MX2012009328A

MX2012009328A - Polipeptidos agonistas que se enlazan a dr5.

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Publication number: MX2012009328A
Application number: MX2012009328A
Authority: MX
Inventors: Seth Ettenberg; David Raymond Stover; Karen Cromie; Bruno Dombrecht; Joost Kolkman; Jing Li; Jingxing Zhang; Kris Meerschaert
Original assignee: Ablynx Nv
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2011-02-10
Publication date: 2012-11-30
Also published as: MY156337A; CL2012002217A1; GEP20146176B; AU2011214355B2; SG183210A1; UY33222A; US20110318366A1; GT201200236A; US20150259426A1; TWI480051B; CU24133B1; JP2013519364A; CA2789251A1; KR20130031241A; TW201130513A; PE20121703A1; CN102884083A; WO2011098520A1; NI201200134A; TN2012000393A1

Abstract

La presente invención se refiere a las secuencias de aminoácidos que se dirigen contra el receptor de superficie celular 2 de TRAIL (en la presente también "DR5"), así como a los compuestos o construcciones de las mismas, y en particular a las proteínas y los polipéptidos y los nucleótidos que las codifican (referidos en la presente en su totalidad como "agentes NB"), y a los fragmentos de las mismas, y a las variantes farmacéuticamente efectivas de las mismas, y a su uso en el diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades y los trastornos asociados con el DR5.

Description

POLIPÉPTIDOS AGONISTAS QUE SE ENLAZAN A DR5 ANTECEDENTES El ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL) induce apoptosis en una variedad de líneas celulares tumorigénicas y transformadas con poco o ningún efecto sobre las células normales, se han identificado cuando menos cinco receptores para TRAIL, de los cuales dos, es decir, DR4 (Receptor de Muerte 4, TRAIL-R1), y DR5 (Receptor de Muerte 5, TRAIL-R2; KILLER o TRICK 2), son capaces de transducir una señal de apoptosis, mientras que los otros tres (TRAIL-R3, TRAIL-R4 y OPG soluble) sirven como receptores de señuelo para bloquear la apoptosis mediada por TRAIL. Véase, por ejemplo, Ozoren y El-Deiry, Sem. Cáncer Biol 13: 135 (2003); Yagita y colaboradores, Cáncer Sci., 95(10): 777 (2004).

TRAIL o Apo2L es un ligando citotóxico de 281 aminoácidos que se encuentra integrado en la membrana citoplásmica con el término C expuesto en la superficie extracelular (ligando Tipo II) de las células. También se pueden detectar pequeñas cantidades del ligando TRAIL soluble. El TRAIL forma una molécula homo-trimérica que se enlaza a sus receptores respectivos, iniciando una cascada de eventos de señalización.

El enlace del ligando TRAIL a los receptores DR4 o DR5 inicia la senda de muerte celular extrínseca, dando como resultado la formación de complejos de señalización inductores de muerte (DISC), que contienen el adaptador FADD (DD activador de Fas), y la pro-caspasa 8 o la pro-caspasa 10. Las interacciones en el DISC y la activación de la cascada corriente abajo son similares a FAS, que da como resultado la activación de las sendas de cinasa N-terminal NF B y Jun (JNK). Véase, por ejemplo, Mongkolsapaya y colaboradores, at. Struct. Biol., 6(11): 1048 (1999); Cha y colaboradores, J. Biol. Chem., 275(40): 31171 (2000). El enlace de TRAIL a DR4 o DR5 también da como resultado una disociación de BID (por la caspasa 8 ó 10), la activación de mitocondrias, y por consiguiente, la activación de la senda de apoptosis intrínseca.

La capacidad del ligando TRAIL para inducir preferencialmente la apoptosis de las células tumorales, con poco o ningún efecto sobre las células normales, lo convierte en un candidato potencialmente bueno para la terapia de cáncer. Sin embargo, se ha demostrado que el TRAIL soluble induce la apoptosis de los hepatocitos humanos normales in vitro, realzando potencialmente las preocupaciones por la toxicidad. Véase, por ejemplo, Jo y colaboradores, Nat Med. 6(5): 564 (2000). Un objetivo más conveniente para la terapia de cáncer es el DR5. Debido a que el DR5 requiere de múltiples receptores para inducir la apoptosis de los hepatocitos normales, se predice que el desarrollo de agonistas contra el DR5 específico responsable de la inducción de apoptosis, eliminará esta toxicidad contra las células normales, mientras que conservará la capacidad para aniquilar las células tumorales.

Se han usado agonistas de péptidos y anticuerpos de DR5 para inducir la apoptosis en las células que expresan DR5. Véase, por ejemplo, Li y colaboradores, J. Mol. Biol . , 361, 522-536 (2006); Kajiwara y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 1699: 131-137 (2004); Yang y colaboradores, Cáncer Cell, 5, 501-512 (2004). Los agonistas de DR5 tienen el potencial para utilizarse en la terapia de cáncer contra un gran número de cánceres. Por ejemplo, el Lexatumumab, un anticuerpo monoclonal contra DR5, induce la expresión de DR5 y promueve la apoptosis en un modelo de carcinoma de células renales de ratón. Zhang y colaboradores, Cáncer Lett. 251(1): 146-57 (2007). Otros anticuerpos monoclonales agonistas contra DR5, o el fragmento Fv de una sola cadena contra DR5, y la actividad tumoricida de los mismos, se describen de una manera similar, por ejemplo, en Takeda y colaboradores, Journal Exp. Medicine, 199, 437-448 (2004); Guo y colaboradores, J. Biol. Chem., 280, 41940-41952 (2005); Motoki y colaboradores, Clin. Cáncer Res 11(8): 3126-35 (2005); e Ichikawa y colaboradores, Nature Medicine, 7, 954-960 (2001), Chuntharapai y colaboradores, J. Immunol. 166(8): 4891-8 (2001), Shi y colaboradores, Cáncer Res., 66(24): 11946-11953 (2006).

Se están desarrollando diferentes anticuerpos específicos de DR5 para utilizarse en la clínica, pero ninguno ha sido aprobado todavía.. Se cree que para que se active el DR5, se requieren múltiples anticuerpos reticulantes, y siguen quedando las cuestiones de suficiente suministro de estos anticuerpos en el sitio de acción para lograr efectos terapéuticos reproducibles. Por consiguiente, existe una necesidad de mejores agonistas específicos de DR5 para el tratamiento de las enfermedades asociadas.

BREVE DESCRI PCIÓN DE LA I NVENCIÓN La presente invención se refiere a uno o más "agentes NB" que comprenden secuencias de aminoácidos que se dirigen contra el Receptor de Muerte 5 (referido en la presente como "D R5") as se dispone en la presente , así como a los compuestos o construcciones específicas , y en particular proteínas y polipéptidos , que comprenden o que consisten esencialmente en una o más de estas secuencias de aminoácidos (también referidos como "compuestos" y "polipéptidos" , respectivamente) , y fragmentos de los mismos, más los ácidos nucleicos que codifican estas construcciones. En la presente se proporcionan variantes monoméricas y multiméricas de las construcciones específicas de DR5 de la i nvención . Se proporcionan variantes humanizadas y humano-diseñadas (humaneered) de los agentes N B . En una modalidad , los agentes NB farmacéuticamente relevantes de la invención actúan como los agonistas de los receptores D R5 de TRAI L.

La i nvención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican tales secuencias de aminoácidos y pol ipéptidos; a métodos para la preparación de tales secuencias de aminoácidos y polipéptidos ; a células huésped que expresan o que son capaces de expresar tales secuencias de aminoácidos o polipéptidos ; a composiciones, y en particular a composiciones farmacéuticas , que comprenden tales secuencias de aminoácidos , pol ipéptidos , ácidos nucleicos y/o células huésped; y al uso de tales secuencias de aminoácidos o polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped y/o composiciones, en particular para propósitos profilácticos, terapéuticos, o de diagnóstico, tales como los propósitos mencionados en la presente.

Los agonistas de los receptores DR5 de TRAIL descritos en la presente como agentes NB tienen el potencial para utilizarse en terapia contra un gran número de enfermedades asociadas con DR5. Estos agentes NB de la invención, por consiguiente, tienen utilidad en el tratamiento de las enfermedades proliferativas, incluyendo, por ejemplo, cánceres, tales como tumores sólidos, cánceres primarios metastásicos, tales como carcinoma de células renales, y cánceres del pulmón (por ejemplo, cáncer pulmonar microcelular "SCLC" y cáncer pulmonar no microcelular "NSCLC"), páncreas, malignidad hematopoiética, glioma, astrocitoma, mesotelioma, cánceres colo-rectales, cáncer de próstata, osteosarcoma, melanoma, linfoma (incluyendo, pero no limitándose a, linfoma de Burkitt), cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer de piel, cáncer de ovario, y cánceres de células escamosas de cualquier origen (por ejemplo, pulmón, cabeza y cuello, mama, tiroides, cérvix, piel, esofágico, etc.). así como cánceres líquidos, por ejemplo, tales como leucemias (véase, por ejemplo, Uno y colaboradores, Nature Medicine, 12(6): 693-698 (2006)) incluyendo en especial una leucemia de células-T, tal como leucemia de células-T aguda (T-ALL), leucemia de células-B aguda (B-ALL), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mielógena aguda (AML), mieloma de células de plasma, y mieloma múltiple (MM). Estos agentes NB de la invención también tienen utilidad en el tratamiento de indicaciones que no son de cáncer, incluyendo enfermedad inflamatoria y autoinmune, tal como lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Hashimoto, artritis reumatoide, enfermedad del injerto contra el huésped, síndrome de Sjogren, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, esclerodermia, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Crohn, anemia hemolítica autoinmune; esterilidad, miastenia grave, esclerosis múltiple, enfermedad de Basedow; trombocitopenia trombótica, trombocitopenia purpúrea, diabetes mellitus dependiente de insulina, alergia; asma; enfermedad atópica; arterieesclerosis; miocarditis; cardiomiopatía; nefritis glomerular; y anemia hipoplásica.

Las secuencias de aminoácidos y polipéptidos descritos en la presente se pueden dirigir contra, o pueden ser específicos para, cualquier DR5. De acuerdo con un aspecto no limitante, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos descritos en la presente se dirigen contra el DR5. En una modalidad, los agentes NB específicamente se enlazan a un dominio extracelular del DR5.

Los polipéptidos y las composiciones de la presente invención se pueden utilizar en términos generales para modular el DR5. En una modalidad, un agente NB desencadenará, activará y/o incrementará o mejorará la señalización que es mediada por el DR5. En una modalidad, el agonismo del DR5 mediante un agente NB modulará, y en particular desencadenará o incrementará, los mecanismos, las respuestas, y los efectos biológicos asociados con el DR5 , su señalización y/o las sendas en donde Está involucrado el DR5.

En una modalidad , los compuestos, polipéptidos y las composiciones descritas en la presente inducen , desencadenan , incrementan , o mejoran apoptosis en ciertas células o tejidos . En una modalidad, los compuestos, pol i péptidos y las composiciones descritas en la presente, son capaces de enlazarse al DR5 sobre una superficie celular, y en particular de enlazarse al D R5 de tal manera que se induzca, se desencadene , se incremente , o se mejore la señalización mediada por el DR5. En una modalidad , los polipéptidos y las composiciones descritas en la presente pueden ser tales que sean capaces de enlazarse a un DR5 , de tal manera que se desencadene o se induzca la apoptosis en la célula en la que esté presente el DR5.

En una modalidad , los compuestos NB , los polipéptidos (monovalentes o multivalentes) , y las composiciones descritas en la presente , se pueden enlazar al sitio de enlace de TRAI L sobre el DR5. En una modalidad , los agentes NB compiten con TRAI L para enlazarse al DR5. En una modalidad , el enlace de estos compuestos y polipéptidos al D R5 induce , desencadena, i ncrementa, o mejora la señalización mediada por el D R5, y en particular desencadena o induce la apoptosis en la célula en la que esté presente el D R5.

Otros aspectos, modalidades, ventajas y aplicaciones de la invención llegarán a quedar más claros a partir de la descripción adicional en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una representación gráfica de un experimento ELISA que muestra el enlace de los agentes NB anti-DR5 multivalentes contra los miembros de la familia de los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF).

La Figura 2 es una representación gráfica de un tejido tumoral PD (activación de Caspasa3/7) de los agentes NB anti-DR5 tetravalentes.

La Figura 3 es una representación gráfica de la eficacia in vivo de los agentes NB anti-DR5 tetravalentes y pentavalentes in un modelo de tumores Colo205.

Las Figuras 4A y 4B son representaciones gráficas del tetrámero 11 H6 que exhibe actividad anti-tumoral en un modelo de tumor pancreático MiaPaCa cultivado en huéspedes NSG (es decir, huéspedes deficientes en macrófagos/NK) ya sea sin (Figura 4A) o con (Figura 4B) el inhibidor de CSF-1R.

La Figura 5 muestra la capacidad del tetrámero 11H6 para dar regresión al tumor pancreático derivado del paciente TPAN1-IFA que es insensible a LCR211, un anticuerpo de murino especifico para el DR5.

Las Figuras 6A, 6B y 6C son representaciones gráficas que muestran que un aumento en el número de subunidades en una construcción NB corresponde a una mejor eficacia y potencia para los trímeros, tetrámeros y pentámeros de 11H6 (Figura 6A), en las células Colo205; para los tetrámeros y pentámeros 4E6 y 11 H6 (Figura 6B) en las células Colo205; y para los tetrámeros y pentámeros 4E6 y 11H6 (Figura 6C) en las células H226.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los agentes NB descritos en la presente, es decir, los compuestos, polipéptidos (monovalentes o multivalentes), y composiciones, se enlazan al Receptor de Muerte 5 ("DR5"). En una modalidad, el enlace de los compuestos y polipéptidos que se dan a conocer al DR5, induce, desencadena, incrementa, o mejora la señalización mediada por el DR5, y en particular desencadena o induce la apoptosis en la célula en la que esté presente el DR5.

Como se utiliza en la presente un "agente NB" de la invención se define como un polipéptido que contiene cuando menos una secuencia de CDR3 que se enlaza específicamente a un polipéptido de DR5 y cuyo enlace produce un efecto agonista sobre la actividad del DR5, o de un nucleótido que codifique ese polipéptido. En una modalidad, los agentes NB de la invención son un polipéptido que tiene la estructura general de un dominio VH. En una modalidad, los agentes NB de la invención son un polipéptido que tiene la estructura general de un dominio VHH. En una modalidad, los agentes NB de la invención son un polipéptido que tiene la estructura general de un dominio VL. En una modalidad, los agentes NB de la invención contienen cuando menos una secuencia de CDR1 y cuando menos una secuencia de CDR2 en adición a la secuencia de CDR3. En una modalidad, los agentes NB de la invención comprenden cuando menos un polipéptido monovalente que tiene la construcción FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 como se define más adelante para la fórmula 1. En una modalidad, los agentes NB de la invención son composiciones monoméricas. En una modalidad, los agentes NB son composiciones multiméricas. En una modalidad, los agentes NB de la invención son composiciones monovalentes. En una modalidad, los agentes NB son composiciones multivalentes. En una modalidad, las regiones de estructura contienen residuos que se optimizan en la secuencia para utilizarse en seres humanos. Otros aspectos de los agentes NB de la invención se describen más adelante.

Mientras que el término "agente NB" se utiliza como un término general que pretende abarcar el alcance completo de las composiciones de la invención, los términos "secuencia de NB" o de una manera alternativa "construcción de NB" se utilizan en la presente para referirse a las variantes de polipéptidos específicas que se dan a conocer en la presente como las SEQ ID NOs: 1-72, 87-88 y 103-104, y los nucleótidos que las codifican, incluyendo los que se dan a conocer específicamente en la presente como las SEQ ID NOs: 96-99 y la secuencias que codifican las mismas secuencias de polipéptidos que las SEQ ID NOs: 96-99 pero que difieren por el código degenerado.

Agentes NB de la Invención En una modalidad, el agente NB se selecciona a partir del grupo de 11D1, 11H6, 10F1, 7A12, y 4E6, o una variante de los mismos. En una modalidad, el agente NB es una variante cuya secuencia se optimiza para utilizarse en seres humanos, por ejemplo, se humaniza. En una modalidad, los agentes NB humanizados incluyen, sin limitación, el grupo de 4E6hu y 11H6hu. En una modalidad, el agente NB es una variante monomérica del grupo enlistado, o una variante de la misma. En una modalidad, el agente NB es una variante multimérica del grupo enlistado, o una variante de la misma. En una modalidad, la variante multimérica del grupo enlistado es monoespecífica, o una variante de la misma. En una modalidad, la variante multimérica del grupo enlistado es multiespecífica, o una variante de la misma. En una modalidad, los múltiples epítopos reconocidos por un agente NB multiespecífico son diversos epítopos del objetivo del DR5, o una variante de los mismos. En una modalidad, los múltiples epítopos reconocidos por un agente NB multiespecífico es cuando menos un epítopo del objetivo del DR5 y cuando menos un epítopo sobre un objetivo diferente del polipéptido de DR5, o una variante de los mismos.

En una modalidad, el agente NB se selecciona a partir de una o más de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104, o de las SEQ ID NOs: 96-99, o una variante de las mismas. Las modalidades específicas de los agentes NB 11D1, 11H6, 10F1, 7A12, y 4E6, o las variantes de los mismos, son como se proporcionan más adelante y en las Tablas 1 a 4.

Los agentes NB de ejemplo de la invención incluyen las siguientes construcciones de polipéptidos de NB y las variantes de las mismas.

Familia 4E6 En una modalidad, el agente NB es 4E6, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 4E6 es el monómero de la SEQ ID NO: 1, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 4E6 es el monómero de la SEQ ID NO: 26, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 4E6 es un multímero que comprende dos o más monómeros de la SEQ ID NO: 1 que se enlazan operativamente, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción del 4E6 es un multímero que comprende dos o más monómeros de la SEQ ID NO: 26 que se enlazan operativamente, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción del 4E6 es un multímero que comprende dos o más monómeros de tanto la SEQ ID NO: 1 como la SEQ ID NO: 26 que se enlazan operativamente, o una variante de los mismos, en donde los monómeros pueden estar en cualquier orden.

En una modalidad, la construcción multimérica del 4E6 es un trímero, un tetrámero, o un pentámero de la SEQ ID NO: 1, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción multimérica del 4E6 es un trímero, un tetrámero, o un pentámero de la SEQ ID NO: 26, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción multimérica del 4E6 es un trímero, un tetrámero, o un pentámero de una combinación de tanto la SEQ ID NO: 1 como la SEQ ID NO: 26, o una variante de los mismos, en donde los monómeros pueden estar en cualquier orden. En una modalidad, la construcción del 4E6 es el multímero como se proporciona en cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 6-8 y 27-29, o una variante de las mismas. También se contemplan multímeros de orden más alto, tales como los multímeros comprendidos de 6 a 10 subunidades.

En una modalidad, la construcción del 4E6 comprende la SEQ ID NO: 64, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 4E6 comprende la SEQ ID NO: 65, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 4E6 comprende una secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 42, una secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 52 y una secuencia de CDR3 de cualquiera o más de la SEQ ID NO: 64 y/o la SEQ ID NO: 65, o una variante de las mismas. En una modalidad, la construcción del 4E6 es una secuencia humanizada o humano-diseñada (humaneered), o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 4E6 es como se proporciona en la SEQ ID NO: 28, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 4E6 es como se proporciona en la SEQ ID NO: 29, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 4E6 comprende las SEQ ID NOs: 35, 42, 46, 52, 57, 64 y 70, respectivamente, o una variante de las mismas. En una modalidad, la construcción del 4E6 comprende las SEQ ID NOs: 36, 42, 47, 52, 58, 65 y 71, respectivamente, o una variante de las mismas.

En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica el polipéptido de 4E6 de la SEQ ID NO: 1 o las variantes, multímeros o fragmentos del mismo. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica el polipéptido de 4E6Hu de la SEQ ID NO: 26 o las variantes, multímeros o fragmentos del mismo. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica una o más de las regiones CDR del polipéptido de 4E6Hu, es decir, SEQ ID NOs: 42, 52 y 64, o las variantes de las mismas. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica una o más de las regiones CDR del polipéptido de 4E6, es decir, SEQ ID NOs: 42, 52 y 65, o las variantes de las mismas. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica la región CDR3 de la SEQ ID NO: 64 o las variantes de la misma. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica la región CDR3 de la SEQ ID NO: 65 o las variantes de la misma.

Familia 7A12 En una modalidad, el agente NB es 7A12, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 7A12 es el monómero de la SEQ ID NO: 2, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 7A12 es un multímero que comprende dos o más monómeros de la SEQ ID NO: 2 que se enlazan operativamente, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción multimérica del 7A12 es un trímero, un tetrámero, o un pentámero de la SEQ ID NO: 2, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción del 7A12 es el multímero como se proporciona en cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 9-11, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 7A12 comprende la SEQ ID NO: 63. En una modalidad, la construcción del 7A12 comprende una secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 41, una secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 51 y una secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 63, o una variante de las mismas. En una modalidad, la construcción del 7A12 es una secuencia humanizada o humano-diseñada (humaneered), o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 7A12 es como se proporciona en la SEQ ID NO: 10, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 7A12 es como se proporciona en la SEQ ID NO: 11, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 7A12 comprende las SEQ ID NOs: 34, 41, 45, 51, 56, 63 y 69, respectivamente, o una variante de las mismas. También se contemplan multímeros de orden más alto, tales como los multímeros comprendidos de 6 a 10 subunidades.

En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica el polipéptido del 7A12 de la SEQ ID NO: 2 o las variantes, multímeros o fragmentos del mismo. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica una o más de las regiones CDR de las SEQ ID NOs: 41, 51 y 63, o las variantes del mismo. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica la región CDR3 de la SEQ ID NO: 63 o las variantes del mismo.

Familia 10F1 En una modalidad, el agente NB es 10F1, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 10F1 es el monómero de la SEQ ID NO: 3, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 10F1 es un multímero que comprende dos o más monómeros de la SEQ ID NO: 3 que se enlazan operativamente, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción multimérica del 10F1 es un trímero, un tetrámero, o un pentámero de la SEQ ID NO: 3, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción del 10F1 es el multímero como se proporciona en cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 12-16, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 10F1 comprende la SEQ ID NO: 68, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 10F1 comprende una secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 44, una secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 55 y una secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 68, o una variante de las mismas. En una modalidad, la construcción del 10F1 es una secuencia humanizada o humano-diseñada (humaneered), o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 10F1 comprende la SEQ ID NO: 15, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 10F1 comprende la SEQ ID NO: 16, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 10F1 comprende las SEQ ID NOs: 40, 44, 50, 55, 62, 68 y 72, respectivamente, o una variante de las mismas. También se contemplan multímeros de orden más alto, tales como los multímeros comprendidos de 6 a 10 subunidades.

En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica el polipéptido del 10F1 de la SEQ ID NO: 3 o las variantes, multímeros o fragmentos del mismo. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica una o más de las regiones CDR de la SEQ ID NO: 44, 55 y 68, o las variantes de las mismas. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica la región CDR3 de la SEQ ID NO: 68 o las variantes de la misma.

Familia 11 D1 En una modalidad, el agente NB es 11D1, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 11 DI es el monómero de la SEQ ID NO: 4, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 11D1 es un multímero que comprende dos o más monómeros de la SEQ ID NO: 4 que se enlazan operativamente, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción multimérica del 1 D1 es un trímero, un tetrámero, o un pentámero de la SEQ ID NO: 4, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción del 11D1 es el multímero como se proporciona en cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 17-19, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 11D1 comprende la SEQ ID NO: 67, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 11D1 comprende una secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 43, una secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 54 y una secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 67, o una variante de las mismas. En una modalidad, la construcción del 11D1 es una secuencia humanizada o humano-diseñada (humaneered), o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 11D1 comprende la SEQ ID NO: 18, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 11D1 comprende la SEQ ID NO: 19, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 11D1 comprende las SEQ ID NOs: 39, 43, 49, 54, 61, 67 y 71, respectivamente, o una variante de las mismas. También se contemplan multímeros de orden más alto, tales como los multímeros comprendidos de 6 a 10 subunidades.

