CN104826121A - 肿瘤靶向基因递送系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤靶向基因递送系统，该基因递送系统包含：连接有双功能肽的聚乙烯亚胺衍生物，所述聚乙烯亚胺衍生物为普朗尼克修饰的低分子量聚乙烯亚胺，所述双功能肽含有特异性亲和DR5受体的DR5短肽、及细胞穿膜肽TAT。本发明还公开了该基因递送系统的制备方法和应用。本发明的肿瘤靶向基因递送系统，兼具高转染效率、高肿瘤细胞和组织靶向性及良好的安全性和体内外稳定性，可实现肿瘤细胞的定向杀伤作用，毒副作用低，治疗指数高，应用前景广阔。

Description

肿瘤靶向基因递送系统及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种双功能肽修饰的肿瘤靶向基因递送系统及其应用。

背景技术

肿瘤已成为威胁人类生命健康的一个重大疾患，目前还缺乏有效的治疗手段。治疗肿瘤的传统药物疗效较差，副作用大且靶向效果差。肿瘤发展的生物学起因是基因突变，对病变的基因和肿瘤细胞进行靶向治疗是目前最有力的治疗方法，也是现代研究肿瘤治疗最活跃的领域。

要成功地实施基因治疗，必须具备三个关键因素：针对性的治疗基因；基因递送系统；基因表达调节系统。其中基因递送系统是基因治疗的核心技术，理想的基因递送载体系统应具备以下特性：细胞毒性低、缩合DNA能力强、良好的体液稳定性、可靶向于特定细胞、能及时穿膜并在胞内转运和释放等。目前，相对于生物化学和分子生物学等学科对基因治疗技术的巨大促进作用，进展缓慢的基因递送系统已经成为制约基因治疗发展的“紧箍咒”，阻碍了基因治疗的顺利实施。因此，构建具有较高转基因效率、特异靶向性及良好稳定性和安全性的基因递送载体系统迫在眉睫。

目前的基因载体主要包括病毒和非病毒载体两种。病毒载体转染效率较高但存在运载能力低、有潜在安全威胁等缺点，因此，越来越多的研究者把目光转移到非病毒载体。聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体，富含阳离子，具有强大的缓冲能力，有较强结合DNA和黏附细胞的能力，可缩聚DNA分子形成颗粒并转入真核细胞进行表达。然而，PEI作为基因载体仍存在两个突出问题:第一，转染效率与细胞毒性存在矛盾。小分子PEI虽细胞毒性低，但在生理的离子浓度下与DNA易发生解离，造成转染效果差；分子量在20kDa以上的PEI虽具有较理想转染效率，但由于PEI的表面富含阳性电荷以及体内不可降解性，致使高分子量PEI表现出较强的细胞毒性。第二，聚乙烯亚胺靶向性差。它是利用自身所带的正电荷，与细胞表面带负电荷的受体通过静电作用相结合，所以细胞的选择特异性差，解决靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。因此，如何将PEI改造成细胞毒性低、靶向性强、转染效率高的基因载体材料是解决PEI应用难题的突破口。

肿瘤细胞表面存在TRAIL死亡受体DR5，对其靶向定位，可以实现肿瘤细胞的靶向性，改变肿瘤/非瘤组织中的分配，使毒副作用降低，治疗指数提高。TAT细胞穿膜肽具有增强递药系统稳定性，更易穿过肿瘤细胞膜的作用。

但是目前由DR5短肽和TAT细胞穿膜肽连接组成的双功能肽修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其应用在国内外尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肿瘤靶向基因递送系统，该基因递送系统是将低分子量的聚乙烯亚胺(PEI)连接到普朗尼克(Pluronic)聚合物表面形成聚乙烯亚胺衍生物，再将具有肿瘤靶向和促穿膜作用的双功能肽与聚乙烯亚胺衍生物偶联而构建成的肿瘤靶向纳米基因递送系统，该系统作为基因载体，不仅高效低毒，且靶向性强、稳定性好。

此外，还需要提供一种上述肿瘤靶向基因递送系统的制备方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种肿瘤靶向基因递送系统，该基因递送系统包含：连接有双功能肽的聚乙烯亚胺衍生物，所述聚乙烯亚胺衍生物为普朗尼克修饰的低分子量聚乙烯亚胺，所述双功能肽含有特异性亲和DR5受体的DR5短肽、及细胞穿膜肽TAT。

