CN113975404B - 一种氟苯尼考多肽衍生物及其应用 - Google Patents

一种氟苯尼考多肽衍生物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药化工领域，具体涉及一种氟苯尼考多肽衍生物及应用。本发明将氟苯尼考与短肽R8通过三种连接臂丁二酸\戊二酸\己二酸连接获得了三种氟苯尼考多肽衍生物FSR8、FGR8、FOR8；所述氟苯尼考多肽衍生物具有显著的抗菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有明显的抑菌效果，并对耐氟苯尼考的大肠杆菌具有更显著的抑菌作用；并且所述氟苯尼考多肽衍生物具有良好的水溶性，可用于制备治疗细菌感染的药物。

Description

一种氟苯尼考多肽衍生物及其应用
技术领域
本发明属于医药化工领域，具体涉及一种氟苯尼考多肽衍生物及用于制备抗细菌感染药物的应用。
背景技术
临床中抗菌药物的使用引发大量耐药性产生及抗生素疗效降低等一系列问题，对人类和动物的健康造成严重威胁。氟苯尼考是目前常用的一种兽用抗生素，抗菌谱广，抑菌作用强，但由于近些年氟苯尼考的广泛使用，对其耐药的问题越来越严重。另外，氟苯尼考的水溶性极低，开发性能优良的水溶性氟苯尼考一直是兽药领域研究的热点。
抗菌肽存在于绝大多数生物体中，具有广谱抗菌作用，能够抵御外界细菌、真菌、原虫和病毒等微生物的侵害。抗菌肽以细菌细胞膜为作用靶点这一不同于传统抗生素的抗菌机理使抗菌肽有望成为后抗生素时代最有前景的新型抗菌药物。
多肽-药物偶联物(Peptide-drug conjugate，PDC)通过化学键将小分子药物与多肽连接得到一类新兴药物分子。PDC借助多肽自身性质可以有效地改善小分子药物的不足，如增强药物水溶性、靶向性。
目前尚需具有对耐药菌具有更好抗菌活性的全新结构抗菌类化合物。
发明内容
针对上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种新型氟苯尼考多肽衍生物、制备方法及在制备抗细菌感染药物中的应用。具体的，本发明提供了三种氟苯尼考多肽衍生物，均为白色结晶体粉末，腥味，易溶于水，溶于甲醇，二甲基甲酰胺等有机溶剂；具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种氟苯尼考多肽衍生物，所述氟苯尼考多肽衍生物结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003272319000000011
其中，n为大于等于0的任一整数。
优选地，所述n为0，或1，或2；所述氟苯尼考多肽衍生物分别命名为FSR8、FGR8、FOR8，对应的分子式分别为C64H115Cl2FN34O14S、C65H117Cl2FN34O14S、C66H119Cl2FN34O14S，对应的结构式分别如下所示：
Figure BDA0003272319000000021
第二方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的氟苯尼考多肽衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗菌药物中的应用。
优选地，所述抗菌药物为抗细菌感染的药物。
优选地，所述细菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、具有多药耐药性的临床分离菌。
优选地，所述细菌为金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。
优选地，所述细菌为耐氟苯尼考的临床分离菌。
优选地，所述细菌为耐氟苯尼考的大肠杆菌。
第三方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的氟苯尼考多肽衍生物或其药学上可接受的盐，加入药学上可接受的载体制成药学上可接受的任一剂型。
优选地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、注射剂。
第四方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的氟苯尼考多肽衍生物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将氟苯尼考与丁二酸酐\戊二酸酐\己二酸酐酯化反应分别形成氟苯尼考丁二酸酯(FS)、氟苯尼考戊二酸酯(FG)、氟苯尼考己二酸酯(FO)；