En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica el polipéptido del 11D1 de la SEQ ID NO: 4 o las variantes, multímeros o fragmentos del mismo. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica una o más de las regiones CDR de la SEQ ID NO: 43, 54 y 67, o las variantes de las mismas. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica la región CDR3 de la SEQ ID NO: 67 o las variantes del mismo.

Familia 11H6 En una modalidad, el agente NB es 11H6, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 11H6 es el monómero de la SEQ ID NO: 5, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 11 H6 es el monómero de la SEQ ID NO: 30, o una variante del mismo. En una modalidad, la construcción del 11H6 es un multímero que comprende dos o más monómeros de la SEQ ID NO: 5 que se enlazan operativamente, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción del 11 H6 es un multímero que comprende dos o más monómeros de la SEQ ID NO: 30 que se enlazan operativamente, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción del 11H6 es un multímero que comprende dos o más monómeros de tanto la SEQ ID NO: 5 como la SEQ ID NO: 30 que se enlazan operativamente, o una variante de los mismos (por ejemplo, la SEQ ID NO: 88), en donde los monómeros pueden estar en cualquier orden. También se contemplan multímeros de orden más alto, tales como los multímeros comprendidos de 6 a 10 subunidades.

En una modalidad, la construcción multimérica del 11H6 es un trímero, un tetrámero, o un pentámero de la SEQ ID NO: 5, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción multimérica del 11H6 es un trímero, un tetrámero, o un pentámero de la SEQ ID NO: 30, o una variante de los mismos. En una modalidad, la construcción multimérica del 11H6 es un trímero, un tetrámero, o un pentámero de una combinación de tanto la SEQ ID NO: 5 como la SEQ ID NO: 30, o una variante de los mismos, en donde los monómeros pueden estar en cualquier orden. En una modalidad, la construcción del 11H6 es el multímero como se proporciona en cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 20-22 y 31-33, o una variante del mismo.

En una modalidad, la construcción del 11H6 comprende la SEQ ID NO: 66 u 83, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 11H6 comprende una secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 43, una secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 53 y una secuencia de CDR3 de cualquiera o más de la SEQ ID NO: 66, o una variante de las mismas. En una modalidad, la construcción del 11H6 es una secuencia humanizada o humano-diseñada (humaneered), o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 11H6 es como se proporciona en la SEQ ID NO: 31, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 11H6 es como se proporciona en la SEQ ID NO: 32, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 11H6 es como se proporciona en la SEQ ID NO: 33, o una variante de la misma. En una modalidad, la construcción del 11H6 comprende las SEQ ID NOs: 37, 43, 48, 53, 59, 66 y 70, respectivamente, o una variante de las mismas. En una modalidad, la construcción del 11H6 comprende las SEQ ID NOs: 38, 43, 48, 53, 60, 66 y 71, respectivamente, o una variante de las mismas.

En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica el polipéptido de 11 H6 de la SEQ ID NO: 5 ó variantes, multímeros o fragmentos del mismo. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica el polipéptido de 11H6Hu de la SEQ ID NO: 30 ó variantes, multímeros o fragmentos del mismo. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica una o más de las regiones CDR de las SEQ ID NOs: 43, 53 y 66, o las variantes de las mismas. En una modalidad, la construcción de NB es un ácido nucleico que codifica la región CDR3 de la SEQ ID NO: 66 o las variantes del mismo.

Otras variantes contempladas de los agentes NB En una modalidad, un agente NB de la invención es una construcción multimérica que comprende cuando menos dos subunidades diferentes seleccionadas a partir del grupo de 11D1, 11H6, 10F1, 7A12, y 4E6, o una variante de las mismas. En una modalidad, el orden particular de las construcciones multiméricas comprende subunidades alternadas. Se proporciona una construcción de ejemplo en la SEQ ID NO: 84. Se contemplan otras configuraciones de las subunidades dentro de una construcción de NB multimérica. Una persona experta será capaz de determinar y seleccionar en general las sustituciones, supresiones o inserciones adecuadas, o las combinaciones adecuadas de las mismas, basándose en la divulgación de la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, que puede involucrar, por ejemplo, introducir un número limitado de posibles sustituciones y determinar su influencia sobre las propiedades de las construcciones de NB obtenidas de esta manera.

En adición a las construcciones de polipéptidos de NB de ejemplo dadas a conocer y proporcionadas en la presente, la invención abarca nucleótidos que codifican cualquier agente de NB abarcado dentro de la divulgación de la presente invención, incluyendo, sin limitación: secuencias de ADN y de ARN o las variantes de las mismas, en aislamiento o en vectores recombinantes o similares, y/o como regiones codificantes o fragmentos, incluyendo en especial fragmentos que codifiquen la región CDR3 de las construcciones de NB dadas a conocer. En una modalidad, el agente NB es un ácido nucleico que codifica la construcción de NB de cualquiera de las secuencias proporcionadas en las Tablas 1 a 4. En una modalidad, el agente NB es un ácido nucleico que codifica la construcción del 4E6 de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-5, 2, 3, 4, 5, 26, 30 y 87. En una modalidad, el agente NB es un ácido nucleico que codifica cualquiera de las SEQ ID NOs: 41-44, 51-55 y 63-68. En una modalidad, el agente NB es un ácido nucleico que codifica cualquiera de las SEQ ID NOs: 41-44, 51-55 y 63-68.

Las secuencias de ejemplo de la invención se proporcionan en seguida en las Tablas 1 a 4. El término de encabezado "ID" se refiere a la SEQ ID NO dada. Las combinaciones preferidas de secuencias de FR y de CDR para cada construcción de NB se utilizan indistintamente a través de toda la solicitud.

Tabla 1: Secuencias de polipéptidos de los componentes de enlace de DR5 monovalentes/monoméricos a partir del rastreo inicial, con las SEQ ID NOs.

Tabla 4: Secuencias para CDRs y regiones de estructura, más combinaciones preferidas como se proporcionan para la fórmula I, es decir, FR1 -CDR1 - FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 Tabla 4 (cont.) Tabla 4 (cont.) Los aspectos adicionales de los agentes NB de la invención se proporcionan en seguida.

Los compuestos , los polipéptidos (monovalentes o multivalentes) , y las composiciones descritas en la presente, pueden ser tales que se enlacen al D R5 pero que no se enlacen al sitio de TRA I L sobre el D R5 , y/o pueden ser tales que no compitan con TRAI L para enlazarse al DR5. Estos compuestos y polipéptidos pueden ser tales que su enlace al DR5 induzca, desencadene , incremente , o mejore la señalización mediada por el DR5, y en particular desencadene o induzca la apoptosis en la cél ula en la que esté presente el DR5. Estos compuestos y polipéptidos también pueden ser tales q ue aumenten o mejoren la señalización q ue es mediada por TRAI L y el DR5 después de enlazar el TRAI L a su receptor. De acuerdo con este aspecto, el enlace tanto de TRAI L así como de los compuestos/polipéptidos descritos en la presente al mismo receptor puede conducir a un efecto sinérgico sobre la señalización.

En un aspecto específico , los compuestos y polipéptidos descritos en la presente , son son compuestos y polipéptidos multi mé ricos (como se describen en la presente) di rigidos contra el DR5. En particular, los compuestos y polipéptidos descritos en la presente , pueden ser polipéptidos multiméricos que son capaces de multi merizar el D R5 sobre una membrana cel ular y, como tales, son capaces de inducir, desencadenar, incrementar o mejorar la señalización mediada por el D R5 , y más particularmente, de desencadenar o inducir la apoptosis en la célula en la que esté presente el DR5. En una modalidad, los compuestos o polipéptidos monoméricos o multiméricos que se dan a conocer en la presente se pueden enlazar al DR5 en o cerca del sitio de enlace de TRAIL sobre el DR5, y/o pueden competir con TRAIL para enlazarse al DR5. En una modalidad, no se enlazan al sitio de enlace para TRAIL sobre el DR5, esencialmente no obstaculizan ni impiden el enlace de TRAIL al DR5, y/o no compiten con TRAIL para enlazarse al DR5, e inclusive pueden ser tales que aumenten o mejoren la señalización que es mediada por TRAIL y el DR5 después de enlazar el TRAIL a su receptor (lo cual puede dar nuevamente como resultado un efecto sinérgico después de la señalización mediada por el DR5). En una modalidad, la secuencia de aminoácidos contiene una porción derivada a partir del ligando TRAIL que se presenta naturalmente, es decir, comprende un segmento formado de un polipéptido de ligando TRAIL natural o cualquier fragmento de enlace del receptor de TRAIL de este ligando TRAIL.

Los polipéptidos y las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para la prevención y el tratamiento de las enfermedades y los trastornos asociados con DR5. De una manera específica, "las enfermedades y los trastornos asociados con DR5" se definen como aquéllos que se pueden prevenir y/o tratar, respectivamente, mediante la administración adecuada a un sujeto que lo necesite (es decir, que tenga la enfermedad o el trastorno o cuando menos un síntoma de los mismos, y/o que esté en riesgo de atraer o desarrollar la enfermedad o el trastorno) ya sea de un polipéptido o de una composición de la i nvención (y en particular, de una cantidad farmacéuticamente activa del mismo) y/o de un principio activo conocido con actividad contra el DR5 o una senda o mecanismo biológico en donde esté invol ucrado el D R5 (y en particular, de una cantidad farmacéuticamente activa del mismo) , lo cual da como resultado la modulación , es deci r, el agonismo o antagonismo, de la señalización mediada por el DR5. Como se enlistan más adelante, las enfermedades y los trastornos que se pueden tratar mediante la i nducción de apoptosis en la célula o tejido di rigido en la enfermedad se incluyen particularmente en la presente como asociados con D R5.

Las enfermedades y los trastornos asociados con D R5 pueden ser en particular las enfermedades y los trastornos que se puedan tratar mediante el desencadenamiento, el inicio, el incremento, o la mejora de la señalización , de los mecanismos, de las respuestas, y de los efectos en donde esté i nvolucrado el DR5 (en otras palabras, efectuando u n efecto agonista sobre el DR5 o sobre la señalización mediada por el D R5). Más particularmente , las enfermedades y los trastornos asociados con D R5 pueden ser las enfermedades y los trastornos que se puedan tratar mediante el desencadenamiento, el inicio, el i ncremento, o la mejora de la apoptosis celular en una o más cél ulas o tejidos en el sujeto que se vaya a tratar.

En una modalidad, los agentes N B de la invención son los agonistas de los receptores D R5 de TRAI L, que tienen el potencial para utilizarse en terapia contra un gran número de enfermedades asociadas con DR5. Los ejemplos de las enfermedades y los trastornos asociados con DR5 estarán claros para la persona experta basándose en la divulgación de la presente. En una modalidad, los agentes NB de la invención tienen utilidad en el tratamiento de las enfermedades proliferativas, incluyendo, por ejemplo, cánceres, tales como tumores sólidos, cánceres primarios y metastásicos, tales como carcinoma de células renales, y cánceres del pulmón (por ejemplo, cáncer pulmonar microcelular "SCLC" y cáncer pulmonar no microcelular "NSCLC"), páncreas, malignidad hematopoiética, glioma, astrocitoma, mesotelioma, cánceres colo-rectales, cáncer de próstata, osteosarcoma, melanoma, linfoma (incluyendo, pero no limitándose a, linfoma de Burkitt), cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer de piel, cáncer de ovario, y cánceres de células escamosas de cualquier origen (por ejemplo, pulmón, cabeza y cuello, mama, tiroides, cérvix, piel, esofágico, etc.), así como cánceres líquidos, por ejemplo, tales como leucemias, incluyendo en especial una leucemia de células-T, tal como leucemia de células-T aguda (T-ALL), leucemia de células-B aguda (B-ALL), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mielógena aguda (AML), mieloma de células de plasma, y mieloma múltiple (MM). En una modalidad, los agentes NB de la invención tienen utilidad en el tratamiento de indicaciones que no sean de cáncer, incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, enfermedades inflamatorias y autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Hashimoto, artritis reumatoide, enfe rmedad del injerto contra el huésped, síndrome de Sjogren , anemia perniciosa, enfermedad de Addison , esclerodermia, s índrome de Goodpasture , enfermedad de Crohn , anemia hemol ítica autoi nmune, esteri l idad , miastenia grave , esclerosis múltiple , enfe rmedad de Basedow, trombocitopenia trombótica, trombocitopenia pu rpúrea, diabetes mell itus dependiente de insuli na, alergia; asma, enfermedad atópica; arterioesclerosis ; miocarditis ; cardiomiopatía; nefritis glomerular; y anemia hipoplásica.

Por consiguiente , sin limitarse a lo mismo, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención se pueden util izar, por ejemplo, para prevenir y/o para tratar todas las enfermedades y los trastornos que actualmente se estén previniendo o tratando con los principios activos que pueden modular la señalización mediada por el D R5 , tales como aquéllos mencionados en la presente , y las referencias citadas en la técnica. En una modalidad , los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para preveni r y/o para tratar todas las enfermedades y los trastornos para cuyo tratamiento se estén desarrollando actualmente, se hayan propuesto, o se propongan o se desarrol len en el futu ro los principios activos. En una modalidad , se prevé que , debido a sus propiedades favorables como se describen adicionalmente en la presente, los polipéptidos de la presente se pueden uti lizar para la prevención y el tratamiento de otras enfermedades y trastornos diferentes de aquéllos para los cuales se estén utilizando o se propongan o se desarrollen estos pri ncipios activos conocidos; y/o que los polipéptidos de la presente invención pueden proporcionar nuevos métodos y regímenes para el tratamiento de las enfermedades y los trastornos descritos en la presente .

Otras aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención llegarán a quedar más claros para la persona experta a parti r de la divulgación adicional en la presente .

En una modal idad, la invención proporciona agentes farmacológicamente activos, así como composiciones que comprenden los mismos (ya sea que formen o no los pol ipéptidos como se describen en la presente , y/o fragmentos y/o variantes multi mé ricas de estos polipéptidos o fragmentos , todos los cuales son referidos ampliamente en la presente como las "composiciones de la invención"), que se pueden utilizar en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y los trastornos asociados con el DR5 y de las enfermedades y los trastornos adicionales mencionados en la presente; y para proporcionar métodos para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de estas enfermedades y trastornos que involucran la administración y/o el uso de estos agentes y composiciones .

En una modal idad , la invención proporciona los agentes farmacológicamente activos, composiciones y/o métodos que tienen ciertas ventajas comparándose con los agentes , composiciones y/o métodos que se utilizan actualmente y/o que se conocen en la materia. Estas ventajas l legarán a quedar más claras a parti r de la siguiente descripción adicional .

En una modalidad , la invención proporciona secuencias de aminoácidos que se dirigen contra el DR5, en particular contra el DR5 a partir de un animal de sangre caliente , más particularmente , contra el D R5 a parti r de un mam ífero, y en especial contra el DR5 humano; y para proporcionar prote ínas y polipéptidos, los cuales comprenden o esencialmente consisten en cuando menos una de estas secuencias de ami noácidos .

En una modalidad, la invención proporciona las secuencias de aminoácidos y las proteínas y/o polipéptidos que son adecuados para su uso profiláctico, terapéutico y/o de diagnóstico en un animal de sangre caliente, y en particular en un mam ífero, y en especial en un ser humano .

En una modalidad, la invención proporciona las secuencias de aminoácidos y las proteínas y/o polipéptidos que se pueden utilizar para la prevención , el tratamiento, el alivio y/o el diagnóstico de u na o más enfermedades , trastornos o condiciones asociadas con el D R5 y/o mediadas por el DR5 (tales como las enfermedades, los trastornos y las condiciones mencionadas en la presente) en un animal de sangre caliente , en particular en un mam ífero , y más particularmente, en un ser hu mano.

En una modalidad , la invención proporciona las composiciones de la invención para util izarse en la preparación de composiciones farmacéuticas o veterinarias para la prevención y/o el tratamiento de una o más enfermedades , trastornos o condiciones asociadas con , y/o mediadas por, el DR5 (tales como las enfermedades, los trastornos y las condiciones mencionadas en la presente) en un animal de sang re caliente , en particular en un mam ífero, y más particularmente, en un ser humano.

En una modalidad , la i nvención proporciona las composiciones de la i nvención que se dirigen contra, y/o que se pueden enlazar específicamente al D R5; as í como los compuestos y las construcciones , y en particular las proteínas y los polipéptidos , que comprenden cuando menos una de estas secuencias de aminoácidos. De una manera más específica, la invención proporciona secuencias de aminoácidos que se pueden enlazar específicamente al receptor de superficie celular DR5, como se definen , por ejemplo, con el número de acceso "BAA33723" para encontrarse , por ejemplo, en la base de datos de proteínas NCBI . En particular, la invención proporciona secuencias de ami noácidos que se pueden enlazar específicamente al receptor de superficie celular D R5 , como se definen , por ejemplo, con el número de acceso "BAA33723" para encontrarse, por ejemplo, en la base de datos de proteínas NCB I y que no se enlazan a cuando menos otro receptor de TRAI L, tal como TRAI L-R3 y TRAI L- R4. También se conoce una variante de empalme de forma corta del DR5 humano (GenBank entrada N P_671 71 6) .

En una modal idad , la invención proporciona secuencias de aminoácidos que se pueden enlazar al DR5 con una afi nidad (de una manera adecuada medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , un índice ka ct¡vado y/o un índice kdeSact¡vado> o de una manera alternativa, como un valor IC50, en el intervalo farmacéuticamente aceptable como se dispone en la presente; así como los compuestos y las construcciones, y en particular las proteínas y los polipéptidos, que comprenden cuando menos una de estas secuencias de aminoácidos.

En una modalidad, las composiciones de la invención son tales que: a) se enlazan al DR5 con una constante de disociación (KD) de 10"5 a 10"12 moles/litro o menos, y de preferencia de 10"7 a 10'12 moles/litro o menos, y de una manera muy preferible de 1 O"8 a 10'12 moles/litro (es decir, con una constante de disociación (KA) de 105 a 1012 litros/moles o más, y de preferencia de 107 a 1012 litros/moles o más, y de una manera muy preferible de 108 a 1012 litros/moles); y/o b) se enlazan al DR5 con un índice kactivado de entre 102 M" V1 y aproximadamente 107 M" s"1, de preferencia de entre 103 M'1s'1 y 107 M"1s"1, más preferiblemente de entre 1 O4 M'V1 y 107 M"1s'\ tal como de entre 105 M"1s"1 y 107 M"1s~1; y/o c) se enlazan al DR5 con un índice kdesactlvad0 de entre 1s'1 (t1 2=0.69 s), y 10"6 s" (proporcionar un complejo casi irreversible con un t1/2 de múltiples días), de preferencia de entre 10"2 s"1 y 10"6 s'\ más preferiblemente de entre 10~3 s"1 y 10"6 s'\ tal como de entre 10"4 s"1 y 10"6 s"\ En una modalidad, una composición de la invención, ya sea monovalente o multivalente, se enlaza al DR5 con una afinidad menor de 100 nM, y/o menor de 10 nM, y/o menor de 1 nM, tal como menor de 500 pM. En una modalidad, la composición de la invención es una composición tetravalente. En una modalidad, la composición de la invención es una composición pentavalente.

En una modalidad, una composición de la invención, ya sea monovalente o multivalente, inducirá específicamente la apoptosis en diferentes tipos de células de cáncer (por ejemplo, cuando menos un tipo) con una IC50 menor de 100 nM, de preferencia menor de 10 nM, más preferiblemente menor de 1 nM, tal como menor de 500 pM. En una modalidad, una secuencia de aminoácidos multivalente de la invención es cuando menos 10 veces más potente en una línea celular tumoral que en una línea celular normal (no tumoral), o cuando menos 100 veces más potente que en una línea celular normal (no tumoral), como se mide, por ejemplo, en las líneas celulares no tumorales mencionadas en la parte experimental, por ejemplo, Huvec, IMR-90 y ARPE-19. Véanse los Ejemplos y la Tabla 13.

Para enlazarse al DR5, una composición de la invención usualmente contendrá dentro de su secuencia de aminoácidos, uno o más residuos de aminoácidos, o uno o más estiramientos de residuos de aminoácidos (es decir, comprendiendo cada "estiramiento" dos o más residuos de aminoácidos que están adyacentes unos a otros o en estrecha proximidad unos a otros, es decir, en la estructura primaria (lineal) o terciaria (conformacional) de la secuencia de aminoácidos) mediante los cuales se puede enlazar la secuencia de aminoácidos de la invención al DR5, cuyos residuos de aminoácidos o esti ramientos de residuos de ami noácidos , por consiguiente , forman el "sitio" para enlazarse al DR5 (también referido en la presente como el "sitio de enlace de antígeno" o "epítopo") . En la presente se proporcionan experimentos de mapeo de ep ítopos , en los Ejemplos.

En una modalidad , las composiciones de la invención proporcionadas en la presente están en una forma esencialmente aislada, o forman parte de una prote ína o pol ipéptido de la i nvención que puede comprender o que consiste esencialmente en una o más secuencias de ami noácidos dadas a conocer en la presente . En una modalidad , las composiciones de la invención pueden comprender además una o más secuencias de aminoácidos adicionales . En una modalidad , estas secuencias adicionales se enlazan por medio de uno o más enlazadores adicionales. Sin limitación , las composiciones de la invención se pueden utilizar como u na unidad de enlace en una prote ína o polipéptido. Las composiciones de la invención pueden contene r una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden servi r como una unidad de enlace adicional (es deci r, contra uno o más objetivos diferentes del DR5) , como para proporcionar un polipéptido monovalente , multivalente, o multiespecífico de la invención , respectivamente. Esta proteína o polipéptido también puede estar en una forma esencial mente aislada.

En una modalidad , las composiciones de la invención consisten esencialmente en una sola cadena de aminoácidos que no se enlaza por medio de puentes de disulfu ro a cualq uier otra secuencia o cadena de aminoácidos (pero que pueden contener o no uno o más puentes de disulfuro intramoleculares) o una composición farmacéuticamente relevante. Como un ejemplo de un puente de disulfuro intramolecular, se sabe que las construcciones VHH de camélido algunas veces pueden contener un puente de disulfuro entre CDR3 y CDR1 o FR2. En una modalidad, las composiciones de la invención pueden estar enlazado unas a otras y/o a otras secuencias de aminoácidos (por ejemplo, por medio de puentes de disulfuro), para proporcionar construcciones peptídicas alternativas (por ejemplo fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, construcciones ScFv, "diacuerpos" y otras construcciones multivalentes y/o multiespecíficas. Véase la reseña por Holliger y Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep; 23(9): 1126-36). Los ejemplos de las composiciones farmacéuticamente relevantes incluyen los fármacos que tratan una enfermedad, o las composiciones que aumentan la vida media, que se dirigen a tejidos específicos, y/o que aniquilan a la célula objetivo.

En una modalidad, las composiciones de la invención consisten esencialmente en una sola cadena de aminoácidos que se enlaza, por medio de cuando menos un puente de disulfuro intermolecular, a cualquier otra secuencia o cadena de aminoácidos (cualquiera de las cuales puede o no contener uno o más puentes de disulfuro intramoleculares), o una composición farmacéuticamente relevante.

En una modalidad, cuando una composición de la invención se pretende para su administración a un sujeto (por ejemplo, para propósitos terapéuticos y/o de diagnóstico, como se describen en la presente), es ya sea una secuencia de aminoácidos que no se presenta naturalmente en ese sujeto; o, cuando sí se presenta naturalmente en ese sujeto, está en una forma esencialmente aislada.

En una modalidad, para uso farmacéutico, las secuencias de aminoácidos que se dan a conocer en la invención (así como los compuestos, las construcciones, y los polipéptidos que las comprenden) se dirigan contra el DR5 humano. En una modalidad, para propósitos veterinarios, las composiciones que se dan a conocer se dirigen contra el DR5 a partir de la especie que se vaya a tratar. En una modalidad, para propósitos veterinarios, las composiciones que se dan a conocer reaccionan cruzadamente con el DR5 a partir de la especie que se vaya a tratar.

En una modalidad, una secuencia de aminoácidos de la invención tiene cuando menos un sitio de enlace para enlazarse contra el DR5, y puede contener uno o más sitios de enlace adicionales para enlazarse contra otros epítopos, antígenos, proteínas u objetivos.

