CN115340591A - 一种基于vh032的细胞内自组装蛋白降解剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于vh032的细胞内自组装蛋白降解剂及其制备方法和应用 Download PDF

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司茹
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卢闻
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Abstract

本发明公开一种基于VH032的细胞内自组装蛋白降解剂及其制备方法和应用，通过使用不同长度的烷基二胺将索拉菲尼和生物正交基团降冰片烯连接，获得带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体；通过不同类型的连接链将四嗪基团修饰在E3泛素连接酶配体上，得到带有生物正交基团四嗪的E3泛素连接酶配体；使得带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体分子和带有生物正交基团四嗪的E3泛素连接酶配体先后进入细胞，在细胞内发生生物正交反应，自组装形成蛋白降解剂。本发明构建的细胞内自组装蛋白降解剂的制备方法简单，易于实现，并且收率较高，能够用于制备治疗癌症的药物中，尤其用于制备以PDGFR‑β为靶点的抗肿瘤药物中。

Description

一种基于VH032的细胞内自组装蛋白降解剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于降解剂制备技术领域，涉及一种基于VH032的细胞内自组装蛋白降解剂及其制备方法和应用。
背景技术
索拉菲尼(Sorafenib)是一种新型多靶点抗肿瘤药物，可同时作用于肿瘤细胞和肿瘤血管，具有双重的抗肿瘤作用：既可通过阻断由RAF/MEK/ERK介导的细胞信号传导通路而直接抑制肿瘤细胞的增殖，还可通过抑制血管内皮生长因子受体VEGFR和血小板衍生生长因子受体PDGFR而阻断肿瘤新生血管的形成，间接地抑制肿瘤细胞的生长，但是临床治疗中常发生严重不良反应，且长期应用极易产生耐药性。
蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis Targeting Chimera，PROTAC)是一种能够同时结合靶蛋白和E3泛素连接酶的双功能分子，通过同时结合靶蛋白和E3泛素连接酶，拉近靶蛋白和E3连接酶之间的距离，从而诱导靶蛋白的泛素化，泛素化的靶蛋白能够被26S蛋白酶体识别并降解，达到彻底清除疾病相关蛋白的目的。与小分子抑制剂相比，PROTAC具有用量少，不易产生耐药性等优点，所以在新药研发领域呈现出蓬勃发展的态势。但蛋白降解靶向嵌合体固有的特性——分子量大导致其理化性质及细胞渗透性差，限制了其进一步发展，因此亟需对其药代动力学性质进行优化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于VH032的细胞内自组装蛋白降解剂及其制备方法和应用，该降解剂的制备方法简单，易于实现，并且收率较高，可在制备抗肿瘤药物中应用。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于VH032的细胞内自组装蛋白降解剂，该降解剂结构式如下：
Figure BDA0003810036670000021
其中X＝2～10，Y＝2～10，R1＝CH3或H，R2＝-Ph-或-CH2-。
一种如上所述的细胞内自组装蛋白降解剂的制备方法，包括以下步骤：
通过烷基二胺将索拉菲尼和降冰片烯连接，获得带有降冰片烯的靶蛋白配体；
通过连接链将四嗪基团修饰在E3泛素连接酶配体上，得到带有四嗪的E3泛素连接酶配体；
将带有降冰片烯的靶蛋白配体分子和带有四嗪的E3泛素连接酶配体先后进入细胞，在细胞内发生生物正交反应，自组装形成蛋白降解剂。
进一步的，带有降冰片烯的靶蛋白配体的结构式如下：
Figure BDA0003810036670000022
其中，X＝2～10。
进一步的，带有降冰片烯的靶蛋白配体通过以下过程制得：