(2)将步骤(1)所得FS、FG、FO分别与一级结构为H-RRRRRRRR-NH2的短肽R8酰胺化反应得到所述的氟苯尼考多肽衍生物。
优选地，所述步骤(2)为：将步骤(1)所得FS、FG、FO分别与短肽R8按摩尔比1：1混合溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，氮气保护下室温反应得到所述的氟苯尼考多肽衍生物。
优选地，所述短肽R8通过Fmoc固相合成法获得。
优选地，所述氟苯尼考多肽衍生物的合成路线如下所示：
Figure BDA0003272319000000031
其中，(a)为丁二酸酐\戊二酸酐\己二酸酐。
本发明的有益效果是：①本发明应用固相合成技术合成由8个精氨酸组成的短肽，命名为R8，进一步通过有机合成技术，将R8与氟苯尼考衍生物FS、FG与FO偶联，获得三种氟苯尼考多肽衍生物FSR8、FGR8与FOR8；②本发明所述的氟苯尼考多肽衍生物FSR8、FGR8与FOR8在浓度为1000μmol/L时，FSR8、FGR8、FOR8的溶血率分别为4.58％、5.48％、9.89％，溶血率很低，安全性较高；③细胞毒试验显示FSR8、FGR8与FOR8对人结肠癌细胞(Caco-2)的半抑制浓度IC50分别为426.3μmol/L、466.7μmol/L、435.3μmol/L，表明本发明所述的氟苯尼考多肽衍生物FSR8、FGR8与FOR8对细胞无明显的毒性，临床使用时安全性较高；④本发明创造性地将R8与氟苯尼考衍生物FS、FG与FO偶联，获得本发明所述的氟苯尼考多肽衍生物FSR8、FGR8与FOR8水溶性优良，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有良好的抑菌活性，并且对耐氟苯尼考大肠杆菌具有良好的抑菌活性，可作为治疗细菌感染的抗菌药物。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做出简单的介绍。
图1氟苯尼考多肽衍生物FSR8的HPLC检测结果示意图；
图2氟苯尼考多肽衍生物FGR8的HPLC检测结果示意图；
图3氟苯尼考多肽衍生物FOR8的HPLC检测结果示意图；
图4氟苯尼考多肽衍生物FSR8的HRMS检测结果示意图；
图5氟苯尼考多肽衍生物FGR8的HRMS检测结果示意图；
图6氟苯尼考多肽衍生物FOR8的HRMS检测结果示意图；
图7氟苯尼考多肽衍生物FSR8的细胞毒结果示意图；
图8氟苯尼考多肽衍生物FGR8的细胞毒结果示意图；
图9氟苯尼考多肽衍生物FOR8的细胞毒结果示意图；
图10氟苯尼考多肽衍生物对绵羊红细胞的溶血率示意图；
图11氟苯尼考多肽衍生物FSR8对S.aureus 29213杀菌曲线示意图；
图12氟苯尼考多肽衍生物FSR8对E.coli 25922杀菌曲线示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 氟苯尼考多肽衍生物的制备
针对现有技术存在的问题，本发明创新性地将氟苯尼考与R8通过丁二酸、戊二酸与己二酸连接，形成了三种氟苯尼考多肽衍生物FSR8、FGR8与FOR8，FSR8、FGR8与FOR8对耐氟苯尼考大肠杆菌具有较强的抑菌活性。
本发明提供了三种氟苯尼考多肽衍生物，所述氟苯尼考多肽衍生物分别为FSR8、FGR8、FOR8，分子式为C64H115Cl2FN34O14S、C65H117Cl2FN34O14S、C66H119Cl2FN34O14S，均为白色结晶体粉末，腥味，易溶于水，溶于甲醇，二甲基甲酰胺等有机溶剂，分子结构式分别为：
Figure BDA0003272319000000041
所述氟苯尼考多肽衍生物的合成路线如下所示：
Figure BDA0003272319000000051
其中，(a)为丁二酸酐\戊二酸酐\己二酸酐。
具体合成过程包括以下步骤：
第一步、运用固相合成法合成短肽R8：
短肽R8是直链小肽，其一级结构为H-RRRRRRRR-NH2。具体的R8通过Fmoc固相合成法得到氨基端裸露的肽树脂，然后经裂解、纯化得到多肽修饰物。选用Rink Amide树脂，肽链由C端向N端延长。缩合剂为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑/二异丙基乙胺(HBTU/HOBt/DIEA)。脱保护试剂为哌啶/DMF溶剂。裂解时向肽树脂中加入裂解液，先冰浴反应，再常温反应；优选先冰浴反应30min，再常温反应120min。裂解所用的裂解液由三氟乙酸(TFA)、乙二硫醇、苯甲醚和水组成。所述纯化采用高效液相色谱法进行；优选地，所用洗脱剂为乙腈、水和少量(0.1％v/v)三氟乙酸。