La eficacia de las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención, y de las composiciones que comprenden las mismas, se pueden probar utilizando cualquier ensayo in vitro adecuado, ensayo basado en células, ensayo in vivo y/o modelo animal conocido por sí mismo, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad o el trastorno específico involucrado. Éstos pueden ser, por ejemplo, ensayos o modelos para medir la influencia de las secuencias de aminoácidos o compuestos descritos en la presente sobre la apoptosis, sobre la proliferación de las células tumorales, y/o sobre el crecimiento de tumores en un modelo animal para dicho tumor. Los ensayos y modelos animales adecuados quedarán claros para la persona experta, y, por ejemplo, incluyen los ensayos y modelos animales utilizados en la parte experimental más adelante y en las referencias citadas en la técnica en la presente. Los ejemplos son ensayos de enlace, tales como ELISA, FACS o la metodología de resonancia de plasmón superficial; ensayos funcionales in vitro, tales como ensayo de sobrevivencia celular in vitro con un panel de líneas celulares tumorales y normales, ensayo de eficacia in vitro con detección de sobrevivencia de células Jurkat; ensayos funcionales in vivo, tales como estudio de una sola dosis in vivo combinado con una lectura de activación de caspasa 3/7, proporcionando diferentes datos de eficacia, farmacocinéticos (PK), y farmacodinámicos (PD).

En una modalidad, de acuerdo con la invención, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos que se dirigen contra el DR5 a partir de una primera especie de animal de sangre caliente puede o no mostrar reactividad cruzada con el DR5 a partir de una o más especies diferentes de animal de sangre caliente. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos dirigidos contra el DR5 humano pueden o no mostrar reactividad cruzada con el DR5 a partir de una o más especies diferentes de primates (tales como, sin limitación, monos a partir del género Macaco (tales como, y en particular, monos cinomolgos (Macaca fascicularis, conocido como "ciño") y/o monos Rhesus (Macaca mulatta)), y babuino (Papio ursinus)) y/o con el DR5 a partir de una o más especies de animales que se utilizan con frecuencia en modelos animales para enfermedades (por ejemplo ratón, rata, conejo, cerdo o perro), y en particular, en modelos animales para las enfermedades y los trastornos asociados con el DR5 (tales como las especies y los modelos animales mencionados en la presente). En este aspecto, estará claro para la persona experta que la reactividad cruzada, cuando está presente, puede tener ventajas desde el punto de vista del desarrollo el fármaco, debido a que permite que se prueben las secuencias de aminoácidos y polipéptidos contra el DR5 humano en esos modelos de enfermedad. Diferentes construcciones de la invención proporcionadas en la presente muestran una reactividad cruzada específica con el DR5 de cinomolgo.

En una modalidad, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención que reaccionan cruzadamente con el DR5 a partir de múltiples especies de mamíferos, usualmente serán convenientes para utilizarse en aplicaciones veterinarias, debido a que esto permitirá que se utilice la misma secuencia de aminoácidos o polipéptido a través de múltiples especies. Por consiguiente, en una modalidad, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos dirigidos contra el DR5 a partir de una especie de animal (tales como las secuencias de aminoácidos y polipéptidos contra el DR5 humano) se pueden utilizar en el tratamiento de otra especie de animal, siempre que el uso de las secuencias de aminoácidos y/o polipéptidos proporcionen los efectos deseados en la especie que se vaya a tratar.

La presente invención, en su sentido más amplio, tampoco está particularmente limitada a, ni es definida por, un determinante antigénico específico, epítopo, parte, dominio, subunidad o confirmación (en donde sea aplicable) de DR5 contra el cual se dirijan las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención. Sin embargo, en una modalidad, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención se dirigen contra el dominio extracelular del DR5. En un aspecto no limitante, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención se dirigen contra el dominio de enlace del DR5, y son como se definen adicionalmente en la presente. En una modalidad, una secuencia de aminoácidos monovalente o multivalente y los polipéptidos de la invención compiten con el ligando natural del DR5 en un ensayo de enlace competitivo, como se describe en la parte experimental. En una modalidad, una secuencia de aminoácidos monovalente o multivalente y los polipéptidos de la invención se enlazan sinérgicamente con el ligando natural del DR5 en un ensayo de enlace competitivo.

En una modalidad de la invención, en donde se aplicable, una secuencia de aminoácidos de la invención puede enlazarse a dos o más determinantes antigénicos, epítopos, partes, dominios, subunidades o confirmaciones del DR5. En este caso, los determinantes antigénicos, epítopos, partes, dominios o subunidades del D R5 a los que se enlazan las secuencias de aminoácidos y/o polipéptidos de la i nvención , pueden ser esencialmente los mismos (por ejemplo, si el D R5 contiene motivos estructurales repetidos o se presenta en una forma multimérica) o pueden ser diferentes (y en el último caso, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención se pueden enlazar a los diferentes determinantes antigénicos, ep ítopos, partes, dominios, subunidades del D R5 con una afi nidad y/o especificidad que puede ser igual o diferente) . También , por ejemplo, cuando el DR5 existe en una conformación activada y en una conformación inactiva, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la i nvención se pueden enlazar ya sea a una de estas confirmaciones, o bien se pueden enlazar a ambas confirmaciones (es deci r, con una afinidad y/o especificidad que puede ser igual o diferente) . También , por ejemplo , las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención se pueden enlazar a u na conformación del DR5 en donde se enlazan a un ligando pertinente , se pueden enlazar a una conformación del DR5 en donde no se enlazan a un ligando pertinente , o se pueden enlazar a ambas conformaciones (nuevamente con una afinidad y/o especificidad que puede ser igual o diferente) .

También se espera que las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención se enlazará en general a todos los análogos que se presenten naturalmente o sintéticos , variantes, mutantes , alelos , partes y fragmentos del D R5; o cuando menos a los análogos, variantes , mutantes, alelos , partes y fragmentos del D R5 que contengan uno o más determinantes antigénicos o ep ítopos que sean esencialmente los mismos que los determinantes antigénicos o epítopos a los que se enlacen las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención en el DR5 (por ejemplo, en el DR5 de tipo silvestre) . N uevamente , en este caso, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la i nvención se pueden enlazar a estos análogos, variantes , mutantes , alelos , partes y f ragmentos con una afi nidad y/o especificidad que es la misma que , o que es dife rente de (es decir, más alta que, o más baja que) , la afinidad y especificidad con q ue se enlazan las secuencias de aminoácidos de la i nvención al DR5 (de tipo silvestre) . También se i ncluye dentro del alcance de la invención , que las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención se enlazan a algunos análogos, variantes , mutantes , alelos, partes y fragmentos del D R5 , pero no a otros .

En general , cuando el DR5 existe en una forma monomérica y en uno o más formas multiméricas, está dentro del alcance de la invención que las secuencias de aminoácidos y los pol ipéptidos de la invención solamente se enlazan al D R5 en una forma monomérica, solamente se enlazan al DR5 en una forma multi mérica, o se enlazan tanto a la forma monomérica como a la forma multimérica. Nuevamente, en este caso, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención se pueden enlazar a la forma monomérica con una afi nidad y/o especificidad que es igual q ue , o que es diferente de (es decir, más alta q ue, o más baja que) , la afinidad y especificidad con que se enlazan las secuencias de aminoácidos de la invención a la forma multimérica.

También , cuando el DR5 puede asociarse con otras proteínas o polipéptidos para formar complejos de prote ína (por ejemplo, con múltiples subunidades) , está dentro del alcance de la invención que las secuencias de aminoácidos y los pol ipéptidos de la i nvención se enlazan al DR5 en su estado no asociado, se enlazan al D R5 en su estado asociado , o se enlazan a ambos. En todos estos casos, las secuencias de ami noácidos y los polipéptidos de la invención se pueden enlazar a estos multímeros o complejos de prote ína asociados con una afinidad y/o especificidad que puede ser la misma que, o diferente de (es decir, más alta que , o más baja que) la afinidad y/o especificidad con que las secuencias de ami noácidos y los polipéptidos de la invención se enlazan al D R5 en su estado monomé rico y no asociado.

En una modalidad , como quedará claro para la persona experta, las composiciones de la i nvención q ue contienen dos o más secuencias de am inoácidos di rigidas contra el DR5 se pueden enlazar con una avidez más alta al D R5 que las secuencias de aminoácidos monoméricas correspondientes . Por ejemplo, y sin li mitación , las proteínas o los polipéptidos q ue contienen dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho, diez o más unidades monoméricas operativamente enlazadas de secuencias de aminoácidos dirigidas contra los mismos o diferentes ep ítopos del DR5 se pueden enlazar (y usual mente se enlazarán) con una avidez más alta que cada uno de los dife rentes monómeros, y las proteínas o los pol ipéptidos que contengan dos, tres, cuatro o más secuencias de ami noácidos di rigidas contra el DR5 se pueden enlazar (y usual mente se enlazarán) también con una avidez más alta a un multímero del D R5. En una modalidad , la composición de la invención es una sola cadena de polipéptido hecha de cuatro monómeros di rigidos contra el DR5 conectados por enlazadores de aminoácidos. En una modalidad , la composición de la invención es una sola cadena de polipéptido hecha de cinco monóme ros di rigidos contra el D R5 conectados por enlazadores de aminoácidos.

En términos generales, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la i nvención se enlazarán cuando menos a las formas de D R5 (incluyendo las formas monoméricas, multiméricas y asociadas) que sean las más relevantes desde un punto de vista biológico y/o terapéutico, como quedará claro para la persona experta.

Está dentro del alcance de la invención utilizar composiciones que comprendan partes, fragmentos, análogos , mutantes , variantes , alelos y/o derivados de las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención , y/o uti lizar prote ínas o polipéptidos, los cuales comprendan o esencialmente consistan en una o más de estas composiciones siempre que éstas sean adecuadas para los usos previstos en la presente. En una modalidad , estas composiciones contendrán (cuando menos parte de) un sitio de enlace de antígeno funcional para enlazarse contra el DR5. En u na modalidad , estas composiciones serán capaces de tener un enlace específico al D R5. En una modalidad , estas composiciones serán capaces de enlazarse al DR5 con una afinidad (de u na manera adecuada medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente), un índice kac,¡vado y/o un índice kde sactivado . o de una manera alternativa, como un valor I C50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se dispone en la presente. Algu nos ejemplos no limitantes de estas composiciones llegarán a quedar más claros a parti r de la descripción adicional en la presente. Los fragmentos o polipéptidos adicionales de la invención también se pueden proporcionar mediante la combinación adecuada (es decir, mediante enlace o fusión genética) de una o más composiciones (más pequeñas) como se describen en la presente.

En un aspecto no li mitante de la invención , los análogos, mutantes, variantes , alelos, y/o derivados de los polipéptidos de la invención tienen un aumento de su vida media en suero (como se describe adicional mente en la presente) comparándose con la secuencia de aminoácidos a parti r de la cual se han derivado. Por ejemplo, una secuencia de ami noácidos de la invención puede estar enlazada (qu ímicamente o de otra manera) a uno o más grupos o fracciones que extiendan la vida media (tales como P EG) , como para proporcionar un derivado de una secuencia de aminoácidos de la invención con una mayor vida media.

En un aspecto específico, pero no li mitante , la secuencia de aminoácidos de la i nvención puede se r una secuencia de aminoácidos que comprende un pliegue de inmunoglobulina, o puede ser una secuencia de aminoácidos que, bajo condiciones adecuadas (tales como condiciones fisiológicas) es capaz de formar un pliegue de inmunoglobulina (es decir, mediante plegado). Se hace referencia, entre otras cosas, a la reseña por Halaby y colaboradores, J. (1999) Protein Eng. 12, 563-71. En una modalidad, cuando se pliega apropiadamente como para formar un pliegue de inmunoglobulina, esta secuencia de aminoácidos es capaz de tener un enlace específico al DR5. En una modalidad adicional, esta construcción es capaz de enlazarse al DR5 con una afinidad (de una manera adecuada medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente), un valor KA (real o aparente), un índice kact¡vad0 y/o un índice kdesactivado> o de una manera alternativa, como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se dispone en la presente. En una modalidad, las partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados de estas secuencias de aminoácidos son tales que comprenden un pliegue de inmunoglobulina o que son capaces de formar, bajo condiciones adecuadas, un pliegue de inmunoglobulina.

En particular, pero sin limitación, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser secuencias de aminoácidos que consisten esencialmente en cuatro regiones de estructura (FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente), y tres regiones determinantes de complementariedad intercaladas (CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente); o cualquier fragmento adecuado de esta secuencia de aminoácidos (la cual entonces usualmente contendrá cuando menos algunos de los residuos de aminoácidos que forman cuando menos una de las CDRs, como se describen adicionalmente en la presente). En una modalidad, estas regiones se configuran como se muestra en la fórmula I: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 (Fórmula I) Las secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser en particular una secuencia de inmunoglobulina o un fragmento adecuado de la misma, y más particularmente, pueden ser una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina o un fragmento adecuado de la misma, tal como una secuencia del dominio variable de la cadena ligera (por ejemplo, una secuencia VL) o un fragmento adecuado de la misma; o una secuencia del dominio variable de la cadena pesada (por ejemplo, una secuencia VH) o un fragmento adecuado de la misma. Cuando la secuencia de aminoácidos de la invención es una secuencia del dominio variable de la cadena pesada, puede ser una secuencia del dominio variable de la cadena pesada que se derive a partir de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional (tal como, sin limitación, una secuencia VH que se derive a partir de un anticuerpo humano) o puede ser una denominada como secuencia VHH que se derive a partir de un denominado como "anticuerpo de cadena pesada".

Se debe observar que la invención no está limitada con respecto al origen de la secuencia de aminoácidos de la invención (o de la secuencia de nucleótidos de la invención utilizada para expresarla), ni con respecto a la manera en que la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos de la invención se genere o se obtenga (o se haya generado u obtenido). Por consiguiente, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden contener secuencias de aminoácidos que se presenten naturalmente (a partir de cualquier especie adecuada) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semi-sintéticas. En un aspecto específico, pero no limitante, de la invención, la secuencia de aminoácidos es una secuencia de inmunoglobulina que se presenta naturalmente (a partir de cualquier especie adecuada) o una secuencia de inmunoglobulina sintética o semi-sintética, incluyendo, pero no limitándose a, "secuencias de inmunoglobulina "humanizadas" (por ejemplo, tales como secuencias de inmunoglobulina de ratón, conejo o mono, parcial o completamente humanizadas (o secuencias de inmunoglobulina de cualquier otra especie de mamífero contemplada por un experto en este campo), y en particular secuencias HH de camélido parcial o completamente humanizadas, o fragmentos de las mismas), secuencias de inmunoglobulina "camelizadas", así como secuencias de inmunoglobulina que se hayan obtenido mediante técnicas tales como maduración de afinidad (por ejemplo, empezando a partir de secuencias de inmunoglobulina sintéticas, aleatorias, o que se presenten naturalmente), injerto de CDR, chapeado, combinación de fragmentos derivados a partir de diferentes secuencias de inmunoglobulina, ensamble mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores traslapados, y técnicas similares para el diseño de secuencias de inmunoglobulina bien conocidas por la persona experta; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de los anteriores. Se hace referencia, por ejemplo, a los libros de texto convencionales, así como a la descripción adicional y a las referencias de la técnica mencionadas en la presente.

De una manera similar, las secuencias de nucleotidos de la invención pueden ser secuencias de nucleotidos que se presenten naturalmente o secuencias sintéticas o semi-sintéticas, y, por ejemplo, pueden ser secuencias que se aislen mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de una plantilla que se presente naturalmente adecuada (por ejemplo, ADN o ARN aislado a partir de una célula), secuencias de nucleotidos que se hayan aislado a partir de una biblioteca (y en particular, una biblioteca de expresión), secuencias de nucleotidos que se hayan preparado mediante la introducción de mutaciones en una secuencia de nucleotidos que se presente naturalmente (empleando cualquier técnica adecuada conocida por sí misma, tal como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de mal emparejamiento), secuencias de nucleotidos que se hayan preparado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores traslapados, o secuencias de nucleotidos que se hayan preparado empleando técnicas para la síntesis de ADN conocidas por sí mismas.

La secuencia de aminoácidos de la invención puede ser en particular un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un anticuerpo de dominio), un anticuerpo de un solo dominio (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un anticuerpo de un solo dominio), un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un dAb), o un anticuerpo de camélido (e incluyendo, pero no limitándose a, una secuencia VHH o las variantes de la misma); otros dominios variables individuales, o cualquier fragmento adecuado de cualquiera de los mismos. Para una descripción general de los anticuerpos de (un solo) dominio, también se hace referencia a las referencias de la técnica citadas anteriormente, así como a la Patente Europea Número EP 0 368 684. Para el término "dAbs", se hace referencia, por ejemplo, a Ward y colaboradores (Nature, 12 de Octubre de 1989; 341 (6242): 544-6), a Holt y colaboradores, Trends Biotechnol., 2003, 21 (11 ): 484-490; así como a, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 06/030220, la Publicación Internacional Número WO 06/003388, y otras solicitudes de patente publicadas de Domantis Ltd. En una modalidad de la invención, los anticuerpos de un solo dominio o los dominios variables individuales se pueden derivar a partir de ciertas especies de tiburón (por ejemplo, los denominados como "dominios IgNAR", véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 05/18629).

En particular, la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser una construcción de dominio variable de cadena pesada de camélido (por ejemplo, una VHH O las variables de la misma, incluyendo las variables optimizadas para utilizarse como un producto terapéutico humano, por ejemplo, como se define , por ejemplo, en la Publicación I nternacional Número WO 2008/020079) o un fragmento adecuado o una variante del mismo. En una modalidad , la secuencia de aminoácidos es un NANOBO DY( R ) (Nanocuerpo) o una construcción del mismo. Observe que NANOBODYM R, NANOBODI ESM R Y NANOCLON EM R son marcas comerciales registradas de Ablynx N .V. Las construcciones de domi nio variable de cadena pesada específicas dirigidas contra el D R5 , ya sean o no "humanizadas" , o alteradas u optimizadas de otra manera, serán referidas en la presente como una "secuencia de NB" de la invención.

Como se uti liza en la presente, la frase "secuencia optimizada" , o de u na manera alternativa, las secuencias q ue son "alteradas u optimizadas" , se definen para referirse al reemplazo de los residuos de un agente NB, en especial en la región de estructura, para reducir la presentación de una respuesta i n munogénica al agente NB por parte del sujeto al cual se administra. En el caso en donde el sujeto es un ser humano, la frase incluye cualquier técnica conocida en la materia para humanizar la secuencia.

En una modalidad , los agentes NB son los denominados como "clase VH3" (es decir, una construcción de NB con un alto grado de homología de secuencia con las secuencias de la l ínea germinal humana de la clase VH3, tales como D P-47, D P-51 o DP-29) . En una modalidad , esta clase VH3 de construcciones de NB comprenden las regiones de estructura de esta invención. Sin embargo, la invención en, su sentido más amplio, en términos generales cubre cualquier tipo de agentes NB dirigidos contra el DR5. Por ejemplo, en una modalidad, la invención también cubre las construcciones de NB pertenecientes a la denominada como "clase VH4" (es decir, las construcciones de NB con un alto grado de homología de secuencia con las secuencias de la línea germinal humana de la clase VH4, tales como DP-78). Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 07/118670.

En una modalidad, las construcciones de NB (en particular las construcciones completamente humanizadas y parcialmente humanizadas) se caracterizan por la presencia de uno o más "residuos Hallmark" en una o más de las secuencias de estructura. En una modalidad, las secuencias de estructura presentes en las construcciones de NB de la invención, pueden ser tales que la secuencia de aminoácidos es una variante de una construcción VHH de camélido. Algunos ejemplos no limitantes (combinaciones adecuadas) de estas secuencias de estructura y los residuos Hallmark alternativos aparecen, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 2008/020079, páginas 65 - 98, cuyas páginas se incorporan como referencia en su totalidad. También se contemplan otros residuos humanizados o parcialmente humanizados conocidos en la materia como abarcados dentro de la invención.

En términos generales, una construcción VH o VHH se puede definir como una secuencia de aminoácidos con la estructura (general) de la fórmula I, en donde FR1 a FR4 se refieren a las regiones de estructura 1 a 4, respectivamente, y en donde CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente.

En una modalidad, una composición de la invención puede ser una construcción de NB con una secuencia de aminoácidos con la estructura (general) de la fórmula I, en donde uno o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat, se seleccionan a partir de los residuos Hallmark mencionados en la Tabla A-3 de la Publicación Internacional Número WO 2008/020079 y en donde esta secuencia de aminoácidos tiene cuando menos el 80 por ciento, el 85 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento ó el 100 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de estructura de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1 a 22 de la Publicación Internacional Número WO 2008/020079, en donde, para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, no se consideran los residuos de aminoácidos que forman las secuencias de CDR (indicadas con X en las secuencias).

En los agentes NB de la invención, incluyendo, sin limitación los diferentes formatos o andamiajes, las secuencias de CDR son en términos generales como se proporcionan en las Tablas 1 a 3, y en especial como se designan específicamente mediante la SEQ ID NO en la Tabla 4. En particular, la CDR1 puede ser cualquiera de las SEQ ID NOs: 41 a 44; la CDR2 puede ser cualquiera de las SEQ ID NOs: 51 a 55; y la CDR3 puede ser cualquiera de las SEQ ID NOs: 63 a 68.

Por consiguiente, en una modalidad, la invención se refiere a las construcciones VH que se pueden enlazar a, y/o se dirigen contra, el DR5, a los fragmentos adecuados de las mismas, así como a los polipéptidos que comprenden o que consisten esencialmente en una o más de estas construcciones VH y/o fragmentos adecuados.

En general, las SEQ ID NOs: 1 - 22, 26 - 40, 87-88, y 103-104 proporcionan las secuencias de aminoácidos de un número de agentes NB que se han reproducido contra el DR5 (véanse las Tablea 1 a 4). Las SEQ ID NOs: 96-99 proporcionan secuencias de ácidos nucleicos específicas que codifican agentes NB específicos, como se dispone en la presente.

En algunas modalidades, las composiciones de la invención son agentes NB, por ejemplo, como se muestra en las Tablas 1 a 4, que se pueden enlazar a, y/o se dirigen contra, el DR5, y que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1 - 22, 26 - 40, 87-88 y 103-104, en donde, para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, no se consideran los residuos de aminoácidos que forman las secuencias de CDR, y en donde uno o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat son residuos Hallmark.

En diferentes modalidades, y como se proporcionan en la Tabla 4, las construcciones de NB comprenden las secuencias de estructura 1 de las SEQ ID NOs: 34 a 40), las secuencias de estructura 2 de las SEQ ID NOs: 45 a 50, las secuencias de estructura 3 de las SEQ ID NOs: 56 a 62, y las secuencias de estructura 4 de las SEQ ID NOs: 69 a 72. En una modalidad, no se consideran los residuos de aminoácidos en las posiciones 1 a 4 y 27 a 30 de las secuencias de estructura 1 de las construcciones de NB de las SEQ ID NOs: 1 - 22, 26 - 40, 87-88 y 103-104, para determinar el grado de identidad de aminoácidos.

En una modalidad, los agentes NB de la invención y las composiciones se pueden derivar de cualquier manera adecuada y a partir de cualquier fuente adecuada, y, por ejemplo, pueden ser secuencias VHH que se presenten naturalmente (es decir, a partir de una especie adecuada de camélido) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semi-sintéticas, incluyendo, pero no limitándose a, agentes NB "humanizados", secuencias de inmunoglobulina "camelizadas" (y en particular secuencias de dominio variable de cadena pesada camelizadas), así como agentes NB que se hayan obtenido mediante técnicas tales como maduración de afinidad (por ejemplo, empezando a partir de secuencias de inmunoglobulina sintéticas, aleatorias, o que se presenten naturalmente), injerto de CDR, chapeado, combinación de fragmentos derivados a partir de diferentes secuencias de inmunoglobulina, ensamble mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores traslapados, y técnicas similares para el diseño de secuencias de inmunoglobulina bien conocidas por la persona experta; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de los anteriores, como se describen adicionalmente en la presente. También, cuando una composición de la invención comprende una secuencia VHH, esta composición se puede humanizar adecuadamente, como se describe en la presente, como para proporcionar una o más composiciones (parcialmente o completamente) humanizadas adicionales de la invención. En una modalidad, cuando una composición de la invención comprende una secuencia sintética o semi-sintética (tal como una secuencia parcialmente humanizada), esta composición opcionalmente se puede humanizar además adecuadamente, por ejemplo, de nuevo se puede humanizar parcial o completamente.

