900000063
其中，Y＝2～10，R3＝CH3/H，R4＝Ph/CH2。
根所述细胞内自组装形成蛋白降解剂的化合物的制备方法，包括以下合成步骤：
1)所述带有生物正交基团(降冰片烯)的靶蛋白配体分子的制备方法如下：
抗肿瘤活性分子Linifanib或S5与不同长度的Linker(例如Boc保护的氨基丁酸)经酰胺缩合反应，柱色谱纯化得到一类带有Boc保护基化合物，然后经氯化氢的乙酸乙酯作用脱除Boc保护基暴露出活性反应基团氨基，再与5-降冰片烯-2-羧酸经酰胺缩合反应得到带有生物正交基团(降冰片烯)的靶蛋白配体分子。
2)带有生物正交基团(四嗪)的E3泛素连接酶配体分子的制备方法如下：
乙腈或醋酸甲脒、不同类型的氰基化合物以及水合肼在催化剂三氟甲磺酸锌或三氟甲磺酸镍的作用下，经环化反应，氧化脱氢形成带有不同取代基的1,2,4,5-四嗪类化合物，而后在三氟乙酸的作用下脱去Boc保护基暴露出氨基活性基团，再通过不同长度的二酸与E3泛素连接酶配体VH032连接在一起形成带有生物正交基团(四嗪)的E3泛素连接酶配体分子VH032。
将固定浓度或不同浓度的带有生物正交基团(降冰片烯)靶蛋白配体分子溶液加入到肿瘤细胞培养皿中孵育2h后，再加入不同浓度或者固定浓度的带有生物正交基团(四嗪)的E3泛素连接酶配体分子，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h，在细胞内经自组装形成的蛋白降解剂，其特征在于，其结构通式如下：
Figure BDA0003809485900000071
其中X＝1～6，Y＝2～10，R1＝CH3/Cl，R2＝F/H，R3＝CH3/H，R4＝Ph/CH2
下面结合图中所示的合成路线和具体的合成实施例来详细说明本发明提供的一类用于细胞内自组装形成蛋白降解剂的靶向识别分子的制备和活性筛选方法。
实施例1
一种带有降冰片烯基团的靶蛋白配体分子LN的制备方法，包括以下合成步骤：
Figure BDA0003809485900000081
1)将48.5mmolγ-氨基丁酸溶于80mL的四氢呋喃并置于冰水浴中，加入1mol/L的氢氧化钠溶液80mL，然后逐滴滴加53.3mmol二碳酸二叔丁酯的四氢呋喃溶液，并室温搅拌，茚三酮检测反应进程，待反应完毕后，减压旋除可挥发性溶剂，用1M HCl调节至2～3，乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压旋除溶剂即得浅黄色化合物1，结构式如下，LC-MS(ESI,m/z):204.30[M+H]+，202.10[M+H]+。
Figure BDA0003809485900000082
2)将0.80mmol化合物1，0.60mmol HATU溶于干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下，滴加1.60mmol DIPEA，室温搅拌15min，加入0.40mmol Linifanib，室温搅拌过夜(本发明中过夜为12h)，加水，二氯甲烷萃取，饱和氯化钠洗涤有机相，无水Na2SO4干燥，抽滤除去干燥剂，减压旋除溶剂，经柱色谱分离得透明油状物质，即化合物2(0.22g)，结构式如下，产率为98.30％，LC-MS(ESI,m/z):561.25[M+Na]+，559.15[M-H]-。
Figure BDA0003809485900000091
3)将0.39mmol化合物2溶于2mol/L氯化氢的乙酸乙酯溶液中，室温搅拌过夜，抽滤所得滤饼(白色固体)即为化合物3(0.18g)，结构式如下，产率为99.61％，LC-MS(ESI,m/z):461.15[M+H]+，459.15[M-H]-。
Figure BDA0003809485900000092
4)将0.47mmol 5-降冰片烯-2-羧酸与0.70mmol HATU溶于干燥二氯甲挖中，在冰浴条件下，逐滴加入1.86mmol DIPEA，搅拌10min后，加入0.47mmol化合物3，室温搅拌8h。反应完毕后，旋除有机相，加入适量的水，乙酸乙酯萃取(3×)，饱和氯化钠洗涤，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，减压旋除溶剂，经柱色谱分离得白色产物，即带有降冰片烯基团的靶蛋白配体分子LN(90mg)，结构式如下，产率为33.33％，LC-MS(ESI,m/z):581.25[M+H]+，579.15[M-H]-。
Figure BDA0003809485900000093
实施例2
一种带有降冰片烯基团的靶蛋白配体分子S5N的制备方法，包括以下合成步骤：
Figure BDA0003809485900000094
1)将48.5mmolγ-氨基丁酸溶于80mL的四氢呋喃并置于冰水浴中，加入1mol/L的氢氧化钠溶液80mL，然后逐滴滴加53.3mmol二碳酸二叔丁酯的四氢呋喃溶液，并室温搅拌，茚三酮检测反应进程，待反应完毕后，减压旋除可挥发性溶剂，用1M HCl调节至2～3，乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压旋除溶剂即得浅黄色化合物1，结构式如下，LC-MS(ESI,m/z):204.30[M+H]+，202.10[M+H]+。
Figure BDA0003809485900000101
