CN111154002B - 双功能肽k14、基因载体和共载药系统 - Google Patents

双功能肽k14、基因载体和共载药系统 Download PDF

Info

Publication number
CN111154002B
CN111154002B CN202010025284.5A CN202010025284A CN111154002B CN 111154002 B CN111154002 B CN 111154002B CN 202010025284 A CN202010025284 A CN 202010025284A CN 111154002 B CN111154002 B CN 111154002B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
curcumin
dissolving
pei
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010025284.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111154002A (zh
Inventor
刘克海
郭馨丽
韩萍
张海涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Ocean University
Original Assignee
Shanghai Ocean University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Ocean University filed Critical Shanghai Ocean University
Priority to CN202010025284.5A priority Critical patent/CN111154002B/zh
Publication of CN111154002A publication Critical patent/CN111154002A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111154002B publication Critical patent/CN111154002B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种双功能肽K14、基因载体和共载药系统，采用双功能肽K14交联低分子量聚乙烯亚胺，得到基因载体；将姜黄素偶联至PEI‑K14表面，并与p53自装配成纳米复合物，协同逆转卵巢癌的化疗耐药性；该系统可通过K14中肿瘤靶向肽tLyP‑1序列主动靶向并浓集于肿瘤组织，随后GPLGIAGQ肽经MMP2酶解，姜黄素被释放，而释放姜黄素后的PEI‑K14/p53复合物则内吞进入肿瘤细胞内，PEI发挥抑制P‑gp对细胞毒性药物外排的作用，而K14中核定位信号NLS序列则主动携带该复合物转运至细胞核，p53用于调控多药耐药蛋白MRP；本发明的共载药系统的递送效率高，可有效增强卵巢癌的化疗敏感性。

Description

双功能肽K14、基因载体和共载药系统
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种双功能肽K14、基因载体和共载药系统。
背景技术
卵巢癌是发病率位于第三位的女性生殖系统恶性肿瘤，其死亡率居妇科恶性肿瘤之首。目前，对化疗药物耐药(MDR)仍然是卵巢癌治疗失败的主要原因。化疗耐药是涉及基因突变和药物外排等多因素的复杂过程，针对单因素的逆转肿瘤耐药手段具有局限性，疗效尚不理想。因此采用多种逆转肿瘤化疗耐药途径，发挥协同作用成为卵巢癌治疗的热点。
卵巢癌化疗耐药的发生过程中，抑癌基因发挥着重要作用。研究表明，近80％的卵巢癌患者存在p53基因的突变，且p53的突变与其化疗耐药性密切相关，因此，针对卵巢癌化疗耐药性的基因治疗多聚焦于肿瘤抑癌基因p53。基因治疗是将外源性目的基因导入靶细胞，随着基因表达，细胞获得特定功能，达到治疗目的。如何将p53基因成功递送至卵巢癌耐药细胞是基因治疗有效逆转其化疗耐药的关键。另一方面，TLRs作为炎症相关受体家族，近年来备受关注，其中TLR-4在卵巢癌细胞表面高表达。Kelly等报道了在人卵巢癌细胞上，TLR-4/MyD88+信号通路与紫杉醇耐药有关。因此，如何拮抗化疗药物与TLR-4的结合，使其无法激活TLR-4/MyD88+通路，就可有效降低化疗耐药性。研究表明姜黄素可作用于TLR-4的辅助蛋白—髓样分化蛋白2(MD-2)，阻断配体(如LPS、PTX)与TLR4/MD-2复合物结合，抑制TLR-4二聚体形成而拮抗TLR-4介导的信号通路，从而有效降低由TLR-4/MyD88+信号通路引起的化疗耐药。
如何将p53基因与姜黄素同时递送至卵巢癌耐药细胞，发挥协同作用，共同逆转卵巢癌化疗耐药，是药剂学家面临的重要问题。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种双功能肽K14。