En una modalidad, las composiciones humanizadas son secuencias de aminoácidos que tienen cuando menos un residuo de aminoácido presente (y en particular, en cuando menos uno de los residuos de estructura) que es y/o que corresponde a una sustitución de humanización. En esta modalidad no limitante, las sustituciones de humanización (y las combinaciones adecuadas de las mismas) estarán claras para la persona experta basándose en la divulgación de la presente. En una modalidad, las sustituciones de humanización potencialmente útiles se pueden aseverar mediante la comparación de la secuencia de las regiones de estructura de una secuencia VHH que se presente naturalmente, con la secuencia de estructura correspondiente de una o más secuencias VH humanas estrechamente relacionadas, después de lo cual, una o más de las sustituciones de humanización potencialmente útiles (o combinaciones de las mismas), determinadas de esta manera, se pueden introducir en la secuencia VHH de cualquier manera conocida por sí misma. En una modalidad, las secuencias VHH humanizadas resultantes se prueban para determinar su afinidad por el objetivo, su estabilidad, su facilidad y nivel de expresión, y/otras propiedades deseadas. De esta manera, por medio de un grado limitado de ensayo y error, la persona experta puede determinar otras sustituciones de humanización adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas), basándose en la divulgación de la presente. También, basándose en lo anterior, (las regiones de estructura de) una composición de la invención puede ser parcialmente humanizada o completamente humanizada.

En una modalidad, las composiciones humanizadas de la presente son variantes humanizadas de las composiciones de las SEQ ID NOs: 1 - 22, 26 - 40, 87-88, y 103-104, y de las SEQ ID NOs: 96-99. En una modalidad, las construcciones de NB humanizadas son como se proporcionan en la Tabla 3.

Por consiguiente, algunas otras composiciones preferidas de la invención son las composiciones que se pueden enlazar a (como se definen adicionalmente en la presente) al DR5 y que: (a) son una variante humanizada de una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1 - 22, 26 - 40, 87-88, y 103-104; y/o (b) tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1 - 22, 26 - 40, 87-88, y 103-104. En una modalidad, para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, no se consideran los residuos de aminoácidos que forman las secuencias de CDR.

En una modalidad, uno o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat, se seleccionan a partir de los residuos Hallmark mencionados en la Tabla A-3 de la Publicación Internacional Número WO 2008/020079.

En una modalidad, la invención proporciona un número de estiramientos de residuos de aminoácidos (es decir, péptidos pequeños) que son en particular adecuados para enlazarse al DR5. Estos estiramientos de residuos de aminoácidos pueden estar presentes en, y/o se pueden incorporar en, una secuencia de aminoácidos de la invención, en particular de tal manera que formen (parte de) el sitio de enlace de antígeno de una secuencia de aminoácidos de la invención. Debido a que estos estiramientos de residuos de aminoácidos se generan primero como secuencias de CDR de anticuerpos de cadena pesada o secuencias VHH que se reproducen contra el DR5 (o se pueden basar en, y/o derivar a partir de estas secuencias de CDR, como se describen adicionalmente en la presente), también serán referidas en términos generales en la presente como "secuencias de CDR" (es decir, como secuencias de CDR1, secuencias de CDR2, y secuencias de CDR3, respectivamente) . Sin embargo, se debe observar que la i nvención en su sentido más amplio no está l i mitada a un papel o función estructu ral específica que estos esti ramientos de residuos de aminoácidos pueden tener en una secuencia de aminoácidos de la invención , siempre que estos estiramientos de residuos de aminoácidos permitan que la secuencia de aminoácidos de la i nvención se enlace al DR5. Por consiguiente , en térmi nos generales , la invención , en su sentido más amplio, comprende cualquier secuencia de aminoácidos que sea capaz de enlazarse al DR5 y que comprenda una o más secuencias de CDR como se describen en la presente, y en particular una combinación adecuada de dos o más de estas secuencias de CDR , que adecuadamente se enlazan unas a otras por medio de una o más secuencias de aminoácidos adicionales , de tal manera que la secuencia de aminoácidos entera forma un domi nio de enlace y/o unidad de enlace que es capaz de enlazarse al DR5. Sin embargo, también se debe observar que la presencia de solamente una secuencia de CD R en una secuencia de aminoácidos de la i nvención puede por s í misma ser ya suficiente para proporcionar una secuencia de aminoácidos de la i nvención q ue sea capaz de enlazarse al DR5 ; por ejemplo , nuevamente se hace referencia a los denominados como "f ragmentos expeditos" descritos en la Publicación Internacional Número WO 03/050531 .

En una modalidad , la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser una secuencia de aminoácidos que comprenda cuando menos una secuencia de ami noácidos que se selecciona a parti r del grupo que consiste en las secuencias de CDR 1 , las secuencias de CDR2 y las secuencias de CD R3 que se describen en la presente (o cualquier combinación adecuada de las mismas) . En particular, una secuencia de aminoácidos de la i nvención puede ser una secuencia de aminoácidos que comprenda cuando menos un sitio de enlace de antígeno, en donde este sitio de en lace de antígeno comprende cuando menos una secuencia de aminoácidos que se selecciona a parti r del g rupo que consiste en las secuencias de CD R 1 , las secuencias de C DR2 y las secuencias de CD R3 que se describen en la presente (o cualquier combinación adecuada de las mismas) .

En una modalidad , la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que comprenda cuando menos un estiramiento de los residuos de aminoácidos, en donde este esti ramiento de los residuos de aminoácidos tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de cuando menos uno de las secuencias de CD R descritas en la presente . Esta secuencia de aminoácidos puede o no comprender un pliegue de inmu noglobulina. Por ejemplo , y si n li mitación , esta secuencia de aminoácidos puede ser un fragmento adecuado de una secuencia de inmunoglobulina que comprenda cuando menos una secuencia de CD R , pero que no sea suficientemente g rande para formar un pliegue de i nmunoglobulina (completo) (por ejemplo, nuevamente se hace referencia a los "fragmentos expeditos" descritos en la Publ icación I nternacional N úmero WO 03/050531 ) . De una manera alternativa, esta secuencia de aminoácidos puede ser un "andamiaje de proteína" adecuado que comprenda cuando menos un estiramiento de los residuos de aminoácidos que correspondan a esa secuencia de CDR (es decir, como parte de su sitio de enlace de antígeno). Los andamiajes adecuados para presentar las secuencias de aminoácidos quedarán claros para la persona experta, y, por ejemplo, comprenden, sin limitación, los andamiajes de enlace que se basan en, o se derivan a partir de, inmunoglobulinas (es decir, diferentes de la secuencias de inmunoglobulina ya descritas en la presente), los andamiajes de proteína derivados a partir de los dominios de proteína A (por ejemplo, tales como AFFIBODIES R), tendamistato, fibronectina, incluyendo el dominio de fibronectina tipo III, lipocalina, CTLA-4, receptores de células-T, repeticiones de anquirina diseñados, avímeros y dominios PDZ (Binz y colaboradores, Nat. Biotech 2005, Volumen 23: 1257), y las fracciones de enlace que se basan en ADN o ARN, incluyendo, pero no limitándose a, aptámeros de ADN o ARN (Ulrich y colaboradores, Comb Chem. High Throughput Screen 20069(8): 619-32).

En una modalidad, cualquier secuencia de aminoácidos de la presente que comprenda una o más de estas secuencias de CDR, se puede enlazar específicamente al DR5. En una modalidad, puede enlazarse al DR5 con una afinidad (de una manera adecuada medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente), un valor KA (real o aparente), un índice kactivado y/o un índice kdesact¡vad0, o de una manera alternativa, como un valor IC50) como se dispone en la presente.

En una modalidad, una composición de la invención en la presente, puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que comprenda cuando menos un sitio de enlace de antígeno, en donde este sitio de enlace de antígeno comprende cuando menos dos secuencias de aminoácidos que se seleccionan a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 descritas en la presente, las secuencias de CDR2 descritas en la presente, y las secuencias de CDR3 descritas en la presente, de tal manera que: (1) cuando la primera secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de las secuencias de CDR1 descritas en la presente, la segunda secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de las secuencias de CDR2 descritas en la presente o las secuencias de CDR3 descritas en la presente; (2) cuando la primera secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de las secuencias de CDR2 descritas en la presente, la segunda secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de las secuencias de CDR1 descritas en la presente o las secuencias de CDR3 descritas en la presente; o (3) cuando la primera secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de las secuencias de CDR3 descritas en la presente, la segunda secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de las secuencias de CDR1 descritas en la presente o las secuencias de CDR3 descritas en la presente.

En una modalidad, una composición de la invención en la presente, puede ser de secuencias de aminoácidos que comprenden cuando menos un sitio de enlace de antígeno, en donde este sitio de enlace de antígeno comprende cuando menos tres secuencias de aminoácidos que se seleccionan a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 descritas en la presente, las secuencias de CDR2 descritas en la presente, y las secuencias de CDR3 descritas en la presente, de tal manera que la primera secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de las secuencias de CDR1 descritas en la presente, la segunda secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de las secuencias de CDR2 descritas en la presente, y la tercera secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de las secuencias de CDR3 descritas en la presente. Las combinaciones preferidas de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 llegarán a quedar más claras a partir de la descripción adicional en la presente. Como quedará claro para la persona experta, esta secuencia de aminoácidos es de preferencia una secuencia de inmunoglobulina (como se describe adicionalmente en la presente), pero, por ejemplo, también puede ser cualquier otra secuencia de aminoácidos que comprenda un andamiaje adecuado para presentar estas secuencias de CDR.

En una modalidad, una composición de la invención en la presente se refiere a una secuencia de aminoácidos dirigida contra el DR5, y en particular contra el DR5 como se proporciona en las bases de datos públicas, tales como, por ejemplo, base de datos de proteínas NCBI Número de Acceso BAA33723, en donde la secuencia de aminoácidos comprende uno o más estiramientos de residuos de aminoácidos seleccionados a partir del grupo que consiste en: (a) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44; (b) las secuencias de aminoácidos que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44; (c) las secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44; (d) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55; (e) las secuencias de aminoácidos que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55; (f) las secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55; (g) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68; (h) las secuencias de aminoácidos que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68; (i) las secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68; o cualquier combinación adecuada de las mismas.

Cuando una secuencia de aminoácidos de la invención contiene una o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con b) y/o c): (1) cualquier sustitución de aminoácido en esta secuencia de aminoácidos de acuerdo con b) y/o c) es de preferencia, y comparándose con la secuencia de aminoácidos correspondiente de acuerdo con a), una sustitución de aminoácido conservadora; y/o (2) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con b) y/o c) de preferencia contiene solamente sustituciones de aminoácidos, y no hay supresiones o inserciones de aminoácidos, comparándose con la secuencia de aminoácidos correspondiente de acuerdo con a); y/o (3) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con b) y/o c) puede ser una secuencia de aminoácidos que se derive a partir de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con a) por medio de maduración de afinidad, utilizando una o más técnicas de maduración de afinidad conocidas por sí mismas.

De una manera similar, cuando una secuencia de aminoácidos de la invención contiene una o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con e) y/o f): (1) cualquier sustitución de aminoácido en esta secuencia de aminoácidos de acuerdo con e) y/o f) es de preferencia, y comparándose con la secuencia de aminoácidos correspondiente de acuerdo con d), una sustitución de aminoácido conservadora; y/o (2) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con e) y/o f) de preferencia contiene solamente sustituciones de aminoácidos, y no hay supresiones o inserciones de aminoácidos, comparándose con la secuencia de aminoácidos correspondiente de acuerdo con d) ; y/o (3) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con e) y/o f) puede ser una secuencia de aminoácidos que se derive a parti r de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con d) por medio de madu ración de afinidad, utilizando una o más técnicas de madu ración de afinidad conocidas por sí mismas .

También , de una manera similar, cuando una secuencia de aminoácidos de la invención contiene una o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con h) y/o i) : ( 1 ) cualquier sustitución de ami noácido en esta secuencia de aminoácidos de acuerdo con h) y/o i) es de preferencia, y comparándose con la secuencia de aminoácidos correspondiente de acuerdo con g) , una sustitución de aminoácido conservadora; y/o (2) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con h) y/o i) de preferencia contiene solamente sustituciones de aminoácidos , y no hay supresiones o inserciones de aminoácidos , comparándose con la secuencia de ami noácidos correspondiente de acuerdo con g) ; y/o (3) la secuencia de ami noácidos de acuerdo con h) y/o i) puede ser una secuencia de aminoácidos que se derive a parti r de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con g) por medio de maduración de afinidad , uti l izando una o más técnicas de madu ración de afinidad conocidas por s í mismas.

Se debe entender que los últimos párrafos precedentes también se aplican en general a cualesquiera secuencias de aminoácidos de la invención que comprendan una o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b), c), d), e), f), g), h) o i), respectivamente.

En este aspecto específico, la secuencia de aminoácidos de preferencia comprende uno o más estiramientos de residuos de aminoácidos seleccionados a partir del grupo que consiste en: (i) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44; (ii) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55; y (iii) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68; o cualquier combinación adecuada de las mismas.

También, de preferencia, en esta secuencia de aminoácidos, cuando menos uno de los estiramientos de residuos de aminoácidos forma parte del sitio de enlace de antígeno para enlazarse contra el DR5.

En un aspecto no limitante, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos dirigida contra el DR5, la cual comprende dos o más estiramientos de residuos de aminoácidos seleccionados a partir del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44; b) las secuencias de aminoácidos que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44; c) las secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44; d) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55; e) las secuencias de aminoácidos que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55; f) las secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55; g) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68; h) las secuencias de aminoácidos que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68; i) las secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68; de tal manera que (1) cuando el primer estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b) o c), el segundo estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con d), e), f), g), h) o i); (2) cuando el primer estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con d), e) o f), el segundo estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b), c), g), h) o i); o (3) cuando el primer estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con g), h) o i), el segundo estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b), c), d), e) o f).

En este aspecto específico, la secuencia de aminoácidos de preferencia comprende dos o más estiramientos de residuos de aminoácidos seleccionados a partir del grupo que consiste en: (i) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44; (i¡) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55; y (iii) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68; de tal manera que, (1) cuando el primer estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44, el segundo estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55 o de las SEQ ID NOs: 63 a 68; (2) cuando el primer estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55, el segundo estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44 o de las SEQ ID NOs: 63 a 68; o (3) cuando el primer estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68, el segundo estiramiento de los residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44 o de las SEQ ID NOs: 51 a 55.

También, en esta secuencia de aminoácidos, los cuando menos dos estiramientos de residuos de aminoácidos nuevamente de preferencia forman parte del sitio de enlace de antígeno para enlazarse contra el DR5.

En una modalidad, en particular en lo que se refiere a los párrafos anteriores, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende dos o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b), c), d), e), f), g), h) o i), respectivamente. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos es una variante dimérica de un agente NBe. En una modalidad, los monómeros que comprenden el dimero se enlazan operativamente en un solo marco de lectura. En una modalidad, la secuencia enlazadora que une los monómeros es un multímero de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 81) o GGGS (SEQ ID NO: 82), o una combinación de ambas, o se selecciona a partir de una secuencia enlazadora proporcionada en la presente como las SEQ ID NOs: 44, 45 ó 46, o como se conoce en la materia.

En una modalidad, en particular en lo que se refiere a los párrafos anteriores, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos, la cual comprende tres o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b), c), d), e), f), g), h) o i), respectivamente. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos es una variante trimérica de un agente NBe. En una modalidad, los monomeros que comprenden el trímero se enlazan operativamente en un solo marco de lectura. En una modalidad, la secuencia enlazadora que une los monomeros es un multímero de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 81) o GGGS (SEQ ID NO: 82), o una combinación de ambas, o se selecciona a partir de una secuencia enlazadora proporcionada en la presente como las SEQ ID NOs: 44, 45 ó 46, o como se conoce en la materia.

En una modalidad, en particular en lo que se refiere a los párrafos anteriores, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos, la cual comprende cuatro o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b), c), d), e), f), g), h) o i), respectivamente. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos es una variante tetramérica de un agente NBe. En una modalidad, los monomeros que comprenden el tetrámero se enlazan operativamente en un solo marco de lectura. En una modalidad, la secuencia enlazadora que une los monomeros es un multímero de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 81) o GGGS (SEQ ID NO: 82), o una combinación de ambas, o se selecciona a partir de una secuencia enlazadora proporcionada en la presente como las SEQ ID NOs: 44, 45 ó 46, o como se conoce en la materia.

En una modalidad, en particular en lo que se refiere a los párrafos anteriores, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos, la cual comprende cinco o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b), c), d), e), f), g), h) o i), respectivamente. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos es una variante pentamérica de un agente NBe. En una modalidad, los monómeros que comprenden el pentámero se enlazan operativamente en un solo marco de lectura. En una modalidad, la secuencia enlazadora que une los monómeros es un multímero de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 81) o GGGS (SEQ ID NO: 82), o una combinación de ambas, o se selecciona a partir de una secuencia enlazadora proporcionada en la presente como las SEQ ID NOs: 44, 45 ó 46, o como se conoce en la materia.

En una modalidad, en particular en lo que se refiere a los párrafos anteriores, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos, la cual comprende seis o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b), c), d), e), f), g), h) o i), respectivamente. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos es una variante hexamérica de un agente NBe. En una modalidad, los monómeros que comprenden el hexámero se enlazan operativamente en un solo marco de lectura. En una modalidad, la secuencia enlazadora que une los monómeros es un multímero de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 81) o GGGS (SEQ ID NO: 82), o una combinación de ambas, o se selecciona a partir de una secuencia enlazadora proporcionada en la presente como las SEQ ID NOs: 44, 45 ó 46, o como se conoce en la materia.

En una modalidad, en particular en lo que se refiere a los párrafos anteriores, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos, la cual comprende dos, tres, cuatro, cinco seis, siete, ocho, nueve, diez o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b), c), d), e), f), g), h) o i), respectivamente. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos es una variante multimérica de un agente NBe. En una modalidad, los monómeros que comprenden el multímero se enlazan operativamente en un solo marco de lectura. En una modalidad, la secuencia enlazadora que une los monómeros se selecciona a partir de cuando menos una de las secuencias GGGGS (SEQ ID NO: 81) o GGGS (SEQ ID NO: 82), o una combinación de ambas, o se selecciona a partir de una secuencia enlazadora proporcionada en la presente como las SEQ ID NOs: 44, 45 ó 46, o como es conocido por un experto en este campo.

De preferencia, en estas secuencias de aminoácidos, las secuencias de CDR tienen cuando menos el 70 por ciento de identidad de aminoácidos, de preferencia cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos, más preferiblemente cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos, tal como cuando menos el 95 por ciento de identidad de aminoácidos o más, o incluso esencialmente el 100 por ciento de identidad de aminoácidos con las secuencias de CDR de cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1 - 22, 26 - 40, 87-88, y 103-104. Este grado de identidad de aminoácidos, por ejemplo, se puede determinar mediante la determinación del grado de identidad de aminoácidos (de una manera descrita en la presente) entre esta secuencia de aminoácidos y una o más de las secuencias de las S EQ I D NOs: 1 - 22 , 26 - 40 , 87-88, y 1 03- 1 04, en donde no se consideran los residuos de ami noácidos q ue forman las regiones de estructu ra. También , tales secuencias de ami noácidos se pueden humanizar o modificar como se describe adicionalmente en la presente .

También , las secuencias de aminoácidos son de preferencia de tal manera que se pueden enlazar específicamente al DR5 ; y más particularmente, se enlazan al D R5 con una afinidad (de una manera adecuada medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente), un valor KA (real o aparente) , un índice kact¡vado y/o un índice kde sacüvado . o de una manera alternativa, como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se dispone en la presente .

En un aspecto no limitante, la invención se refiere a una secuencia de ami noácidos que esencialmente consiste en cuatro regiones de estructura ( FR 1 a FR4, respectivamente) , y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR 1 a CDR3, respectivamente) , en donde las secuencias de CD R de esta secuencia de ami noácidos tienen cuando menos el 70 por ciento de identidad de ami noácidos, de preferencia cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos, más preferiblemente cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos, tal como cuando menos el 95 por ciento de identidad de aminoácidos o más, cuando menos el 98 por ciento de identidad de aminoácidos o más, cuando menos el 99 por ciento de identidad de ami noácidos o más , o incluso esencialmente el 1 00 por ciento de identidad de aminoácidos con las secuencias de C D R de cuando menos una de las secuencias de ami noácidos de las S EQ I D NOs: 1 - 22, 26 - 40 , 87-88 , y 1 03-1 04. Este grado de identidad de aminoácidos, por ejemplo , se puede dete rminar mediante la determinación del grado de identidad de aminoácidos (de u na manera descrita en la presente) entre esta secuencia de ami noácidos y una o más de las secuencias de las S EQ I D NOs: 1 - 22, 26 - 40, 87-88, y 1 03- 1 04, en donde no se consideran los residuos de aminoácidos que forman las regiones de estructu ra. Tales secuencias de aminoácidos de la invención se pueden modificar adicional mente como se describe en la presente .

En esta secuencia de aminoácidos de la invención, las secuencias de estructura puede ser cualesquiera secuencias de estructu ra adecuadas, y los ejemplos de las secuencias de estructura adecuadas quedarán claras para la persona experta, por ejemplo, con base en los libros de texto convencionales , y en la divulgación adicional y en las referencias de la técnica mencionadas en la presente .

Las secuencias de estructura son de preferencia (una combinación adecuada de) secuencias de estructura de inmunoglobul ina o secuencias de estructura que se hayan derivado a partir de secuencias de estructura de inmunoglobulina (por ejemplo, mediante h umanización o camelización) . Por ejemplo , las secuencias de estructura pueden ser secuencias de estructura derivadas a partir de un dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia VL) y/o a partir de un dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia VH). En un aspecto particularmente preferido, las secuencias de estructura son cualquiera de las secuencias de estructura que se hayan derivado a partir de una secuencia VHH (en donde estas secuencias de estructura opcionalmente pueden haber sido parcial o completamente humanizadas) o son secuencias VH convencionales que se han camelizado.

Las secuencias de estructura son de preferencia de tal manera que la secuencia de aminoácidos de la invención es un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un anticuerpo de dominio); es un anticuerpo de un solo dominio (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un anticuerpo de un solo dominio); es un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un dAb); o es un agente NB (incluyendo, pero no limitándose a, las secuencias VH y/o VHH)- Nuevamente, las secuencias de estructura adecuadas quedarán claras para la persona experta, por ejemplo, con base en los libros de texto convencionales, y en la divulgación adicional y en las referencias de la técnica mencionadas en la presente.

En una modalidad, como se describe en términos generales en la presente, para las secuencias de aminoácidos de la invención, es posible utilizar fragmentos adecuados (o combinaciones de fragmentos) de cualquiera de los anteriores, tales como fragmentos que contengan una o más secuencias de CDR , de una manera adecuada flanqueadas por, y/o enlazadas por medio de , una o más secuencias de estructu ra (por ejemplo , en el mismo orden en que se puedan presentar estas C DRs y secuencias de estructu ra en la secuencia de inmunoglobulina de tamaño completo a parti r de la cual se derivó el fragmento) . Estos fragmentos también pueden ser nuevamente de tal manera que comprendan o puedan formar un pl iegue de inmunoglobulina, o de una manera alternativa, pueden ser de tal manera que no comprendan o no puedan formar un pliegue de inmunoglobuli na.

En un aspecto , este fragmento comprende una sola secuencia de CD R como se describe en la presente (y en particular una secuencia de CDR3) , que está flanqueada en cada lado por (es parte de) una secuencia de estructu ra (y en particular, parte de las secuencias de estructura que, en la secuencia de i nmunoglobulina a parti r de la cual se deriva el f ragmento, están adyacentes a dicha secuencia de CDR . Por ejemplo, una secuencia de CDR3 puede ser precedida por (parte de) una secuencia de FR3 y seguida por (parte de) una secuencia de FR4) . Este fragmento también puede contener un puente de disulfuro, y en particular un puente de disulfuro que enlaza las dos regiones de estructu ra que preceden y siguen a la secuencia de CDR , respectivamente (para el propósito de formar este puente de disulfuro, se pueden utilizar los residuos de ciste ína que se presentan natu ralmente en esas regiones de estructura, o de una manera alternativa, los residuos de cisteína se pueden agregar sintéticamente a, o se pueden i ntroduci r en , esas regiones de estructu ra) . En una modalidad , esta construcción es un fragmento Expedito. Para una descripción adicional de estos "fragmentos expeditos", nuevamente se hace referencia a la Publicación I nternacional Número WO 03/050531 , así como a la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamé rica de Ablynx N .V. titulada como " Peptides able of bindi ng to serum proteins" de Ablynx N .V. (inventores : Revets y colaboradores) presentada el 5 de Diciembre de 2006.

