CN102884083A - Dr5 结合多肽激动剂 - Google Patents

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J·科尔克曼
J·李
K·米尔斯谢尔特
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J·张
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Abstract

本发明涉及针对TRAIL细胞表面受体2（本文也称“DR5”）的氨基酸序列，以及其化合物或构建体，尤其是蛋白质和多肽及编码它们的核酸（本文将其整体称为“NB剂”）及其片段，其药物有效变体，及它们在诊断和治疗DR5相关疾病和障碍中的用途。

Description

DR5 结合多肽激动剂
背景技术
肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体（TRAIL）在多种致瘤和转化细胞系中诱导凋亡，对正常细胞具有很小的作用或无作用。已鉴定出至少5个TRAIL受体，其中2个，即DR4（死亡受体4，TRAIL-R1）和DR5（死亡受体5，TRAIL-R2；KILLER或TRICK 2）能够转导凋亡信号，而另外3个（TRAIL-R3，TRAIL-R4和可溶性OPG）作为诱饵受体来阻断TRAIL介导的凋亡。见例如Ozoren和El-Deiry，Sem.Cancer Biol13:135(2003)；Yagita等,Cancer Sci.,95(10):777(2004)。
TRAIL或Apo2L是281个氨基酸的细胞毒性配体，发现其整合入细胞质膜，C端暴露在细胞的胞外表面（II型配体）。还可以检测到少量可溶性TRAIL配体。TRAIL形成同三聚体分子，结合其各自受体，起始信号发放事件级联。
TRAIL配体与受体DR4或DR5的结合起始外在细胞死亡途径，导致诱导死亡的信号传递复合物（DISC）的形成，该复合物包含衔接头FADD（Fas激活DD）和胱天蛋白酶原8或胱天蛋白酶原10。DISC上的相互作用和下游级联的激活类似于FAS，导致NFκB和Jun N端激酶途径（JNK）的激活。见例如Mongkolsapaya等,Nat.Struct.Biol.,6(11):1048(1999)；Cha等,J.Biol.Chem.,275(40):31171(2000)。TRAIL与DR4或DR5的结合还导致BID切割（通过胱天蛋白酶8或10）、线粒体激活，从而导致内在凋亡途径的激活。
TRAIL配体优先诱导肿瘤细胞的凋亡而对正常细胞具有很小的作用或无作用的能力使它成为癌症治疗的潜在良好的候选物。但是，已显示可溶性TRAIL在体外诱导正常人肝细胞的凋亡，突出了潜在的毒性忧虑。见例如Jo等,Nat Med.6(5):564(2000)。癌症治疗的更有利的靶标是DR5。因为DR5需要多个受体来诱导正常肝细胞的凋亡，所以开发针对负责诱导凋亡的具体DR5的激动剂，预测可以避免针对正常细胞的此毒性，同时保留杀死肿瘤细胞的能力。
已用DR5的肽和抗体激动剂在表达DR5的细胞中诱导凋亡。见例如Li等,J.Mol.Biol.,361,522-536(2006)；Kajiwara等,Biochim.Biophys.Acta 1699:131-137(2004)；Yang等,Cancer Cell,5,501-512(2004)。DR5的激动剂具有用于癌症治疗中抵抗范围广泛的癌症的潜能。例如，抗DR5的单克隆抗体Lexatumumab在肾细胞癌的小鼠模型中诱导DR5的表达并促进凋亡。Zhang等,Cancer Lett.251(1):146-57(2007)。其他抗DR5的激动剂性单克隆抗体，或抗DR5的单链Fv片段，及其杀肿瘤活性也被类似地描述于：例如Takeda等,Journal Exp.Medicine,199,437-448(2004)；Guo等,J.Biol.Chem.,280,41940-41952(2005)；Motoki等,Clin.CancerRes 11(8):3126-35(2005)；和Ichikawa等,Nature Medicine,7,954-960(2001)；Chuntharapai等,J.Immunol.166(8):4891-8(2001)；Shi等,CancerRes.,66(24):11946-11953(2006)中。
正在研发多种DR5特异性抗体用于临床，但尚无任何一种获批。据信，为了激活DR5，需要多个交联抗体，在作用部位足量递送这些抗体来达到可再现的疗效仍存在问题。因此，存在对用于治疗相关疾病的改进的DR5特异性激动剂的需要。
发明概述
本发明涉及包含本文提供的针对死亡受体5（本文称为“DR5”）的氨基酸序列的一种或多种“NB剂”，以及涉及包含一个或多个这种氨基酸序列或基本上由一个或多个这种氨基酸序列组成的特异性化合物或构建体，尤其是蛋白质和多肽（也分别称为“化合物”和“多肽”），及其片段，以及编码这类构建体的核酸。本文提供本发明的DR5特异性构建体的单体变体和多聚体变体。提供NB剂的人源化变体和人工程化（humaneered）变体。在一个实施方案中，本发明的药物相关NB剂作为TRAIL受体DR5的激动剂起作用。
本发明还涉及编码这类氨基酸序列和多肽的核酸；用于制备这类氨基酸序列和多肽的方法；表达或能够表达这类氨基酸序列或多肽的宿主细胞；包含这类氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，尤其是药物组合物；以及这类氨基酸序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的用途，尤其是用于预防、治疗或诊断目的，如本文提到的目的。
本文描述为NB剂的TRAIL受体DR5的激动剂具有用于治疗中对抗范围广泛的DR5相关疾病的潜能。因此，本发明的NB剂在增生性疾病的治疗中具有效用，该增生性疾病包括：例如，癌症，如实体瘤，原发性和转移性癌症，如肾细胞癌和肺癌（例如小细胞肺癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”），胰腺、造血系统恶性肿瘤，神经胶质瘤，星形细胞瘤，间皮瘤，结肠直肠癌，前列腺癌，骨肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤（包括但不限于伯基特淋巴瘤），乳腺癌，子宫内膜癌，肝癌，胃癌，皮肤癌，卵巢癌和任意来源（例如肺、头和颈、乳腺、甲状腺、子宫颈、皮肤、食管等）的鳞状细胞癌；以及液体癌症，例如白血病（见例如Uno等,Nature Medicine,12(6):693-698(2006)），尤其包括T细胞白血病（如急性T细胞白血病（T-ALL））、急性B细胞白血病（B-ALL）、慢性骨髓性白血病（CML）、急性骨髓性白血病（AML）、浆细胞性骨髓瘤和多发性骨髓瘤（MM）。本发明的NB剂在非癌适应症的治疗中也具有效用，该非癌适应症包括炎性和自身免疫性疾病，如系统性红斑性狼疮、桥本病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主疾病、干燥综合症、恶性贫血、艾迪生病、硬皮病、肺出血肾炎综合症、克罗恩病、自身免疫性溶血性贫血；不育、重症肌无力、多发性硬化、突眼性甲状腺肿(Basedow’s disease)；血栓形成性血小板减少症、血小板减少性紫癜、胰岛素依赖性糖尿病、变态反应；哮喘；特应性疾病；动脉硬化；心肌炎；心肌病；肾小球肾炎（globerula nephritis）；和再生不良性贫血。
本文描述的氨基酸序列和多肽可以针对任意DR5或对任意DR5特异。根据一个非限制性方面，本文所述的氨基酸序列和多肽针对DR5。在一个实施方案中，NB剂特异性结合DR5胞外域。
本发明的多肽和组合物可以一般地用于调节DR5。在一个实施方案中，NB剂将触发、激活和/或增加或增强由DR5介导的信号发放。在一个实施方案中，NB剂对DR5的激动作用将调节，尤其是触发或增加，与DR5、其信号发放和/或DR5所涉及的途径相关的生物学机制、反应和效应。
在一个实施方案中，本文所述的化合物、多肽和组合物诱导、触发、增加或增强在某些细胞或组织中的凋亡。在一个实施方案中，本文所述的化合物、多肽和组合物能够结合细胞表面上的DR5，尤其是以诱导、触发、增加或增强DR5介导的信号发放这样的方式结合DR5。在一个实施方案中，本文所述的多肽和组合物可以是这样的，它们能够结合DR5从而在其上存在DR5的细胞中触发或诱导凋亡。
在一个实施方案中，本文所述的NB化合物、（单价或多价）多肽和组合物可以结合DR5上的TRAIL结合部位。在一个实施方案中，NB剂与TRAIL竞争结合DR5。在一个实施方案中，该化合物和多肽与DR5的结合诱导、触发、增加或增强由DR5介导的信号发放，尤其是在其上存在DR5的细胞中触发或诱导凋亡。
本发明的其他方面、实施方案、优势和应用将从本文的进一步描述变得显而易见。
附图简述
图1是ELISA实验的图示，显示多价抗-DR5NB剂对TNF受体家族成员的结合。
图2是四价抗-DR5 NB剂的肿瘤组织PD（胱天蛋白酶3/7激活）的图示。
图3是四价和五价抗-DR5 NB剂在Colo205肿瘤模型中的体内功效的图示。
图4A和4B图示11H6四聚体在无（图4A）或有（图4B）CSF-1R抑制剂的情况下在生长于NSG宿主（即巨噬细胞/NK缺陷宿主）中的MiaPaCa胰腺肿瘤模型中表现出抗肿瘤活性。
图5显示11H6四聚体使患者来源的胰腺肿瘤TPAN1-IFA消退的能力，该肿瘤对LCR211（一种对DR5特异的鼠抗体）不敏感。
图6A、6B和6C的图示显示了，对于（图6A）11H6三聚体、四聚体和五聚体在Colo205细胞中，（图6B）4E6和11H6四聚体和五聚体在Colo205细胞中，以及（图6C）4E6和11H6四聚体和五聚体在H226细胞中，NB构建体中增加的亚基数对应于改善的功效和效力。
发明详述
本文所述的NB剂（即化合物、多肽（单价或多价）和组合物）结合死亡受体5（“DR5”）。在一个实施方案中，所公开的化合物和多肽与DR5的结合诱导、触发、增加或增强由DR5介导的信号发放，尤其是在其上存在DR5的细胞中触发或诱导凋亡。
如本文所使用，本发明的“NB剂”定义为：特异性结合DR5多肽且其结合对DR5活性产生激动作用的、包含至少一个CDR3序列的多肽，或编码该多肽的核苷酸。在一个实施方案中，本发明的NB剂是具有VH结构域的一般结构的多肽。在一个实施方案中，本发明的NB剂是具有VHH结构域的一般结构的多肽。在一个实施方案中，本发明的NB剂是具有VL结构域的一般结构的多肽。在一个实施方案中，除该CDR3序列外，本发明的NB剂还包含至少一个CDR1和至少一个CDR2序列。在一个实施方案中，本发明的NB剂包含至少一个具有下文式1定义的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4构造的单价多肽。在一个实施方案中，本发明的NB剂是单体组合物。在一个实施方案中，NB剂是多聚体组合物。在一个实施方案中，本发明的NB剂是单价组合物。在一个实施方案中，NB剂是多价组合物。在一个实施方案中，构架区包含为用于人而进行了序列优化的残基。下文描述本发明的NB剂的其他方面。
术语“NB剂”被用作意在涵盖全部范围的本发明组合物的上位术语，而术语“NB序列”或备选的“NB构建体”在本文中用来指本文作为SEQID NO:1-72、87-88和103-104公开的具体多肽变体和编码它们的核苷酸，包括本文作为SEQ ID NO:96-99明确公开的那些，及与SEQ ID NO:96-99编码相同的多肽序列但因简并密码而不同的那些序列。
本发明的NB剂
在一个实施方案中，NB剂选自11D1、11H6、10F1、7A12和4E6，或其变体。在一个实施方案中，NB剂是为用于人类而对其序列进行了优化（例如人源化）的变体。在一个实施方案中，人源化NB剂包括但不限于4E6hu和11H6hu的组。在一个实施方案中，NB剂是所列组的单体变体，或其变体。在一个实施方案中，NB剂是所列组的多聚体变体，或其变体。在一个实施方案中，所列组的多聚体变体，或其变体，是单特异性的。在一个实施方案中，所列组的多聚体变体，或其变体，是多特异性的。在一个实施方案中，多特异性NB剂（或其变体）所识别的多个表位是DR5靶标上的多种表位。在一个实施方案中，多特异性NB剂（或其变体）所识别的多个表位是DR5靶标上的至少一个表位和非DR5多肽的靶标上的至少一个表位。
在一个实施方案中，NB剂选自SEQ ID NO:1-22、26–40、87-88和103-104，或SEQ ID NO:96-99，或其变体中的一个或多个。NB剂11D1、11H6、10F1、7A12和4E6或其变体的具体实施方案在下文及表1-4中提供。
本发明的示例性NB剂包括以下NB多肽构建体及其变体。
4E6家族
在一个实施方案中，NB剂是4E6，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体是SEQ ID NO:1的单体，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体是SEQ ID NO:26的单体，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID NO:1的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID NO:26的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体是包含有效连接的两个或更多个单体的多聚体、或其变体，其中所述两个或更多个单体为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:26单体两者的组合，其中所述单体可以处于任何顺序。
在一个实施方案中，4E6多聚体构建体是SEQ ID NO:1的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，4E6多聚体构建体是SEQID NO:26的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，4E6多聚体构建体是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:26二者组合的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体，其中单体可以处于任意顺序。在一个实施方案中，4E6构建体是SEQ ID NO:6-8和27-29的任意一个或多个中提供的多聚体，或其变体。本发明还考虑更高级的多聚体，如由6-10个亚基组成的多聚体。
在一个实施方案中，4E6构建体包含SEQ ID NO:64，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体包含SEQ ID NO:65，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体包含SEQ ID NO:42的CDR1序列、SEQ ID NO:52的CDR2序列及SEQ ID NO:64和/或SEQ ID NO:65的任意一个或多个的CDR3序列，或其变体。在一个是实施方案中，4E6构建体是人源化或人工程化序列，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体如SEQ ID NO:28中所提供，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体如SEQ ID NO:29中所提供，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体包含SEQ ID NO:35、42、46、52、57、64或70，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体包含SEQ ID NO:36、42、47、52、58、65或71，或其变体。
在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:1的4E6多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ IDNO:26的4E6Hu多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码4E6Hu多肽的一个或多个CDR区（即SEQ ID NO:42、52和64）的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码4E6多肽的一个或多个CDR区（即SEQ ID NO:42、52和65）的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:65的CDR3区的核酸，或其变体。
7A12家族
在一个实施方案中，NB剂是7A12，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体是SEQ ID NO:2的单体，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID NO:2的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，7A12多聚体构建体是SEQ ID NO:2的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体是SEQ ID NO:9-11的任意一个或多个中提供的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体包含SEQ ID NO:63。在一个实施方案中，7A12构建体包含SEQ ID NO:41的CDR1序列、SEQ ID NO:51的CDR2序列及SEQ ID NO:63的CDR3序列，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体是人源化或人工程化序列，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体如SEQ ID NO:10中所提供，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体如SEQ ID NO:11中所提供，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体包含SEQ ID NO:34、41、45、51、56、63或69，或其变体。还考虑更高级的多聚体，如由6-10个亚基组成的多聚体。
在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:2的7A12多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQID NO:41、51和63的CDR区中的一个或多个的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:63的CDR3区的核酸，或其变体。
10F1家族
在一个实施方案中，NB剂是10F1，或其变体。在一个实施方案中，10F1构建体是SEQ ID NO:3的单体，或其变体。在一个实施方案中，10F1构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID NO:3的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，10F1多聚体构建体是SEQ ID NO:3的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，10F1构建体是SEQ ID NO:12-16的任意一个或多个中提供的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，10F1构建体包含SEQ ID NO:68，或其变体。在一个实施方案中，10F1构建体包含SEQ ID NO:44的CDR1序列、SEQ ID NO:55的CDR2序列及SEQ ID NO:68的CDR3序列，或其变体。在一个实施方案中，10F1构建体是人源化或人工程化序列，或其变体。在一个实施方案中，10F1构建体包含SEQ ID NO:15，或其变体。在一个实施方案中，10F1构建体包含SEQ ID NO:16，或其变体。在一个实施方案中，10F1构建体包含SEQ ID NO:40、44、50、55、62、68或72，或其变体。还考虑更高级的多聚体，如由6-10个亚基组成的多聚体。
在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:3的10F1多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQID NO:44、55和68的CDR区中的一个或多个的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:68的CDR3区的核酸，或其变体。
11D1家族
在一个实施方案中，NB剂是11D1，或其变体。在一个实施方案中，11D1构建体是SEQ ID NO:4的单体，或其变体。在一个实施方案中，11D1构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID NO:4的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，11D1多聚体构建体是SEQ ID NO:4的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，11D1构建体是SEQ ID NO:17-19的任意一个或多个中提供的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，11D1构建体包含SEQ ID NO:67，或其变体。在一个实施方案中，11D1构建体包含SEQ ID NO:43的CDR1序列、SEQ ID NO:54的CDR2序列及SEQ ID NO:67的CDR3序列，或其变体。在一个实施方案中，11D1构建体是人源化或人工程化序列，或其变体。在一个实施方案中，11D1构建体包含SEQ ID NO:18，或其变体。在一个实施方案中，11D1构建体包含SEQ ID NO:19，或其变体。在一个实施方案中，11D1构建体包含SEQ ID NO:39、43、49、54、61、67或71，或其变体。还考虑更高级的多聚体，如由6-10个亚基组成的多聚体。
在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:4的11D1多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQID NO:43、54和67的CDR区中的一个或多个的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:67的CDR3区的核酸，或其变体。
11H6家族
在一个实施方案中，NB剂是11H6，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是SEQ ID NO:5的单体，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是SEQ ID NO:30的单体，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID NO:5的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID NO:30的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是包含有效连接的两个或更多个单体的多聚体，或其变体（例如SEQ ID NO:88），其中所述两个或更多个单体为SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:30二者的组合，其中所述单体可以处于任意顺序。还考虑更高级的多聚体，如由6-10个亚基组成的多聚体。
在一个实施方案中，11H6多聚体构建体是SEQ ID NO:5的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，11H6多聚体构建体是SEQ ID NO:30的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，11H6多聚体构建体是SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:30二者组合的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体，其中单体可以处于任意顺序。在一个实施方案中，11H6构建体是SEQ ID NO:20-22和31-33的任意一个或多个中提供的多聚体，或其变体。
在一个实施方案中，11H6构建体包含SEQ ID NO:66或83，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体包含SEQ ID NO:43的CDR1序列、SEQ ID NO:53的CDR2序列及SEQ ID NO:66的任意一个或多个的CDR3序列，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是人源化或人工程化序列，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体如SEQ ID NO:31中所提供，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体如SEQ ID NO:32中所提供，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体如SEQ ID NO:33中所提供，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体包含SEQ ID NO:37、43、48、53、59、66或70，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体包含SEQ ID NO:38、43、48、53、60、66或71，或其变体。
在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:5的11H6多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQID NO:30的11H6Hu多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:43、53和66的CDR区中的一个或多个的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ IDNO:66的CDR3区的核酸，或其变体。
所考虑的其他NB剂变体
在一个实施方案中，本发明的NB剂是包含选自11D1、11H6、10F1、7A12和4E6的至少两个不同亚基的多聚体构建体，或其变体。在一个实施方案中，多聚体构建体中的具体顺序包含交替亚基。SEQ ID NO:84中提供示例性构建体。考虑亚基在多聚体NB构建体内的其他排列。基于本文的公开内容和可选地在有限程度的常规实验后，技术人员通常将能够确定和选择适宜的取代、缺失或插入，或其适宜组合，该常规实验可以例如涉及引入有限数目的可能取代，和确定它们对这样获得的NB构建体的特性的影响。
除所公开的本文提供的示例性NB多肽构建体外，本发明还涵盖编码本发明公开内容所涵盖的任何NB剂的核苷酸，其非限制性地包括：DNA和RNA序列或其变体，可以是分离的或在重组载体中的等等，和/或为编码区或片段，包括尤其是编码所公开的NB构建体的CDR3区的片段。在一个实施方案中，NB剂是编码表1-4中提供的序列中任一个的NB构建体的核酸。在一个实施方案中，NB剂是编码SEQ ID NO:1-5、2、3、4、5、26、30和87中任一个的4E6构建体的核酸。在一个实施方案中，NB剂是编码SEQ ID NO:41-44、51-55和63-68中任一个的核酸。在一个实施方案中，NB剂是编码SEQ ID NO:41-44、51-55和63-68中任一个的核酸。
下文表1-4中提供本发明的示例性序列。表头的术语“ID”指给定的SEQ ID NO。对于每一种NB构建体，FR和CDR序列的优选组合在本申请通篇中可互换使用。
表1：来自最初筛选的单价/单体DR5结合组分的多肽序列，附SEQ IDNO
Figure BDA00002226856200121
Figure BDA00002226856200131
表2：具有可选的接头序列的多价抗-DR5NB构建体的多肽序列，附SEQ ID NO
Figure BDA00002226856200132
Figure BDA00002226856200151
表3：人优化的核苷酸(NT)和多肽(AA)序列
Figure BDA00002226856200171
Figure BDA00002226856200191
表4：CDR和构架的序列，以及针对式I，即FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，提供的优选组合
 克隆   FR1   ID   CDR1   ID   FR2   ID
 7A12   evqlvesggglvqaggslrlscaasgrtfs   34   NYAMG   41   wfrqapgkerefva   45
 4E6 hu   evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfg   35   SIRVG   42   wfrqapgkgrefvs   46
 4E6   evqlvesgggsvqagdslrlscaasgrtfg   36   SIRVG   42   wfrqtpgkerefva   47
 11H6 hu   evqllesggglvqpggslrlscaasgtfdk   37   INNMG   43   wyrqapgkqrdlva   48
 11H6   evqlvesggglvqpggslrlscaasgtfdk   38   INNMG   43   wyrqapgkqrdlva   48
 11D1   evqlvesggglvqpggslrlscaasgsids   39   INNMG   43   wyrqapgkqrelva   49
  10F1   evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfs   40   RYWMY   44   wvrqapgkglewvs   50
表4(续)
 克隆   CDR2   ID   FR3   ID
 7A12   ALNWSGGSTYYVDSVKG   51   rftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaa   56
 4E6 hu   AINRNDGTTYYADSVKG   52   rftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaa   57
 4E6   AINRNDGTTYYADSVKG   52   rftisrdnakntvymqmaslkpedtavyycaa   58
 11H6 hu   QITPGGITDYADSVKG   53   rftisrdnskntlylqmnslrpedtavyycna   59
 11H6   QITPGGITDYADSVKG   53   rftisrdnakdtmylqmnslkpedtavyfcna   60
 11D1   EITPRGRTNYADDSEKS   54   rftisrdnakrtvnlqmnslkpedtavyycna   61
 10F1   AINSGGGDTYYRDSVRG   55   rftisrdnfkntlylqmnslksedtavyycak   62
表4(续)
  克隆   CDR3   ID   FR4   ID
  7A12   AGSFSLGGRPYGDDY   63   wgkgtlvtvss   69
  4E6 hu   GLQYNRAADRVPVGAVY   64   wgqgtlvtvss   70
  4E6   GLQYNRSADRVPVGAVY   65   wgqgtqvtvss   71
  11H6 hu   EILKRAYIDVYVNY   66   wgqgtlvtvss   70
  11H6   EILKRAYIDVYVNY   66   wgqgtqvtvss   71
  11D1   EVRERGTSWYRPDY   67   wgqgtqvtvss   71
  10F1   AEGPPTFSLIRTMTVDP   68   gaqgtqvtvss   72
下文提供本发明的NB剂的其他方面。
本文所述的化合物、(单价或多价)多肽和组合物可以是这样，它们结合DR5，但不结合DR5上的TRAIL结合部位，和/或可以是这样，它们不与TRAIL竞争结合DR5。这类化合物和多肽可以是这样，它们与DR5的结合诱导、触发、增加或增强DR5介导的信号发放，尤其是在其上存在DR5的细胞中触发或诱导凋亡。该化合物和多肽还可以是这样，它们增加或增强TRAIL与其受体结合时由TRAIL和DR5介导的信号发放。根据此方面，TRAIL以及本文所述化合物/多肽二者与同一受体的结合可以导致对这种信号发放的协同效应。
在一个具体方面，本文所述化合物和多肽是针对DR5的多聚体化合物和多肽(如本文所述)。特别地，本文所述化合物和多肽可以是多聚体多肽，其能够使细胞膜上的DR5多聚化，因此能够诱导、触发、增加或增强DR5介导的信号发放，更尤其是能够在其上存在DR5的细胞中触发或诱导凋亡。在一个实施方案中，本文公开的该单体或多聚体化合物或多肽可以在DR5上的TRAIL结合部位处或其附近结合DR5，和/或可以与TRAIL竞争结合DR5。在一个实施方案中，它们不结合DR5上的TRAIL结合部位，基本不妨碍或阻止TRAIL与DR5的结合，和/或不与TRAIL竞争结合DR5，甚至可以是这样，它们增加或增强TRAIL与其受体结合时由TRAIL和DR5介导的信号发放（这又可以导致在由DR5介导的信号发放上的协同效应）。在一个实施方案中，氨基酸序列包含源自天然存在的TRAIL配体的部分，即它包含由天然TRAIL配体多肽或该TRAIL-配体的任何TRAIL-受体结合片段构成的区段。
本发明的多肽和组合物可以用来预防和治疗与DR5相关的疾病和障碍。具体而言，“与DR5相关的疾病和障碍”定义为可以通过对有需要（即患有该疾病或障碍或其至少一种症状和/或有吸引或发展该疾病或障碍的风险）的受试者适宜地施用本发明的多肽或组合物（尤其是其药物活性量）和/或对DR5或涉及DR5的生物学途径或机制具有活性的已知有效成分（尤其是其药物活性量）来预防和/或治疗的那些，所述有效成分导致对DN5介导的信号发放的调节，即激动或拮抗。如下文所列，与DR5相关的疾病和障碍尤其包括可通过在疾病的靶标细胞或组织中诱导凋亡来治疗的疾病和障碍。
与DR5相关的疾病和障碍尤其可以是可以通过触发、起始、增加或增强DR5所涉及的信号发放、机制、反应和效应（换言之，通过对DR5或DR5介导的信号发放产生激动作用）来治疗的疾病和障碍。更特别地，与DR5相关的疾病和障碍可以是可以通过在待治疗的受试者的一种或多种细胞或组织中触发、起始、增加或增强细胞凋亡来治疗的疾病和障碍。
在一个实施方案中，本发明的NB剂是TRAIL受体DR5的激动剂，其具有用于治疗范围广泛的与DR5相关的疾病的潜力。基于本文的公开内容，对技术人员而言，与DR5相关的疾病和障碍的实例将显而易见。在一个实施方案中，本发明的NB剂在增生性疾病的治疗中具有效用，该增生性疾病包括：例如，癌症，如实体瘤，原发性和转移性癌症，如肾细胞癌和肺癌（例如小细胞肺癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”），胰腺、造血系统恶性肿瘤，神经胶质瘤，星形细胞瘤，间皮瘤，结肠直肠癌，前列腺癌，骨肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤（包括但不限于伯基特淋巴瘤），乳腺癌，子宫内膜癌，肝癌，胃癌，皮肤癌，卵巢癌和任意来源（例如肺、头和颈、乳腺、甲状腺、子宫颈、皮肤、食管等）的鳞状细胞癌；以及液体癌症，例如白血病，尤其包括T细胞白血病（如急性T细胞白血病（T-ALL））、急性B细胞白血病（B-ALL）、慢性骨髓性白血病（CML）、急性骨髓性白血病（AML）、浆细胞性骨髓瘤和多发性骨髓瘤（MM）。在一个实施方案中，本发明的NB剂在非癌适应症的治疗中具有效用，该非癌适应症包括但不限于，例如，炎性和自身免疫性疾病，如系统性红斑性狼疮、桥本病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主疾病、干燥综合症、恶性贫血、艾迪生病、硬皮病、肺出血肾炎综合症、克罗恩病、自身免疫性溶血性贫血、不育、重症肌无力、多发性硬化、突眼性甲状腺肿、血栓形成性血小板减少症、血小板减少性紫癜、胰岛素依赖性糖尿病、变态反应；哮喘、特应性疾病；动脉硬化；心肌炎；心肌病；肾小球肾炎；和再生不良性贫血。
因此，非限制性地，本发明的氨基酸序列和多肽可以例如用来预防和/或治疗目前用可调节DR5介导的信号发放的有效成分来预防或治疗的所有疾病和障碍，如本文和所引用的本领域参考文献中提到的那些。在一个实施方案中，本发明的多肽可以用来预防和/或治疗目前正在开发、已经提出或以后将要提出或开发以这样的有效成分进行治疗的所有疾病和障碍。在一个实施方案中，可以想到，由于下文进一步描述的本发明多肽的有利特性，本文的多肽可以用来预防和治疗不同于这些已知有效成分正在用于的或将要提出或开发用于的那些疾病的疾病和障碍；和/或本发明的多肽可以提供用于治疗本文所述疾病和障碍的新方法和新方案。
对技术人员而言，本发明的氨基酸序列和多肽的其他应用和用途将从本文的进一步公开变得显而易见。
在一个实施方案中，本发明提供药物活性剂，以及包含该药物活性剂的组合物（无论是本文所述的完整多肽，和/或是片段和/或所述多肽或片段的多聚体变体，全部在本文中可以被泛称为“本发明的组合物”），其可以用于诊断、预防和/或治疗与DR5相关的疾病和障碍及本文提到的其他疾病和障碍；提供用于诊断、预防和/或治疗这类疾病和障碍的方法，包括施用和/或使用所述活性剂和组合物。
在一个实施方案中，本发明提供药物活性剂、组合物和/或方法，与目前使用和/或本领域已知的活性剂、组合物和/或方法相比，其具有某些优势。这些优势将从下文的进一步描述变得显而易见。
在一个实施方案中，本发明提供针对DR5、尤其是针对来自温血动物的DR5、更尤其是针对来自哺乳动物的DR5和尤其是针对人DR5的氨基酸序列；提供包含至少一个该氨基酸序列或基本上由至少一个该氨基酸序列组成的蛋白质和多肽。
在一个实施方案中，本发明提供这样的氨基酸序列和蛋白质和/或多肽，其适用于温血动物中、尤其是在哺乳动物中和尤其是在人类中用于预防、治疗和/或诊断用途。
在一个实施方案中，本发明提供这样的氨基酸序列和蛋白质和/或多肽，其可以用于在温血动物中、尤其是在哺乳动物中和更尤其是在人类中预防、治疗、减轻和/或诊断与DR5相关和/或由DR5介导的一种或多种疾病、障碍或病症（如本文提到的疾病、障碍和病症）。
在一个实施方案中，本发明提供这样的本发明组合物，其用于制备药物或兽医组合物，该组合物用于在温血动物中、尤其是在哺乳动物中和更尤其是在人类中预防和/或治疗与DR5相关和/或由DR5介导的一种或多种疾病、障碍或病症（如本文提到的疾病、障碍和病症）。
在一个实施方案中，本发明提供针对DR5和/或能够特异性结合DR5的本发明组合物；以及包含至少一个这样的氨基酸序列的化合物和构建体，尤其是蛋白质和多肽。更特别地，本发明提供氨基酸序列，其可以特异性结合DR5细胞表面受体，例如，在例如NCBI蛋白质数据库中以检索号“BAA33723”定义的DR5细胞表面受体。特别地，本发明提供氨基酸序列，其可以特异性结合DR5细胞表面受体，例如，在例如NCBI蛋白质数据库中以检索号“BAA33723”定义的DR5细胞表面受体，但不结合至少另一种TRAIL受体，如TRAIL-R3和TRAIL-R4。还已知人DR5的短的剪接变体（GenBank登录号NP_671716）。
在一个实施方案中，本发明提供可以以本文提供的可药用范围内的亲和力（适宜地测量和/或表示为KD-值（实际或表观）、KA-值（实际或表观）、kon-速率和/或koff-速率，或备选地测量和/或表示为IC50值）结合DR5的氨基酸序列；以及包含至少一个这样的氨基酸序列的化合物和构建体，尤其是蛋白质和多肽。
在一个实施方案中，本发明的组合物是这样，它们：
a）以10-5至10-12摩尔/升或更小、优选10-7至10-12摩尔/升或更小和更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数（KD）（即以105至1012升/摩尔或更大、优选107至1012升/摩尔或更大和更优选108至1012升/摩尔的结合常数（KA））结合DR5；和/或
b）以102M-1s-1至约107M-1s-1之间、优选103M-1s-1和107M-1s-1之间、更优选104M-1s-1和107M-1s-1之间、如105M-1s-1和107M-1s-1之间的kon-速率结合DR5；和/或
c）以1s-1（t1/2=0.69s）和10-6s-1（提供近乎不可逆的复合，t1/2为多天）之间、优选10-2s-1和10-6s-1之间、更优选10-3s-1和10-6s-1之间、如10-4s-1和10-6s-1之间的koff速率结合DR5。
在一个实施方案中，本发明的组合物（无论单价或多价）以低于100nM、和/或低于10nM、和/或低于1nM、如低于500pM的亲和力结合DR5。在一个实施方案中，本发明的组合物是四价组合物。在一个实施方案中，本发明的组合物是五价组合物。
在一个实施方案中，本发明的组合物（无论单价或多价）将以低于100nM、优选低于10nM、更优选低于1nM、如低于500pM的IC50在多种类型癌细胞（例如至少一种类型）中特异性诱导凋亡。在一个实施方案中，按照在例如实验部分中提到的非肿瘤细胞系，例如Huvec、IMR-90和ARPE-19中所测量的，本发明的多价氨基酸序列在肿瘤细胞系中的效力比在正常（非肿瘤）细胞系中高至少10倍，或比在正常（非肿瘤）细胞系中高至少100倍。见实施例和表13。
为了结合DR5，本发明的组合物通常将在其氨基酸序列内包含一个或多个氨基酸残基或一个或多个氨基酸残基区段（即，每“区段”包含两个或更多个氨基酸残基，这些氨基酸残基相互邻近或相互靠近，即在氨基酸序列的一级（线性）或四级（构象）结构中），通过所述氨基酸残基或氨基酸残基区段，本发明的氨基酸序列可以结合DR5，因此，该氨基酸残基或氨基酸残基区段形成用于结合DR5的“部位”（本文中也称为“抗原结合部位”或“表位”）。本文在实施例中提供表位作图实验。
在一个实施方案中，本文提供的本发明组合物为基本上分离的形式，或形成本发明蛋白质或多肽的部分，其可以包含本文公开的一个或多个氨基酸序列或基本上由本文公开的一个或多个氨基酸序列组成。在一个实施方案中，本发明的组合物可以进一步包含一个或多个额外的氨基酸序列。在一个实施方案中，该额外序列通过一个或多个适宜的接头连接。非限制性地，本发明的组合物可以用作蛋白质或多肽中的结合单位。这样的本发明组合物可以包含可用作额外结合单位（即针对DR5以外的一个或多个其他靶标）的一个或多个其他氨基酸序列，从而提供本发明的单价、多价或多特异性多肽。该蛋白质或多肽也可以为基本上分离的形式。
在一个实施方案中，本发明的组合物基本上由单条氨基酸链组成，该氨基酸链不通过二硫键与任何其他氨基酸序列或链（但可以包含或不包含一个或多个分子内二硫键）或药物相关组合物连接。作为分子内二硫键的实例，已知驼源VHH构建体有时可以在CDR3和CDR1或FR2之间包含二硫键。在一个实施方案中，可以将本发明的组合物相互连接和/或与其他氨基酸序列连接（例如通过二硫键）来提供备选的肽构建体（例如Fab’片段、F(ab’)2片段、ScFv构建体、“双抗体”(diabody)及其他多价和/或多特异性构建体。见Holliger和Hudson,Nat Biotechnol.2005Sep;23(9):1126-36的综述）。药物相关组合物的实例包括治疗疾病的药物、或增加半衰期、靶向特定组织和/或杀死靶细胞的组合物。
在一个实施方案中，本发明的组合物基本上由单条氨基酸链组成，该氨基酸链通过至少一个分子间二硫键与任何其他氨基酸序列或链（其任一可以包含或不包含一个或多个分子内二硫键）或药物相关组合物连接。
在一个实施方案中，当本发明的组合物旨在用于对受试者施用（例如用于本文所述的治疗和/或诊断目的）时，它是并非天然存在于该受试者中的氨基酸序列；或者，当其天然存在于该受试者中时，它是基本上分离的形式。
在用于药物用途的一个实施方案中，所公开的本发明的氨基酸序列（以及包含其的化合物、构建体和多肽）针对人DR5。在用于兽医目的的一个实施方案中，本发明公开的组合物针对来自待治疗的物种的DR5。在用于兽医目的的一个实施方案中，本发明公开的组合物与来自待治疗的物种的DR5交叉反应。
在一个实施方案中，本发明的氨基酸序列具有至少一个用于结合DR5的结合部位，且可以包含一个或多个其他结合部位用于结合其他表位、抗原、蛋白质或靶标。
取决于所涉及的具体疾病或障碍，可以用任何适宜的本身已知的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或动物模型、或其任何组合，测试本发明的氨基酸序列和多肽及包含本发明的氨基酸序列和多肽的组合物的功效。这些可以是例如用于测量如下的测定试验或模型：本文所述氨基酸序列或化合物对凋亡的影响、对肿瘤细胞增殖的影响和/或对在肿瘤动物模型中的肿瘤生长的影响。适宜的测定和动物模型对技术人员而言显而易见，且包括例如用于下文实验部分中和本文引用的本领域参考文献中的测定和动物模型。实例是结合测定，如ELISA、FACS或表面等离子体共振法；功能性体外测定，如使用一系列肿瘤和正常细胞系的体外细胞存活测定、使用Jurkat细胞存活检测的体外功效测定；功能性体内测定，如与提供多种功效的胱天蛋白酶3/7激活读出值（PK和PD数据）组合的单剂量体内研究。
在本发明的一个实施方案中，针对来自第一温血动物物种的DR5的氨基酸序列和多肽可以显示或不显示与来自一个或多个其他温血动物物种的DR5的交叉反应性。例如，针对人DR5的氨基酸序列和多肽可以显示或不显示与来自一个或多个其他灵长类物种（如，但不限于猕猴属（Macaca）的猴（如，且尤其是食蟹猴（Macaca fascicularis,a.k.a.,“cyno”）和/或恒河猴（Macaca mulatta））和狒狒（Papio ursinus））的DR5和/或与来自常用于疾病的动物模型（例如小鼠、大鼠、兔、猪或狗），尤其是用于与DR5相关的疾病和障碍的动物模型（如本文提到的物种和动物模型）的一个或多个动物物种的DR5具有交叉反应性。在这方面，对技术人员而言显而易见的是，从药物研发的观点看，这种交叉反应性，如果存在的话，可以具有优势，因为它允许在这类疾病模型中测试针对人DR5的氨基酸序列和多肽。本文提供的多种本发明构建体显示与cyno DR5的特异性交叉反应性。
在一个实施方案中，与来自多个哺乳动物物种的DR5交叉反应的本发明氨基酸序列和多肽通常将对用于兽医应用有利，因为这将允许在多个物种中使用相同的氨基酸序列或多肽。因此，在一个实施方案中，针对来自一个动物物种的DR5的氨基酸序列和多肽（如针对人DR5的氨基酸序列和多肽）可以用于治疗另一个动物物种，只要该氨基酸序列和/或多肽的使用在待治疗的物种中提供期望的作用。
本发明在其最广义上并不受本发明的氨基酸序列和多肽所针对的DR5的特定抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象（适用时）的限制，或不由其定义。但是，在一个实施方案中，本发明的氨基酸序列和多肽针对DR5的胞外域。在一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列和多肽针对DR5的DR5结合结构域，且如本文进一步定义。在一个实施方案中，本发明的单价或多价氨基酸序列和多肽在实验部分中所述的竞争结合测定中与DR5的天然配体竞争。在一个实施方案中，本发明的单价或多价氨基酸序列和多肽在竞争结合测定中与DR5的天然配体协同结合。
在本发明的一个实施方案中，酌情地，本发明的氨基酸序列可以结合DR5的两个或更多个抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象。在这种情况下，本发明的氨基酸序列和/或多肽所结合DR5的抗原决定簇、表位、部分、结构域或亚基可以基本相同（例如，如果DR5包含重复的结构基序或以多聚体形式存在）或可以不同（在此后一种情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以相同或不同的亲和力和/或特异性结合DR5的该不同的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基）。另外，例如，在DR5以激活构象和以失活构象存在时，本发明的氨基酸序列和多肽可以结合这些构象中的任一种，或者可以结合这两种构象（即以可以相同或不同的亲和力和/或特异性）。另外，例如，本发明的氨基酸序列和多肽可以与DR5结合相关配体时的DR5构象结合，或可以与DR5未结合相关配体时的DR5构象结合，或者可以与两种构象均结合（再次，以可以相同或不同的亲和力和/或特异性）。
还预期，本发明的氨基酸序列和多肽可以广泛结合DR5的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因变体、部分和片段；或至少结合包含一个或多个如下抗原决定簇或表位的DR5类似物、变体、突变体、等位基因变体、部分和片段，所述抗原决定簇或表位与本发明的氨基酸序列和多肽所结合的DR5中（例如野生型DR5中）的抗原决定簇（一个或多个）或表位（一个或多个）基本上相同。同样，在此后一种情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以这样的亲和力和/或特异性结合该类似物、变体、突变体、等位基因变体、部分和片段，该亲和力和/或特异性与本发明的氨基酸序列结合（野生型）DR5的亲和力和特异性相同或不同（即高于或低于）。同样包含于本发明的范围内的是，本发明的氨基酸序列和多肽结合DR5的一些类似物、变体、突变体、等位基因变体、部分和片段，但不结合其他类似物、变体、突变体、等位基因变体、部分和片段。
一般地，在DR5以单体形式和以一种或多种多聚体形式存在时，本发明的范围涵盖，本发明的氨基酸序列和多肽只结合单体形式的DR5、只结合多聚体形式的DR5，或结合单体和多聚体形式二者。同样，在后一种情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以这样的亲和力和/或特异性结合单体形式，该亲和力和/或特异性与本发明的氨基酸序列结合多聚体形式的亲和力和特异性相同或不同（即高于或低于）。
另外，在DR5可以结合其他蛋白质或多肽以形成蛋白质复合体（例如，具有多个亚基）时，本发明的范围涵盖，本发明的氨基酸序列和多肽结合处于其非结合状态的DR5、结合处于其结合状态的DR5、或结合二者。在所有这些情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以这样的亲和力和/或特异性结合该多聚体或该缔合的蛋白质复合体，该亲和力和/或特异性可以与本发明的氨基酸序列和多肽结合处于其单体和非结合状态的DR5的亲和力和/或特异性相同或不同（即高于或低于）。
在一个实施方案中，如对技术人员而言将是显而易见的，包含两个或更多个针对DR5的氨基酸序列的本发明组合物可以以高于对应的单体氨基酸序列（一个或多个）的亲合力（avidity）结合DR5。例如，但非限制性地，包含有效连接的针对DR5的相同或不同表位的两个、三个、四个、五个、六个、八个、十个或更多个氨基酸序列单体单位的蛋白质或多肽可以（且通常将）以高于每一种不同单体的亲合力结合DR5，且包含两个、三个、四个或更多个针对DR5的氨基酸序列的蛋白质或多肽也可以（且通常将）以更高的亲合力结合DR5的多聚体。在一个实施方案中，本发明的组合物是由通过氨基酸接头连接的四个针对DR5的单体构成的单条多肽链。在一个实施方案中，本发明的组合物是由通过氨基酸接头连接的五个针对DR5的单体构成的单条多肽链。
通常，如对技术人员而言显而易见的，本发明的氨基酸序列和多肽将至少结合从生物学和/或治疗的观点看最相关的那些DR5形式（包括单体、多聚体和缔合形式）。
本发明还涵盖：使用包含本发明的氨基酸序列和多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因变体和/或衍生物的组合物，和/或使用包含一种或多种这样的组合物或基本上由一种或多种这样的组合物组成的蛋白质或多肽，条件是这些适用于本文所设想的用途。在一个实施方案中，组合物将包含（至少部分）功能性抗原结合部位用于结合DR5。在一个实施方案中，组合物将能够特异性结合DR5。在一个实施方案中，组合物将能够以本文所提供的亲和力（适宜地测量和/或表示为KD-值（实际或表观）、KA-值（实际或表观）、kon-速率和/或koff-速率，或备选地测量和/或表示为IC50值，如本文进一步描述）结合DR5。组合物的一些非限制性实例将从本文的进一步描述变得显而易见。还可以通过适宜地组合（即，通过连接或遗传融合）本文所述的一或多个（较小的）组合物来提供本发明的其他片段或多肽。
在本发明的一个非限制性方面，本发明多肽的类似物、突变体、变体、等位基因变体和/或衍生物，与其所衍生自的氨基酸序列相比，在血清中具有增加的半衰期（如本文进一步描述）。例如，可以将本发明的氨基酸序列与一个或多个延长半衰期的基团或结构部分（如PEG）连接，以提供具有增加的半衰期的本发明氨基酸序列的衍生物。
在一个具体但非限制性方面，本发明的氨基酸序列可以是包含免疫球蛋白折叠的氨基酸序列，或者可以是能够在适宜条件（如生理条件）下形成免疫球蛋白折叠（即，通过折叠）的氨基酸序列。尤其可参考Halaby等,J.(1999)Protein Eng.12,563-71的综述。在一个实施方案中，当正确地折叠以形成免疫球蛋白折叠时，氨基酸序列能够特异性结合DR5。在一个实施方案中，该构建体能够以如本文所提供的亲和力（适宜地测量和/或表示为KD-值（实际或表观）、KA-值（实际或表观）、kon-速率和/或koff-速率，或备选地测量和/或表示为IC50值，如本文进一步描述）结合DR5。在一个实施方案中，氨基酸序列的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因变体和/或衍生物是这样，它们包含免疫球蛋白折叠，或者能够在适宜条件下形成免疫球蛋白折叠。
特别地，但非限制性地，本发明的氨基酸序列可以是基本上由四个构架区（分别为FR1、FR2、FR3和FR4）和三个散布其间的互补决定区（分别为CDR1、CDR2和CDR3）组成的氨基酸序列；或者是该氨基酸序列的任何适宜的片段（这通常将包含至少一些形成至少一个CDR的氨基酸残基，如本文进一步描述）。在一个实施方案中，这些区域按式I中所示排列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4（式I）
本发明的氨基酸序列尤其可以是免疫球蛋白序列或其适宜的片段，更尤其可以是免疫球蛋白可变结构域序列或其适宜的片段，如轻链可变结构域序列（例如VL序列）或其适宜的片段；或重链可变结构域序列（例如VH序列）或其适宜的片段。在本发明的氨基酸序列是重链可变结构域序列时，它可以是源自常规四链抗体的重链可变结构域序列（如，但不限于，源自人抗体的VH序列），或者可以是源自所谓的“重链抗体”的所谓VHH-序列。
应指出，本发明不受限于本发明的氨基酸序列（或用于表达它的本发明核苷酸序列）的来源，也不受限于用于产生或获得（或已经用于产生或获得）本发明的氨基酸序列或核苷酸序列的方式。因此，本发明的氨基酸序列可以包含天然存在的氨基酸序列（来自任何适宜的物种）或合成或半合成的氨基酸序列。在本发明的一个具体但非限制性方面，氨基酸序列是天然存在的免疫球蛋白序列（来自任何适宜的物种）或合成或半合成的免疫球蛋白序列，包括但不限于“人源化”免疫球蛋白序列（例如，部分或完全人源化的小鼠、兔或猴免疫球蛋白序列（或本领域技术人员所考虑的任何其他哺乳动物物种的免疫球蛋白序列），尤其是部分或完全人源化的驼源VHH序列或其片段），“驼源化（camelized）”免疫球蛋白序列，以及已通过诸如亲和力成熟（例如，从合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列起始）、CDR移植、镶嵌（veneering）、组合源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装等等技术及技术人员公知的用于改造免疫球蛋白序列的类似技术获得的免疫球蛋白序列；或任何以上序列的任何适宜的组合。参考例如标准手册，以及参考进一步的描述和本文提到的本领域参考文献。
类似地，本发明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成或半合成的序列，且可以是例如通过PCR从适宜的天然存在的模板（例如分离自细胞的DNA或RNA）分离的序列，已从文库（尤其是表达文库）分离出的核苷酸序列，已通过将突变引入天然存在的核苷酸序列（使用本身已知的任何适宜的技术，如错配PCR）制备的核苷酸序列，已通过使用重叠引物的PCR制备的核苷酸序列，或已用本身已知的DNA合成技术制备的核苷酸序列。
本发明的氨基酸序列尤其可以是结构域抗体（或适合用作结构域抗体的氨基酸序列）、单结构域抗体（或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列）、“dAb”（或适合用作dAb的氨基酸序列）或驼源抗体（包括但不限于VHH序列或其变体）；其他单可变结构域，或其任一种的任何适宜的片段。对于（单）结构域抗体的一般描述，还可以参考上文引用的本领域参考文献，以及EP 0368684。对于术语“dAb”，参考例如Ward等(Nature 1989Oct12;341(6242):544-6)；Holt等,Trends Biotechnol.,2003,21(11):484-490；以及参考例如WO 06/030220、WO 06/003388和其他公开的Domantis Ltd的专利申请。在本发明的一个实施方案中，单结构域抗体或单可变结构域可以衍生自某些鲨鱼物种（例如，所谓的“IgNAR结构域”，见例如WO05/18629）。
特别地，本发明的氨基酸序列可以是驼源重链可变结构域构建体（例如VHH或其变体，包括为用作人用药物而优化的变体，例如，如例如WO2008/020079中所定义）或其适宜的片段或变体。在一个实施方案中，氨基酸序列是NANOBODY(R)或其构建体。注意，NANOBODYTM、NANOBODIESTM和NANOCLONETM是Ablynx N.V.的注册商标。无论是否被“人源化”或以其他方式改变或优化，针对DR5的特异性重链可变结构域构建体都在本文中称为本发明的“NB序列”。
如本文所使用，短语“序列优化的”，或备选地，“改变或优化的序列”定义为指，置换NB剂的残基，尤其是构架区中的残基，以降低接受该NB剂施用的受试者对该NB剂发生免疫原性应答的发生率。在受试者是人的情况下，该短语包括本领域已知的使序列人源化的任何技术。
在一个实施方案中，NB剂是所谓的“VH3类”（即，与VH3类的人种系序列，如DP-47、DP-51或DP-29具有高度序列同源性的NB构建体）。在一个实施方案中，此VH3类的NB构建体包含本发明的构架区。但是，本发明在其最广义上一般地涵盖针对DR5的任何类型的NB剂。例如，在一个实施方案中，本发明还涵盖隶属于所谓的“VH4类”（即，与VH4类的人种系序列，如DP-78具有高度序列同源性的NB构建体）的NB构建体。见例如WO 07/118670。
在一个实施方案中，NB构建体（尤其是完全人源化和部分人源化的构建体）的表征在于：在一个或多个构架区序列中存在一个或多个“标志残基”。在一个实施方案中，存在于本发明的NB构建体中的构架序列可以是这样的，其氨基酸序列为驼源VHH构建体的变体。这类构架序列和备选的标志残基（的适宜组合）的一些非限制性实例出现在例如WO2008/020079，65-98页中，这些页以其整体引入作为参考。本发明涵盖，还考虑本领域已知的其他人源化或部分人源化的残基。
通常，VH或VHH构建体可以定义为具有式I的（一般）结构的氨基酸序列，其中FR1至FR4分别指构架区1至4，且其中CDR1至CDR3分别指互补决定区1至3。
在一个实施方案中，本发明的组合物可以是具有这样的氨基酸序列的NB构建体，该氨基酸序列具有式I的（一般）结构，其中，按照Kabat编号，11、37、44、45、47、83、84、103、104和108位的氨基酸残基中的一个或多个选自WO 2008/020079表A-3中提到的标志残基，且其中所述氨基酸序列与WO 2008/020079中的SEQ ID NO:1至22的构架氨基酸序列中的至少一个具有至少80%,85%,90%,95%,98%,99%或100%氨基酸同一性，其中，为了测定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基（在序列中用X表示）。
在本发明的NB剂中，包括但非限制性地多种形式或支架，CDR序列一般如表1-3中所提供，且尤其是通过表4中的SEQ ID NO明确指定。具体而言，CDR1可以是SEQ ID NO:41至44中的任一个；CDR2可以是SEQ ID NO:51至55中的任一个；而CDR3可以是SEQ ID NO:63至68中的任一个。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及可以结合和/或针对DR5的VH构建体，其适宜的片段，以及包含一个或多个该VH构建体和/或适宜的片段或基本上由一个或多个该VH构建体和/或适宜的片段组成的多肽。
一般而言，SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104提供已经针对DR5制备的许多NB剂的氨基酸序列（见表1-4）。SEQ ID NO:96-99提供编码本文提供的具体NB剂的具体核酸序列。
在一些实施方案中，本发明的组合物是例如表1至4中所示的NB剂，其可以结合和/或针对DR5，且其与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性，其中，为了测定氨基酸同一性程度的目的，忽略来自CDR序列的氨基酸残基，其中，按照Kabat编号的11、37、44、45、47、83、84、103、104和108位氨基酸残基中的一个或多个是标志残基。
在多种实施方案中，且如表4中所提供，NB构建体包含SEQ ID NO:34至40的构架1序列、SEQ ID NO:45至50的构架2序列、SEQ ID NO:56至62的构架3序列和SEQ ID NO:69至72的构架4序列。在一个实施方案中，为了测定氨基酸同一性程度，忽略SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的NB构建体的构架1序列的1至4位和27至30位氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明的NB剂和组合物可以以任何适宜的方式和从任何适宜的来源得到，且可以例如是天然存在的VHH序列（即来自适宜的驼类(Camelid)物种）或合成或半合成的氨基酸序列，包括但不限于“人源化”NB剂、“驼源化”免疫球蛋白序列（尤其是驼源化重链可变结构域序列），以及通过诸如亲和力成熟（例如，从合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列起始）、CDR移植、镶嵌、组合来自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装等技术及技术人员公知的用于改造免疫球蛋白序列的类似技术获得的NB剂；或本文进一步描述的任何前述序列的任何适宜的组合。另外，当本发明的组合物包含VHH序列时，可以按本文所述适宜地人源化该组合物，以提供本发明的一种或多种其它（部分或完全）人源化的组合物。在一个实施方案中，在本发明的组合物包含合成或半合成序列（如部分人源化的序列）时，可以可选地进一步适宜地人源化（例如，同样部分或完全人源化）该组合物。
在一个实施方案中，人源化组合物是存在至少一个这样的氨基酸残基（尤其是在至少一个构架残基中）的氨基酸序列，该氨基酸残基是人源化取代物和/或对应于人源化取代物。在该非限制性实施方案中，基于本文的公开内容，人源化取代物（及其适宜的组合）对技术人员而言显而易见。在一个实施方案中，可以通过将天然存在的VHH序列的构架区的序列与对应的一个或多个密切相关的人VH序列的构架序列相比较，确定可能有用的人源化取代物，然后可以以本身已知的任何方式将这样确定的一个或多个可能有用的人源化取代物（或其组合）引入该VHH序列。在一个实施方案中，针对对靶标的亲和力、稳定性、表达的难易和水平和/或其他希望的特性，测试所得到的人源化VHH序列。这样，利用有限程度的试误，技术人员可以根据本文的公开内容来确定其他适宜的人源化取代物（或其适宜的组合）。同样，根据前文，可以部分人源化或完全人源化本发明的组合物（的构架区）。
在一个实施方案中，本文的人源化组合物是SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104及SEQ ID NO:96-99的组合物的人源化变体。在一个实施方案中，人源化NB构建体如表3中所提供。
因此，本发明的一些其他优选的组合物是这样的组合物，其可以结合（如本文进一步定义）DR5，且其（a）是SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列之一的人源化变体；和/或（b）与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性。在一个实施方案中，为了测定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基。
在一个实施方案中，按照Kabat编号的11、37、44、45、47、83、84、103、104和108位氨基酸残基中的一个或多个选自WO 2008/020079中表A-3中提到的标志残基。
在一个实施方案中，本发明提供多个特别适于结合DR5的氨基酸残基区段（即小肽）。这些氨基酸残基区段尤其可以存在于和/或可以整合入本发明的氨基酸序列，尤其是以这样的方式，即，它们形成本发明的氨基酸序列的抗原结合部位（的部分）。由于这些氨基酸残基区段首先作为针对DR5的重链抗体或VHH序列的CDR序列产生（或者可以基于和/或衍生自所述CDR序列，如本文进一步描述），本文中通常也将它们称为“CDR序列”（即，分别为CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列）。但是，应指出，本发明在其最广义上不受限于这些氨基酸残基区段在本发明的氨基酸序列中可能具有的具体结构作用或功能，只要这些氨基酸残基区段允许本发明的氨基酸序列结合DR5即可。因此，通常，本发明在其最广泛的含义上包含任何如下氨基酸序列，该氨基酸序列能够结合DR5，且包含一个或多个本文所述的CDR序列，尤其是两个或更多个该CDR序列的适宜的组合，所述CDR序列通过一个或多个其他氨基酸序列适宜地相互连接，使得整个氨基酸序列形成能够结合DR5的结合结构域和/或结合单位。但是，还应指出，仅一个这样的CDR序列在本发明的氨基酸序列中的存在本身就可能已经足以提供能够结合DR5的本发明氨基酸序列；例如，同样可以参考WO 03/050531中描述的所谓“加速（Expedite）片段”。
在一个实施方案中，本发明的氨基酸序列可以是包含选自本文所述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列（或其任何适宜的组合）的至少一个氨基酸序列的氨基酸序列。特别地，本发明的氨基酸序列可以是包含至少一个抗原结合部位的氨基酸序列，其中该抗原结合部位包含选自本文所述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列（或其任何适宜的组合）的至少一个氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的氨基酸序列可以是包含至少一个氨基酸残基区段的任何氨基酸序列，其中所述氨基酸残基区段具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列对应于至少一个本文所述CDR序列的序列。该氨基酸序列可以包含或不包含免疫球蛋白折叠。例如，且非限制性地，这种氨基酸序列可以是免疫球蛋白序列的适宜片段，其包含至少一个该CDR序列，但又未大到足以形成（完整的）免疫球蛋白折叠（例如，同样参考WO 03/050531中描述的“加速片段”）。备选地，这种氨基酸序列可以是适宜的“蛋白质支架”，该蛋白质支架包含至少一个对应于该CDR序列的氨基酸残基区段（即，作为抗原结合部位的部分）。适合用于呈递氨基酸序列的支架对技术人员而言显而易见，且例如包括但不限于基于或衍生自免疫球蛋白的结合支架（即，非本文已描述的免疫球蛋白序列）；衍生自A蛋白结构域（例如，如AFFIBODIESTM）、tendamistat、纤连蛋白（包括III型纤连蛋白结构域）、脂笼蛋白、CTLA-4、T细胞受体、设计的锚蛋白重复序列、avimer和PDZ结构域的蛋白质支架（Binz等,Nat.Biotech 2005,Vol.23:1257）；及基于DNA或RNA的结合部分，其包括但不限于DNA或RNA适体（Ulrich等,Comb Chem.High Throughput Screen 20069(8):619-32）。
在一个实施方案中，包含这些CDR序列中一个或多个的本文任何氨基酸序列可以特异性结合DR5。在一个实施方案中，它可以以本文提供的亲和力（适宜地测量和/或表示为KD-值（实际或表观）、KA-值（实际或表观）、kon-速率和/或koff-速率，或备选地测量和/或表示为IC50值）结合DR5。
在一个实施方案中，本发明的组合物可以是包含至少一个抗原结合部位的任何氨基酸序列，其中该抗原结合部位包含选自本文所述CDR1序列、本文所述CDR2序列和本文所述CDR3序列的至少两个氨基酸序列，这样：（1）在第一氨基酸序列选自本文所述CDR1序列时，第二氨基酸序列选自本文所述CDR2序列或本文所述CDR3序列；（2）在第一氨基酸序列选自本文所述CDR2序列时，第二氨基酸序列选自本文所述CDR1序列或本文所述CDR3序列；（3）在第一氨基酸序列选自本文所述CDR3序列时，第二氨基酸序列选自本文所述CDR1序列或本文所述CDR3序列；
在一个实施方案中，本发明的组合物可以是包含至少一个抗原结合部位的氨基酸序列，其中该抗原结合部位包含选自本文所述CDR1序列、本文所述CDR2序列和本文所述CDR3序列的至少三个氨基酸序列，这样，第一氨基酸序列选自本文所述CDR1序列，第二氨基酸序列选自本文所述CDR2序列，第三氨基酸序列选自本文所述CDR3序列。CDR1、CDR2和CDR3序列的优选组合将从本文的进一步描述变得显而易见。如对技术人员而言显而易见，该氨基酸序列优选是免疫球蛋白序列（如本文进一步描述），但它还可以是例如包含适合用于呈递该CDR序列的支架的任何其他氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的组合物涉及针对DR5，尤其是针对公共数据库中提供的DR5，诸如NCBI蛋白质数据库检索号BAA33723提供的DR5，其中该氨基酸序列包含一个或多个选自以下的氨基酸残基区段：
（a）SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列；
（b）与SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列；
（c）与SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列中的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
（d）SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列；
（e）与SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列；
（f）与SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列中的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
（g）SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列；
（h）与SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列；
（i）与SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列中的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或其任何适宜的组合。
在本发明的氨基酸序列包含一个或多个根据b）和/或c）的氨基酸序列时：
（1）与对应的a）的氨基酸序列相比，b）和/或c）的氨基酸序列中的任何氨基酸取代优选是保守性氨基酸取代；和/或
（2）与对应的a）的氨基酸序列相比，b）和/或c）的氨基酸序列优选仅包含氨基酸取代，而无氨基酸缺失或插入；和/或
（3）b）和/或c）的氨基酸序列可以是使用本身已知的一种或多种亲和力成熟技术，通过亲和力成熟而自a）的氨基酸序列得到的氨基酸序列。
类似地，在本发明的氨基酸序列包含一个或多个e）和/或f）的氨基酸序列时：
（1）与对应的d）的氨基酸序列相比，e）和/或f）的氨基酸序列中的任何氨基酸取代优选是保守性氨基酸取代；和/或
（2）与对应的d）的氨基酸序列相比，e）和/或f）的氨基酸序列优选仅包含氨基酸取代，而无氨基酸缺失或插入；和/或
（3）e）和/或f）的氨基酸序列可以是使用本身已知的一种或多种亲和力成熟技术，通过亲和力成熟而自d）的氨基酸序列得到的氨基酸序列。
同样，类似地，在本发明的氨基酸序列包含一个或多个h）和/或i）的氨基酸序列时：
（1）与对应的g）的氨基酸序列相比，h）和/或i）的氨基酸序列中的任何氨基酸取代优选是保守性氨基酸取代；和/或
（2）与对应的g）的氨基酸序列相比，h）和/或i）的氨基酸序列优选仅包含氨基酸取代，而无氨基酸缺失或插入；和/或
（3）h）和/或i）的氨基酸序列可以是使用本身已知的一种或多种亲和力成熟技术，通过亲和力成熟而自g）的氨基酸序列得到的氨基酸序列。
应理解，紧前面的段落一般地也适用于包含根据a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)的一个或多个氨基酸序列的任何本发明氨基酸序列。
在此具体方面，该氨基酸序列优选包含一个或多个选自以下的氨基酸残基区段：
（i）SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列；
（ii）SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列；和
（iii）SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列；
或其任何组合。
同样，优选地，在该氨基酸序列中，至少一个所述氨基酸残基区段形成用于结合DR5的抗原结合部位的部分。
在一个非限制性方面，本发明涉及针对DR5的氨基酸序列，其包含两个或更多个选自以下的氨基酸残基区段：
a）SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列；
b）与SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列；
c）与SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列中的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d）SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列；
e）与SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列；
f）与SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列中的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g）SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列；
h）与SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列；
i）与SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列中的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，
这样，（1）在第一氨基酸残基区段对应于a）、b）或c）的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基区段对应于d)、e)、f)、g)、h)或i)的氨基酸序列之一；（2）在第一氨基酸残基区段对应于d）、e）或f）的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基区段对应于a)、b)、c)、g)、h)或i)的氨基酸序列之一；或（3）在第一氨基酸残基区段对应于g）、h）或i）的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基区段对应于a)、b)、c)、d)、e)或f)的氨基酸序列之一。
在此具体方面，该氨基酸序列优选包含两个或更多个选自以下的氨基酸残基区段：
（i）SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列；
（ii）SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列；和
（iii）SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列，
这样，（1）在第一氨基酸残基区段对应于SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基区段对应于SEQ ID NO:51至55或SEQID NO:63至68的氨基酸序列之一；（2）在第一氨基酸残基区段对应于SEQID NO:51至55的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基区段对应于SEQ IDNO:41至44或SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列之一；或（3）在第一氨基酸残基区段对应于SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基区段对应于SEQ ID NO:41至44或SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列之一。
同样，在这种氨基酸序列中，该至少两个氨基酸残基区段优选形成用于结合DR5的抗原结合部位的部分。
在一个实施方案中，尤其是当它涉及前面的段落时，本发明涉及包含根据a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)的两个或更多个氨基酸序列的氨基酸。在一个实施方案中，该氨基酸序列是NB剂的二聚体变体。在一个实施方案中，该二聚体包含的单体在单个阅读框中有效连接。在一个实施方案中，连接单体的接头序列是序列GGGGS(SEQ ID NO:81)或GGGS(SEQ ID NO:82)的多聚体或二者的组合，或选自本文作为SEQ ID NO:44、45或46提供的或如本领域已知的接头序列。
在一个实施方案中，尤其是当它涉及前面的段落时，本发明涉及包含根据a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)的三个或更多个氨基酸序列的氨基酸。在一个实施方案中，该氨基酸序列是NB剂的三聚体变体。在一个实施方案中，该三聚体包含的单体在单个阅读框中有效连接。在一个实施方案中，连接单体的接头序列是序列GGGGS(SEQ ID NO:81)或GGGS(SEQ ID NO:82)的多聚体或二者的组合，或选自本文作为SEQ ID NO:44、45或46提供的或如本领域已知的接头序列。
在一个实施方案中，尤其是当它涉及前面的段落时，本发明涉及包含根据a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)的四个或更多个氨基酸序列的氨基酸。在一个实施方案中，该氨基酸序列是NB剂的四聚体变体。在一个实施方案中，该四聚体包含的单体在单个阅读框中有效连接。在一个实施方案中，连接单体的接头序列是序列GGGGS(SEQ ID NO:81)或GGGS(SEQ ID NO:82)的多聚体或二者的组合，或选自本文作为SEQ ID NO:44、45或46提供的或如本领域已知的接头序列。
在一个实施方案中，尤其是当它涉及前面的段落时，本发明涉及包含a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)的五个或更多个氨基酸序列的氨基酸。在一个实施方案中，该氨基酸序列是NB剂的五聚体变体。在一个实施方案中，该五聚体包含的单体在单个阅读框中有效连接。在一个实施方案中，连接单体的接头序列是序列GGGGS(SEQ ID NO:81)或GGGS(SEQ IDNO:82)的多聚体或二者的组合，或选自本文作为SEQ ID NO:44、45或46提供的或如本领域已知的接头序列。
在一个实施方案中，尤其是当它涉及前面的段落时，本发明涉及包含a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)的六个或更多个氨基酸序列的氨基酸。在一个实施方案中，该氨基酸序列是NB剂的六聚体变体。在一个实施方案中，该六聚体包含的单体在单个阅读框中有效连接。在一个实施方案中，连接单体的接头序列是序列GGGGS(SEQ ID NO:81)或GGGS(SEQ IDNO:82)的多聚体或二者的组合，或选自本文作为SEQ ID NO:44、45或46提供的或如本领域已知的接头序列。
在一个实施方案中，尤其是当它涉及前面的段落时，本发明涉及包含根据a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸序列的氨基酸。在一个实施方案中，该氨基酸序列是NB剂的多聚体变体。在一个实施方案中，该多聚体包含的单体在单个阅读框中有效连接。在一个实施方案中，连接单体的接头序列选自序列GGGGS(SEQ ID NO:81)或GGGS(SEQ ID NO:82)或二者的组合中的至少一个，或选自本文作为SEQ ID NO:44、45或46提供的或如本领域技术人员已知的接头序列。
优选地，在该氨基酸序列中，CDR序列与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列中的至少一个的CDR序列具有至少70%氨基酸同一性、优选至少90%氨基酸同一性、更优选至少90%氨基酸同一性，如至少95%氨基酸同一性或更多，或甚至基本100%氨基酸同一性。可以例如通过（以本文所述的方式）测定该氨基酸序列与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104序列中的一个或多个之间的氨基酸同一性程度来测定氨基酸同一性程度，其中，忽略形成构架区的氨基酸残基。同样，可以按本文进一步描述来人源化或修饰这类氨基酸序列。
同样，这类氨基酸序列优选是这样，它们可以特异性结合DR5；且更尤其是以如本文所提供的亲和力（适宜地测量和/或表示为KD-值（实际或表观）、KA-值（实际或表观）、kon-速率和/或koff-速率，或备选地测量和/或表示为IC50值，如本文进一步描述）结合DR5。
在一个非限制性方面，本发明涉及基本上由四个构架区（分别为FR1至FR4）和三个互补决定区（分别为CDR1至CDR3）组成的氨基酸序列，其中该氨基酸序列的CDR序列与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列中的至少一个的CDR序列具有至少70%氨基酸同一性、优选至少90%氨基酸同一性、更优选至少90%氨基酸同一性，如至少95%氨基酸同一性或更多、至少98%氨基酸同一性或更多、至少99%氨基酸同一性或更多、或甚至基本100%氨基酸同一性。可以例如通过（以本文所述的方式）测定该氨基酸序列与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104序列的一个或多个之间的氨基酸同一性程度来测定此氨基酸同一性程度，其中，忽略形成构架区的氨基酸残基。可以按本文所述来进一步修饰这类氨基酸序列。
在本发明的这种氨基酸序列中，构架序列可以是任何适宜的构架序列，例如根据标准手册和本文的进一步公开及所提到的技术参考文献，适宜的构架序列的实例对技术人员而言将显而易见。
构架序列优选是免疫球蛋白构架序列或衍生自免疫球蛋白构架序列（例如通过人源化或驼源化）的构架序列（的适宜的组合）。例如，构架序列可以是衍生自轻链可变结构域（例如VL-序列）和/或衍生自重链可变结构域（例如VH-序列）的构架序列。在一个尤其优选的方面，构架序列是已经衍生自VHH-序列的构架序列（其中该构架序列可以可选地已经部分或完全人源化）或是已驼源化的常规VH序列。
构架序列优选是这样，其使得本发明的氨基酸序列是结构域抗体（或适合用作结构域抗体的氨基酸序列）；是单结构域抗体（或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列）；是“dAb”（或适合用作dAb的氨基酸序列）；或是NB剂（包括但不限于VH和/或VHH序列）。同样，例如根据标准手册和本文的进一步公开及所提到的技术参考文献，适宜的构架序列对技术人员而言将显而易见。
在一个实施方案中，如本文针对本发明的氨基酸序列的一般描述，可以使用任何前述序列的适宜的片段（或片段的组合），如包含一个或多个CDR序列的片段，该CDR序列适宜地由一个或多个构架序列位于其侧翼和/或连接（例如，以与这些CDR和构架序列在该片段所衍生自的全尺寸免疫球蛋白序列中可能的存在顺序相同的顺序）。该片段也同样可以是这样，它们包含或可以形成免疫球蛋白折叠；或备选地是这样，它们不包含或不能形成免疫球蛋白折叠。
在一方面，片段包含单个本文所述的CDR序列（且尤其是CDR3序列），该CDR序列的两侧具有构架序列（的部分）（尤其是在衍生该片段的免疫球蛋白序列中邻近该CDR序列的构架序列（一个或多个）的部分）。例如，CDR3序列之前可以是FR3序列（的部分），之后可以是FR4序列（的部分）。片段还可以包含二硫键，尤其是连接该CDR序列之前和之后的两个构架区的二硫键（为了形成这种二硫键的目的，可以使用天然存在于该构架区中的半胱氨酸残基，或备选地，可以通过合成在该构架区中加入或引入半胱氨酸残基）。在一个实施方案中，这种构建体是加速片段。这些“加速片段”的进一步描述可以同样参考WO 03/050531，以及2006年12月5日提交的Ablynx N.V.的标题为“Peptides capable of binding toserum proteins”的Ablynx N.V.的美国临时申请（发明人：Revets等）。
在一方面，本发明涉及：包含本发明的一个或多个氨基酸序列（或其适宜的片段）或基本上由本发明的一个或多个氨基酸序列（或其适宜的片段）组成、且可选地还包含一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位的NB剂，尤其是蛋白质或多肽。如技术人员从本文的进一步公开显而易见，该其他基团、残基、结构部分、结合单位或氨基酸序列可以向本发明的氨基酸序列（和/或向它存在于其中的化合物或构建体）提供或不提供其他功能性，且可以改变或不改变本发明的氨基酸序列的特性。
例如，这类其他基团、残基、结构部分或结合单位可以是一个或多个额外氨基酸序列，使得本发明化合物或构建体是（融合）蛋白质或（融合）多肽。在优选但非限制的方面，该一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位是免疫球蛋白序列。甚至更优选地，该一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位选自结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸序列、或驼源VHH构建体。
在一个实施方案中，这类基团、残基、结构部分或结合单位可以是例如化学基团、残基、结构部分，其本身可以具有或不具有生物学和/或药理学活性。例如，且非限制地，如本文进一步描述，可以将这类基团与本发明的一个或多个氨基酸序列连接，以提供本发明的氨基酸序列或多肽的“衍生物”。
包含本文所述的一个或多个衍生物或基本上由本文所述的一个或多个衍生物组成，且可选地进一步包含（可选地通过一个或多个接头连接的）一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位的化合物或构建体，也在本发明的范围之内。优选地，该一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位是氨基酸序列。
在上述化合物或构建体中，一个或多个本发明氨基酸序列和该一个或多个基团、残基、结构部分或结合单位可以直接相互连接和/或通过一个或多个适宜的接头或间隔区连接。例如，在该一个或多个基团、残基、结构部分或结合单位是氨基酸序列时，该接头也可以是氨基酸序列，使得产生的化合物或构建体是融合蛋白质或融合多肽。该接头的氨基酸序列可以如本文所提供，或者可以是本领域技术人员已知的氨基酸序列。
一般可以通过包括至少一个如下步骤的方法来制备本发明的化合物或多肽：可选地通过一个或多个适宜的接头，将本发明的一个或多个氨基酸序列与该一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位适宜地连接，以提供本发明的化合物或多肽。还可以通过一般至少包括以下步骤的方法来制备本发明的多肽：提供编码本发明的多肽的核酸，以适宜的方式表达该核酸，及回收所表达的本发明的多肽。可以以本身已知的方式进行这类方法，例如根据本文进一步描述的方法和技术，该方式对技术人员而言显而易见。
从本发明的氨基酸序列起始，设计/选择和/或制备本发明的化合物或多肽的过程在本文中也称为“格式化（formatting）”本发明的该氨基酸序列；构成为本发明化合物或多肽的一部分的本发明氨基酸称为“格式化的”或处于本发明的化合物或多肽的“格式”中。根据本文的公开内容，可以用于格式化本发明的氨基酸序列的方式的实例及这类格式的实例对技术人员而言将显而易见；且这类格式化的氨基酸序列构成本发明的其他方面。
根据一个优选方面，本发明的化合物是包含两个或更多个（优选三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多、八个或更多和/或十个或更多）针对DR5的氨基酸序列（例如本文提供的氨基酸序列）的多价多肽，所述针对DR5的氨基酸序列可选地通过一个或多个适宜的接头（其可以如本文进一步描述）或通过交联技术或通过以本领域技术人员已知的方式产生的共价键连接。在一个或多个备选的实施方案中，该多价多肽包含结合DR5以外的靶标的任选亚基。
特别地，本发明的化合物可以是这样的多价多肽，其能够诱导、触发、增加或增强由DR5介导的信号发放，更特别地，能够在其上存在DR5的细胞中触发或诱导凋亡。在一个实施方案中，该多价多肽由三个有效连接的单体DR5结合单位组成，从而产生三聚体多肽。在一个实施方案中，该多价多肽由四个有效连接的单体DR5结合单位组成，从而产生四聚体多肽。在一个实施方案中，该多价多肽由五个有效连接的单体DR5结合单位组成，从而产生五聚体多肽。在一个实施方案中，该多价多肽由六个有效连接的单体DR5结合单位组成，从而产生六聚体多肽。在一个实施方案中，该多价多肽由七个、八个、九个、十个或更多个有效连接的单体DR5结合单位组成，从而产生其他多聚体蛋白质变体。
如上文已提到，这种多聚体多肽还可以是这样，它可以结合DR5上的TRAIL结合部位，和/或它们可以与TRAIL竞争结合DR5。
多价多肽还可以是这样，它不结合DR5上的TRAIL结合部位，和/或基本上不阻止或抑制TRAIL与DR5的结合，和/或不与TRAIL竞争结合DR5，和/或甚至是这样，它们增加或增强TRAIL与其受体结合时由TRAIL和DR5介导的信号发放（其又可以对DR5介导的信号发放产生协同效应）。在一个实施方案中，该多价多肽以高于单价组合物的亲和力结合DR5。
在本发明的多价多肽中，形成结合单位的本发明的氨基酸序列可以每一个都针对DR5受体上的相同表位，例如DR5的表位，或者针对DR5上的不同表位。
在本发明的一个具体方面，与对应的本发明的氨基酸序列相比，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有增加的半衰期。基于本文的进一步公开，对技术人员而言，这类化合物和多肽的一些非限制性实例将变得显而易见，且例如包括：已通过化学修饰来增加其半衰期（例如，利用聚乙二醇化）的本发明的氨基酸序列或多肽；包含至少一个用于结合血清蛋白质（如血清白蛋白）的附加结合部位的本发明的氨基酸序列；或包含至少一个本发明的氨基酸序列且该氨基酸序列与至少一个增加本发明的氨基酸序列的半衰期的部分（且尤其是至少一个氨基酸序列）连接的本发明多肽。基于本文的进一步公开，对技术人员而言，包含这类延长半衰期的结构部分或氨基酸序列的本发明的多肽的实例将变得显而易见，且例如非限制性地包括：多肽，其中，本发明的一个或多个氨基酸序列适宜地连接于一个或多个血清蛋白质或其片段（如（人）血清白蛋白或其适宜的片段）、或一个或多个可以结合血清蛋白质的结合单位（例如，适于结合诸如血清白蛋白（如人血清白蛋白）的血清蛋白质、诸如IgG的血清免疫球蛋白或转铁蛋白的结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、dAb、适合用作dAb的氨基酸序列或NANOBODIESTM；参考本文的进一步描述和所提到的参考文献）；多肽，其中本发明的氨基酸序列连接于Fc部分（如人Fc）或其适宜的部分或片段；或多肽，其中本发明的一个或多个氨基酸序列连接于一个或多个可以结合血清蛋白质的小蛋白质或肽（如，非限制地，WO 91/01743、WO01/45746、WO 02/076489和2006年12月5日提交的Ablynx N.V.的标题为“Peptides capable of binding to serum proteins”的Ablynx N.V.的美国临时申请中所述的蛋白质和多肽）。
通常，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽优选具有比对应的本发明的氨基酸序列本身的半衰期大至少1.5倍、优选至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如，与对应的本发明的氨基酸序列本身相比，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽可以具有增加了1小时以上、优选2小时以上、更优选6小时以上，如12小时以上，或甚至24、48或72小时以上的半衰期。
在本发明的优选但非限制的方面，与对应的本发明的氨基酸序列本身相比，本发明的这类化合物或多肽具有增加了1小时以上、优选2小时以上、更优选6小时以上，如12小时以上，或甚至24、48或72小时以上的血清半衰期。
在本发明的另一优选但非限制的方面，本发明的这类化合物或多肽在人中显示至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更长的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天（如约5至10天）、优选至少9天（如约9至14天）、更优选至少约10天（如约10至15天）或至少约11天（如约11至16天）、更优选至少约12天（如约12至18天或更长）或14天以上（如约14至19天）的血清半衰期。
在另一方面，本发明涉及编码本发明的氨基酸序列或本发明的多肽（或其适宜的片段）的核酸。这种核酸在本文中还将称为“本发明的核酸”，且可以例如是遗传构建体（例如CDR片段）的形式或在载体中，如本文进一步描述。在一个实施方案中，本发明的核酸序列编码表1至4的任何一个或多个中所公开的任何一个或多个多肽的NB构建体。在一个实施方案中，本发明的核酸序列编码SEQ ID NO:1-72、81-82和87-92中提供的任何一个或多个构建体。在一个实施方案中，为在目的宿主细胞或宿主生物中进行表达而对本发明的核酸序列进行了密码子优化。在一个实施方案中，该密码子优化是为了在哺乳动物细胞中进行表达。在一个实施方案中，该密码子优化是为了在酵母细胞中进行表达。在一个实施方案中，该密码子优化是为了在大肠杆菌（E.coli）中进行表达。
在另一方面，本发明涉及表达（或处于适宜环境下能够表达）本发明的氨基酸序列和/或本发明的多肽；和/或包含本发明的核酸的宿主或宿主细胞。这类宿主或宿主细胞的一些优选但非限制的实例将从本文的进一步描述变得显而易见。
本发明还涉及产品或组合物，其包含或含有至少一个本发明的氨基酸序列、至少一个本发明的多肽（或其适宜的片段）、至少一个本发明的化合物和/或至少一个本发明的核酸，且可选地本身已知的这类组合物的一种或多种其他成分（即，取决于该组合物的预期用途）。这类产品或组合物可以是例如药物组合物（如本文所述）、兽医组合物或用于诊断用途的产品或组合物（也如本文所述）。本文提供这类产品或组合物的一些非限制性实例。
在一个实施方案中，本发明涉及NB构建体或包含NB构建体的组合物在用于体外（例如在体外测定或细胞测定中）或体内（例如在单细胞中或在多细胞生物中，且尤其是在哺乳动物中，更尤其是在人类中，如在有罹患DR5相关的疾病和障碍的风险或患有DR5相关的疾病和障碍的人类中）调节DR5的方法或组合物中的用途。
本发明还涉及用于在体外（例如在体外测定或细胞测定中）或体内（例如在单细胞中或在多细胞生物中，且尤其是在哺乳动物中，更尤其是在人类中，如在有罹患DR5相关的疾病和障碍的风险或患有DR5相关的疾病和障碍的人类中）调节DR5的方法，该方法至少包括以下步骤：以适于用至少一个本发明的氨基酸序列、NB构建体调节DR5的方式和量，使至少一个本发明的氨基酸序列、NB构建体、或包含其的组合物与DR5接触。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、NB构建体在制备用于在体外（例如在体外测定或细胞测定中）或在体内（例如在单细胞中或在多细胞生物中，且尤其是在哺乳动物中，更尤其是在人类中，如在有罹患DR5相关的疾病和障碍的风险或患有DR5相关的疾病和障碍的人类中）调节DR5的组合物（如，非限制性地，本文所述的药物组合物或制剂）中的用途。
在本发明的背景中，“调节”或“以调节”一般意指，如使用适宜的体外测定、细胞测定或体内测定（如本文提到的那些）测量的，降低或完全抑制DR5的活性，或备选地增加DR5的活性。特别地，“调节”或“以调节”可以意指，与在相同条件下但不存在本发明的NB构建体的相同测定中的DR5活性相比，使用适宜的体外测定、细胞测定或体内测定（如本文提到的那些）测量，降低或完全抑制DR5的活性，或备选地增加DR5的活性，达至少1%、优选至少5%，如至少10%或至少25%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%或更多。在一个主要实施方案中，DR5活性（尤其包括DR5介导的信号发放）需要在细胞表面形成DR5的三聚体。在一个实施方案中，本文的NB构建体通过促进DR5同型三聚体的形成，发挥作用来调节DR5活性，从而例如通过外在细胞死亡途径，增加DR5介导的凋亡起始。
如对技术人员而言显而易见，“调节”还可以涉及，与相同条件但不存在本发明的氨基酸序列、NB构建体相比，引起DR5对其一个或多个靶标、配体或底物的亲和力、亲合性、特异性和/或选择性的变化（其可以是增加或减少）；和/或引起DR5对DR5所存在于其中的介质或环境中的一种或多种条件(例如，pH、离子强度、辅因子的存在，等等)的敏感性的变化（其可以是增加或减少）。如对技术人员而言显而易见，这同样可以以任何适宜的方式和/或用本身已知的任何适宜的测定试验（如本文或本文引用的技术参考文献中所述的测定试验）来确定。
“调节”还可以意指，就DR5所涉及（或它的一种或多种底物、一种或多种配体或一种或多种途径所涉及）的一种或多种生物学或生理学机制、效应、反应、功能、途径或活性（如它的信号传导途径或代谢途径及它们的相关的生物学或生理学效应），引起变化（即，作为激动剂或作为拮抗剂的活性）。同样，如对技术人员而言显而易见，可以以任何适宜的方式和/或用本身已知的任何适宜的测定试验（体外测定和通常为细胞测定或体内测定），如本文或本文引用的技术参考文献中所述的测定试验，确定这种作为激动剂或拮抗剂的作用。特别地，作为激动剂或拮抗剂的作用可以是这样，与相同条件下但不存在本发明的NB构建体的相同测定中的生物学或生理学活性相比，使预期的生物学或生理学活性增加或减少至少1%、优选至少5%，如至少10%或至少25%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%或更多。
调节可以涉及例如降低或抑制DR5与它的底物或配体之一的结合和/或与天然配体、底物竞争结合DR5。调节还可以涉及激活DR5或它所涉及的机制或途径。调节可以是可逆或不可逆的，但为了药学和药理学目的，通常将以可逆的方式调节。
本发明还涉及用于制备或产生本文所述的氨基酸序列、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的方法。这类方法的一些优选但非限制的实例将从本文的进一步描述变得显而易见。
通常，这些方法可以包括以下步骤：
a）提供氨基酸序列组、集合或文库；
b）针对可以结合DR5和/或对DR5具有亲和力的氨基酸序列筛选该氨基酸序列组、集合、或文库；和
c）分离结合DR5和/或对DR5具有亲和力的氨基酸序列（一个或多个）。
在这种方法中，氨基酸序列的组、集合或文库可以是任何适宜的氨基酸序列的组、集合、或文库。例如，该氨基酸序列的组、集合、或文库可以是免疫球蛋白序列的组、集合、或文库（如本文所述），如幼稚(naive)免疫球蛋白序列的组、集合、或文库；合成或半合成的免疫球蛋白序列的组、集合或文库；和/或进行了亲和力成熟的免疫球蛋白序列的组、集合、或文库。
同样，在这种方法中，氨基酸序列的组、集合、或文库可以是重链可变结构域（如VH结构域或VHH结构域）或轻链可变结构域的组、集合、或文库。例如，氨基酸序列的组、集合、或文库可以是结构域抗体或单结构域抗体的组、集合、或文库，或者可以是能够作为结构域抗体或单结构域抗体发挥作用的氨基酸序列的组、集合或文库。
在此方法的优选方面，氨基酸序列的组、集合或文库可以是免疫球蛋白序列的免疫组、集合、或文库，例如源自哺乳动物，该哺乳动物已用DR5或用基于DR5或衍生自DR5的适宜的抗原决定簇，如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其他表位适宜地免疫。在一个具体方面，抗原决定簇可以是胞外部分、区域、结构域、环或其他胞外表位（一个或多个）。
在以上方法中，氨基酸序列的组、集合、或文库可以展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适宜的微生物（如酵母）上，以便于筛选。例如基于本文的进一步公开，对本领域技术人员而言，用于展示和筛选氨基酸序列（的组、集合、或文库）的适宜的方法、技术和宿主生物将显而易见。同样可以参考Hoogenboom在Nature Biotechnology，23(9):1105-1116(2005)中的综述。
在另一方面，用于产生氨基酸序列的方法至少包括以下步骤：
a）提供表达氨基酸序列的细胞的集合或样品；
b）从该细胞集合或样品，筛选表达可以结合DR5和/或对DR5具有亲和力的氨基酸序列的细胞；和
c）（1）分离该氨基酸序列；或者（2）从该细胞分离编码该氨基酸序列的核酸序列，然后表达该氨基酸序列。
例如，在期望的氨基酸序列是免疫球蛋白序列时，该细胞集合或样品可以是例如B细胞集合或样品。同样，在此方法中，细胞样品可以衍生自哺乳动物，该哺乳动物已用DR5或用基于DR5或衍生自DR5的适宜的抗原决定簇，如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其他表位适宜地免疫。在一个具体方面，该抗原决定簇可以是胞外部分、区域、结构域、环或其他胞外表位(一个或多个)。
如对技术人员而言显而易见，可以以任何适宜的方式进行以上方法。参考例如EP 0542810、WO 05/19824、WO 04/051268和WO 04/106377。优选用诸如FACS的流式细胞术技术进行步骤b）的筛选。为此，参考例如Lieby等,Blood,97(12),3820(2001)。
在另一方面，用于产生针对DR5的氨基酸序列的方法可以至少包括以下步骤：
a）提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合、或文库；
b）从该核酸序列的组、集合、或文库，筛选编码可以结合DR5和/或对DR5具有亲和力的氨基酸序列的核酸序列；和
c）分离该核酸序列，然后表达该氨基酸序列。
在这种方法中，编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合、或文库可以是例如编码幼稚(naive)免疫球蛋白序列的组、集合、或文库的核酸序列组、集合、或文库；编码合成或半合成的免疫球蛋白序列的组、集合、或文库的核酸序列的组、集合、或文库；和/或编码已进行了亲和力成熟的免疫球蛋白序列的组、集合、或文库的核酸序列的组、集合、或文库。
同样，在这种方法中，核酸序列的组、集合、或文库可以编码重链可变结构域（如VH结构域或VHH结构域）或轻链可变结构域的组、集合、或文库。在一个实例中，核酸序列的组、集合、或文库编码结构域抗体或单结构域抗体的组、集合、或文库，或能够作为结构域抗体或单结构域抗体发挥作用的氨基酸序列的组、集合、或文库。
在此方法的一个方面，氨基酸序列的组、集合、或文库可以是例如衍生自哺乳动物的核酸序列的免疫组、集合、或文库，其中所述哺乳动物已用DR5或用基于DR5或衍生自DR5的适宜的抗原决定簇，如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其他表位适宜地免疫。在一个具体方面，该抗原决定簇可以是胞外部分、区域、结构域、环或其他胞外表位（一个或多个）。
核酸序列的组、集合、或文库可以例如编码重链可变结构域或轻链可变结构域的免疫组、集合、或文库。在一个具体方面，核苷酸序列的组、集合、或文库可以编码VHH序列的组、集合、或文库。
在以上方法中，核苷酸序列的组、集合、或文库可以展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适宜的微生物（如酵母）上，以便于筛选。例如基于本文的进一步公开，对本领域技术人员而言，用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列（的组、集合、或文库）的适宜的方法、技术和宿主生物将显而易见。还参考Hoogenboom在Nature Biotechnology，23(9):1105-1116(2005)中的综述。
本发明还涉及通过以上方法，或者备选地通过包括以上方法之一及至少以下额外步骤的方法获得的氨基酸序列，所述额外步骤为：测定该免疫球蛋白序列的核苷酸序列或氨基酸序列；以已知的方式，如通过在适宜的宿主细胞或宿主生物中表达或通过化学合成来表达或合成该氨基酸序列。
同样，在以上步骤之后，可以适宜地人源化（或备选地驼源化）本发明的一个或多个氨基酸序列；和/或可以将这样获得的氨基酸序列（一个或多个）相互连接或与一个或多个其他适宜的氨基酸序列连接（可选地通过一个或多个适宜的接头），以提供本发明的多肽。同样，可以适宜地人源化（或备选地驼源化）和适宜地表达编码本发明的氨基酸序列的核酸序列；和/或可以将一个或多个编码本发明氨基酸序列的核酸序列相互连接或与编码其他适宜的氨基酸序列的一个或多个核酸序列连接（可选地通过编码一个或多个适宜的接头的核苷酸序列），然后可以适宜地表达这样获得的核苷酸序列，以提供本发明的多肽。
本发明还涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用和用途，以及用于预防和/或治疗与DR5相关的疾病和障碍的方法。一些优选但非限制的应用和用途将从本文的进一步描述变得显而易见。
在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物用于治疗疾病或障碍。
在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物之一或多种用于治疗有罹患疾病或障碍的风险或患有疾病或障碍的受试者，该疾病或障碍可以通过将药物有效量的本文描述为NB剂或NB构建体的氨基酸序列、化合物、构建体或多肽施用予有需要的受试者来预防或治疗。
在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物用于治疗与DR5相关的疾病和障碍。
本发明的其他方面、实施方案、优势和应用将从本文的进一步描述变得显而易见，其中更详细的描述和讨论了本发明。
在某些实施方案中，与“dAb”或类似的（单）结构域抗体或免疫球蛋白序列相比，本发明的NB剂VHH变体通常提供某些优势（在下文中描述），本发明的组合物也可以提供该优势。但是，对技术人员而言，显而易见的是，以下教导的更一般的方面也可以（直接地或类似地）适用于本发明的其他氨基酸序列。
定义
在本说明书、实施例和权利要求中，除非另有说明，一般适用以下定义。如下文和全文中所使用，除非另有说明或通过上下文显而易见，单数术语或短语的使用意在并入复数含义，反之亦然。
除非另有说明或定义，使用的所有术语都具有它们在本领域中的通常含义，其对技术人员而言将是显而易见的。参考例如标准手册，如Sambrook等,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"(第2版),1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；F.Ausubel等编辑,"Current protocols in molecular biology",Green Publishing and WileyInterscience,New York(1987)；Lewin,"Genes II",John Wiley&Sons,New York,N.Y.,(1985)；Old等,"Principles of Gene Manipulation:AnIntroduction to Genetic Engineering",第2版,University of CaliforniaPress,Berkeley，CA(1981)；Roitt等,"Immunology"(第6版),Mosby/Elsevier，Edinburgh(2001)；Roitt等,Roitt's Essential Immunology，第10版Blackwell Publishing,UK(2001)；和Janeway等,"Immunobiology"(第6版),Garland Science Publishing/ChurchillLivingstone,New York(2005)；以及本文引用的一般背景技术。其他参考文献包括例如以下综述：Presta,Adv.Drug Deliv.Rev.2006,58(5-6):640-56；Levin和Weiss,Mol.Biosyst.2006,2(1):49-57；Irving等,J.Immunol.Methods,2001,248(1-2),31-45；Schmitz等,Placenta,2000,21Suppl.A,S106-12；Gonzales等,Tumour Biol.,2005,26(1),31-43；其描述了用于蛋白质工程的技术，如亲和力成熟，及用于改善诸如免疫球蛋白的蛋白质的特异性和其他希望的特性的其他技术。
除非另有说明，认为可以进行且已经以本身已知的方式进行了未明确地详细描述的所有方法、步骤、技术和操作，且对技术人员而言将是显而易见的。同样参考例如标准手册及本文提到的一般背景技术和其中引用的其他参考文献。将按照IUPAC代码表提供的标准三字母或单字母氨基酸代码表示氨基酸残基。
除非另有说明，无论在本文中用来指重链抗体或指常规四链抗体，都将术语“免疫球蛋白序列”用作包括全尺寸抗体、其各单条链及其所有部分、结构域或片段（分别包括但不限于抗原结合结构域或片段，如VHH结构域或VH/VL结构域）的一般术语。
本文使用的术语“序列”（例如在如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“sdAb序列”、“VH序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”的术语中）通常用来涵盖相关氨基酸序列以及核苷酸序列或编码其的核苷酸序列，除非上下文需要更有限制性的解释。
除非另有说明，术语“核苷酸序列”和“核酸”通常可互换使用，指脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）的聚合物，除非上下文需要更有限制性的解释。
为了比较两个或更多个核苷酸序列的目的，可以计算或确定第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分比，例如，通过获取第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中在对应的位置上的核苷酸相同的核苷酸数目，将该数目除以第一核苷酸序列中的核苷酸总数，然后乘以100%。在与第一核苷酸序列比较时，将第二核苷酸序列中的每个核苷酸缺失、插入、取代或添加都看作是在单核苷酸位置上的差异。本领域技术人员还可以使用适宜的计算机算法或技术，如使用标准设置的NCBI Blastv2.0。
对于构架1（FR1），对技术人员而言显而易见的是，为了测定氨基酸同一性程度，优选忽略1至4和27至30位上的氨基酸残基。
在一个实施方案中，在两个氨基酸序列间的序列同一性程度的确定中，技术人员可以考虑所谓的“保守性”氨基酸取代。保守性取代为本领域已知，且是这样的取代，其中一个氨基酸残基用具有共同特性的同一组内的另一氨基酸残基取代。保守氨基酸组及其共同特性如下：（a）小的脂肪族非极性或弱极性残基，包括Ala、Ser、Thr、Pro和Giy；（b）极性带负电荷残基及其（不带电荷的）酰胺，包括Asp、Asn、Glu和Gln；（c）极性带正电荷残基，包括His、Arg和Lys；（d）大的脂肪族非极性残基，包括Met、Leu、He、Val和Cys；和（e）芳香族残基，包括Phe、Tyr和Trp。
尤其优选的保守性取代如下：Ala取代为Gly或取代为Ser；Arg取代为Lys；Asn取代为Gln或取代为His；Asp取代为Glu；Cys取代为Ser；Gln取代为Asn；Glu取代为Asp；Gly取代为Ala或取代为Pro；His取代为Asn或取代为Gln；Ile取代为Leu或取代为Val；Leu取代为Ile或取代为Val；Lys取代为Arg、取代为Gln或取代为Glu；Met取代为Leu、取代为Tyr或取代为Ile；Phe取代为Met、取代为Leu或取代为Tyr；Ser取代为Thr；Thr取代为Ser；Trp取代为Tyr；Tyr取代为Trp；和/或Phe取代为Val、取代为Ile或取代为Leu。
应用于本文所述多肽的任何氨基酸取代还可以基于：Schulz等,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag,1978发展的、对不同物种的同源蛋白质间氨基酸变异的频度的分析；Chou和Fasman,Biochemistry13:211,1974及Adv.Enzymol.,47:45-149,1978发展的结构形成潜能的分析；Eisenberg等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:140-144,1984、Kyte&Doolittle;J Molec.Biol.157:105-132,1981及Goldman等,Ann.Rev.Biophys.Chem.15:321-353,1986发展的蛋白质中疏水性模式的分析。上文引用的一般背景技术中给出了关于驼源VHH构建体的一级、二级和三级结构的信息，以及例如Desmyter等,Nature Structural Biology，Vol.3,9,803(1996)、Spinelli等,Natural Structural Biology(1996);3,752-757及Decanniere等,Structure,Vol.7,4,361(1999)给出了例如来自美洲驼（llama）的VHH构建体的晶体结构。在上文引用的文献中还可以找到关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基以及在这些位置上进行潜在的驼源化取代的信息。
如果氨基酸序列和核酸序列在其全长具有100%序列同一性，则将氨基酸序列和核酸序列被称为“精确相同”。
在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”指与第二序列相比，第一序列的位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应理解，两个氨基酸序列可以包含一个、两个或更多个该氨基酸差异。
当述及核苷酸序列或氨基酸序列“包含”另一核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本上由另一核苷酸序列或氨基酸序列组成”时，这一般是指，所提到的第一核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内具有一个核苷酸或氨基酸残基区段，该区段与后一序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不考虑所提到的第一序列实际上是如何产生或获得的（可以是例如本文所述的任何适宜的方法）。
术语“基本上分离的形式”是指，核酸或氨基酸序列，与它所获自的天然生物来源和/或反应介质或培养介质相比，与它在该来源或介质中通常结合的至少一种其他成分分开。“至少一种其他成分”可以是另一核酸、另一蛋白质/多肽、另一生物成分或大分子或至少一种污染物、杂质或次要成分。在一个实施方案中，当核酸序列或氨基酸序列已被纯化至少2倍、尤其是至少10倍、更尤其是至少100倍和高达1000倍或更多时，核酸序列或氨基酸序列被视为是“基本上分离”的。“基本上分离的形式”的核酸序列或氨基酸序列优选是基本上同质的，如用适宜的技术，如适宜的层析技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的。
本文使用的术语“结构域”和“结合结构域”通常指抗体链的球状区域，尤其是指重链抗体的球状区域，或指基本上由这种球状区域组成的多肽。通常，这种结构域将包含例如以片层形式或通过二硫键稳定的肽环（例如3或4个肽环）。
术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中也可以互换使用，指抗原上由抗原结合分子（如本发明的NB构建体），更特别地，由该分子的抗原结合部位识别的表位。
对特定抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质(或对其至少一部分、片段或表位)可以（特异性）结合、具有亲和力、和/或具有特异性的氨基酸序列（如本发明的NB构建体、VHH或VH构建体、抗体、或一般地抗原结合蛋白质或多肽或其片段），被称为“抗”或“针对”该抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质。
其中提到的术语“特异性”指：特定抗原结合分子或抗原结合蛋白质（如本发明的NB构建体）分子可以结合至的不同类型的抗原或抗原决定簇的数。可以根据亲和力和/或亲合性来确定抗原结合蛋白质的特异性。通常，抗原结合蛋白质（如本发明的NB构建体）将以10-5至10-12摩尔/升或更小、优选10-7至10-12摩尔/升或更小和更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数（KD）（即，以105至1012升/摩尔或更大、优选107至1012升/摩尔或更大和更优选108至1012升/摩尔或更大的结合常数（KA））结合其抗原。一般认为大于10-4摩尔/升的任何KD值（或小于104M-1升/摩尔的任何KA值）指示非特异性结合。优选地，本发明的NB构建体将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，如小于500pM的亲和力结合其期望的抗原。可以以本身已知的任何适宜的方式，测定抗原结合蛋白质与抗原或抗原决定簇的“特异性结合”，包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定（RIA）、酶免疫测定（EIA）和夹心法竞争测定，及本领域本身已知的其不同的变通形式；以及本文提到的其他技术。
用抗原与抗原结合蛋白质的平衡解离常数（KD）表示的“亲和力”是抗原决定簇和抗原结合蛋白质上的抗原结合部位间结合强度的量度：KD值越小，抗原决定簇和抗原结合分子间的结合强度越强（备选地，亲和力还可以表示为亲和力常数（KA），其是1/KD）。如对技术人员而言显而易见，取决于具体的目的抗原，可以以本身已知的方式测定亲和力。
“亲合性”(avidity)是抗原结合分子（如本发明的NB构建体）与相关抗原间结合强度的量度。亲合性与抗原决定簇和它在抗原结合分子上的抗原结合部位之间的亲和力以及存在于抗原结合分子上的相关结合部位的数目二者相关。
解离常数可以是实际或表观解离常数。用于测定解离常数的方法为本领域已知。
在描述抗原（例如蛋白质）与NB构建体或其功能片段，例如在抗体构架中的所公开的CDR、抗体片段、或抗体衍生的结合剂之间的相互作用的上下文中使用时，短语“特异性结合”或“选择性结合”指：可以确定抗原在异质的蛋白质和其他生物物质的群体中，例如在生物样品（例如血液、血清、血浆或组织样品）中的存在的结合反应。因此，在某些规定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的NB构建体、抗体或结合剂以至少两倍于背景的方式与特定抗原结合，且基本上不以显著的量结合样品中存在的其他抗原。在一个实施方案中，在规定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的NB构建体、抗体或结合剂以至少十倍于背景的方式与特定抗原结合，且基本上不以显著的量结合样品中存在的其他抗原。在这类条件下与NB构建体、抗体或结合剂的特异性结合可能需要该NB构建体、抗体或结合剂已经针对其对特定蛋白质的特异性而进行过选择。期望或适当时，可以通过扣除与例如来自其他物种（例如小鼠或大鼠）的DR5分子或构成死亡受体家族成员或亚型的其他多肽交叉反应的NB构建体或抗体，进行此选择。备选地，在一些实施方案中，选择与某些期望的分子交叉反应的NB构建体、抗体或抗体片段。
可以用多种免疫测定型式来选择与特定蛋白质特异性免疫反应的NB构建体。例如，固相ELISA免疫测定通常可以用来选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体（参见例如Harlow&Lane,Using Antibodies,A LaboratoryManual(1998)，描述了可以用于测定特异性免疫反应性的免疫测定型式和条件），且同样可以用于NB构建体结合分析。通常，特异性或选择性结合反应将产生超过背景信号至少2倍、更通常是超过背景至少10至100倍的信号。除本文所述的亲和力常数（KA）外，本发明的DR5结合性NB构建体通常还具有小于5x10-2M、小于10-2M、小于5x10-3M、小于10-3M、小于5x10-4M、小于10-4M、小于5x10-5M、小于10-5M、小于5x10-6M、小于10-6M、小于5x10-7M、小于10-7M、小于5x10-8M、小于10-8M、小于5x10-9M、小于10-9M、小于5x10-10M、小于10-10M、小于5x10-11M、小于10-11M、小于5x10-12M、小于10-12M、小于5x10-13M、小于10-13M、小于5x10-14M、小于10-14M、小于5x10-15M、或小于10-15M或更低的解离速率常数（KD）（koff/kon），且以比它结合非特异性抗原（例如人血清白蛋白“HSA”）的亲和力高至少两倍的亲和力结合DR5。
本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期一般指：构建体的血清浓度在体内降低50%所耗费的时间，所述降低可以例如由序列或化合物的降解和/或天然机制对序列或化合物的清除或隔离引起。可以以本身已知的任何方式，如通过药物代谢动力学分析，测定本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期。对本领域技术人员而言，适宜的技术显而易见。可以用诸如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积（AUC）等参数，表示半衰期。见下文实验部分，以及标准手册，如Kenneth等,Chemical Stability ofPharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists；Peters等,Pharmacokinetic analysis:A Practical Approach(1996)；由Marcel Dekker出版的Gibaldi&Perron,"Pharmacokinetics",第2修订版(1982)。术语“半衰期增加”或“增加的半衰期”指t1/2-β增加，其中t1/2-α和/或AUC或二者增加或不增加。
“与DR5相关的疾病和障碍”如上文和说明书通篇中所定义，例如前文21页段落中所定义。虽然不受限于理论，但认为DR5在这类疾病和/或障碍中的作用机制如例如21页段落中所提供。所考虑的与DR5相关的疾病和障碍的非限制性实例如本说明书通篇（包括例如21页段落中）所提供，且基于本文所提供的教导，对本领域技术人员而言，其他实例可以变得显而易见。
在本发明的背景中，“调节”或“以调节”通常意指降低或抑制靶标或抗原的活性，或备选地增加靶标或抗原的活性，如用适宜的体外测定、细胞测定或体内测定测量。特别地，“调节”或“以调节”可以指：如用适宜的体外测定、细胞测定或体内测定（通常将取决于所涉及的靶标或抗原）测量，与靶标或抗原在相同测定中在相同条件下但不存在本发明的构建体时的活性相比，降低或抑制靶标或抗原的活性，或备选地，增加靶标或抗原的（相关或预期的）生物学活性，达至少1%、优选至少5%，如至少10%或至少25%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%或更多。
如对技术人员而言显而易见，“调节”还可以涉及：与相同条件但不存在本发明的构建体时相比，引起靶标或抗原对它的配体、结合配偶体、缔合为同型多聚体或异多聚体形式的配偶体或底物中的一种或多种的亲和力、亲合性、特异性和/或敏感性的改变；和/或引起靶标或抗原对该靶标或抗原所存在的介质或环境中的一个或多个条件（如pH、离子强度、辅因子的存在等）的敏感性的改变（可以是增加或减少）。如对技术人员而言显而易见，取决于所涉及的靶标或抗原，这同样可以以任何适宜的方式和/或用本身已知的任何适宜的测定试验来测定。
在一个实施方案中，“调节”还可以指：就靶标或抗原所涉及（或它的底物（一种或多种）、配体（一种或多种）或途径（一种或多种）所涉及，如其信号传导途径或代谢途径及它们相关的生物学或生理学效应）的一种或多种生物学或生理学机制、效应、反应、功能、途径或活性，引起变化（即，取决于靶标或抗原和希望的生物学或生理学效应，作为中和剂、作为激动剂、作为拮抗剂或作为反向激动剂的活性）。如对技术人员而言显而易见，取决于所涉及的靶标或抗原，可以以任何适宜的方式和/或用本身已知的任何适宜的（体外测定，且通常为细胞测定或体内测定）测定试验来测定这种作为中和剂、作为激动剂或拮抗剂的作用。具体而言，作为激动剂或拮抗剂的作用可以是这样，与在相同测定试验中在相同条件下但不存在本发明的构建体时的生物学或生理学活性相比，使预期的生物学或生理学活性增加或减少至少1%、优选至少5%，如至少10%或至少25%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%或更多。
调节可以涉及例如靶标或抗原的变构调节；和/或降低或抑制靶标或抗原与它的底物或配体之一的结合和/或与天然配体、底物竞争结合靶标或抗原。调节还可以涉及激活靶标或抗原或它所涉及的机制或途径。调节还可以涉及，例如就靶标或抗原的折叠或构象，或就靶标或抗原的折叠、改变其构象（例如，在结合配体后）、与其他（亚）单位缔合或解离的能力，引起变化。调节还可以涉及，例如引起靶标或抗原转运其他化合物或充当其他化合物（如离子）的通道的能力的变化。
调节可以是可逆或不可逆的，但为了药学和药理学目的，通常将以可逆的方式调节。
就靶标或抗原而言，术语靶标或抗原上的“相互作用部位”意指靶标或抗原上的部位、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基区段，其可以是用于结合配体、受体或其他结合配偶体的部位、催化部位、断裂位点、用于变构相互作用的部位、涉及靶标或抗原的多聚化（如同多聚化或异多聚化）的部位；或涉及靶标或抗原的生物学作用或机制的、靶标或抗原上的任何其他部位、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基区段。更具体而言，“相互作用部位”可以是靶标或抗原上的如下任何部位、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基区段，本发明的氨基酸序列或多肽可以与之结合，由此使得靶标或抗原（和/或靶标或抗原所涉及的任何途径、相互作用、信号发放、生物学机制或生物学效应）受调节。
如果一个氨基酸序列或多肽被称作相比于第二靶标或抗原对第一靶标或抗原是“特异的”，则该氨基酸序列或多肽结合第一抗原的亲和力（如上文所述，且适宜地表示为KD值、KA值、Koff速率和/或Kon速率），以比该氨基酸序列或多肽结合第二靶标或多肽的亲和力，好至少10倍，如至少100倍、优选至少1000倍和高达10,000倍或更多。例如，第一抗原可以以这样的KD值结合靶标或抗原，该KD值比该氨基酸序列或多肽结合第二靶标或多肽的KD低至少10倍，例如低至少100倍、优选低至少1000倍，如低10,000倍或甚至更大的倍数差异。在一个实施方案中，当与第二靶标或抗原相比，氨基酸序列或多肽对第一靶标或抗原“特异”时，它是针对该第一靶标或抗原，但不针对该第二靶标或抗原的。
术语“交叉阻断（cross-block）”、“交叉阻断的（cross-blocked）”和“交叉阻断（cross-blocking）”在本文中可互换使用，指氨基酸序列或其他结合剂（如本发明的多肽）干扰本发明的其他氨基酸序列或结合剂与给定靶标的结合的能力。可以用竞争结合测定试验来测定本发明的氨基酸序列或其他结合剂能够干扰另一氨基酸序列或其他结合剂与DR5的结合的程度，从而确定是否可以根据本发明将它称为交叉阻断。一个尤其适宜的定量测定试验使用Biacore机器，其可以用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一适宜的定量交叉阻断测定试验用基于ELISA的方法测量氨基酸序列和另一结合剂之间竞争与靶标结合的竞争性。
适合用于测定氨基酸序列或其他结合剂按照本发明是否交叉阻断或是否能够交叉阻断的一个测定试验是示例性Biacore测定或示例性ELISA测定。
如果一个氨基酸序列对两个不同的抗原或抗原决定簇都具有特异性，则称该氨基酸序列对该两个不同的抗原或抗原决定簇（如来自两个不同的哺乳动物物种的血清白蛋白，如人血清白蛋白和cyno血清白蛋白）具有“交叉反应性”。
“基本上不依赖于pH”的结合在本文中一般意指，氨基酸序列在动物或人体细胞中存在的pH值（一个或多个）（如本文进一步描述）下就血清蛋白质（如血清白蛋白）而言的结合常数（KA）是该氨基酸序列在该细胞外存在的pH值（一个或多个）下就相同的血清蛋白质而言的结合常数（KA）的至少5%，如至少10%、优选至少25%、更优选至少50%、甚至更优选至少60%，如甚至更优选至少70%，如至少80%或至少90%或更多（或甚至100%以上，如110%以上、120%以上或甚至130%或更多，或甚至150%以上，或甚至200%以上）。备选地，“基本上不依赖于pH”的结合在本文中一般意指，氨基酸序列在动物或人体细胞中存在的pH值（一个或多个）（如，例如本文进一步描述，例如约5.5的pH，例如5.3至5.7）下就血清蛋白质（如血清白蛋白）而言的koff速率（通过Biacore测量-见例如实验2）是该氨基酸序列在该细胞外存在的pH值（一个或多个)(例如pH 7.2至7.4）下就相同的血清蛋白质而言的koff速率的至少5%，如至少10%、优选至少25%、更优选至少50%、甚至更优选至少60%，如甚至更优选至少70%，如至少80%或至少90%或更多（或甚至100%以上，如110%以上、120%以上或甚至130%或更多，或甚至150%以上，或甚至200%以上）。“动物或人体细胞中存在的pH值（一个或多个）”意指，可以出现在细胞内，尤其是涉及血清蛋白质的再循环的细胞内的pH值（一个或多个）。特别地，“动物或人体细胞中存在的pH值（一个或多个）”意指可以出现于涉及血清蛋白质的再循环（例如，由于胞饮作用、胞吞作用、胞转作用、胞吐作用和吞噬作用、或摄入或内化入该细胞的类似机制）的（亚）细胞区室或小泡（如内体、溶酶体或胞饮泡）内的pH值（一个或多个）。
如本文进一步描述，NB构建体中氨基酸残基的总数可以在110-120的范围，优选112-115，最优选113。但是，应指出，NB构建体的部分、片段、类似物或衍生物（如本文进一步描述）不特别地受到其长度和/或尺寸的限制，只要该部分、片段、类似物或衍生物符合本文所述的其他要求，且可选地适合用于本文的目的即可。
如本文述及的，对于本文所述多种实施方案，或对于特定实施方案(如果如此期望的话)，“优选的”（或“更优选的”、“甚至更优选的”等）适用于特定的NB化合物或其变体，或它们的用途。
NB构建体的氨基酸残基按照Kabat等“Sequence of proteins ofimmunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,Publication No.91给出的VH结构域的一般编号来编号，该编号也在文章Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000 Jun 23;240(1-2):185-195中应用于来自驼源的VHH结构域。因此，一般而言，NB构建体的FR1包含1-30位的氨基酸残基，NB构建体的CDR1包含31-35位的氨基酸残基，NB构建体的FR2包含36-49位的氨基酸，NB构建体的CDR2包含50-65位的氨基酸残基，NB构建体的FR3包含66-94位的氨基酸残基，NB构建体的CDR3包含95-102位的氨基酸残基，NB构建体的FR4包含103-113位的氨基酸残基。但是，本领域众所周知，对于VH结构域和VHH结构域，各CDR中的氨基酸残基总数可以不同，因此可能不对应于Kabat编号所示的氨基酸残基总数。作为实例，对于本文所述的本发明的NB构建体，本文表4中提供了NB构建体中其具体的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的氨基酸残基及位置。可以用诸如Kabat和Chothia的其他方法来定义具体CDR的备选形式，接触点和相互作用部位的晶体学测定可以进一步向本领域技术人员提供每个具体CDR和/或FR区的范围。
本文提供的附图、序列表和实验部分/实施例用于进一步说明本发明，除非本文明确地另有说明，否则不应解释或理解为以任何方式限制本发明和/或所附权利要求的范围。
对于重链抗体及其可变结构域的一般描述，尤其可参考本文引用的本领域文献。
按照本领域所用的命名法，存在于天然存在的重链抗体中的可变结构域也被称为“VHH结构域”，以便将其与存在于常规四链抗体中的重链可变结构域（其在本文中称为“VH结构域”）及存在于常规四链抗体中的轻链可变结构域（其在本文中称为“VL结构域”）区分开。一般而言，VHH结构域已天然地“设计”为在不存在轻链可变结构域和不存在与轻链可变结构域的任何相互作用的情况下功能性结合抗原。
如上文引用的参考文献中所提到，VHH结构域具有许多独特的结构特征和功能特性。这使得分离的VHH结构域（以及基于它的本发明组合物，与天然存在的VHH结构域共享这些结构特征和功能特性）和包含该VHH结构域的蛋白质可以高度有利地用作功能性抗原结合结构域或蛋白质。特别地，但非限制性地，VHH结构域和本发明的组合物可以作为单个相对小的功能性抗原结合结构单位、结构域或蛋白质发挥作用。这使得VHH结构域与常规四链抗体的VH和VL结构域区分开，常规四链抗体的VH和VL结构域本身通常不适合以单个抗原结合蛋白质或结构域的形式用于实际应用，而是需要以某种形式组合或与另一结构域组合来提供功能性抗原结合单位（如，在例如常规抗体片段，如Fab片段中；在由与VL结构域共价连接的VH结构域组成的ScFv片段中）。
由于这些独特特性，与常规VH和VL结构域、ScFv或常规抗体片段（如Fab或F(ab’)2片段）的应用相比，VHH结构域及基于它的本发明NB剂和组合物，以单个抗原结合蛋白质或抗原结合结构域（即，作为更大的蛋白质或多肽的部分）的形式，的应用提供了许多明显的优势。驼源VHH变体的NB构建体的优势是，例如：仅需要单个结构域来高亲和力和高选择性地结合抗原，所以无需制备或组合多个分开的结构域，也无需保证这些(两个)结构域以正确的空间构象和构型存在；可以从单个转录物表达VHH结构域，且无需翻译后折叠或修饰；可以容易地将VHH结构域改造为多价和多特异性形式（如本文进一步描述）；VHH结构域高度可溶，且没有聚集的倾向；VHH结构域对热、pH、蛋白酶和其他变性剂或条件高度稳定；VHH结构域可以容易地且相对低廉地制备和放大生产；与常规四链抗体及其抗原结合片段相比，VHH结构域相对小（单体约为15kDa，或比常规IgG小10倍），因此显示比常规四链抗体及其抗原结合片段高(更高)的组织透过性（包括但不限于实体瘤和其他致密组织）；VHH结构域可以表现出所谓的空穴（cavity）结合特性（这是因为例如与常规VH结构域相比它们具有伸展的CDR3环），因此也可以接近常规四链抗体及其抗原结合片段所不能接近的靶标和表位。
针对DR5的NB构建体
在一个具体和优选的方面，本发明提供针对DR5的NB剂，尤其是针对来自温血动物的DR5的NB剂，更尤其是针对来自哺乳动物的DR5的NB剂，尤其是针对人DR5的NB剂，该人DR5如公共数据库中，例如NCBI蛋白质数据库检索号BAA33723（SEQ ID NO:89）中所提供；以及包含至少一个这种NB剂的蛋白质和/或多肽。
特别地，本发明提供针对DR5的NB剂及包含其的蛋白质和/或多肽，其与针对DR5的常规抗体或抗体片段相比，与可以基于这类常规抗体或抗体片段的构建体（如Fab’片段、F(ab’)2片段、ScFv构建体、“双抗体”及其他多特异性构建体（见例如Holliger和Hudson,Nat Biotechnol.2005Sep;23(9):1126-36的综述））相比，以及与可以衍生自常规抗体的可变结构域的所谓“dAb”或类似的（单）结构域抗体相比，具有改善的治疗和/或药理特性和/或其他有利特性（如，例如提高的制备方便性和/或降低的商品价格）。
在一个实施方案中，如本文针对本发明治疗有用的氨基酸序列所一般地描述的，本发明的NB剂及其变体为基本上分离的形式，或形成本发明的蛋白质或多肽的部分，该蛋白质或多肽可以包含一个或多个本发明NB剂或基本上由一个或多个本发明NB剂组成。在一个实施方案中，NB剂变体可以进一步包含一个或多个额外氨基酸序列。在一个实施方案中，该一个或多个额外氨基酸序列通过一个或多个适宜的接头连接。在一个实施方案中，且非限制性地，本发明的一个或多个氨基酸序列可以用作这种蛋白质或多肽中的结合单位，该蛋白质或多肽可以任选地包含一个或多个可以作为结合单位的其他氨基酸序列（即，针对DR5以外的一个或多个靶标），以提供本发明的单价、多价或多特异性多肽。在一个实施方案中，这种蛋白质或多肽可以包含本发明的一个或多个NB剂以及可选地一个或多个（其他）多肽结构域或表位结合组合物（即，针对DR5以外的其他靶标），或基本上由其组成，它们全都可以可选地通过一个或多个适宜的接头连接，以提供单价、多价或多特异性NB剂。
在一个实施方案中，用于结合DR5的结合部位由CDR序列形成。在一个实施方案中，除至少一个用于结合DR5的结合部位外，本发明的组合物还可以包含一个或多个其他结合部位用于结合其他抗原、蛋白质或靶标。对于用于引入这类第二结合部位的方法和位置，可以参考例如Keck和Huston,Biophysical Journal,71,October 1996,2002-2011；EP 0640130；WO 06/07260；及Ablynx N.V.于2006年11月27日提交的标题为“Immunoglobulin domains with multiple binding sites”的美国临时申请。
在一个实施方案中，在本发明的氨基酸序列（或包含本发明的氨基酸序列的本发明的多肽）预期用于对受试者施用（例如为了本文所述的治疗和/或诊断目的）时，它是针对人DR5的。在用于兽医目的的一个实施方案中，本发明的组合物针对来自待治疗的物种的DR5。本文中本发明的组合物可以具有或可以不具有交叉反应性（即，对来自两个或更多个哺乳动物物种的DR5具有活性，如针对人DR5和来自本文提到的至少一个哺乳动物物种的DR5）。在一个实施方案中，本发明的NB构建体可以特异性结合DR5，但不结合DR-4、TRAIL-R3或TRAIL-R4。
在一个实施方案中，本发明的组合物可以一般地针对DR5的任何抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象（适用时）。在一个实施方案中，本发明的NB剂针对DR5的胞外域部分。
在一个具体实施方案中，本文中本发明的组合物在竞争性结合测定中与DR5的天然配体竞争。在一个实施方案中，本发明的NB剂与TRAIL竞争结合DR5。在一个实施方案中，本发明的组合物不与TRAIL竞争结合DR5。在一个实施方案中，本发明的NB剂与TRAIL协同结合DR5。
在一个非限制性实施方案中，本发明组合物的氨基酸序列和结构包含四个构架区或“FR”（或者有时也称为“FW”），其在本领域和本文中分别称为“构架区1”或“FR1”、“构架区2”或“FR2”、“构架区3”或“FR3”和“构架区4”或“FR4”；这些构架区被三个互补决定区或“CDR”中断，其在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、和“互补决定区3”或“CDR3”。在一个实施方案中，构架区序列和CDR（及其组合）是本文、尤其是表4中所述的本发明NB构建体中存在的那些。可以通过本文所述的方法获得其他适宜的CDR序列。
在一个非限制性实施方案中，本发明的CDR序列使得：
a）NB构建体可以以10-5至10-12摩尔/升或更小、优选10-7至10-12摩尔/升或更小和更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数（KD）（即，以105至1012升/摩尔或更大、优选107至1012升/摩尔或更大、和更优选108至1012升/摩尔的结合常数（KA））结合DR5；和/或
b）NB构建体可以以102M-1s-1至约107M-1s-1之间、优选103M-1s-1和107M-1s-1之间、更优选104M-1s-1和107M-1s-1之间、如105M-1s-1和107M-1s-1之间的kon-速率结合DR5；和/或
c）NB构建体可以以1s-1（t1/2=0.69s）和10-6s-1（提供近乎不可逆的复合，t1/2为多天）之间、优选10-2s-1和10-6s-1之间、更优选10-3s-1和10-6s-1之间、如10-4s-1和10-6s-1之间的koff速率结合DR5。
在一个实施方案中，本文的CDR序列是这样，其使得：本发明的单价组合物（或仅包含一个本发明NB构建体的多肽）以小于100nM、优选小于10nM、更优选小于1nM、如小于500pM的亲和力结合DR5。
可以以本身已知的方式测定本发明的NB剂对DR5的亲和力，例如，用测量本文提到的KD、KA、koff或kon的一般技术，以及本文所述的具体测定中的一些。
在一个非限制性方面，本发明涉及针对DR5的NB剂，其由四个构架区（分别为FR1至FR4）和三个互补决定区（分别为CDR1至CDR3）组成。在一个实施方案中，该NB剂是NB构建体，其中：
CDR1选自：
a)SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列中的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
CDR2选自：
a)SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO:51至55的氨基酸序列中的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
CDR3选自：
a)SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO:63至68的氨基酸序列中的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或该氨基酸序列的任何适宜的片段。
在本发明的NB剂中，尤其优选包含上文明确列出的一个或多个CDR的NB构建体；更尤其优选包含上文明确列出的两个或更多个CDR的NB构建体；最尤其优选包含上文明确列出的三个CDR的NB构建体。
下文表4中提到了CDR序列的一些尤其优选但非限制性的组合，以及CDR序列和构架序列的优选组合，表4列出了存在于多个本发明的优选（但非限制）的NB构建体中的CDR序列和构架序列。如对技术人员而言显而易见，通常优选存在于同一克隆中的CDR1、CDR2和CDR3序列组合（即，表4中的同一行上提到的CDR1、CDR2和CDR3序列，且尤其是SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104中所提供的）（但本发明在其最广义上不限于这些组合，还包含表4中提到的CDR序列的其他适宜的组合）。同样，通常优选存在于同一克隆中的CDR序列和构架序列的组合（即，表4中的同一行上提到CDR序列和构架序列，且尤其是在SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104中提供的）（但本发明在其最广义上不限于这些组合，还包含表4中提到的CDR序列和构架序列的其他适宜的组合，以及这些CDR序列和其他适宜的构架序列的组合）。
在一个实施方案中，在包含表4中提到的CDR序列组合的NB构建体中，每一个CDR都可以用选自与所提到的该CDR具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、甚至更优选至少99%序列同一性的氨基酸序列的CDR来取代。
因此，在本发明的NB构建体中，所存在的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个可以适宜地选自表4中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列；或选自与表4中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、甚至更优选至少99%“序列同一性”的CDR1、CDR2和CDR3序列；和/或选自与表4中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个具有3个、2个或仅1个“氨基酸差异”的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在此上下文中，“适宜地选自”是指，根据适用，CDR1序列选自适宜的CDR1序列（即，如本文所定义），CDR2序列选自适宜的CDR2序列（即，如本文所定义），CDR3序列选自适宜的CDR3序列（即，如本文所定义）。在一个实施方案中，选择CDR序列，使得本发明的NB构建体以本文提供的亲和力（适宜地测量和/或表示为KD-值（实际或表观）、KA-值（实际或表观）、kon-速率和/或koff-速率，或备选地测量和/或表示为IC50值）结合DR5。
在本发明的NB构建体的一个实施方案中，至少所存在的CDR3序列适宜地选自表4中所列的CDR3序列，或选自与表4中所列的CDR3序列中的至少一个具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、甚至更优选至少99%序列同一性的CDR3序列；和/或选自与表4中所列的CDR3序列中的至少一个具有3个或具有2个或只具有1个氨基酸差异的CDR3序列。
在本发明的NB构建体的一个实施方案中，所存在的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少两个分别适宜地选自表4中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列，或选自分别与表4中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个具有至少80%、和/或至少90%、和/或至少95%、和/或至少99%序列同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列；和/或选自分别与表4中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个具有3个、2个或仅1个“氨基酸差异”的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在本发明的NB构建体的一个实施方案中，至少所存在的CDR3序列适宜地选自表4中所列的CDR3序列，或选自与表4中所列的CDR3序列中的至少一个具有至少80%、和/或至少90%、和/或至少95%、和/或至少99%序列同一性的CDR3序列；并且，所存在的CDR1和CDR2序列中的至少一个适宜地选自表4中所列的CDR1和CDR2序列，或选自分别与表4中所列的CDR1和CDR2序列中的至少一个具有至少80%、和/或至少90%、和/或至少95%、和/或至少99%序列同一性的CDR1和CDR2序列；和/或选自分别与表4中所列的CDR1和CDR2序列中的至少一个具有3个、2个或仅1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列。
在本发明的NB构建体的一个实施方案中，所存在的全部三个CDR1、CDR2和CDR3序列分别适宜地选自表4中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一个实施方案中，优选表4中所列的CDR的组合（即，表4中针对相同的构建体提到的那些）。因此，在一方面，当本发明的NB构建体中的一个CDR是表4中提到的CDR序列，或适宜地选自与表4中所列的CDR序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、甚至更优选至少99%序列同一性的CDR序列，和/或选自与表4中所列的CDR序列具有3个、2个或仅1个氨基酸差异的CDR序列时，其他CDR中的至少一个且优选两个都适宜地选自隶属于表4中的同一组合（即，在表4中的同一行上提到）的CDR序列，或适宜地选自与隶属于同一组合的CDR序列(一个或多个)具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、甚至更优选至少99%序列同一性的CDR序列，和/或选自与隶属于同一组合的CDR序列(一个或多个)具有3个、2个或仅1个氨基酸差异的CDR序列。上一段中指出的其他优选性也适用于表4中提到的CDR的组合。
在本发明的NB构建体的一个实施方案中，所存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适宜地选自表4中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合之一。
根据本发明的NB构建体的一个非限制性方面：（a）CDR1具有1至12个氨基酸残基之间，通常为2至9个氨基酸残基之间，如5、6或7个氨基酸残基的长度；和/或（b）CDR2具有13至24个氨基酸残基之间，通常为15至21个氨基酸残基之间，如16和17个氨基酸残基的长度；和/或（c）CDR3具有2至35个氨基酸残基之间，通常为3至30个氨基酸残基之间，如6和23个氨基酸残基的长度。
在一个非限制性方面，本发明涉及NB构建体，其中CDR序列与SEQID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列中的至少一个的CDR序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上，如至少99%或更大的序列同一性。
通常，具有以上CDR序列的NB剂可以如本文进一步描述。在一个实施方案中，NB剂具有构架序列，构架序列也如本文进一步描述的。因此，例如，如本文所提到，这类NB剂可以是天然存在的单结构域抗体（来自任何适宜的物种）、天然存在的VHH序列（即，来自适宜的驼类物种）、或合成或半合成的氨基酸序列或NB剂，包括但不限于部分人源化的NB构建体或VHH序列、完全人源化的NB构建体或VHH序列、驼源化重链可变结构域序列，以及已经通过本文提到的技术获得的NB剂。
因此，在一个非限制性方面，本发明涉及人源化NB剂，其由四个构架区（分别为FR1至FR4）和三个互补决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中CDR1至CDR3如本文所定义，且其中该人源化NB剂包含至少一个人源化取代，尤其是在其构架序列的至少一个中的至少一个人源化取代。
在另一优选但非限制性方面，本发明涉及NB剂，其中CDR序列与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列中的至少一个的CDR序列具有至少70%氨基酸同一性、优选至少80%氨基酸同一性、更优选至少90%氨基酸同一性，如95%氨基酸同一性或更高或甚至基本上100%氨基酸同一性。此氨基酸同一性程度可以，例如通过测定该NB剂与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的序列中的一个或多个之间的氨基酸同一性程度（以本文所述的方式）来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。这类NB剂可以如本文进一步描述。
在一个非限制性方面，本发明涉及NB剂，包括但不限于NB构建体，其具有选自SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104或选自与SEQ IDNO:1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列中的至少一个具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、如至少99%或更高序列同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。
本发明的另一非限制性方面涉及SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的NB构建体的人源化变体或进一步人源化的变体，与对应的天然序列相比，其包含至少一个人源化取代，尤其是在其构架序列的至少一个中的至少一个人源化取代。
单价和多价结合多肽
本发明进一步涉及化合物，该化合物包含如下或基本上由如下组成：针对DR5、且更尤其是针对人DR5的本发明的一个或多个多肽，以及可选地包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位，其中该化合物能够增强凋亡。在一个实施方案中，本发明的一些NB剂是包含至少三个、四个、五个或更多个针对DR5受体的单价结合多肽，如本发明的针对DR5的NB剂的蛋白质。如本文所提到，在本发明的这类多价多肽中，各单价结合多肽（如NB构建体）可以针对DR5上的同一表位，或针对DR5上的不同表位。SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104中给出了本发明的这类NB多肽的一些非限制性实例。
通常，包含单个结合多肽（如，单个DR5结合亚基的本发明NB剂）或基本上由其组成的蛋白质或多肽，在本文中称为“单价”蛋白质或多肽或称为“单价构建体”。包含两个或更多个结合多肽（如，连接的至少两个本发明NB剂、或至少一个本发明的NB剂和至少一个其他NB剂或多肽构建体）或基本上由其组成的蛋白质和多肽，在本文中称为“多价”蛋白质或多肽或称为“多价构建体”，其与对应的本发明的单价结合多肽相比可以提供某些优势。这类多价构建体的具体的非限制性实例如本文所提供。
多价NB剂的具体实例包括包含两个多肽亚基的二聚体或二价构建体，包含三个多肽亚基的三聚体或三价NB剂，包含四个多肽亚基的四聚体或四价NB剂，包含五个多肽亚基的五聚体或五价NB剂，包含六个多肽亚基的六聚体或六价NB剂，或它们的其他多聚体变体。
在一个非限制性方面，本发明的三聚体NB剂包含三个本发明的单价多肽亚基或基本上由三个本发明的单价多肽亚基组成。在一个实施方案中，三聚体NB剂包含三个相同的本发明DR5结合性单价多肽亚基，在这种情况下，NB剂是多价但单特异性的三聚体。在一个实施方案中，三聚体NB剂包含第一和/或第二DR5结合性亚基和第二或第三亚基，或基本上由第一和/或第二DR5结合性亚基和第二或第三亚基组成，该第二或第三亚基可选地是特异性结合不同表位（DR5上或另一靶标上）的亚基，例如，在这种情况下，NB剂是多价且多特异性的三聚体。
在一个非限制性实施方案中，NB剂包含至少四个本发明的单价DR5结合性多肽亚基或基本上由至少四个本发明的单价DR5结合性多肽亚基组成。本发明的这种四聚体NB剂可以是单特异性的，或者可以通过可选地连接其他亚基来转化为多特异性构建体，该其他亚基特异性结合与第一DR5表位相同或不同的DR5表位和/或结合DR5以外的靶标。
在一个非限制性实施方案中，NB剂包含至少五个本发明的单价DR5结合性多肽亚基或基本上由至少五个本发明的单价DR5结合性多肽亚基组成。本发明的这种五聚体NB剂可以是单特异性的，或者可以通过可选地连接其他亚基来转化为多特异性构建体，该其他亚基特异性结合与第一DR5表位不同的DR5表位和/或结合DR5以外的靶标。
在一个非限制性实施方案中，NB剂包含六个、八个或十个本发明的单价DR5结合性多肽亚基，或基本上由六个、八个或十个本发明的单价DR5结合性多肽亚基组成。本发明的这种多聚体NB剂可以是单特异性的，或者可以通过可选地连接其他亚基来转化为多特异性构建体，该其他亚基特异性结合与第一DR5表位不同的DR5表位和/或结合DR5以外的靶标。
在一个实施方案中，与包含本发明的单体NB剂或基本上由本发明的单体NB剂组成的蛋白质或多肽相比，这类多聚体NB剂，无论是单特异性的还是多特异性的，都提供某些优势。在一个实施方案中，优势包括但不限于改善得多的对DR5，例如对人DR5的亲合性。多聚体NB剂的一些具体但非限制性的实例是SEQ ID NO:6至22、27-29、31-33和88的NB构建体。
在一个非限制性方面，本发明的多肽包含如下或者基本上由如下组成：至少一个本发明的NB剂，可选地一个或多个其他NB剂，及赋予本发明的NB剂和/或所产生的融合蛋白质至少一种期望特性的至少一个其他氨基酸序列（如蛋白质或多肽）。同样，与对应的本发明的单价NB剂相比，这类融合蛋白质可以提供某些优势。这类氨基酸序列以及这类融合构建体的一些非限制性实例将从本文的进一步描述变得显而易见。
在一个实施方案中，可以组合两个或更多个以上方面，例如，以提供包含两个本发明的NB剂和一个其他NB剂并可选地包含一个或多个其他氨基酸序列的三价双特异性构建体。这类构建体的其他非限制性实例以及在本发明中尤其优选的一些构建体将从本文的进一步描述变得显而易见。
在以上构建体中，可以将一个或多个针对DR5的结合多肽和/或其他氨基酸序列相互有效连接和/或通过一个或多个接头序列适宜地相互连接。这类接头的一些适宜但非限制性的实例将从本文的进一步描述变得显而易见。
在一个具体方面，本发明的多价化合物包含至少三个、四个、五个或更多个单价结合多肽（即亚基），且如测量的，如在例如Colo205或Jurkat细胞存活测定试验中测量的，具有低于100nM、优选低于10nM、更优选低于1nM、甚至更优选低于100pM，例如低于10pM的IC50。其他癌细胞系，例如实施例中提到的，可以用于测定IC50。此外，可以用于细胞存活测定的其它癌细胞系包括但不限于例如Jurkat、Molt4、Colo205、BxPC3、T24、Panc-1、M30、H226、H2122、H2052和MiaPaCa-2。
在一个实施方案中，在诸如Colo205或Jurkat细胞存活测定等细胞存活测定试验中，本发明的多价化合物在肿瘤细胞系中的效力比在非肿瘤细胞系中高至少10倍、优选至少100倍。
在本发明的一个具体方面，与对应的本发明的氨基酸序列相比，本发明的NB剂或包含至少一个本发明NB剂的本发明化合物、构建体或多肽可以具有增加的半衰期。基于本文的进一步公开，对技术人员而言，这类NB剂、化合物和多肽的一些非限制性实例将变得显而易见，且例如包括已通过化学修饰来增加其半衰期（例如，利用聚乙二醇化）的本发明的NB剂序列或多肽；包含至少一个额外结合部位的本发明的氨基酸序列，该额外结合部位用于结合血清蛋白质（如血清白蛋白）；或包含至少一个本发明的NB剂的本发明多肽，该NB剂与增加本发明的NB剂的半衰期的至少一个结构部分（尤其是至少一个氨基酸序列）连接。基于本文的进一步公开，对技术人员而言，包含这类延长半衰期的结构部分或氨基酸序列的本发明多肽的实例将变得显而易见；且例如包括，但不限于：其中一个或多个本发明的NB剂与一个或多个血清蛋白质或其片段（如血清白蛋白或其适宜的片段）或与可以结合血清蛋白质的一个或多个结合单位（如，例如可以结合血清蛋白质如血清白蛋白、血清免疫球蛋白（如IgG）或转铁蛋白的NB剂、驼源VHH构建体或（单）结构域抗体）适宜地连接的多肽；其中本发明的NB剂与Fc部分（如人Fc）或其适宜的部分或片段连接的多肽；或其中一个或多个本发明的NB剂与一个或多个可以结合血清蛋白质的小蛋白质或肽（如，非限制性地，Ablynx N.V.提交的WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489和WO 2006/122787、WO 2008/028977、WO 2008/043821、WO 2008/068280和WO 2009/127691中所述的蛋白质和肽）适宜地连接的多肽。
同样，如对技术人员而言显而易见，这类NB剂可以包含一个或多个额外基团、残基、部分或结合单位，如一个或多个其他氨基酸序列，尤其是一个或多个额外NB剂（即，不针对DR5），以提供二、三或更高的多特异性的NB剂构建体。
通常，具有增加的半衰期的本发明的NB剂（或包含本发明的NB剂的化合物、构建体或多肽）优选具有比对应的本发明的氨基酸序列本身的半衰期高至少1.5倍、优选至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或20倍以上的半衰期。例如，与对应的本发明的氨基酸序列本身相比，具有增加的半衰期的本发明NB剂、化合物、构建体或多肽可以具有增加了1小时以上、优选2小时以上、更优选6小时以上，如12小时以上或甚至24、48或72小时以上的半衰期。
在本发明的优选但非限制性方面，本发明的这类NB剂、化合物、构建体或多肽在人中显示至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更长的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天（如约5至10天）、优选至少9天（如约9至14天）、更优选至少约10天（如约10至15天）、或至少约11天（如约11至16天）、更优选至少约12天（如约12至18天或更长）或14天以上（如约14至19天）的半衰期。
在本发明的另一方面，本发明的多肽包含与一个或多个（如两个，且优选一个）允许所产生的本发明多肽跨过血脑屏障的氨基酸序列连接（可选地通过一个或多个适宜的接头序列）的一个或多个（如两个或优选一个）本发明的NB剂。特别地，该一个或多个允许所产生的本发明多肽跨过血脑屏障的氨基酸序列可以是一个或多个（如两个，且优选一个）NANOBODIESTM，如WO 02/057445中所述的NANOBODIESTM，其中FC44（WO 06/040153的SEQ ID NO:189）和FC5（WO 06/040154的SEQID NO:190）是具体实例。
在一个实施方案中，包含一个或多个本发明的NB剂的多肽是这样，它们：
a)以10-5至10-12摩尔/升或更小、优选10-7至10-12摩尔/升或更小、和更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数（KD）（即，以105至1012升/摩尔或更大、优选107至1012升/摩尔或更大、和更优选108至1012升/摩尔的结合常数（KA））结合DR5；
和/或是这样，它们：
b)以102M-1s-1至约107M-1s-1之间、优选103M-1s-1和107M-1s-1之间、更优选104M-1s-1和107M-1s-1之间、如105M-1s-1和107M-1s-1之间的kon-速率结合DR5；
和/或是这样，它们：
c)以1s-1（t1/2=0.69s）和10-6s-1（提供近乎不可逆的复合,t1/2为多天）之间、优选10-2s-1和10-6s-1之间、更优选10-3s-1和10-6s-1之间、如10-4s-1和10-6s-1之间的koff速率结合DR5。
在一个实施方案中，仅包含一个本发明的氨基酸序列的多肽是这样，它将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM、如小于500pM的亲和力结合DR5。在这方面，对技术人员而言显而易见，与仅包含一个本发明的氨基酸序列的多肽相比，包含两个或更多个本发明的NB剂的多肽可以以增加的亲合性结合DR5。
本发明的此优选方面的其他多肽可以例如选自与SEQ ID NO:1-22、26-40和87-88的氨基酸序列中的一个或多个具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上，如至少99%或更高“序列同一性”的氨基酸序列，其中包含在所述氨基酸序列中的NB剂优选如本文所进一步定义的。
用于产生本发明的NB构建体的核酸、宿主细胞和方法
本发明的另一方面涉及编码本发明NB剂或包含本发明NB剂的本发明多肽的核酸。同样，如本文针对本发明的核酸所一般地描述的，这种核酸可以是本文提供的遗传构建体的形式。
在另一方面，本发明涉及宿主或宿主细胞，其表达或能够表达本发明NB剂和/或包含本发明NB剂的本发明多肽；和/或包含本发明核酸。这类宿主或宿主细胞的一些优选但非限制性的实例将从本文的进一步描述变得显而易见。
本发明的另一方面涉及产品或组合物，其包含或含有至少一个本发明NB剂、至少一个本发明多肽和/或至少一个本发明核酸，且可选地本身已知的这类组合物的一种或多种其他成分(即，取决于该组合物的预期用途）。这种产品或组合物可以是例如药物组合物（如本文所述）、兽医组合物或用于诊断用途的产品或组合物（也如本文所述）。这类产品或组合物的一些优选但非限制性的实例将从本文的进一步描述变得显而易见。
本发明进一步涉及用于制备或产生本文所述的NB剂、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的方法。这类方法的一些优选但非限制性的实例将从本文的进一步描述变得显而易见。
本发明进一步涉及本文所述NB剂、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用和用途，以及用于预防和/或治疗与DR5相关的疾病和障碍的方法。具体的非限制性应用和用途将从本文的进一步描述变得显而易见。
本发明的其他方面、实施方案、优势和应用也将从下文的进一步描述变得显而易见。
一般地，应注意，以其最广义在本文中使用的术语“NB剂”不受限于具体的生物来源或具体的制备方法。例如，如将在下文中更详细地讨论，一般可以通过WO 08/020079的61和62页上提到的技术（1）至（8）中的任一种、或本身已知的任何其他适宜的技术来获得本发明NB剂。一类优选的NB剂对应于天然存在的针对DR5的重链抗体的VHH或VH结构域。如本文进一步讨论，一般可以通过以下来产生或获得VHH序列：用DR5适宜地免疫驼类物种（即，以引起针对DR5的免疫应答和/或重链抗体），从该驼类物种获得适宜的生物样品（如血液样品、血清样品或B细胞的样品），从该样品起始，用本身已知的任何适宜的技术产生针对DR5的VHH序列。这类技术对技术人员而言显而易见和/或在本文中进一步描述。
备选地，可以从幼稚(naive)驼源VHH序列文库获得这类天然存在的针对DR5的VHH结构域，例如使用本身已知的一种或多种筛选技术，通过用DR5或其至少一个部分、片段、抗原决定簇或表位筛选这种文库。这类文库和技术例如描述于WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694中。备选地，可以使用衍生自幼稚VHH文库的合成或半合成的改良文库，如通过描述于例如WO 00/43507中的诸如随机诱变和/或CDR改组的技术获自幼稚VHH文库的VHH文库。
因此，在另一方面，本发明涉及用于产生针对DR5的NB剂的方法。在一个实施方案中，该方法至少包括以下步骤：
a)提供NB剂序列组、集合、或文库；
b)从该NB剂序列的组、集合或文库中筛选可以结合DR5和/或对DR5具有亲和力的NB剂序列；
和
c)分离可以结合DR5和/或对DR5具有亲和力的氨基酸序列（一个或多个）。
在这种方法中，NB剂序列的组、集合、或文库可以是幼稚的NB剂序列的组、集合、或文库；合成或半合成的NB剂序列的组、集合、或文库；和/或已进行了亲和力成熟的NB剂序列的组、集合、或文库。
在此方法的一个具体方面，NB剂序列的组、集合、或文库可以是NB剂序列的免疫组、集合、或文库，尤其是源自驼类物种的VHH序列的免疫组、集合、或文库，其中该驼类物种已用DR5或用基于或衍生自DR5的适宜的抗原决定簇，如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其他表位适宜地进行了免疫。在一个具体方面，该抗原决定簇可以是胞外部分、区域、结构域、环或其他胞外表位（一个或多个）。
在以上方法中，VHH序列的组、集合、或文库可以展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适宜的微生物（如酵母）上，以便于筛选。例如基于本文的进一步公开，对本领域技术人员而言，适合用于展示和筛选序列（的组、集合、或文库）的方法、技术和宿主生物将显而易见。也参考WO 03/054016和Hoogenboom在Nature Biotechnology，23,9,1105-1116(2005)中的综述。
在一个实施方案中，用于产生VHH序列的方法包括至少以下步骤：
a)提供自表达免疫球蛋白序列的驼类物种得到的细胞集合或样品；
b)从该细胞集合或样品，筛选（1）表达可以结合DR5和/或对DR5具有亲和力的免疫球蛋白序列的细胞；和（2）表达重链抗体的细胞，其中子步骤（1）和（2）基本上可以作为单个筛选步骤或以任何适宜的顺序作为两个分开的筛选步骤进行，以提供表达能够结合DR5和/或对DR5具有亲和力的重链抗体的至少一个细胞；
和
c)（1）从该细胞分离存在于该重链抗体中的VHH序列；或者（2）从该细胞分离编码存在于该重链抗体中的VHH序列的核酸序列，然后表达该VHH结构域。
在此方面的方法中，该细胞的集合或样品可以是例如B细胞的集合或样品。同样，在此方法中，该细胞的样品可以源自驼类动物，其中该驼类动物已用DR5或用基于或衍生自DR5的适宜的抗原决定簇，如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其他表位适宜地免疫。在一个具体方面，该抗原决定簇可以是胞外部分、区域、结构域、环或其他胞外表位（一个或多个）。
如对技术人员而言显而易见，可以以任何适宜的方式进行以上方法。参考例如EP 0542810、WO 05/19824、WO 04/051268和WO 04/106377。步骤b）的筛选优选用诸如FACS的流式细胞术技术进行。对此，可参考例如Lieby等,Blood,Vol.97,No.12,3820。见例如描述于Ablynx N.V.的国际申请WO 06/079372中的所谓的“NanocloneTM”技术。
在另一方面，用于产生针对DR5的氨基酸序列的方法可以至少包括以下步骤：
a)提供编码重链抗体或VHH序列的核酸序列的组、集合、或文库；
b)从该核酸序列的组、集合、或文库，筛选编码可以结合DR5和/或对DR5具有亲和力的重链抗体或VHH序列的核酸序列；和
c)分离该核酸序列，然后表达存在于该重链抗体中的VHH序列或表达该NB构建体序列。
在这种方法中，该编码重链抗体或VHH序列的核酸序列的组、集合、或文库可以是例如编码幼稚的重链抗体或VHH序列的组、集合、或文库的核酸序列的组、集合、或文库；编码合成或半合成的VHH序列的组、集合、或文库的核酸序列的组、集合、或文库；和/或编码已进行了亲和力成熟的VHH序列的组、集合、或文库的核酸序列的组、集合、或文库。
在此方法的一个实施方案中，氨基酸序列的组、集合、或文库可以是编码源自如下驼类动物的重链抗体或VHH序列的免疫核酸序列的组、集合、或文库，其中该驼类动物已用DR5或用基于或衍生自DR5的适宜的抗原决定簇，如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其他表位适宜地免疫。在一方面，该抗原决定簇可以是胞外部分、区域、结构域、环或其他胞外表位（一个或多个）。
在以上方法中，核苷酸序列的组、集合、或文库可以展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适宜的微生物（如酵母）上，以便于筛选。例如基于本文的进一步公开，对本领域技术人员而言，适合用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列（的组、集合、或文库）的方法、技术和宿主生物将显而易见。也参考WO 03/054016和Hoogenboom在Nature Biotechnology，23,9,1105-1116(2005)中的综述。
在一个实施方案中，本文所述方法的筛选步骤还可以作为选择步骤进行。因此，本说明书中使用的术语“筛选”可以包括选择、筛选或选择和/或筛选技术的任何适宜的组合。在使用序列的组、集合、或文库时，它可以包含任何适宜数目的序列，如1、2、3或约5、10、50、100、500、1000、5000、104、105、106、107、108或更多个序列。
在一个实施方案中，可以通过理论的或半经验的方法，如计算机建模技术或生物统计学或数据挖掘技术，获得或定义以上氨基酸序列的组、集合、或文库中的一个或多个或全部序列。
此外，这种组、集合、或文库可以包含互为变体（例如，具有设计的点突变或具有随机化的位置）的一个、两个或更多个序列，包含来自多样的一组天然多样化序列（例如免疫文库）或任何其他多样序列来源（如描述于例如Hoogenboom等,Nat Biotechnol 23:1105,2005和Binz等,NatBiotechnol 2005,23:1247中）的多个序列。这类序列的组、集合、或文库可以展示在噬菌体颗粒、核糖体、细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞的表面，并与这些载体内编码氨基酸序列的核苷酸序列连接。这使得这种组、集合、或文库可以适用于选择方法以分离期望的本发明氨基酸序列。更一般地，在序列展示在适宜的宿主或宿主细胞上时，还可以（且常规地）首先从该宿主或宿主细胞分离编码希望的序列的核苷酸序列，然后通过在适宜的宿主生物中适宜地表达该核苷酸序列来获得希望的序列。同样，如对技术人员而言显而易见，这可以以本身已知的任何适宜的方式进行。
用于获得针对DR5的VHH序列、VH序列或一些其他变体的NB剂序列的另一技术涉及：适宜地免疫能够表达重链抗体的转基因哺乳动物（即，以引起针对DR5的免疫应答和或重链抗体），从包含该序列（编码该序列的核酸序列）的该转基因哺乳动物获得适宜的生物样品（如血液样品、血清样品或B细胞的样品），然后从该样品起始，用本身已知的任何适宜的技术（如本文所述方法或杂交瘤技术中的任一种）产生针对DR5的NB剂序列。例如，为了此目的，可以使用描述于WO 02/085945、WO 04/049794、WO 06/008548及Janssen’s等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006Oct10;103(41):15130-5中的表达重链抗体的小鼠及其他方法和技术。例如，这类表达重链抗体的小鼠可以表达具有任何适宜的（单）可变结构域的重链抗体，如来自天然来源的（单）可变结构域（例如，人（单）可变结构域、驼源（单）可变结构域或鲨鱼（单）可变结构域），以及例如合成或半合成的（单）可变结构域。
在一个实施方案中，本发明涉及通过以上方法或备选地通过包括以上方法之一以及至少一个以下步骤的方法而获得的NB剂序列，所述步骤为：确定该NB剂序列的核苷酸序列或氨基酸序列；以本身已知的方式表达或合成该NB剂序列，如通过在适宜的宿主细胞或宿主生物中表达或通过化学合成。
在一个实施方案中，本发明提供一类NB剂，其包含具有这样的氨基酸序列的驼源VHH构建体，该氨基酸序列对应于天然存在的美洲驼VHH结构域的氨基酸序列，但已“人源化”，即，该天然存在的VHH序列的氨基酸序列中（且尤其是在构架序列中，但也可选地在一个或多个CDR中）的一个或多个氨基酸残基用来自人的常规四链抗体的VH结构域中的对应位置（一个或多个）上的一个或多个氨基酸残基取代，例如，如上文所指出和例如，如进一步描述的，使用WO 08/020079的63页上所提到的技术。在一个实施方案中，本发明提供包含这样的氨基酸序列的一类NB剂，该氨基酸序列对应于天然存在的VH结构域的氨基酸序列，但已“驼源化”，即，例如，如进一步描述的，使用WO 08/020079的63页上所提到的技术，用存在于重链抗体的VHH结构域中的一个或多个对应位置上的一个或多个氨基酸残基取代来自常规四链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。
用于从天然存在的VH序列或VHH序列起始获得本发明NB剂（包括多肽和/或编码多肽的核酸）的其他适宜的方法和技术对技术人员而言显而易见，且可以包括例如WO 08/020079的64页上所提到的技术。
如本文所提到，NB剂尤其可以具有这样的表征：在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”（如WO 2008/020079的65-98页中所述）。
在一个实施方案中，NB剂可以是例如VHH序列或可以是人源化或进一步人源化的NB构建体。在NB剂序列是VHH序列时，它们可以适宜地人源化。在NB剂是部分人源化的NB构建体时，它们可以可选地进一步适宜地人源化。在以上NB剂中，如所述的（例如，在它们是VHH序列或部分或完全人源化的NB构建体时），优选进一步的一个或多个标志残基。
本文的NB剂可以是例如VHH序列或可以是人源化或人工程化的。在以上NB剂序列是VHH序列时，它们可以适宜地人源化，如本文所提供的。在NB剂是部分人源化的时，它们可以可选地按本文所述进一步适宜地人源化。实施例中提供了人源化的一个非限制性和示例性方法，但可以考虑本领域已知的其他方法。
在以上NB剂的一个实施方案中，（进一步的）一个或多个标志残基如本文所述（例如，在它们是驼源VHH序列或部分或完全人源化的VHH构建体时）。
在一个非限制性方面，本发明涉及上文所述的NB剂，其中CDR序列与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列的至少一个的CDR序列具有至少70%氨基酸同一性、优选至少80%氨基酸同一性、更优选至少90%氨基酸同一性，如至少95%氨基酸同一性或更多或甚至基本上100%氨基酸同一性。此氨基酸同一性程度可以例如通过测定该NB剂与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的序列中的一个或多个之间的氨基酸同一性程度（以本文所述的方式）来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。此NB剂可以如本文所进一步描述的进行修饰。
如上文已提到，本发明的其他优选但非限制的方面涉及具有这样的氨基酸序列的NB剂，该氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104，或选自与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列中的至少一个具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上，如至少99%或更多序列同一性的氨基酸序列。
在以上NB剂的具体实施方案中：
i)与对应的SEQ ID NO:1-22、26-40和87-88的氨基酸序列相比，任何氨基酸取代（在它不是本文定义的人源化取代时）优选是保守性氨基酸取代；
和/或
ii)与对应的SEQ ID NO:1-22、26-40和87-88的氨基酸序列相比，它的氨基酸序列优选仅包含氨基酸取代，或者优选包含不大于5个、优选不大于3个和更优选仅1个或2个氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)CDR可以是，例如从对应的SEQ ID NO:1-22、26-40和87-88的氨基酸序列的CDR开始，利用亲和力成熟衍生的CDR。
优选地，本发明NB剂中的CDR序列和FR序列是这样，其使得本发明NB剂（和包含本发明NB剂的多肽）：
a)以10-5至10-12摩尔/升或更小、优选10-7至10-12摩尔/升或更小和更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数（KD）（即以105至1012升/摩尔或更大、优选107至1012升/摩尔或更大和更优选108至1012升/摩尔的结合常数（KA））结合DR5，例如人DR5；
和/或
b)以102M-1s-1至约107M-1s-1之间、优选103M-1s-1和107M-1s-1之间、更优选104M-1s-1和107M-1s-1之间、如105M-1s-1和107M-1s-1之间的kon-速率结合DR5，例如人DR5；
和/或：
c)以1s-1（t1/2=0.69s）和10-6s-1（提供近乎不可逆的复合，t1/2为多天）之间、优选10-2s-1和10-6s-1之间、更优选10-3s-1和10-6s-1之间、如10-4s-1和10-6s-1之间的koff速率结合DR5，如人DR5。
在一个实施方案中，存在于本发明NB剂中的CDR序列和FR序列是这样，使得本发明NB剂将以低于500nM、优选低于200nM、更优选低于10nM、如低于500pM的亲和力结合DR5，例如人DR5。
在本发明的一个非限制性方面，NB剂可以如本文所提供，但条件是与对应的天然存在的人VH结构域的构架区相比，尤其是与对应的DP-47的构架区相比，它在至少一个构架区中具有至少“一个氨基酸差异”。更特别地，根据本发明的一个非限制性方面，NB剂可以如本文所提供，但条件是与对应的天然存在的人VH结构域的构架区相比，尤其是与对应的DP-47的构架区相比，它在至少一个标志残基（包括108、103和/或45位的那些）处具有至少“一个氨基酸差异”。通常，NB剂将在FR2和/或FR4的至少一个中，尤其是在FR2和/或FR4中的至少一个标志残基（同样，包括108、103和/或45位的那些）处与天然存在的VH结构域具有至少一个这种氨基酸差异。
在一个实施方案中，本发明的人源化NB剂可以如本文所提供，但条件是与对应的天然存在的VHH结构域的构架区相比，它在至少一个构架区中具有至少“一个氨基酸差异”。更特别地，根据本发明的一个非限制性方面，人源化NB剂可以如本文所提供，但条件是与对应的天然存在的VHH结构域的构架区相比，它在至少一标志残基（包括108、103和/或45位的那些）处具有至少“一个氨基酸差异”。通常，人源化NB剂将在FR2和/或FR4的至少一个中，尤其是在FR2和/或FR4中的至少一个标志残基（同样，包括108、103和/或45位的那些）处与天然存在的VHH结构域具有至少一个这种氨基酸差异。
如从本文的公开显而易见，在本发明的范围之内也涵盖，使用本文提供的本发明NB剂的天然或合成的类似物、突变体、变体、等位基因变体、同源物和直向同源物（本文统称为“类似物”），尤其是SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104及SEQ ID NO:96-99的NB构建体的类似物。因此，根据本发明的一个方面，术语“本发明NB剂”和术语“本发明的NB构建体”在其最广泛的含义上还涵盖这类类似物。
通常，在这类类似物中，与本文提供的本发明NB剂相比，可以已经取代、缺失和/或添加了一个或多个氨基酸残基。可以在一个或多个构架区中和/或在一个或多个CDR中产生这类取代、插入或缺失。当在一个或多个构架区中产生这类取代、插入或缺失时，它们可以在一个或多个标志残基处和/或在构架残基中的一个或多个其他位置处产生，但通常较不优选标志残基处的取代、插入或缺失（除非这些是本文所述的适宜的人源化取代）。
作为非限制性实例，取代可以是例如保守性取代（如本文所述），和/或氨基酸残基可以用另一VHH结构域中天然存在于同一位置的另一氨基酸残基取代（这类取代的非限制性实例见例如WO 2008/020079），但本发明通常不限于此。因此，改善本发明NB剂的特性或至少不使本发明NB剂的期望特性或期望特性的平衡或组合减损太多（即，达到使得该NB剂不再适合用于其预期用途的程度）的任何一个或多个取代、缺失或插入、或其任何组合，也包含在本发明的范围之内。基于本文的公开和可选地在有限程度的常规实验之后，技术人员通常将能够确定和选择适宜的取代、缺失或插入或其适宜的组合，该常规实验可以涉及例如引入有限数目的可能取代，并测定它们对这样获得的NB剂的特性的影响。
在一方面，在本领域技术人员的能力范围之内，取决于用来表达NB剂（即，本发明的多核苷酸或多肽）的宿主生物，可以设计这类缺失和/或取代，使得去除用于翻译后修饰的一个或多个位点（如一个或多个糖基化位点）。备选地，可以设计取代或插入来引入一个或多个用于结合官能团（如本文所述）的位点，例如以允许位点特异的聚乙二醇化（同样如本文所述）。
如WO 2008/020079中就可能的氨基酸取代所提供的和如上文所提出的，构架区中的一些氨基酸残基比其他氨基酸残基更保守。在一方面，虽然本发明在其最广泛的含义上不限于此，但优选任何取代、缺失或插入在较不保守的位置处产生。在一个非限制性方面，与氨基酸缺失或插入相比，优选氨基酸取代。
在一个非限制性方面，类似物是这样，它们可以以本文针对本发明NB剂提供的亲和力（适宜地测量和/或表示为KD-值（实际或表观）、KA-值（实际或表观）、kon-速率和/或koff-速率，或备选地测量和/或表示为IC50值，如本文进一步描述）结合DR5。
在一个非限制性方面，类似物是这样，它们保留本文所述的NB剂的有利特性。
在一个实施方案中，类似物与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104的NB构建体之一具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、如至少95%或99%或更高的序列同一性程度；和/或优选具有至多20个、优选至多10个、甚至更优选至多5个、如4个、3个、2个或仅1个氨基酸差异。
在非限制性方面，类似物的构架序列和CDR将：（a）在108位具有Q；和/或（b）在45位具有带电荷氨基酸或半胱氨酸残基，且优选在44位具有E，更优选在44位具有E和在45位具有R；和/或（c）在103位具有P、R或S。
在一个非限制性方面，一类本发明NB剂的类似物包含已人源化（即，与本发明的天然存在的NB剂的序列相比）的NB剂。如本文引用的背景技术中所提到，这种人源化通常涉及用存在于人VH结构域，如人VH3结构域中相同位置处的氨基酸残基取代天然存在的VHH的序列中的一个或多个氨基酸残基。对技术人员而言，可能的人源化取代或人源化取代的组合的实例将例如从本文的表格、从本文引用的背景技术中提到的可能的人源化取代和/或从NB剂的序列与天然存在的人VH结构域的序列之间的比较，而是显而易见的。
在一个非限制性方面，选择人源化取代，使得产生的人源化NB剂仍保留本文提供的NB剂的有利特性，且进一步地使得它们如前一段中针对类似物所述的。基于本文的公开和可选地在有限程度的常规实验之后，技术人员通常将能够确定和选择适宜的人源化取代或适宜的人源化取代的组合，该常规实验可以涉及例如引入有限数目的可能的人源化取代，并测定它们对这样获得的NB剂的特性的影响。
在一个非限制性方面，由于人源化，本发明NB剂可以变得更“人样的”，同时仍保留本文所述的本发明NB剂的有利特性。结果，与对应的天然存在的VHH结构域相比，这类人源化NB剂可以具有几个优势，如降低的免疫原性。同样，基于本文的公开和可选地在有限程度的例行实验之后，技术人员将能够选择人源化取代或适宜的人源化取代的组合，以在人源化取代提供的有利特性和天然存在的VHH结构域的有利特性之间实现优化或达到期望或适宜的平衡。
可以在任何构架残基（一个或多个）处适宜地人源化本发明NB剂，如在一个或多个标志残基处或在一个或多个其他构架残基（即，非标志残基）处或其任何适宜的组合。“P、R、S-103组”或“KERE组”的NB剂的一个优选的人源化取代是Q108取代为L108。还可以通过Q108取代为L108来人源化“GLEW类”的NB剂，只要至少一个其他标志残基包含驼源（驼源化）取代。例如，如本文所提到，一类尤其优选的人源化NB剂在44-47位具有GLEW或GLEW样序列；在103位具有P、R或S（且尤其是R）；在108位具有L。
可以例如使用WO 08/020079的103和104页上提到的一种或多种技术，以本身已知的任何方式提供人源化类似物和其他类似物，及编码人源化类似物和其他类似物的核酸序列。
在一个非限制性方面，本发明NB剂的一类类似物包含已人源化（即，与本发明的天然存在的NB剂的序列相比）的NB剂。如本文应用的背景技术中所提到，这种人源化通常涉及用存在于人VH结构域，如人VH3结构域中相同位置处的氨基酸残基取代天然存在的VHH的序列中的一个或多个氨基酸残基。对技术人员而言，可能的人源化取代或人源化取代的组合的实例将例如从本文的表格、从本文引用的背景技术中提到的可能的人源化取代、和/或从NB剂的序列与天然存在的人VH结构域的序列之间的比较，而是显而易见的。
在一个非限制性方面，选择人源化取代，使得产生的人源化NB剂仍保留本文提供的NB剂的有利特性，且更优选地，使得它们如前面段落中针对类似物所述的。基于本文的公开和可选地在有限程度的例行实验之后，技术人员通常将能够确定和选择适宜的人源化取代或适宜的人源化取代的组合，该例行实验可以涉及例如引入有限数目的可能的人源化取代，并测定它们对这样获得的NB剂的特性的影响。
通常，由于人源化，本发明NB剂可以变得更“人样”的，同时仍保留本文所述的本发明NB剂的有利特性。结果，与对应的天然存在的VHH结构域相比，这类人源化NB剂可以具有几个优势，如降低的免疫原性。同样，基于本文的公开和可选地在有限程度的例行实验之后，技术人员将能够选择人源化取代或适宜的人源化取代的组合，以在人源化取代提供的有利特性和天然存在的VHH结构域的有利特性之间实现优化或达到希望或适宜的平衡。
可以在任何构架残基（一个或多个）处适宜地人源化本发明NB剂，如在一个或多个标志残基（如WO 2008/020079中所定义）处或在一个或多个其他构架残基（即，非标志残基）处或其任何适宜的组合。
可以以本身已知的任何方式提供人源化类似物和其他类似物，及编码人源化类似物和其他类似物的核酸序列。例如，可以通过以下来获得类似物：提供编码天然存在的VHH结构域的核酸，将编码待取代的一个或多个氨基酸残基的密码子变为编码对应的期望氨基酸残基的密码子（例如，通过定点诱变或通过使用适宜的错配引物的PCR），在适宜的宿主或表达系统中表达这样获得的核酸/核苷酸序列；及可选地分离和/或纯化这样获得的类似物以提供基本上分离形式（例如，如本文进一步描述）的该类似物。
这通常可以用本身已知的方法和技术来进行，对技术人员而言，这些方法和技术将例如从本文引用的手册和参考文献、本文引用的背景技术和/或从本文的进一步描述显而易见。备选地，可以以本身已知的方式（例如，用自动化仪器合成具有预先确定的氨基酸序列的核酸序列），合成编码希望的类似物的核酸，然后可以按本文所述表达。另一技术可以涉及组合各自编码期望类似物的一部分的一个或多个天然存在的和/或合成的核酸序列，然后按本文所述表达该组合的核酸序列。同样，可以使用本身已知的肽合成技术，如本文提到的那些，通过相关氨基酸序列的化学合成，提供类似物。
在这方面，对技术人员而言，同样显而易见的是，可以从人VH序列（即，氨基酸序列或对应的核苷酸序列）起始，例如从诸如DP-47、DP-51或DP-29的人VH3序列起始，设计和/或制备本发明NB剂（包括它们的类似物），即通过引入一个或多个驼源化取代（即，将该人VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基变为存在于VHH结构域中对应位置处的氨基酸残基），以提供本发明NB剂的序列和/或以将NB剂的有利特性赋予这样获得的序列。同样，这通常可以用人VH结构域的氨基酸序列和/或核苷酸序列作为起点，用前一段中提到的多种方法和技术来进行。
如其中所提到，对技术人员而言，显而易见的是，可以从人VH序列（即，氨基酸序列或对应的核苷酸序列）起始，例如从诸如DP-47、DP-51或DP-29的人VH3序列起始，设计和/或制备本发明NB剂（包括它们的类似物），即通过引入一个或多个驼源化取代（即，将该人VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基变为存在于VHH结构域中对应位置处的氨基酸残基），以提供本发明NB剂的序列和/或以将NB剂的有利特性赋予这样获得的序列。同样，这通常可以用人VH结构域的氨基酸序列和/或核苷酸序列作为起点，用前一段中提到的多种方法和技术来进行。
一些非限制性驼源化取代可以源自WO 2008/020079。显而易见，一个或多个标志残基处的驼源化取代通常将比一个或多个其他氨基酸位置处的取代对期望特性具有更大的影响，但二者及其任何适宜的组合都包含于本发明的范围之内。例如，可以引入已赋予至少一些希望的特性的一个或多个驼源化取代，然后引入进一步改善该特性和/或赋予其他有利特性的其他驼源化取代。同样，基于本文的公开和可选地在有限程度的例行实验之后，技术人员通常将能够确定和选择适宜的驼源化取代或适宜的驼源化取代的组合，该例行实验可以涉及例如引入有限数目的可能的驼源化取代，并测定是否获得或改善（即，与最初的VH结构域相比）了NB剂的有利特性。
在一个非限制性方面，这类驼源化取代是这样，使得产生的氨基酸序列至少：（a）在108位包含Q；和/或（b）在45位包含带电荷氨基酸或半胱氨酸残基，优选还在44位包含E，更优选在44位包含E和在45位包含R；和/或（c）在103位包含P、R或S；及可选地包含一个或多个其他驼源化取代。在一个非限制性方面，驼源化取代是这样，其导致本发明NB剂和/或其类似物，如人源化类似物和/或优选地如前面段落中所提供的类似物。
如也将从本文的公开显而易见，使用本文提供的本发明NB剂的部分或片段、或两个或更多个部分或片段的组合，尤其是SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104及SEQ ID NOS:96-99的NB剂的部分或片段，也在本发明的范围之内。因此，根据本发明的一个方面，术语“本发明NB剂”在其最广泛的含义上还涵盖这类部分或片段。
通常，本发明NB剂（包括其类似物）的这类部分或片段具有这样的氨基酸序列，其中，与对应的本发明的全长NB剂（或其类似物）的氨基酸序列相比，已缺失和/或去除了一个或多个N端氨基酸残基、一个或多个C端氨基酸残基、一个或多个连续的内部氨基酸残基、或其任何组合。
该部分或片段优选是这样，它们可以以本文针对本发明NB剂提供的亲和力（适宜地测量和/或表示为KD-值（实际或表观）、KA-值（实际或表观）、kon-速率和/或koff-速率，或备选地测量和/或表示为IC50值，如本文进一步描述）结合DR5，如人DR5。
任何部分或片段优选是这样，它包含对应的本发明的全长NB剂的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸残基、优选至少20个连续氨基酸残基、更优选至少30个连续氨基酸残基、如至少40个连续氨基酸残基。
任何部分或片段还优选是这样，它包含CDR1、CDR2和/或CDR3的至少一个或至少其部分（且尤其是至少CDR3或至少其部分）。更优选地，任何部分或片段是这样，它包含至少一个CDR（且优选至少CDR3或其部分）和至少一个其他CDR（即，CDR1或CDR2）或至少其部分，优选地通过一个或多个适宜的构架序列或至少其部分连接。更优选地，任何部分或片段是这样，它包含至少一个CDR（且优选至少CDR3或其部分）和至少其余两个CDR的部分，同样优选通过一个或多个适宜的构架序列或至少其部分连接。
根据另一尤其优选但非限制的方面，这种部分或片段包含对应的本发明的全长NB剂的至少CDR3，如FR3、CDR3和FR4，即，如例如国际申请WO 03/050531（Lasters等）中所述。
如本文已提到，还可以组合两个或更多个这种部分或片段（即，来自相同或不同的本发明NB剂），即，以提供类似物和/或提供本发明NB剂的其他部分或片段。例如，还可以将本发明NB剂的一个或多个部分或片段与人VH结构域的一个或多个部分或片段组合。
根据一个方面，该部分或片段与SEQ ID NO:1-22、26-40、87-88和103-104及SEQ ID NO:96-99的NB剂之一具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%和/或至少90%、95%或99%或更高的序列同一性程度。
可以以本身已知的任何方式提供和可选地组合部分和片段及编码部分和片段的核酸序列。例如，可以通过在编码本发明的全尺寸NB剂的核酸中插入终止密码子，然后以本身已知的方式（例如，如本文所述）表达这样获得的核酸来获得这类部分或片段。备选地，可以通过适宜地限制性消化编码本发明的全尺寸NB剂的核酸或通过以本身已知的方式合成这种核酸来获得编码这类部分或片段的核酸。还可以用本身已知的肽合成技术来提供部分或片段。
本发明在其最广泛的含义上还包含本发明NB剂的衍生物。通常可以通过修饰，尤其是通过化学和/或生物学（例如酶）修饰本发明NB剂和/或形成本发明NB剂的氨基酸残基中的一个或多个来获得这类衍生物。
对技术人员而言，这类修饰的实例、以及NB剂序列内可以以这种方式（即，在多肽主链上，但优选在侧链上）修饰的氨基酸残基的实例、可以用来引入这类修饰的方法和技术、及这类修饰的潜在用途和优势，是显而易见的。
在一个非限制性方面，这种修饰涉及将一个或多个官能团、残基或结构部分，尤其是赋予本发明NB剂一种或多种期望特性或功能性的一个或多个官能团、残基或结构部分，引入（例如，通过共价连接或以其他适宜的方式）至本发明NB剂之中或之上。对技术人员而言，这类官能团的实例显而易见。
在一个非限制性方面，这种修饰包括引入（例如，通过共价结合或以任何其他适宜的方式）一个或多个官能团，该一个或多个官能团增加本发明NB剂的半衰期、可溶性和/或吸附，降低本发明NB剂的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明NB剂的任何不希望的副作用，和/或赋予本发明NB剂和/或多肽其他有利特性，和/或减少本发明NB剂和/或多肽的不希望的特性；或前述两种或多种的任何组合。这类官能团及用于引入它们的技术的实例对技术人员而言显而易见，且通常可以包括上文引用的一般背景技术中提到的所有官能团和技术，以及本身已知的用于修饰药用蛋白质，尤其是用于修饰抗体或抗体片段（包括ScFv和单结构域抗体）的官能团和技术，其可参考例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1980)。对技术人员而言同样显而易见，这类官能团可以例如与本发明NB剂直接（例如共价）连接，或可选地通过适宜的接头或间隔区连接。
用于增加药用蛋白质的半衰期和/或降低药用蛋白质的免疫原性的最广泛使用的技术之一包括：连接适宜的可药用聚合物，如聚乙二醇（PEG）或其衍生物（如甲氧基聚乙二醇或mPEG）。通常，可以使用任何适宜形式的聚乙二醇化，如本领域用于抗体和抗体片段（包括但不限于（单）结构域抗体和ScFv）的聚乙二醇化；见例如Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese和Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003)；Harris和Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.,2,(2003)；及WO04/060965中。用于蛋白质的聚乙二醇化的多种试剂也可从例如NektarTherapeutics,USA购得。
在一个实施方案中，使用位点定向聚乙二醇化，尤其是通过半胱氨酸残基（见例如Yang等,Protein Engineering,16,10,761-770(2003)）。在多种实施方案中，为了此目的，将PEG连接至天然存在于本发明NB剂中的半胱氨酸残基。可以修饰本发明NB剂来适宜地引入用于连接PEG的一个或多个半胱氨酸残基，或者可以将包含用于连接PEG的一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸序列融合至本发明NB剂的N端和/或C端，其全都可以使用技术人员本身已知的蛋白质工程的技术实现。
在一个实施方案中，对于本发明NB剂和蛋白质，使用分子量5000以上、如10,000以上且小于200,000、如小于100,000、例如在20,000-80,000的范围内的PEG。
在一个实施方案中，取决于用于表达本发明NB剂或多肽的宿主细胞，修饰包括N联糖基化或O联糖基化，通常作为共翻译修饰和/或翻译后修饰的一部分。
在一个实施方案中，修饰可以包括引入一个或多个可检测的标记或其他产生信号的基团或部分，这取决于标记的NB剂的预期用途。适宜的标记及连接、使用和检测它们的技术对技术人员而言显而易见，且例如包括但不限于荧光标记、磷光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性同位素、金属、金属螯合物、金属阳离子、生色团和酶，如WO 08/020079的109页上提到的那些。其他适宜的标记对技术人员而言显而易见，且例如包括可以用NMR或ESR光谱学检测的结构部分。
取决于具体标记的选择，本发明的这类标记的NB剂和多肽可以例如用于体外、体内或原位测定试验（包括本身已知的免疫测定，如ELISA、RIA、EIA和其他“夹心法测定”等），以及体内诊断和成像目的。
在一个实施方案中，修饰可以涉及引入螯合基团来例如螯合上文提到的金属或金属阳离子之一。适宜的螯合基团例如非限制性地包括二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）或乙二胺四乙酸（EDTA）。
在一个实施方案中，修饰可以包括引入官能团，该官能团是特异性结合对，如生物素-（链霉）抗生物素蛋白结合对，的一个部分。可以用这种官能团来将本发明NB剂连接至与该结合对的另一半结合的另一蛋白质、多肽或化学化合物，即，通过形成结合对。例如，本发明NB剂可以缀合生物素，并与缀合抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的另一蛋白质、多肽、化合物或载体连接。例如，这种缀合的NB剂可以用作报道分子，例如用于其中可检测的产生信号的物质与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的诊断系统中。这类结合对还可以例如用来使本发明NB剂与载体结合，包括适合用于药学目的的载体。一个非限制性实例是Cao和Suresh,Journal of Drug Targeting,8,4,257(2000)描述的脂质体制剂。这类结合对还可以用来将治疗活性剂与本发明NB剂连接。
对于一些应用，尤其是对于其中旨在杀死表达本发明NB剂所针对的靶标的细胞（例如，在癌症的治疗中）、或旨在减少或减慢这种细胞的生长和/或增殖的那些应用中，本发明NB剂还可以连接毒素或连接（细胞）毒性残基或结构部分。可以连接本发明NB剂来提供例如细胞毒性化合物的毒性部分、化合物或残基的实例对技术人员而言显而易见，且可以例如见于上文引用的技术参考文献中和/或本文的进一步描述中。一个实例是WO03/055527中所述的所谓的ADEPTTM技术。
其他可能的化学修饰和酶修饰对技术人员而言显而易见，且在本发明的范围之内。还可以为了研究的目的（例如，研究功能-活性关系）引入这类修饰。参考例如Lundblad和Bradshaw，Biotechnol.Appl.Biochem.,26,143-151(1997)。
在一个非限制性方面，衍生物是这样，它们以本文针对本发明NB剂提供的亲和力（适宜地测量和/或表示为KD-值（实际或表观）、KA-值（实际或表观）、kon-速率和/或koff-速率，或备选地测量和/或表示为IC50值，如本文进一步描述）结合DR5，例如人DR5。
如本文所提到，本发明还涉及基本上由至少一个本发明NB剂组成或包含至少一个本发明NB剂的蛋白质或多肽。“基本上由…组成”意指本发明多肽的氨基酸序列或者与本发明NB剂的氨基酸序列完全相同，或者对应于本发明NB剂的氨基酸序列但在该NB剂的氨基酸序列的氨基端、羧基端或氨基酸和羧基端二者处加入了有限数目的氨基酸残基，如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基，优选1-6个氨基酸残基，如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基。
所述氨基酸残基可以或可以不改变、改动或以其他方式显著地影响NB剂的（生物学）特性，且可以或可以不向NB剂加入其它功能性。例如，这类氨基酸残基：
a）例如由于在异源宿主细胞或宿主生物中表达，可以包含N端Met残基；或
b）可以形成在合成后指导NB剂从宿主细胞分泌的信号序列或前导序列。适宜的分泌前导肽对技术人员而言显而易见，且可以如本文进一步描述。通常，这种前导序列将与NB剂的N端连接，虽然本发明在其最广泛的含义上不限于此；或
c）可以形成序列或信号，该序列或信号允许NB剂导向和/或透过或进入特定器官、组织、细胞或细胞的部分或区室，和/或允许NB剂渗透或跨过生物屏障，如细胞膜、细胞层（如上皮细胞层）、肿瘤（包括实体瘤）或血脑屏障。这类氨基酸序列的实例对技术人员而言显而易见，且包括WO 08/020079的112页的c）段中提到的那些；或
d）可以形成“标签”，例如允许或便于纯化NB剂的氨基酸序列或残基，例如用针对该序列或残基的亲和技术。然后，可以去除（例如，通过化学切割或酶切割）该序列或残基来提供NB剂序列（为了此目的，标签可以可选地通过可切割的接头序列与NB剂序列连接，或者包含可切割的基序）。这类残基的一些非限制性实例是cMyc标签（SEQ ID NO:91）、多组氨酸残基如Hisx6标签（SEQ ID NO:92）或cMyc标签和Hisx6标签的组合（SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94）、聚乙二醇化底物标签（SEQ IDNO:95）、谷胱甘肽残基和其他myc标签（见例如WO 06/12282的SEQ IDNO:31）中的一种或多种；或
e）可以是已被官能化和/或可以作为用于连接官能团的位点的一个或多个氨基酸残基。适宜的氨基酸残基和官能团对技术人员而言显而易见，且包括但不限于本文针对本发明NB剂的衍生物提到的氨基酸残基和官能团。
根据一个方面，本发明多肽包含本发明NB剂，该本发明NB剂在其氨基端、在其羧基端或在其氨基酸和在其羧基端两者上，与至少一个其他氨基酸序列融合，即，以提供包含该本发明NB剂和一个或多个其他氨基酸序列的融合蛋白质。这种融合物在本文中称为“NB剂融合物”。
该一个或多个其他氨基酸序列可以是任何适宜和/或希望的氨基酸序列。该其他氨基酸序列可以或可以不改变、改动或以其他方式影响NB剂的（生物学）特性，且可以或可以不向本发明NB剂或多肽加入其他功能性。优选地，该其他氨基酸序列是这样，它赋予本发明NB剂或多肽一种或多种希望的特性或功能性。
例如，该其他氨基酸序列还可以提供第二结合部位，该结合部位可以针对任何希望的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位（包括但不限于与本发明NB剂所针对的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位相同的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位，或不同的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位）。
这类氨基酸序列的实例对技术人员而言显而易见，且通常可以包括在基于常规抗体及其片段（包括但不限于ScFv和单结构域抗体）的肽融合物中使用的所有氨基酸序列。参考例如Holliger和Hudson,NatureBiotechnology，23,9,1126-1136(2005)的综述。
在一个非限制性方面，这种氨基酸序列是这样的氨基酸序列，与本发明NB剂本身相比，其增加本发明多肽的半衰期、可溶性或吸附，降低本发明多肽的免疫原性或毒性，消除或减弱本发明多肽的不希望的副作用，和/或赋予本发明多肽其他有利特性和/或减少本发明多肽的不希望的特性。这类氨基酸序列的一些非限制性实例是血清蛋白质，如人血清白蛋白（见例如WO 00/27435），或半抗原分子（例如被循环抗体识别的半抗原，见例如WO 98/22141）。
特别地，本领域已描述，免疫球蛋白的片段（如VH结构域）与血清白蛋白或其片段连接可以用来增加半衰期。参考例如WO 00/27435和WO01/077137。根据本发明，本发明NB剂优选直接或通过适宜的接头（尤其是通过可以在连接后使得本发明多肽表达为遗传融合物（蛋白质）的适宜肽）与血清白蛋白（或与其适宜的片段）连接。根据一个具体方面，本发明NB剂可以与至少包含血清白蛋白的结构域III或其部分的血清白蛋白片段连接。参考例如Ablynx N.V.的WO 07/112940。
备选地，该其他氨基酸序列可以提供针对血清蛋白（例如，人血清白蛋白或另一血清蛋白质，如IgG）的第二结合部位或结合单位，以提供增加的血清半衰期。这类氨基酸序列例如包括下文所述的NB剂、以及WO91/01743、WO 01/45746和WO 02/076489中所述的小肽和结合蛋白质、及WO 03/002609和WO 04/003019中所述的dAb。也参考Harmsen等,Vaccine,23(41);4926-42,2005，以及EP 0368684，及Ablynx N.V的WO2006/122787、WO 2008/028977、WO 2008/043821、WO 2008/068280和WO2009/127691。
这类氨基酸序列尤其可以针对血清白蛋白（更尤其是人血清白蛋白）和/或针对IgG（更尤其是人IgG）。例如，这类氨基酸序列可以是针对（人）血清白蛋白的氨基酸序列和可以结合（人）血清白蛋白上不参与血清白蛋白与FcRn的结合的氨基酸残基的氨基酸序列（见例如WO 06/0122787），和/或能够结合血清白蛋白上不形成血清白蛋白的结构域III的部分的氨基酸残基的氨基酸序列（同样见WO 06/0122787）；具有或可以提供增加的半衰期的氨基酸序列（见例如Ablynx N.V的WO 08/028977）；针对人血清白蛋白的氨基酸序列，其与来自至少一个哺乳动物物种，尤其是至少一个灵长类物种（如，包括但不限于，来自猕猴属的猴（如，且尤其是食蟹猴（Macaca fascicularis,a.k.a.,“cyno”）和/或恒河猴（Macaca mulatta））和狒狒（Papio ursinus），同样参考美国临时申请60/843,349）的血清白蛋白交叉反应；可以以依赖于pH的方式结合血清白蛋白的氨基酸序列（见例如2006年10月11日Ablynx N.V.提交的标题为“Amino acid sequencesthat bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of thepH，compounds comprising the same，and uses thereof”的美国临时申请60/850,774）；和/或作为条件结合剂的氨基酸序列（见例如2006年10月11日Ablynx N.V.提交的标题为“Amino acid sequences that bind to a desiredmolecule in a conditional manner”的美国临时申请60/850,775，以及WO2006/122787、WO 2008/028977、WO 2008/043821、WO 2008/068280和WO 2009/127691）。
根据另一方面，该一个或多个其他氨基酸序列可以包含常规四链抗体（尤其是人抗体）和/或重链抗体的一个或多个部分、片段或结构域。例如，虽然通常较不优选，但可以将本发明NB剂与常规（优选人）VH或VL结构域或与VH或VL结构域的天然或合成的类似物连接，可选地通过接头序列连接（包括但不限于其他（单）结构域抗体，如Ward等所述的dAb）。
该至少一个NB剂可以，可选地通过接头序列，与一个或多个（优选人）CH1、CH2和/或CH3结构域连接。例如，可以将与适宜的CH1结构域连接的NB剂与适宜的轻链一起使用来产生抗体片段/结构，该抗体片段/结构类似于常规Fab片段或F(ab’)2片段，但其中已用本发明NB剂取代了一个或（在F(ab’)2片段的情况下）一个或两个常规VH结构域。同样，可以将两个NB剂与CH3结构域连接（可选地通过接头）来提供具有增加的体内半衰期的构建体。
在本发明的一个方面，本发明的一个或多个NB剂与一个或多个抗体部分、片段或结构域连接，该抗体部分、片段或结构域赋予本发明多肽一种或多种效应子功能和/或可以赋予结合一种或多种Fc受体的能力。例如，为了此目的，但不限于，该一个或多个其他氨基酸序列可以包含抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域，如来自重链抗体（如本文所述）和更优选来自常规人四链抗体；和/或可以形成Fc区（的部分），例如来自IgG、来自IgE或来自另一人Ig。例如，WO 94/04678描述了包含驼源VHH结构域或其人源化衍生物的重链抗体，其中已用人CH2和CH3结构域取代了驼源CH2和/或CH3结构域，以提供由每个均包含VHH及人CH2和CH3结构域（但无CH1结构域）的两条重链组成的免疫球蛋白，该免疫球蛋白具有由CH2和CH3结构域提供的效应子功能，且该免疫球蛋白可以在不存在任何轻链的情况下发挥功能。可以与本发明NB剂适宜地连接来提供效应子功能的其他氨基酸序列对技术人员而言显而易见，且可以根据希望的一种或多种效应子功能来选择。参考例如WO 04/058820、WO 99/42077和WO 05/017148，以及Holliger和Hudson,上文的综述。与对应的本发明NB剂相比，本发明NB剂与Fc部分的偶联也可以导致增加的半衰期。对于一些应用，赋予增加的半衰期而无任何生物学上显著的效应子功能的Fc部分和/或恒定区（即，CH2和/或CH3结构域）的使用也可以是适宜的或者甚至是优选的。具有增加的体内半衰期的包含一个或多个NB剂和一个或多个恒定结构域的其他适宜的构建体对技术人员而言显而易见，且可以例如包括与CH3结构域连接（可选地通过接头序列）的两个NB剂。通常，具有增加的半衰期的任何融合蛋白质或衍生物都将优选具有50kD以上（肾脏吸收的截断值）的分子量。
该其他氨基酸序列还可以形成在合成后指导本发明NB剂或多肽从宿主细胞分泌的信号序列或前导序列（例如，取决于用来表达本发明多肽的宿主细胞，提供本发明多肽的前（pre）、原（pro）或前原（prepro）形式）。
在一个方面，其他氨基酸序列形成序列或信号，该序列或信号允许本发明NB剂或多肽定向和/或渗透或进入特定器官、组织、细胞或细胞的部分或区室，和/或允许本发明NB剂或多肽渗透或跨过生物屏障，如细胞膜、细胞层（如上皮细胞层）、肿瘤（包括实体瘤）或血脑屏障。这类氨基酸序列的适宜的实例对技术人员而言显而易见，且例如包括但不限于WO08/020079的118页上提到的那些。对于一些应用，尤其是对于其中旨在杀死表达本发明NB剂所针对的靶标的细胞（例如，在癌症的治疗中）、或旨在减少或减慢这种细胞的生长和/或增殖的那些应用，本发明NB剂还可以连接（细胞）毒性蛋白质或多肽。可以连接本发明NB剂来提供例如本发明的细胞毒性多肽的该毒性蛋白质和多肽的实例对技术人员而言显而易见，且可以例如见于上文引用的技术参考文献中和/或本文的进一步描述中。一个实例是WO 03/055527中所述的所谓的ADEPTTM技术。
在一个非限制性方面，该一个或多个其他氨基酸序列包含至少一个其他NB剂，以提供包含至少两个、如三个、四个、五个或更多个NB剂的本发明多肽，其中所述这些NB剂可以可选地通过一个或多个接头序列连接。包含一个、两个或更多个VHH构建体（例如，如WO 08/020079的119和120页上所述）和至少一个本发明NB剂的本发明多肽在本文中也称为本发明的“多价”多肽，存在于这类多肽中的NB剂（一个或多个）在本文中也称为处于“多价型式”中。
包含至少两个NB剂且其中至少一个NB剂针对第一抗原（即，针对DR5）且至少一个NB剂针对第二抗原（即，不同于DR5）的多肽，也称为本发明的“多特异性”多肽，存在于这类多肽中的NB剂在本文中也称为处于“多特异性型式”中。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原（即，DR5）的NB剂、更优选三个、四个、五个或更多个针对DR5的NB剂，和至少一个针对第二抗原（即，不同于DR5）的其他NB剂的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原（即，DR5的一个表位）的NB剂、至少一个针对第二抗原（即，不同于DR5的表位或不同于TRAIL-受体的抗原）的其他NB剂和至少一个针对第三抗原（即，不同于DR5和第二抗原二者）的其他NB剂的多肽等。
因此，最简单形式的本发明双特异性多肽是本发明的二价多肽，其包含针对DR5的第一NB剂和针对第二抗原的第二NB剂，其中该第一和第二NB剂可以可选地通过接头序列连接；而最简单形式的本发明三特异性多肽是本发明的三价多肽，其包含针对DR5的第一NB剂、针对第二抗原的第二NB剂和针对第三抗原的第三NB剂，其中该第一、第二和第三NB剂可以可选地通过一个或多个、且尤其是一个和多个、尤其是两个接头序列连接。
如从本文的描述显而易见，就如下意义而言，本发明不限于以上所述：本发明的多特异性多肽可以包含至少一个或多个针对DR5的NB剂和任何数目的针对一个或多个不同于DR5的抗原的NB剂。
在提到本发明的具体多价或多特异性多肽时，应注意，除非清楚地另有说明，这涵盖了相关NB剂的任何顺序或排列。
此外，本发明多肽包含两个或更多个NB剂和一个或多个其他氨基酸序列（如本文所提到），也在本发明的范围之内。
对于包含一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及它们的制备，也参考Conrath等,J.Biol.Chem.,276卷,10.7346-7350,2001；Muyldermans,Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001),277-302；以及例如WO 96/34103和WO 99/23221。本发明的一些具体的多特异性和/或多价多肽的一些其他实例可以见于本文提到的Ablynx N.V.的申请中。
本发明的多特异性多肽的一个非限制性实例包含至少一个本发明NB剂和至少一个赋予增加的半衰期的NB剂。这类NB剂可以是例如针对血清蛋白质，尤其是人血清蛋白质，如人血清白蛋白、甲状腺素结合蛋白质、（人）转铁蛋白、凝血因子I、免疫球蛋白（如IgG、IgE或IgM），或针对WO 04/003019中所列出的血清蛋白质之一的NB剂。在这些中，尤其优选可以结合血清白蛋白（尤其是人血清白蛋白）或IgG（尤其是人IgG，见例如Muyldermans同上综述中的NANOBODYTM VH-1）的NB剂（例如对于小鼠或灵长类中的实验，可以使用针对小鼠血清白蛋白（MSA）或来自该灵长类的血清白蛋白或与小鼠血清白蛋白（MSA）或来自该灵长类的血清白蛋白交叉反应的NB剂，但是，对于药用，通常将优选针对人血清白蛋白或人IgG的NB剂）。提供增加的半衰期且可以用于本发明多肽中的NB剂包括WO 04/041865、WO 06/122787及Ablynx N.V.的其他专利申请（如本文提到的那些）中所述的针对血清白蛋白的NB剂。
例如，用于本发明中提供增加的半衰期的一些优选的NB剂包括：可以结合（人）血清白蛋白上不涉及血清白蛋白与FcRn的结合的氨基酸残基的NANOBODIESTM（见例如WO 06/0122787）；能够结合血清白蛋白上不形成血清白蛋白的结构域III的部分的氨基酸残基的NANOBODIESTM（见例如WO 06/0122787）；具有或可以提供增加的半衰期的NANOBODIESTM（见例如本文提到的Ablynx N.V的美国临时申请60/843,349）；针对人血清白蛋白的NANOBODIESTM，其与来自至少一个哺乳动物物种，尤其是至少一个灵长类物种（如，但不限于，来自猕猴属的猴（如，且尤其是食蟹猴（Macaca fascicularis）和/或恒河猴（Macacamulatta））和狒狒（Papio ursinus））的血清白蛋白交叉反应（见例如AblynxN.V的美国临时申请60/843,349）；可以以依赖于pH的方式结合血清白蛋白的NANOBODIESTM（见例如本文提到的Ablynx N.V.的美国临时申请60/850,774）；和/或作为条件结合剂的NANOBODIESTM（见例如AblynxN.V.的美国临时申请60/850,775）。
提供增加的半衰期且可以用于本发明多肽中的一些尤其优选的NANOBODIESTM包括WO 06/122787（见其中的表II和III）中公开的NANOBODIESTM ALB-1至ALB-10，其中尤其优选ALB-8（WO 06/122787中的SEQ ID NO:62）。
根据本发明的具体但非限制的方面，除一个或多个本发明NB剂外，本发明多肽还包含至少一个针对人血清白蛋白的NB剂。
在一个实施方案中，包含一个或多个本发明NB剂的具有增加的半衰期的本发明的任何多肽及具有增加的半衰期的本发明NB剂或这类多肽的任何衍生物，具有比对应的本发明NB剂本身的半衰期大至少1.5倍、和/或至少2倍、和/或至少5倍、例如至少10倍或20倍以上的半衰期。例如，与对应的本发明NB剂本身相比，这类具有增加的半衰期的衍生物或多肽可以具有增加了1小时以上、和/或2小时以上、和/或6小时以上、如12小时以上、或甚至24、48或72小时以上的半衰期。
在本发明的一个非限制性方面，这类衍生物或多肽在人中显示至少约12小时、和/或至少24小时、和/或至少48小时、和/或至少72小时或更长的血清半衰期。例如，这类衍生物或多肽可以具有至少5天（如约5至10天）、和/或至少9天（如约9至14天）、和/或至少约10天（如约10至15天）、和/或至少约11天（如约11至16天）、和/或至少约12天（如约12至18天或更长）、和/或14天以上（如约14至19天）的半衰期。
根据本发明的一个方面，这类多肽能够结合一个或多个可以增加该多肽的体内半衰期的分子。
本发明的这类多肽通过结合抵抗降解和/或清除或隔离的分子，而在体内被稳定化以及增加它们的半衰期。通常，所述分子是本身具有长的体内半衰期的天然存在的蛋白质。
本发明的多特异性多肽的另一非限制性实例包含至少一个本发明NB剂和至少一个这样的NB剂，该NB剂将本发明多肽定向至特定器官、组织、细胞或细胞的部分或区室，和/或允许本发明多肽渗透或进入特定器官、组织、细胞或细胞的部分或区室，和/或允许本发明NB剂渗透或跨过生物屏障，如细胞膜、细胞层（如上皮细胞层）、肿瘤（包括实体瘤）或血脑屏障。这类NB剂的实例包括针对希望的器官、组织或细胞的特定细胞表面蛋白质、标记或表位（例如与肿瘤细胞相关的细胞表面标记）的NB剂，及WO 02/057445和WO 06/04015中所述的靶向脑的单结构域抗体片段，其中FC44（WO 06/040153的SEQ ID NO:189）和FC5（WO 06/040154的SEQ ID NO:190）是优选的实例。
接头
在本发明多肽或化合物中，一个或多个针对DR5的结合多肽（如NB剂）和一个或多个多肽可以直接相互连接（如，例如WO 99/23221中所述）和/或可以通过一个或多个适宜的间隔区或接头或其任何组合相互连接。
用于多价和多特异性多肽中的适宜的间隔区或接头对技术人员而言显而易见，且通常可以是本领域用来连接氨基酸序列的任何接头或间隔区。优选地，该接头或间隔区适合用于构建旨在用于药用的蛋白质或多肽。
一些尤其优选的间隔区包括本领域用来连接抗体片段或抗体结构域的间隔区和接头。这些包括上文引用的一般背景技术中提到的接头，以及例如本领域用来构建双抗体或ScFv片段的接头（但是，在这方面，应指出，尽管在双抗体和ScFv片段中所使用的接头序列应具有允许相关VH和VL结构域组合在一起形成完整的抗原结合部位的长度、柔性程度和其他特性，但对用于本发明多肽中的接头序列的长度或柔性无特定限制，因为各NB剂自身形成完整的抗原结合部位）。
例如，接头可以是适宜的氨基酸序列，尤其是1至50个氨基酸残基之间、例如5至50个氨基酸残基之间、优选1至35个氨基酸残基之间、如1至10个氨基酸残基之间的氨基酸序列。这类氨基酸序列的一些优选的实例包括gly-ser接头，例如(glyxsery)z类型的，如例如WO 99/42077中所述的(gly4ser)3或(gly3ser2)3，及本文提到的Ablynx的申请（见例如WO06/040153和WO 06/122825）中所述的GS30、GS15、GS9和GS7接头，以及铰链样区域，如天然存在的重链抗体的铰链区或类似的序列（例如，如WO 94/04678中所述）。
一些其他尤其优选的接头是聚丙氨酸（如AAA），以及接头GS30（WO06/122825中的SEQ ID NO:85）和GS9（WO 06/122825中的SEQ ID NO:84）。
其他适宜的接头通常包括有机化合物或聚合物，尤其是适合用于药用蛋白质中的那些。非限制性实例包括例如聚乙二醇部分，例如，如用来连接抗体结构域的那些。见例如WO 04/081026。
在本发明的范围之内涵盖，所使用的接头（一个或多个）的长度、柔性程度和/或其他特性（虽然不如通常对于ScFv片段中所用的接头那样关键）可以对本发明的最终多肽的特性具有一些影响，该特性包括但不限于对DR5或对一种或多种其他抗原的亲和力、特异性或亲合性。基于本文的公开，可选地在一些有限的例行实验之后，技术人员将能够确定用于本发明的具体多肽中的最适的接头（一个或多个）。
在一个实施方案中，在包含例如针对多聚体抗原（如多聚体受体或其他蛋白质）的NB剂的本发明多价多肽中，接头的长度和柔性可以是这样，其使得存在于该多肽中的每个本发明NB剂均可以分别结合该多聚体的各亚基上的抗原决定簇。类似地，在包含针对同一抗原上的两个或更多个不同抗原决定簇（例如针对抗原的不同表位和/或针对多聚体受体、通道或蛋白质的不同亚基）的NB剂的本发明多特异性多肽中，接头的长度和柔性可以是这样，其使得可以允许各NB剂分别结合其预期的抗原决定簇。同样，基于本文的公开，可选地在一些有限的例行实验之后，技术人员将能够确定用于本发明的具体多肽中的最适的接头（一个或多个）。
在本发明的范围之内也涵盖，所使用的接头（一个或多个）赋予本发明多肽一种或多种其他有利特性或功能性、和/或提供一个或多个用于形成衍生物和/或用于连接官能团（例如，如本文针对本发明NB剂的衍生物所述）的位点。例如，包含一个或多个带电荷氨基酸残基的接头可以提供改善的亲水特性，而形成或包含小的表位或标签的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化的目的。同样，基于本文的公开，可选地在一些有限的例行实验之后，技术人员将能够确定用于本发明的具体多肽中的最适的接头。
最后，在将两个或更多个接头用于本发明多肽中时，这些接头可以相同或不同。同样，基于本文的公开，可选地在一些有限的例行实验之后，技术人员将能够确定用于本发明的具体多肽中的最适的接头。
通常，为了易于表达和生产，本发明多肽将是线性多肽。但是，本发明在其最广泛的含义上不限于此。例如，在本发明多肽包含三个或更多个NB剂时，可以通过使用具有三条或更多条“臂”的接头来连接它们，每条“臂”与一个NB剂连接，以提供“星状”构建体。虽然通常较不优选，但也可以使用环状构建体。
本发明进一步包含本发明多肽的衍生物，其可以基本上类似于本发明NB剂的衍生物，即，如本文所述。
本发明还包含“基本上由本发明多肽组成”的蛋白质或多肽（其中用词“基本上由…组成”具有与上文所指出的基本相同的含义）。
根据本发明的一个方面，本发明多肽处于本文定义的基本上分离的形式。
制备本发明NB剂的方法
如技术人员从本文的进一步描述显而易见，可以以本身已知的方式制备本发明的氨基酸序列、NB剂、多肽、化合物和核酸。例如，可以以本身已知的用于制备抗体，尤其是用于制备抗体片段（包括但不限于（单）结构域抗体和ScFv片段）的任何方式，制备本发明NB剂和多肽。用于制备氨基酸序列、NB剂、多肽和核酸的一些优选但非限制的方法包括本文所述的方法和技术。
如对技术人员而言显而易见，用于制备本发明的氨基酸序列、NB剂和/或多肽的一种尤其有用的方法通常包括以下步骤：
a)在适宜的宿主细胞或宿主生物（在本文中也称为“本发明的宿主”）中或在另一适宜的表达系统中表达编码该本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽的核酸（在本文中也称为“本发明核酸”），可选地然后：
b)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽。
特别地，这种方法可以包括以下步骤：
a)在使得本发明的宿主表达和/或产生至少一个本发明的氨基酸序列、NB剂和/或多肽的条件下培养和/或维持本发明的宿主；
可选地然后：
b)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽。
本发明核酸可以为单链或双链DNA或RNA的形式。在一个实施方案中，多核苷酸NB剂为双链DNA的形式。例如，本发明的核苷酸NB序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA（如，为在预期的宿主细胞或宿主生物中表达而已经特别调整了密码子使用的DNA）。
根据本发明的一个方面，本发明核酸处于本文定义的基本上分离的形式。
本发明核酸可以为载体的形式、存在于载体中和/或是载体的部分，该载体为例如质粒、粘粒或YAC，其同样可以处于基本上分离的形式。
本发明核酸可以基于本文给出的本发明多肽的氨基酸序列的信息，以本身已知的方式制备或获得，和/或可以分离自适宜的天然来源。为了提供类似物，可以例如对编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列进行位点定向诱变，以提供编码该类似物的本发明核酸。如对技术人员而言显而易见，为了制备包括几个核苷酸序列（例如至少一个编码NB剂的核苷酸序列和例如编码一个或多个接头的核酸）的本发明核酸，可以以适宜的方式将这些序列连接在一起。
用于产生本发明核酸的技术对技术人员而言显而易见，且可以例如包括但不限于：自动化DNA合成；位点定向诱变；组合两个或更多个天然存在的和/或合成的序列（或其两个或更多个部分）；引入导致表达截短的表达产品的突变；引入一个或多个限制位点（例如，以产生可以用适宜的限制酶容易地消化和/或连接的盒和/或区域）；和/或用例如天然存在的DR5形式的序列作为模板，使用一个或多个“错配”引物，利用PCR反应引入突变。这些及其他技术对技术人员而言显而易见，且同样可以参考本文提到的标准手册，如Sambrook等和Ausubel等，以及下文的实施例。
如对技术人员而言显而易见，且如例如WO 08/020079的131-134页上所述，本发明核酸可以为遗传构建体的形式、存在于遗传构建体中和/或是遗传构建体的部分。这类遗传构建体通常包含至少一个本发明核酸，该核酸可选地与本身已知的遗传构建体的一个或多个元件有效连接，如，例如一个或多个适宜的调节元件（如一个或多个适宜的启动子、增强子、终止子等）和本文提到的遗传构建体的其他元件。包含至少一个本发明核酸的这类遗传构建体在本文中也称为“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA。本发明的遗传构建体可以为适合用于转化预期的宿主细胞或宿主生物的形式、适合用于整合入预期的宿主细胞的基因组DNA中的形式、或适合用于在预期的宿主生物中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以为载体的形式，如，例如质粒、黏粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，该载体可以是表达载体，即可以提供体外和/或体内表达（例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物和/或表达系统中）的载体。
本发明核酸可以为遗传构建体的形式、存在于遗传构建体中和/或是遗传构建体的部分。这类遗传构建体通常包含至少一个本发明核酸，该核酸可选地与本身已知的遗传构建体的一个或多个元件连接，如，例如一个或多个适宜的调节元件（如一个或多个适宜的启动子、增强子、终止子等）和本文提到的遗传构建体的其他元件。在本发明的范围之内也考虑本领域已知的其他适宜的遗传构建体，包括例如WO 08/020079的131-134页上所述的那些。包含至少一个本发明核酸的这类遗传构建体在本文中也称为“本发明的遗传构建体”。
在一个非限制性实施方案中，本发明的遗传构建体包含：a）至少一个本发明核酸；其中该多核苷酸NB剂有效连接于b）一个或多个调节元件，如启动子和可选地适宜的终止子；及可选地c）一个或多个本身已知的遗传构建体的其他元件。
在一个实施方案中，在本发明的遗传构建体中，该至少一个本发明核酸和该调节元件及可选地该一个或多个其他元件相互“有效连接”，“有效连接”通常指它们相互处于功能关系中。例如，如果启动子能够起始或以其他方式控制/调节编码序列的转录和/或表达，则认为该启动子与该编码序列“有效连接”（其中，应将该编码序列理解为“处于该启动子的控制之下”）。通常，在两个核苷酸序列有效连接时，它们将处于相同的取向，且通常还将处于同一阅读框中。它们通常将基本上连续，虽然这可以是不需要的。短语“有效连接（operably connected）”和“有效地连接（operablylinked）”可互换使用。
术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“有效连接”具有它们在本领域中的通常含义。存在于遗传构建体中的“其他元件”可以是例如3'-或5'-UTR序列、前导序列、选择标记、表达标记/报道基因、和/或可以便于或增加转化或整合（的效率）的元件。用于这类遗传构建体的这些及其他适宜的元件对技术人员而言显而易见，且可以例如取决于所使用的构建体的类型、预期的宿主细胞或宿主生物、表达本发明的目的核苷酸序列的方式（即，通过组成性表达、瞬时表达或诱导型表达）、和/或所使用的转化技术。例如，可以以基本上类似的方式，使用本身已知的用于表达和产生抗体和抗体片段（包括但不限于（单）结构域抗体和ScFv片段）的调节序列、启动子和终止子。
在一个实施方案中，本发明的遗传构建体的调节元件和其他元件是这样，它们能够在预期的宿主细胞或宿主生物中提供其预期的生物学功能。
例如，启动子、增强子或终止子应在预期的宿主细胞或宿主生物中“有效”，“有效”意指（例如）该启动子应能够起始或以其他方式控制/调节与它有效连接（如本文所定义）的核苷酸序列（例如编码序列）的转录和/或表达。一些尤其优选的启动子包括但不限于本身已知的用于在本文提到的宿主细胞中表达的启动子；尤其是用于在细菌细胞中表达的启动子。
本发明核酸和/或本发明的遗传构建体可以用来转化宿主细胞或宿主生物，即用于表达和/或产生本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽。适宜的宿主或宿主细胞对技术人员而言显而易见，且可以是例如任何适宜的真菌、原核或真核细胞或细胞系，或任何适宜的真菌、原核或真核生物，例如WO 08/020079的134和135页上所述的那些；以及本身已知的用于表达和产生抗体和抗体片段（包括但不限于（单）结构域抗体和ScFv片段）的所有其他宿主或宿主细胞，其对技术人员而言显而易见。也参考上文引用的一般背景技术；以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等,(1998),上引文；Riechmann和Muyldermans,(1999),上引文；van der Linden,(2000),上引文；Thomassen等,(2002),上引文；Joosten等,(2003),上引文；Joosten等,(2005),上引文；以及本文引用的其他参考文献。
如WO 08/020079中的135和136页上及WO 08/020079中引用的其他参考文献中进一步描述的，例如为了预防和/或治疗的目的（例如，作为基因治疗），可以在多细胞生物的一个或多个细胞、组织或器官中引入和表达本发明的NB氨基酸序列和多肽。
对于NB剂在细胞中的表达，它们可以表达为所谓的“胞内抗体”(intrabody),如例如WO 94/02610、WO 95/22618和US-A-7004940、WO03/014960中、Cattaneo,A.&Biocca,S.(1997)Intracellular Antibodies:Development and Applications.Landes and Springer-Verlag中和Kontermann,Methods 34,(2004),163-170中所述的。
本发明的NB氨基酸序列和多肽还可以例如在转基因哺乳动物的乳汁中，例如在兔、奶牛、山羊或绵羊的乳汁中产生（用于将转基因引入哺乳动物中的一般技术见例如US6,741,957、US6,304,489和US6,849,992）；在植物或植物部分,包括但不限于,它们的叶、花、果实、种子、根或块茎中（例如在烟草、玉米、大豆或苜蓿中）产生；或在例如家蚕（Bombyx mori）的蚕蛹中产生。
此外，本发明的NB氨基酸序列和多肽可以在无细胞表达系统中表达和/或产生，且这类系统的适宜的实例对技术人员而言显而易见。一些非限制性实例包括在小麦胚系统中、在兔网织红细胞裂解物中或在大肠杆菌（E.coli）Zubay系统中表达。
如本文所提到，使用从质粒或载体表达的NB剂的优势之一是，可以通过在适宜的细菌系统中表达来制备基于该NB剂的多肽，且对技术人员而言，适宜的细菌表达系统、载体、宿主细胞、调节元件等例如从上文引用的参考文献是显而易见的。但是，应指出，本发明在其最广泛的含义上不限于在细菌系统中表达。
在一个实施方案中，通过参考具体宿主细胞/宿主生物的密码子使用的频率，优化本发明的多核苷酸序列的密码子使用。产生的核苷酸序列是“密码子优化的”NB核苷酸序列。可以针对在原核或真核宿主细胞/宿主生物中的表达来产生密码子优化的NB序列。具体的实例包括本文提供的表达系统。
在本发明的一个实施方案中，使用可以以适合用于药用的形式提供本发明多肽的表达系统（体内或体外），例如细菌表达系统，且这类表达系统对技术人员而言同样显而易见。如对技术人员而言同样显而易见，可以用肽合成技术制备适合用于药用的本发明多肽。
对于工业规模的生产，用于NB剂或包含NB剂的蛋白质药物的（工业）生产的优选异源宿主包括大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、酿酒酵母（S.cerevisiae）的如下菌株，其适合用于大规模表达/生产/发酵，且尤其适合用于大规模药物（即，GMP级）表达/生产/发酵。这类菌株的适宜的实例对技术人员而言显而易见。这类菌株和生产/表达系统也可以得自诸如Biovitrum（Uppsala,瑞典）的公司。
备选地，哺乳动物细胞系，尤其是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞可以用于大规模表达/生产/发酵，尤其是用于大规模药物表达/生产/发酵。同样，这类表达/生产系统也可以得自本文提到的一些公司。
具体表达系统的选择将部分取决于对某些翻译后修饰（更特别地，糖基化）的需要。对于希望或需要糖基化的包含NB剂的重组蛋白质的产生，将需要具有糖基化所表达的蛋白质的能力的哺乳动物表达宿主。在这方面，对技术人员而言显而易见，所获得的糖基化模式（即，所连接的残基的种类、数目和位置）将取决于用来表达的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系（即，导致基本上具有人糖基化模式的蛋白质），或者使用另一哺乳动物细胞系，该哺乳动物细胞系可以提供基本上和/或在功能上与人糖基化相同或至少模拟人糖基化的糖基化模式。通常，诸如大肠杆菌的原核宿主不具有糖基化蛋白质的能力，且诸如酵母的低等真核生物的使用通常导致不同于人糖基化的糖基化模式。然而，应理解，取决于待获得的期望氨基酸序列、NB剂或多肽，所有前述宿主细胞和表达系统都可以用于本发明。
因此，根据本发明的一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽是糖基化的。根据本发明的另一非限制性方面，本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽是非糖基化的。
根据本发明的一个优选但非限制的方面，在细菌细胞中，尤其是在适合用于大规模药物产生的细菌细胞中，如在本文提到的菌株的细胞中产生本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽。
根据本发明的另一优选但非限制的方面，在酵母细胞中，尤其是在适合用于大规模药物产生的酵母细胞中，如在本文提到的物种的细胞中产生本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽。
还根据本发明的另一优选但非限制的方面，在哺乳动物细胞中，尤其是在人细胞中或人细胞系的细胞中，更尤其是在适合用于大规模药物产生的人细胞或人细胞系的细胞中，如在上文提到的细胞系中产生本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽。
当通过在宿主细胞中表达来产生本发明的氨基酸序列、NB剂和多肽时，本发明的NB氨基酸序列和多肽可以在胞内（例如在胞质溶胶中、在周质中或在包含体中）产生，然后从宿主细胞分离并可选地进一步纯化；或者可以在胞外（例如在培养宿主细胞的培养基中）产生，然后从培养基分离并可选地进一步纯化。因此，根据本发明的一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽是已在胞内产生、并已从宿主细胞，且尤其是从细菌细胞或从细菌细胞中的包含体分离的氨基酸序列、NB剂或多肽。根据本发明的另一非限制性方面，本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽是已在胞外产生、并已从培养宿主细胞的培养基分离的氨基酸序列、NB剂或多肽。
例如WO 08/020079的138和139页上，提供表达系统的更充分的讨论。包括与这些宿主细胞一起使用的启动子的非限制性列表，例如包括WO 08/020079的139和140页上提到的那些。同样包括与这些宿主细胞一起使用的分泌序列的非限制性列表，例如包括WO 08/020079的140页上提到的那些。
适合用于转化本发明的宿主或宿主细胞的技术对技术人员而言显而易见，且可以取决于预期的宿主细胞/宿主生物和所使用的遗传构建体。同样可以参考本文提到的手册和专利申请。
对技术人员而言同样显而易见，本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽可以（首先）以未成熟的形式（如本文所提到）产生，然后取决于所使用的宿主细胞/宿主生物，被翻译后修饰。同样，也取决于所使用的宿主细胞/宿主生物，本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽可以是糖基化的。
然后可以使用本身已知的蛋白质分离和/或纯化技术，如（制备型）层析和/或电泳技术、差示沉淀技术、亲和技术（例如，使用与本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽融合的特定可切割的氨基酸序列）和/或制备型免疫学技术（即，使用针对待分离的氨基酸序列的抗体），从宿主细胞/宿主生物和/或从培养该宿主细胞或宿主生物的培养基，分离本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽。
药物制剂或组合物
通常，对于药用，可以将本发明多肽配制为药物制剂或组合物，其包含至少一个本发明多肽和至少一种可药用载体、稀释剂或赋形剂和/或助剂，且可选地一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。作为非限制性实例，这种制剂可以为适合用于口服施用、用于肠胃外施用（如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注）、用于局部施用、用于通过吸入、通过皮肤贴剂、通过植入、通过栓剂等施用的形式。这类适宜的施用形式（取决于施用方式，其可以是固体、半固体或液体）以及用于其制备的方法和载体对技术人员而言显而易见，并在本文中进一步描述。这种药物制剂或组合物通常在本文中称为“药物组合物”。用于非人生物的药物制剂或组合物通常在本文中称为“兽医组合物”。
因此，在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一个本发明的氨基酸序列、至少一个本发明NB剂或至少一个本发明多肽和至少一种适宜的载体、稀释剂或赋形剂（即，适合用于药用），并可选地包含一种或多种其他活性物质。
通常，可以以本身已知的任何适宜的方式，配制和施用本发明的NB氨基酸序列和多肽。参考例如上文引用的一般背景技术（尤其是参考WO04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867和WO08/020079），以及标准手册，如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company，USA(1990),Remington,the Science andPractice of Pharmacy，第21版,Lippincott Williamsh和Wilkins(2005)；或the Handbook of Therapeutic Antibodies(S.Dubel,Ed.),Wiley，Weinheim,2007（见例如252-255页）。
可以以本身已知的用于常规抗体和抗体片段（包括ScFv和双抗体）及其他药物活性蛋白质的任何方式，配制和施用本发明的NB氨基酸序列和多肽。这类制剂和用于制备这类制剂的方法对技术人员而言显而易见，且例如包括适合用肠胃外施用（例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、管腔内、动脉内或鞘内施用）或用于局部（即，经皮肤或真皮内）施用的制剂。
用于肠胃外施用的制剂可以是例如适合用于输注或注射的无菌的溶液、悬液、分散体或乳剂。适合用于这类制剂的载体或稀释剂例如非限制性地包括WO 08/020079的143页上提到的那些。在一个实施方案中，该制剂是水溶液或悬液。
可以用基因治疗的递送方法来施用本发明的NB氨基酸序列和多肽。见例如美国专利号5,399,346，在此针对其基因治疗递送方法而将其引入作为参考。使用基因治疗递送方法，转染了编码本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽的基因的原代细胞可以额外地用组织特异性启动子转染来靶向特定器官、组织、移植物、肿瘤或细胞，且可以额外地用信号序列和稳定化序列转染来进行亚细胞定位的表达。
因此，本发明的NB氨基酸序列和多肽可以全身施用，例如口服，与药物可接受载体诸如惰性稀释剂或可同化的可食用载体组合。它们可以包封在硬质或软质外壳明胶胶囊中，可以压制成片剂，或可以直接掺入患者膳食的食物。对于口服治疗施用，本发明的NB氨基酸序列和多肽可以与一种或多种赋形剂组合，并以吞咽片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂（wafer）等形式使用。这类组合物和制剂应包含至少0.1%本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽。当然，它们在该组合物和制剂中的百分比可以变动，且可以方便地在给定的单位剂型的重量的约2%至约60%之间。本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽在这类可药用组合物中的量是这样，其使得可以获得有效剂量水平。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以包含黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂和甜味剂或调味剂，例如WO 08/020079的143-144页上提到的那些。在单位剂型是胶囊时，除以上类型的材料外，它可以包含液体载体，如植物油或聚乙二醇。多种其他材料可以包衣存在或以其他方式修饰固体单位剂型的物理形式。例如，可以用明胶、腊、虫胶或糖等包被片剂、丸剂或胶囊。糖浆剂或酏剂可以包含本发明的NB氨基酸序列和多肽、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂，如樱桃或桔子味。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料都应该是可药用的，且在所用量下基本无毒性。此外，本发明的NB氨基酸序列和多肽可以掺入缓释制剂和装置。
还可以用允许本发明的构建体抵抗胃部环境并进入肠的肠溶衣来提供用于口服施用的制剂和剂型。更特别地，可以适宜地配制用于口服施用的制剂和剂型来递送入任何希望的胃肠道部分。此外，可以用适宜的栓剂来递送入胃肠道。
还可以通过输注或注射来静脉内或腹膜内施用本发明的NB氨基酸序列和多肽。具体实例如WO 08/020079的144和145页上进一步描述。
对于局部施用，本发明的NB氨基酸序列和多肽可以以纯的形式应用，即，在它们是液体时。但是，通常希望将它们与可皮肤用载体组合，作为组合物或制剂（其可以是固体或液体）对皮肤施用。具体实例如WO08/020079的145页上进一步描述。
通常，本发明的NB氨基酸序列和多肽在诸如洗剂的液体组合物中的浓度将是约0.1-25wt-%、优选约0.5-10wt-%。在诸如凝胶或粉末的半固体或固体组合物中的浓度将是约0.1-5wt-%、优选约0.5-2.5wt-%。
治疗应有所需的本发明的NB氨基酸序列和多肽的量不仅将随所选择的具体氨基酸序列、NB剂或多肽而变，还将随给药途径、所治疗的病症的性质和患者的年龄和状态而变，且最终由主治医师或临床医师判断。本发明的NB氨基酸序列和多肽的剂量也取决于靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官而变。
希望的剂量可以方便地以单剂量或按适当的时间间隔施用的分剂量（例如每天两个、三个、四个或多个亚剂量（sub-dose））提供。亚剂量本身可以进一步分为例如许多不连续的松散间隔开的施用；如从吹药器多次吸入或通过应用多次滴入眼内。
给药方案可以包括长期、每日治疗。“长期”意指至少两周，且优选几周、几个月或几年的持续时间。考虑本文的教导，本领域普通技术人员仅用例行实验即可以确定对此剂量范围的必要修改。见Remington’sPharmaceutical Sciences(Martin,E.W.,第4版),Mack Publishing Co.,Easton,PA。在任何并发症的情况下，剂量还可以由各医师调整。
另一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种与DR5相关的疾病和障碍的方法，该方法包括对有需要的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明NB剂、本发明多肽、和/或包含其的药物组合物。
在本发明的背景中，术语“预防和/或治疗”不仅包含预防和/或治疗该疾病，通常还包含预防该疾病的起始，减慢或逆转该疾病的进展，预防或减慢与该疾病相关的一种或多种症状的起始，减轻和/或缓解与该疾病相关的一种或多种症状，降低该疾病和/或与之相关的任何症状的严重度和/或持续时间，和/或预防该疾病和/或与之相关的任何症状的严重度的进一步增加，预防、减少或逆转由该疾病引起的任何生理损伤，以及通常地对所治疗的患者有益的任何药理学作用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但尤其是哺乳动物，更尤其是人类。对技术人员而言显而易见，待治疗的受试者将尤其是患有本文提到的疾病和障碍或有罹患本文提到的疾病和障碍的风险的个体。
本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种与DR5相关、与它的生物学或药理学活性相关和/或与DR5所涉及的生物途径或信号发放相关的疾病或障碍的方法，该方法包括对有需要的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明NB剂、本发明多肽，和/或包含其的药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种可以通过调节DR5、它的生物学或药理学活性和/或DR5所涉及的生物途径或信号发放来治疗的疾病或障碍的方法，该方法包括对有需要的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明NB剂、本发明多肽，和/或包含其的药物组合物。在一个实施方案中，该药物有效量可以是足以调节DR5、它的生物学或药理学活性、和/或DR5所涉及的生物途径或信号发放的量；和/或提供足以调节DR5、它的生物学或药理学活性和/或DR5所涉及的生物途径或信号发放的本发明氨基酸序列、本发明NB剂、本发明多肽的循环水平的量。
在一个实施方案中，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种疾病或障碍的方法，所述疾病或障碍可以通过对患者施用本发明的NB氨基酸序列或多肽、或编码其的NB核苷酸构建体、和/或包含其的药物组合物来预防和/或治疗。在一个实施方案中，该方法包括对有需要的受试者施用药物活性量的本发明的NB氨基酸序列或多肽、或编码其的NB核苷酸构建体、和/或包含其的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种疾病或障碍的方法，所述疾病或障碍可以通过增强待治疗的受试者的特定细胞或特定组织的细胞凋亡（尤其是通过增强存在于待治疗的受试者中的癌细胞或肿瘤的细胞凋亡）来预防和/或治疗，该方法包括对有需要的受试者施用药物活性量的本发明的NB氨基酸序列或多肽、或编码其的NB核苷酸构建体、和/或包含其的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种疾病或障碍的方法，该疾病或障碍选自本文所列疾病和障碍，该方法包括对有需要的受试者施用本发明的NB氨基酸序列或多肽、或编码其的NB核苷酸构建体、和/或包含其的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于免疫治疗，尤其是用于被动免疫治疗的方法，该方法包括对患有本文提到的疾病和障碍或有罹患本文提到的疾病和障碍的风险的受试者施用药物活性量的发明的NB氨基酸序列或多肽、或编码其的NB核苷酸构建体、和/或包含其的药物组合物。
在以上方法中，取决于待使用的具体药物制剂或组合物，可以以任何适宜的方式施用本发明的氨基酸序列、NB剂和/或多肽、和/或包含其的组合物。因此，同样取决于待使用的具体药物制剂或组合物，本发明的氨基酸序列、NB剂和/或多肽和/或包含其的组合物可以例如口服施用、腹膜内施用（例如静脉内、皮下、肌内或通过绕开胃肠道的任何其他给药途径）、鼻内施用、经皮施用、局部施用、利用栓剂施用、通过吸入施用。取决于待预防或治疗的疾病或障碍和临床医师公知的其他因素，临床医师将能够选择适宜的给药途径及适合用于这类施用的药物制剂或组合物。
按照适合用于预防和/或治疗待预防或治疗的疾病或障碍的治疗方案施用本发明的氨基酸序列、NB剂和/或多肽和/或包含其的组合物。取决于诸如待预防或治疗的疾病或障碍、待治疗的疾病的严重度和/或其症状的严重度、待使用的本发明的具体氨基酸序列、NB剂或多肽、待使用的具体给药途径和药物制剂或组合物、患者的年龄、性别、体重、饮食、一般状态等因素，以及临床医师公知的类似因素，临床医师通常将能够确定适宜的治疗方案。
通常，治疗方案将包含以一个或多个药物有效量或剂量施用一种或多种本发明的氨基酸序列、NB剂和/或多肽，或一种或多种包含其的组合物。同样基于上文述及的因素，临床医师可以确定待施用的具体量或剂量。
通常，对于本文提到的疾病和障碍的预防和/或治疗，且取决于待治疗的具体疾病或障碍、待使用的本发明的具体氨基酸序列、NB剂和多肽的效力、所使用的具体给药途径和具体药物制剂或组合物，通常以每天每千克体重1克至0.01微克之间、优选每天每千克体重0.1克至0.1微克之间、如每天每千克体重约1、10、100或1000微克的量，连续地（例如通过输注）或作为单个日剂量或作为一天内的多个分剂量，施用本发明的NB氨基酸序列和多肽。取决于本文提到的因素，临床医师通常将能够确定适宜的日剂量。同样显而易见，在具体病例中，临床医师可以例如根据上文述及的因素和其专家判断来选择偏离这些量。通常，可以从通过基本相同的途径施用的针对同一靶标的可比常规抗体或抗体片段的通常施用量，但考虑亲和力/亲合性、功效、生物分布、半衰期和技术人员公知的类似因素的差异，获得关于待施用的量的一些指导。
在一个实施方案中，使用单个连续的本发明氨基酸序列、NB剂或多肽，无论翻译的序列包含单个结构域或多个单价或多价的结构域。在一个实施方案中，组合提供本发明的两个或更多个氨基酸序列、NB剂和/或多肽。
本发明NB剂、氨基酸序列和多肽可以与一种或多种其他药物活性化合物或成分组合使用，即，作为组合治疗方案，其可以或可以不产生协同效应。同样，基于上文述及的因素和他的专家判断，临床医生将能够选择这类其他化合物或成分，以及适宜的组合治疗方案。
特别地，本发明的NB氨基酸序列和多肽可以与其他药物活性化合物或成分组合使用，其中该药物活性化合物或成分用于或可以用于预防和/或治疗本文所述的疾病和障碍，因此，可以或可以不获得协同效应。这类化合物和成分的实例，以及用于施用它们的途径、方法和药物制剂或组合物对临床医师而言显而易见，且一般包括通常用于治疗待治疗的肿瘤的细胞抑制性活性成分。
具体考虑的与本发明NB剂的组合包括但不限于例如紫杉醇、吉西他滨、顺铂、cIAP抑制剂（如cIAP1、cIAP2和/或XIAP的抑制剂）、MEK抑制剂（包括但不限于例如U0126、PD0325901）、bRaf抑制剂（包括但不限于例如RAF265）和mTOR抑制剂（包括但不限于例如RAD001）。本文和实施例中提供具体的组合。
在将两种或多种物质或成分用作组合治疗方案的部分时，它们可以在基本相同的时间或在不同的时间（例如基本上同时地、连续地或按照交替方案），通过相同的给药途径或通过不同的给药途径施用。对技术人员而言显而易见，在通过相同的给药途径同时施用该物质或成分时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或作为组合药物制剂或组合物的部分施用。
同样，在将两种或多种物质或成分作为组合治疗方案的部分使用时，可以按照与单独使用该化合物或成分时相同的量以及相同的方案，施用各物质或成分，且这种组合使用可以或可以不产生协同效应。但是，在两种或多种活性物质或成分的组合使用产生协同效应时，也可以降低所施用的一种、多种或全部物质或成分的量，同时仍达到希望的治疗作用。这可以例如用于避免、限制或减少任何不希望的与一种或多种物质或成分按它们的常用量使用时相关的副作用，同时仍获得希望的药物作用或治疗作用。
对临床医师而言显而易见，可以以本身已知的用于所涉及的疾病或障碍的任何方式，确定和/或跟踪按照本发明使用的治疗方案的有效性。适当时，且具体病例具体分析，临床医师也能够改变或修改具体的治疗方案来达到希望的治疗效果，以避免、限制或减少不希望的副作用，和/或在达到希望的治疗效果与避免、限制或减少不希望的副作用之间达到适当的平衡。
通常，将跟踪治疗方案直至达到希望的治疗效果和/或长达期望的治疗效果可以维持的时间。同样，这可以由临床医师确定。
在另一方面，本发明涉及本发明的氨基酸序列、NB剂或多肽在制备用于预防和/或治疗至少一种与DR5相关的疾病和障碍的药物组合物中的用途；和/或在本文提到的一种或多种治疗方法中的用途。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但尤其是哺乳动物，更尤其是人类。在兽医应用中，待治疗的受试者包括为了商业目的饲养或作为宠物饲养的任何动物。对技术人员而言显而易见，该待治疗的受试者将尤其是患有本文提到的疾病和障碍或有罹患本文提到的疾病和障碍的风险的个体。
本发明涉及本发明的NB氨基酸序列或多肽或编码其的NB核苷酸在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于预防和/或治疗至少一种可以通过对患者施用本发明的NB氨基酸序列或多肽、或编码其的NB核苷酸、和/或包含其的药物组合物来预防和/或治疗的疾病或障碍。
更特别地，本发明涉及本发明的NB氨基酸序列或多肽、或编码其的NB核苷酸在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于预防和/或治疗与DR5相关的疾病和障碍，尤其是用于预防和治疗本文所列的一种或多种疾病和障碍。
同样，在这种药物组合物中，该一种或多种本发明的NB氨基酸序列或多肽、或编码其的NB核苷酸、和/或包含其的药物组合物还可以与一种或多种其他活性成分（如本文提到的那些）适宜地组合。
在一个实施方案中，虽然更优选使用本发明的示例性NB剂，但显而易见，基于本文的描述，技术人员将能够以类似的方式设计和/或产生其他针对DR5的氨基酸序列，尤其是（单）结构域抗体，以及包含这类（单）结构域抗体的多肽，和/或编码它们的核苷酸。
例如，对技术人员而言显而易见，可以将本文提到的本发明NB剂的一个或多个CDR“移植”到（单）结构域抗体或其他蛋白质支架上，其包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架。适合用于这种CDR移植的支架和技术对技术人员而言显而易见，且为本领域公知，见例如WO 08/020079中提到的那些。例如，可以以类似的方式使用本身已知的用于将小鼠或大鼠CDR移植至人构架和支架的技术来提供包含一个或多个本发明NB剂的CDR和一个或多个人构架区或序列的嵌合蛋白质。
还应指出，在本发明NB剂包含一个或多个不同于本文提到的优选CDR序列的CDR序列时，可以例如使用WO 08/020079中所述的一种或多种技术，以本身已知的任何方式获得这些CDR序列。
基于本文的公开，本发明的氨基酸序列、NB剂、多肽、核酸、遗传构建体及宿主和宿主细胞的其他用途对技术人员而言显而易见。例如，且非限制性地，本发明的氨基酸序列可以与适宜的载体或固体支持物连接，以提供可以以本身已知的方式用来从包含DR5的组合物和制剂中纯化DR5的介质。包含适宜可检测标记的本发明氨基酸序列的衍生物还可以用作测定（定性地或定量地）DR5在组合物或制剂中的存在的标记，或用作选择性检测DR5在细胞或组织表面上的存在的标记（例如，与适宜的细胞分选技术组合）。
现将用以下非限制性实验部分来进一步描述本发明。
1.实施例I
1.1.人和cyno DR5克隆及蛋白质制备
1.1.1.克隆人长片段形式DR5胞外域(ECD）及cyno长片段和短片段形式DR5 ECD
通过RT-PCR克隆人长片段形式DR5 ECD（aa55-213）。通过Qiagen的RNeasy mini Kit（目录号74104）从Jurkat和Raji细胞分离总RNA。通过SuperScript II First Strand Synthesis System（Invitrogen,目录号11904-018）制备cDNA，然后使用标准流程，通过High Fidelity PlatinumTaq DNA Polymerase（Invitrogen,目录号11304-011）扩增：94℃2分钟；随后95℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒的30个循环；最后72℃孵育7分钟。用于PCR的正向和反向引物分别是：5’-CTGATCACCCAACAAGACCT AG-3’(SEQ ID NO:83)和5’-GCCTGAGAGAGAACAGGGAG A-3’(SEQ ID NO:84)。然后将产生的476bp片段连接入大肠杆菌表达载体pBAD/Thio-TOPO（Invitrogen,目录号K370-01）。通过PCR鉴定阳性克隆，并通过DNA测序确认。
全长cyno DR5基因最初通过PR-PCR克隆自食蟹猴肝cDNA（BioChain Institute,Inc.美国）。根据人DR5核苷酸序列，设计正向引物(5’-CACCATGGAA CAACGGGGAC AGAACGCC-3’)(SEQ ID NO:85)和反向引物(5’-TTAGGACATG GCAGAGTCTG CATTAC CTTC-3’)(SEQ ID NO:86)，分别包括起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA）。用High Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase（Invitrogen,目录号11304-011）进行PCR，并将产生的片段连接入pcDNA3.1定向TOPO载体。通过DNA测序鉴定阳性克隆。类似于人DR5基因，鉴定出cyno DR5基因的两个可选剪接变体。一个具有长片段形式ECD，另一个具有短片段形式ECD。
将cyno长片段（aa55-213）和短片段（aa55-174）形式的DR5ECD都进一步克隆入pBAD/Thio-TOPO载体（Invitrogen,目录号K370-01）。通过PCR鉴定阳性克隆，并通过DNA测序确认。
1.1.2.建立表达细胞表面cyno DR5的CHO细胞系
用FuGENE6（Roche Applied Sciences）和1μg gpcDNA3.1-cynoDR5表达载体，在90-95%汇合时转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）。通过500μg/ml遗传霉素（G418）选择转染的细胞，并通过细胞分选进行亚克隆。
1.1.3.从大肠杆菌表达和纯化硫氧还蛋白-DR5ECD-His6融合物
为了表达DR5 ECD，将pBAD/Thio-DR5ECD转化入大肠杆菌菌株TOP10（Invitrogen,目录号C4040-03）。用单菌落接种100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB。225转/分摇动，37℃过夜孵育此培养物。用30ml该过夜培养物接种三升LB/氨苄青霉素，并在37℃摇动，直至OD600达到0.5。然后用0.02%阿拉伯糖在37℃诱导培养物3小时。将细菌沉淀重悬在21毫升含有蛋白酶抑制剂（Roche,目录号1836153）的裂解缓冲液（含0.3M NaCl、0.4%Triton X-100和10mM咪唑的PBS）中。超声处理裂解物两次60秒，然后20,000xg离心20分钟。通过镍螯合物亲和层析，纯化可溶的带Hisx6标签的DR5 ECD。可溶的带Hisx6标签的DR5 ECD通过在DR5构建体阅读框的3’端插入编码SEQ ID NO:91或92的多肽标签的序列来产生，其中该标签表达在多肽的C末端。使澄清的裂解物通过6ml用裂解缓冲液平衡的Ni-NTA Agarose（Qiagen,目录号30210）。用20ml裂解缓冲液洗涤柱，然后用15ml含有50mM咪唑和0.1%TritonX-100的PBS洗涤。然后用10ml含有100mM咪唑和0.1%Triton X-100的PBS，然后用含有250mM咪唑的相同缓冲液，洗脱DR5 ECD蛋白质。在4-12%NuPAGE Bis-Tris凝胶（Invitrogen,目录号NP0329BOX）上检查级分。混合含有DR5 ECD蛋白质的阳性级分，浓缩，并保存在-20℃。
镍螯合物亲和层析后，通过在具有Unicorn软件程序的AmershamAKTA explorer上进行的大小排阻层析，进一步纯化蛋白质。柱子是柱床体积为320ml的HiPrep 26/60 Sephacryl S-200HR（Amersham,目录号17-1195-01）。按照厂家的建议使用标准参数。简言之，1xPBS缓冲液（pH7.2）按0.5ml/分钟流过柱子，并在4℃收集0.5ml/级分。
纯化的最后一步是离子交换层析。使用阴离子交换剂Mono Q 5/50GL柱（Amersham,目录号17-5166-01），按1ml/分钟的流速梯度洗脱，并在4℃收集0.5ml/级分。
1.1.4.从HEK293细胞表达和纯化DR5ECD-Fc融合蛋白质
将人和cyno的长片段形式和短片段形式的DR5 ECD都克隆入包含CMV启动子和人IgG1Fc基因片段的pRS5a-IgG表达载体中。通过PCR鉴定阳性克隆，并通过DNA测序确认。用Lipofectamine 2000（Gibco,批号11317078）瞬时转染HEK293细胞。转染后7天收集含有DR5ECD-Fc融合蛋白质的培养基。将浓缩的上清调节至pH 7.2，通过过滤澄清，并按0.5ml/分钟上样在5ml Protein A-Sepharose FF柱上。PBS pH 7.3基线洗涤后，用50mM柠檬酸/140mM NaCl、pH 2.7洗脱结合的物质，中和，并过滤除菌。
1.2.免疫
用人DR5抗原免疫三只美洲驼。一只美洲驼（106）用短的（133残基）重组人DR5（Peprotech,Rocky Hill NJ,目录号310-19）免疫。另外两只美洲驼用全长胞外域人DR5-硫氧还蛋白融合物免疫。美洲驼接受肌内注射50-100微克抗原（用Stimune（Cedi Diagnostics,Lelystad NL）作为佐剂）的7个周剂量，然后在两周后接受另外50微克剂量。在开始免疫后第47和88天采集免疫血液样品，以及在第88天采集淋巴结组织样品。
1.3.文库构建
从免疫血液和淋巴结样品的总RNA制备物制备cDNA样品。使用引物ABL051(SEQ ID NO:73)、ABL052(SEQ ID NO:74)和ABL003(SEQID NO:75)，在一步法RT-PCR反应中，从人DR5免疫的该三只美洲驼的cDNA样品，扩增编码DR5 NB构建体的核苷酸序列。表5中显示引物序列。从凝胶分离扩增自样品中的IgG2和IgG3 cDNA的700bp扩增子，随后在使用含有SfiI和MfeI限制位点的ABL050-MfeI引物(SEQ ID NO:76)及ABL003引物的嵌套式PCR反应中用作模板。随后用SfiI和BstEII（天然存在于VHH基因的FR4中）消化PCR产品，并连接入噬菌粒载体pAX50的对应限制位点，在电穿孔入大肠杆菌TG-1之后获得文库。pAX50是衍生自pUC119的表达载体，其包含LacZ启动子、大肠杆菌噬菌体pIII蛋白质编码序列、氨苄青霉素或羧苄青霉素抗性基因、多克隆位点和gen3前导序列。与NB构建体编码序列符合读框地，该载体编码C端c-Myc标签和(His)6标签。该噬菌粒载体允许产生将各DR5 NB构建体表达为与gene3产物的融合蛋白质的噬菌体颗粒。
表5：引物和接头序列，附SEQ ID NO
Figure BDA00002226856201291
1.4.选择
将0至1微克/ml之间的不同浓度的短片段（182氨基酸）人DR5-Fc融合蛋白质（R&D Systems,Minneapolis MN,目录号631-T2/CF）、全长胞外域人DR5-Fc融合蛋白质（与人IgG1 Fc融合的人DR5氨基酸56至213）和生物素化的短片段（133残基）重组人DR5（Peprotech,Rocky HillNJ,目录号310-19）分别固定在平板和链霉抗生物素蛋白包被的平板上。用补充了1%酪蛋白的PBS进行封闭。加入从上文提到的三个pAX50文库制备的噬菌体，并孵育30分钟（在补充了0.1%酪蛋白和0.1%吐温20的PBS中）。洗去未结合的噬菌体（用补充了0.05%吐温20的PBS）；通过加入胰蛋白酶（1mg/ml于PBS中）并在37℃孵育30分钟来洗脱结合的噬菌体。使洗脱的噬菌体感染指数生长的TG-1细胞，然后将TG-1细胞铺在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上。将从选出物制备的噬菌体用作输入物，在上文所述的全长人DR5-Fc融合蛋白质（与人IgG1 Fc融合的人DR5氨基酸56至213）和生物素化的短片段（133残基）重组人DR5（Peprotech,Rocky Hill NJ,目录号310-19）上进行第二轮选择。
制备第1和第2轮选择输出物的质粒DNA，用SfiI和BstEII消化，将编码抗-DR5 NB构建体的DNA片段连接入pAX50载体，并转化入TG-1感受态细胞。pAX50是衍生自pUC119的表达载体，其包含LacZ启动子、氨苄青霉素或羧苄青霉素抗性基因、多克隆位点和gen3前导序列。与NB构建体编码序列符合读框地，该载体编码C端c-Myc标签和(His)6标签。针对插入片段的存在分析了羧苄青霉素抗性克隆，并验证了阳性克隆的序列。将包含目的DR5 NB构建体的TG-1细胞培养在补充了羧苄青霉素的TB培养基中，并通过加入IPTG来诱导表达。使表达在37℃持续4小时。离心后，将细胞沉淀过夜冷冻，然后在PBS（培养体积的1/10）中4℃重悬1小时，然后再次离心。将得到的上清用作周质提取物。
1.5.筛选
通过ELISA分析了周质提取物（如上文所述）的DR5结合。将10倍稀释的周质提取物加入短片段（133残基）重组人DR5（Peprotech,RockyHill NJ,目录号310-19）或食蟹猴DR5-Fc融合蛋白质（与人IgG1 Fc融合的cyno DR5氨基酸56至213）氨基酸56至213，IgG1 NVTS）包被的平板，并孵育2小时（在补充了0.1%酪蛋白和0.1%吐温20的PBS中）。洗去未结合的周质提取物（补充了0.05%吐温20的PBS），用小鼠抗-myc（Roche,Basel CH,目录号11667149001）、然后用兔抗-小鼠-碱性磷酸酶（Sigma,St.Louis MO,目录号A-1902）检测结合的NB构建体。
在另一组实验中，将表达人DR5（Colo205）或食蟹猴DR5的细胞系（用在CMV启动子下游携带全长cynoDR5基因的表达载体转染的CHO-K1细胞）暴露于周质提取物（重悬在补充了10%胎牛血清的PBS中）。用小鼠抗-myc（单克隆抗体，克隆9E10 ATCC（Teddington,UK）编号CRL-1792，作为腹水在小鼠中产生，并用标准亲和层析，内部纯化）、然后用抗-小鼠IgG-藻红蛋白（Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA,目录号115-115-164），检测NB构建体与细胞结合的DR5的结合。用TO-PRO-3（Molecular Probes,Carlsbad CA,目录号T3605）对染死细胞。结果显示在表6中。
表6：通过ELISA检测的单体NB构建体与DR5的结合（ABS405nm）
  NB构建体   人   Cyno
  10F1   0.754   0.124
  11D1   0.540   0.213
  11H6   0.552   0.133
  4E6   0.838   0.313
  7A12   0.812   0.341
在Biacore 3000仪器上通过表面等离子体共振，评价NB构建体与DR5的结合。通过使周质提取物的稀释液通过270RU短片段（133残基）重组人DR5（Peprotech,Rocky Hill NJ,目录号310-19）包被的CM5传感芯片，分析结合的特异性。分析了解离期，对应的解离速率（koff）在表7和表8中给出。表7显示通过FACS检测的单体NB构建体与细胞结合的DR5的结合的结果（平均荧光计数）。表8显示通过表面等离子体共振测定的解离速率的结果。序列在表1-4中提供。
表7：通过FACS检测的单体NB构建体与细胞结合的DR5的结合。
  NB构建体   人   Cyno
  10F1   125   1626
  11D1   919   417
  11H6   723   292
  4E6   972   2868
  7A12   1097   24516
表8：通过表面等离子体共振测定的解离速率（1/s）。
  NB构建体   koff(1/s)
  10F1   2.34x10-03
  11D1   4.44x10-04
  11H6   2.12x10-03
  4E6   9.54x10-05
  7A12   1.90x10-04
2.实施例II
2.1.三聚化
用MfeI和BstEII消化编码抗-DR5 NB构建体的DNA片段，并与接头序列符合读框地克隆入pAX73、pAX74和pAX75载体。将这些载体转化入TG-1感受态细胞，针对插入片段的存在分析卡那霉素抗性克隆，并验证序列。用SfiI、BpuAI和NotI消化所得到的构建体，然后通过四点连接，将包含NB构建体的片段克隆入SfiI-NotI消化的pAX51载体。同样验证阳性羧苄青霉素抗性克隆（即，编码三价的带CMYC-HIS6标签的NB构建体（各NB构建体构件块通过接头序列与下一个NB构建体构件块融合））的序列。pAX73、pAX74、pAX75和pAX83是pUC衍生的克隆载体，其包含卡那霉素或新霉素抗性基因、多克隆位点，且这些载体以与NB构建体编码序列符合读框的方式编码GlySer接头序列。
2.2.四聚化
分别使用M13Rev(SEQ ID NO:78)和Rev_30GlySer(SEQ ID NO:79)或For_GlySer35(SEQ ID NO:80)和M13Fwd(SEQ ID NO:77)，利用PCR扩增编码抗-DR5NB构建体的DNA片段。Rev_30GlySer和For_GlySer35都编码接头序列（表5中的引物序列）。用MfeI、BamHI和BstEII消化PCR产品，通过三点连接，将两个片段都以与载体编码的接头序列符合读框的方式连接入pAX75和pAX83。将这些载体转化入TG-1感受态细胞，针对二价NB构建体插入片段的存在，分析卡那霉素抗性克隆，并验证序列。然后用SfiI、BpuAI和NotI消化阳性二价克隆，然后将包含NB构建体的片段克隆入SfiI-NotI消化的pAX51载体。同样验证阳性羧苄青霉素抗性克隆的序列，该克隆编码四价NB构建体，各NB构建体构件块通过接头序列与下一个NB构建体构件块融合。
2.3.五聚化
编码第四GlySer接头序列和第五NB构件块的合成基因订购自GeneArt AG（Regensburg,德国）。然后用HgaI和NotI消化这些片段，并连接入BstEII-NotI消化的四价NB构建体。
2.4.小规模表达
将包含目的多价抗-DR5 NB构建体的TG-1细胞培养在装有加入了100μg/ml羧苄青霉素的TB培养基的带挡板的摇瓶中，并通过加入1mMIPTG诱导表达。使表达在37℃持续4小时。收集细胞后，制备周质提取物，通过固定化金属亲和层析（HisTrap FF Crude,GE Healthcare），随后后在PBS中进行凝胶过滤层析（Superdex 75 HR16/10,GE Healthcare），纯化带HIS6标签的NB构建体。
3.实施例III
3.1.Biacore上的结合
用短片段（182氨基酸）人DR5-Fc融合蛋白质（R&D Systems,Minneapolis MN,目录号631-T2/CF）或食蟹猴DR5-Fc融合蛋白质（氨基酸56至213，IgG1 NVTS）包被Biacore CM5传感芯片。然后将不同浓度（1至100nM）的单价和多价抗-DR5 NB构建体浮在芯片上进行结合相互作用的动力学分析。所有多价抗-DR5 NB构建体都结合人和食蟹猴DR5（表9）。
表9：通过表面等离子体共振测定的抗-DR5 NB构建体的亲和力（M）。
ND：未测定；BDL：低于检测限
3.2.FACS上的结合
在另一组实验中，将表达人DR5（Colo205）或食蟹猴DR5的细胞系（用在CMV启动子下游携带全长cynoDR5基因的表达载体转染的CHO-K1细胞)暴露于1nM的多价抗-DR5NB构建体（重悬在补充了10%胎牛血清的PBS中）。用小鼠抗-myc（单克隆抗体，克隆9E10 ATCC（Teddington,UK）编号CRL-1792，作为腹水在小鼠中产生，并用标准亲和层析由内部纯化）、然后用抗-小鼠IgG-藻红蛋白（JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA,目录号115-115-164），检测NB构建体与细胞结合的DR5的结合。用TO-PRO-3（Molecular Probes,Carlsbad CA,目录号T3605）对染死细胞。所有多价NB构建体都特异性结合细胞结合的人DR5和食蟹猴DR5。NB构建体与短片段形式和长片段形式的DR5之每个的结合大致相当，表明所有表位在两种形式之间是共同的。
在另一实验中，从10至0.005nM四价抗-DR5 NB构建体对细胞结合的人和食蟹猴DR5的FACS（如上文所述）饱和结合实验，估计表观结合常数。用GraphPad Prism 5（GrafPad Software,San Diego,CA）计算表观结合常数。
3.3.DR5特异性
选择一组TNF受体超家族成员来测试DR5特异性（表10）。将TNF受体超家族成员的胞外域克隆入pBadThioTopo，并转化入大肠杆菌菌株TOP10（Invitrogen#C4040-03）。按照厂家的流程表达蛋白质。收集细胞裂解物进行ELISA筛选。每10mL裂解物加入25μL 20%BSA。用100μL裂解物包被His捕获平板（Sigma#S-5688），并在室温孵育1小时。吸去剩余的溶液，并用PBS+0.05%Tween（PBST）洗涤孔三次。在封闭缓冲液（含有10%FBS的PBS）中稀释第一抗体如下：LBY135（阳性对照，抗-DR5抗体，Novartis AG）稀释至0.24mg/mL，兔抗-V5（Abcam#Ab9116-100）1:5000稀释。每孔加入100μL稀释的第一抗体。试验平板在室温孵育1小时，然后用PBST洗涤三次。将第二抗体（对于用V5孵育的孔，第二抗体为山羊抗-兔IgG-HRP（Jackson ImmunoresearchLaboratories#111-035-046），对于用LBY135孵育的孔，第二抗体为山羊抗-人IgG-HRP（Jackson Immunoresearch Laboratories#109-035-098））1:5000稀释在含有5%FBS和0.025%Tween的PBS中。向适当的孔中加入100μL第二抗体。室温孵育1小时后，用PBST洗涤平板三次。加入100μL Sure Blue（KPL#52-00-03），一旦颜色出现，即在650nm的吸光度读板。
表10：TNF受体超家族成员
  TNFR号   TNFR名称   登录号   ECD
  TNFRSF1A   TNFR1   NM001065   Leu34-Thr211
  TNFRSF1B   TNFR2   M32315   Thr27-Leu241
  TNFRSF3   TNFR3   L04270   Pro30-Thr224
  TNFRSF4   OX40   X75962   Gly33-Gly212
  TNFRSF5   CD40   X60592   Val18-Leu192
  TNFRSF6   FAS   M67454   Ser20-Gly175
  TNFRSF6B   DcR3   AF104419   Val27-Ala176
  TNFRSF7   CD27   M63928   Thr21-Ser187
  TNFRSF9   CD137   L12964   Glu19-Ile188
  TNFRSF10C   DcR1   AF012536   Thr27-Leu241
  TNFRSF10D   DcR2   AF029761   Thr57-Thr198
  TNFRSF11B   OPG   U94332   Lys17-Ile197
  TNFRSF13   BCMA   NM001192   Met1-Thr56
  TNFRSF13B   TACl   NM012452   Met2-Val161
  TNFRSF13C   BAFFR NM052945   Met1-Gly64
  TNFRSF16   NGFR   M14764   Lys29-Ile233
所有NB构建体都特异性结合DR5，但不结合其他TRAIL和TNF受体家族成员。见例如图1。
3.4.Biacore表位作图
短片段（133残基）重组人DR5（Peprotech,Rocky Hill NJ,目录号310-19）上的Biacore解离速率筛选揭示，所有抗-DR5 NB构建体都结合DR5的胞外域，但不结合29残基的可变剪接区（氨基酸残基185至231）。
在另一实验中，用单价抗-DR5 NB构建体（230至520RU）包被BiacoreCM5传感芯片。然后，将500nM短片段（133残基）重组人DR5（Peprotech,Rocky Hill NJ,目录号310-19）浮在芯片上，直至达到饱和。此时，将50nM人TRAIL（R&D Systems,Minneapolis MN,目录号375-TEC/CF）浮在芯片上，并与TRAIL表位相比，用结合信号的增加来将NB构建体分类为不同的表位种类（表11）。
表11：与TRAIL相比，抗-DR5NB构建体的表位作图
  NB构建体  结果
  11D1  无TRAIL阻断
  4E6  部分TRAIL阻断
  10F1  TRAIL阻断
  11H6  无TRAIL阻断
  7A12  TRAIL阻断
3.5.体外细胞存活
实验前将细胞维持在对数生长期。测定当天，按每孔5,000-20,000个细胞，将细胞转入96孔板（Corning Inc.,Lowell,MA,目录号3917），然后按50μl/孔加入系列稀释的抗-DR5 NB构建体。孵育24至72小时后，使用基于萤光素酶的ATP定量试剂盒（Cell Titer Glo,Promega,Madison,WI目录号G7571）并在冷光仪（luminescence plate reader）（FluoroskanAscent FL,Thermo Electron,Waltham,MA）上读数来定量存活细胞的相对数目。
用Colo205细胞在细胞存活测定中筛选一系列三价抗-DR5 NB构建体。与在此测定中不具有生物学活性的它们的单价对应物（数据未显示）相反，所有三价构建体都诱导Colo205凋亡（见表12）。无关（非DR5结合）NB构建体的四价构建体未诱导凋亡。
表12：三价抗-DR5 NB构建体对Colo205的体外效力（IC50(M)）
  NB构建体   IC50(M)
  10F1三聚体   4.07x10-11
  11D1三聚体   1.11x10-10
  11H6三聚体   4.58x10-11
  4E6三聚体   3.79x10-11
  7A12三聚体   1.20x10-10
在另一实验中（表13），在针对一系列肿瘤细胞系和正常细胞系的细胞存活测定中筛选所选择的三价抗-DR5 NB构建体。
表13：三价抗-DR5NB构建体的体外效力（IC50(M)）
  4E6 tri   11D1 tri   10F1 tri   7A12 tri   11H6 tri
  Jurkat   20   20   20   20   20
  Molt4   20   20   20   20   20
  A549   20   20   20   20   20
  H226   2.0×10-11   3.0×10-11   2.0×10-11   3.0×10-11   20
  H2052   6.0×10-12   1.5×10-11   1.3×10-11   6.4×10-11   3.6×10-10
  H2122   2.0×10-12   4.0×10-12   3.0×10-12   8.0×10-12   1.2×10-11
  M30   20   20   20   20   20
  Panc-1   20   20   20   20   20
  MiaPaCa-2   2.3×10-11   20   20   20   20
  ARPE-19   20   20   20   20   20
  IMR-90   20   20   20   20   20
  Huvec   20   20   20   20   20
20：IC5020nM
在另一实验中（表14），在针对一系列肿瘤细胞系和正常细胞系的细胞存活测定中筛选所选择的四价抗-DR5NB构建体
表14：四价抗-DR5NB构建体的体外效力（IC50(M)）
  4E6 tetra   11D1 tetra   10F1 tetra   7A12 tetra   11H6 tetra
 Colo205   8.0×10-13   8.1×10-12   2.0×10-12   6.6×10-12   3.7×10-12
 Jurkat   6.0×10-13   3.5×10-11   3.0×10-12   3.7×10-11   9.1×10-12
 Molt4   ＜1.0×10-13   1.5×10-11   2.0×10-12   20   8.0×10-13
 A549   3.3×10-10   20   20   20   20
 H2122   8.0×10-13   8.0×10-12   1.0×10-12   3.6×10-12   2.8×10-12
 H226   1.0×10-11   8.9×10-11   2.4×10-11   20   1.1×10-10
 H2052   8.0×10-13   2.5×10-11   4.0×10-12   3.3×10-11   1.5×10-11
 M30   20   20   20   20   20
 Panc-1   3.0×10-12   20   9.0×10-12   20   2.2×10-10
 MiaPaCa-2   1.8×10-12   1.9×10-11   2.8×10-11   4.1×10-11   1.1×10-11
 8×PC-3   1.9×10-12   4.1×10-11   3.0×10-12   2.3×10-11   2.7×10-11
 Malme-3   20   20   20   20   20
 Wl-38   20   20   20   20   20
 ARPE-19   20   20   20   20   20
 184A1   20   20   20   20   20
 Huvec   20   20   20   20   20
 HAAE-1   20   20   20   20   20
20：IC5020nM
图6A、6B和6C中的图显示了提高多聚体的等级导致提高的功效和效力，其中三聚体、四聚体和五聚体11H6和4E6NB构建体分别对体外所处理的Colo205和H226肿瘤细胞具有递增的效力。
多价抗-DR5NB构建体对肿瘤细胞系而不对正常（健康）细胞系显示凋亡诱导活性。一般趋势是，随多聚体NB组合物中亚基数的增加，观察到提高的凋亡诱导活性。如通过取决于细胞系所达到的IC50的降低或最大细胞死亡的增加所示例，从NB的四聚体形式增加到五聚体形式提供了在细胞死亡测定中效力进一步提高的证据。
3.6.交联
在另一实验中，在室温孵育30分钟，使包含cMYC标签的多价NB构建体（10微克）通过其CMYC标签与1.5μg至150μg小鼠抗-myc（单克隆抗体，克隆9E10 ATCC（Teddington,UK）编号CRL-1729，作为腹水在小鼠中产生，并用标准亲和层析由内部纯化）交联。然后在体外细胞存活测定中评价了交联的NB构建体。增加的交联与改善的效力和功效相关（见表15-16）。表15提供与不同量的抗体交联的三价抗-DR5NB构建体对Jurkat细胞的体外效力（IC50(M)）。表16提供与不同量的抗体交联的四价抗-DR5 NB构建体对Jurkat细胞的体外功效（%死细胞）。一般趋势是，随着带标签的NB多聚体的交联量的增加，更多的细胞被杀死。
表15：交联的三价抗-DR5NB构建体的体外效力（IC50(M)）
  Jurkat细胞 重量比(μg/μg)  IC50(M)
  11D1三聚体 0   未观察到凋亡
  11D1三聚体 0.15   1.1x10-8
  11D1三聚体 15.0   7.3x10-10
比值：交联抗体/四价抗-DR5NB构建体的重量比
表16：交联的四价抗-DR5NB构建体的体外功效（%死细胞）
  Jurkat细胞   重量比(μg/μg)   功效(%死细胞)
  11D1四聚体   0   48
  11D1四聚体   0.15   48
  11D1四聚体   0.75   60
  11D1四聚体   1.5   63
  11D1四聚体   7.5   88
  11D1四聚体   15.0   93
比值：交联抗体/四价抗-DR5NB构建体的重量比
3.7.血清稳定性
3.7.1.ELISA中的NB构建体和DR5结合
用100%新鲜人血清在37℃预孵育NB构建体24小时。用50μl含有1μg/ml DR5-Fc融合蛋白质（DR5氨基酸56至213）的PBS在4℃过夜包被平底96孔ELISA平板（Costar，Cambridge,MA,目录号3590）。然后用300μl含有2%BSA（Gibco,Grand Island,NY，目录号11018-025）的PBS封闭平板1小时，并洗涤3次。NB构建体样品系列稀释在含有10%人血清的PBS缓冲液中，然后加入ELISA平板，并在室温孵育1小时。洗涤后，在平板中加入1:5000HRP缀合的抗-myc多克隆抗体（Invitrogen：460709），或加入1:7000兔抗-VHH抗体，随后加入1:15000HRP缀合的抗-兔IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.West Grove,PA,目录号115-035-072）。最后一组洗涤后，加入100μl/孔TMB Microwell过氧化物酶底物（BioFX,Owings Mills,MD,目录号TBNP-1000-01），并在室温孵育10分钟。用100μl Stop Reagent（BioFX,Owings Mills,MD,目录号LSTP-0100-01）终止反应。在SpectraMax M5微板读数器（MolecularDevices,Sunnyvale,CA）中在450nm进行产物的比色检测。按照其用户手册用SoftMax Pro软件（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）分析数据。
通过抗-Myc或抗-NB构建体抗体检测，人血清显示几乎不干扰NB构建体三聚体或四聚体结合DR5。
3.7.2.细胞存活测定中的NB构建体功能
还在存在和缺乏约10-15%人血清白蛋白的情况下进行了细胞存活测定。与存在10%胎牛血清的对照测定相比，四价抗-DR5NB构建体保持其体外效力。
4.实施例IV
4.1.单剂量体内三价抗-DR5NB构建体
麻醉远系(outbred)无胸腺（nu/nu）雌性小鼠（Harlan Sprague Dawley，Indianapolis,IN），并用1x106Colo205细胞皮下植入每只动物的右腋（侧）区。使肿瘤生长至大小为200mm3，然后起始给药。将NB构建体配制为PBS中的溶液，并通过静脉浓注，按200ug/小鼠，单剂量施用。在1小时、2小时、4小时和8小时从动物组（每个时间点一组，每组三只动物）收集肿瘤样品。
用部分组织样品进行胱天蛋白酶3的免疫组织化学（IHC）染色。立即将组织放入10%中性缓冲的福尔马林（NBF，Fisher Scientific,Pittsburgh,PA,目录号SF100-20），处理并包埋入石蜡块。将4.0μm的切片切在SuperFrost Plus带电荷载玻片（Fisher Scientific,目录号12-550-15）上。将切片在二甲苯中脱石蜡（5分钟X2），并在乙醇梯度系列（100%乙醇5分钟、95%乙醇2分钟、70%乙醇2分钟和去离子水5分钟）中水化。水化的切片进行抗原修复，抗原修复是通过在柠檬酸缓冲液（0.01M,pH 6.0,BioGenex,San Ramon,CA,目录号HK080-9K）中微波处理载玻片10分钟来进行的。用去离子水洗涤载玻片5分钟后将它们放在自动染色器（Dako Cytomation）的染色架上。室温下用Dako自动化系统进行以下步骤。在各步骤之间，用漂洗缓冲液（OptiMax Wash Buffer，Biogenex,目录号HK583-5K）漂洗载玻片三次。通过用过氧化氢（Dako,目录号S2001）孵育载玻片10分钟来阻断内源性过氧化物酶。通过Block Serum（Dako,目录号X0909）10分钟，封闭非特异性抗原反应。用断裂的胱天蛋白酶3兔多克隆抗体（Cell Signaling Technology，Beverly，MA,目录号9661）孵育载玻片60分钟，然后漂洗，并暴露于过氧化物酶缀合的抗体（DAKOEnvision system,目录号K4003）30分钟。对于检测，应用DAB（3,3’-二氨基联苯）溶液（Dako Cytomation,目录号K3468）2分钟。用Harris苏木精（SurgiPath,目录号01560）轻微复染免疫染色的载玻片，通过一系列渐增的乙醇浓度（70%、95%和100%乙醇，各1分钟）和二甲苯（5分钟X2）脱水，并用盖玻片（Leica）封固。
用Aperio系统（Aperio Technologies,Inc.Vista,CA）将载玻片扫描为数字化载玻片数据库，用来自Aperio的优化的Positive Pixel CountingAlgorithm进行图像分析。整个切片，除了被该成像系统提供的工具“标记除去”的坏死区域和宿主组织部分，用于图像分析。所有多价抗-DR5NB构建体都诱导胱天蛋白酶3激活。
部分组织样品与T-per缓冲液（Pierce,Rockford,IL,目录号78510）混合，然后立即在组织裂解剂（Qiagen,目录号85210）中匀浆。收集组织裂解物的上清，并用标准BCA测定（Pierce,目录号1856210）测定其蛋白质浓度。将组织裂解物用于以下测定来检验NB构建体和抗体浓度以及肿瘤中胱天蛋白酶3活性。
在ELISA中测定NB构建体浓度。用100μl含有1μg/ml人DR5-Fc融合蛋白质（DR5氨基酸56至213）的PBS在4℃过夜包被ELISA平板（Nunc,Rochester NY，目录号439454），然后用含有1%BSA（Gibco,目录号11018-025）的PBS在室温封闭1小时，然后洗涤3次。将系列稀释的血清或组织裂解物样品转入ELISA平板，并在室温孵育1.5小时。三次洗涤后，将1/22500稀释的抗-VHH加入ELISA平板，并在室温孵育1小时。再洗涤平板3次，然后用100μl/孔1/20000稀释的HRP-山羊-抗-兔（Pierce,目录号31462）孵育1小时。最后一组洗涤后，加入100μl/孔的TMB Microwell过氧化物酶底物（BioFX,Owings Mills,MD,目录号TMBW-0100-01）10分钟，然后用100μl终止溶液（BioFX,目录号LSTP-1000-01）终止反应。在SpectraMax M5酶标仪（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）中在450nm进行产物的比色检测。按照其用户手册用SoftMax Pro软件（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）在4参数模型中分析数据。所有NB构建体都显示在血清和肿瘤组织中快速的清除及快速的组织渗透。
通过胱天蛋白酶glo测定（Promega目录号G8092），按照其用户手册，评价肿瘤组织裂解物中的胱天蛋白酶3/7活性。用SpectraMax M5酶标仪（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）读取发光。与IHC结果一致，所有NB构建体都在8小时内激活胱天蛋白酶3。
4.2.单剂量体内四价抗-DR5NB构建体
麻醉远系无胸腺（nu/nu）雌性小鼠（Harlan Sprague Dawley，Indianapolis,IN），并用1x106Colo205细胞皮下植入每只动物的右腋（侧）区。使肿瘤生长至大小为200mm3，然后起始给药。将NB构建体配制为PBS中的溶液，并通过静脉浓注，按200ug/小鼠，单剂量施用。在以下时间点从动物组（每个时间点一组，每组三只动物）收集血清和肿瘤组织：0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时和48小时。将肿瘤组织样品与T-per缓冲液（Pierce,Rockford,IL,目录号78510）混合，然后立即在组织裂解剂（Qiagen,目录号85210）中匀浆。收集组织裂解物的上清，并用标准BCA测定（Pierce,目录号1856210）测定其蛋白质浓度。
在上文所述的ELISA中测定血清和组织裂解物中的NB构建体浓度。用WinNonlin Professional Software Version 5.1（Pharsight Corporation,Mountain View California,美国）内的模型7，对平均血清浓度-时间曲线进行双室药代动力学分析。对于各NB构建体，用迭代重复加权(iterativereweighting)1/y.y拟合浓度-时间曲线，其中y是预测的浓度。不同NB构建体的平均滞留期（MRT，表17）在2.6至13.5小时之间。不同NB构建体的分布体积（Vss）比20g的小鼠的血浆体积（≈1.5ml）大2-35倍，表明在血管空间外的广泛分布。不同NB构建体的总体清除率至少比鼠肾小球滤过率（≈15ml/小时）低5倍，因此，所有四价构建体都高度有效地显著降低尿过滤和随后在肾脏水平的排泄。
表17：四价抗-DR5NB构建体的PK参数
Figure BDA00002226856201441
按照其用户手册及上文所述，通过胱天蛋白酶glo测定（Promega目录号G8092），评价肿瘤组织裂解物中的胱天蛋白酶3/7活性。所有四聚体都具有相似的PD谱（图2）。
开发间接响应模型来描述不同NB构建体的药理学作用的效力（EC50）、功效（Emax）和时程。该模型描述由DR5受体结合后增强的产生速率引起的细胞胱天蛋白酶水平的变化（即，刺激细胞胱天蛋白酶的累积）。通过以下公式来描述细胞胱天蛋白酶的速率（响应，R）。
dR dt = k in · [ 1 + E max · C n EC 50 n + C n ] - k out · R (公式1)
其中kin是零级合成速率，R是胱天蛋白酶水平，Emax是最大刺激，C是肿瘤处的NB构建体浓度，n是响应形状因素，kout是胱天蛋白酶一级清除速率常数。
先将肿瘤浓度-时间曲线拟合成为提供浓度-时间数据的合理表征所最低限度地需要的药代动力学函数（WinNonlin Software Version 5.1内的双室模型3或模型11）。然后将针对各NB构建体获得的药代动力学函数用作公式1的输入函数。获得的药物动力学参数在表18中列出。
表18：单剂量四价抗-DR5NB构建体的PK/PD参数
  参数1   10F1四聚体   7A12四聚体  4E6四聚体   11D1四聚体   11H6四聚体
  kout(1/小时)   0.319   0.301  0.412   0.416   0.356
  EC50(ng/mg组织)   0.365   1.41  1.36   12.2   8.37
  Emax   15.8   15.3  4.74   12.2   17.5
  N   2.14   3.85  10.1   0.18   4.62
4.3.使用异种移植物模型的体内测试
用悬浮在总体积为100ml的100%Hanks平衡盐溶液（HBSS）中的约1-2x106COLO205肿瘤细胞，皮下植入远系无胸腺（nu/nu）雌性小鼠（Harlan Sprague Dawley，Indianapolis,IN）的右腋（侧）区。使肿瘤生长至200mm3，然后起始给药。将NB构建体配制为PBS中的溶液，并每周给药一次，或每周在星期一、星期三和星期五三次给药。两种治疗都静脉内施用4周。每周一次或两次测量肿瘤并记录动物个体的体重。距离最初给药7周后结束实验。将抗肿瘤活性表示为%T/C（比较肿瘤体积的变化，治疗组对载体对照组）。用公式(1-T/T0)x100%计算消退，其中T是实验结束时治疗组的平均肿瘤体积，T0是实验开始时的平均肿瘤体积。一律用单因素方差检验事后Tukey分析，评价结果的统计显著性。如图3中所示，NB构建体在Colo205肿瘤模型中诱导肿瘤停滞或消退。五聚体形式的NB构建体倾向于具有比四聚体形式更强的效力。
5.实施例V
5.1.4E6的人源化
5.1.1.4E6人源化变体的表征
将亲本4E6的蛋白质序列与人VH3-23（DP-47）和JH5种系比对（表19）。相对于人种系序列的氨基酸差异用字母表示，相同的氨基酸用点表示。选择下划线的构架区中的氨基酸差异用于转化为人对应物，而其他氨基酸保持不变。
表19：4E6亲本和人源化N糖基化敲除变体的比对
Figure BDA00002226856201461
VH3-23/JH5＝SEQ ID NO：90
4E6＝SEQ ID NO：1
4E6-Hu＝SEQ ID NO：26
从4E6、4E6-Hu和变体4E6hx（其中4E6hx具有与4E6-Hu相同的人源化FR区，但具有4E6的CDR3）产生纯化的单价材料。然后在许多测定中表征这些构建体对人和食蟹猴DR5的结合，即FACS饱和结合（表观Kd）和SPR动力学（见表20）。此外，还在热漂移测定中分析变体（表20）。在10μl缓冲液（100mM磷酸盐、100mM硼酸盐、100mM柠檬酸盐、115mM NaCl，缓冲在从3.5至9的不同pH）中用5μl荧光探针SyproOrange（Invitrogen,Carlsbad,CA,目录号S6551）（终浓度10x）孵育5μl各纯化的单价抗-DR5 NB构建体（80μg/ml）。然后在LightCycler 480II机器（Roche,Basel,瑞士）中按4.4℃/秒将样品从37℃加热至90℃，然后按2.2℃/秒将它们冷却至37℃。在加热诱导的解折叠后，暴露蛋白质的疏水片，Sypro Orange与该疏水片结合导致荧光强度的增加。荧光强度曲线的一阶导数的拐点可作为解链温度（Tm）的量度。更多细节请参见Ericsson等2006(Annals of Biochemistry，357:289-298)。总体上，4E6-hx变体显示类似于4E6亲本的亲和力。此外，与4E6亲本相比，此变体的Tm提高7%。
表20A单价4E6人源化和N糖基化敲除变体
Figure BDA00002226856201471
表20B单价4E6人源化和N糖基化敲除变体
Figure BDA00002226856201472
5.1.2.人源化4E6的N糖基化敲除变体
与大肠杆菌是表达宿主时仅一种16kDa产品相比，在巴斯德毕赤酵母中表达4E6-hx后进行SDS-PAGE和抗-VHH（多克隆抗-N
Figure BDA00002226856201473
）western印迹显示了存在两种产品（16kDa和21kDa）。PNGaseF处理和伴刀豆球蛋白染色显示，21kDa产品是16kDa产品的N糖基化形式。按照厂家的建议（New England Biolabs,Ipswich,MA,目录号P0704S）用PNGaseF从蛋白质切割N糖基化部分。PNGaseF是酰胺酶，其在来自N联糖蛋白的高甘露糖、杂合和复合寡糖的最里面GlcNAc和天冬酰胺残基之间切割。用伴刀豆球蛋白A在Western测定中进行蛋白质N糖基化的检测，伴刀豆球蛋白A是识别含有α-D-甘露糖、α-D-葡萄糖的糖蛋白的凝集素。用封闭缓冲液（PBS、0.05%Tween-20、1mM CaCl2、1mM MnCl2）封闭印迹的蛋白质2小时，然后用5μg/ml伴刀豆球蛋白A生物素缀合物（Sigma,St.Louis MO,目录号C2272）在封闭缓冲液4℃孵育。用1/2000稀释在封闭缓冲液中的extravidin-HRP缀合物和DAB为底物（Sigma,St.Louis MO,目录号E2886和D6815）进行检测。考马斯蓝染色凝胶中可见的36kDa条带是PNGaseF酶。人DR5上的解离速率分析显示，巴斯德毕赤酵母产生的材料与大肠杆菌产生的材料相比>8倍的提高，表明N糖基化干扰4E6-hu与DR5的结合。
潜在的N糖基化基序存在于4E6和4E6-hx的CDR3中（氨基酸“nrs”——在表19中显示为黑斜体）。产生4E6-Hu变体（CDR3具有显示为黑体大写字母的取代的“A”残基——表19），在大肠杆菌中产生，纯化，并用FACS饱和结合测定和SPR动力学，分析与人和食蟹猴DR5的结合（表20）。与4E6-hx相比，4E6-Hu对人DR5和食蟹猴DR5二者具有相同的结合特征。在巴斯德毕赤酵母中表达时，4E6-Hu变体仅产生了16kDa产品。这确认了糖基化基序的功能性敲除。
5.1.3.4E6-Hu的体外表征
从野生型4E6及其人源化变体4E6-Hu产生纯化的四价材料。然后在Colo205和Jurkat的细胞存活测定中测定这些材料（表21）。人源化变体的效力和功效与亲本4E6构建体相对地相同。
表21-四价野生型4E6和4E6-Hu的体外效力和功效
Figure BDA00002226856201481
5.2.11H6人源化
5.2.1.11H6人源化变体的表征
将野生型11H6的蛋白质序列与人VH3-23（DP-47）和JH5种系比对（表22）。相对于人种系序列的氨基酸差异用字母表示，相同的氨基酸用点表示。选择下划线的构架区中的氨基酸差异用于转化为人对应物，而其他氨基酸保持不变。
表2211H6亲本和人源化变体的比对
Figure BDA00002226856201491
VH3-23/JH5＝SEQ ID NO：90
11H6＝SEQ ID NO：5
11H6-hu＝SEQ ID NO：30
产生11H6和11H6-Hu的纯化的单价材料，然后在许多测定中表征其在人和食蟹猴DR5上的结合，即FACS饱和结合（表观Kd）和SPR动力学（见表23）。此外，还在热漂移测定中分析变体（表23）。11H6-hu变体保留亲本11H6结合特征。与亲本11H6相比，它的解链温度也具有8%的提高。Tm在pH 7测定。
表23-单价11H6亲本和人源化变体的表征
5.2.2.11H6-Hu的体外表征
从亲本克隆11H6及其人源化变体11H6-Hu产生纯化的四价材料。然后在针对Colo205和Jurkat的细胞存活测定中测定这些材料（表24）。人源化变体的效力和功效与亲本相当。功效表示所观察到的死细胞的百分比。
表24四价野生型11H6和11H6-hum的体外效力和功效
Figure BDA00002226856201501
5.3.11H6-Hu和4E6-Hu四聚体和五聚体的体外表征
以达到约75%汇合为目的，将细胞接种在96孔板（Costar#3903白色透明底）中。测定前一天按7500-15000细胞/孔（取决于细胞系），将细胞接种在100μl培养基中。测定当天，去除培养基，并加入新鲜培养基。然后加入系列稀释的NB剂（起始浓度可以取决于细胞系而不同），起始浓度通常在1-20nM之间，然后一般将其3-4倍稀释10次，终体积为150μl。然后在提供CO2的培养箱中37℃孵育细胞24-72小时。孵育后，使接种的细胞和Cell Titer Glo（Promega#G7571）试剂至室温（约30分钟）。然后向各孔中加入50μL重构的Cell Titer Glo试剂。摇动平板2-3分钟，然后避光平衡10分钟，然后在Spectromax上读取发光。
表25中提供具体实例。
表25.11H6-hu和4E6-hu四聚体和五聚体的体外表征
Figure BDA00002226856201502
Figure BDA00002226856201511
6.实施例VI
6.1.白血病患者的离体测定
提供白血病患者的离体测定，作为预测哪些患者将对NB构建体治疗有反应的方法。治疗前从患者获得血液样品，并用来测定潜在的治疗反应。用反应的程度和方向作为治疗的选择标准。
认为T细胞白血病（T-ALL）一般对DR5刺激敏感。用本发明的NB构建体处理T-ALL样品，并进行评估来确定白血病细胞的数目是否随治疗减少（或经受凋亡）。对于用本发明的NB构建体进行的离体处理，测定药物范围从约20nm至约0.0001nM。
还可以获得来自诊断患有其他适应症的患者的细胞样品，并类似地测试。
6.2.一般离体敏感性测定：
在患者外的实验室环境中测试肿瘤样品，作为帮助预测哪些患者可以对一种或多种NB剂有反应的方法。
取决于肿瘤类型，以类似于以上测定的方式处理来自血液或组织的原发患者肿瘤材料。通过全血采集或组织活检取出肿瘤，并接种入适当的组织培养盘0-24小时。然后用稀释系列的不同浓度的一种或多种NB剂（例如起始浓度可以是20nM，3-4倍稀释10次），处理肿瘤样品。然后在提供CO2的培养箱中在37℃用一种或多种NB剂处理组织培养板24-72小时。孵育后，用检测样品对处理的反应的方法，分析接种的样品。如在以上实例中，提供用于细胞生存力的Cell Titer Glo（Promega#G7571）、或胱天蛋白酶3/7激活、或膜联蛋白V染色、或细胞计数、或FACS分析、或测定生长、死亡或对NB剂处理的反应的其他方法。
在提供CO2的培养箱中在37℃用多种浓度的一种或多种NB剂，处理NB剂敏感的细胞系（例如Jurkat）或NB剂不敏感的细胞系（BE13）或PBMC（外周血单核细胞，例如从健康志愿者的血液新鲜制备）或细胞培养物（细胞系）的组合（掺杂入PBMC）3.5小时，然后按照厂家提供的指导，评估胱天蛋白酶3/7激活（Promega#G7790）。
7.实施例VII
7.1.RAF-MEK-ERK途径和DR5活性的分析
死亡受体5（DR5）在癌症药物开发中具有特殊意义，因为它的激活选择性诱导癌细胞凋亡，同时不影响许多正常细胞。DR5特异性激动剂构建体可以避免配体的限制，即与诸如DcR1、DcR2和OPG的诱饵受体结合。DR5激动剂抗体的临床开发的主要障碍一直是难于鉴定预测在患者亚群中的功效的生物标志。来自200个癌细胞系的数据的分析显示，没有明显的遗传突变（包括RAS和RAF中的那些）与对LBY135（DR5激动剂抗体（Novartis AG））的敏感性相关。
通过基于DR5致敏/拯救来筛选混合shRNA的策略，鉴定在遗传干扰后改变DR5介导的凋亡的基因或途径。在跨多种谱系的七个癌细胞系中进行筛选，并通过对整合发夹进行基于Solexa的深度测序，去褶合(deconvolute)该shRNA组合物。
一组常见的致敏物和拯救物被鉴定为已知途径成分，从而靶向胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶3和DR5本身的shRNA是顶级拯救物，而靶向BCLxl的那些是顶级致敏物，指示了筛选的稳健性。有趣的是，除这些常见基因的组外，对BRAF-MEK-ERK的抑制在DR5介导的凋亡上显示出依赖于细胞背景的对立表型。具体而言，BRAF-MEK-ERK途径的抑制使Miapaca2细胞敏感于DR5介导的凋亡，但从DR5介导的凋亡中拯救Colo205细胞。
这些对立表型与胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9活性的不同动力学十分地相关，但似乎不依赖于DR5表达水平。途径解析显示，cFLIP和cIAP1（内源性凋亡抑制剂中的两种）介导了DR5介导的凋亡与BRAF-MEK-ERK途径之间的串话（cross-talk）。在Miapaca2细胞中，U0126（MEK抑制剂）和DR5抗体的组合可以加快cFLIP和cIAP1蛋白质的降解，而在colo205中，cFLIP和cIAP1mRNA都上调。一致地，shRNA对cFLIP或cIAP1的抑制或化学抑制可以消除Colo205细胞中的拯救表型，并使Miapaca2对DR5介导的凋亡进一步敏感。MEK抑制剂处理的Miapaca2和Colo205细胞的微阵列分析揭示了在两个细胞系中都下调的基因，包括DUSP6、ETV5和ERG1，其是ERK的规范下游靶标。
7.2.Bcl-xL、cIAP1和BRAF-MEK-ERK为DR5介导的凋亡的依赖于 细胞背景的调节物
如果广泛地定义，许多蛋白质都作为依赖于细胞背景的调节物来起作用。例如，Bcl-xL抑制剂ABT737对LBY135诱导的凋亡显示一系列表型。在待检查的35个细胞系中，它强烈致敏LBY135对7个细胞系的作用，轻度致敏9个细胞系，但对其他19个细胞系无作用。合理的原因之一是，一些细胞系中存在补偿Bcl-xL抑制的平行途径。例如，对我们的筛选的分析显示，针对Bcl-xL的shRNA致敏除Miapaca2细胞外的所有细胞系，Miapaca2细胞实际上通过靶向MCL1的shRNA致敏。这种调节物将不妨碍联合治疗的开发。在这方面，cIAP1的抑制剂是类似的抑制剂，其在许多细胞系中致敏DR5激动剂抗体（表26，及未显示的数据）。有趣的是，cIAP1（而不是x-IAP）特异性参与DR5与BRAF-MEK-ERK途径之间的串话。
BRAF-MEK-ERK途径落入依赖于细胞背景的调节物的种类中。它的依赖于细胞背景的作用从致敏物直到拮抗物。此显著差异提供了洞察调节DR5介导的凋亡的信号传导网络的机会。但是，应鉴定生物标志，否则将难以研发组合治疗，即使致敏作用是强烈的和希望的。实际上，对于DR5抗性细胞系，如ES2和A375，BRAF/MEK抑制剂是下表中显示强致敏作用的唯一配偶体，而Bcl-xL的抑制剂则不是。cIAP1的下调与多种细胞系中的致敏作用相关，表明它是这种组合策略的PD生物标志。我们的结果表明，DR5激动剂抗体与c1抑制剂和BRAF-MEK抑制剂的三重组合可以是一种解决方案。
表26显示DR5激动剂抗体与cIAP1或Bcl-xL的抑制剂之间的协同效应。用LBY135（DR5激动剂抗体，Novartis AG）单独或与LBW242（cIAP1抑制剂）或ABT737（Bcl-xL抑制剂）组合，处理35个细胞系。在5nMLBY135下当存活率高于70%时将细胞标为不敏感。对于组合作用，在该组合使细胞生存力降低30%以上时将它标为‘+++’；在该组合使细胞生存力降低10%至30%时标为‘++’。在用该联合治疗未观察到协同作用时将它标为“无”。
表26：DR5激动剂与cIAP1或Bcl-xL抑制剂之间的协同效应
Figure BDA00002226856201541
++：致敏；+++：强烈致敏；
此外，还将180个基因鉴定为在该两个细胞系之间被MEK抑制所差异调节的基因。通过基因集富集分析（GSEA）预测可以负责调节这些基因的转录因子集，然后用shRNA单独检查来确认它们的参与。在许多转录因子中，仅发现FOXO3和SP1直接涉及两条途径间的串话，这被它们在Colo205细胞中在mRNA水平调节cFLIP或cIAP1的作用所证实。但是，在Miapcaca2细胞中，cFLIP或cIAP1以依赖于蛋白酶体和胱天蛋白酶8的方式在蛋白质水平受调节。最后，在其他细胞系中，降低的cIAP1蛋白质水平与致敏作用相关。这些结果鉴定出用于DR5激动剂抗体LBY135的多种有效的组合策略，并揭示出BRAF-MEK-ERK途径对DR5介导的凋亡的依赖于细胞背景的调节。
为了验证shRNA结果，用对BRAF和MEK特异的化学抑制剂来破坏BRAF-MEK-ERK途径。即，RAF265和U0126分别是BRAF和MEK的抑制剂。用任一化合物抑制BRAF-MEK-ERK途径都使Miapaca2细胞对LBY135处理敏感，但从LBY135处理中拯救Colo205细胞。其他BRAF和MEK特异性抑制剂给出了相似的表型。
Miapaca2细胞具有活化的KRAS突变（G12C），而Colo205细胞具有活性BRAF突变（V600E）。因此，这些突变可能负责所述的不同表型。但是，具有与Miapaca2细胞相同的KRAS突变的H2122未显示如Miapaca2中的任何致敏效果。此外，筛选另外七个细胞系（全都具有BRAF突变）之后，我们发现，MEK抑制剂在一些细胞系中显示无作用，而其他细胞系如在Miapaca2细胞中一样致敏。总之，我们的结果显示，BRAF和KRAS突变都不能解释BRAF-MEK-ERK途径对DR5介导的凋亡的依赖于细胞背景的作用。
总体上，BRAF-MEK-ERK的抑制是一把双刃剑，在与DR5激动剂组合使用时，它可以导致致敏作用或拮抗作用。cIAP1或XIAP的抑制剂、Bcl-xL的抑制剂或cFLIP的抑制剂、与DR5激动剂组合足以致敏。但是，BRAF抑制剂和MEK或ERK抑制剂的组合似乎拮抗LBY135预处理的作用。虽然这引起了对临床中同时靶向两条途径的联合治疗的担忧，但数据表明，与cIAP抑制剂的三重组合可以是拮抗作用的解决方案。即，由DR5激动剂、cIAP抑制剂（抑制cIAP1或抑制XIAP）、和选择的MEK抑制剂或BRAF抑制剂构成的三重组合也应导致细胞死亡的协同诱导。
7.3.实验方案
对于shRNA文库筛选，用靶向激酶组和apotome的shRNA的混合shRNA文库感染靶细胞，用嘌呤霉素选择，然后用交联LBY135或PBS对照处理。对在第0、7和14天收集的样品进行DNA提取，PCR扩增整合的shRNA并纯化，然后进行solexa测序。相同时间点的处理间的比较揭示出调节DR5介导的凋亡的shRNA。PBS对照中时间点之间的比较显示shRNA对细胞生长的影响。然后对这些命中物进行单独验证。
为了分析LIMK2的敲低(knock-down)使Miapaca2和Colo205敏感于LBY135诱导的凋亡，用针对LIMK2的shRNA或对照发夹感染细胞，用嘌呤霉素选择5天，然后接种在96孔板中，次日用系列稀释的交联LBY135处理36小时。通过cell-titer-glow试剂测量细胞生存力，并相对于未用LBY135处理的样品进行标化。将细胞存活率作为浓度的函数作图，产生剂量-反应曲线。数据包括至少两个独立实验中的代表性实验的一式三次重复的平均值±SD。
用MEK和BRAF的化学抑制剂来验证在该筛选中的shRNA表型。用DMSO、MEK抑制剂U0126（10uM）或BRAF抑制剂RAF265（1uM）过夜预孵育Miapaca2和Colo205，然后用系列稀释的交联LBY135处理36小时。通过cell-titer-glow试剂测量细胞生存力，并相对于未用LBY135处理的样品进行标化。将细胞存活率作为浓度的函数作图，产生剂量-反应曲线。数据是至少两个独立实验中的代表性实验的一式三次重复的平均值±SD。
为了显示DR5对ERK的激活在两种细胞系中保持完整，用DMSO或U0126（10uM）过夜预孵育Miapaca2和Colo205细胞，用交联LBY135（0.25nM）处理，并在0小时、1小时、3小时和6小时收集，进行ERK和p-ERK的western印迹分析。MEK抑制在Colo205细胞中减少DR5诱导的胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3/7的活性，而它在Miapaca2细胞中增加这些活性。用0nM、0.25nM或1nM的交联LBY-135处理Colo205和Miapaca2，7小时。裂解细胞进行胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3/7的活性的分析。将胱天蛋白酶活性作为LBY135浓度的函数作图。数据是至少两个独立实验中的代表性实验。
用微阵列分析来显示受MEK调节的基因中在Colo205和Miapaca2细胞之间显著相关的那些基因。在5个独立实验中用DMSO或U0126过夜预孵育Colo205和Miapaca2细胞。提取RNA进行微阵列分析。将U0126相对于DMSO处理的细胞中各基因的相对表达水平在Y轴上作为Colo205细胞的函数、在X轴上作为Miapaca2细胞的函数作图。
7.4.DR5和RAF-MEK-ERK之间串话的工作模型
工作模型提出，DR5激动剂处理激活胱天蛋白酶-8和ERK二者。这两条途径间的串话由cFLIP和cIAP1介导，cFLIP和cIAP1负调节胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-9的激活，这又控制DR5激动剂诱导的凋亡。cFLIP和cIAP1以依赖于细胞背景的方式在不同水平受到调节。在Colo205细胞中，它们通过转录因子FOXO3和SP1在其RNA水平受调节，转录因子FOXO3和SP1本身受BRAF-MEK-ERK途径调节。在Miapaca2细胞中，BRAF-MEK-ERK途径以依赖于蛋白酶体和胱天蛋白酶8的方式在蛋白质水平调节cFLIP和cIAP1。
8.实施例VIII
8.1.示例性Biacore测定
Biacore测定是适合用于确定氨基酸序列或其他结合剂是否交叉阻断或是否能够交叉阻断的一种测定试验。应理解，该测定可以用于本文所述的任何氨基酸序列（或其他结合剂，如本发明多肽）。
按照厂家的建议，操作Biacore机器（例如Biacore 3000）。在一个示例性交叉阻断测定中，用标准胺偶联化学将靶蛋白偶联至CM5 Biacore芯片，产生用靶标包被的表面。通常，可将200-800共振单位的靶标偶联至芯片（即，可以提供可容易地测量的结合水平、但可容易地被所用测试试剂的浓度饱和的量）。
在适宜的缓冲液中按结合部位的摩尔比为1:1混合待评估其相互交叉阻断的能力的两个测试氨基酸序列（称为A*和B*），产生测试混合物。在以结合部位为基础计算浓度时，假定氨基酸序列的分子量是该氨基酸序列的总分子量除以该氨基酸序列上的靶结合部位的数目。测试混合物中各氨基酸序列的浓度应足够高，以易于饱和被捕获在Biacore芯片上的靶分子上的针对该氨基酸序列的结合部位。混合物中的氨基酸序列处于相同的摩尔浓度（以结合为基础），且该浓度通常在1.00和1.5μM之间（以结合部位为基础）。还配制包含A*单独和B*单独的分开的溶液。与测试混合物相比，这些溶液中的A*和B*在相同的缓冲液中，且处于相同的浓度。
使测试混合物通过靶标包被的Biacore芯片，并记录结合总量。然后处理芯片，使得去除结合的氨基酸序列而不损伤芯片结合的靶标。通常，这通过用30mM HCl处理芯片60秒来进行。然后使A*单独的溶液通过靶标包被的表面，并记录结合量。再次处理芯片来去除所有结合的氨基酸序列而不损伤芯片结合的靶标。然后使B*单独的溶液通过靶标包被的表面，并记录结合量。
然后计算A*和B*的混合物的最大理论结合，其是各氨基酸序列单独通过靶标表面时的结合的总和。如果实际记录的混合物的结合小于此理论最大值，则两个氨基酸序列相互交叉阻断。因此，一般而言，本发明的交叉阻断的氨基酸序列或其他结合剂是这样，其可在以上Biacore交叉阻断测定中结合靶标，使得在测定期间，在本发明的第二氨基酸序列或其他结合剂的存在下，所记录到的结合在两个氨基酸序列或结合剂组合的最大理论结合的80%和0.1%之间（例如80%至4%）、特别地在最大理论结合的75%和0.1%之间（例如75%至4%）、更特别地在最大理论结合（如上文刚刚定义）的70%和0.1%之间（例如70%至4%）。
上述Biacore测定是用来测定本发明的氨基酸序列或其他结合剂是否相互交叉阻断的一个主要测定试验。少数情况下，特定氨基酸序列或其他结合剂可以不结合通过胺化学偶联至CM5 Biacore芯片的靶标（这通常在与芯片的偶联掩蔽或破坏了靶标上的相关结合部位时发生）。在这种情况下，可以用靶标的带标签的形式，例如N端带His标签的形式（R&DSystems,Minneapolis,MN,USA;2005目录号1406-ST-025）来测定交叉阻断。在此具体型式中，可将抗-His氨基酸序列偶联至Biacore芯片，然后可使带His标签的靶标通过芯片的表面并被抗-His氨基酸序列捕获。除在每个芯片再生循环后将新的带His标签的靶标加载回抗-His氨基酸序列包被的表面上之外，基本按上文所述进行交叉阻断分析。除用N端带His标签的DR5给出的实例外，备选地，可以使用C端带His标签的靶标。此外，可以用本领域已知的多种其他标签和标签结合蛋白质的组合来进行这种交叉阻断分析（例如，HA标签与抗-HA抗体；FLAG标签与抗-FLAG抗体；生物素标签与链霉抗生物素蛋白）。
9.实施例IX
9.1.示例性ELISA测定
下文一般性地描述用于测定针对靶标的氨基酸序列或其他结合剂是否交叉阻断（如本文所定义）或是否能够交叉阻断的ELISA测定。此测定可以用于本文的任何氨基酸序列（或其他结合剂，如本发明多肽）。
该测定的一般原理是使针对靶标的氨基酸序列或结合剂包被在ELISA平板的孔上。在溶液中（即，不结合于ELISA平板）加入过量可能交叉阻断的抗靶标的第二氨基酸序列。然后向孔中加入有限量的靶标。包被的氨基酸序列和溶液中的氨基酸序列竞争结合该有限量的靶分子。洗涤平板，以去除未被包被的氨基酸序列结合的过量靶标，也去除溶液相第二氨基酸序列、以及溶液相第二氨基酸序列和靶标间形成的任何复合体。然后用适于检测靶标的试剂测量结合的靶标的量。相对于缺乏溶液相第二氨基酸序列的情况下包被的氨基酸序列可以结合的靶分子数目，如果溶液中的氨基酸序列能够交叉阻断包被的氨基酸序列，则其将能够导致包被的氨基酸序列可以结合的靶分子数目的减少。
在选择第一氨基酸序列（例如Ab-X）作为固定化氨基酸序列的情况下，将它包被在ELISA平板的孔上，然后用适宜的封闭溶液封闭平板，以最小化随后加入的试剂的非特异性结合。然后向ELISA平板中加入过量的第二氨基酸序列（即，Ab-Y），使得每个孔的Ab-Y[靶标]结合部位的摩尔数比包被ELISA平板期间每个孔所用的Ab-X[靶标]结合部位的摩尔数高至少10倍。然后加入[靶标]，使得每个孔所加入的[靶标]的摩尔数比用来包被各孔的Ab-X[靶标]结合部位的摩尔数低至少25倍。适宜的孵育期之后，洗涤ELISA平板，加入用于检测靶标的试剂，以测量被包被的抗-[靶标]氨基酸序列（在此情况下是Ab-X）特异性结合的靶标的量。
测定试验的背景信号定义为在具有包被的氨基酸序列（在此情况下是Ab-X）、第二溶液相氨基酸序列（在此情况下是Ab-Y）、仅[靶标]缓冲液（即，无靶标）和靶标检测试剂的孔中获得的信号。测定试验的阳性对照信号定义为在具有包被的氨基酸序列（在此情况下是Ab-X）、仅第二溶液相氨基酸序列缓冲液（即，无第二溶液相氨基酸序列）、靶标和靶标检测试剂的孔中获得的信号。ELISA测定可以以这样的方式进行，使得阳性对照信号至少是背景信号的六倍。
为了避免由于在哪一个氨基酸序列作为包被氨基酸序列而哪一个氨基酸序列作为第二（竞争者）氨基酸序列上进行选择所引起的任何假象（例如，Ab-X和Ab-Y对[靶标]之间显著不同的亲和力），交叉阻断测定可以以两种型式进行：（1）型式1，其中Ab-X是包被在ELISA平板上的氨基酸序列，Ab-Y是溶液中的竞争氨基酸序列；和（2）型式2，其中Ab-Y是包被在ELISA平板上的氨基酸序列，Ab-X是溶液中的竞争氨基酸序列。如果在型式1中或在型式2中，与在缺乏溶液相抗靶标氨基酸序列的情况下（即，阳性对照孔）获得的靶标检测信号相比，溶液相抗靶标氨基酸序列能够导致靶标检测信号{即，包被的氨基酸序列结合的靶标的量}降低60%和100%之间、特别地70%和100%之间、更特别地80%和100%之间，则将Ab-X和Ab-Y定义为交叉阻断。
10.实施例X
10.1.巨噬细胞耗竭实验
迄今为止，处于临床研发中的所有抗-DR5抗体都需要交联来达到最佳的体外和体内效力。在体内，认为此交联通过抗-DR5抗体的Fc部分与表达Fc受体的免疫细胞的结合来介导。为了与预期不需要此交联的NB构建体比较来研究抗-DR5抗体LCR211的体内交联作用，在NOD/LtSz-scidIL2R gammanull雌性小鼠（NSG小鼠）背景的MiaPaCa-2异种移植模型中，在肿瘤相关巨噬细胞（TAM）耗竭条件下将小鼠IgG1抗-DR5抗体LCR211的活性与11H6四聚体相比较。NSG（NOD-SCIDγ）小鼠是T细胞、B细胞缺陷的，且由于IL-2Rγ-链缺失而因破坏的细胞因子信号传导而具有很小的NK细胞细胞毒活性或无NK细胞细胞毒活性（Shultz,J.of Immunology 2005）。用通过CSF-1受体抑制信号发放的小分子来达到TAM的耗竭。如之前所示，200mg/kg、每天一次的三个剂量可以耗竭多达80%的巨噬细胞。在整个研究过程中持续每天给药。
收集指数生长期的MiaPaCa细胞。将与Matrigel 50:50混合的五百万个细胞皮下植入裸鼠的右上侧腹。对于细胞植入，使用集成的多室麻醉中心（IMCAC）和诱导室（Vetequip.Inc.,Pleasanton,CA），用2-4%异氟烷/氧混合物的连续流，麻醉小鼠。肿瘤摄取率>90%，细胞植入后约14天，肿瘤达到约150-350mm3。按照肿瘤体积，随机化分组动物，使得平均肿瘤体积和范围在处理组之间在统计上相似（通过斯氏t检验确定）。起始给药时每周两次用数字测径器测量肿瘤。用椭圆体公式计算肿瘤体积：(长x宽2)/2。在有或无250mg/kg qd po的CSF1-R抑制剂（CSF-1Ri）的情况下，按10mg/kg3qw iv施用LCR211，按10mg/kg和40mg/kg qw iv施用11H6四聚体。
用以下公式计算百分比治疗/对照（T/C）值：
若ΔT>0，则%T/C=100×ΔT/ΔC
若ΔT<0，则%消退=100×ΔT/T初始
其中：
T=药物处理组在该研究最后一天的平均肿瘤体积；
ΔT=药物处理组在该研究最后一天的平均肿瘤体积–药物处理组在给药首日的平均肿瘤体积；
T初始=药物处理组在给药首日的平均肿瘤体积；
C=对照组在该研究最后一天的平均肿瘤体积；和
ΔC=对照组在该研究最后一天的平均肿瘤体积–对照组在给药首日的平均肿瘤体积。
在研究结束时进行%T/C计算。
如表27中及图4A和4B中所示，11H6四聚体在NSG小鼠背景中在TAM耗竭条件下保持对MiaPaCa-2异种移植物的有效单活性剂活性，而鼠抗-DR5抗体LCR211在相同条件下丧失功效。
表27：TAM耗竭条件下的11H6四聚体功效的总结
  分子   无TAM耗竭时的%T/C   TAM耗竭时的%T/C
  LCR211 10mg/kg 3qw   22%   95%
  11H6四聚体10mg/kg qw   -23.64%   -5.73%
  11H6四聚体40mg/kg qw   -67.77%   -9.11%
10.2.DR5剂在对LCR211不敏感的患者来源的肿瘤模型中的抗肿瘤 活性
将TPAN1-IFA（患者来源的胰腺肿瘤（Xentech））皮下（sc）植入（80只）雌性裸鼠（Harlan，植入时约8周龄）。开始处理时将动物随机分为9组。起始肿瘤体积是99mm3（在63-196mm3的范围内）。处理组是：（1）载体，每周一次（qw），静脉内（i.v.）；（2）LCR211，10mg/kg，每周三次（3qw），i.v.；（3）11H6四聚体，10mg/kg，qw，i.v.；（4）11H6，40mg/kg，qw，i.v.；（5）吉西他滨，60mg/kg，每周两次（2qw），i.v.。静脉内给药体积是5ml/kg。每周两次称重小鼠。每周两次用测径器测量肿瘤，并用公式计算肿瘤体积（TV）：使用TV(mm3)=[长(mm)x宽(mm)2]/2，其中长和宽分别是各肿瘤的最长直径和最短直径。
如图5中所示，给药4周后，LCR211显示无单活性剂活性，处理组肿瘤体积的平均变化比对照（T/C）=109%。相反，按每周10mg/kg和每周40mg/kg施用的11H6分别导致1%和86%的消退（与载体比较，p<0.05）。吉西他滨处理导致25%的T/C（与载体比较，p<0.05）。LCR211和11H6处理被很好地耐受，未观察到明显的体重减轻。因此，在对靶向DR5的常规抗体不敏感的患者来源的癌症中，本发明NB构建体显示有效的肿瘤消退。在此实例中，NB构建体具有治疗更大类的患者的潜力，所述患者可对此途径的常规靶向方法具有抵抗性。
11.实施例XI
11.1.人DR5/NB构建体复合体的X射线晶体结构测定
测定了与单体构建体11H6（SEQ ID NO:103）和4E6（SEQ ID NO:104）结合的人DR5 ECD片段的晶体结构。如下文详述，表达各单个DR5蛋白质片段，纯化，并混合形成复合体。利用蛋白质晶体学来产生与这两个实例结合的DR5蛋白质的原子分辨率数据。
产生DR5蛋白质的两个变体进行晶体学分析，即DR5_54和DR5_61。按照GenBank检索号BAA33723.1（SEQ ID NO:89）的人DR5的序列编号，这些DR5序列分别对应于残基54至183和61至183。如表28中所示，产生过程中去除了以小写字母显示的序列。对于DR5_54（SEQ ID NO:100）和DR5_61（SEQ ID NO:101），在人DR5序列上标下划线。在表28中，“ID”代表SEQ ID NO。
表28：用于晶体结构测定的蛋白质
Figure BDA00002226856201641
用杆状病毒表达系统在SF9细胞中表达以上蛋白质，表达载体包含GP67信号肽。2.5天感染后，从细胞生长培养基纯化DR5蛋白质。加入5mM CaCl2、1mM NiCl2、50mM Tris pH 8.0和1μM PMSF来澄清培养基。用重力流柱，将蛋白质捕获在以50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl平衡的Ni-NTA树脂（Qiagen）上。用50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、30mM咪唑洗涤柱，然后用50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、300mM咪唑洗脱。用PreScission蛋白酶（GE Healthcare）切割从Ni柱洗脱的DR5，然后用在50mM HEPES pH 7.6、150mM NaCl中平衡的Superdex75柱（GE Healthcare）进行凝胶过滤层析。使用MonoQ柱（GEHealthcare）、pH 7.5、20柱体积的0.03-1M NaCl梯度，通过离子交换进一步纯化DR5。通过SDS-PAGE和LCMS分析峰级分，之后汇合。
11.2.4E6和11H6与DR5结晶
用BL21(DE3)pLysS细胞和BL21(DE3)Star细胞，将4E6（pAX111-4E6,SEQ ID NO:103）和11H6（pAX100-11H6,SEQ ID NO:102）二者都作为单体NB构建体克隆以在大肠杆菌中表达，二者都包含上文表28中提供的用于周质定位的信号序列。用IPTG在37℃诱导3小时后，收集并裂解细胞。将蛋白质捕获在Ni-NTA柱上，该Ni-NTA柱在50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl中预平衡。用50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、50mM咪唑洗涤柱，然后用50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、300mM咪唑洗脱。使用Superdex 75柱（GE Healthcare），通过凝胶过滤层析进一步纯化Ni洗脱物。对于11H6，这是最后的纯化步骤，而4E6通过MonoS阳离子交换柱（GE Healthcare）进行额外的纯化步骤。
通过以下制备DR5_61/4E6的复合体：按1:1的摩尔比（通过LCUV测量浓度）混合DR5_61和4E6，冰上孵育1小时，并在以20mM HEPESpH 7.5、150mM NaCl平衡的Superdex75柱（GE Healthcare）上纯化复合体。通过SDS-PAGE和LCMS分析峰级分。将含有DR5_61/4E6的级分浓缩至约10mg/ml用于结晶。
通过以下制备DR5_54/11H6的复合体：按1:1.3的摩尔比（通过LCUV估计浓度）混合DR5_54和11H6，冰上孵育1小时，并在以25mM HEPESpH 7.5、150mM NaCl平衡的Superdex75柱（GE Healthcare）上纯化复合体。混合含有DR5_54/11H6二聚体的峰值级分，并浓缩至约12.7mg/ml。然后用胰蛋白酶处理该二聚体如下：用200μl二聚体（约2.5mg）重悬20μg冻干的胰蛋白酶，然后将其在室温孵育15分钟。离心DR5_54/11H6/胰蛋白酶混合物，然后建立结晶筛选。
从包含等体积的蛋白质和储存溶液(reservoir solution)的液滴，通过坐滴蒸发扩散，生长晶体。对于DR5_61/4E6复合体，22%PEG 3350、150mM醋酸钙、100mM HEPES pH 7.5的储存溶液在20℃孵育时产生晶体。对于胰蛋白酶处理的DR5_54/11H6复合体，0.2M硫酸铵、0.1M Tris pH 8.5、25%PEG 3350的储存溶液在20℃孵育时产生晶体。
将DR5_61/4E6晶体转移至含有25%PEG 3350、50mM HEPES pH7.5、150mM醋酸钙、15%甘油、10%乙二醇的冷冻溶液，并在液氮中迅速冷却。将DR5_a54/11H6晶体转移至额外还含有22%甘油的储存溶液，并在液氮中迅速冷却。
对于DR5_61/4E6复合体，在Swiss Light Source（Paul ScherrerInstitut,Villigen,瑞士）的PXI-X06SA站点收集衍射数据。用autoPROC（Global Phasing,LTD），以
Figure BDA00002226856201661
处理和缩放数据，空间群C121，晶胞尺寸
Figure BDA00002226856201663
Figure BDA00002226856201664
α=90°、β=99.38°、γ=90°。以DR5结构2H9G和驼源化的人VH结构1OL0为检索模型，使用Phaser(McCoy等,(2007)J.Appl.Cryst.40:658-674)，通过分子取代来解析DR5_61/4E6结构。在COOT（Emsley&Cowtan(2004)Acta Cryst.60:2126-2132）中构建每个不对称单位包含2分子DR5_61/4E6复合体的最终模型，并用PHENIX（Adams等,Acta Cryst.D66,213-221(2010)）精细化至R值和Rfree值分别为22.2%和24.1%，键长和键角的rmsd分别为
Figure BDA00002226856201665
和0.69°。
对于DR5_54/11H6复合体，在Advanced Photon Source（ArgonneNational Laboratory，USA）以beamline 17-ID收集衍射数据。用autoPROC（Global Phasing,LTD），以
Figure BDA00002226856201671
处理和缩放数据，空间群P65，晶胞尺寸
Figure BDA00002226856201672
Figure BDA00002226856201673
Figure BDA00002226856201674
α=90°、β=90°、γ=120°。以DR5结构2H9G和NB构建体4E6为检索模型，使用Phaser(McCoy等,(2007)J.Appl.Cryst.40:658-674)，通过分子取代来解析DR5_54/11H6结构。在COOT（Emsley&Cowtan(2004)Acta Cryst.60:2126-2132）中构建每个不对称单位包含2分子DR5_54/11H6复合体的最终模型，并用PHENIX（Adams等,Acta Cryst.D66,213-221(2010)）精细化至R值和Rfree值分别为19.5%和22.0%，键长和键角的rmsd分别为
Figure BDA00002226856201675
和0.64°。
11.3.4E6和11H6识别DR5上的独特表位
用4E6/DR5_61复合体的晶体结构鉴定了4E6构建体的DR5表位。DR5上的相互作用表面由三个不连续（即，非相邻）的序列形成：即，表29A中详述的残基77至80、残基87至91和残基105至114。这些残基形成NB构建体识别的三维表面。相互作用包括主链相互作用、溶剂介导的相互作用和直接的侧链相互作用。表29A中指出了其侧链直接贡献于相互作用的氨基酸。来自4E6NB构建体的相互作用表面贡献由其N端残基2和三个环区（残基28至33、残基53至59和残基99至115）形成。表29B中列出了接触残基。
在表29A中，列出了包含与NB构建体4E6接触的原子的DR5残基。将接触定义为处于NB构建体的5埃之内，以解释潜在的水介导的相互作用。其侧链直接贡献于相互作用表面的氨基酸用“+”标注。
表29A：用于4E6的DR5构象表位
  蛋白质   氨基酸   序列位置   侧链相互作用
  DR5   S   77
  DR5   E   78   +
  DR5   G   79
  DR5   L   80   +
  DR5   I   87   +
  DR5   S   88
  DR5   E   89
  DR5   D   90
  DR5   G   91  +
  DR5   T   105
  DR5   H   106  +
  DR5   W   107  +
  DR5   N   108
  DR5   D   109  +
  DR5   L   110  +
  DR5   L   111  +
  DR5   F   112  +
  DR5   L   114  +
在表29B中，列出了NB构建体4E6中与DR5接触的残基。将接触定义为处于NB构建体的5埃之内，以解释潜在的水介导的相互作用。其侧链直接贡献于相互作用表面的氨基酸用“+”标注。
表29B：与DR5接触的4E6氨基酸
  蛋白质   氨基酸   序列位置   侧链相互作用
  4E6   V   2   +
  4E6   T   28   +
  4E6   G   30   +
  4E6   S   31   +
  4E6   I   32   +
  4E6   R   33   +
  4E6   R   53
  4E6   N   54   +
  4E6   Y   59
  4E6   G   99  +
  4E6   L   100
  4E6   Q   101  +
  4E6   Y   102  +
  4E6   N   103
  4E6   R   104
  4E6   A   105  +
  4E6   A   106  +
  4E6   V   111  +
  4E6   V   114  +
  4E6   Y   115  +
用11H6/DR5_54复合体的晶体结构，鉴定11H6构建体的DR5表位。如表30A中详述，DR5上的相互作用表面由两个不连续的序列（残基86至102和残基111至118）及两个额外的残基74和125形成。这些残基形成NB构建体识别的三维表面。相互作用包括主链相互作用、溶剂介导的相互作用和直接侧链相互作用。表30A中指出了其侧链直接贡献于相互作用的氨基酸。来自11H6构建体的相互作用表面贡献延伸超过针对4E6构建体观察到的环区。如表30B中详述，残基30至37、残基44至61、和残基96至112贡献于11H6构建体的结合表面。11H6构建体的来自残基98至110的环处于与4E6构建体的对应环非常不同的构象。此可变的环位置为DR5结合提供独特的结合表面。
在表30A中，列出了包含与11H6构建体接触的原子的DR5残基。将接触定义为处于11H6的5埃之内，以解释潜在的水介导的相互作用。其侧链直接贡献于相互作用表面的氨基酸用“+”标注。将埋藏的表面积测定为百分比。
表30A：用于11H6的DR5构象表位
  蛋白质   氨基酸   序列位置   埋藏的表面积(%)
  DR5   S   74
  DR5   H   86  +
  DR5   I   87
  DR5   S   88  +
  DR5   E   89  +
  DR5   D   90  +
  DR5   R   92
  DR5   D   93  +
  DR5   I   95  +
  DR5   S   96
  DR5   K   98  +
  DR5   G   100
  DR5   Q   101  +
  DR5   D   102  +
  DR5   L   111  +
  DR5   F   112  +
  DR5   C   113
  DR5   R   115  +
  DR5   R   118  +
  DR5   E   125
在表30B中，列出了11H6中与DR5接触的残基。将接触定义为处于11H6构建体的5埃之内，以解释潜在的水介导的相互作用。其侧链直接贡献于相互作用表面的氨基酸用“+”标注。
表30B：与DR5接触的11H6氨基酸
  蛋白质   氨基酸   序列位置   侧链相互作用
  11H6   K   30   +
  11H6   N   32   +
  11H6   N   33   +
  11H6   Y   37  +
  11H6   Q   44  +
  11H6   R   45
  11H6   D   46  +
  11H6   L   47  +
  11H6   Q   50  +
  11H6   I   51
  11H6   T   52  +
  11H6   P   53
  11H6   G   54
  11H6   G   55
  11H6   I   56  +
  11H6   T   57
  11H6   D   58  +
  11H6   A   60  +
  11H6   D   61
  11H6   N   96  +
  11H6   E   98  +
  11H6   L   100  +
  11H6   Y   104
  11H6   D   106
  11H6   V   107  +
  11H6   Y   108  +
  11H6   N   110  +
  11H6   W   112  +
等同实施方案
1.一个实施方案提供分离的多肽，其包含特异性结合人DR5的NB剂的单可变结构域的至少一个单体。
2.一个实施方案提供段落1的多肽，其中该单可变结构域选自：a）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列选自SEQ ID NO:63-68的任何一个或多个；b）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列与选自SEQ ID NO:63-68的任何一个或多个的至少一个CDR3具有90%同一性；和c）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该该一个或多个CDR3序列与选自SEQ ID NO:63-68的任何一个或多个的至少一个CDR3具有至少95%同一性。
3.一个实施方案提供段落1的多肽，其中该单可变结构域选自：a）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列选自SEQ ID NO:41-44、51-55和63-68的任何一个或多个；b）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列与选自SEQ ID NO:41-44、51-55和63-68的任何一个或多个的至少一个CDR3具有至少90%同一性；和c）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列与选自SEQ ID NO:41-44、51-55和63-68的任何一个或多个的至少一个CDR3具有至少95%同一性。
4.一个实施方案提供段落1的多肽，其中该单可变结构域选自：a）SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域；和b）与SEQ ID NO:1-5、26、30和87的至少一个单可变结构域具有至少95%同一性的单可变结构域。
5.一个实施方案提供分离的多肽，其包含特异性结合人DR5的单可变结构域的至少三个单体。
6.一个实施方案提供段落5的多肽，其中该多肽包含单可变结构域的三个相同的单体，且其中该单可变结构域选自：a）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列选自SEQID NO:63-68的任何一个或多个；b）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列与选自SEQ ID NO:63-68的任何一个或多个的至少一个CDR3具有90%同一性；和c）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列与选自SEQ ID NO:63-68的任何一个或多个的至少一个CDR3具有至少95%同一性。
7.一个实施方案提供段落5的多肽，其中该多肽包含单可变结构域的三个相同的单体，且其中该单可变结构域选自：a）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列选自SEQID NO:41-44、51-55和63-68的任何一个或多个；b）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列与选自SEQ ID NO:41-44、51-55和63-68的任何一个或多个的至少一个CDR3具有至少90%同一性；和c）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列与选自SEQ ID NO:41-44、51-55和63-68的任何一个或多个的至少一个CDR3具有至少95%同一性。
8.一个实施方案提供段落5的多肽，其中该多肽包含单可变结构域的三个相同的单体，且其中该单可变结构域选自：a）SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域；b）与SEQ ID NO:1-5、26、30和87的至少一个单可变结构域具有至少90%同一性的单可变结构域；和c）与SEQ ID NO:1-5、26、30和87的至少一个单可变结构域具有至少95%同一性的单可变结构域。
9.一个实施方案提供段落5的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：a）SEQ ID NO:6、9、12-14、17、20、27和31的氨基酸序列；和b）与SEQ ID NO:6、9、12-14、17、20、27和31的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
10.一个实施方案提供段落5的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：a）SEQ ID NO:6、9、12-14、17、20、27和31的氨基酸序列；和b）与SEQ ID NO:6、9、12-14、17、20、27和31的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
11.段落5的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：a）SEQ ID NO:6、9、12-14、17、20、27和31的氨基酸序列；和b）与SEQ ID NO:6、9、12-14、17、20、27和31的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
12.一个实施方案提供分离的多肽，其包含特异性结合人DR5的单可变结构域的至少四个单体。
13.一个实施方案提供段落12的多肽，其中该多肽包含四个单可变结构域，且其中该单可变结构域选自来自以下的一个、两个、三个或四个单体：1）SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域；b）与SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域具有至少90%同一性的单可变结构域；和c）与SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域具有95%同一性的单可变结构域。
14.一个实施方案提供段落12的多肽，其中该多肽包含四个相同的单可变结构域，且其中该单可变结构域选自：1）SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域；b）与SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域具有至少90%同一性的单可变结构域；和c）与SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域具有95%同一性的单可变结构域。
15.一个实施方案提供段落12的多肽，其中该多肽包含四个相同的单可变结构域，且其中该单可变结构域选自：1）SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域；和b）与SEQ ID NO:1-5、26、30和87的至少一个单可变结构域具有95%同一性的单可变结构域。
16.一个实施方案提供段落12的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：a）SEQ ID NO:88的氨基酸序列；b）与该SEQ ID NO:88的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列；和c）与该SEQ ID NO:88的氨基酸序列具有95%同一性的氨基酸序列。
17.一个实施方案提供段落12的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：a）SEQ ID NO:7、10、15、18、21、28和32的氨基酸序列；b）与该SEQID NO:7、10、15、18、21、28和32的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列；和c）与该SEQ ID NO:7、10、15、18、21、28和32的氨基酸序列具有95%同一性的氨基酸序列。
18.段落12的多肽，其包含选自以下的人源化氨基酸序列：a）SEQ IDNO:28的氨基酸序列；b）SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和c）与该SEQID NO:28和32的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
19.一个实施方案提供分离的多肽，其包含特异性结合人DR5的单可变结构域的至少五个单体。
20.一个实施方案提供段落19的多肽，其中该多肽包含五个单可变结构域，且其中该单可变结构域选自以下的一个、两个、三个、四个或五个单体：1）SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域；b）与该SEQID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域具有至少90%同一性的单可变结构域；和c）与该SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域具有至少95%同一性的单可变结构域。
21.一个实施方案提供段落19的多肽，其中该多肽包含五个相同的单可变结构域，且其中该单可变结构域选自：1）SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域；b）与该SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域具有至少90%同一性的单可变结构域；和c）与该SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域具有95%同一性的单可变结构域。
22.一个实施方案提供段落19的多肽，其中该多肽包含五个单可变结构域，且其中该单可变结构域是人源化的，且该人源化结构域选自：a）SEQ ID NO:26和30的单可变结构域；b）与SEQ ID NO:26和30的至少一个单可变结构域具有至少90%同一性的单可变结构域；和c）与SEQID NO:26和30的至少一个单可变结构域具有至少95%同一性的单可变结构域。
23.一个实施方案提供段落19的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：a）SEQ ID NO:8、11、16、19、22、29和33的氨基酸序列；b）与该SEQID NO:8、11、16、19、22、29和33的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列；和c）与该SEQ ID NO:8、11、16、19、22、29和33的氨基酸序列具有95%同一性的氨基酸序列。
24.一个实施方案提供段落19的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：a）SEQ ID NO:29的氨基酸序列；b）与该SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列；和c）与该SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有95%同一性的氨基酸序列。
25.一个实施方案提供段落19的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：a）SEQ ID NO:33的氨基酸序列；b）与该SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列；和c）与该SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
26.一个实施方案提供分离的多肽，其包含特异性结合人DR5的单可变结构域的三个或四个或五个单体，且其中该多肽对选自Colo205、Jurkat、Molt4、H2122、H226和H2052的至少2个肿瘤细胞系具有等于或低于100nM的体外效力（IC50）。
27.一个实施方案提供段落26的多肽，其中该多肽具有等于或低于10nM的体外效力。
28.一个实施方案提供段落26的多肽，其中该多肽具有等于或低于1nM的体外效力。
29.一个实施方案提供段落26的多肽，其中该多肽具有等于或低于100pM的体外效力。
30.一个实施方案提供段落26至29的多肽，其中该多肽对选自Malme-3、WI-38、ARPE-19、184A1、Huvec、HAAE-1的至少3个非肿瘤细胞系具有等于或大于20nM的体外效力（IC50）。
31.一个实施方案提供段落26至29的多肽，其中该多肽对选自Malme-3、WI-38、ARPE-19、184A1、Huvec、HAAE-1的至少3个非肿瘤细胞系具有等于或大于100nM的体外效力（IC50）。
32.一个实施方案提供段落26至31的多肽，其中该多肽包含单可变结构域的三个或四个或五个单体，且其中该单可变结构域选自：a）SEQ IDNO:1-5、26、30和87的单可变结构域；和b）与该SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域具有至少90%同一性的单可变结构域。
33.段落26至31的多肽，其中该多肽包含单可变结构域的三个或四个或五个单体，其中该单可变结构域是人源化的，且选自：a）SEQ ID NO:26和30的单可变结构域；和b）与该SEQ ID NO:26和30的单可变结构域具有至少90%同一性的单可变结构域；和b）与该SEQ ID NO:26和30的单可变结构域具有至少95%同一性的单可变结构域。
34.一个实施方案提供段落26至31的多肽，其中该多肽选自：a）选自SEQ ID NO:27、28和29的任何一个或多个的多肽；b）与选自SEQID NO:27、28和29的任何一个或多个的至少一个多肽具有至少95%同一性的多肽；c）选自SEQ ID NO:31、32和33的任何一个或多个的多肽；和d）与选自SEQ ID NO:31、32和33的任何一个或多个的至少一个多肽具有至少95%同一性的多肽。
35.一个实施方案提供分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:1-22、26-33、87和88的一个或多个氨基酸序列的氨基酸序列。
36.一个实施方案提供前述段落1至35中任一的分离的多肽，其中该多肽在竞争性结合测定中未完全地或部分地与DR5的天然配体竞争。
37.一个实施方案提供前述段落1至36中任一的分离的多肽，其中该多肽在竞争性结合测定中完全地或部分地与DR5的天然配体竞争。
38.一个实施方案提供段落1、5、12、19、26或37的分离的多肽，其包含至少一个互补决定区（CDR），该至少一个CDR与SEQ ID NO:41至44（CDR1）、SEQ ID NO:51至55（CDR2）、SEQ ID NO:63至68（CDR3）、更优选SEQ ID NO:51至55和SEQ ID NO:63至68中任一个所示的CDR区中的至少一个具有至少60%、70%、80%、90%、95%或100%序列同一性。
39.一个实施方案提供段落1、5、12、19、26或37的分离的多肽，其包含CDR1至CDR3区，该CDR1至CDR3区分别与SEQ ID NO:41至44（CDR1）、SEQ ID NO:51至55（CDR2）、SEQ ID NO:63至68（CDR3）中任一个所示的CDR区具有至少90%、95%或100%序列同一性。
40.一个实施方案提供段落1、5、12、19、26或37的分离的多肽，其包含这样的氨基酸序列或基本上有这样的氨基酸序列组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:26至33中所示的任何氨基酸序列具有至少90%、95%或100%序列同一性。
41.一个实施方案提供段落1、5、12、19、26或37中任一段落的分离的多肽，其包含SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:66的CDR3区。
42.一个实施方案提供段落1、5、12、19、26或37中任一段落的分离的多肽，包含分别与SEQ ID NO:41至44（CDR1）、SEQ ID NO:51至55（CDR2）、SEQ ID NO:63至68（CDR3）中所示的CDR区相同的CDR1、CDR2和CDR3区，或与以上所示的原始CDR区相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或插入的变体CDR区。
43.一个实施方案提供前述段落1至42中任一段落的分离的多肽，其是免疫球蛋白或其片段。
44.一个实施方案提供前述段落1至43中任一段落的分离的多肽，其是人源化免疫球蛋白、驼源化免疫球蛋白、或可通过亲和力优化技术获得的免疫球蛋白，或其片段。
45.一个实施方案提供前述段落1至44中任一段落的分离的多肽，其基本上由轻链可变结构域序列（例如VL-序列）或重链可变结构域序列（例如VH-序列）组成。
46.一个实施方案提供前述段落1至45中任一段落的分离的多肽，其基本上由源自常规四链抗体的重链可变结构域序列组成，或基本上由源自重链抗体的重链可变结构域序列组成。
47.一个实施方案提供前述段落1至46中任一段落的分离的多肽，其基本上由结构域抗体、单结构域抗体、dAb和驼源抗体或片段（包括但不限于VHH序列）组成。
48.一个实施方案提供前述段落1至47中任一段落的分离的多肽，其基本上由VHH序列组成。
49.一个实施方案提供前述段落1至48中任一段落的分离的多肽，其基本上由VHH序列组成，该VHH序列：
a）与SEQ ID NO 1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性，其中，为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；且其中：
b）可选地，根据Kabat编号的氨基酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108中的一个或多个被人工程化。
50.一个实施方案提供前述段落1至49中任一段落的分离的多肽，其基本上由VHH序列组成，该VHH序列：
a）与SEQ ID NO 1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列中的至少一个具有至少90%氨基酸同一性，其中，为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；且其中：
b）可选地，DR5与VHH序列间的接触点选自：
i）包含表29A中的残基的DR5构象表位；
ii）包含表30A中的残基的DR5构象表位；
iii）表29B中列出的VHH氨基酸的相互作用表面；和
iv）表30B中列出的VHH氨基酸的相互作用表面。
51.一个实施方案提供前述段落1至50中任一段落的分离的多肽，其基本上由人源化VHH序列组成。
52.一个实施方案提供化合物，其包含根据前述段落1至51中任一段落的一种或多种多肽，或基本上由该一种或多种多肽组成，且可选地进一步包含一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位，其中该化合物能够增强细胞凋亡。
53.一个实施方案提供段落52的化合物，例如在Colo205细胞存活测定中测量，其具有小于100nM、优选小于10nM、更优选小于1nM、甚至更优选小于100pM、例如低于10pM的IC50。
54.一个实施方案提供段落52或53的化合物，其中，例如在Colo205细胞存活测定中测量，对应的单价结合多肽不如该多价多肽有效。
55.一个实施方案提供段落52或54中任一段落的化合物，其中该至少三个、四个、五个或更多个单价结合多肽可以各自以单价结合人DR5。
56.一个实施方案提供段落52或54中任一段落的化合物，其中该至少三个、四个、五个或更多个单价结合多肽可以各自以单价结合人DR5，但不结合TRAIL-R3和/或TRAIL-R4受体。
57.一个实施方案提供段落52或54中任一段落的化合物，其中该至少三个、四个、五个或更多个单价结合多肽可以各自以单价结合人DR5，并在结合测定中与天然TRAIL配体竞争。
58.一个实施方案提供段落52或54中任一段落的化合物，其中该至少三个、四个、五个或更多个单价结合多肽全都针对人DR5的同一结合区。
59.一个实施方案提供段落52或53中任一段落的化合物，其中至少一个单价结合多肽针对DR5的一个结合区，而至少一个其他单价结合多肽针对DR5的另一不同的结合区或另一DR5的结合区。
60.一个实施方案提供段落52或53中任一段落的化合物，其中该至少三个、四个、五个或更多个单价结合多肽具有基本相同的氨基酸序列。
61.一个实施方案提供段落52或53中任一段落的化合物，其基本上由单链多肽组成，且其中该至少三个、四个、五个或更多个单价结合单可变结构域通过肽接头连接在一起。
62.一个实施方案提供段落61的化合物，其中该接头基本上由含有5至50个氨基酸残基的肽组成。
63.一个实施方案提供段落52或54中任一段落的化合物，其中该一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位是多肽，可选地通过一个或多个接头连接。
64.一个实施方案提供段落1至63中任一段落的化合物，其中该一个或多个接头是肽接头或多肽接头。
65.一个实施方案提供段落64的化合物，其中该一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位选自结构域抗体、单结构域抗体、dAb和驼源抗体或其片段，包括但不限于VHH序列。
66.一个实施方案提供段落52至65中任一段落的化合物，其中，与不含该一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位的相同化合物相比，在哺乳动物中施用时，该一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位赋予该化合物增加的半衰期。
67.一个实施方案提供分离的核酸，其编码：（1）包含段落1至51的任一段落中定义的多肽的氨基酸序列的多肽；或（2）段落52至66中任一段落的化合物。
68.一个实施方案提供宿主细胞，其表达或能够在适宜环境下表达段落错误！未找到引用源。的核酸。
69.一个实施方案提供用于产生段落1至51中任一段落的DR5结合多肽或段落52至66中任一段落的化合物的方法，其包括：
a）在适宜的宿主细胞或非人宿主生物中表达段落67的核酸；和
b）分离和/或纯化该DR5结合多肽或化合物。
70.一个实施方案提供段落1至51中任一段落的多肽或段落52至66中任一段落的化合物，其用作药物。
71.一个实施方案提供段落70的多肽，其用作抗癌药物。
72.一个实施方案提供组合物，其包含至少段落1至51中任一段落的多肽，或段落52至66中任一段落的化合物，及至少一种可药用载体、稀释剂或赋形剂和/或助剂。
73.一个实施方案提供用于预防和/或治疗可以通过增强细胞凋亡来治疗的障碍的方法，该方法包括对有需要的受试者施用药物有效量的至少一种段落1至51中任一段落的多肽，或至少一种段落52至66中任一段落的化合物。
74.一个实施方案提供段落73的方法，其中该障碍是增生性疾病。
75.一个实施方案提供段落74的方法，其中该增生性疾病选自：
a）一种或多种实体瘤，其选自原发性和转移性癌症，如肾细胞癌和肺癌（例如小细胞肺癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”），胰腺、造血系统恶性肿瘤，神经胶质瘤，星形细胞瘤，间皮瘤，结肠直肠癌，前列腺癌，骨肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤（包括但不限于伯基特淋巴瘤），乳腺癌，子宫内膜癌，肝癌，胃癌，皮肤癌，卵巢癌和任何来源的鳞状细胞癌（包括但不限于肺、头和颈、乳腺、甲状腺、子宫颈、皮肤和/或食管的鳞状细胞癌）；和
b）一种或多种液体癌症，其选自白血病，包括尤其T细胞白血病，如急性T细胞白血病（T-ALL））、急性B细胞白血病（B-ALL）、慢性骨髓性白血病（CML）、急性骨髓性白血病（AML）、浆细胞性骨髓瘤和多发性骨髓瘤（MM）。
76.一个实施方案提供段落74的方法，其中该增生性疾病是一种或多种非癌适应症，该适应症包括一种或多种炎性和自身免疫性疾病，如系统性红斑性狼疮、桥本病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主疾病、干燥综合症、恶性贫血、艾迪生病、硬皮病、肺出血肾炎综合症、克罗恩病、自身免疫性溶血性贫血、不育、重症肌无力、多发性硬化、突眼性甲状腺肿、血栓形成性血小板减少症、血小板减少性紫癜、胰岛素依赖性糖尿病、变态反应、哮喘、特应性疾病、动脉硬化、心肌炎、心肌病、肾小球肾炎和再生不良性贫血。
77.一个实施方案提供段落75的方法，其中该增生性疾病是胰腺癌。
78.一个实施方案提供段落75的方法，其中该增生性疾病是T-ALL。
79.一个实施方案提供段落75的方法，其中该增生性疾病是间皮瘤。
80.一个实施方案提供段落75的方法，其中该增生性疾病是任何组织来源的鳞状细胞癌。
81.一个实施方案提供段落75的方法，其中该增生性疾病是AML。
82.一个实施方案提供段落75的方法，其中该增生性疾病是黑素瘤。
83.一个实施方案提供段落75的方法，其中该增生性疾病是骨髓瘤。
84.一个实施方案提供组合物，其包含段落1至51中任一段落的多肽或至少一种段落52至66中任一段落的化合物，该组合物与选自cIAP1、cIAP2、XIAP、cFLIP和Bcl-xL的任何一个或多个基因的至少一种抑制剂组合。
85.一个实施方案提供段落84的组合物，其中该抑制剂是cIAP1的抑制剂。
86.一个实施方案提供段落85的组合物，其进一步包含MEK的抑制剂。
87.一个实施方案提供段落85的组合物，其进一步包含BRAF的抑制剂。
88.一个实施方案提供段落84的组合物，其中该抑制剂是XIAP的抑制剂。
89.一个实施方案提供段落84的组合物，其中该抑制剂是cFLIP的抑制剂。
90.一个实施方案提供段落84的组合物，其中该抑制剂是选自LCL161和ABT263的低分子量化合物。
91.一个实施方案提供段落84的组合物，其中该抑制剂是shRNA。
92.一个实施方案提供使用任何一种或多种段落72的组合物的方法，该方法包括对有需要的受试者施用药物有效量的该组合物或其组合来治疗DR5相关疾病。
93.一个实施方案提供段落92的方法，其中该DR5相关疾病选自以下的一种或多种：
a）选自实体癌症和液体癌症的一种或多种增生性疾病：
（i）其中实体瘤包括原发性和转移性癌症，如肾细胞癌和肺癌（例如小细胞肺癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”），胰腺、造血系统恶性肿瘤，神经胶质瘤，星形细胞瘤，间皮瘤，结肠直肠癌，前列腺癌，骨肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤（包括但不限于伯基特淋巴瘤），乳腺癌，子宫内膜癌，肝癌，胃癌，皮肤癌，卵巢癌和任何来源的鳞状细胞癌（包括但不限于肺、头和颈、乳腺、甲状腺、子宫颈、皮肤和/或食管的鳞状细胞癌）；和
（ii）其中液体癌症包括白血病，包括尤其T细胞白血病，如急性T细胞白血病（T-ALL）、急性B细胞白血病（B-ALL）、慢性骨髓性白血病（CML）、急性骨髓性白血病（AML）、浆细胞性骨髓瘤和多发性骨髓瘤（MM）；和
b）非癌适应症，其包括一种或多种炎性和自身免疫性疾病，如系统性红斑性狼疮、桥本病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主疾病、干燥综合症、恶性贫血、艾迪生病、硬皮病、肺出血肾炎综合症、克罗恩病、自身免疫性溶血性贫血、不育、重症肌无力、多发性硬化、突眼性甲状腺肿、血栓形成性血小板减少症、血小板减少性紫癜、胰岛素依赖性糖尿病、变态反应、哮喘；特应性疾病、动脉硬化、心肌炎、心肌病、肾小球肾炎和再生不良性贫血。
94.一个实施方案提供前述段落1至93中任何一个或多个段落的分离的多肽，其中按照Kabat和/或Chothia规则，计算CDR。
95.一个实施方案提供前述段落1至94中任何一个或多个段落的分离的多肽，其中该多肽结合表29A和/或30A中提供的一个或多个表位，和/或包含表29B和/或30B中提供的相互作用表面残基。
本发明的以下权利要求是非限制性的。可以考虑本领域技术人员能力范围之内的本发明的某些变通形式，其包括但不限于制剂、递送、人源化、表达系统等的变化。认为这类变通形式在本发明的范围之内。
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Claims (31)

1.分离的多肽，其包含特异性结合人DR5的NB剂的单可变结构域的至少一个单体。
2.权利要求1的多肽，其中所述单可变结构域选自：a）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列选自SEQ ID NO:63-68的任何一个或多个；b）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列与选自SEQ ID NO:63-68的任何一个或多个的至少一个CDR3具有90%同一性；和c）包含一个或多个互补决定区3（CDR3）序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列与选自SEQ ID NO:63-68的任何一个或多个的至少一个CDR3具有至少95%同一性。
3.权利要求1的多肽，其中所述单可变结构域选自：a）SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域；和b）与SEQ ID NO:1-5、26、30和87的至少一个单可变结构域具有至少95%同一性的单可变结构域。
4.分离的多肽，其包含特异性结合人DR5的单可变结构域的至少3个、至少4个或至少5个单体亚基，其中所述亚基可选地通过多肽接头连接。
5.权利要求4的多肽，其中所述多肽包含单可变结构域的相同的单体，且其中所述单可变结构域选自：a）SEQ ID NO:1-5、26、30和87的单可变结构域；b）与SEQ ID NO:1-5、26、30和87的至少一个单可变结构域具有至少90%同一性的单可变结构域；和c）与SEQ ID NO:1-5、26、30和87的至少一个单可变结构域具有至少95%同一性的单可变结构域。
6.权利要求4的多肽，其包含选自以下的一个或多个亚基的氨基酸序列：a）SEQ ID NO:6、9、12-14、17、20、27和31的氨基酸序列；和b）与所述SEQ ID NO:6、9、12-14、17、20、27和31的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
7.权利要求4的多肽，其特异性结合人DR5，且其中所述多肽对选自Colo205、Jurkat、Molt4、H2122、H226和H2052的一组至少2个肿瘤细胞系具有等于或低于100nM的体外效力（IC50）。
8.权利要求7的多肽，其中所述多肽具有等于或低于10nM、等于或低于1nM、或等于或低于100pM的体外效力。
9.分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:1-22、26-33、87和88的一个或多个氨基酸序列的氨基酸序列。
10.权利要求1的分离的多肽，其包含至少一个互补决定区（CDR），该至少一个CDR与SEQ ID NO:41至44（CDR1）、SEQ ID NO:51至55（CDR2）、SEQ ID NO:63至68（CDR3）、更优选SEQ ID NO:51至55和SEQ ID NO:63至68中任一个所示的CDR区的至少一个具有至少60%、70%、80%、90%、95%或100%序列同一性。
11.前述权利要求中任一项的分离的多肽，其是人源化免疫球蛋白、驼源化免疫球蛋白、或可通过亲和力优化技术获得的免疫球蛋白，或其片段。
12.前述权利要求中任一项的分离的多肽，其基本上由轻链可变结构域序列，例如VL-序列、或重链可变结构域序列，例如VH-序列组成；或是结构域抗体、单结构域抗体、dAb和驼源抗体或片段，包括但不限于VHH序列。
13.前述权利要求中任一项的分离的多肽，其基本上由VHH序列组成，该VHH序列：
（a）与SEQ ID NO 1-22、26-40、87-88和103-104的氨基酸序列中的至少一个、或由SEQ ID NO:96-99中的至少一个编码的氨基酸序列具有至少90%氨基酸同一性，其中，为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
且其中
（b）可选地，根据Kabat编号的氨基酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108中的一个或多个被人工程化。
14.化合物，其包含一种或多种根据前述权利要求中任一项的多肽或基本上由该一种或多种多肽组成，且可选地进一步包含一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位，其中所述化合物能够增强细胞凋亡。
15.权利要求14的化合物，其中所述至少3个、4个、5个或更多个单价结合多肽全都针对人DR5的同一结合区。
16.权利要求14的化合物，其中所述至少一个单价结合多肽针对DR5的一个结合区，至少一个其他单价结合多肽针对DR5的另一不同的结合区或另一DR5的结合区。
17.权利要求1的多肽，其用作药物。
18.权利要求17的多肽，其用作抗癌药物。
19.权利要求18的多肽和至少一种可药用载体、稀释剂或赋形剂和/或助剂。
20.用于预防和/或治疗可以通过增强细胞凋亡来治疗的障碍的方法，该方法包括对有需要的受试者施用药物有效量的至少一种任何以上权利要求的多肽。
21.权利要求20的方法，其中所述障碍是对激动DR5活性有反应的增生性疾病。
22.权利要求21的方法，其中所述增生性疾病选自：
a）一种或多种实体癌症，选自原发性和转移性癌症，如肾细胞癌和肺癌（例如小细胞肺癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”），胰腺、造血系统恶性肿瘤，神经胶质瘤，星形细胞瘤，间皮瘤，结肠直肠癌，前列腺癌，骨肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤（包括但不限于伯基特淋巴瘤），乳腺癌，子宫内膜癌，肝癌，胃癌，皮肤癌，卵巢癌和任何来源的鳞状细胞癌（包括但不限于肺、头和颈、乳腺、甲状腺、子宫颈、皮肤和/或食管的鳞状细胞癌）；
b）一种或多种液体癌症，选自白血病，包括尤其T细胞白血病，如急性T细胞白血病（T-ALL）、急性B细胞白血病（B-ALL）、慢性骨髓性白血病（CML）、急性骨髓性白血病（AML）、浆细胞性骨髓瘤和多发性骨髓瘤（MM）；和
c）一种或多种非癌适应症，该适应症包括一种或多种炎性和自身免疫性疾病，如系统性红斑性狼疮、桥本病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主疾病、干燥综合症、恶性贫血、艾迪生病、硬皮病、肺出血肾炎综合症、克罗恩病、自身免疫性溶血性贫血、不育、重症肌无力、多发性硬化、突眼性甲状腺肿、血栓形成性血小板减少症、血小板减少性紫癜、胰岛素依赖性糖尿病、变态反应、哮喘、特应性疾病、动脉硬化、心肌炎、心肌病、肾小球肾炎和再生不良性贫血。
23.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是胰腺癌。
24.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是T-ALL。
25.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是间皮瘤。
26.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是任何组织来源的鳞状细胞癌。
27.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是AML。
28.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是黑素瘤。
29.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是骨髓瘤。
30.前述权利要求中任何一项或多项的分离的多肽，其中按照Kabat和/或Chothia规则，计算CDR。
31.前述权利要求中任何一项或多项的NB构建体，其结合表29A中提供的DR5表位或结合表30A中提供的DR5表位。
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