2)将0.794mmol化合物1，0.794mmol HATU溶于干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下，滴加1.588mmol DIPEA，室温搅拌15min，加入0.397mmol S5，室温搅拌过夜，加水，二氯甲烷萃取，饱和氯化钠洗涤有机相，无水Na2SO4干燥，抽滤除去干燥剂，减压旋除溶剂，经柱色谱分离得透明油状物质，即化合物4(0.84g)，结构式如下，产率为98.65％，LC-MS(ESI,m/z):585.25[M+Na]+，561.15[M-H]-。
Figure BDA0003809485900000102
3)将0.391mmol化合物4溶于2mol/L氯化氢的乙酸乙酯溶液中，室温搅拌过夜，抽滤所得滤饼(白色固体)即为化合物5(0.18g)，结构式如下，产率为99.44％，LC-MS(ESI,m/z):463.10[M+H]+，461.05[M-H]-。
Figure BDA0003809485900000103
4)将0.389mmol 5-降冰片烯-2-羧酸与0.584mmol HATU溶于干燥二氯甲挖中，在冰浴条件下，逐滴加入1.558mmol DIPEA，搅拌10min后，加入0.389mmol化合物5，室温搅拌8h。反应完毕后，旋除有机相，加入适量的水，乙酸乙酯萃取(3×)，饱和氯化钠洗涤，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，减压旋除溶剂，经柱色谱分离得白色产物，即带有降冰片烯基团的靶蛋白配体分子S5N(94mg)，结构式如下，产率为41.46％，LC-MS(ESI,m/z):583.15[M+H]+，581.10[M-H]-。
Figure BDA0003809485900000111
将实施例1中的γ-氨基丁酸改为7-氨基庚酸即可制备带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体L7N(X＝4)，具有如下结构式：
Figure BDA0003809485900000112
将实施例1中的γ-氨基丁酸改为9-氨基壬酸即可制备带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体L9N(X＝6)，具有如下结构式：
Figure BDA0003809485900000113
实施例3
一种带有生物正交基团四嗪的E3泛素连接酶配体分子的制备方法，包括以下合成步骤：
Figure BDA0003809485900000121
1)在氮气保护下，25mmol乙腈、2.5mmol(4-氰基苄基)氨基甲酸叔丁酯、1.25mmol三氟甲磺酸锌以及125mmol(6.067mL)的80％水合肼(质量分数)混合置于60℃反应36h，反应液冷却至室温，将50mmol亚硝酸钠溶液(3.45g亚硝酸钠溶于20mL的水)加入反应液中，然后缓慢滴加1mol/L盐酸直到无气泡产生且为pH为3。乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，经柱层析分离得到紫红色粉末，即化合物6a(0.11g)，结构如下所示，产率为14.67％，LC-MS(ESI,m/z):302.40[M+H]+。
Figure BDA0003809485900000122
2)在氮气保护下，25mmol醋酸甲脒、2.5mmol(4-氰基苄基)氨基甲酸叔丁酯、1.25mmol三氟甲磺酸锌以及125mmol(6.067mL)的80％水合肼(质量分数)混合置于30℃反应24h，反应液冷却至室温，将50mmol亚硝酸钠溶液(3.45g亚硝酸钠溶于20mL的水)加入反应液中，然后缓慢滴加1mol/L盐酸直到无气泡产生且为pH为3。乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，经柱层析分离得到红色粉末，即化合物6b(0.2g)，结构如下所示，产率为27.78％，LC-MS(ESI,m/z):287.25[M+H]+。
Figure BDA0003809485900000123
3)在氮气保护下，40mmol乙腈、4mmol N-(叔丁氧基羰基)-2-氨基乙腈、2mmol三氟甲磺酸镍以及200mmol(9.70mL)的80％水合肼(质量分数)混合置于60℃反应24h，反应液冷却至室温，将80mmol亚硝酸钠溶液(5.52g亚硝酸钠溶于30mL的水)加入反应液中，然后缓慢滴加1mol/L盐酸直到无气泡产生且pH为3。抽滤，滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，经柱层析分离得到红色粉末，即化合物6c(0.12g)，结构如下所示，产率为6.67％，LC-MS(ESI,m/z):126.00[M+H]+。
Figure BDA0003809485900000131
4)将化合物6a(1eq)或化合物6b(1eq)溶于4mL干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下滴加500μL三氟乙酸，室温搅拌2h，直接旋干，用于下一步反应，将旋干后的产品与丁二酸酐(1eq)，混溶于二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下逐滴加入三乙胺(3eq)，室温反应过夜。反应结束后，减压旋蒸除去二氯甲烷，经柱色谱分离得紫红色粉末，即化合物8a或红色粉末，即化合物8b，8a(0.12g)，收率93.02％，8b(0.20g)，产率64.62％。LC-MS(ESI,m/z)8a:302.30[M+H]+，300.25[M-H]-。8b:286.20[M-H]-。结构式如下：