En un aspecto, la invención se refiere a un agente N B , y en particular, a una proteína o polipéptido que comprende o que consiste esencialmente en una o más secuencias de aminoácidos de la i nvención (o fragmentos adecuados de las mismas) , y opcional mente comprende además u no o más grupos adicionales, residuos, f racciones o unidades de enlace. Como llegará a quedar más claro para la persona experta a parti r de la divulgación adicional en la presente , los grupos adicionales, los residuos, las fracciones, las unidades de enlace, o las secuencias de aminoácidos pueden o no proporcionar una funcionalidad adicional a la secuencia de aminoácidos de la i nvención (y/o al compuesto o a la construcción en donde esté presente) , y puede o no modificar las propiedades de la secuencia de ami noácidos de la invención.

Por ejemplo, los grupos adicionales , los residuos , las fracciones o las unidades de enlace , pueden ser una o más secuencias de aminoácidos adicionales, de tal manera que el compuesto o la construcción es una proteína (de fusión) o un polipéptido (de fusión). En un aspecto preferido pero no limitante, el uno o más grupos adicionales, los residuos, las fracciones, o las unidades de enlace, son secuencias de inmunoglobulina. Todavía más preferiblemente, el uno o más grupos adicionales, los residuos, las fracciones, o las unidades de enlace, se seleccionan a partir del grupo que consiste en los anticuerpos de dominio, las secuencias de aminoácidos que son adecuadas para utilizarse como un anticuerpo de dominio, los anticuerpos de un solo dominio, las secuencias de aminoácidos que son adecuadas para utilizarse como un anticuerpo de un solo dominio, los "dAbs", las secuencias de aminoácidos que son adecuadas para utilizarse como un dAb, o las construcciones VHH de camélido.

En una modalidad, los grupos, los residuos, las fracciones o las unidades de enlace, por ejemplo, pueden ser grupos, residuos, o fracciones químicas, que pueden o no ser por sí mismos biológicamente y/o farmacológicamente activos. Por ejemplo, y sin limitación, estos grupos se pueden enlazar a la una o más secuencias de aminoácidos de la invención, como para proporcionar un "derivado" de una secuencia de aminoácidos o polipéptido de la invención, como se describe adicionalmente en la presente.

También dentro del alcance de la presente invención están compuestos o construcciones, que comprendan o esencialmente consistan en uno o más derivados como se describe en la presente, y opcionalmente comprendan además uno o más grupos adicionales , residuos, fracciones o unidades de enlace , opcionalmente enlazado por medio de uno o más enlazadores. De preferencia, uno o más grupos adicionales , residuos , fracciones o unidades de enlace son secuencias de ami noácidos.

En los compuestos o construcciones descrito ante riormente , una o más secuencias de aminoácidos de la invención , y uno o más grupos , residuos , fracciones o unidades de enlace puede estar enlazados di rectamente unos a otros y/o por medio de uno o más enlazadores adicionales o espaciadores . Por ejemplo, cuando u no o más grupos , residuos, f racciones o unidades de enlace son secuencias de aminoácidos, los enlazadores también puede ser secuencias de aminoácidos , de tal manera que el compuesto o construcción resultante es una prote ína de fusión o u n polipéptido de fusión . Las secuencias de aminoácidos de los enlazadores puede ser como se dispone en la presente , o puede ser u na conocida por la persona experta en la materia.

Los compuestos o polipéptidos de la invención se pueden preparar en términos generales mediante un método, el cual comprende cuando menos un paso de una manera adecuada enlazando una o más secuencias de aminoácidos de la i nvención a uno o más g rupos, los residuos , fracciones o unidades de enlace adicionales , opcionalmente por medio de uno o más enlazadores adicionales, como para proporcionar el compuesto o polipéptido de la invención . Los pol ipéptidos de la i nvención también se pueden preparar mediante un método, el cual en térmi nos generales comprende cuando menos los pasos de proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención , expresando el ácido nucleico en una manera adecuada, y recuperar el polipéptido expresado de la invención. Los métodos se puede llevar a cabo de una manera conocida por sí misma, la cual quedará clara para la persona experta, por ejemplo, en la base de los métodos y técnicas descritos además en la presente .

El proceso de diseñar/seleccionar y/o preparar un compuesto o polipéptido de la invención, empezando a partir de u na secuencia de aminoácidos de la invención , también se refiere en la presente como "formatear" esta secuencia de aminoácidos de la invención; y un aminoácido de la invención que se hace parte de un compuesto o pol ipéptido de la invención se dice que se "formatea" o se pone "en el formato de" el compuesto o polipéptido mencionado de la invención. Los ejemplos de las formas en donde una secuencia de aminoácidos de la i nvención puede ser formateada y los ejemplos de los formatos estarán claros para la persona experta basándose en la divulgación de la presente ; y las secuencias formateadas de aminoácidos forman un aspecto adicional de la invención .

De acuerdo con un aspecto preferido, un compuesto de la invención es un pol ipéptido multivalente que contiene dos o más (de preferencia tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más , ocho o más , y/o diez o más) secuencias de aminoácidos di rigidas contra el DR5 (por ejemplo, las secuencias de ami noácidos como se dispone en la presente) , opcionalmente enlazado por medio de uno o más enlazadores adicionales (los cuales pueden ser como se descri be adicionalmente en la presente) o por medio de u na técnica de enlace cruzado o enlace covalente creado de una manera conocida para un experto en este campo. En una o más modalidades alternativas, el pol ipéptido m ultivalente contiene una subunidad opcional que se enlaza a un objetivo diferente de DR5.

En particular, un compuesto de la invención puede ser un polipéptido multivalente el cual es capaz de inducir, desencadenar, incrementar o mejorar la señalización mediada por el DR5 , y más particularmente, de desencadenar o induci r la apoptosis en la cél ula en la que esté presente el D R5. En una modal idad, el polipéptido multivalente consiste en tres unidades de enlace de DR5 monomé ricas que se enlazan operativamente , creando de esta manera un polipéptido trimérico. En una modalidad, el polipéptido multivalente consiste en cuatro unidades de enlace de DR5 monoméricas que se enlazan operativamente , creando de esta mane ra un polipéptido tetramérico. En una modalidad , el polipéptido multivalente consiste en ci nco unidades de enlace de D R5 monoméricas que se enlazan operativamente , creando de esta manera un polipéptido pentamérico. En una modalidad, el pol ipéptido multivalente consiste en seis unidades de enlace de DR5 monoméricas que se enlazan operativamente , creando de esta manera a polipéptido hexamérico. En una modalidad, el polipéptido multivalente consiste en siete, ocho, nueve , diez o más unidades de enlace de DR5 monoméricas que se enlazan operativamente , creando de esta manera variantes adicionales de una prote ína multi mérica .

Como ya se mencionó en la presente , los polipéptidos multiméricas además pueden estar de tal manera que puedan enlazarse al sitio de enlace de TRAI L sobre el D R5, y/o de tal manera que puedan competir con TRAI L para enlazarse al DR5.

El polipéptido multivalente también pueden ser tal que no se enlaza al sitio de enlace para TRAI L sobre el D R5 , y/o esencial mente no previene o inhibe el enlace de TRAI L al DR5, y/o no compite con TRAI L para enlazarse al DR5 , y/o aún ser de tal manera que aumenten o mejoren la señalización que es mediada por TRAI L y el D R5 después de enlazar el TRAI L a su receptor (lo cual puede dar nuevamente como resultado un efecto sinérgico después de la señalización mediada por el DR5) . En una modalidad , el polipéptido multivalente se enlaza al DR5 con una afinidad mayor a la de una composición monovalente.

En los polipéptidos multivalentes de la invención , las secuencias de ami noácidos de la i nvención que forma las unidades de enlace pueden ser cada uno dirigido contra el mismo ep ítopo sobre el DR5 receptor, por ejemplo, un epítopo del D R5, o contra ep ítopos diferentes sobre el DR5.

En un aspecto específico de la invención, u n compuesto de la invención o un polipéptido de la invención puede tener un aumento de media vida, comparándose con la secuencia de ami noácidos correspondiente de la invención . Algunos ejemplos no limitantes de estos compuestos y los polipéptidos llegarán a q uedar más claros para la persona experta basándose en la divulgación adicional en la presente , y por ejemplo, comprenden secuencias de aminoácidos o polipéptidos de la invención que se han modificado qu ímicamente para aumentar la vida media de las mismas (por ejemplo, por medio de pegilación) ; secuencias de ami noácidos de la invención que comprenden cuando menos un sitio de enlace adicional para enlazarse a una proteína de suero (tal como albúmina de suero) ; o polipéptidos de la invención que comprenden cuando menos una secuencia de ami noácidos de la invención que se enlaza a cuando menos un fracción (y en particular cuando menos una secuencia de aminoácidos) que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos de la invención . Los ejemplos de poli péptidos de la invención que comprenden las fracciones o secuencias de aminoácidos que extienden la vida media llegarán a quedar más claros para la persona experta basándose en la divulgación adicional en la presente ; y, por ejemplo, incluyen , sin li mitación , polipéptidos en donde la una o más secuencias de aminoácidos de la invención son adecuadas enlazadas a uno o más proteínas de suero o fragmentos de las mismas (tal como (humano) albúmina de suero o fragmentos adecuados de los mismos) o a uno o más unidades de enlace que se pueden enlazar a prote ínas de suero (tales como, por ejemplo, anticuerpos de domi nio, las secuencias de ami noácidos que son adecuadas para utilizarse como un anticuerpo de dominio, los anticuerpos de un solo dominio, las secuencias de aminoácidos que son adecuadas para utilizarse como un anticuerpo de un solo dominio, (dAbs), las secuencias de aminoácidos que son adecuadas para utilizarse como un dAb, o NANOBODIESMR que se pueden enlazar a proteínas de suero tal como albúmina de suero (tal como human albúmina de suero), inmunoglobulinas de suero tal como IgG, o transferrina; se hace referencia, a la descripción y referencias adicionales mencionadas en la presente); los polipéptidos en donde una secuencia de aminoácidos de la invención se enlaza en la porción Fe (tal como una Fe humana) o una parte o fragmento adecuado de la misma; o los polipéptidos en donde la una o más secuencias de aminoácidos de la invención son adecuadas enlazado a uno o más proteínas o péptidos pequeños que se pueden enlazar a proteínas de suero (tales como, sin limitación, las proteínas y péptidos descritos en la Publicación Internacional Número WO 91/01743, Publicación Internacional Número WO 01/45746, Publicación Internacional Número WO 02/076489 y la Solicitud Provisional de Estados Unidos de Ablynx N.V. titulada "Péptidos capaces de enlazarse a proteínas de suero " de Ablynx N.V. presentada el 5 de diciembre de 2006.

En términos generales, los compuestos o polipéptidos de la invención con una mayor vida media de preferencia tienen una vida media que es cuando menos 1.5 veces, de preferencia cuando menos 2 veces, tal como cuando menos 5 veces, por ejemplo, cuando menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la vida media de la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención por sí misma. Por ejemplo, los compuestos o polipéptidos de la invención con una mayor vida media puede tener una vida media que se incrementa con más de 1 hora, de preferencia más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 ó 72 horas, comparándose con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención por sí misma.

En un aspecto preferido, pero no limitante de la invención, estos compuestos o polipéptidos de la invención tienen una vida media de suero que se incrementa con más de 1 hora, de preferencia más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 ó 72 horas, comparándose con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención por sí misma.

En otro aspecto preferido, pero no limitante de la invención, estos compuestos o polipéptidos de la invención exhiben una vida media de suero en humano de cuando menos aproximadamente 12 horas, de preferencia cuando menos 24 horas, más preferiblemente cuando menos 48 horas, todavía más preferiblemente cuando menos 72 horas o más. Por ejemplo, los compuestos o polipéptidos de la invención puede tener una vida medía de cuando menos 5 días (tal como aproximadamente 5 a 10 días), de preferencia cuando menos 9 días (tal como aproximadamente 9 a 14 días), más preferiblemente cuando menos aproximadamente 10 días (tal como aproximadamente 10 a 15 días), o cuando menos aproximadamente 11 días (tal como aproximadamente 11 a 16 días), más preferiblemente cuando menos aproximadamente 12 días (tal como aproximadamente 12 a 18 días o más), o más de 14 días (tal como aproximadamente 14 a 19 días).

En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la invención o un polipéptido de la invención (o un fragmento adecuado de los mismos). También se referirá en la presente el ácido nucleico como un "ácido nucleico de la invención" y, por ejemplo, puede ser en forma de un construcción genético, por ejemplo, un fragmento de CDR o en un vector, como se describe adicionalmente en la presente. En una modalidad, las secuencias de ácido nucleico de la invención codifican las construcciones de NB de uno o más polipéptidos que se dan a conocer en una o más de las Tablas 1 a 4. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico de la invención codifica uno o más construcciones proporcionados en las SEQ ID NOs: 1-72, 81-82 y 87-92. En una modalidad, las secuencias de ácido nucleico de la invención son codón optimizado para la expresión en las células huésped u organismos huésped de interés. En una modalidad, la optimización del codón es para la expresión en una célula de mamífero. En una modalidad, la optimización del codón es para la expresión en una célula de levadura. En una modalidad, la optimización del codón es para la expresión en E. coli.

En otro aspecto, la invención se refiere a un huésped o célula huésped que expresa (o que bajo las circunstancias adecuadas es capaz de expresar) una secuencia de aminoácidos de la invención y/o un polipéptido de la invención; y/o que contiene un ácido nucleico de la invención. Algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de estos huéspedes o células huésped llegarán a quedar más claros a partir de la descripción adicional en la presente.

La invención se refiere además a un producto o una composición que contiene, o el cual comprende cuando menos una secuencia de aminoácidos de la invención, cuando menos un polipéptido de la invención (o un fragmento adecuado del mismo), cuando menos un compuesto de la invención y/o cuando menos un ácido nucleico de la invención, y opcionalmente uno o más componentes adicionales de estas composiciones conocidos por sí mismos, es decir, dependiendo del uso que se intente de la composición. Un producto o una composición, por ejemplo, pueden ser una composición farmacéutica (como se describe en la presente), una composición veterinaria o un producto o una composición para uso de diagnóstico (como también se describen en la presente). Algunos ejemplos no limitantes de los productos o composiciones se proporcionan en la presente.

En una modalidad, la invención se refiere al uso de un construcción de NB, o de una composición que comprenda el mismo, en los métodos o composiciones para modular DR5, ya sea in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o in vivo (por ejemplo, en una sola célula o en un organismo multicelular, y en particular en un mamífero, y más particularmente, en un ser humano, tal como en un ser humano que está en riesgo que sufre de una enfermedad y los trastornos asociados con el DR5).

La invención también se refiere a métodos para modular el DR5, ya sea in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o in vivo (por ejemplo, en una sola célula, o un organismo multicelular, y en particular en un mamífero, y más particularmente, en un ser humano, tal como en un ser humano que está en riesgo o que sufre de una enfermedades y los trastornos asociados con el DR5), cuyo método comprende cuando menos el paso de poner en contacto el DR5 con cuando menos una secuencia de aminoácidos, el construcción de NB de la invención, o con una composición que comprenda los mismos, en una manera y en una cantidad adecuadas para modular el DR5, con cuando menos una secuencia de aminoácidos, construcción de NB de la invención.

La invención también se refiere al uso de una secuencia de aminoácido, construcción de NB de la invención en la preparación de una composición (tal como, sin limitación, una composición farmacéutica o preparación como se describe adicionalmente en la presente) para modular al DR5, ya sea in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o in vivo (por ejemplo, en una sola célula o en un organismo multicelular, y en particular en un mamífero, y más particularmente, en un ser humano, tal como en un ser humano que está en riesgo o que sufre de una enfermedades y los trastornos asociados con el DR5).

En el contexto de la presente invención, "modulando" o " modular" en términos generales significa cualquiera reducir o inhibir completamente la actividad de, o de una manera alternativa incrementar la actividad de, DR5, como se mide utilizando un ensayo adecuado in vitro, celular o in vivo (tal como aquéllos mencionados en la presente). En particular, "modulando" o "modular" puede significar cualquiera de reducir o inhibir completamente la actividad de, o de una manera alternativa la actividad de DR5, como se mide utilizando un ensayo adecuado in vitro, celular o in vivo (tal como aquéllos mencionados en la presente), por cuando menos el 1 por ciento, de preferencia por cuando menos el 5 por ciento, tal como por cuando menos el 10 por ciento o por cuando menos el 25 por ciento, por ejemplo, por cuando menos el 50 por ciento, por cuando menos el 60 por ciento, por cuando menos el 70 por ciento, por cuando menos el 80 por ciento, o por cuando menos el 90 por ciento o más, comparándose con la actividad del DR5 en los mismos ensayos bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la construcción de NB de la invención. En una modalidad principal, la actividad de DR5, en especial incluyendo la señalización mediada por el DR5, requiere la formación de un trímero del DR5 sobre la superficie celular. En una modalidad, una construcción de NB en la presente actúa para modular la actividad de DR5 mediante la promoción de la formación del homotrímero de DR5 y por consiguiente incrementa la iniciación mediada por DR5 de la apoptosis, por ejemplo, por medio de la senda de muerte celular extrínseca.

Como quedarán claros para la persona experta, "modulación" también puede involucrar efectuar un cambio (el cual puede ser un aumento o una disminución) en afinidad, avidez, especificidad y/o selectividad del DR5 para uno o más de sus objetivos, ligandos o sustratos; y/o efectuar un cambio (el cual puede ser un aumento o una disminución) en la sensibilidad del DR5 para una o más condiciones en el medio o alrededores en donde el DR5 está presente (tal como pH, fuerza de iones, la presencia de co-factores, etc.). comparándose con las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, construcción de NB de la invención. Como quedará claro para la persona experta, esto se puede volver a determinar de cualquier manera adecuada y/o utilizando cualquier ensayo adecuado conocido por sí mismo, tal como los ensayos descritos en la presente o las referencias citadas en la técnica en la presente.

"Modulación" también puede significar efectuar un cambio (es decir, una actividad como un agonista o como un antagonista, respectivamente) con respecto a uno o más mecanismos biológicos o fisiológicos, efectos, respuestas, funciones, vías, o actividades en donde el DR5 (o en donde su sustrato(s), ligando(s) o vía(s) están involucrados, tal como su vía señalizada o vía metabólica y sus efectos biológicos o fisiológicos asociados) están involucrados. Nuevamente, como quedará claro para la persona experta, una acción como un agonista o un antagonista se puede determinar de cualquier manera adecuada y/o utilizando cualquier ensayo adecuado (in vitro y usualmente celular o en ensayo) conocido por sí mismo, tales como los ensayos descritos en la presente o las referencias citadas en la técnica en la presente. En particular, una acción como un agonista o antagonista puede ser tal que se incremente o disminuya u na actividad biológica o fisiológica desti nada, respectivamente , por cuando menos el 1 por ciento, de preferencia por cuando menos el 5 por ciento , tal como por cuando menos el 1 0 por ciento o por cuando menos el 25 por ciento, por ejemplo, por cuando menos el 50 por ciento, por cuando menos el 60 por ciento, por cuando menos el 70 por ciento, por cuando menos el 80 por ciento , o por cuando menos el 90 por ciento o más, comparándose con la actividad biológica o fisiológica en el mismo ensayo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la construcción de NB de la invención .

Modular, por ejemplo, puede involucrar reduci r o inhibir el enlace de DR5 a uno de sus sustratos o ligandos y/o compitiendo con un ligando natural, sustrato para enlazarse al DR5. Modular también puede i nvol ucrar activar el D R5 ó el mecanismo o vía en donde esté involucrado. Modular puede ser reversible o i rreversible, pero para los propósitos farmacéuticos y farmacológicos normalmente será en una mane ra reversible.

La i nvención se refiere además a métodos para la preparación o generación de las secuencias de aminoácidos, polipéptidos , ácidos nucleicos, células huésped, productos y las composiciones descritas en la presente . Algunos ejemplos preferidos, pero no li mitantes de los métodos l legarán a quedar más claros a partir de la descripción adicional en la presente.

En términos generales, estos métodos puede comprender los pasos de: a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de las, secuencias de aminoácidos; b) detectar el conjunto colección o biblioteca de las secuencias de aminoácidos para las secuencias de aminoácidos que se pueden enlazar a y/o tienen afinidad para el DR5; y c) aislar la secuencia de aminoácidos(s) que se enlazan a y/o que tienen afinidad para el DR5.

En este método, el conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de aminoácidos puede ser cualquier conjunto, colección o biblioteca adecuada de las secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de inmunoglobulina (como se describe en la presente), tal como un conjunto, colección o biblioteca limpia de las secuencias de inmunoglobulina; un conjunto, colección o biblioteca sintética o semi-sintética de las secuencias de inmunoglobulina; y/o un conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de inmunoglobulina que se han sometido a la maduración de afinidad.

También, en este método, el conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca de los dominios variables de cadena pesada (tales como los dominios VH o los dominios VHH) O de los dominios variables de cadena l igera. Por ejemplo, el conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca de los anticuerpos de dominio o los anticuerpos de un solo domi nio, o puede ser un conjunto , colección o biblioteca de las secuencias de aminoácidos que son capaces de funcionar como u n anticuerpo de domi nio o anticuerpo de dominio individual .

En un aspecto preferido de este método, el conj unto , colección o biblioteca de las secuencias de aminoácidos puede ser un conj unto, colección o biblioteca i nmune de las secuencias de inmunoglobulina, por ejemplo , derivado a parti r de un mam ífero que se ha inm unizado de una manera adecuada con el D R5 o con un determi nado antigénico adecuado basado en el mismo o un derivado del mismo , tal como una parte , fragmento, región , domi n io, lazo , u otro ep ítopo del mismo antigénico . En un aspecto particular, el dete rmi nante antigénico puede ser una parte, región , dominio, lazo extracelular, u otros epítopos extracelulares.

En los métodos anteriores, el conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de aminoácidos se puede desplegar en un fago, fagémido, ribosoma, o micro-organismo adecuado (tal como levadura) , tal como con el objeto de facilitar la detección . Los métodos , técnicas y organismos huéspedes adecuados para desplegar y detectar (un conjunto, colección o biblioteca de) las secuencias de ami noácidos será claro para la persona experta en la materia , por ejemplo, con base en la divulgación adicional en la presente. También se hace referencia a la reseña por Hoogenboom en Nature Biotechnology, 23(9): 1105-1116 (2005).

En otro aspecto, el método para generar secuencias de aminoácidos comprende cuando menos los pasos de: a) proporcionar una colección o muestra de las células que expresan secuencias de aminoácidos; b) detectar la colección o muestras de las células para las células que expresan una secuencia de aminoácidos que se pueda enlazar a, y/o que tenga afinidad para el DR5; y c) cualquiera de (1) aislar la secuencia de aminoácidos; o (2) aislar a partir de la célula, una secuencia de ácido nucleico que codifique la secuencia de aminoácidos, seguida por expresar la secuencia de aminoácidos.

Por ejemplo, cuando la secuencia de aminoácidos deseada es una secuencia de inmunoglobulina, la colección o muestra de las células, por ejemplo, pueden ser una colección o muestra de células-B. También, en este método, la muestra de las células se pueden derivar a partir de un mamífero que se ha inmunizado de una manera adecuada con el DR5 o con un determinante antigénico adecuado basado en lo mismo o derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, lazo antigénico, u otro epítopo de los mismos. En un aspecto particular, el determinante antigénico puede ser una parte, región, domino, lazo extracelular, u otros epítopos extracelulares.

El método anterior se puede llevar a cabo de cualquier manera adecuada, como quedará claro para la persona experta. Se hace referencia, por ejemplo, a la Patente Europea Núme ro EP 0 542 81 0 , y a las Publ icaciones I nternacionales Números WO 05/1 9824, WO 04/051 268 y WO 04/1 06377. La detección del paso b) de preferencia se realiza utilizando una técnica de citometría de fl ujo, tal como FACS . Para esto , se hace referencia, por ejemplo, a Lieby y colaboradores, Blood, 97( 12) , 3820 (2001 ) .