本发明的第二个目的是提供一种基因载体。
本发明的第三个目的是提供一种共载药系统的制备方法，即采用双功能肽K14交联PEI制备高分子量PEI-K14衍生物，并通过GPLGIAGQ肽接枝姜黄素，同时与p53自组装成纳米复合物，从而构建姜黄素与p53共递送系统CUR-PEI-K14/p53，通过增强p53的体内转染效率，利用CUR与TLR-4特异性结合，从而有效提高卵巢癌耐药细胞的化疗敏感性，提高卵巢癌的化疗效果。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种双功能肽K14，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
K14为具有靶向于NRPs受体的TLyP-1肽和核定位信号肽NLS(PKKKRKV)两端各连接一个半胱氨酸组成的双功能多肽C-TLyP-1-NLS-C(CGNKRTRCKKKRKC)。
一种基因载体，其由双功能肽K14和聚乙烯亚胺偶联而成，聚乙烯亚胺和双功能肽K14的摩尔比为1:1-1:30；
双功能肽K14为上述的双功能肽K14。
优选地，聚乙烯亚胺的分子量为600-70000Da。
一种共载药系统的制备方法，其包括如下步骤：
(1)、合成如上述的双功能肽K14；
(2)、将(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶于二甲亚砜溶液内，得到(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯液；将双功能肽K14溶于磷酸缓冲盐溶液内，得到双功能肽K14液；将聚乙烯亚胺溶于磷酸缓冲盐溶液内，得到聚乙烯亚胺液；将(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯液加入聚乙烯亚胺液内，得到第一混合液，将双功能肽K14液加入第一混合液内，冷冻干燥，得到基因载体；
(3)、姜黄素和4-二甲氨基吡啶溶于四氢呋喃内，加入三乙胺，得到姜黄素溶液，将戊二酸酐溶于四氢呋喃溶液后，加入姜黄素溶液内，经过萃取，得到姜黄素衍生酸；
1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于无水二甲基甲酰胺内得到第二混合液，姜黄素衍生酸溶于无水二甲基甲酰胺内得到第三混合液，将第二混合液加入第三混合液内得到第四混合液，将八肽和N,N-二异丙基乙胺溶于无水二甲基甲酰胺内得到第五混合液，将第五混合液加入第四混合液内，干燥，得到姜黄素载体；
(4)、将步骤(2)的基因载体溶于磷酸缓冲盐溶液内得到基因载体液，将步骤(3)的姜黄素载体溶于磷酸缓冲盐溶液内得到姜黄素载体液，将(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯加入基因载体液内得到第六混合液，将姜黄素载体液加入第六混合液内，干燥，得到姜黄素-基因载体；
(5)、将姜黄素-基因载体加水稀释，然后再加入p53基因，得到共载药系统；
步骤(2)中的基因载体为上述的基因载体。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明采用含有tLyP-1与NLS序列的双功能肽C-tLyP-1-NLS-C(即K14)交联低分子量聚乙烯亚胺(PEI)，得到新型非病毒基因载体PEI-K14，；然后利用交联技术将姜黄素(CUR)偶联至PEI-K14表面，并与p53自装配成纳米复合物从而构建姜黄素与p53共递送系统CUR-PEI-K14/p53，协同逆转卵巢癌的化疗耐药性。该系统在血循环中具有良好稳定性，可通过K14中肿瘤靶向肽tLyP-1序列主动靶向并浓集于肿瘤组织，随后GPLGIAGQ肽经MMP2酶解，姜黄素被释放，阻断TLR-4/MyD88+信号通路引起的化疗耐药，而释放姜黄素后的PEI-K14/p53复合物则内吞进入肿瘤细胞内，PEI-K14/p53中PEI发挥抑制P-gp对细胞毒性药物外排的作用，而K14中核定位信号NLS序列则主动携带该复合物转运至细胞核，p53被释放、转录、复制，用于调控多药耐药蛋白MRP。三者经程序化递送至胞外、胞质及胞核，分级响应，协同发挥逆转卵巢癌腹腔转移瘤化疗耐药性。本发明的共载药系统的转染效率高，对细胞的抑制力最佳。
附图说明
图1为本发明的实施例中CUR-PEI-K14/p53的体外转染效率的示意图(横坐标w/wRation表示不同质量配比，纵坐标Lucifelase assay表示萤光素酶测定)。
图2为本发明不同处理组对耐药细胞SKOV3-DDP的抑制率的示意图(横坐标Different treatment表示不同处理组，纵坐标Cell inhibition rate表示细胞抑制率)。
具体实施方式
本发明提供了一种双功能肽K14、基因载体和共载药系统。
<双功能肽K14>
本发明的双功能肽K14的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