短肽R8的核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)以及高分辨质谱HRMS数据如下：
R8：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.63(d，J＝7.1Hz，1H)，8.27-8.20(m，3H)，8.12(q，J＝6.6Hz，3H)，7.89(m，9H)，7.54-7.21(m，19H)，7.14(s，1H)，4.33(d，J＝6.5Hz，1H)，4.25(d，J＝7.3Hz，5H)，4.16(q，J＝7.3Hz，1H)，3.84(q，J＝6.1Hz，1H)，3.30-2.82(m，16H)，1.83-1.62(m，9H)，1.51(m，23H)。13C-NMR(101MHz，DMSO-d6)δ173.82，171.80，171.61，171.43，168.84，160.37，160.03，159.70，159.36，157.40，157.37，157.34，121.24，118.31，115.38，112.45，52.83，52.61，52.48，52.13，40.83，40.66，40.52，28.80，25.44，24.44。Chemical Formula：C48H99N33O8，Exact Mass：1265.8354，HRMS(+TOF MS)：633.9237(M+2H)/2。
第二步、由氟苯尼考的羟基位与丁二酸酐、戊二酸酐与己二酸酐形成氟苯尼考丁二酸酯(FS)、氟苯尼考戊二酸酯(FG)、与氟苯尼考己二酸酯(FO)：
FSR8、FGR8与FOR8的合成利用有机合成技术，以丁二酸\戊二酸\己二酸作为连接臂，分别与氟苯尼考的羟基和R8的氨基脱水缩合形成FSR8、FGR8与FOR8复合物。具体的：(1)氟苯尼考分别与丁二酸酐\戊二酸酐\己二酸酐于丙酮中在4-二甲基吡啶(DMAP)催化下回流6h得到化合物FS、FG与FO。氟苯尼考与丁二酸酐\戊二酸酐\己二酸酐的物质的量比为1.5/1，DMAP为氟苯尼考质量的4％。
FS、FG纯化：先50℃旋转蒸发除去溶剂，然后缓慢加入饱和的50℃的NaHCO3溶液，直到溶液中无气泡产生。过滤除去杂质后缓慢加入0.1mol盐酸溶液至PH＝2.0，将液体冷藏4℃冰箱。有白色固体逐渐析出，抽滤，蒸馏水洗涤数次。产率FS＝72.7％，FG＝74.1％。
FO处理：先向反应液中加入10％稀盐酸，然后用二氯甲烷(DCM)萃取水相，合并有机相，水洗涤后，用无水硫酸镁干燥2h，浓缩得棕色稠状物。再用展开剂为乙酸乙酯︰石油醚＝1/1过柱分离得白色固体，产率＝70.2％。
上述化合物的核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)以及高分辨质谱HRMS数据如下：
FS：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.33(s，1H)，8.91(d，J＝8.8Hz，1H)，7.89(d，J＝8.5Hz，2H)，7.61(d，J＝8.4Hz，2H)，6.44(s，1H)，6.01(d，J＝4.3Hz，1H)，4.64-4.29(m，3H)，3.20(s，3H)，2.65(m，2H)，2.54(m，2H)。13C-NMR(101MHz，DMSO-d6)δ173.45，171.26，163.96，142.74，140.48，127.43，127.00，82.87，81.18，66.33，53.20，43.52，28.93，28.66。Chemical Formula：C16H18Cl2FNO7S，Exact Mass：457.0165，HRMS(+TOF MS)：475.0517[M+NH4]+。