En otro aspecto, el método para generar una secuencia de aminoácidos di rigida contra el D R5 puede comprender cuando menos los pasos de : a) proporcionar un conj unto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos q ue codifique secuencias de aminoácidos; b) rastrear el conjunto , colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos para determi nar las secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen una secuencia de aminoácidos que se pueda enlazar a, y/o que tenga afinidad por el DR5; y c) aislar la secuencia de ácido nucleico mencionada, seguido por la expresión de esta secuencia de aminoácidos.

En este método, el conjunto, la colección o la biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos, por ejemplo, puede ser un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen un conjunto, colección o biblioteca limpia de las secuencias de inmunoglobuli na; un conj unto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un conjunto, colección o biblioteca sintética o semi-sintética de las secuencias de inmunoglobulina; y/o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de inmunoglobulina que se han sometido a maduración de afinidad.

También, en este método, el conjunto, la colección o la biblioteca de las secuencias de ácidos nucleicos puede codificar un conjunto, colección o biblioteca de dominios variables de cadena pesada (tales como los dominios VH o los dominios VHH) o de dominios variables de cadena ligera. En un ejemplo, el conjunto, la colección o la biblioteca de las secuencias de ácidos nucleicos codifica un conjunto, colección o biblioteca de anticuerpos de dominio o de anticuerpos de un solo dominio, o un conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de aminoácidos que son capaces de funcionar como un anticuerpo de dominio o un anticuerpo de un solo dominio.

En un aspecto de este método, el conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de las secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, derivadas a partir de un mamífero que se haya inmunizado adecuadamente con el DR5 o con un determinante antigénico adecuado basado en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, lazo antigénico u otro epítopo de los mismos. En un aspecto particular, el determinante antigénico puede ser una parte, región, domino, lazo extracelular, u otros epítopos extracelulares.

El conjunto, la colección o la biblioteca de las secuencias de ácidos nucleicos por ejemplo, puede codificar un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de dominios variables de cadena pesada o de dominios variables de cadena ligera. En un aspecto específico, el conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de nucleótidos puede codificar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias VHH- En los métodos anteriores, el conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de nucleótidos se puede exhibir sobre un fago, fagémido, ribosoma, o microorganismo adecuado (tal como levadura), tal como con el objeto de facilitar el rastreo. Los métodos, técnicas y organismos huésped adecuados para exhibir y rastrear (un conjunto, colección o biblioteca de) secuencias de nucleótidos que codifiquen secuencias de aminoácidos estarán claros para la persona experta en este campo, por ejemplo, con base en la divulgación adicional en la presente. También se hace referencia a la reseña por Hoogenboom en Nature Biotechnology, 23(9): 1105-1116 (2005).

La invención también se refiere a las secuencias de aminoácidos que se obtienen mediante los métodos anteriores, o de una manera alternativa, mediante un método que comprenda uno de los métodos anteriores, y en adición, cuando menos los pasos de determinar la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos de la secuencia de ¡nmunoglobulina; y de expresar o sintetizar esta secuencia de aminoácidos de una manera conocida, tal como mediante la expresión en una célula huésped o un organismo huésped adecuado o mediante s íntesis qu ímica.

También , siguiendo los pasos anteriores, una o más secuencias de ami noácidos de la invención se pueden humanizar adecuadamente (o de una manera alternativa, se pueden camelizar) ; y/o las secuencias de aminoácidos obtenidas de esta manera se pueden enlazar unas a otras o a una o más secuencias de ami noácidos adecuadas diferentes (opcionalmente por medio de uno o más enlazadores adicionales) , como para proporcionar un polipéptido de la invención . También , una secuencia de ácido nucleico que codifique una secuencia de aminoácidos de la invención se puede humanizar adecuadamente (o de una manera alternativa, se puede camelizar) , y de una manera adecuada se puede expresar; y/o una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen u na secuencia de ami noácidos de la invención, se pueden enlazar unas a otras o a una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen otras secuencias de ami noácidos adecuadas (opcionalmente por medio de secuencias de nucleótidos que codifiquen uno o más enlazadores adicionales) , después de lo cual , la secuencia de nucleótidos obtenida de esta manera se puede expresar adecuadamente como para proporcionar un polipéptido de la invención .

La invención se refiere además a las aplicaciones y usos de las secuencias de am i noácidos , los compuestos , las construcciones, polipéptidos , ácidos nucleicos, cél ulas huésped , productos y las composiciones descritas en la presente , así como a los métodos para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y los trastornos asociados con el D R5. Algu nas aplicaciones y usos no limitantes preferidos llegarán a quedar más claros a parti r de la descripción adicional en la presente.

En una modalidad, la invención se refiere a las secuencias de aminoácidos, los compuestos, las construcciones , polipéptidos , ácidos nucleicos, células huésped , productos y las composiciones descritas en la presente , para utilizarse en la terapia de una enfermedad o trastorno.

En una modalidad, la invención se refiere a una o más de las secuencias de am i noácidos , los compuestos, las construcciones, polipéptidos, ácidos nucleicos , células huésped , productos y las composiciones descritas en la presente, para utilizarse en la terapia de un sujeto en riesgo de, o que padezca de, una enfermedad o trastorno que se pueda preveni r o tratar mediante la adm inistración, al sujeto que lo necesite , de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una secuencia de aminoácidos , compuesto, construcción o polipéptido, como se describe en la presente como un agente NB o construcción de N B .

En una modalidad, la invención se refiere a las secuencias de aminoácidos, los compuestos, las construcciones, polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped , productos y las composiciones descritas en la presente , para utilizarse en la terapia de las enfermedades y los trastornos asociados con el DR5.

Otros aspectos, modalidades, ventajas y aplicaciones de la invención llegarán a quedar más claros a partir de la descripción adicional en la presente, en donde la invención se describe y se discute con mayor detalle.

En ciertas modalidades, las variantes VHH de los agentes NB de la invención, en términos generales, ofrecen ciertas ventajas (ilustradas en la presente) comparándose con los "dAbs" o anticuerpos de dominio (individuales) similares o secuencias de inmunoglobulina, cuyas ventajas también son proporcionadas por las composiciones de la invención. Sin embargo, estará claro para la persona experta que también se pueden aplicar los aspectos más generales de la enseñanza que se encuentran más adelante (ya sea directamente o de una manera análoga) a otras secuencias de aminoácidos de la invención.

Definiciones En la presente descripción, ejemplos y reivindicaciones, se aplican en general las siguientes definiciones, a menos que se indique de otra manera. Como se utiliza más adelante y a través de todo el texto, el uso de un término o frase en el singular significa que incorpora el significado del plural, y viceversa, a menos que se observe de otra manera o que sea evidente a través del contexto.

A menos que se indiquen o se definan de otra manera, todos los términos empleados tienen su significado usual en la técnica, los cuales quedarán claros para la persona experta. Se hace referencia, por ejemplo, a los libros de texto convencionales, tales como Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2a Edición), Volúmenes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel y colaboradores, Editores, "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wíley Interscience, Nueva York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., (1985); Oíd y colaboradores, "Principies of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", Segunda Edición, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt y colaboradores, "Immunology" (6a Edición), Mosby/Elsevier, Edimburgo (2001); Roitt y colaboradores, Roitt's Essential Immunology, 10a Edición, Blackwell Publishing, Reino Unido (2001); y Janeway y colaboradores, "Immunobiology" (6a Edición), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, Nueva York (2005), así como a la técnica antecedente general citada en la presente. Las referencias adicionales incluyen, por ejemplo, las siguientes reseñas: Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56; Levin y Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving y colaboradores, J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz y colaboradores, Placenta, 2000, 21 Suplemento A, S106-12, Gonzales y colaboradores, Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43, los cuales describen técnicas para el diseño de proteínas, tales como maduración de afinidad y otras técnicas para mejorar la especificidad y otras propiedades deseadas de las proteínas, tales como las inmunoglobulinas.

A menos que se indique de otra manera, se cree que todos los métodos, pasos, técnicas y manipulaciones que no se describan específicamente con detalle, se pueden llevar a cabo y se han llevado a cabo de una manera conocida por sí misma, y quedarán claros para la persona experta. Nuevamente se hace referencia, por ejemplo, a los libros de texto convencionales y a la técnica antecedente general mencionada en la presente, y a las referencias adicionales citadas en los mismos. Los residuos de aminoácidos se indicarán de acuerdo con el código estándar de aminoácidos de tres letras o de una letra, como es proporcionado por las Tablas de Códigos de IUPAC.

A menos que se indique de otra manera, el término "secuencia de inmunoglobulina", utilizado en la presente para referirse a un anticuerpo de cadena pesada o a un anticuerpo de cuatro cadenas convencional, se utiliza como un término general para incluir tanto el anticuerpo de tamaño completo, las cadenas individuales del mismo, así como todas las partes, dominios o fragmentos de las mismas (incluyendo, pero no limitándose a, dominios o fragmentos de enlace de antígeno, tales como dominios VHH O dominios VH/VL, respectivamente).

El término "secuencia", como se utiliza en la presente (por ejemplo en términos como "secuencia de inmunoglobulina", "secuencia de anticuerpo", "secuencia de dominio variable", "secuencia de sdAb", "secuencia VH", "secuencia VHH" O "secuencia de proteína"), se utiliza en general para incluir tanto la secuencia de aminoácidos relevante, así como las secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de n ucleótidos que codifican las mismas , a menos q ue el contexto requiera una interpretación más limitada.

A menos q ue se indique de otra manera, los términos "secuencia de nucleótidos" y "ácido nucleico" , en términos generales , se utilizan de una manera i ntercambiable para referi rse a un pol ímero de ácidos desoxi rribonucleicos (ADN) o de ácidos ribonucleicos (AR N) , a menos que el contexto requiera u na interpretación más l imitada.

Para los propósitos de comparar dos o más secuencias de nucleótidos, el porcentaje de "identidad de secuencia" entre una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos se puede calcular o determinar, por ejemplo, tomando el número de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos q ue sean idénticos a los nucleótidos en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de n ucleótidos , dividiendo ese número entre el número total de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos y entonces multiplicando por el 1 00 por ciento . Cada supresión , inserción , sustitución o adición de un nucleótido en la segunda secuencia de nucleótidos - cuando se compara con la pri mera secuencia de nucleótidos - se considera como una diferencia en la posición de un solo nucleótido. Un experto en este campo también puede utilizar un algoritmo o una técnica de computación adecuada, tal como, por ejemplo, NCBI Blast v2.0, uti lizando las posiciones convencionales .

Con respecto a la estructu ra 1 ( FR 1 ) , debe quedar claro para la persona experta que, para determinar el grado de identidad de aminoácidos, de preferencia no se consideran los residuos de aminoácidos en las posiciones 1 a 4 y 27 a 30.

En una modalidad, en la determinación del grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos, la persona experta puede tomar en cuenta las denominadas como sustituciones de aminoácidos "conservadoras". Las sustituciones conservadoras son conocidas en la técnica, y son las sustituciones en donde un aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido dentro del mismo grupo, que tienen una propiedad común. Los grupos de aminoácidos conservados y sus propiedades comunes son como siguen: (a) residuos pequeños al if áticos , no polares, o ligeramente polares, incluyendo Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (b) residuos polares negativamente cargados y sus amidas (no cargadas), incluyendo Asp, Asn, Glu y Gln; (c) residuos polares positivamente cargados, incluyendo His, Arg y Lys; (d) residuos no polares grandes alifáticos, incluyendo Met, Leu, He, Val y Cys; y (e) residuos aromáticos, incluyendo Phe, Tyr y Trp.

Las sustituciones conservadoras particularmente preferidas son como siguen: Ala en Gly o en Ser; Arg en Lys; Asn en Gln o en His; Asp en Glu; Cys en Ser; Gln en Asn; Glu en Asp; Gly en Ala o en Pro; His en Asn o en Gln; Me en Leu o en Val; Leu en Me o en Val; Lys en Arg, en Gln o en Glu; Met en Leu, en Tyr o en Me; Phe en Met, en Leu o en Tyr; Ser en Thr; Thr en Ser; Trp en Tyr; Tyr en Trp; y/o Phe en Val, en lie o en Leu.

Cualesquiera sustituciones de aminoácidos aplicadas a los polipéptidos descritos en la presente también se pueden basar en el análisis de las frecuencias de variaciones de aminoácidos entre proteínas homologas de diferentes especies desarrolladas por Schuiz y colaboradores, Principies of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, sobre los análisis de potenciales formadores de estructura desarrollados por Chou y Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 y Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, y sobre el análisis de los patrones de hidrofobicidad en proteínas desarrollado por Eisenberg y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. ELI A 81: 140-144, 1984; Kyte y Doolittle; J olec. Biol. 157: 105-132, 198 1, y Goldman y colaboradores, Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986. La información sobre la estructura primaria, secundaria y terciaria de las construcciones VHH de camélido se da en la técnica antecedente general citada anteriormente, y la estructura del cristal de esta construcción VHH de una llama es dada, por ejemplo, por Desmyter y colaboradores, Nature Structural Biology, Volumen 3, 9, 803 (1996); Spinelli y colaboradores, Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; y Decanniere y colaboradores, Structure, Volumen 7, 4, 361 (1999). Se puede encontrar mayor información acerca de algunos de los residuos de aminoácidos que, en los dominios VH convencionales, forman la interfase VH/VL y las sustituciones de camelización potenciales sobre estas posiciones, en la técnica citada anteriormente.

Se dice que las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ácidos nucleicos son "exactamente iguales" si tienen el 100 por ciento de identidad de secuencia sobre toda su longitud.

Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, el término "diferencia de aminoácido" se refiere a una inserción, supresión o sustitución de un solo residuo de aminoácido en una posición de la primera secuencia, comparándose con la segunda secuencia; siendo entendido que dos secuencias de aminoácidos pueden contener una, dos o más de esas diferencias de aminoácidos.

Cuando se dice que una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos "comprende" otra secuencia de nucleótidos u otra secuencia de aminoácidos, respectivamente, o "consiste esencialmente en otra secuencia de nucleótidos u otra secuencia de aminoácidos, esto significa, en términos generales, que la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos primeramente mencionada tiene, dentro de su secuencia, un estiramiento de nucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente, que tiene la misma secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, respectivamente, que esta última secuencia, sin importar la manera en que se haya generado u obtenido realmente la primera secuencia mencionada (la cual, por ejemplo, puede ser mediante cualquier método adecuado descrito en la presente).

El término "en una forma esencialmente aislada" significa que una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos se separa de cuando menos otro componente con el que esté usualmente asociada en una fuente o medio, comparándose con su fuente biológica nativa y/o el medio de reacción o medio de cultivo a parti r del cual se haya obtenido . El "cuando menos otro componente" puede ser otro ácido nucleico, otra proteína/polipéptido, otro componente biológico o macromolécula, o cuando menos un contaminante, impureza o componente menor. En una modal idad , una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos se considera "esencialmente aislada" cuando se ha pu rificado cuando menos 2 veces, en particular cuando menos 1 0 veces , más particularmente, cuando menos 1 00 veces , y hasta 1 000 veces o más . U na secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos que está "en una forma esencialmente aislada" es de preferencia esencialmente homogénea, como se determine empleando una técnica adecuada, tal como una técnica cromatográfica adecuada, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida.

Los términos "domi nio" y "dominio de enlace" , como se utiliza en la presente, se refiere en términos generales a una región globular de una cadena de anticue rpo, y en particular a una región globular de un anticuerpo de cadena pesada, o a un polipéptido que esencialmente consiste en esa región globular. Usualmente , este dominio comprenderá lazos peptídicos (por ejemplo 3 ó 4 lazos peptídicos) estabil izados , por ejemplo, como una hoja o mediante enlaces de disulfuro.

Los términos "determinante antigénico" y "epítopo", los cuales también se pueden utilizar de una manera intercambiable en la presente, se refieren al epítopo sobre el antígeno reconocido por la molécula de enlace de antígeno (tal como una construcción de NB de la invención), y más particularmente, por el sitio de enlace de antígeno de dicha molécula.

Una secuencia de aminoácidos (tal como una construcción de NB de la invención, una construcción VHH O Vh, un anticuerpo, o en términos generales una proteína o polipéptido de enlace de antígeno o un fragmento de los mismos) que se puede enlazar (de una manera específica) a, que tiene afinidad por, y/o que tiene especificidad para, un determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína particular (o por cuando menos una parte, fragmento o epítopo de los mismos), se dice que está "contra" o "dirigido contra" ese determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína.

El término "especificidad" , como se menciona en la presente, se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o determinantes antigénicos con los que se puede enlazar una molécula de enlace de antígeno o una proteína de enlace de antígeno particular (tal como una construcción de NB de la invención). La especificidad de una proteína de enlace de antígeno se puede determinar basándose en la afinidad y/o avidez. Típicamente, las proteínas de enlace de antígeno (tales como la construcción de NB de la invención) se enlazarán a su antígeno con una constante de disociación (KD) de 10"5 a 10'12 moles/litro o menos, y de preferencia de 10"7 a 10"12 moles/litro o menos, y de una manera muy preferible de 10"8 a 10"12 moles/litro (es decir, con una constante de disociación (KA) de 105 a 1012 litros/moles o más, y de preferencia de 107 a 1012 litros/moles o más, y de una manera muy preferible de 108 a 1012 litros/moles). Cualquier valor KD mayor de 104 moles/litro (o cualquier valor KA menor de 104 M"1) litros/moles, se considera en general que indica un enlace no específico. De preferencia, una construcción de NB de la invención se enlazará a su antígeno deseado con una afinidad menor de 500 nM, de preferencia menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. "Un enlace específico" de una proteína de enlace de antígeno a un antígeno o determinante antigénico se puede determinar de cualquier manera adecuada conocida por sí misma, incluyendo, por ejemplo, análisis de Scatchard y/o ensayos de enlace competitivo, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA), y ensayos competitivos de emparedado, y las diferentes variantes de los mismos conocidas por sí mismas en la materia; así como las otras técnicas mencionadas en la presente.

"Afinidad", representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de enlace de antígeno (KD), es una medida para la fuerza de enlace entre un determinante antigénico y un sitio de enlace de antígeno sobre la proteína de enlace de antígeno: mientras menor sea el valor de la KD, mayor será la fuerza de enlace entre un determinante antigénico y la molécula de enlace de antígeno (de una manera alternativa, la afinidad también se puede expresar como la constante de afinidad (KA), la cual es 1 /KD) . Como quedará claro para la persona experta, la afi nidad se puede determinar de una manera conocida por s í misma, dependiendo del antígeno específico de interés.

"Avidez" es la medida de la fuerza de enlace entre una molécula de enlace de antígeno (tal como una construcción de N B de la invención) , y el antígeno pertinente . La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre u n determinante antigénico y su sitio de enlace de antígeno sobre la molécula de enlace de antígeno, como con el número de sitios de enlace pertinentes presentes sobre la molécula de enlace de antígeno.

La constante de disociación puede ser la constante de disociación real o aparente . Los métodos para determinar la constante de disociación son conocidos en la materia.

La frase "se enlaza específicamente" o "se enlaza selectivamente", cuando se utilizan en el contexto de describi r la inte racción entre un antígeno (por ejemplo , una prote ína) , y u na construcción de N B, o un fragmento funcional de la misma, por ejemplo, que tiene las regiones determi nantes de complementariedad (C DRs) dadas a conocer en la estructu ra de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o agente de enlace derivado de anticuerpo, se refiere a una reacción de enlace que es determinante de la presencia del antígeno en una población homogénea de prote ínas y otros productos biológicos, por ejemplo, en una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de sangre , suero , plasma o tej ido. Por consiguiente, bajo ciertas condiciones de i nmunoensayo diseñadas, la construcción de NB, los anticuerpos, o los agentes de enlace con una especificidad de enlace particular, se enlazan a un antígeno particular cuando menos dos veces el fondo y no se enlazan sustancialmente en una cantidad significativa a otros antígenos presentes en la muestra. En una modalidad, bajo las condiciones de inmunoensayo diseñadas , la construcción de NB, el anticuerpo, o los agentes de enlace con una especificidad de enlace particular, se enlazan a un antígeno particular cuando menos diez (1 0) veces el fondo, y no se enlazan sustancialmente en una cantidad significativa a otros antígenos presentes en la muestra. Un enlace específico para una construcción de NB, un anticuerpo, o un agente de enlace , bajo estas condiciones , puede requeri r que la construcción de NB, el anticuerpo, o el agente de enlace se haya seleccionado por su especificidad por u na proteína particular. Como se desee o según sea apropiado , esta selección se puede lograr sustrayendo las construcciones de NB o los anticuerpos q ue reaccionan cruzadamente con , por ejemplo, las moléculas de DR5 a parti r de otras especies (por ejemplo, de ratón o de rata) u otros pol ipéptidos que son miembros o subtipos de la familia del Receptor de M uerte. De una manera alternativa, en algunas modalidades, se seleccionan construcciones de N B, anticuerpos , o fragmentos de anticuerpos que reaccionan cruzadamente con ciertas moléculas deseadas .

Se pueden uti l izar una variedad de formatos de inm unoensayo para seleccionar las construcciones de N B que sean específicamente inmuno-reactivas con una proteína particular. Por ejemplo, los ¡nmunoensayos ELISA en fase sólida se utilizan rutinariamente para seleccionar anticuerpos específicamente inmuno-reactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998), para una descripción de los formatos de inmunoensayo y las condiciones que se pueden utilizar para determinar la inmuno-reactividad específica), y de la misma manera se pueden utilizar para construir análisis de enlace de NB. Típicamente, una reacción de enlace específico o selectivo producirá una señal cuando menos dos veces sobre la señal del fondo, y más típicamente cuando menos de 10 a 100 veces sobre el fondo. En adición a la constante de afinidad (KA) descrita en la presente, una construcción de NB de enlace de DR5 de la invención típicamente también tiene una constante de índice de disociación (KD) (kdesactivado/kactivado) menor de 5 x 10"2M, menor de 10"2M, menor de 5x10'3M, menor de 10"3M, menor de 5 x 10"4M, menor de 10'4M, menor de 5 x 10~5M, menor de 10"5M, menor de 5 x 10'6M, menor de 10"6M, menor de 5 x 10"7M, menor de 10"7M, menor de 5 x 10'8M, menor de 10"8M, menor de 5 x 10"9M, menor de 10"9M, menor de 5 x 10"10M, menor de 10"10M, menor de 5 x 10"11M, menor de 10"11M, menor de 5 x 10"12M, menor de 10"12M, menor de 5 x 10"13M, menor de 10" 3M, menor de 5 x 10"1 M, menor de 10"14M, menor de 5 x 10"15M, o menor de 10'15M o más baja, y se enlaza al DR5 con una afinidad que es cuando menos dos veces mayor que su afinidad para enlazarse a un antígeno no específico (por ejemplo, albúmina de suero humano "HSA").

La vida media de una secuencia de aminoácidos, compuesto, o polipéptido de la invención, se refiere en términos generales al tiempo que se necesita para que se reduzca la concentración de la construcción en suero por el 50 por ciento, in vivo, por ejemplo, debido a la degradación de la secuencia o del compuesto, y/o a la eliminación o el secuestro de la secuencia o del compuesto mediante mecanismos naturales. La vida media in vivo de una secuencia de aminoácidos, compuesto, o polipéptido de la invención, se puede determinar de cualquier manera conocida por sí misma, tal como mediante análisis farmacocinético. Las técnicas adecuadas estarán claras para la persona experta en este campo. La vida media se puede expresar utilizando parámetros tales como el t1 2-alfa, ti/2-beta y el área debajo de la curva (AUC). Véase la parte experimental más adelante, más los libros de texto convencionales, tales como Kenneth y colaboradores, Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, y Peters y colaboradores, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996); Gibaldi y Perron, "Pharmacokinetics", publicado por Marcel Dekker, 2a Revisión. Edición (1982). Los términos "aumentan su vida media" o "mayor vida media" se refieren a un aumento en el ti/2-beta, ya sea con o sin un aumento en el ti/2-alfa y/o la AUC o ambos.