本发明中，普朗尼克修饰的聚乙烯亚胺，其化学结构式如下：

式中，PEI为聚乙烯亚胺，x＝2-80，y＝10-40。

所述聚乙烯亚胺的分子量范围为600-2000Da。

普朗尼克为两亲性聚合物，是一种由中部疏水的聚氧丙烯(PO)链侧面连接两段亲水聚氧乙烯(EO)构成的非离子式三嵌段共聚物，其化学结构式如下：

EO链形成亲水性外壳，可以增加载体材料的胶体稳定性，降低PEI的细胞毒性；而PO链形成亲脂性内核，可以增加材料的亲脂性，提高对细胞的亲和力，进而提高转染效率。

由于聚氧乙烯链的亲水性和聚氧丙烯链的亲脂性，使普朗尼克这类共聚物具有极不相同的表面活性，属于非离子型表面活性剂。根据亲水亲油平衡值(HLB)，普朗尼克具有从极端疏水性的Ploxamer 401(HLB＝0.5)到极端亲水性的Ploxamer 108(HLB＝30.5)的多种产品。

优选的，本发明的普朗尼克包括：型号为P123、F68、P105、L61(Mw＝5780、8594、6554、2022)的普朗尼克。对于普朗尼克的商品型号，其识别码为一个表示其室温下物理形态的字母(L：液体，P：糊状，F：片状(固体)后缀两位或者三位数字，第一位数(及三位数字情况下的前两位数)乘以300表示疏水物聚氧丙烯的近似分子质量，后一位数x 10为聚氧乙烯所占的百分比(例如L61表示分子质量为1800g/mol的聚氧丙烯带有10％的聚氧乙烯构成的普朗尼克)。

优选的，本发明双功能肽具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种双功能肽，该双功能肽含有特异性亲和DR5受体的DR5短肽、及细胞穿膜肽TAT。

在本发明的另一方面，还提供了一种纳米复合物，包含上述肿瘤靶向基因递送系统和基因治疗药物。

所述基因治疗药物包括DNA或RNA。

在本发明的另一方面，还提供了一种肿瘤靶向基因递送系统的制备方法，包括以下步骤：

用三光气和N-羟基琥珀酰亚胺活化普朗尼克两端羟基，再将活化的普朗尼克与聚乙烯亚胺反应，得普朗尼克修饰的聚乙烯亚胺；

合成双功能肽，该双功能肽含有特异性亲和DR5受体的DR5短肽、及细胞穿膜肽TAT；

用SMCC法将合成的双功能肽与普朗尼克修饰的聚乙烯亚胺偶联，形成肿瘤靶向基因递送系统。

在本发明的另一方面，还提供了上述肿瘤靶向基因递送系统或其纳米复合物在制备肿瘤靶向基因药物制剂中的应用。

本发明的肿瘤靶向基因递送系统，兼具高转染效率、高肿瘤细胞和组织靶向性及良好的安全性和体内外稳定性，可实现肿瘤细胞的定向杀伤作用，且毒副作用低，治疗指数明显提高。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1没有活化和活化的普朗尼克P123的红外图谱图；