FG：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.16(s，1H)，8.95(d，J＝8.8Hz，1H)，7.95-7.89(m，2H)，7.66-7.59(m，2H)，6.45(s，1H)，6.00(d，J＝5.0Hz，1H)，4.61–4.28(m，3H)，3.21(s，3H)，2.47(m，2H)，2.24(t，J＝7.3Hz，2H)，1.76(m，2H)。13C-NMR(101MHz，DMSO-d6)δ174.01，171.68，163.95，142.82，140.62，127.54，127.17，82.96，66.34，53.15，43.52，32.67，19.75。Chemical Formula：C17H20Cl2FNO7S，Exact Mass：471.0322，HRMS(+TOF MS)：489.0721[M+NH4]+。
FO：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.55(s，1H)，7.88(d，J＝8.0Hz，2H)，7.66(d，J＝8.0Hz，2H)，7.23(s，1H)，5.94(d，J＝4.3Hz，1H)，4.57(m，1H)，4.48-4.24(m，2H)，3.19(s，3H)，2.37(m，2H)，2.01-1.92(m，2H)，1.59-1.49(m，4H)，1.23(s，2H)。13C-NMR(101MHz，DMSO-d6)δ175.93，171.93，164.29，143.22，140.44，127.59，127.05，82.78，81.09，66.69，53.13，43.52，35.84，33.30，24.89，24.10.Chemical Formula：C18H22Cl2FNO7S，Exact Mass：485.0478，HRMS(+TOF MS)：503.0818[M+NH4]+。
第三步、由FS、FG与FO的羧基端与R8的氨基端通过酰胺化形成氟苯尼考多肽衍生物FSR8、FGR8与FOR8：
称取化合物FS、FG与FO(0.065mmol)与(3H-1,2,3-三唑并[4,5-B]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐(Pyaop，0.078mmol)于A瓶内，加入0.5mL DMF，然后通过N2保护，室温搅拌0.5h；然后称取R8(0.065mmol)于B瓶内，用0.5mL DMF溶解，转移到A瓶，再用0.5mLDMF洗B瓶后移入A瓶，N2保护，再加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，0.13mmol)后于室温反应6h。反应终止后，用冷冻干燥仪冻干溶剂，然后用高效制备液相分离产物FSR8、FGR8与FOR8，产率45％～60％。
上述化合物的核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)以及高分辨质谱(HRMS)数据如下：
FSR8：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.00(d，J＝8.8Hz，1H)，8.10(m，7H)，7.99(d，J＝7.4Hz，1H)，7.90(d，J＝8.2Hz，2H)，7.86-7.82(m，1H)，7.77(d，J＝6.1Hz，7H)，7.61(d，J＝8.2Hz，2H)，7.53-7.32(m，13H)，7.23-7.07(m，13H)，6.48(s，1H)，6.00(d，J＝4.2Hz，1H)，4.52-4.32(m，3H)，4.25(q，J＝6.3，5.8Hz，7H)，4.19-4.12(m，1H)，3.19(s，3H)，3.14-3.03(m，16H)，2.65(m，2H)，2.47(d，J＝10.0Hz，2H)，1.67(d，J＝10.5Hz，8H)，1.51(m，24H)。13C-NMR(101MHz，DMSO-d6)δ173.67，172.00，171.77，171.66，171.48，171.32，164.25，160.27，159.94，159.61，159.28，157.16，143.02，140.69，127.65，127.26，121.31，118.37，115.42，112.48，83.05，81.35，72.73，66.54，53.45，53.25，52.71，52.44，52.39，43.72，40.74，40.61，29.79，29.48，29.26，25.30，22.73。Chemical Formula：C64H115Cl2FN34O14S，ExactMass：1704.8414，HRMS(+TOF MS)：854.4191(M+2H)/2。