"Las enfermedades y los trastornos asociados con el DR5" son como se definen anteriormente, y a través de toda la memoria descriptiva, por ejemplo, en los párrafos anteriores. Aunque no está limitado por la teoría, se cree que el mecanismo de acción del DR5 en estas enfermedades y/o trastornos es como se dispone, por ejemplo, en los párrafos anteriores. Los ejemplos no limitantes de las enfermedades y los trastornos asociados con el DR5 contemplados, son como se proporcionan a través de toda la memoria descriptiva, incluyendo, por ejemplo, en los párrafos anteriores, y otros pueden llegar a ser evidentes para un experto en este campo basándose en las enseñanzas proporcionadas en la presente.

En el contexto de la presente invención, "modulando" o "modular", en términos generales, significa ya sea reducir o inhibir la actividad de, o de una manera alternativa aumentar la actividad de, un objetivo o antígeno, como se mide utilizando un ensayo in vitro, celular, o in vivo adecuado. En particular, "modulando" o "modular" puede significar ya sea reducir o inhibir la actividad de, o de una manera alternativa aumentar una actividad biológica (relevante o pretendida) de, un objetivo o antígeno, como se mide utilizando un ensayo in vitro, celular, o in vivo adecuado (el cual usualmente dependerá del objetivo o antígeno involucrado), por cuando menos el 1 por ciento, de preferencia por cuando menos el 5 por ciento, tal como por cuando menos el 10 por ciento, o por cuando menos el 25 por ciento, por ejemplo, por cuando menos el 50 por ciento, por cuando menos el 60 por ciento, por cuando menos el 70 por ciento, por cuando menos el 80 por ciento, o por cuando menos el 90 por ciento o más, comparándose con la actividad del objetivo o antígeno en el mismo ensayo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la construcción de la invención.

Como quedará claro para la persona experta , la "modulación" tambi én puede i nvol ucrar efectuar u n cambio (el cual puede ser ya sea un aumento o bien una disminución) en la afinidad , avidez, especificidad y/o selectividad de un objetivo o antígeno para uno o más de sus ligandos, componentes de enlace, componentes para asociación en una forma homo-multimérica o hetero-multimérica, o sustratos; y/o efectuar un cambio (el cual puede ser ya sea un aumento o bien una disminución) en la sensibilidad del objetivo o antígeno para uno o más condiciones en el medio o en los al rededores en donde esté presente el objetivo o el antígeno (tales como p H , concentración iónica, la presencia de co-factores , etc.) . comparándose con las mismas condiciones pero sin la presencia de la construcción de la i nvención . Como quedará claro para la persona experta , esto nuevamente se puede determinar de cualquier manera adecuada y/o utilizando cualquier ensayo adecuado conocido por sí mismo, dependiendo del objetivo o ant ígeno invol ucrado .

En una modalidad, "modulación" también puede significar efectuar un cambio (es deci r, una actividad como un agente neutralizante , como un agonista, como un antagonista, o como un agonista inverso, respectivamente , dependiendo del objetivo o antígeno y del efecto biológico o fisiológico deseado) con respecto a uno o más mecanismos biológicos o fisiológicos, efectos , respuestas, funciones, sendas o actividades en donde esté invol ucrado el objetivo o antígeno (o en donde estén involucrados sus sustratos, ligandos o sendas, tales como su senda de señalización o su senda metabólica, y sus efectos biológicos o fisiológicos asociados). Como quedará claro para la persona experta, esta acción como un agente neutralizante, como un agonista o un antagonista se puede determinar de cualquier manera adecuada y/o utilizando cualquier ensayo adecuado (in vitro y usualmente celular o en un ensayo) conocido por sí mismo, dependiendo del objetivo o antígeno involucrado. En particular, una acción como un agonista o antagonista puede ser tal que se aumente o se disminuya una actividad biológica o fisiológica pretendida, respectivamente, por cuando menos el 1 por ciento, de preferencia por cuando menos el 5 por ciento, tal como por cuando menos el 10 por ciento, o por cuando menos el 25 por ciento, por ejemplo, por cuando menos el 50 por ciento, por cuando menos el 60 por ciento, por cuando menos el 70 por ciento, por cuando menos el 80 por ciento, o por cuando menos el 90 por ciento o más, comparándose con la actividad biológica o fisiológica en el mismo ensayo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la construcción de la invención.

La modulación puede involucrar, por ejemplo, la modulación aloestérica del objetivo o antígeno; y/o reducir o inhibir el enlace del objetivo o antígeno a uno de sus sustratos o ligandos, y/o competir con un ligando natural o sustrato por el enlace al objetivo o antígeno. La modulación también puede involucrar activar el objetivo o antígeno o el mecanismo o la senda en donde esté involucrado. La modulación también puede involucrar, por ejemplo, efectuar un cambio con respecto al pliegue o la confirmación del objetivo o antígeno, o con respecto a la capacidad del objetivo o antígeno para plegarse, para cambiar su confirmación (por ejemplo, después de enlazarse a un ligando), para asociarse con otras (sub)unidades, o para disociarse. La modulación puede involucrar, por ejemplo, efectuar un cambio en la capacidad del objetivo o antígeno para transportar otros compuestos o para servir como un canal para otros compuestos (tales como iones).

La modulación puede ser reversible o irreversible, pero para los propósitos farmacéuticos y farmacológicos, usualmente será de una manera reversible.

Con respecto a un objetivo o antígeno, el término "sitio de interacción" sobre el objetivo o antígeno significa un sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio o estiramiento de los residuos de aminoácidos sobre el objetivo o antígeno que es un sitio para enlazarse a un ligando, receptor u otro componente de enlace, un sitio catalítico, un sitio de disociación, un sitio para la interacción aloestérica, un sitio involucrado en la multimerización (tal como homomerización o heteromerización) del objetivo o antígeno; o cualquier otro sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio o estiramiento de los residuos de aminoácidos sobre el objetivo o antígeno que esté involucrado en una acción o un mecanismo biológico del objetivo o antígeno. En términos más generales, un "sitio de interacción" puede ser cualquier sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio o estiramiento de los residuos de aminoácidos sobre el objetivo o antígeno con el que se puede enlazar una secuencia de aminoácidos o polipéptido de la invención , de tal manera que el se modula el objetivo o antígeno (y/o cualquier senda, interacción , señalización , mecanismo biológico o efecto biológico en donde está i nvolucrado el objetivo o antígeno) .

Se dice que una secuencia de aminoácidos o de polipéptido es "específica para" un prime r objetivo o antígeno comparándose con un segundo objetivo o antígeno cuando que se enlaza al primer antígeno con una afinidad (como se describe anteriormente , y se expresa de una manera adecuada como un valor KD , u n valor KA, un índice Kd esacti vad 0 y/o un índice Kact¡vad0) que es cuando menos 1 0 veces, tal como cuando menos 1 00 veces, y de preferencia cuando menos 1 ,000 veces , y hasta 1 0,000 veces o más, mejor que la afi nidad con que se enlaza la secuencia de aminoácidos o polipéptido al segundo objetivo o polipéptido. Por ejemplo, el primer antígeno se puede enlazar al objetivo o antígeno con un valor KD que es cuando menos 1 0 veces menor, por ejemplo , cuando menos 1 00 veces menor, y de preferencia cuando menos 1 ,000 veces menor, tal como 1 0,000 veces menor, o incluso una diferencia de veces mayor que el KD con que se enlaza la secuencia de aminoácidos o el pol ipéptido al segundo objetivo o polipéptido. En una modalidad, cuando una secuencia de aminoácidos o polipéptido es "espec ífica para" un primer objetivo o antígeno comparándose con un segundo objetivo o antígeno, se dirige contra el primer objetivo o antígeno, pero no se di rige contra el segundo objetivo o antígeno.

Los té rminos "bloquear cruzadamente", "bloqueado cruzadamente" y " bloqueando cruzadamente" se utilizan indisti ntamente en la presente, para significar la capacidad de una secuencia de aminoácidos u otros agentes de enlace (tal como un polipéptido de la i nvención) para interferi r con el enlace de otras secuencias de am i noácidos o con los agentes de enlace de la invención para un objetivo dado. El grado hasta el cual una secuencia de ami noácidos u otros agentes de enlace de la invención son capaces de i nterferi r con el en lace de otros al D R5 , y por consiguiente , si se puede deci r que tienen un bloqueo cruzado de acuerdo con la invención , se puede determinar empleando ensayos de enlace competitivo . U n ensayo cuantitativo adecuado en particular utiliza una máquina Biacore que puede medir el grado de interacciones utilizando tecnolog ía de resonancia de plasmón superficial . Otro ensayo de bloq ueo cruzado cuantitativo adecuado utiliza una aproximación basada en ELI SA para medi r la competición entre la secuencia de ami noácidos y otros agentes de enlace en términos de su enlace al objetivo.

Un ensayo adecuado para determinar si una secuencia de aminoácidos u otro agente de enlace bloquea cruzadamente o es capaz de bloquear cruzadamente de acuerdo con la invención es un ensayo Biacore de ejemplo o un ensayo ELI SA de ejemplo .

Se dice que una secuencia de aminoácidos es de "reacción cruzada" para dos dife rentes antígenos o determi nantes antigénicos (tales como albú mina de suero a parti r de dos diferentes especies de mam ífero, tales como albúmina de suero humano y albúmina de suero de ci nomolgo) , si es específica para estos diferentes antígenos o determinantes antigénicos .

Un enlace que es "esencialmente independiente del pH" significa en general en la presente que la constante de asociación (KA) de la secuencia de aminoácidos con respecto a la prote ína de suero (tal como la albúmina de suero) en valores de pH q ue se presentan en una célula de un animal o de un cuerpo humano (como se describe adicionalmente en la presente) , es cuando menos del 5 por ciento, tal como de cuando menos el 1 0 por ciento, de preferencia de cuando menos el 25 por ciento, más preferiblemente de cuando menos el 50 por ciento, todavía más preferiblemente de cuando menos el 60 por ciento, tal como todavía más preferiblemente de cuando menos el 70 por ciento, tal como de cuando menos el 80 por ciento, o de cuando menos el 90 por ciento o más (o inclusive más del 1 00 por ciento, tal como más del 1 1 0 por ciento , más del 1 20 por ciento, o i ncluso el 1 30 por ciento o más , o inclusive más del 1 50 por ciento, o incluso más del 200 por ciento) de la constante de asociación (KA) de la secuencia de aminoácidos con respecto a la misma prote ína de suero en valores de pH que se presentan fuera de esta célula. De una manera alternativa, un enlace que es "esencialmente independiente del pH" significa en general en la presente que el índice kd e Sact¡ vado (medido mediante Biacore -véase, por ejemplo, el Experimento 2) de la secuencia de aminoácidos con respecto a la proteína de suero (tal como albúmi na de suero) en valores de pH que se presentan en una célula de un animal o de un cuerpo humano (como se describen , por ejemplo, adicional mente en la presente, por ejemplo , un pH de al rededor de 5.5, por ejemplo, de 5.3 a 5.7), es de cuando menos el 5 por ciento, tal como de cuando menos el 1 0 por ciento, de preferencia de cuando menos el 25 por ciento , más preferiblemente de cuando menos el 50 por ciento , todavía más preferiblemente de cuando menos el 60 por ciento , tal como todavía más preferiblemente de cuando menos el 70 por ciento, tal como de cuando menos el 80 por ciento , o de cuando menos el 90 por ciento o más (o inclusive más del 1 00 por ciento, tal como más del 1 1 0 por ciento , más del 120 por ciento, o incluso el 1 30 por ciento o más , o inclusive más del 1 50 por ciento, o inclusive más del 200 por ciento) del índice kd esactivado de la secuencia de aminoácidos con respecto a la misma prote ína de suero en valores de pH que se presentan fuera de esta célula , por ejemplo, pH de 7.2 a 7.4. "Los valores de pH que se presentan en una célula de un animal o de un cuerpo humano" significan los valores de p H que pueden presentarse dentro de una célula, y en particular dentro de una célula que está i nvolucrada en el reciclaje de la prote ína de suero. En particular, "los valores de pH que se presentan en una célula de un animal o de un cuerpo humano" significan los valores de pH que se pueden presentar dentro de un comparti miento o vesícula (sub)celular que está involucrada en el reciclaje de la proteína de suero (por ejemplo , como un resultado de la pinocitosis, endocitosis, transcitosis, exocitosis y fagocitosis, o un mecanismo similar de absorción o internalización en esta cél ula) , tal como un endosoma, lisosoma o pinosoma.

Como se describe adicionalmente en la presente, el número total de los residuos de aminoácidos en una construcción de NB puede estar en la región de 110 a 120, es de preferencia 112-115, y es más preferiblemente 113. Sin embargo, se debe observar que las partes, fragmentos, análogos o derivados (como se describen adicionalmente en la presente) de una construcción de NB no están limitados en particular con respecto a su longitud y/o tamaño, siempre que tales partes, fragmentos, análogos o derivados satisfagan los requerimientos adicionales ilustrados en la presente, y sean opcionalmente adecuados para los propósitos de la presente.

Como se menciona en la presente "preferido" (o "más preferido", "todavía más preferido", etc.) se aplican a los compuestos de NB específicos o las variantes de los mismos, o a su usos, para una variedad de modalidades descritas en la presente, o para las modalidades particulares si así se describen.

Los residuos de aminoácidos de una construcción de NB se numeran de acuerdo con la numeración general para los dominios VH, como es dada por Kabat y colaboradores, "Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicación No. 91 , como se aplica a los dominios VHH a partir de camélidos en el artículo de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods, 23 de Junio de 2000; 240 (1-2): 185-195 (véase, por ejemplo, la Figura 2 de esta publicación). De conformidad con lo anterior, en general una FR1 de una construcción de NB comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 1 a 30, una CDR1 de una construcción de NB comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 31 a 35, una FR2 de una construcción de NB comprende los aminoácidos en las posiciones 36 a 49, una CDR2 de una construcción de NB comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 50 a 65, una FR3 de una construcción de NB comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 66 a 94, una CDR3 de una construcción de NB comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 95 a 102, y una FR4 de una construcción de NB comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 103 a 113. Sin embargo, es bien conocido en la materia para los dominios VH y para los dominios VHH que el número total de los residuos de aminoácidos en cada una de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) puede variar y, por consiguiente, puede no corresponder al número total de los residuos de aminoácidos indicados por la numeración de Kabat. A manera de ejemplo, para una construcción de NB de la invención descrita en la presente, los residuos de aminoácidos y su posición en la construcción de NB para sus FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 particulares, son como se proporcionan en la Tabla 4 en la presente. Se pueden utilizar otros métodos tales como Kabat y Chotia para definir versiones alternativas de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) particulares, y la determinación cristalográfica de los puntos de contacto y los sitios de interacción pueden informar adicionalmente a un experto en este campo con respecto a la extensión de cada región CDR y/o FR particular.

Las Figuras, el Listado de Secuencias, y la Parte Experimental/Ejemplos, se dan para ilustrar adicionalmente la invención, y no deben interpretarse o construirse para limitar el alcance de la invención y/o de las reivindicaciones adjuntas de cualquier manera, excepto si se indica explícitamente de otra manera en la presente.

Para una descripción general de los anticuerpos de cadena pesada y de los dominios variables de los mismos, se hace referencia, entre otras cosas, a las referencias de la técnica citadas en la presente.

De acuerdo con la terminología utilizada en la materia, los dominios variables presentes en los anticuerpos de cadena pesada que se presentan naturalmente, también serán referidos como "dominios VHH", con el objeto de distinguirlos de los dominios variables de la cadena pesada que están presentes en los anticuerpos de 4 cadenas convencionales (los cuales serán referidos en la presente como "dominios VH"), y de los dominios variables de la cadena ligera que están presentes en los anticuerpos de 4 cadenas convencionales (los cuales serán referidos en la presente como "dominios VL"). En general, los dominios VHH han sido "diseñados" por naturaleza para enlazarse funcionalmente a un antígeno sin la presencia de, y sin cualquier interacción con, un dominio variable de cadena ligera.

Como se menciona en las referencias citadas en la técnica anteriores, dominios VHH tienen un número de características estructurales y propiedades funcionales únicas. Éstas hacen que los dominios VHH aislados (así como las composiciones de la invención basadas en los mismos que compartan estas características estructurales y propiedades funcionales con los dominios VHH que se presentan naturalmente), y las proteínas que los contienen sean altamente convenientes para utilizarse como dominios o proteínas de enlace de antígeno funcionales. En particular, y sin limitarse a lo mismo, los dominios VHH y las composiciones de la invención pueden funcionar como una sola unidad, dominio o proteína estructural de enlace de antígeno funcional relativamente pequeña. Esto distingue los dominios VHH de los dominios VH y VL de los anticuerpos de 4 cadenas convencionales, los cuales, por sí mismos, en general no son adecuados para la aplicación práctica como proteínas o dominios de enlace de antígeno individuales, sino que se necesitan combinar de alguna forma u otra para proporcionar una unidad de enlace de antígeno funcional (por ejemplo, como en los fragmentos de anticuerpos convencionales, tales como los fragmentos Fab; en los fragmentos ScFv, los cuales consisten en un dominio VH covalentemente enlazado a un dominio VL).

Debido a estas propiedades únicas, el uso de los dominios VHH, y de los agentes NB de la invención, y de las composiciones basadas en los mismos, como proteínas de enlace de antígeno o como dominios de enlace de antígeno individuales (es decir, como parte de una proteína o polipéptido más grande), ofrece un número de ventajas significativas sobre el uso de los dominios VH y VL convencionales, los ScFvs, o los fragmentos de anticuerpos convencionales (tales como los fragmentos Fab o F(ab')2). Las ventajas de una variante VHH de camélido de una construcción de NB son, por ejemplo, que únicamente se requiere que se enlace un solo dominio a un antígeno con una alta afinidad y con una alta selectividad, de tal manera que no hay necesidad de elaborar o combinar múltiples dominios separados, ni hay necesidad de garantizar que estos dos dominios estén presentes en la conformación y configuración espacial correcta; los dominios VHH se pueden expresar a partir de una sola transcripción, y no requieren de pliegue o modificaciones posteriores a la traducción; los dominios VHH se pueden diseñar fácilmente en formatos multivalentes y multiespecíficos (como se discute adicionalmente en la presente); los dominios VHH son altamente solubles y no tienen tendencia a aglomerarse; los dominios VHH son altamente estables al calor, el pH, a las proteasas, y a otros agentes o condiciones desnaturalizantes; los dominios VHH son fáciles y relativamente baratos de preparar y escalar para la producción; los dominios VHH son relativamente pequeños (los monómeros son de aproximadamente 15 kDa, ó 10 veces más pequeños que la IgG convencional), comparándose con los anticuerpos de 4 cadenas convencionales y con los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos y, por consiguiente, muestran una penetración más alta en los tejidos (incluyendo, pero no limitándose a, tumores sólidos y otros tejidos densos) que los anticuerpos de 4 cadenas convencionales los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos; los dominios VHH pueden mostrar las denominadas como propiedades de enlace de cavidades (entre otras cosas, debido a su lazo extendido de CDR3, comparándose con los dominios VH convencionales) y, por consiguiente, también pueden tener acceso a los objetivos y epítopos no accesibles para los anticuerpos de 4 cadenas convencionales y los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos.

Construcciones de NB contra el DR5 En un aspecto específico y preferido, la invención proporciona agentes NB contra el DR5, y en particular agentes NB contra el DR5 a partir de un animal de sangre caliente, y más particularmente, los agentes NB contra el DR5 a partir de un mamífero, y en especial agentes NB contra el DR5 humano, tal como se proporciona en las bases de datos públicas, por ejemplo, en las bases de datos de proteínas NCBI Número de Acceso BAA33723 (SEO. ID NO: 89); así como proteínas y/o polipéptidos, los cuales comprenden cuando menos un agente NB.

En particular, la invención proporciona agentes NB contra el DR5, y proteínas y/o polipéptidos que los comprenden, que tienen mejores propiedades terapéuticas y/o farmacológicas y/u otras propiedades convenientes (tales como, por ejemplo, mayor facilidad de preparación y/o costos reducidos de los artículos), comparándose con los anticuerpos convencionales contra el DR5, o fragmentos de los mismos, comparándose con las construcciones que se podrían basar en los anticuerpos convencionales o fragmentos de anticuerpos (tales como fragmentos Fab' , fragmentos F(ab' )2, construcciones ScFv, "diacuerpos" y otras construcciones multiespec íficas (véase , por ejemplo , la reseña por Holliger y Hudson , Nat Biotechnol . Septiembre de 2005; 23(9) : 1 1 26-36)) , y también comparándose con los denominados como "dAbs" o anticuerpos de domi nio (individuales) simi lares que se pueden derivar a parti r de los dominios variables de los anticuerpos convencionales.

En una modal idad, y como se describe en términos generales en la presente para las secuencias de aminoácidos terapéuticamente útiles de la invención , los agentes NB y las variantes de los mismos de la invención, están en una forma esencialmente aislada, o forman parte de una proteína o polipéptido de la invención que puede comprender o consistir esencialmente en uno o más agentes N B de la invención. En una modalidad, la variante del agente NB puede comprender además una o más secuencias de aminoácidos adicionales. En una modalidad, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales se enlazan por medio de uno o más enlazadores adicionales. En una modalidad , y sin limitación , la u na o más secuencias de aminoácidos de la i nvención se pueden uti lizar como una unidad de enlace en una prote ína o pol ipéptido, q ue opcionalmente pueden contener una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden servir como u na unidad de enlace (es decir, contra uno o más objetivos diferentes del DR5), como para proporcionar un polipéptido monovalente, multivalente, o multiespecífico de la invención, respectivamente. En una modalidad, esta proteína o polipéptido puede comprender o consistir esencialmente en uno o más agentes NB de la invención y opcionalmente uno o más (otros) dominios de polipéptido o composiciones de enlace de epítopos (es decir, dirigidos contra objetivos diferentes del DR5), todos opcionalmente enlazados por medio de uno o más enlazadores adicionales, como para proporcionar un agente NB monovalente, multivalente, o multiespecífico, respectivamente.

En una modalidad, el sitio de enlace para el enlace contra el DR5 se forma mediante las secuencias de CDR. En una modalidad, una composición de la invención, en adición al cuando menos un sitio de enlace para enlazarse contra el DR5, puede contener uno o más sitios de enlace adicionales para enlazarse contra otros antígenos, proteínas u objetivos. Para los métodos y las posiciones para introducir estos segundos sitios de enlace, se hace referencia, por ejemplo, a Keck y Huston, Biophysical Journal, 71, Octubre de 1996, 2002-2011; Patente Europea Número EP 0 640 130; Publicación Internacional Número WO 06/07260, y la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica por Ablynx N.V. titulada como "Immunoglobulin domains with múltiple binding sites" presentada el 27 de Noviembre de 2006.

En una modalidad, cuando las secuencias de aminoácidos de la invención (o un polipéptido de la invención que comprende las mismas) se pretenden para su administración a un sujeto (por ejemplo, para propósitos terapéuticos y/o de diagnóstico, como se describen en la presente), se dirigen contra el DR5 humano. En una modalidad, para propósitos veterinarios, la composición de la invención se dirige contra el DR5 a partir de la especie que se vaya a tratar. Las composiciones de la invención en la presente pueden o no reaccionar cruzadamente (es decir, pueden ser activas contra el DR5 a partir de dos o más especies de mamífero, tal como contra el DR5 humano y el DR5 a partir de cuando menos una de las especies de mamífero mencionadas en la presente). En una modalidad, una construcción de NB de la invención se puede enlazar específicamente al DR5 pero no se enlaza al DR-4, al TRAIL-R3, o al TRAIL-R4.

En una modalidad, las composiciones de la invención se dirigen en general contra cualquier determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o confirmación (en donde sea aplicable) del DR5. En una modalidad, los agentes NB de la invención se dirigen contra la porción del dominio extracelular del DR5.

En una modalidad específica, las composiciones de la invención en la presente compiten con el ligando natural del DR5 en un ensayo de enlace competitivo. En una modalidad, un agente NB de la invención compite con TRAIL para enlazarse al DR5. En una modalidad, una composición de la invención no compite con TRAIL-para enlazarse al DR5. En una modalidad, un agente NB de la invención hace sinergismo con TRAIL para enlazarse al DR5.