将索拉菲尼经水解得到带有活性反应基团羧基的化合物，然后与烷基二胺经酰胺缩合反应，得到带有活性反应基团氨基的化合物，最后带有活性反应基团氨基的与5-降冰片烯-2-羧酸经酰胺缩合反应，得到带有降冰片烯的靶蛋白配体。
进一步的，带有四嗪的E3泛素连接酶配体的结构式如下：
Figure BDA0003810036670000031
其中，Y＝2～10，R1＝CH3或H，R2＝-Ph-或-CH2-。
进一步的，带有四嗪的E3泛素连接酶配体通过以下过程制得：
乙腈、氰基化合物以及水合肼在三氟甲磺酸锌或三氟甲磺酸镍的作用下，或者醋酸甲脒、氰基化合物以及水合肼在三氟甲磺酸锌的作用下，经环化反应，氧化脱氢形成1,2,4,5-四嗪类化合物，然后在三氟乙酸的作用下脱去Boc保护基，再通过二酸与E3泛素连接酶配体VH032连接，形成带有四嗪的E3泛素连接酶配体。
进一步的，将带有降冰片烯的靶蛋白配体溶液加入到含有细胞的培养皿中孵育后，再加入带有四嗪的E3泛素连接酶配体溶液，孵育，在细胞内经自组装形成蛋白降解剂。
一种如上所述的细胞内自组装蛋白降解剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，抗肿瘤药物为选择性诱导PDGFR-β蛋白降解的药物。
进一步的，抗肿瘤药物为抗乳腺癌或抗神经胶质瘤药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明中带有生物正交基团(降冰片烯)的靶蛋白配体分子与带有生物正交基团(四嗪)的E3泛素连接酶配体分子先后进入细胞，在细胞内发生生物正交反应自组装形成蛋白降解靶向嵌合体，最终利用泛素-蛋白酶体系统将靶蛋白进行降解。本发明通过分步给药使其能够在细胞内自组装形成蛋白降解剂，本发明构建的细胞内自组装形成蛋白降解剂的制备方法简单，易于实现，并且收率较高。
本发明构建的自组装型蛋白降解靶向嵌合体不仅能够利用蛋白降解靶向嵌合体的作用机制降解疾病相关蛋白，还能够以自组装的方式减小化合物的分子量，解决整体蛋白降解剂分子量大的问题，增加细胞渗透性，优化其理化性质，增强作用效果，并且具有诱导PDGFR-β蛋白降解的功能，可用于制备新型抗肿瘤药物。
本发明的小分子蛋白降解靶向嵌合体能够用于制备治疗癌症的药物中，尤其用于制备以PDGFR-β为靶点的抗肿瘤药物中。
附图说明
图1为本发明构建的靶向识别分子S4N-1与TzA生物正交反应过程(2-32h)的高效液相色谱图；
图2为本发明构建的靶向识别分子S4N-1与TzB生物正交反应过程(10-240min)的高效液相色谱图；
图3为本发明构建的靶向识别分子S4N-1与TzC生物正交反应过程(2-32h)的高效液相色谱图；
图4为本发明构建的靶向识别分子S4N-1与TzD生物正交反应过程(2-32h)的高效液相色谱图；
图5为本发明构建的靶向识别分子S4N-1与TzE生物正交反应过程(2-32h)的高效液相色谱图；
图6为本发明构建的用于细胞内自组装形成蛋白降解剂的靶向识别分子S4N-1和TzB对EA.hy926细胞的蛋白降解效果考察结果；其中，A为固定S4N-1给药浓度，B为固定TzB给药浓度。
图7为本发明构建的用于细胞内自组装形成蛋白降解剂的靶向识别分子S4N-1和TzA对U87细胞的蛋白降解效果考察结果；其中，A为固定S4N-1给药浓度，B为固定TzA给药浓度。
图8为本发明构建的用于细胞内自组装形成蛋白降解剂的靶向识别分子S4N-1和TzB对U87细胞的蛋白降解效果考察结果；其中，A为固定S4N-1给药浓度，B为固定TzB给药浓度。
图9为本发明构建的用于细胞内自组装形成蛋白降解剂的靶向识别分子S4N-1和TzC对U87细胞的蛋白降解效果考察结果；其中，A为固定S4N-1给药浓度，B为固定TzC给药浓度。
图10为本发明构建的用于细胞内自组装形成蛋白降解剂的靶向识别分子S4N-1和TzD对U87细胞的蛋白降解效果考察结果；其中，A为固定S4N-1给药浓度，B为固定TzD给药浓度。
图11为本发明构建的用于细胞内自组装形成蛋白降解剂的靶向识别分子S4N-1和TzE对U87细胞的蛋白降解效果考察结果；其中，A为固定S4N-1给药浓度，B为固定TzE给药浓度。