FGR8：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.05(d，J＝8.8Hz，1H)，8.08(m，7H)，7.98(d，J＝7.4Hz，1H)，7.90(d，J＝8.3Hz，2H)，7.88-7.84(m，1H)，7.82-7.74(m，7H)，7.61(d，J＝8.2Hz，2H)，7.55-7.32(m，13H)，7.26-7.05(m，13H)，6.49(s，1H)，5.98(d，J＝4.8Hz，1H)，4.64-4.30(m，3H)，4.27-4.20(m，7H)，4.15(q，J＝7.2Hz，1H)，3.19(s，3H)，3.15-2.92(m，16H)，2.42(m，2H)，2.25-2.09(m，2H)，1.78-1.61(m，10H)，1.57-1.40(m，24H)。13C-NMR(101MHz，DMSO-d6)δ173.67，172.31，172.13，171.96，171.71，171.67，171.48，164.24，160.16，159.82，159.49，159.15，157.17，143.08，140.77，127.72，127.36，121.18，118.25，115.31，112.38，83.09，81.40，72.84，72.78，66.55，53.38，53.18，52.71，52.61，52.43，43.70，40.74，40.71，40.60，34.29，33.10，29.46，29.23，20.60。Chemical Formula：C65H117Cl2FN34O14S，Exact Mass：1718.8570，HRMS(+TOF MS)：861.4254(M+2H+)/2。
FOR8：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.01(d，J＝8.8Hz，1H)，8.07(m，7H)，7.97(d，J＝7.4Hz，1H)，7.91(d，J＝8.3Hz，2H)，7.71(m，8H)，7.61(d，J＝8.3Hz，2H)，7.44(d，J＝49.5Hz，13H)，7.11(d，J＝37.1Hz，13H)，6.48(s，1H)，5.97(d，J＝5.1Hz，1H)，4.59-4.40(m，3H)，4.25(q，J＝7.0Hz，7H)，4.15(q，J＝7.1Hz，1H)，3.19(s，3H)，3.14-2.96(m，16H)，2.41(t，J＝7.0Hz，2H)，2.22-2.18(m，1H)，2.12(q，J＝24.8Hz，1H)，1.67-1.61(m，8H)，1.56-1.39(m，28H)。13C-NMR(101MHz，DMSO-d6)δ174.61，174.57，173.62，173.49，172.75，172.10，171.65，171.61，171.43，164.19，160.05，159.71，159.37，159.03，157.07，157.06，143.03，140.80，127.75，127.36，121.01，118.08，115.15，112.22，83.05，81.36，72.80，72.74，66.55，53.36，53.16，52.65，52.37，51.45，43.68，40.75，40.70，40.62，34.95，33.65，33.57，33.37，33.26，29.47，25.34，25.25，24.88，24.29，24.21，24.20，24.15。ChemicalFormula：C66H119Cl2FN34O14S，Exact Mass：1732.8727，HRMS(+TOF MS)：868.4414(M+2H+)/2。
实施例2：氟苯尼考多肽衍生物体外抗菌活性测定
1.试验菌株
金黄色葡萄球菌(Staphyloccusaureus，S.aureus，ATCC 29213)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA，ATCC 43300)和大肠杆菌(Escherichia coli，E.coi，ATCC 25922)，购自中国食品药品检定研究院；大肠杆菌临床菌株：2019XJ06、2019XJ25、2018XJ108、2018XJ105、2018XJ30，耐氟苯尼考大肠杆菌临床菌株2017XJ30、2019XJ20，均由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所兽药研究室分离、鉴定、保存。