跨膜蛋白受体(Neuropilin receptor，NRP)在卵巢癌化疗耐药形成中扮演重要角色，是卵巢癌潜在的药物治疗靶点。一方面，tLyP-1是环形多肽LyP-1的剪切肽，是最新发现的NRP受体特异性、高亲和性靶向多肽。另一方面，在tLyP-1基础上引入核定位信号NLS序列，大分子物质可通过NLS的介导经核孔复合体主动转运至细胞核内，促进复合物入胞后的核递送，这对复合物克服细胞核膜屏障、提高体内转染效率至关重要。因此，我们将tLyP-1(序列为GNKRTR)引入NLS序列(KKKRK)，合成含tLyP-1、NLS的双功能肽(序列为CGNKRTRCKKKRKC)，即K14，增强载体对肿瘤细胞的选择性，并提高核递送能力，从而增加p53的转染效率。
<基因载体>
本发明的基因载体由双功能肽K14和聚乙烯亚胺(PEI)偶联而成，聚乙烯亚胺和双功能肽K14的摩尔比可以为1:1-1:30，优选为1:3。
其中，聚乙烯亚胺的分子量为600-70000Da。
聚乙烯亚胺(polyethylenimine PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子聚合物非病毒载体，同时具有显著抑制转运体糖蛋白P-gp对化疗药物的外排作用。本发明采用K14交联PEI，得到新型非病毒载体PEI-K14。PEI-K14表面含有大量正电荷，可通过静电吸附作用与p53形成稳定的多聚复合物，使p53分子由伸展结构压缩至纳米尺度，这样的纳米复合物既不易被核酸酶降解，又不会在短时间内沉淀，同时其交联剂K14，既可高效靶向于卵巢癌耐药细胞高表达的跨膜蛋白受体NRP，又可促进细胞核转运，从而大大提高了p53的体外转染效率。
综上，本发明选择对NRPs高效结合的tLyP-1肽，与核定位信号肽NLS(PKKKRKV)连接，并在两端各接枝半胱氨酸，合成具有靶向于卵巢癌耐药细胞和提高核递送能力的双功能肽C-TLyP-1-NLS-C(CGNKRTRCKKKRKC)(命名为K14)，并利用K14交联PEI，得到多分枝状或网状结构的高分子量新型非病毒载体PEI-K14；然后将CUR与八肽通过酸胺缩合反应连接，进一步将CUR-GPLGIAGQ通过SMCC法连接到PEI-K14上，同时与p53自组装成纳米复合物，从而构建姜黄素与p53共递送载药系统CUR-PEI-K14/p53。具体地，
<共载药系统的制备方法>
本发明的共载药系统的制备方法包括如下步骤：
(1)、采用固相法合成上述的双功能肽K14。
将Fmoc-Wang树脂作为固体基质，从羧基端(C端)向氨基端(N端)按照多肽序列逐一添加氨基酸进行合成。主要步骤为：(1)去保护：使用含有20％哌啶的DMF溶液去除氨基的保护基团；(2)激活和交联：使用过量的高浓度HBTU、HoBt及DIEA试剂进行氨基和羧基的缩合，形成肽键。此过程应保证树脂上的氨基完全反应掉；(3)循环：重复以上两个步骤直至反应完成。在合成过程中反复用DMF和DCM清洗树脂尽可能消除杂质的产生和副反应发生的可能性；(4)洗脱和保护：反应结束后，将反应器中的树脂清洗干净，并将多肽从树脂上洗脱下来，进行纯化处理。
(2)、PEI-K14的合成：
其中，SMCC是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂，可以将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起，其分子结构为如下。
Figure BDA0002362228670000041
将(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)溶于二甲亚砜(DMSO)溶液内，得到(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯液(SMCC液)；将双功能肽K14溶于磷酸缓冲盐(PBS)溶液内，得到双功能肽K14液；将聚乙烯亚胺(PEI)溶于磷酸缓冲盐(PBS)溶液内，得到聚乙烯亚胺液(PEI液)；将(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯液(SMCC液)按摩尔比1:1-100:1逐滴加入聚乙烯亚胺液(PEI液)内，边加边搅拌，在室温下反应30min，得到第一混合液，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，将双功能肽K14液按摩尔比1:1-1:10加入第一混合液内，4℃摇动反应过夜。反应液经截留分子量为3000的超滤离心管离心去除未被结合的双功能肽K14，经冷冻干燥后，得到基因载体PEI-K14。
(3)、MMP2水解八肽与姜黄素的连接：
将姜黄素(CUR)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于四氢呋喃(THF)内，加入三乙胺，得到姜黄素溶液，将戊二酸酐(95％)的THF溶液缓慢滴加到CUR溶液中，在氩气下搅拌，真空除去THF，加入乙酸乙酯，然后加入1mol/L的HCl并搅拌10min。分离有机相，用乙酸乙酯萃取三次，除去溶剂THF并干燥，通过柱色谱纯化产物，得到姜黄素衍生酸。
