CN110004180B - 一种由功能肽a25修饰的基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种由功能肽a25修饰的基因载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体公开一种由功能肽A25修饰的基因载体及其制备方法和应用。所述基因载体为功能肽A25与聚乙烯亚胺形成的偶联物；所述聚乙烯亚胺的分子量为500‑2000Da；所述功能肽A25与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1‑5。本发明将Angiopep‑2肽与核定位信号肽NLS连接，合成具有靶向于LRP受体和可以提高核递送能力的含Angiopep‑2和NLS双功能多肽A25；进一步将其与低分子PEI偶联，从而构建新型非病毒基因载体系统，本发明的基因载体不仅具有低毒性的特点，对肿瘤细胞具有选择性，且可促进载体细胞核递送，可以更好的靶向肿瘤细胞进行转染，增加载体的转染效率。

Description

一种由功能肽A25修饰的基因载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种由功能肽A25修饰的基因载体及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗是近年来建立在基因工程技术和分子遗传学原理基础上的新型治疗方法，因肿瘤发生与发展的生物学基础是基因突变，所以基因治疗现已成为攻克肿瘤最具希望的领域。基因治疗现阶段面临的最大难题在于尚未找到理想的基因载体。
聚乙烯亚胺(polyethylenimine PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体，富含阳离子，具有强大的缓冲能力，有较强结合DNA和黏附细胞的能力。然而，小分子PEI细胞毒性低，但转染效率也低，大分子PEI转染效率高，但高分子量PEI表现出较强细胞毒性。另外，由于聚乙烯亚胺是利用自身所带的正电荷，与细胞表面带负电荷的受体通过静电作用相结合，所以细胞的选择特异性差。解决小分子PEI细胞毒性和靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。因此，如何将PEI改造成靶向性强、转染效率高、细胞毒性低的基因载体材料是解决PEI应用难题的突破口。
血脑屏障(blood brain bar rier，BBB)是使脑内环境保持平衡的一道具有选择性阻碍作用的动态界面，是药物进入脑内的主要屏障。受体介导的胞吞转运是目前递送药物入脑最为成熟的脑靶向策略之一。BBB上有多种特异性受体，如胰岛素受体、乳铁蛋白受体、转铁蛋白受体、N-乙酰胆碱受体和低密度脂蛋白受体等。其中，在BBB和脑胶质瘤上高表达的LRP-1受体，可将其作为基因治疗的靶向点。
Angiopep-2(24KDa)是由19个氨基酸分子组成的新型，广泛存在于生物体内，它可通过BBB上表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)受体介导内吞进入脑组织，在脑实质的分布容积是转铁蛋白(Transferrin)的2.5倍。此外，Angiopep-2修饰的纳米递药系统通过LRP介导显著增加脑部的蓄积。研究表明，人脑胶质瘤细胞都表达LRP受体，这提示LRP可能成为脑胶质瘤靶向递药的一个潜在作用靶点。
NLS是核内功能蛋白进入细胞核的结构基础，是介导某些蛋白入核的一段充分而必要的信息片段。NLS序列，可促进大分子物质入胞后的核递送，尤其是体内转染时非分裂分化细胞的核递送。这对克服细胞核膜屏障、提高体内转染效率至关重要。
因此，理论上可将Angiopep-2多肽与核定位信号肽NLS连接，合成具有靶向于LRP和提高核递送能力的含Angiopep-2和NLS双功能多肽，用于修饰低分子PEI，增强其在体内对肿瘤细胞选择性，并提高核递送能力，从而增加DNA的体内转染效率。
现有技术中，关于双功能肽(Angiopep-2和NLS)修饰的聚乙烯亚胺及其制备方法和应用还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于PEI的转染效率高、毒性低、靶向性强的基因载体材料。
本发明的第二个目的在于，提供如上所述功能肽A25修饰的PEI基因载体的制备方法。
本发明的第三个目的在于，提供如上所述基因载体的用途。
本发明的第四个目的在于，提供一种DNA复合物。
本发明的第五个目的在于，提供一种功能肽A25。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种由功能肽A25修饰的PEI基因载体，所述基因载体为功能肽A25与聚乙烯亚胺形成的偶联物，所述功能肽A25的氨基酸序列为Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys；所述聚乙烯亚胺的分子量为500-2000Da；所述功能肽A25与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-5。
在上述基因载体中，作为一个优选方案，所述聚乙烯亚胺的分子量为1800Da。
在上述基因载体中，作为一个优选方案，所述功能肽A25与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述功能肽A25修饰的PEI基因载体的制备方法，包括如下步骤：
1)合成功能肽A25，所述功能肽A25的氨基酸序列为Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys；
2)SMCC溶解于DMSO溶液中，功能肽A25与PEI分别溶解于PBS溶液中，将SMCC溶液加入PEI液中进行反应，得到马来酰亚胺化的PEI；
3)将功能肽A25溶液加入来酰亚胺化的PEI溶液中，反应得到功能肽A25修饰的PEI基因载体。
在上述基因载体的制备方法中，作为一个优选方案，所述制备方法如下：
1)合成功能肽A25，所述功能肽A25的氨基酸序列为Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys；
2)SMCC溶解于DMSO溶液中，将功能肽A25与PEI(分子量1.8KDa)分别溶解于PBS溶液中，将制备好的SMCC液按摩尔比2:1逐滴加入PEI液中，边加边搅拌，在室温下反应30mim，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，即得maleimided PEI液。将功能肽A25液按照摩尔比1:1加入maleimided PEI液中，4℃摇动反应过夜。然后用超滤离心管离心，冻干，即得PEI-A25。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的基因载体与DNA形成的复合物。
在上述DNA复合物中，作为一个优选方案，所述的DNA复合物包含报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
第一方面，提供如上任一所述的基因载体在制备用于基因治疗的药物中的应用。
第二方面，提供如上任一所述的基因载体在制备靶向人脑胶质瘤基因载体材料中的应用。
为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
一种功能肽A25，所述功能肽A25的氨基酸序列为：Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys。
本发明采用低分子PEI，利用人脑胶质瘤细胞都表达LRP受体的特点，选择特异亲和LRP的Angiopep-2多肽，与核定位信号肽NLS连接，合成具有靶向于LRP和提高核递送能力的双功能肽Angiopep-2-NLS(命名为A25)，利用交联技术将A25与低分子PEI偶联，从而构建新型非病毒基因载体系统。
Angiopep-2(24KDa)是由19个氨基酸分子组成，广泛存在于生物体内，它可通过BBB上表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)受体介导内吞进入脑组织，在脑实质的分布容积是转铁蛋白(Transferrin)的2.5倍。此外，Angiopep-2修饰的纳米递药系统通过LRP介导显著增加脑部的蓄积。研究表明，人脑胶质瘤细胞都表达LRP受体，这提示LRP可能成为脑胶质瘤靶向递药的一个潜在作用靶点。NLS是核内功能蛋白进入细胞核的结构基础，是介导某些蛋白入核的一段充分而必要的信息片段，大分子物质可通过NLS的介导经核孔复合物主动运转至细胞核内，其中研究最多的NLS是来自SV40的T抗原。因此，我们将Angiopep-2肽与核定位信号肽NLS连接，合成具有靶向于LRP受体和可以提高核递送能力的含Angiopep-2和NLS双功能多肽，用于修饰低分子PEI，提高其肿瘤细胞选择性，又可促进载体细胞核递送，从而增加DNA的转染效率。
将PEI及PEI-A25以不同浓度梯度加入到含有人神经母胶质瘤细胞株(U87MG)细胞的96孔板中，培养48h，采用MTT法测定细胞毒性，结果PEI-A25显示了较高细胞活性，证明了其可以作为基因载体的可行性。
将U87MG细胞接种于24孔板，孵箱中培养36～48h，待细胞密度为70～80％时进行转染实验。将聚合物与虫荧光素酶质粒按照一定的N/P混合形成复合物，加入各孔中，于培养箱培养4h后，吸去培养液，每孔加入含10％血清的新鲜培养液继续培养，48h后测定虫荧光素酶。结果PEI-A25显示了很高转染效率。
附图说明
附图1为双功能肽A25修饰的PEI基因载体体外转染实验结果。
附图2为双功能肽A25修饰的PEI基因载体细胞毒性实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1双功能肽A25修饰的低分子PEI的制备及功能验证(一)
1、功能肽A25的制备
功能肽A25的序列为Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys(TFFYGGSRGKRNNFKTEEYCKKKRK)，由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成。
作为对照的多肽K12序列为Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg，由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成。
2、功能肽A25修饰的低分子PEI的制备
SMCC溶解于DMSO溶液中，将功能肽A25与PEI(分子量1.8KDa)分别溶解于PBS溶液中，将制备好的SMCC液按摩尔比2:1逐滴加入PEI液中，边加边搅拌，在室温下反应30mim，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，即得maleimided PEI液。将功能肽A25液按照摩尔比1:1加入maleimided PEI液中，4℃摇动反应过夜。然后用超滤离心管离心，冻干，即得PEI-A25。
3、PEI-A25细胞毒性实验
将U87MG细胞接种于96孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。实验前，吸去培养基，每孔加入不同浓度阳离子聚合物(4，6，8，16，24，32μg/mL，无血清1640作为溶剂)，继续培养72h，MTT法检测细胞毒性，结果如表1及图1所示。可以看出，未修饰的PEI(25kDa)细胞毒性较强，而PEI-A25几乎无毒，保证了PEI-A25作为基因载体的可行性。
表1细胞毒性实验结果
4、PEI-A25的体外转染实验
将U87MG细胞接种于24孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。将PEI-A25与虫荧光素酶报告基因按质量比1:1、5:1、10:1和20:1制成复合物，加入24孔板上，培养4h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，结果如表2和图2所示。从结果中可以看出，在质量比为5时，PEI-A25显示了很强转染效率，远远高于对照组PEI 1.8KDa，也比PEI 25KDa的最佳表达高1000倍，说明PEI-A25可以很好的靶向于细胞进行转染。
表2体外转染实验结果
5、PEI-A25与PEI-K12的体外转染对比实验
PEI-K12的制备与PEI-A25制备方法相同。将U87MG细胞接种于24孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。取PEI-A25与PEI-K12分成两组，分别与虫荧光素酶报告基因按质量比1:1、5:1、10:1和20:1制成复合物，加入24孔板上，培养4h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，结果如下表所示。可以看出PEI-A25显示了很强的转染效果，远高于对照组PEI-K12，说明PEI-A25具有更强的转染率，可以更好的靶向细胞进行转染。
表3 PEI-A25与PEI-K12的体外转染效果对比
实施例2双功能肽A25修饰的低分子PEI的制备及功能验证(二)
1、功能肽A25的制备
功能肽A25的序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEYCKKKRK，由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成。
2、功能肽A25修饰的低分子PEI的制备
SMCC溶解于DMSO溶液中，将功能肽A25与PEI(分子量2.0KDa)分别溶解于PBS溶液中，将制备好的SMCC液按摩尔比2:1逐滴加入PEI液中，边加边搅拌，在室温下反应30mim，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，即得maleimided PEI液。将功能肽A25液按照摩尔比1:2加入maleimided PEI液中，4℃摇动反应过夜。然后用超滤离心管离心，冻干，即得PEI-A25。
3、PEI-A25细胞毒性实验
将U87MG细胞接种于96孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。实验前，吸去培养基，每孔加入不同浓度阳离子聚合物(4，6，8，16，24，32μg/mL，无血清1640作为溶剂)，继续培养72h，MTT法检测细胞毒性，结果如表4所示。可以看出，未修饰的PEI(25kDa)细胞毒性较强，而PEI-A25几乎无毒，保证了PEI-A25作为基因载体的可行性。
表4细胞毒性实验结果
4、PEI-A25的体外转染实验
将U87MG细胞接种于24孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。将PEI-A25与虫荧光素酶报告基因按质量比1:1、5:1、10:1和20:1制成复合物，加入24孔板上，培养4h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，结果如表5所示。从结果中可以看出，在质量比为5时，PEI-A25显示了很强转染效率，远远高于PEI 1.8KDa组，也比PEI 25KDa组的表达高1000倍，说明PEI-A25可以很好的靶向于细胞进行转染。
表5体外转染实验结果
5、PEI-A25与PEI-K12的体外转染对比实验
PEI-K12的制备与PEI-A25制备方法相同。将U87MG细胞接种于24孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。取PEI-A25与PEI-K12分成两组，分别与虫荧光素酶报告基因按质量比1:1、5:1、10:1和20:1制成复合物，加入24孔板上，培养4h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达。结果显示PEI-A25荧光素酶的表达强度远高于对照组PEI-K12。当质量比为20时，PEI-A25荧光素酶的表达强度为对照组PEI-K12的8.52倍，说明PEI-A25具有更强的转染率，可以更好的靶向细胞进行转染。
实施例3双功能肽A25修饰的低分子PEI的制备及功能验证(三)
1、功能肽A25的制备
功能肽A25的序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEYCKKKRK，由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成。
2、功能肽A25修饰的低分子PEI的制备
SMCC溶解于DMSO溶液中，将功能肽A25与PEI(分子量0.5KDa)分别溶解于PBS溶液中，将制备好的SMCC液按摩尔比2:1逐滴加入PEI液中，边加边搅拌，在室温下反应30mim，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，即得maleimided PEI液。将功能肽A25液按照摩尔比1:5加入maleimided PEI液中，4℃摇动反应过夜。然后用超滤离心管离心，冻干，即得PEI-A25。
3、PEI-A25细胞毒性实验
将U87MG细胞接种于96孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。实验前，吸去培养基，每孔加入不同浓度阳离子聚合物(4，6，8，16，24，32μg/mL，无血清1640作为溶剂)，继续培养72h，MTT法检测细胞毒性，结果如表6所示。可以看出，未修饰的PEI(25kDa)细胞毒性较强，而PEI-A25几乎无毒，保证了PEI-A25作为基因载体的可行性。
表6细胞毒性实验结果
4、PEI-A25的体外转染实验
将U87MG细胞接种于24孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。将PEI-A25与虫荧光素酶报告基因按质量比1:1、5:1、10:1和20:1制成复合物，加入24孔板上，培养4h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，结果如表7所示。从结果中可以看出，在质量比为5时，PEI-A25显示了很强转染效率，远远高于PEI 1.8KDa组，也比PEI 25KDa组的表达高1000倍，说明PEI-A25可以很好的靶向于细胞进行转染。
表7体外转染实验结果
5、PEI-A25与PEI-K12的体外转染对比实验
PEI-K12的制备与PEI-A25制备方法相同。将U87MG细胞接种于24孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。取PEI-A25与PEI-K12分成两组，分别与虫荧光素酶报告基因按质量比1:1、5:1、10:1和20:1制成复合物，加入24孔板上，培养4h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达。结果显示PEI-A25荧光素酶的表达强度远高于对照组PEI-K12。当质量比为20时，PEI-A25荧光素酶的表达强度为对照组PEI-K12的7.68倍，说明PEI-A25具有更强的转染率，可以更好的靶向细胞进行转染。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海海洋大学
<120> 一种由功能肽A25修饰的基因载体及其制备方法
<130> /
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr Cys Lys Lys Lys Arg Lys
20 25

Claims (6)

1.一种由功能肽A25修饰的PEI基因载体，其特征在于，所述基因载体为功能肽A25与聚乙烯亚胺形成的偶联物，所述功能肽A25的氨基酸序列为Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys；所述聚乙烯亚胺的分子量为500-2000Da；所述功能肽A25与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-5。
2.根据权利要求1所述功能肽A25修饰的PEI基因载体，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的分子量为1800Da。
3.根据权利要求1所述功能肽A25修饰的PEI基因载体，其特征在于，所述功能肽A25与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1。
4.权利要求1-3任一所述功能肽A25修饰的PEI基因载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)合成功能肽A25，所述功能肽A25的氨基酸序列为Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys；
2)SMCC溶解于DMSO溶液中，功能肽A25与PEI分别溶解于PBS溶液中，将SMCC溶液加入PEI液中进行反应，得到马来酰亚胺化的PEI；
3)将功能肽A25溶液加入马来酰亚胺化的PEI溶液中，反应得到功能肽A25修饰的PEI基因载体。
5.权利要求1-3任一所述的基因载体与DNA形成的复合物。
6.权利要求1-3任一所述的基因载体在制备靶向人脑胶质瘤基因载体材料中的应用。
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