图2是本发明实施例1根据不同浓度NHS的紫外吸光度绘制的标准曲线图；

图3是本发明实施例2的P123-PEI的结构示意图；

图4是本发明实施例2的P123-PEI的红外图谱图；

图5是本发明实施例2的P123-PEI的核磁共振图谱图；

图6是本发明实施例3的双功能肽D21的质谱分析结果图；

图7是本发明实施例3的双功能肽D21的高效液相色谱分析结果图；

图8是本发明实施例4的P123-PEI-D21产物的核磁共振图谱图；

图9是本发明实施例5的MTT检测获得的细胞IC50曲线图；

图10是本发明实施例6流式细胞仪测定结果图；

图11是本发明实施例6流式细胞仪测定结果柱状图；

图12是本发明实施例6荧光显微镜观察基因表达结果图；

图13是本发明实施例6荧光显微镜定量观察载基因纳米粒基因表达结果图；

图14是本发明实施例7的Pluronic-PEI-D21/miRNA抗恶性黑素瘤细胞增殖的IC50曲线图。

具体实施方式

针对目前PEI非病毒基因载体存在的三个突出问题：转染效率与细胞毒性相矛盾、体液环境中稳定性与穿膜能力相矛盾、以及靶向性差，本发明先采用不同EO/PO比的Pluronic连接低分子量PEI(LMW-PEI)，筛选得到高效、低毒的基因载体材料(Pluronic-PEI)。通过将LMW-PEI连接到能形成单分子聚合物胶束的Pluronic表面，既有荷正电PEI与基因的结合能力，又可避免使用大分子PEI可能带来的细胞毒性，且可显著提高复合物在体液中的稳定性。然后DR5受体在人多数肿瘤细胞表面高表达的特点，选择特异亲和该DR5受体的DR5短肽，与细胞穿膜肽TAT连接，合成具有靶向于肿瘤细胞和促载体穿膜作用的双功能肽DR5-TAT(D21)，再利用交联技术将D21与Pluronic-PEI偶联，构建一种兼具高转染效率、高肿瘤细胞和组织的特异靶向性及良好安全性和体内外稳定性的的肿瘤靶向纳米基因递送系统(Pluronic-PEI-D21)。

实施例1普朗尼克(Pluronic)的活化及其产率的计算

普朗尼克(Pluronic)是两亲性的嵌段共聚物，是一种由中部疏水的聚氧丙烯(PO)链侧面连接两段亲水聚氧乙烯(EO)构成的非离子式三嵌段共聚物(聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物)。本发明用Pluronic作为桥连接分子串接低分子量聚乙烯亚胺(PEI)，首先要把Pluronic两端的羟基都活化，才能和两个相同的聚乙烯亚胺分子反应。使用三光气+N-羟基琥珀亚酰胺法活化Pluronic，下面以Pluronic 123(P123)活化为例详细阐述Pluronic的活化过程。

(1)P123的活化

利用Pluronic 123(P123)的羟基与三光气缩合，所得产物再与N-羟基琥珀酰亚胺的亚氨基缩合得到活化的P123，反应式如下所示。

取适量的P1230.588g，加入三光气0.066g，溶解于无水甲苯和无水二氯甲烷(3:1)的混合溶液，室温下磁力搅拌过夜。真空旋蒸除去大部分溶剂，将所得固体溶于无水甲苯和无水二氯甲烷(2:1)的混合溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺适量(Pluronic摩尔量之比为1:2)，磁力搅拌下将无水三乙胺(0.2ml溶于4ml二氯甲烷)逐滴加入反应液中，继续搅拌反应4小时。等反应完全后，将反应液减压过滤并真空旋蒸，除去溶剂。所得产物溶于乙酸乙酯中，高速离心，得到的反应液真空旋蒸除去乙酸乙酯，冷却固化反应物，保存于-20℃条件下干燥。将产物以KBr为参比物，红外光谱仪测定，扫描：60SCS。

结果：红外扫描图谱如图1所示，图1A是没有活化的P123的红外图谱，图1B是活化的P123的红外图谱。活化后的P123羟基消失。羟基的吸收峰在3750cm^-1-3000cm^-1，在未活化的P123的红外图谱中存在3750cm^-1-3000cm^-1的吸收峰；而双活化的P123在这个区间中不存在吸收峰，在1900cm^-1-1650cm^-1处存在羰基吸收峰。图1A在3500cm^-1存在较大的吸收峰，而图1B在3500cm^-1的吸收峰相对较小，由此可知Pluroni P123已经活化。

(2)测算活化的普朗尼克P123产率

活化率的计算是基于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在弱碱性条件下在260nm处有最大吸收峰。利用反应中N-羟基琥珀酰亚胺的消耗量来计算P123的活化率。反应方程式如下：

量取25％浓氨水0.748mL，用蒸馏水稀释成100ml，其浓度为0.1mol/L。精密称取0.0058gNHS，加入蒸馏水至100ml，使其浓度为0.508mmol/L。

按下表1添加氨水、NHS和蒸馏水，并测定各个溶液的紫外吸光度。

表1不同浓度NHS的吸光度

以紫外吸光度为纵坐标，NHS的最终浓度为横坐标，绘制标准曲线，并求出回归方程。绘制的标准曲线如图2所示，可得回归方程为A＝8.4483C+0.0019(R²＝1.0000)。通过测定P123三次活化产物的紫外吸光度率，可以算得产率在74％-85％。