图12为本发明构建的用于细胞内自组装形成蛋白降解剂的靶向识别分子S8N-1和TzB对U87细胞的蛋白降解效果考察结果；其中，A为固定S8N-1给药浓度，B为固定TzB给药浓度。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明的一种细胞内自组装蛋白降解剂的制备方法，通过使用不同长度的二胺将靶蛋白配体索拉菲尼和生物正交基团降冰片烯连接，获得带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体；通过不同类型的连接链(连接链为不同长度的烷基二酸，)将四嗪基团修饰在E3泛素连接酶配体上，得到带有生物正交基团四嗪的E3泛素连接酶配体。通过分步给药的方法，使得带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体分子和带有生物正交基团四嗪的E3泛素连接酶配体能够先后进入细胞，在细胞内发生生物正交反应自组装形成蛋白降解剂，从而达到减小分子量，增加细胞渗透性，优化传统蛋白降解剂固有缺陷的目的。可利用泛素-蛋白酶体系统将靶蛋白进行降解。
本发明中在细胞内自组装形成的蛋白降解剂能够在治疗癌症中应用。
本发明涉及的蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)能够选择性诱导PDGFR-β蛋白的降解。
带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体的结构式如下：
Figure BDA0003810036670000061
其中，X＝2～10。
带有生物正交基团四嗪的E3泛素连接酶配体的结构式如下：
Figure BDA0003810036670000071
其中，Y＝2～10，R1＝CH3/H，R2＝-Ph-/-CH2-。
细胞内自组装蛋白降解剂的结构式如下：
Figure BDA0003810036670000072
其中X＝2～10，Y＝2～10，R1＝CH3/H,R2＝-Ph-/-CH2-。
本发明提供的蛋白降解剂在体外具有抗肿瘤活性，可应用于抗肿瘤药物的制备。
抗肿瘤药物为抗乳腺癌或抗神经胶质瘤药物。
下面结合图中所示的合成路线和具体的合成实施例来详细说明本发明提供的一类用于细胞内自组装形成蛋白降解剂的靶向识别分子的制备和活性筛选方法。
实施例1
一种带有降冰片烯基团的靶蛋白配体分子的制备方法，包括以下合成步骤：
Figure BDA0003810036670000081
1)在氮气保护下，1.9mmol Sorafenib，29mmol氢氧化钠以及20mL无水乙醇于80℃回流反应10h。TLC检测反应完毕后，减压旋除无水乙醇，加入少量水，用2mol/L盐酸调节pH至3，有黄色固体析出，抽滤，滤饼干燥，得黄褐色粉末，即为化合物1(0.8g)，结构式如下，产率91.45％。LC-MS(ESI,m/z):452.00[M+H]+，450.00[M-H]-。
Figure BDA0003810036670000082
2)将1.33mmol化合物1，2.66mmol PyBop(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷,英文名:Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidino-phosphoniumHexafluorophosphate)溶于30mL干燥二氯甲烷中，加入1mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)助溶，在冰浴条件下，逐滴加入5.31mmol三乙胺，搅拌15min后，加入2.66mmol 1,4-丁二胺或1,8-辛二胺，室温搅拌，TLC检测反应完毕后，减压旋除溶剂，加水，乙酸乙酯萃取(3×)，饱和氯化钠洗涤，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，经柱色谱分离得棕黄色油状产物，即化合物2a～2b，2a(0.61g)，产率88.52％，2b(0.66g)，结构式如下，收率84.05％。LC-MS(ESI,m/z)2a:522.25[M+H]+。2b:578.20[M+H]+，576.00[M-H]-。
Figure BDA0003810036670000083
其中，X为2或6。X＝2时，得化合物2a，X＝6时，得化合物2b。