Figure BDA0003809485900000132
其中，R3为CH3时，得化合物8a；R3为H时，得化合物8b。
5)将化合物6c(1eq)溶于干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下滴加500μL三氟乙酸，室温搅拌2h，旋干有机相，加入少量的水，并用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至7，二氯甲烷萃取，直接旋干，用于下一步反应，将旋干后的产物分别与丁二酸酐(1eq)，庚二酸(1eq)，十二烷二酸(1eq)混溶于二氯甲烷溶液中，其中向庚二酸，十二烷二酸反应体系中再加入1.5eqHATU，在冰浴条件下逐滴加入DIPEA(4eq)，室温反应过夜。反应结束后，减压旋蒸除去二氯甲烷，经柱色谱分离得红色粉末，即化合物8c(0.08g)，化合物8d(0.12g)，化合物8e(0.08g)，产率分别为63.49％，37.52％，24.92％。LC-MS(ESI,m/z)8c:224.00[M-H]-。8d:268.30[M-H]-。8e:338.35[M+H]+，336.25[M-H]-。结构式如下：
Figure BDA0003809485900000141
其中，Y＝2时，得化合物8c；Y＝5时，得化合物8d；Y＝10时，得化合物8e。
6)将化合物8a～8e(1eq)与HATU(1.5eq)溶于干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下，逐滴加入DIPEA(4eq)，搅拌10min，加入(2S,4R)-1-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(VH032)(1eq)，室温搅拌，反应完毕后，减压旋除有机相，加入适量的水，二氯甲烷萃取(3×)，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，减压旋除溶剂，经柱色谱分离得红色产物TzA(0.08g)，TzB(0.015g,)，TzC(0.06g)，TzD(0.10g)，TzE(0.10g)。产率分别为48.19％，9.38％，40.55％，57.47％，57.47％。LC-MS(ESI,m/z)TzA:714.60[M+H]+，712.50[M-H]-。TzB:698.55[M-H]-。TzC:660.40[M+Na]+，636.35[M-H]-。TzD:680.40[M+H]+，678.50[M-H]-。TzE:750.50[M+Na]+，748.45[M-H]-。结构如下所示：
Figure BDA0003809485900000142
其中R3＝CH3,R4＝-Ph-,Y＝2，得产物TzA；
R3＝H,R4＝-Ph-,Y＝2，得产物TzB；
R3＝CH3,R4＝-CH2-,Y＝2，得产物TzC；
R3＝CH3,R4＝-CH2-,Y＝5，得产物TzD；
R3＝CH3,R4＝-CH2-,Y＝10，得产物TzE。
实施例4
带有生物正交基团(降冰片烯)的靶蛋白配体分子与带有生物正交基团(四嗪)的E3泛素连接酶配体分子在细胞内经自组装形成的蛋白降解剂。
1)生物正交反应生成蛋白降解剂
采用高效液相色谱在体外监测两部分靶向识别分子能否发生生物正交反应、反应速率以及反应进程。两部分靶向识别分子置于PBS和乙腈(V:V＝1:1)混合体系中按体积比(1:1)混匀，置于37℃恒温摇床上反应，在不同时间点取样进行检测，结果如图1～图2所示，靶向识别分子能够发生生物正交反应形成蛋白降解剂。
2)细胞内自组装生成蛋白降解剂
将固定浓度或不同浓度的带有生物正交基团(降冰片烯)靶蛋白配体分子溶液加入到肿瘤细胞培养皿中孵育2h后，再加入不同浓度或者固定浓度的带有生物正交基团(四嗪)的E3泛素连接酶配体分子溶液，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h，然后用PBS洗涤，洗涤后将细胞消化离心收集，最后用细胞破碎仪将细胞破碎，并通过滤膜过滤，再进行电喷雾质谱测定，得到细胞内反应的产物。
实施例5
带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体分子的细胞增殖抑制活性测定。
带有生物正交基团降冰片烯的靶向识别分子LN和S5N在细胞水平的活性检测采用MTT检测法。将处于对数增长期U87细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于96孔板(4000个/孔)，每孔180μL。放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养，24h后待细胞贴壁后加药。每组设置4个复孔，阴性对照组和空白组加入20μL/孔无血清培养基，实验组加入不同浓度的药物20μL/孔(以无血清培养基稀释药物)，放入37℃，5％CO2恒温培养箱中继续培养。药物作用48h后，加入MTT溶液(终浓度为0.5mg/mL)22μL/孔，37℃孵育4h后，小心吸弃上清液，加入DMSO 150μL/孔，置于摇床上充分振摇15min。用酶联免疫检测仪于490nm波长下测定各孔吸光度(OD)值。