实施例2 Pluronic-PEI的合成

Pluronic活化后与低分子量PEI(LMW-PEI)反应，然后利用红外扫描和核磁共振对所得产物进行结构测定。

本实施例将PEI与实施例1活化的P123连接，以解决低分子量PEI转染效率低而高分子量PEI细胞毒性大的问题。反应方程式如下：

将上述活化的P123溶于10ml二氯甲烷中，将PEI 2K溶于10ml的二氯甲烷中(两者摩尔量之比接近1:2)，将上述两溶液逐滴慢慢加入到10ml二氯甲烷中，搅拌过夜。高速离心弃去沉淀，真空旋蒸。除去溶剂后，用超纯水将产物溶解。溶解后的产物置于透析袋中，放置于4℃下透析3天(每天都要换透析介质)。透析所得溶液冷冻干燥，得到反应终产物，-20℃中保存。

结果：

双活化的Pluronic与低分子量聚乙烯亚胺交替链接，因为PEI为分枝状结构，故产物的结构为交错的网格状，有利于包裹DNA。产物的结构示意图如图3所示。

P123-PEI的红外扫描图谱如图4所示。从图4可以看到，在3422.48cm^-1存在明显的吸收峰，此峰为PEI结构式中氨基的吸收峰，而活化的P123中存在的氨基在该处没有明显的吸收峰(参见图1)。因此，由图4可知P123-PEI已经成功合成。

图5为P123-PEI的核磁共振(NMR)图谱，从中可以看出，1.1-1.4ppm的峰为-CH₃单元质子峰，3.7-3.9ppm的峰为-CH₂CH₂O-单元质子峰，3.6-4.3ppm为-CH₂CH₂NH-单元质子峰。NMR谱中未见其它峰，说明P123-PEI具有较高的纯度。

实施例3合成双功能肽DR5-TAT(D21)

DR5受体在人多数肿瘤细胞表面高表达，本发明选择特异亲和该DR5受体的DR5短肽，与细胞穿膜肽TAT连接，合成具有肿瘤细胞靶向和促载体穿膜作用的双功能肽DR5-TAT(简称D21)。

双功能多肽D21的序列如下：

Tyr-Cys-Lys-Val-Ile-Leu-Thr-His-Arg-Cys-Tyr-Cys-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(SEQ ID NO.1)。

通过Fmoc法合成D21多肽，该D21多肽的MW为2823.5。

合成的双功能肽D21的序列通过电喷雾质谱分析鉴定，含量通过高效液相色谱(HPLC)进行测定，按归一化法测定相对百分含量。

D21的质谱分析结果如图6所示，由图6可知，已成功合成了D21序列。由HPLC分析结果可知(见图7)，合成的多肽纯度为96.5％，符合投料要求。

实施例4肿瘤靶向基因递送系统的构建及其性能考察

双功能肽D21与Pluronic-PEI可通过异双功能交联剂SMCC偶联。SMCC是4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚酯(N-Succinimidyl 4-(maleimidomethyl)cyclohexanecarbo-xylate)的简称。SMCC首先与PEI的氨基作用，形成马来酰亚胺化的PEI(maleimided-PEI)，其可与含有巯基的蛋白质反应，D21多肽则通过半胱氨酸(Cys)的巯基与马来酰亚胺化PEI反应，产生二硫键连接的D21多肽-PEI衍生物。具体步骤如下：

(1)制备马来酰亚胺化P123-PEI(SMCC法)取SMCC 0.167g溶于DMSO(二甲基亚砜)50ml中使其浓度为3.33mg/ml，取P123-PEI 0.452g溶于PBS(磷酸盐缓冲液)50ml使其浓度为9mg/ml，将上述SMCC溶液与P123-PEI溶液按摩尔比10:1,5:1,2:1逐滴加入到锥形瓶中，边滴边搅拌，在室温条件下反应40min。反应完全后，反应液通过分子量为10000的超滤离心管离心(1000r/min 15min)，将没有结合的SMCC除去。

(2)偶联马来酰亚胺化P123-PEI和D21将D21双功能肽2mg溶于PBS溶液中，定容至10ml，其浓度为0.2mg/ml，将其逐滴加入到马来酰亚胺化P123-PEI溶液中(其摩尔比为10:1、5:1、2:1)，在0℃条件下搅拌过夜。之后将反应液用分子量为10000的超滤离心管离心(1000r/min)，将没有反应的maleimided P123-PEI与D21除去，冷冻干燥，得到所需产物，分别将产物命名为P123-PEI-D21(1:10)、P123-PEI-D21(1:5)；P123-PEI-D21(1:2)。