3)将0.77mmol 5-降冰片烯-2-羧酸，1.15mmol HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，英文名2-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate)溶于30mL干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下逐滴加入3.1mmol DIPEA(二异丙基乙胺)，反应30min后加入0.77mmol化合物2a。室温搅拌过夜(本发明中过夜为12h)，TLC检测反应结束后，减压旋除有机相，加水，乙酸乙酯萃取(3×)，合并有机相并用1mol/L盐酸洗涤1次，再用饱和NaCl洗涤2次，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，经柱色谱分离纯化，可得产物S4N-1(0.10g)，结构如下所示，产率20.22％。LC-MS(ESI,m/z):642.25[M+H]+。
Figure BDA0003810036670000091
将0.69mmol 5-降冰片烯-2-羧酸，1.04mmol HATU溶于30mL干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下逐滴加入2.77mmol DIPEA，反应30min后加入0.77mmol化合物2b。室温搅拌过夜，TLC检测反应结束后，减压旋除有机相，加水，乙酸乙酯萃取(3×)，合并有机相并用1mol/L盐酸洗涤1次，再用饱和NaCl洗涤2次，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，经柱色谱分离纯化可得产物S8N-1(0.09g)，结构如下所示，产率18.75％。LC-MS(ESI,m/z):698.25[M+H]+，696.40[M-H]-。
Figure BDA0003810036670000092
将实施例1中的1,4-丁二胺或1,8-辛二胺改为十二烷二胺即可制备带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体S12N，具有如下结构式：
Figure BDA0003810036670000101
实施例2
一种带有生物正交基团四嗪的E3泛素连接酶配体分子的制备方法，包括以下合成步骤：
Figure BDA0003810036670000102
1)在氮气保护下，25mmol乙腈、2.5mmol(4-氰基苄基)氨基甲酸叔丁酯、1.25mmol三氟甲磺酸锌以及125mmol(6.067mL)的80％水合肼(质量分数)混合置于60℃反应36h，反应液冷却至室温，将50mmol亚硝酸钠溶液(3.45g亚硝酸钠溶于20mL的水)加入反应液中，然后缓慢滴加1mol/L盐酸直到无气泡产生且为pH为3。乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，经柱层析分离得到紫红色粉末，即化合物3a(0.11g)，结构如下所示，产率为14.67％，LC-MS(ESI,m/z):302.40[M+H]+。
Figure BDA0003810036670000103
2)在氮气保护下，25mmol醋酸甲脒、2.5mmol(4-氰基苄基)氨基甲酸叔丁酯、1.25mmol三氟甲磺酸锌以及125mmol(6.067mL)的80％水合肼(质量分数)混合置于30℃反应24h，反应液冷却至室温，将50mmol亚硝酸钠溶液(3.45g亚硝酸钠溶于20mL的水)加入反应液中，然后缓慢滴加1mol/L盐酸直到无气泡产生且为pH为3。乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，经柱层析分离得到红色粉末，即化合物3b(0.2g)，结构如下所示，产率为27.78％，LC-MS(ESI,m/z):287.25[M+H]+。
Figure BDA0003810036670000111
3)在氮气保护下，40mmol乙腈、4mmol N-(叔丁氧基羰基)-2-氨基乙腈、2mmol三氟甲磺酸镍以及200mmol(9.70mL)的80％水合肼(质量分数)混合置于60℃反应24h，反应液冷却至室温，将80mmol亚硝酸钠溶液(5.52g亚硝酸钠溶于30mL的水)加入反应液中，然后缓慢滴加1mol/L盐酸直到无气泡产生且pH为3。抽滤，滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，经柱层析分离得到红色粉末，即化合物3c(0.12g)，结构如下所示，产率为6.67％，LC-MS(ESI,m/z):126.00[M+H]+。