将1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)内得到第二混合液，将姜黄素衍生酸溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)内得到第三混合液，将第二混合液加入第三混合液内搅拌1h得到第四混合液，将八肽和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)内得到第五混合液，将第五混合液加入第四混合液内搅拌过夜，反应结束后蒸干DMF，用水洗涤，得到姜黄素载体CUR-GPLGIAGQ。
(4)、CUR-PEI-K14的合成：
将步骤(2)的基因载体PEI-K14溶于磷酸缓冲盐(PBS)溶液内得到基因载体液(PEI-K14液)，将步骤(3)的姜黄素载体(CUR-GPLGIAGQ)溶于磷酸缓冲盐(PBS)溶液内得到姜黄素载体液(CUR-GPLGIAGQ液)，将(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯液(SMCC液)逐滴加入基因载体液(PEI-K14液)内，边加边搅拌，在室温下反应30min，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，得到第六混合液，将姜黄素载体液(CUR-GPLGIAGQ液)按摩尔比1:1-1:100加入第六混合液内，4℃摇动反应过夜，反应液经截留分子量为3000的超滤离心管离心去除未被结合的CUR-GPLGIAGQ，经冷冻干燥后，得到姜黄素-基因载体CUR-PEI-K14。
(5)、CUR-PEI-K14/p53的制备：
将精密量取的姜黄素-基因载体CUR-PEI-K14聚合物溶液置于EP管(即小型离心管)内，加去离子水稀释，然后再加入p53基因的水溶液内，混匀，室温静置30min，得到共载药系统CUR-PEI-K14/p53复合物溶液。
其中，在步骤(3)和步骤(4)中，基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)几乎在所有人类肿瘤中高表达，其中研究最多的是MMP2。序列为GPLGIAGQ的八肽可被MMP2触发断裂，发展为纳米载体的环境响应嵌段。本发明通过GPLGIAGQ嵌段将姜黄素接枝于PEI-K14表面，在肿瘤细胞外基质中，被MMP2酶解而断开，姜黄素被释放，进而与肿瘤细胞表面TLR-4结合，阻断化疗药物触发TLR-4/MyD88+信号通路，降低其化疗耐药性，即CUR通过MMP2水解八肽接枝到PEI-K14上，p53与CUR-PEI-K14通过静电吸附被包载于载体中。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例：
本实施例的共载药系统的制备方法包括如下步骤：
(1)、采用固相法合成双功能肽K14。
(2)、PEI-K14的制备：
将SMCC溶于DMSO溶液内，得到浓度为3.33mg/mL的SMCC液；将双功能肽K14溶于PBS溶液内，得到双功能肽K14液；将PEI溶于PBS溶液内，得到PEI液；将SMCC液按摩尔比3:1逐滴加入PEI液内，边加边搅拌，在室温下反应30min，得到第一混合液，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，将双功能肽K14液按摩尔比1:3加入第一混合液内，4℃摇动反应过夜。反应液经截留分子量为3000的超滤离心管离心去除未被结合的双功能肽K14，经冷冻干燥后，得到基因载体PEI-K14。
(3)、CUR-GPLGIAGQ的制备：
将5.46mmol CUR和0.92mmol DMAP溶于THF内，加入9.5mmol三乙胺，得到姜黄素溶液，将6mmol戊二酸酐(95％)的THF溶液缓慢滴加到CUR溶液中，在氩气下搅拌，真空除去THF，加入乙酸乙酯，然后加入1mol/L的HCl并搅拌10min。分离有机相，用乙酸乙酯萃取三次，除去溶剂THF并干燥，通过柱色谱纯化产物，得到姜黄素衍生酸。
0.0124mmol HOBt、0.0124mmol EDCI和0.0102mmol DIEA溶于无水DMF内得到第二混合液，0.0102mmol姜黄素衍生酸溶于无水DMF内得到第三混合液，将第二混合液加入第三混合液内搅拌1h得到第四混合液，将0.0102mmol八肽和0.0102mmol DIEA溶于无水DMF内得到第五混合液，将第五混合液缓慢滴加至第四混合液内搅拌过夜，反应结束后蒸干DMF，用水洗涤，得到姜黄素载体CUR-GPLGIAGQ。
(4)、CUR-PEI-K14的制备：