P123-PEI-D21产物的核磁共振图谱如图8所示，从中可以看出，存在1.1-1.4ppm的-CH₃单元质子峰，3.7-3.9ppm的-CH₂CH₂O-单元质子峰，3.6-4.3ppm-CH₂CH₂NH-单元质子峰4.6-5.0ppm的峰，表明存在P123-PEI，2.4-2.6ppm的峰表明苯环的邻位上存在两个氢，证明存在D21。由此证明P123-PEI-D21已成功合成。

下面对P123-PEI-D21的各项性能进行考察。

1)P123-PEI-D21中PEI含量的测定

通过测定，得出P123-PEI-D21(1:2)、P123-PEI-D21(1:5)、P123-PEI-D21(1:10)中PEI的含量分别为11.34％、11.65％、12.80％。

2)P123-PEI-D21水解性能考察

通过测定P123-PEI-D21在37℃不同时间点分子量的方法评价其水解能力，结果聚合物P123-PEI-D21在37℃可缓慢水解，大约60h左右可水解成小分子化合物。

由此可知，合成的P123-PEI-D21在生理条件下其酯键对水敏感，可发生水解反应，使得聚合物被降解成P123低聚物和低分子量PEI，并可通过细胞外排作用分泌到细胞外环境，进而减少胞内蓄积，减小对细胞的毒性。

3)P123-PEI-D21/DNA复合物粒径

通过激光粒度仪测定不同N/P复合物的粒径，结果测得P123-PEI-D21/DNA复合物的粒径大多在100nm-300nm之间，该粒径范围适于复合物的体内外转染。随着复合物N/P值的增加，粒径逐渐减小，表明随着P123-PEI-D21量的增加，荷电数增多，压缩、包裹DNA能力逐渐增强。

4)P123-PEI-D21/DNA复合物表面电位

通过zeta电位仪测定不同N/P(1,5,10,15)复合物的电位，结果是P123-PEI-D21/DNA复合物的平均zeta电位范围为16.9mV-29.9mV，且zeta电位随N/P值的增加而增加，表明随着P123-PEI-D21量的增加，正电荷亦增加。

实施例5 Pluronic-PEI-D21细胞毒性评价

采用MTT法评价合成的P123-PEI-D21对HepG2细胞、Hela细胞、A375细胞、NIH 3T3细胞的细胞毒性，并与Pluronic-PEI、PEI 2KDa和PEI 25KDa对照。分别将装有HepG2细胞、Hela细胞、A375细胞、NIH 3T3细胞的冻存管从液氮瓶中取出，37℃水浴融解，2000rpm离心2min，弃去冻存液，加入新鲜配制的RMPI-1640培养基(含10％胎牛血清)培养24h后换液，再将细胞传代培养。分别将四种细胞用0.1％胰酶消化，按每孔5000细胞接种于96孔板，0.2mL/孔，培养24h，使细胞汇合度达到70％-80％。实验前，吸去培养基，每孔加入不同浓度阳离子聚合物PEI-P123-D21或PEI(5、10、15、20、40、60、80、100、120、160μg/mL，无血清RMPI1640为溶剂)，孵育6h后换含10％FCS的RMPI 1640培养基，继续培养72h。吸去培养基，每孔加入含10％FCS的RMPI 1640培养基180μL和5mg/mL MTT(PBS为溶剂，过滤除菌)20μL，37℃孵育4h。吸取上清液，毎孔加入150μL DMSO，室温振荡10min，用酶标仪在570nm波长处测定各孔吸收值，记录数据，以未经阳离子聚合物处理的细胞作为对照，按下列公式计算HepG2细胞、Hela细胞、A375细胞、NIH 3T3细胞的细胞活度。

细胞存活率(％)＝(A_test/A_control)×100(mean±SD,n＝6)