Figure BDA0003810036670000112
1)将化合物3a(1eq)或3b(1eq)溶于干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下滴加500μL三氟乙酸，室温搅拌2h，直接旋干，用于下一步反应，将其与丁二酸酐(1eq)，混溶于二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下逐滴加入三乙胺(3eq)，室温反应过夜。反应结束后，减压旋蒸除去二氯甲烷，经柱色谱分离得紫红色粉末，即化合物5a，或红色粉末，即化合物5b，化合物5a(0.12g)，收率93.02％，化合物5b(0.20g)，产率64.62％。LC-MS(ESI,m/z)5a:302.30[M+H]+，300.25[M-H]-。5b:286.20[M-H]-。结构式如下：
Figure BDA0003810036670000121
其中，R1为CH3时，得化合物5a；R1为H时，得化合物5b。
2)将化合物3c(1eq)溶于干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下滴加500μL三氟乙酸，室温搅拌2h，旋干有机相，加入少量的水，并用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至7，二氯甲烷萃取，直接旋干，用于下一步反应，将其分别与丁二酸酐(1eq)，庚二酸(1eq)，十二烷二酸(1eq)混溶于二氯甲烷溶液中，其中于庚二酸，十二烷二酸反应体系中再加入1.5eq HATU，在冰浴条件下逐滴加入DIPEA(4eq)，室温反应过夜。反应结束后，减压旋蒸除去二氯甲烷，经柱色谱分离得红色粉末5c(0.08g)，5d(0.12g)，5e(0.08g)，产率分别为63.49％，37.52％，24.92％。LC-MS(ESI,m/z)5c:224.00[M-H]-。5d:268.30[M-H]-，5e:338.35[M+H]+，336.25[M-H]-。结构式如下：
Figure BDA0003810036670000122
其中，Y＝2时，得中间体5c；Y＝5时，得中间体5d；Y＝10时，得中间体5e。
5)将化合物5a～5e(1eq)，HATU(1.5eq)溶于干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下，逐滴加入DIPEA(4eq)，搅拌10min，加入(2S,4R)-1-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(VH032)(1eq)，室温搅拌，反应完毕后，减压旋除有机相，加入适量的水，二氯甲烷萃取(3×)，无水Na2SO4干燥。抽滤除去干燥剂，减压旋除溶剂，经柱色谱分离得红色产物TzA(0.08g)，TzB(0.015g,)，TzC(0.06g)，TzD(0.10g)，TzE(0.10g)。产率分别为48.19％，9.38％，40.55％，57.47％，57.47％。LC-MS(ESI,m/z)TzA:714.60[M+H]+，712.50[M-H]-。TzB:698.55[M-H]-。TzC:660.40[M+Na]+，636.35[M-H]-。TzD:680.40[M+H]+，678.50[M-H]-。TzE:750.50[M+Na]+，748.45[M-H]-。结构如下所示。
Figure BDA0003810036670000131
其中R1＝CH3,R2＝-Ph-,Y＝2，得产物TzA；
R1＝H,R2＝-Ph-,Y＝2，得产物TzB；
R1＝CH3,R2＝-CH2-,Y＝2，得产物TzC；
R1＝CH3,R2＝-CH2-,Y＝5，得产物TzD；
R1＝CH3,R2＝-CH2-,Y＝10，得产物TzE。
实施例3
带有生物正交基团(降冰片烯)的靶蛋白配体分子与带有生物正交基团(四嗪)的E3泛素连接酶配体分子在细胞内经自组装形成蛋白降解剂。
1)生物正交反应生成蛋白降解剂
采用高效液相色谱在体外监测两部分靶向识别分子能否发生生物正交反应、反应速率以及反应进程。相同浓度的两部分靶向识别分子置于PBS和乙腈(V:V＝1:1)混合体系中按体积比(1:1)混匀，置于37℃恒温摇床上反应，在不同时间点取样进行检测，结果如图1～图5所示，所有的靶向识别分子都能够发生生物正交反应形成蛋白降解剂，但反应速率有所不同，其中，带有四嗪标签的靶向识别分子TzB(R1为H，R2为Ph，Y为2)的反应速率最快，能够快速发生生物正交反应形成蛋白降解剂。