将步骤(2)的基因载体PEI-K14溶于PBS溶液内得到PEI-K14液，将步骤(3)的CUR-GPLGIAGQ溶于PBS溶液内得到CUR-GPLGIAGQ液，将SMCC液逐滴加入PEI-K14液内，边加边搅拌，在室温下反应30min，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，得到第六混合液，将CUR-GPLGIAGQ液按摩尔比1:1加入第六混合液内，4℃摇动反应过夜，反应液经截留分子量为3000的超滤离心管离心去除未被结合的CUR-GPLGIAGQ，经冷冻干燥后，得到姜黄素-基因载体CUR-PEI-K14。
(5)、CUR-PEI-K14/p53的制备：
将精密量取的姜黄素-基因载体CUR-PEI-K14聚合物溶液置于EP管内，加去离子水稀释，然后再加入不同浓度的p53基因的水溶液内，混匀，室温静置30min，得到不同w/w的共载药系统CUR-PEI-K14/p53复合物溶液。
<实验>
将上述实施例的产品进行如下实验。
<实验1>
CUR-PEI-K14/p53的体外转染实验：
将SKOV3/DDP细胞接种于24孔板，孵箱中过夜培养，待细胞密度为70-80％时进行转染实验。将聚合物与虫荧光素酶质粒按照一定的N/P混合形成复合物，加入各孔中，于培养箱培养4h后，吸去培养液，每孔加入含15％血清的新鲜培养液继续培养，48h后测定虫荧光素酶。从图1可以看出，CUR-PEI-K14/p53的转染效率达到108。
表1 CUR-PEI-K14/p53的体外转染效率数据
Figure BDA0002362228670000071
<实验2>
CUR-PEI-K14/p53逆转耐药的效果：
将SKOV3/DDP细胞接种于96孔板上，过夜培养，使细胞汇合度达到70-80％，设置不同处理组，MTT法检测细胞抑制率。即将PEI-K14与p53基因按质量比10:1制成复合物，转染同实验1的步骤。设置顺铂DDP组(10ug/ml)，CUR组(20umol/L)，PEI-K14/p53组，CUR+DDP联合用药组，PEI-K14/p53、DDP联合用药组，PEI-K14/p53、CUR联合用药组，CUR-PEI-K14/p53、DDP联合用药组。加入96孔板上，MTT法检测细胞抑制率，从图2可看出，CUR-PEI-K14/p53、DDP联合用药组的细胞抑制力最佳。
表2逆转耐药数据
Figure BDA0002362228670000081
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002362228670000091
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 双功能肽K14、基因载体和共载药系统
<141> 2020-01-10
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Cys Gly Asn Lys Arg Thr Arg Cys Lys Lys Lys Arg Lys Cys
1 5 10

Claims (1)

1.一种共载药系统的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
（1）、合成双功能肽K14；
（2）、将（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶于二甲亚砜溶液内，得到（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯液；将双功能肽K14溶于磷酸缓冲盐溶液内，得到双功能肽K14液；将聚乙烯亚胺溶于磷酸缓冲盐溶液内，得到聚乙烯亚胺液；将所述（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯液按摩尔比1:1-100:1逐滴加入聚乙烯亚胺液内，得到第一混合液，将双功能肽K14液按摩尔比1:1-1:10加入所述第一混合液内，冷冻干燥，得到基因载体；
（3）、将姜黄素和4-二甲氨基吡啶溶于四氢呋喃内，加入三乙胺，得到姜黄素溶液，将戊二酸酐溶于四氢呋喃溶液后，加入姜黄素溶液内，经过萃取，得到姜黄素衍生酸；
1-羟基苯并三唑、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于无水二甲基甲酰胺内得到第二混合液，所述姜黄素衍生酸溶于无水二甲基甲酰胺内得到第三混合液，将所述第二混合液加入第三混合液内得到第四混合液，将八肽和N,N-二异丙基乙胺溶于无水二甲基甲酰胺内得到第五混合液，将所述第五混合液加入所述第四混合液内，干燥，得到姜黄素载体；
（4）、将步骤（2）的所述基因载体溶于磷酸缓冲盐溶液内得到基因载体液，将步骤（3）的所述姜黄素载体溶于磷酸缓冲盐溶液内得到姜黄素载体液，将（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯加入所述基因载体液内得到第六混合液，将姜黄素载体液按摩尔比1:1-1:100加入第六混合液内，干燥，得到姜黄素-基因载体；
（5）、将所述姜黄素-基因载体加水稀释，然后再加入p53基因的水溶液，得到共载药系统；