其中，A_test是PEI-P123-D21或PEI处理细胞的吸收值，A_control是未处理细胞的吸收值。

MTT实验得到的细胞IC50曲线如图9所示，由图9可知，随着聚合物浓度的增加，PEI25KDa对四种细胞毒性逐渐增强，当浓度达到20μg/mL及以上时，细胞大量死亡，显示了较强细胞毒性，而P123-PEI-D21与PEI 2KDa相比较PEI 25KDa在各实验浓度均显示了较低的细胞毒性。值得一提的是，P123-PEI-D21在各实验浓度，甚至是较高浓度，细胞毒性均很小，且P123-PEI-D21对正常细胞NIH 3T3作用的IC50显著高于对肿瘤细胞作用的IC50值，提示P123-PEI-D21非常适于基因转染。

实施例6 Pluronic-PEI-D21体外转染效率考察

1.人黑素瘤细胞A375和人正常上皮细胞NIH-3T3摄取PEI-P23-D21的浓度依赖性考察

A375和NIH-3T3以浓度1×10⁴个/ml接种于6孔板中培养24h，镜下观察汇合度，达到80％，且细胞状态良好，进行载体摄取实验考察。

将DyLight-633标记的PEI-P123-D21和PEI-P123稀释成一系列浓度：0μM、0.20μM、0.40μM和0.80μM，37℃、5％CO₂条件下分别与A375和NIH-3T3孵育60min，PBS液润洗3次后，利用胰酶消化，4℃，1600rpm离心10min弃去上清液，PBS吹悬，调整细胞浓度至1×10⁶个/ml，以空白细胞作阴性对照，每个样品收集10000events，流式检测参数的获取，采用Cellquest软件，流式细胞仪测定细胞摄的定量摄取情况以及细胞的平均荧光强度。

结果如图10、11所示，DyLight-633-PEI-P123和DyLight-633-PEI-P123-D21的细胞摄取效率，在A375和NIH-3T3细胞中，随着材料浓度的增加而增大，在0.40μM时，A375细胞对不同高分子材料的摄取效率顺序为：DyLight-633-PEI-P123-D21>DyLight-633-PEI；NIH-3T3细胞对不同高分子材料的摄取效率顺序为：DyLight-633-PEI>DyLight-633-PEI-P123-D21；在1.20μM时，A375细胞对不同高分子材料的摄取效率顺序为：DyLight-633-PEI-P123-D21>DyLight-633-PEI；NIH-3T3细胞对不同高分子材料的摄取效率顺序为：DyLight-633-PEI>DyLight-633-PEI-P123-D21，同时，统计结果具有统计学意义。结果可能是由于D21可以与A375表面DR5受体结合，增加了细胞对载体的摄取，而NIH-3T3细胞表面没有DR5受体分布，且由于D21的存在，降低了PEI-P123的正电性，减少了细胞对其非特异性内吞，造成NIH-3T3对DyLight-633-PEI的摄取大于DyLight-633-PEI-P123-D21。

2.载基因纳米粒的体外表达效率考察

(1)定性观察基因表达

A375和NIH-3T3按照2×10⁴/孔接种于24孔培养板中，培养2天，待细胞汇合度为70％时换无血清培养液。以3μg pEGFP-N2质粒/孔，加入新鲜配置的PEI与DNA的N/P为1，5，10，15的PEI-P123-D21/DNA或PEI-P123载基因纳米粒，37℃、5％CO₂条件孵育2h后换含血清培养液继续培养48h，采用倒置荧光显微镜观察基因表达产物绿色荧光蛋白(激发波长为488nm，发射波长为525nm)的绿色荧光并拍照。

结果：在不同的N/P比下，利用PEI-P123-D21和PEI-P123包裹pEGFP-N2质粒转染48小时后，荧光显微镜观察pEGFP-N2质粒的表达结果如图12所示，两种纳米粒中pEGFP-N2质粒的表达效果随着N/P比的增大而增加，在A375细胞中，PEI-P123经过D21修饰后，基因的转染效率显著增加。

(2)定量观察基因表达

A375和NIH-3T3按照2×10⁴/孔接种于24孔培养板中，培养2天，待细胞汇合度为70％时换无血清培养液。以3μg pGL-3质粒/孔，加入新鲜配置的PEI与DNA的N/P为1，5，10，15的PEI-P123-D21/DNA或PEI-P123/DNA载基因纳米粒，37℃、5％CO₂条件孵育2h后换含血清培养液继续培养48h，以200μL/孔，加入细胞裂解液裂解A375和NIH-3T3，离心后取上清液，采用荧光素酶分析系统测定基因表达产物荧光素酶的活性，并采用BCA法测定细胞蛋白含量。