2)细胞内自组装生成蛋白降解剂
先用带有生物正交基团(降冰片烯)靶蛋白配体分子(终浓度为10μM)处理细胞2h后，再给予细胞带有生物正交基团(四嗪)的E3泛素连接酶配体分子(终浓度为10μM)，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育24h，然后将细胞消化离心收集，用PBS洗涤细胞三次，加入1ml甲醇:乙腈:水(V:V:V＝2:2:1)并置于液氮中快速淬灭15min，冰上复溶，用细胞破碎仪进行破碎(超2s,停1s，共超20min)，置于-20℃孵育1h沉淀蛋白，4℃，13000rpm，离心15min，取上清冻干，再进行电喷雾质谱测定，验证自组装蛋白降解剂的生成。
实施例4
带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体分子对VEGFR-2激酶的抑制活性筛选。
采用的是ADP-Glo发光方法测定带有生物正交基团(降冰片烯)的靶向识别分子索拉菲尼对VEGFR-2激酶的抑制活性。
用Buffer(Tris 80mM,MgCl2 20mM,BSA 0.2mg/mL,DTT 2mM)稀释ATP(10mM)为250μM；将ATP和底物Poly(4:1Glu,Tyr)Peptide按体积1:1配成ATP(125μM)-Poly(4:1Glu,Tyr)Peptide(0.5μg/μL)混合溶液；用Buffer稀释激酶为1.5ng/μL。将待测化合物配成6个浓度梯度的溶液，于384孔板上依次加入2μL ATP-Poly(4:1Glu,Tyr)Peptide溶液、1μL样品溶液、2μL酶溶液启动反应。30℃孵育60min后，加入ADP-Glo试剂5μL终止反应。再加入KinaseDetection试剂10μL将ADP转化为ATP，在25℃孵育30min，使用PerkinElmer多功能酶标仪的化学发光模块测定发光值，计算抑制率。
数值处理：抑制率＝(阳性值-给药组值)/(阳性值-阴性值)×100％；
化合物的实验结果见表1：
表1靶向识别分子对VEGFR-2激酶的抑制活性结果
Figure BDA0003810036670000151
从表1可以看出，本发明制备的带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体分子对VEGFR-2激酶具有较好的抑制活性。
实施例5
带有生物正交基团降冰片烯的靶蛋白配体分子的细胞增殖抑制活性测定。
带有生物正交基团降冰片烯的靶向识别分子索拉菲尼在细胞水平的活性检测采用MTT检测法。将处于对数增长期的EA.hy926细胞，MDA-MB-453细胞以及U87细胞用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于96孔板(4000个/孔)，每孔180μL。放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养，24h后待细胞贴壁后加药。每组设置4个复孔，6个浓度的待测样品。阴性对照组与空白组均加入20μL/孔无血清培养基，实验组加入不同浓度的药物20μL/孔(以无血清培养基稀释药物)，放入37℃，5％CO2恒温培养箱中继续培养。药物作用48h后，加入MTT溶液(终浓度为0.5mg/mL)22μL/孔，37℃孵育4h后，小心吸弃上清液，加入DMSO 150μL/孔，置于摇床上充分振摇15min。用酶联免疫检测仪于490nm波长下测定各孔吸光度(OD)值。
数值处理：抑制率＝(OD阴性组-OD给药组)/(OD阴性组-OD空白组)×100％；
部分化合物的实验结果见表2：
表2靶向识别分子的细胞增殖抑制活性
Figure BDA0003810036670000161
从表2可以看出，本发明制备靶向识别分子S4N-1与S8N-1对EA.hy926细胞具有较好的增殖抑制活性。
实施例6
细胞内自组装型蛋白降解剂对靶蛋白降解效果的考察。