2.试验试剂
氟苯尼考(萨恩化学技术有限公司)、FS、FG、FO、R8、FSR8、FGR8与FOR8，MH肉汤培养基(广东环凯微生物科技有限公司)。
3.试验方法
严格按照无菌操作要求进行。
a)细菌复苏：取15mL离心管，分别依次加入7mL营养肉汤和10μL菌液，在恒温震荡器内保持37℃孵育18-24h，振荡速度170-180转/分，得到复苏菌液。
b)体外最小抑菌浓度(MIC)测定：采用微量二倍稀释法进行测定，取无菌的96孔板，第一孔加入200μL的抗菌药物，第二至十孔分别加入100μL的MH肉汤培养基，从第一孔吸取100μL加入第二孔，混匀，再吸取100μL至第三孔，依次类推，第十孔吸取100μL弃掉。此时药物浓度依次为：200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39μmol/L，第十一孔加入200μL菌液，第十二孔加入200μLMH培养基。然后在1至10孔各加入100μL菌液，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ML。将接种好的96孔板放置37℃培养箱进行培养，24h取出96孔板目测孔内清澈情况，目测孔内澄清、无沉淀的最后一孔对应的浓度便为该药的MIC值。
4.试验结果
结果如下表1所示。
表1 化合物最小抑菌浓度MIC(μmol/L)
化合物/细菌 氟苯尼考 FS FG FO R8 FSR8 FGR8 FOR8
E.coli(ATCC 25922) 6.25 >100 >100 >100 50 12.5 12.5 12.5
S.aureus(ATCC 29213) 6.25 >100 >100 >100 12.5 12.5 12.5 25
MRSA(ATCC 43300) 6.25 >100 >100 >100 12.5 12.5 12.5 25
2017XJ30 >100 >100 >100 >100 50 12.5 12.5 12.5
2019XJ20 >100 >100 >100 >100 50 12.5 12.5 12.5
2019XJ06 6.25 >100 >100 >100 50 12.5 12.5 12.5
2019XJ25 6.25 >100 >100 >100 50 12.5 12.5 12.5
2018XJ108 6.25 >100 >100 >100 50 12.5 12.5 12.5
2018XJ105 6.25 >100 >100 >100 50 12.5 12.5 12.5
2018XJ30 6.25 >100 >100 >100 50 12.5 12.5 12.5
根据上表结果可知，氟苯尼考多肽衍生物FSR8、FGR8与FOR8对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌都具有良好的抑菌活性，其最小抑菌浓度均达到10微摩尔水平，并且对氟苯尼考耐药的大肠杆菌临床菌株有良好的效果。
实施例3 细胞毒实验
1.试验细胞
人直肠癌细胞(Caco-2购于中国科学院上海细胞库)。
2.试验试剂
DMEM培养基(Gibco)，CCK-8试剂(MCE)，FSR8，FGR8，FOR8。
3.试验方法
向96孔培养板中接种人直肠癌细胞(Caco-2)细胞浓度为1.0×104细胞/孔，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。吸出培养液，并用1×PBS缓冲溶液清洗细胞两次，加入100μL不同浓度的FSR8、FGR8、FOR8样品溶液，37℃孵育24h。
用1×PBS清洗后加入80μLPBS溶液混悬。加入CCK-8试剂，10μL/孔，37℃孵育2h，多功能酶标仪测定450nm吸收波长下的吸收值(OD450)，1×PBS溶液为阴性对照。试验结果分析：重复三次，SPSS分析，取平均值。
三种氟苯尼考多肽衍生物FSR8、FGR8、FOR8的细胞毒实验结果分别如图7-图9所示，FSR8、FGR8与FOR8的药物浓度IC50值分别为426.3μmol/L、466.7μmol/L、435.3μmol/L。结果表明，这三种氟苯尼考多肽衍生物对细胞无明显的毒性，临床使用时安全性较高。
实施例4 红细胞溶血实验
1.试验细胞
红细胞(来源于无菌脱纤维绵羊血-购于北京路桥技术股份有限公司)。