结果：在不同的N/P比下，利用PEI-P123-D21和PEI-P123包裹pGL-3质粒转染48小时后，荧光显微镜观察pGL-3质粒的表达结果如图13所示，两种纳米粒中pGL-3质粒的表达效果随着N/P比的增大而增加，在A375细胞中，PEI-P123经过D21修饰后，基因的转染效率显著增加，当N/P比为5和10时，pGL-3/PEI-P123-D21转染效率大于pGL-3/PEI-P123，且结果具有统计学意义。

实施例7 Pluronic-PEI-D21/miRNA-34a抗恶性黑素瘤细胞增殖-IC50

将装有人黑素瘤细胞A375的冻存管从液氮瓶中取出，37℃水浴融解，2000rpm离心2min，弃去冻存液，加入新鲜配制的RMPI-1640培养基(含10％胎牛血清)培养24h后换液，再将细胞传代培养。将细胞用0.1％胰酶消化，按每孔5000细胞接种于96孔板，0.2mL/孔，培养24h，使细胞汇合度达到70％-80％。实验前，吸去培养基，每孔加入不同浓度的三种纳米复合物PEI-P123-D21/miRNA，PEI-P123/miRNA，PEI-P123-APT/NC-miRNA(阴性对照)(10nM、50nM、100nM、150nM、200nM、300nM、400nM、600nM、800nM、1000nM，无血清RMPI 1640为溶剂)，孵育6h后换含10％FCS的RMPI 1640培养基，继续培养72h。吸去培养基，每孔加入含10％FCS的RMPI 1640培养基180μL和5mg/mL MTT(PBS为溶剂，过滤除菌)20μL，37℃孵育4h。吸取上清液，毎孔加入150μL DMSO，室温振荡10min，用酶标仪在570nm波长处测定各孔吸收值，记录数据，以未经阳离子聚合物处理的细胞作为对照，按实施例5的公式计算A375细胞的细胞活度。三种纳米复合物对A375细胞作用结果，经GraPhpad 5.0软件拟合后，得出3条细胞IC50曲线。结果如图14所示，三种纳米复合物的IC50值分别为PEI-P123-D21/miRNA：117.6nM；PEI-P123/miRNA：253.6nM；PEI-P123-APT/NC-miRNA：2267，其中，PEI-P123-D21/miRNA是PEI-P123/miRNA的0.46倍，说明D21可以显著的促进miRNA进入A375细胞，同时可增强其对A375细胞的抑制效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种肿瘤靶向基因递送系统，其特征在于，该基因递送系统包含：连接有双功能肽的聚乙烯亚胺衍生物，所述聚乙烯亚胺衍生物为普朗尼克修饰的低分子量聚乙烯亚胺，所述双功能肽含有特异性亲和DR5受体的DR5短肽、及细胞穿膜肽TAT。

2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向基因递送系统，其特征在于，所述双功能肽具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的肿瘤靶向基因递送系统，其特征在于，所述普朗尼克包括：型号为P123、F68、P105或L61的普朗尼克。

4.根据权利要求1所述的肿瘤靶向基因递送系统，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的分子量范围为600-2000Da。

5.一种双功能肽，其特征在于，该双功能肽含有特异性亲和DR5受体的DR5短肽、及细胞穿膜肽TAT。

6.一种纳米复合物，其特征在于，包含权利要求1至4任一项所述肿瘤靶向基因递送系统和基因治疗药物。

7.根据权利要求6所述的纳米复合物，其特征在于，所述基因治疗药物包括DNA或RNA。

8.一种肿瘤靶向基因递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

用三光气和N-羟基琥珀酰亚胺活化普朗尼克两端羟基，再将活化的普朗尼克与聚乙烯亚胺反应，得普朗尼克修饰的聚乙烯亚胺；

合成双功能肽，该双功能肽含有特异性亲和DR5受体的DR5短肽、及细胞穿膜肽TAT；

用SMCC法将合成的双功能肽与普朗尼克修饰的聚乙烯亚胺偶联，形成肿瘤靶向基因递送系统。

9.权利要求1所述肿瘤靶向基因递送系统在制备肿瘤靶向基因药物制剂中的应用。

10.权利要求6所述纳米复合物在制备肿瘤靶向基因药物制剂中的应用。