步骤（1）中，所述双功能肽K14的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤（2）中，所述基因载体由双功能肽K14和聚乙烯亚胺偶联而成，所述聚乙烯亚胺和双功能肽K14的摩尔比为1:1-1:30；
所述聚乙烯亚胺的分子量为600-70000Da；
步骤（3）中，所述八肽的序列为GPLGIAGQ。
CN202010025284.5A 2020-01-10 2020-01-10 双功能肽k14、基因载体和共载药系统 Active CN111154002B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010025284.5A CN111154002B (zh) 2020-01-10 2020-01-10 双功能肽k14、基因载体和共载药系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010025284.5A CN111154002B (zh) 2020-01-10 2020-01-10 双功能肽k14、基因载体和共载药系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111154002A CN111154002A (zh) 2020-05-15
CN111154002B true CN111154002B (zh) 2022-11-22

Family

ID=70562397

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010025284.5A Active CN111154002B (zh) 2020-01-10 2020-01-10 双功能肽k14、基因载体和共载药系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111154002B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6696038B1 (en) * 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
CN103788211A (zh) * 2012-11-01 2014-05-14 中国科学院上海药物研究所 双功能肽、所述双功能肽与核酸分子形成的复合物以及治疗肿瘤的药物组合物
CN104830903A (zh) * 2015-05-15 2015-08-12 上海海洋大学 一种基于多肽k12的转基因载体及其应用
AU2014361826A1 (en) * 2013-12-12 2016-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR-Cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
CN106632616A (zh) * 2016-07-18 2017-05-10 复旦大学附属妇产科医院 具有卵巢肿瘤靶向d构型多肽及其基因递释系统
CN110204664A (zh) * 2019-06-17 2019-09-06 苏州大学 一种共载药物和基因用阳离子聚合物及其应用
CN110548152A (zh) * 2018-05-30 2019-12-10 复旦大学 一种穿膜抗炎肽修饰的肿瘤靶向多药共载脂质体及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090011004A1 (en) * 2005-12-30 2009-01-08 Philadelphia Health & Education Corp., D/B/A/ Drexel University Of College Of Medicine Improved carriers for delivery of nucleic acid agents to cells and tissues

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6696038B1 (en) * 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
CN103788211A (zh) * 2012-11-01 2014-05-14 中国科学院上海药物研究所 双功能肽、所述双功能肽与核酸分子形成的复合物以及治疗肿瘤的药物组合物
AU2014361826A1 (en) * 2013-12-12 2016-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR-Cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
CN104830903A (zh) * 2015-05-15 2015-08-12 上海海洋大学 一种基于多肽k12的转基因载体及其应用