2.试验试剂
TritonX 100(阿拉丁试剂有限公司)，FSR8，FGR8，FOR8。
3.试验方法
取96孔板，每孔加入150μL配置好的5％红细胞悬液，每个药物浓度做三个复孔。然后将稀释好的药物对应加入96孔板中，每孔50μL药物，设8-10个浓度梯度，阴性对照组是50μL的1×PBS溶液，阳性对照组是50μL的0.1％Triton X 100溶液；37℃恒温箱内放置1h后将96孔板从恒温箱内取出，置于4℃离心机内离心(3500rpm，5min)。离心完毕，每块板对应都取一块新的96孔板，然后对应地取出100μL上层液体(孔孔对应)，于酶标仪540nm处测取OD值。
试验结果分析：红细胞溶血率＝(A-A0)/(Atotal-A0)×100，A为待测药物的吸光度，A0为阴性对照的吸光度，Atotal为阳性对照组的吸光度。以溶血率与药物浓度作折线图，或用SPSS软件回归分析得到半数溶血值HC50。
氟苯尼考多肽衍生物FSR8、FGR8、FOR8溶血率如图10所示，在浓度为1000μmol/L时，FSR8、FGR8、FOR8的溶血率分别为4.58％、5.48％、9.89％，结果表明，本发明所述氟苯尼考多肽衍生物FSR8、FGR8、FOR8的溶血率很低，安全性较高。
实施例5 杀菌曲线测定
1.试验菌株
金黄色葡萄球菌(Staphyloccusaureus，S.aureus，ATCC 29213)、大肠杆菌(Escherichia coli，E.coi，ATCC 25922)，购自中国食品药品检定研究院。
2.试验试剂
MH肉汤培养基，MH琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)。
3.试验方法
S.aureus 29213和E.coli 25922在MH肉汤培养基中于37℃震荡培养6h，然后稀释至大约6×105CFU/mL；FSR8终浓度为0.5×MIC、1×MIC、2×MIC和4×MIC；分别于0，2，4，6，8，10，12，24h，取0.5mL菌液连续稀释10-1至10-8用0.9％生理盐水；然后将稀释液取100μL铺在无菌的MH琼脂平板上，并在37℃下孵育24h。对活菌落计数并表示为Log10(CFU/mL)；三个重复。
杀菌动力学实验结果如图11和图12所示，FSR8对E.coli 25922、S.aureus 29213杀菌时间曲线呈浓度依赖性，0.5×MIC、1×MIC抑制细菌增殖，2×MIC、4×MIC直接杀死细菌。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种氟苯尼考多肽衍生物，其特征在于，所述氟苯尼考多肽衍生物结构式如下式（Ⅰ）所示：
Figure QLYQS_1
式（Ⅰ），
其中，n为1，或2，或3。
2.如权利要求1所述的氟苯尼考多肽衍生物在制备抗菌药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗菌药物为抗细菌感染的药物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细菌包括革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌包括耐氟苯尼考的大肠杆菌。
6.一种制剂，其特征在于，所述制剂包含权利要求1所述的氟苯尼考多肽衍生物和药学上可接受的载体。
7.如权利要求1所述氟苯尼考多肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将氟苯尼考与丁二酸酐戊二酸酐己二酸酐酯化反应分别形成氟苯尼考丁二酸酯（FS）、氟苯尼考戊二酸酯（FG）、氟苯尼考己二酸酯（FO）；
（2）将步骤（1）所得FS、FG、FO分别与一级结构为H-RRRRRRRR-NH2的短肽R8酰胺化反应得到所述的氟苯尼考多肽衍生物。
8.如权利要求7所述氟苯尼考多肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）为：将步骤（1）所得FS、FG、FO分别与短肽R8按摩尔比1：1混合溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，氮气保护下室温反应得到所述的氟苯尼考多肽衍生物。
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