将处于对数增长期的EA.hy926细胞或U87细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于6孔板(5×105个/孔)，每孔2mL。放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养，24h后待细胞贴壁后加药。先用固定浓度(终浓度为10μM)或不同浓度(终浓度为0.016μM，0.08μM，0.4μM，2μM，10μM)的靶蛋白配体分子处理细胞2h后，再给予不同浓度(终浓度为0.016μM，0.08μM，0.4μM，2μM，10μM)或者固定浓度(终浓度为10μM)的带有四嗪标签的E3泛素连接酶配体处理细胞，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h，然后进行蛋白提取，再采用Western Blot免疫印迹法检测相关蛋白水平。参见图6中A和B以及图8中A和B，可以看出，所构建的细胞内自组装型蛋白降解剂对于U87细胞的作用效果明显优于EA.hy926细胞。参见图7～图11中的A和B经由靶蛋白配体分子S4N-1与各种类型带有四嗪标签的E3泛素连接酶配体VH032组装形成的蛋白降解剂均对PDGFR-β蛋白有较好的降解效果，对于VEGFR-2和EphB4蛋白也有一定的降解效果，参见图12中的A和B可知其它靶蛋白配体分子(S8N-1)与反应速率最快的四嗪标签的E3泛素连接酶配体TzB组装形成的蛋白降解剂作用效果不佳，不如S4N-1的作用效果，表明以S4N-1为靶向识别分子构建的自组装型蛋白降解剂具有良好的应用前景，可用于神经胶质瘤等抗肿瘤药物的制备。

Claims (10)

1.一种基于VH032的细胞内自组装蛋白降解剂，其特征在于，该降解剂结构式如下：
Figure FDA0003810036660000011
其中X＝2～10，Y＝2～10，R1＝CH3或H，R2＝-Ph-或-CH2-。
2.一种如权利要求1所述的细胞内自组装蛋白降解剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过烷基二胺将索拉菲尼和降冰片烯连接，获得带有降冰片烯的靶蛋白配体；
通过连接链将四嗪基团修饰在E3泛素连接酶配体上，得到带有四嗪的E3泛素连接酶配体；
将带有降冰片烯的靶蛋白配体分子和带有四嗪的E3泛素连接酶配体先后进入细胞，在细胞内发生生物正交反应，自组装形成蛋白降解剂。
3.根据权利要求2所述的一种细胞内自组装蛋白降解剂的制备方法，其特征在于，带有降冰片烯的靶蛋白配体的结构式如下：
Figure FDA0003810036660000012
其中，X＝2～10。
4.根据权利要求3所述的一种细胞内自组装蛋白降解剂的制备方法，其特征在于，带有降冰片烯的靶蛋白配体通过以下过程制得：
将索拉菲尼经水解得到带有活性反应基团羧基的化合物，然后与烷基二胺经酰胺缩合反应，得到带有活性反应基团氨基的化合物，最后带有活性反应基团氨基的与5-降冰片烯-2-羧酸经酰胺缩合反应，得到带有降冰片烯的靶蛋白配体。
5.根据权利要求2所述的一种细胞内自组装蛋白降解剂的制备方法，其特征在于，带有四嗪的E3泛素连接酶配体的结构式如下：
Figure FDA0003810036660000021
其中，Y＝2～10，R1＝CH3或H，R2＝-Ph-或-CH2-。
6.根据权利要求5所述的一种细胞内自组装蛋白降解剂的制备方法，其特征在于，带有四嗪的E3泛素连接酶配体通过以下过程制得：
乙腈、氰基化合物以及水合肼在三氟甲磺酸锌或三氟甲磺酸镍的作用下，或者醋酸甲脒、氰基化合物以及水合肼在三氟甲磺酸锌的作用下，经环化反应，氧化脱氢形成1,2,4,5-四嗪类化合物，然后在三氟乙酸的作用下脱去Boc保护基，再通过二酸与E3泛素连接酶配体VH032连接，形成带有四嗪的E3泛素连接酶配体。
7.根据权利要求1所述的一种细胞内自组装蛋白降解剂的制备方法，其特征在于，将带有降冰片烯的靶蛋白配体溶液加入到含有细胞的培养皿中孵育后，再加入带有四嗪的E3泛素连接酶配体溶液，孵育，在细胞内经自组装形成蛋白降解剂。
8.一种如权利要求1所述的细胞内自组装蛋白降解剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，抗肿瘤药物为选择性诱导PDGFR-β蛋白降解的药物。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，抗肿瘤药物为抗乳腺癌或抗神经胶质瘤药物。
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