数值处理：抑制率＝(OD阴性组-OD给药组)/(OD阴性组-OD空白组)×100％；
部分化合物的实验结果见表1：
表1靶向识别分子的细胞增殖抑制活性
Figure BDA0003809485900000161
从表1可以看出，相比于母体化合物本身，本发明制备靶向识别分子S5N对U87细胞具有较好的抑制活性。
实施例6
细胞内自组装型蛋白降解剂对靶蛋白降解效果的考察。
将处于对数增长期的U87细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于6孔板(5×105个/孔)，每孔2mL。放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养，24h后待细胞贴壁后加药。先用固定浓度或不同浓度的靶蛋白配体分子处理细胞2h后，再给予不同浓度或者固定浓度的带有四嗪标签的E3泛素连接酶配体处理细胞，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h，然后进行蛋白提取，再采用Western Blot免疫印迹法检测相关蛋白水平，参见图3中A和B以及图4中A和B，结果显示，经由靶蛋白配体分子S5N与带有四嗪标签的E3泛素连接酶配体TzB组装形成的蛋白降解剂对PDGFR-β蛋白有一定的降解效果，表明以S5N为靶向识别分子构建的自组装型蛋白降解剂具有良好的应用前景，可用于抗肿瘤药物的制备。

Claims (10)

1.一种基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂，其特征在于，该降解剂的结构式如下：
Figure FDA0003809485890000011
其中X＝1～6，Y＝2～10，R1＝CH3或Cl，R2＝F或H，R3＝CH3或H，R4＝Ph或CH2。
2.一种如权利要求1所述的基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过使用链接体将靶蛋白配体Linifanib和降冰片烯连接，或通过使用链接体将靶蛋白配体S5和降冰片烯连接，获得带有降冰片烯基团的靶蛋白配体；其中，靶蛋白配体S5结构式如下：
Figure FDA0003809485890000012
通过连接链将四嗪基团修饰在E3泛素连接酶配体上，得到带有四嗪的E3泛素连接酶配体；
使带有降冰片烯基团的靶蛋白配体分子和带有四嗪的E3泛素连接酶配体先后进入细胞，在细胞内发生生物正交反应自组装，形成基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂。
3.根据权利要求2所述的基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂的制备方法，其特征在于，所述带有降冰片烯基团的靶蛋白配体的结构式如下：
Figure FDA0003809485890000021
其中，X＝1～6，R1＝CH3或Cl，R2＝F或H。
4.根据权利要求2或3所述的基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂的制备方法，其特征在于，所述带有降冰片烯基团的靶蛋白配体通过以下过程制得：
将靶蛋白配体Linifanib或靶蛋白配体S5与链接体经酰胺缩合反应，得到带有Boc保护基化合物，然后经氯化氢的乙酸乙酯作用脱除Boc保护基，再与5-降冰片烯-2-羧酸经酰胺缩合反应，得到带有降冰片烯基团的靶蛋白配体。
5.根据权利要求2所述的基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂的制备方法，其特征在于，所述带有四嗪的E3泛素连接酶配体的结构式如下：
Figure FDA0003809485890000022
其中，Y＝2～10，R3＝CH3或H，R4＝Ph或CH2。
6.根据权利要求2或5所述的基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂的制备方法，其特征在于，所述带有四嗪的E3泛素连接酶配体通过以下过程制得：
将乙腈、氰基化合物以及水合肼在三氟甲磺酸锌或三氟甲磺酸镍的作用下，或者将醋酸甲脒、氰基化合物以及水合肼在三氟甲磺酸锌的作用下，经环化反应，氧化脱氢形成1,2,4,5-四嗪类化合物，然后在三氟乙酸的作用下脱去Boc保护基，再通过二酸与E3泛素连接酶配体VH032连接，形成带有四嗪的E3泛素连接酶配体。
7.根据权利要求2所述的基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂的制备方法，其特征在于，所述蛋白降解剂具体通过以下过程制得：
将带有降冰片烯基团的靶蛋白配体溶液加入到含有细胞的培养皿中孵育，再加入带有四嗪的E3泛素连接酶配体，孵育，在细胞内经自组装形成蛋白降解剂。
8.一种如权利要求1所述的基于生物正交反应的细胞内自组装降解剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，抗肿瘤药物为能够选择性诱导PDGFR-β蛋白的降解的药物。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，抗肿瘤药物为抗神经胶质瘤药物。
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