CN106632616A (zh) * 2016-07-18 2017-05-10 复旦大学附属妇产科医院 具有卵巢肿瘤靶向d构型多肽及其基因递释系统
CN110548152A (zh) * 2018-05-30 2019-12-10 复旦大学 一种穿膜抗炎肽修饰的肿瘤靶向多药共载脂质体及其制备方法
CN110204664A (zh) * 2019-06-17 2019-09-06 苏州大学 一种共载药物和基因用阳离子聚合物及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Co-Delivery System of Curcumin and p53 for Enhancing the Sensitivity of Drug-Resistant Ovarian Cancer Cells to Cisplatin;Xinli Guo et al.;《Molecules》;20200604;第25卷;第1-16页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111154002A (zh) 2020-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11413281B2 (en) Ternary conjugate of antitumor drug, and synthesis and application
JP2010526091A (ja) 癌の処置のための生物学的な標的基の改変
JP2010526091A5 (zh)
JP2004508411A (ja) 持続的薬物送達のための医薬組成物
Bartolami et al. Multivalent DNA recognition by self-assembled clusters: deciphering structural effects by fragments screening and evaluation as siRNA vectors
CN111001012A (zh) 一种亲水碳酸酯型抗体偶联药物
CN106632695B (zh) 一种pH敏感性多肽及其应用
JP6947909B2 (ja) マルチアーム標的抗がんコンジュゲート
JP2023506703A (ja) 治療用ナノ粒子を合成するための方法及び組成物
CN115192730A (zh) 一种靶向pd-l1的双特异性多肽纳米药物及其制备方法和应用
US11351263B2 (en) Polyplex delivery system for proteins, nucleic acids and protein/nucleic acid complexes
WO2023284554A1 (zh) 一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用
CN111154002B (zh) 双功能肽k14、基因载体和共载药系统
US20060014695A1 (en) Hpma-polyamine conjugates and uses therefore
KR20220110174A (ko) 핵산 치료제를 위한 종양-표적화 폴리펩티드 나노입자 전달 시스템
JP2008500971A (ja) 抗−インテグリン活性を有するシクロペプチド誘導体
Liu et al. A facile modular approach toward multifunctional supramolecular polyplexes for targeting gene delivery
MXPA01012802A (es) Copolimeros para el transporte de acidos nucleicos a las celulas.
KR100441904B1 (ko) Ｔａｔ49-57 펩티드 또는 Ｔａｔ49-57 펩티드를 포함하는펩티드사슬과 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자와의공유결합체 및 이를 이용하여 제조된 나노입자
CN112569366A (zh) 一种包载生物大分子药物的口服纳米聚合物靶向递送系统
JP2010526062A (ja) タンパク質を細胞に送達する方法
CN111110860A (zh) 一种还原响应型Her2靶向的多肽药物偶联物及其制备方法和应用
CN111035623B (zh) 一种ido1多肽纳米抑制剂及其制备方法和应用
CN113549128B (zh) 含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用
CN110004180B (zh) 一种由功能肽a25修饰的基因载体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant