CN102399267A - 一种双功能肽修饰的基因载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双功能肽修饰的基因载体及其制备方法和应用。所述双功能肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的基因载体是由双功能肽和聚乙烯亚胺衍生物偶联而成的，所述的聚乙烯亚胺衍生物是普郎尼P123修饰的聚乙烯亚胺。本发明还涉及上述基因载体的制备方法，以及上述双功能肽和基因载体在基因治疗中的应用。本发明的双功能肽具有强靶向性和穿膜能力，本发明的基因载体转染细胞效率高且细胞毒性低，为疾病的基因治疗提供了一种有效的手段。
Description
技术领域
本发明涉及基因载体技术领域，具体地说，是一种双功能肽修饰的基因载体及其制备方法。
背景技术
基因治疗是近年来建立在基因工程技术和分子遗传学原理基础上的新型治疗方法，因肿瘤发生与发展的生物学基础是基因突变，所以基因治疗现已成为攻克肿瘤最具希望的手段，也是研究最为活跃的领域。基因治疗有三个重要环节，即目的基因、转基因载体和靶细胞，其核心技术是基因导入系统的建立。现阶段基因治疗面临的最大难题在于尚未找到理想的基因载体。目前应用的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率较高但存在运载能力低、有潜在安全威胁等缺点，因此，非病毒载体近年来发展迅速，尤其是阳离子聚合物。其中，聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体，富含阳离子，具有强大的缓冲能力，有较强结合DNA和黏附细胞的能力，可缩聚DNA分子形成颗粒并转入真核细胞进行表达。然而，PEI作为基因载体使用仍存在二个突出问题：第一，转染效率与细胞毒性存在矛盾。小分子PEI虽细胞毒性低，但在生理的离子浓度下与DNA易发生解离，造成转染效果差；分子量在20 kDa以上的PEI虽具有较理想转染效率，但由于PEI的表面富含阳性电荷以及体内不可降解性，致使高分子量PEI表现出较强的细胞毒性。第二，聚乙烯亚胺靶向性差。它是利用自身所带的正电荷，与细胞表面带负电荷的受体通过静电作用相结合，所以细胞的选择特异性差，解决靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。因此，如何将PEI改造成细胞毒性低、靶向性强、转染效率高的基因载体材料是解决PEI应用难题的突破口。
普朗尼克P123（Pluronic P123）是一种由中部疏水的聚氧丙烯链侧面连接两段亲水聚氧乙烯（EO）构成的非离子式三嵌段共聚物。该物质无毒、无刺激、无免疫原性，可通过化学交联的方法连接PEI，尤其低分子量PEI（如PEI 600/800/2000 kDa），以形成多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物，该衍生物可保证较高转染效率，转染进入体内细胞后，这些交联的化学键又可以通过水解等反应断开，高分子量PEI衍生物断裂成易代谢的低分子量低毒性的PEI，这就使得其在保证一定转染效率的前提下，大大降低了高分子PEI所带来的细胞毒性；另一方面，P123 的亲水亲油平衡值适中，同时具有亲水性的聚氧乙烯（EO）链和疏水性的聚环氧乙烷（PO）链，它在水中可自发形成稳定的多分子球形胶束样结构，该胶束尺寸可达纳米级，因此适宜基因药物在体内的传输。
整合素在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用，有研究表明，在肿瘤诱导的新生血管中表达丰富的整合素αvβ3对肿瘤血管的生成起重要作用。利用整合素αvβ3在人肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，可将其作为基因治疗的靶点，针对整合素亚基设计一段特异的反义寡核苷酸，并通过转基因载体将其转染入肿瘤细胞中，从而调节整合素αvβ3介导的生物学作用。
RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）的短肽，广泛存在于生物体内，是整合素和其配体相互作用的识别位点，能以一定的亲和力结合整合素αvβ3，成为肿瘤治疗新的靶向策略，RGD肽在肿瘤治疗中的应用已成为研究热点。
细胞穿膜肽（Cell-Penetrating Peptides，CPPs）能够有效地引导蛋白质甚至纳米粒子进入细胞，并可靶向细胞核，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。研究发现：全长86个氨基酸的细胞穿膜肽TAT中49-57位氨基酸残基组成的线性序列即可完全行使细胞穿膜功能，TAT(49-57)氨基酸序列为Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（RKKRRQRRR），这是TAT肽既有穿膜特性又无细胞毒性的最小片段。
因此，理论上可将RGD短肽与细胞穿膜肽TAT(49-57)连接，合成具有靶向于整合素αvβ3和促进载体穿膜的含RGD和TAT(49-57)的双功能肽，用于修饰PEI衍生物，提高其肿瘤细胞选择性，又可促进载体穿膜，从而增加DNA的转染效率。
中国专利文献CN 200810024757.9，公告日2011年6月22日，公开了一种透明质酸接枝聚乙烯亚胺共聚物、制备方法及其作为基因载体的应用，该发明的基因载体是由PEI共价连接在透明质酸二糖单元中被氧化的2位和3位上共聚而成；中国专利文献CN 200710171722.3，公告日2010年11月10日，公开了一种非离子表面活性剂修饰的聚乙烯亚胺及其制备与应用，本发明的基因载体是由聚氧乙烯硬质酸酯修饰的PEI。但是目前关于双功能肽修饰的普朗尼克P123-聚乙烯亚胺及其制备方法和应用还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种双功能肽。
本发明的再一的目的是，提供一种基因载体。
本发明的另一的目的是，提供一种上述基因载体的制备方法。
本发明的第四个目的是，提供一种复合物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种双功能肽，所述的双功能肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
所述的基因载体被上述双功能肽所修饰。
所述的基因载体是由双功能肽和聚乙烯亚胺衍生物偶联而成的。
所述的聚乙烯亚胺衍生物是普郎尼克修饰的聚乙烯亚胺即普郎尼克-聚乙烯亚胺。
所述的普郎尼克与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:20，所述的聚乙烯亚胺的分子量范围为600-70000 Da。
所述的双功能肽与聚乙烯亚胺衍生物的摩尔比为1:1-10:1。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种上述基因载体的制备方法，它包括以下步骤：
（a）双功能肽的合成：合成上述双功能肽；
（b）普朗尼克P123-聚乙烯亚胺的制备：将活化后的普郎尼克和除水后的聚乙烯亚胺分别溶于无水二氯甲烷，再将所得的两液同时加入无水二氯甲烷底液，氮气饱和后磁力搅拌过夜，离心取上清，将所述的上清旋转蒸发；
（c）双功能肽对普朗尼克P123-聚乙烯亚胺的修饰：表面活性剂溶解于二甲基亚砜，步骤（a）所述的双功能肽和步骤（b）所述的普朗尼克P123-聚乙烯亚胺分别溶解于PBS溶液；表面活性剂溶液加入到普朗尼克P123-聚乙烯亚胺液得到maleimided P123-PEI液；双功能肽液加入到所述的maleimided P123-PEI液，反应过夜，离心冻干。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
一种上述基因载体与DNA形成的复合物。
所述的DNA含报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。
本发明优点在于：
1、本发明的基因载体含有双功能肽，该双功能肽可靶向整合素αvβ3并可促进载体穿膜，增强了PEI这种阳离子多聚物非病毒基因载体的靶向性，提高了转染效率。
2、由于双功能肽的存在，使得基因载体可使用小分子PEI取代大分子PEI，既能保证一定转染效率，又能降低对细胞的毒性。
3、本发明所使用的阳离子多聚物非病毒基因载体是P123修饰的PEI衍生物，通过P123的修饰，既可降低细胞毒性，又适宜基因药物在体内的传输。
4、本发明的双功能肽、基因载体和复合物为疾病的基因治疗提供了一种有效的手段。
附图说明
附图1是P123-PEI -R13细胞毒性实验结果。
附图2是P123-PEI -R13体外转染实验结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明的研究思路是：
1、选用P123连接PEI，得到多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物P123-PEI。
2、选择特异亲和整合素αvβ3的RGD短肽，与细胞穿膜肽Tat(49-57)连接，合成具有靶向于αvβ3和促进载体穿膜的双功能肽。
3、利用交联技术将R13与PEI衍生物偶联，构建新型非病毒基因载体系统。
4、检验构建的新型非病毒基因载体系统的细胞毒性。
5、检验构建的新型非病毒基因载体系统的转染效率。
实施例1
1、P123-PEI的制备
称取0.6mmol除水后的P123，溶于40ml，无水甲苯与无水二氯甲烷体积比为3:1的无水甲苯和无水二氯甲烷的混合溶液中，加入1.2mmol双（三氯甲基）碳酸酯，室温下180rpm磁力搅拌反应过夜。真空旋蒸除去溶剂，再用30ml，无水甲苯与无水二氯甲烷体积比为2:1的无水甲苯和无水二氯甲烷混合液溶解，然后加入2.0mmol N-羟基琥珀酰亚胺，180rpm磁力搅拌下，将2.0mmol无水三乙胺逐滴加入反应液中，继续搅拌反应约4h。待反应完全后，将反应液过滤并再次真空旋蒸除去溶剂，所得残渣溶解于50ml乙酸乙酯中，8000rpm离心15min后取上清液，旋转蒸发，挥去乙酸乙酯，冷却固化反应物，即得活化后的P123。PEI （2KDa,0.20 g, 0.10 mmol）除水后溶于10mL无水二氯甲烷中，活化后的P123（0.01mmol）溶于10ml无水二氯甲烷中，同时将上述两液缓慢的滴入10mL无水二氯甲烷底液中，氮气饱和后室温磁力搅拌过夜，透析，冻干，得到P123-PEI。
2、双功能肽R13的合成
根据RGD肽的氨基酸序列：Arg-Gly-Asp（RGD），TAT(49-57)氨基酸序列：Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（RKKRRQRRR），由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成双功能肽RGD-Tat(49-57)，其氨基酸序列为Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（SEQ ID NO.1），并命名为R13。
3、R13对P123-PEI的修饰
将表面活性剂SMCC溶解于二甲基亚砜（DMSO）溶液中至终浓度为3.33mg/mL，双功能肽R13与P123-PEI分别溶解于PBS溶液中至终浓度分别为10mg/mL、9mg/mL，再将SMCC液按摩尔比10:1、5:1、2:1逐滴加入P123-PEI液中，边加边搅拌，在室温下反应30mim，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，即得maleimided Plu-PEI。将R13液按摩尔比10:1、5:1、2:1加入maleimided Plu-PEI液中，4℃摇动反应过夜。然后用超滤离心管离心，冻干，即得三种不同R13浓度的R13和 P123-PEI相偶联的非病毒基因载体P123-PEI-R13，分别命名为P123-PEI-R13-h、P123-PEI-R13-m、P123-PEI-R13-l。
4、P123-PEI-R13的细胞毒性实验
将Hela细胞接种于96孔板上，培养24 h，使细胞汇合度达到70%-80%。吸去培养基，每孔加入不同浓度阳离子聚合物（4，6，8，16，24，32，48μg/mL，无血清1640作为溶剂），继续培养24h，MTT法检测细胞毒性，统计细胞存活率，结果如图1所示。从图1可看出，未修饰的PEI（25 KDa）细胞毒性很强，而P123-PEI-R13与未修饰的PEI（25 KDa）分子量相当，但是二者细胞毒性相比具有显著性差异，P123-PEI-R13几乎无毒。
5、P123-PEI-R13的体外转染实验
将Hela细胞接种于24孔板上，培养24 h，使细胞汇合度达到70%-80%。将P123-PEI-R13与虫荧光素酶报告基因按质量比2:1、5:1、10:1、20:1和30:1制成复合物，加入24孔板上，培养5h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，统计转染效率，结果如图2所示。从图2可看出，P123-PEI-R13具备很高的转染效率，远远高于对照组PEI （2KDa）与PEI （25KDa）的最佳表达（1.18E+07）±（6.20E+06）相比，也高近2倍。
实施例2
1、P123-PEI的制备
称取0.6mmol除水后的P123，溶于40ml，无水甲苯与无水二氯甲烷体积比为3:1的无水甲苯和无水二氯甲烷的混合溶液中，加入0.6mmol双（三氯甲基）碳酸酯，室温下180rpm磁力搅拌反应过夜。真空旋蒸除去溶剂，再用30ml，无水甲苯与无水二氯甲烷体积比为2:1的无水甲苯和无水二氯甲烷混合液溶解，然后加入2.0mmol N-羟基琥珀酰亚胺，180rpm磁力搅拌下，将2.0mmol无水三乙胺逐滴加入反应液中，继续搅拌反应约4h。待反应完全后，将反应液过滤并再次真空旋蒸除去溶剂，所得残渣溶解于50ml乙酸乙酯中，8000rpm离心15min后取上清液，旋转蒸发，挥去乙酸乙酯，冷却固化反应物，即得活化后的P123。PEI （40KDa,0.20 g, 0.10 mmol）除水后溶于10mL无水二氯甲烷中，活化后的P123（0.01mmol）溶于10ml无水二氯甲烷中，同时将上述两液缓慢的滴入10mL无水二氯甲烷底液中，氮气饱和后室温磁力搅拌过夜，透析，冻干，得到P123-PEI。
2、双功能肽R13的合成
根据RGD肽的氨基酸序列：Arg-Gly-Asp（RGD），TAT(49-57)氨基酸序列：Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（RKKRRQRRR），由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成双功能肽RGD-Tat(49-57)，其氨基酸序列为Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（SEQ ID NO.1），并命名为R13。
3、R13对P123-PEI的修饰
将表面活性剂SMCC溶解于二甲基亚砜（DMSO）溶液中至终浓度为3.33mg/mL，双功能肽R13与P123-PEI分别溶解于PBS溶液中至终浓度分别为10mg/mL、9mg/mL，再将SMCC液按摩尔比10:1、5:1、2:1逐滴加入P123-PEI液中，边加边搅拌，在室温下反应30mim，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，即得maleimided Plu-PEI。将R13液按摩尔比10:1、5:1、2:1加入maleimided Plu-PEI液中，4℃摇动反应过夜。然后用超滤离心管离心，冻干，即得三种不同R13浓度的R13和 P123-PEI相偶联的非病毒基因载体P123-PEI-R13，分别命名为P123-PEI-R13-h、P123-PEI-R13-m、P123-PEI-R13-l。
4、P123-PEI-R13的细胞毒性实验
将Hela细胞接种于96孔板上，培养24 h，使细胞汇合度达到70%-80%。吸去培养基，每孔加入不同浓度阳离子聚合物（4，6，8，16，24，32，48μg/mL，无血清1640作为溶剂），继续培养24h，MTT法检测细胞毒性，统计细胞存活率，结果如表1所示。从表1可看出，未修饰的PEI（25 KDa）细胞毒性很强，而P123-PEI-R13与未修饰的PEI（25 KDa）分子量相当，但是二者细胞毒性相比具有显著性差异，P123-PEI-R13几乎无毒。
表1 细胞毒性实验结果
5、P123-PEI-R13的体外转染实验
将Hela细胞接种于24孔板上，培养24 h，使细胞汇合度达到70%-80%。将P123-PEI-R13与虫荧光素酶报告基因按质量比2:1、5:1、10:1、20:1和30:1制成复合物，加入24孔板上，培养5h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，统计转染效率，结果如表2所示。从表2可看出，P123-PEI-R13具备很高的转染效率，远远高于对照组PEI （2KDa）与PEI （25KDa）的最佳表达相比，也高很多。
表2体外转染实验结果
实施例3
1、P123-PEI的制备
称取0.6mmol除水后的P123，溶于40ml，无水甲苯与无水二氯甲烷体积比为3:1的无水甲苯和无水二氯甲烷的混合溶液中，加入12mmol双（三氯甲基）碳酸酯，室温下180rpm磁力搅拌反应过夜。真空旋蒸除去溶剂，再用30ml，无水甲苯与无水二氯甲烷体积比为2:1的无水甲苯和无水二氯甲烷混合液溶解，然后加入2.0mmol N-羟基琥珀酰亚胺，180rpm磁力搅拌下，将2.0mmol无水三乙胺逐滴加入反应液中，继续搅拌反应约4h。待反应完全后，将反应液过滤并再次真空旋蒸除去溶剂，所得残渣溶解于50ml乙酸乙酯中，8000rpm离心15min后取上清液，旋转蒸发，挥去乙酸乙酯，冷却固化反应物，即得活化后的P123。PEI （20KDa,0.20 g, 0.10 mmol）除水后溶于10mL无水二氯甲烷中，活化后的P123（0.01mmol）溶于10ml无水二氯甲烷中，同时将上述两液缓慢的滴入10mL无水二氯甲烷底液中，氮气饱和后室温磁力搅拌过夜，透析，冻干，得到P123-PEI。
2、双功能肽R13的合成
根据RGD肽的氨基酸序列：Arg-Gly-Asp（RGD），TAT(49-57)氨基酸序列：Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（RKKRRQRRR），由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成双功能肽RGD-Tat(49-57)，其氨基酸序列为Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（SEQ ID NO.1），并命名为R13。
3、R13对P123-PEI的修饰
将表面活性剂SMCC溶解于二甲基亚砜（DMSO）溶液中至终浓度为3.33mg/mL，双功能肽R13与P123-PEI分别溶解于PBS溶液中至终浓度分别为10mg/mL、9mg/mL，再将SMCC液按摩尔比10:1、5:1、2:1逐滴加入P123-PEI液中，边加边搅拌，在室温下反应30mim，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，即得maleimided Plu-PEI。将R13液按摩尔比10:1、5:1、2:1加入maleimided Plu-PEI液中，4℃摇动反应过夜。然后用超滤离心管离心，冻干，即得三种不同R13浓度的R13和 P123-PEI相偶联的非病毒基因载体P123-PEI-R13，分别命名为P123-PEI-R13-h、P123-PEI-R13-m、P123-PEI-R13-l。
4、P123-PEI-R13的细胞毒性实验
将Hela细胞接种于96孔板上，培养24 h，使细胞汇合度达到70%-80%。吸去培养基，每孔加入不同浓度阳离子聚合物（4，6，8，16，24，32，48μg/mL，无血清1640作为溶剂），继续培养24h，MTT法检测细胞毒性，统计细胞存活率，结果如表3所示。从表3可看出，未修饰的PEI（25 KDa）细胞毒性很强，而P123-PEI-R13与未修饰的PEI（25 KDa）分子量相当，但是二者细胞毒性相比具有显著性差异，P123-PEI-R13几乎无毒。
表3 细胞毒性实验结果
5、P123-PEI-R13的体外转染实验
将Hela细胞接种于24孔板上，培养24 h，使细胞汇合度达到70%-80%。将P123-PEI-R13与虫荧光素酶报告基因按质量比2:1、5:1、10:1、20:1和30:1制成复合物，加入24孔板上，培养5h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，统计转染效率，结果如表4所示。从表4可看出，P123-PEI-R13具备很高的转染效率，远远高于对照组PEI （2KDa）与PEI （25KDa）的最佳表达相比，也高很多。
表4体外转染实验结果
实施例4
1、P123-PEI的制备
称取0.6mmol除水后的P123，溶于40ml，无水甲苯与无水二氯甲烷体积比为3:1的无水甲苯和无水二氯甲烷的混合溶液中，加入6mmol双（三氯甲基）碳酸酯，室温下180rpm磁力搅拌反应过夜。真空旋蒸除去溶剂，再用30ml，无水甲苯与无水二氯甲烷体积比为2:1的无水甲苯和无水二氯甲烷混合液溶解，然后加入2.0mmol N-羟基琥珀酰亚胺，180rpm磁力搅拌下，将2.0mmol无水三乙胺逐滴加入反应液中，继续搅拌反应约4h。待反应完全后，将反应液过滤并再次真空旋蒸除去溶剂，所得残渣溶解于50ml乙酸乙酯中，8000rpm离心15min后取上清液，旋转蒸发，挥去乙酸乙酯，冷却固化反应物，即得活化后的P123。PEI （600 Da,0.20 g, 0.10 mmol）除水后溶于10mL无水二氯甲烷中，活化后的P123（0.01mmol）溶于10ml无水二氯甲烷中，同时将上述两液缓慢的滴入10mL无水二氯甲烷底液中，氮气饱和后室温磁力搅拌过夜，透析，冻干，得到P123-PEI。
2、双功能肽R13的合成
根据RGD肽的氨基酸序列：Arg-Gly-Asp（RGD），TAT(49-57)氨基酸序列：Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（RKKRRQRRR），由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成双功能肽RGD-Tat(49-57)，其氨基酸序列为Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（SEQ ID NO.1），并命名为R13。
3、R13对P123-PEI的修饰
将表面活性剂SMCC溶解于二甲基亚砜（DMSO）溶液中至终浓度为3.33mg/mL，双功能肽R13与P123-PEI分别溶解于PBS溶液中至终浓度分别为10mg/mL、9mg/mL，再将SMCC液按摩尔比10:1、5:1、2:1逐滴加入P123-PEI液中，边加边搅拌，在室温下反应30mim，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，即得maleimided Plu-PEI。将R13液按摩尔比10:1、5:1、2:1加入maleimided Plu-PEI液中，4℃摇动反应过夜。然后用超滤离心管离心，冻干，即得三种不同R13浓度的R13和 P123-PEI相偶联的非病毒基因载体P123-PEI-R13，分别命名为P123-PEI-R13-h、P123-PEI-R13-m、P123-PEI-R13-l。
4、P123-PEI-R13的细胞毒性实验
将Hela细胞接种于96孔板上，培养24 h，使细胞汇合度达到70%-80%。吸去培养基，每孔加入不同浓度阳离子聚合物（4，6，8，16，24，32，48μg/mL，无血清1640作为溶剂），继续培养24h，MTT法检测细胞毒性，统计细胞存活率，结果如表5所示。从表5可看出，未修饰的PEI（25 KDa）细胞毒性很强，而P123-PEI-R13与未修饰的PEI（25 KDa）分子量相当，但是二者细胞毒性相比具有显著性差异，P123-PEI-R13几乎无毒。
表5细胞毒性实验结果
5、P123-PEI-R13的体外转染实验
将Hela细胞接种于24孔板上，培养24 h，使细胞汇合度达到70%-80%。将P123-PEI-R13与虫荧光素酶报告基因按质量比2:1、5:1、10:1、20:1和30:1制成复合物，加入24孔板上，培养5h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，统计转染效率，结果如表6所示。从表6可看出，P123-PEI-R13具备很高的转染效率，远远高于对照组PEI （2KDa）与PEI （25KDa）的最佳表达相比，也高很多。
表6体外转染实验结果
实施例5
1、P123-PEI的制备
称取0.6mmol除水后的P123，溶于40ml，无水甲苯与无水二氯甲烷体积比为3:1的无水甲苯和无水二氯甲烷的混合溶液中，加入9mmol双（三氯甲基）碳酸酯，室温下180rpm磁力搅拌反应过夜。真空旋蒸除去溶剂，再用30ml，无水甲苯与无水二氯甲烷体积比为2:1的无水甲苯和无水二氯甲烷混合液溶解，然后加入2.0mmol N-羟基琥珀酰亚胺，180rpm磁力搅拌下，将2.0mmol无水三乙胺逐滴加入反应液中，继续搅拌反应约4h。待反应完全后，将反应液过滤并再次真空旋蒸除去溶剂，所得残渣溶解于50ml乙酸乙酯中，8000rpm离心15min后取上清液，旋转蒸发，挥去乙酸乙酯，冷却固化反应物，即得活化后的P123。PEI （70KDa,0.20 g, 0.10 mmol）除水后溶于10mL无水二氯甲烷中，活化后的P123（0.01mmol）溶于10ml无水二氯甲烷中，同时将上述两液缓慢的滴入10mL无水二氯甲烷底液中，氮气饱和后室温磁力搅拌过夜，透析，冻干，得到P123-PEI。
2、双功能肽R13的合成
根据RGD肽的氨基酸序列：Arg-Gly-Asp（RGD），TAT(49-57)氨基酸序列：Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（RKKRRQRRR），由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成双功能肽RGD-Tat(49-57)，其氨基酸序列为Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（SEQ ID NO.1），并命名为R13。
3、R13对P123-PEI的修饰
将表面活性剂SMCC溶解于二甲基亚砜（DMSO）溶液中至终浓度为3.33mg/mL，双功能肽R13与P123-PEI分别溶解于PBS溶液中至终浓度分别为10mg/mL、9mg/mL，再将SMCC液按摩尔比10:1、5:1、2:1逐滴加入P123-PEI液中，边加边搅拌，在室温下反应30mim，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，即得maleimided Plu-PEI。将R13液按摩尔比10:1、5:1、2:1加入maleimided Plu-PEI液中，4℃摇动反应过夜。然后用超滤离心管离心，冻干，即得三种不同R13浓度的R13和 P123-PEI相偶联的非病毒基因载体P123-PEI-R13，分别命名为P123-PEI-R13-h、P123-PEI-R13-m、P123-PEI-R13-l。
4、P123-PEI-R13的细胞毒性实验
将Hela细胞接种于96孔板上，培养24 h，使细胞汇合度达到70%-80%。吸去培养基，每孔加入不同浓度阳离子聚合物（4，6，8，16，24，32，48μg/mL，无血清1640作为溶剂），继续培养24h，MTT法检测细胞毒性，统计细胞存活率，结果如表7所示。从表7可看出，未修饰的PEI（25 KDa）细胞毒性很强，而P123-PEI-R13与未修饰的PEI（25 KDa）分子量相当，但是二者细胞毒性相比具有显著性差异，P123-PEI-R13几乎无毒。
表7细胞毒性实验结果
5、P123-PEI-R13的体外转染实验
将Hela细胞接种于24孔板上，培养24 h，使细胞汇合度达到70%-80%。将P123-PEI-R13与虫荧光素酶报告基因按质量比2:1、5:1、10:1、20:1和30:1制成复合物，加入24孔板上，培养5h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，统计转染效率，结果如表8所示。从表8可看出，P123-PEI-R13具备很高的转染效率，远远高于对照组PEI （2KDa）与PEI （25KDa）的最佳表达相比，也高很多。
表8体外转染实验结果
综合以上各实施例，可见基因载体P123-PEI-R13能有效地携带基因进入靶细胞，细胞毒性低，转染效率高，说明双功能肽R13可明显增强阳离子多聚物非病毒基因载体的靶向性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海海洋大学
<120> 一种双功能肽修饰的基因载体及其制备方法和应用
<130> \
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Arg Gly Asp Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
Claims (9)
1.一种双功能肽，其特征在于，所述的双功能肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种基因载体，其特征在于，它被如权利要求1所述的双功能肽所修饰。
3.根据权利要求2所述的基因载体，其特征在于，它是由双功能肽和聚乙烯亚胺衍生物偶联而成的。
4.根据权利要求3所述的基因载体，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺衍生物是普郎尼克修饰的聚乙烯亚胺即普郎尼克P123-聚乙烯亚胺。
5.根据权利要求4所述的基因载体，其特征在于，所述的普郎尼克与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:20，所述的聚乙烯亚胺的分子量范围为600-70000 Da。
6.根据权利要求3或4所述的基因载体，其特征在于，所述的双功能肽与聚乙烯亚胺衍生物的摩尔比为1:1-10:1。
7.一种如权利要求4所述的基因载体的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
（a）双功能肽的合成：合成如权利要求1所述的双功能肽；
（b）普朗尼克P123-聚乙烯亚胺的制备：将活化后的普郎尼克P123和除水后的聚乙烯亚胺分别溶于无水二氯甲烷，再将所得的两液同时加入无水二氯甲烷底液，氮气饱和后磁力搅拌过夜，离心取上清，将所述的上清旋转蒸发；
（c）双功能肽对普朗尼克P123-聚乙烯亚胺的修饰：表面活性剂溶解于二甲基亚砜，步骤（a）所述的双功能肽和步骤（b）所述的普朗尼克P123-聚乙烯亚胺分别溶解于PBS溶液；表面活性剂溶液加入到普朗尼克P123-聚乙烯亚胺液得到maleimided Plu-PEI液；双功能肽液加入到所述的maleimided Plu-PEI液，反应过夜，离心冻干。
8.一种如权利要求2或3所述的基因载体与DNA形成的复合物。
9.根据权利要求8所述的复合物，其特征在于，所述的DNA含报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。
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