En una modalidad no limitante, la secuencia de aminoácidos y la estructura de una composición de la invención están comprendidas de cuatro regiones de estructura o "FRs" (o algunas veces también referidas como "FWs"), las cuales son referidas en la materia y en la presente como "Región de estructura 1" o "FR1"; como "Región de estructura 2" o "FR2"; como "Región de estructura 3" o "FR3"; y como "Región de estructura 4" o "FR4", respectivamente; cuyas regiones de estructura están interrumpidas por tres regiones determinantes de complementariedad o "CDRs", las cuales son referidas en la materia como "Región determinante de complementariedad 1" o "CDR1"; como "Región determinante de complementariedad 2" o "CDR2"; y como "Región determinante de complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. En una modalidad, las secuencias de estructura y las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) (y las combinaciones de las mismas) son aquéllas que están presentes en las construcciones de NB de la invención como se describen en la presente, y en especial en la Tabla 4. Otras secuencias de CDR adecuadas se pueden obtener mediante los métodos descritos en la presente.

En una modalidad no limitante, las secuencias de CDR de la invención son tales que: a) las construcciones de NB pueden enlazarse al DR5 con una constante de disociación (KD) de 1 O"5 a 10~12 moles/litro o menos, y de preferencia de 10'7 a 10"12 moles/litro o menos, y de una manera muy preferible de 1 O"8 a 10"12 moles/litro (es decir, con una constante de disociación (KA) de 105 a 1012 litros/moles o más, y de preferencia de 1 O7 a 1012 litros/moles o más, y de una manera muy preferible de 108a 1012 litros/moles); y/o son tales que: b) las construcciones de NB pueden enlazarse al DR5 con un índice kact¡vad0 de entre 102 M"1s"1 y aproximadamente 107 M"1s"1, de preferencia de entre 103 M'V1 y 107 M"1s"\ más preferiblemente de entre 104 M"1s'1 y 107 M"V1, tal como de entre 105 M"1s"1 y 107 M'V1; y/o son tales que: c) las construcciones de NB pueden enlazarse al DR5 con un índice kdesactlvad0 de entre 1 s- (t1 2=0.69 s) y 10"6 s'1 (proporcionando un complejo casi irreversible con un t1 2 de múltiples días), de preferencia de entre 10"2 s-1 y 10"6 s-\ más preferiblemente de entre 10"3 s-1 y 10"6 s-1, tal como de entre 10"4 s-1 y 10"6 s"1.

En una modalidad, las secuencias de CDR en la presente son tales que: una composición monovalente de la invención (o un polipéptido que contenga solamente una construcción de NB de la invención) se enlazará al DR5 con una afinidad menor de 100 nM, de preferencia menor de 10 nM, más preferiblemente menor de 1 nM, tal como menor de 500 pM.

La afinidad de los agentes NB de la invención contra el DR5 se puede determinar de una manera conocida por sí misma, por ejemplo, utilizando las técnicas generales para medir las KD, KA, kdesact¡vado o kact¡vado mencionadas en la presente, así como algunos de los ensayos específicos descritos en la presente.

En un aspecto no limitante, la invención se refiere a un agente NB contra el DR5, el cual consiste en cuatro regiones de estructura (FR1 a FR4, respectivamente), y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 una CDR3, respectivamente). En una modalidad, el agente NB es una construcción de NB en donde: la CDR1 se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44; b) las secuencias de aminoácidos que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44; c) las secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41 a 44; y/o la CDR2 se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55; b) las secuencias de aminoácidos que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55; c) las secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51 a 55; y/o la CDR3 se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68; b) las secuencias de aminoácidos que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68 c) las secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63 a 68; o cualquier fragmento adecuado de esta secuencia de aminoácidos.

De los agentes NB de la invención, se prefieren en particular las construcciones de NB que comprenden una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) explícitamente enlistadas anteriormente; se prefieren más particularmente las construcciones de NB que comprenden dos o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) explícitamente enlistadas anteriormente; y se prefieren de una manera muy particular, las construcciones de NB que comprenden tres de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) explícitamente enlistadas anteriormente.

Algunas combinaciones de secuencias de CDR particularmente preferidas, pero no limitantes, así como las combinaciones preferidas de secuencias de CDR y secuencias de estructura, se mencionan en la Tabla 4 más adelante, la cual enlista las secuencias de CDR y las secuencias de estructura que están presentes en un número de construcciones preferidas (pero no limitantes) de NB de la invención. Como quedará claro para la persona experta, normalmente se preferirá una combinación de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que se presentan en el mismo clon (es decir, CDR1, CDR2 y las secuencias de CDR3 que se mencionan sobre la misma línea en la Tabla 4, y en especial como se proporciona en las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104) (aunque la invención en su sentido más amplio no está limitada a la misma, y también comprende otras combinaciones adecuadas de las secuencias de CDR mencionadas en la Tabla 4). También, normalmente se preferirá una combinación de secuencias de CDR y las secuencias de estructura que se presentan en el mismo clon (es decir, las secuencias de CDR y las secuencias de estructura que se mencionan sobre la misma línea en la Tabla 4, y en especial como se proporciona en contexto dentro de las SEQ ID NOs: 1 - 22, 26 - 40, 87-88, y 103-104)) (aunque la invención en su sentido más amplio no está limitada a la misma, y también comprende otras combinaciones adecuadas de las secuencias de CDR y las secuencias de estructura mencionadas en la Tabla 4, así como combinaciones de estas secuencias de CDR y otras secuencias de estructura adecuadas.

En una modalidad, en las construcciones de NB que comprenden las combinaciones de CDRs mencionadas en la Tabla 4, cada CDR puede ser reemplazada por una CDR seleccionada a partir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos que tienen cuando menos el 80 por ciento, de preferencia cuando menos el 90 por ciento, más preferiblemente cuando menos el 95 por ciento, todavía más preferiblemente cuando menos el 99 por ciento de identidad de secuencia con las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) mencionadas.

Por consiguiente, en las construcciones de NB de la invención, cuando menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se selecciona adecuadamente a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla 4; o a partir del grupo de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen cuando menos el 80 por ciento, de preferencia cuando menos el 90 por ciento, más preferiblemente cuando menos el 95 por ciento, todavía más preferiblemente cuando menos el 99 por ciento de "identidad de secuencia" con cuando menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla 4; y/o a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solamente 1 "diferencia de aminoácido(s)" con cuando menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla 4.

En este contexto, "se selecciona adecuadamente" significa que, como sea aplicable, una secuencia de CDR1 se selecciona a partir de las secuencias de CDR1 adecuadas (es decir, como se definen en la presente), una secuencia de CDR2 se selecciona a partir de las secuencias de CDR2 adecuadas (es decir, como se definen en la presente), y una secuencia de CDR3 se selecciona a partir de las secuencias de CDR3 adecuadas (es decir, como se definen en la presente), respectivamente. En una modalidad, las secuencias de CDR se seleccionan de tal manera que las construcciones de NB de la invención se enlazan al DR5 con una afinidad (de una manera adecuada medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente), un valor KA (real o aparente), un índice kactivad0 y/o un índice kdesactivado, o de una manera alternativa, como un valor IC50) que es como se dispone en la presente.

En una modalidad de las construcciones de NB de la invención, cuando menos la secuencia de CDR3 presente se selecciona adecuadamente a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR3 enlistadas en la Tabla 4, o a partir del grupo de las secuencias de CDR3 que tienen cuando menos el 80 por ciento, de preferencia cuando menos el 90 por ciento, más preferiblemente cuando menos el 95 por ciento, todavía más preferiblemente cuando menos el 99 por ciento de identidad de secuencia con cuando menos una de las secuencias de CDR3s enlistadas en la Tabla 4; y/o a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR3 que tienen 3, o tienen 2 o tienen solamente 1 diferencia de aminoácido(s) con cuando menos una de las secuencias de CDR3s enlistadas en la Tabla 4.

En una modalidad de las construcciones de NB de la invención, cuando menos dos de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se seleccionan adecuadamente a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla 4, o a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen cuando menos el 80 por ciento, y/o cuando menos el 90 por ciento, y/o cuando menos el 95 por ciento, y/o cuando menos el 99 por ciento de identidad de secuencia con cuando menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla 4; y/o a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solamente 1 "diferencia de aminoácido(s)" con cuando menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla 4.

En una modalidad de las construcciones de NB de la invención, cuando menos la secuencia de CDR3 presente se selecciona adecuadamente a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR3 enlistadas en la Tabla 4, o a partir del grupo de las secuencias de CDR3 que tienen cuando menos el 80 por ciento, y/o cuando menos el 90 por ciento, y/o cuando menos el 95 por ciento, y/o cuando menos el 99 por ciento de identidad de secuencia con cuando menos una de las secuencias de CDR3s enlistadas en la Tabla 4, respectivamente; y cuando menos una de las secuencias de CDR1 y CDR2 presentes se selecciona adecuadamente a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, enlistadas en la Tabla 4, o a partir del grupo de las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, que tienen cuando menos el 80 por ciento, y/o cuando menos el 90 por ciento, y/o cuando menos el 95 por ciento, y/o cuando menos el 99 por ciento de identidad de secuencia con cuando menos una de las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, enlistadas en la Tabla 4; y/o a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, que tienen 3, 2 o solamente 1 diferencia de aminoácido(s) con cuando menos una de las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, enlistadas en la Tabla 4.

En una modalidad de las construcciones de NB de la invención, todas las tres secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se seleccionan adecuadamente a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla 4.

En una modalidad, se prefieren las combinaciones de CDRs enlistadas en la Tabla 4 (es decir, aquéllas mencionadas para las mismas construcciones en la Tabla 4). Por consiguiente, en un aspecto, cuando una CDR en una construcción de NB de la invención es una secuencia de CDR mencionada en la Tabla 4, o se selecciona adecuadamente a partir del grupo de secuencias de CDR que tienen cuando menos el 80 por ciento, de preferencia cuando menos el 90 por ciento, más preferiblemente cuando menos el 95 por ciento, todavía más preferiblemente cuando menos el 99 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de CDR enlistada en la Tabla 4; y/o a partir del grupo que consiste en las secuencias de CDR q ue tienen 3, 2 o solamente 1 diferencia de aminoácido(s) con una secuencia de CDR enlistada en la Tabla 4, cuando menos una y de preferencia ambas de las otras CDRs se seleccionan adecuadamente a parti r de las secuencias de CD R que pertenezcan a la misma combi nación en la Tabla 4 (es deci r, mencionada sobre la misma l ínea en la Tabla 4) , o se seleccionan adecuadamente a partir del grupo de secuencias de CDR que tienen cuando menos el 80 por ciento, de preferencia cuando menos el 90 por ciento, más preferiblemente cuando menos el 95 por ciento, todavía más preferiblemente cuando menos el 99 por ciento de identidad de secuencia con las secuencias de CDR pertenecientes a la misma combinación , y/o a parti r del grupo que consiste en las secuencias de C DR que tienen 3, 2 o solamente 1 diferencia de ami noácido(s) con las secuencias de C D R pertenecientes a la misma combinación. Las otras prefe rencias indicadas en los párrafos anteriores también se aplican a las combinaciones de C D Rs mencionadas en la Tabla 4.

En u na modal idad de una construcción de NB de la invención, las secuencias de CDR 1 , CDR2 y CDR3 presentes se seleccionan adecuadamente a partir de una de las combinaciones de las secuencias de C DR 1 , CD R2 y C DR3, respectivamente, enlistadas en la Tabla 4.

De acuerdo con un aspecto no li mitante de una construcción de NB de la invención , (a) CDR 1 tiene una longitud de entre 1 y 1 2 residuos de aminoácidos, y usualmente de entre 2 y 9 residuos de aminoácidos, tal como de 5 , 6 ó 7 residuos de aminoácidos ; y/o (b) CDR2 tiene una longitud de entre 13 y 24 residuos de aminoácidos, y usualmente de entre 15 y 21 residuos de aminoácidos, tal como de entre 16 y 17 residuos de aminoácidos; y/o (c) CDR3 tiene una longitud de entre 2 y 35 residuos de aminoácidos, y usualmente de entre 3 y 30 residuos de aminoácidos, tal como de entre 6 y 23 residuos de aminoácidos.

En un aspecto no limitante, la invención se refiere a una construcción de NB en donde las secuencias de CDR tienen más del 80 por ciento, de preferencia más del 90 por ciento, más preferiblemente más del 95 por ciento, tal como cuando menos el 99 por ciento o más de identidad de secuencia con las secuencias de CDR de cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104.

En términos generales, los agentes NB con las secuencias de CDR anteriores pueden ser como se describen adicionalmente en la presente. En una modalidad, los agentes NB tienen secuencias de estructura que son también como se describen adicionalmente en la presente. Por consiguiente, por ejemplo, y como se menciona en la presente, los agentes NB pueden ser los anticuerpos de un solo dominio que se presentan naturalmente (a partir de cualquier especie adecuada), las secuencias VHH que se presenten naturalmente (es decir, a partir de una especie adecuada de camélido), o las secuencias de aminoácidos sintéticas o semi-sintéticas o agentes NB, incluyendo, pero no limitándose a, las construcciones de NB parcialmente humanizadas, o las secuencias VHH, las construcciones de NB completamente humanizadas, o las secuencias VHH, las secuencias del dominio variable de la cadena pesada camelizadas, así como los agentes NB que se hayan obtenido mediante las técnicas mencionadas en la presente.

Por consiguiente, en un aspecto no limitante, la invención se refiere a un agente NB humanizado, el cual consiste en cuatro regiones de estructura (FR1 a FR4, respectivamente), y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 una CDR3, respectivamente), en donde las CDR1 una CDR3 son como se definen en la presente, y en donde el agente NB humanizado comprende cuando menos una sustitución humanizada, y en particular cuando menos una sustitución de humanización en cuando menos una de sus secuencias de estructura.

En otro aspecto preferido, pero no limitante, la invención se refiere a un agente NB en donde las secuencias de CDR tienen cuando menos el 70 por ciento de identidad de aminoácidos, de preferencia cuando menos el 80 por ciento de identidad de aminoácidos, más preferiblemente cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos, tal como el 95 por ciento de identidad de aminoácidos o más, o incluso esencialmente el 100 por ciento de identidad de aminoácidos con las secuencias de CDR de cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104. Este grado de identidad de aminoácidos, por ejemplo, se puede determinar mediante la determinación del grado de identidad de aminoácidos (de una manera descrita en la presente) entre el agente NB y una o más de las secuencias de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104, en donde no se consideran los residuos de aminoácidos que forman las regiones de estructura. Los agentes NB pueden ser como se describen adicionalmente en la presente.

En un aspecto no limitante, la invención se refiere a un agente NB, incluyendo, pero no limitándose a, una construcción de NB, con una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104, o a partir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos que tienen más del 80 por ciento, de preferencia más del 90 por ciento, más preferiblemente más del 95 por ciento, tal como cuando menos el 99 por ciento o más de identidad de secuencia con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104.

Otro aspecto no limitante de la invención se refiere a las variantes humanizadas o adicionalmente humanizadas de las construcciones de NB de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104, que comprenden, comparándose con la secuencia nativa correspondiente, cuando menos una sustitución humanizada, y en particular cuando menos una sustitución de humanización en cuando menos una de sus secuencias de estructura.

Polipéptidos de Enlace Monovalentes v Multi alentes La invención se refiere además a un compuesto que comprende o que consiste esencialmente en uno o más polipéptidos de la invención contra el DR5, y más específicamente contra el DR5 humano, y opcionalmente comprende uno o más grupos, residuos, fracciones o unidades de enlace adicionales, en donde el compuesto mencionado es capaz de mejorar la apoptosis. En una modalidad, algunos agentes NB de la invención son proteínas que comprenden cuando menos tres, cuatro, cinco o más polipéptidos de enlace monovalente contra el receptor DR5, tales como los agentes NB de la invención dirigidos contra el DR5. Como se menciona en la presente, en estos polipéptidos multivalentes de la invención, cada polipéptido de enlace monovalente, tal como una construcción de NB, se puede dirigir contra el mismo epítopo sobre el DR5, o contra diferentes epítopos sobre el DR5. Algunos ejemplos no limitantes de estos polipéptidos de NB de la invención se dan en las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104.

En términos generales, las proteínas o los polipéptidos que comprenden o que consisten esencialmente en un solo polipéptido de enlace (tal como una sola subunidad de enlace de DR5 de un agente NB de la invención) serán referidos en la presente como proteínas o polipéptidos "monovalentes" o como "construcciones monovalentes". Las proteínas y los polipéptidos que comprenden o que consisten esencialmente en dos o más polipéptidos de enlace (tales como cuando menos dos agentes NB unidos de la invención, o cuando menos un agente NB de la invención, y cuando menos otro agente NB o construcción de polipéptido) serán referidos en la presente como proteínas o polipéptidos "multivalentes" o como "construcciones multivalentes" , y éstos pueden proporcionar ciertas ventajas comparándose con los polipéptidos de enlace monovalente correspondientes de la invención. Los ejemplos no limitantes particulares de estas construcciones multivalentes con como se disponen en la presente.

Los ejemplos específicos del agente NB multivalente incluyen un dímero o una construcción divalente que comprende dos subunidades de pol ipéptido, un trímero, o agente N B trivalente que comprende tres subunidades de polipéptido, un tetrámero o agente NB tetravalente que comprende cuatro subunidades de polipéptido, un pentámero o agente NB pentavalente que comprende cinco subunidades de polipéptido, a hexámero o agente N B hexavalente que comprende seis subunidades de polipéptido, o variantes multiméricas adicionales de los mismos .

En un aspecto no limitante , un agente NB trimérico de la invención comprende o consiste esencialmente en tres subunidades de polipéptido monovalentes de la invención . En una modalidad , el agente N B trimérico comprende tres subunidades de polipéptido monovalentes de enlace de D R5 idénticas de la invención, en cuyo caso, el agente NB es un trímero que es multivalente pero monoespec ífico. En una modalidad, un agente N B trimérico comprende o consiste esencial mente en una primera y/o una segunda subu nidad de enlace de DR5 , y una segunda o terce ra subunidad , respectivamente, que es opcionalmente u na subunidad que se enlaza específicamente a un ep ítopo diferente (ya sea sobre D R5 o sobre otro objetivo) , por ejemplo, en cuyo caso, el agente N B es un trímero que es multivalente y multiespecífico.

En una modalidad no limitante , un agente NB comprende o consiste esencial mente en cuando menos cuatro subunidades de pol ipéptido de enlace de DR5 monovalentes de la invención . Este agente NB tetramérico de la invención puede ser monoespecífico o se puede converti r hasta una construcción multiespecífica mediante la unión opcional de subunidades adicionales que se enlacen específicamente al mismo o a un epítopo de D R5 diferente del primero y/o a un objetivo diferente de D R5.

En una modalidad no limitante , un agente N B comprende o consiste esencialmente en cuando menos cinco subunidades de polipéptido de enlace de DR5 monovalentes de la invención . Este agente N B pentamérico de la invención puede ser monoespecífico o se puede convertir hasta una construcción multiespecífica mediante la unión opcional de subunidades adicionales que se enlacen específicamente a un ep ítopo de D R5 diferente del pri mero y/o a u n objetivo diferente de DR5.

En una modalidad no limitante , un agente NB comprende o consiste esencialmente en seis, ocho o diez subunidades de polipéptido de enlace de DR5 monovalentes de la invención . Este agente N B multi mérico de la invención puede ser monoespecífico o se puede converti r hasta una construcción multiespecífica mediante la unión opcional de subunidades adicionales que se enlacen específicamente a un ep ítopo de DR5 diferente del primero y/o a un objetivo diferente de D R5.

En una modalidad , los agentes NB multiméricos, ya sea monoespec íficos o multiespecíficos, proporcionan ciertas ventajas comparándose con una prote ína o polipéptido que comprenda o que consista esencialmente en un agente N B monomérico de la invención ; en una modalidad , las ventajas incluyen , pero no se limitan a, una avidez muy mejorada por DR5 , por ejemplo, por el DR5 humano. Algunos ejemplos específicos, pero no limitantes , de agentes N B multi méricos son las construcciones de NB de las S EQ I D NOs: 6 a 22 , 27-29 , 31 -33 y 88.

En un aspecto no limitante, un pol ipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente en cuando menos un agente N B de la invención , opcionalmente uno o más agentes NB adicionales, y cuando menos otra secuencia de aminoácidos (tal como una proteína o polipéptido) que confiere cuando menos una propiedad deseada al agente NB de la i nvención y/o a la proteína de fusión resultante. Nuevamente, estas prote ínas de fusión pueden proporcionar ciertas ventajas comparándose con el agente NB monovalente correspondiente de la invención . Algu nos ejemplos no limitantes de estas secuencias de aminoácidos y de las construcciones de fusión llegarán a quedar más claros a parti r de la descripción adicional en la presente .

En una modalidad , es posible combinar dos o más de los aspectos anteriores, por ejemplo, para proporcionar una construcción biespecífica trivalente q ue comprenda dos agentes NB de la invención y otro agente NB, y opcionalmente una o más secuencias de aminoácidos diferentes. Los ejemplos no limitantes adicionales de estas construcciones, así como de algunas construcciones que son particularmente preferidas dentro del contexto de la presente invención, llegarán a quedar más claros a partir de la descripción adicional en la presente.

En las construcciones anteriores, el uno o más polipéptidos de enlace contra el DR5 y/u otras secuencias de aminoácidos se pueden enlazar operativamente unas a otras y/o se pueden enlazar adecuadamente unas a otras por medio de una o más secuencias enlazadoras. Algunos ejemplos adecuados, pero no limitantes, de estos enlazadores llegarán a quedar más claros a partir de la descripción adicional en la presente.

En un aspecto específico, el compuesto multivalente de la invención comprende cuando menos tres, cuatro, cinco o más polipéptidos de enlace monovalente (es decir, subunidades), y tiene una IC50 menor de 100 nM, de preferencia menor de 10 nM, más preferiblemente menor de 1 nM, todavía más preferiblemente menor de 100 pM, por ejemplo, debajo de 10 pM, como se mide, por ejemplo, en el ensayo de sobrevivencia celular de Colo205 o Jurkat. Se pueden utilizar otras líneas de células de cáncer para determinar la IC5o, por ejemplo, tales como se mencionan en los Ejemplos. Adicionalmente, las posibles líneas de células de cáncer que se pueden utilizar en los ensayos de sobrevivencia celular incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, Jurkat, Molt4, Colo205, BxPC3, T24, Panc-1, M30, H226, H2122, H2052, y MiaPaCa-2.

En una modalidad, el compuesto multivalente de la invención es cuando menos 10 veces, de preferencia cuando menos 100 veces más potente en una línea de células tumorales que en una línea de células no tumorales y medido en un ensayo de sobrevivencia celular, tal como el ensayo de sobrevivencia celular de Colo205 o Jurkat.

En un aspecto específico de la invención, un agente NB de la invención o un compuesto, construcción o polipéptido de la invención que comprende cuando menos un agente NB de la invención, puede tener una mayor vida media, comparándose con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención. Algunos ejemplos no limitantes de los agentes, compuestos, y polipéptidos de NB llegarán a quedar más claros para la persona experta basándose en la divulgación adicional en la presente y, por ejemplo, comprenden las secuencias o polipéptidos del agente NB de la invención que se han modificado químicamente para aumentar la vida media de los mismos (por ejemplo, por medio de pegilación); las secuencias de aminoácidos de la invención que comprenden cuando menos un sitio de enlace adicional para enlazarse a una proteína de suero (tal como albúmina de suero, o los polipéptidos de la invención que comprenden cuando menos un agente NB de la invención que se enlaza a cuando menos una fracción (y en particular cuando menos una secuencia de aminoácidos) que aumenta la vida media del agente NB de la invención. Los ejemplos de los polipéptidos de la invención que comprenden estas fracciones o secuencias de aminoácidos que extienden la vida media, llegarán a quedar más claros para la persona experta basándose en la divulgación adicional en la presente; y, por ejemplo, incluyen, sin limitación, los polipéptidos en donde el uno o más agentes NB de la invención se enlazan adecuadamente a una o más proteínas de suero o fragmentos de las mismas (tales como albúmina de suero o fragmentos adecuados de la misma) o a una o más unidades de enlace que se pueden enlazar a las proteínas de suero (tales como, por ejemplo, los agentes NB, las construcciones VHH de camélido, o los anticuerpos de (un solo) dominio que pueden enlazarse a las proteínas de suero, tales como albúmina de suero, inmunoglobulinas de suero, tales como IgG, o transferrina); los polipéptidos en donde un agente NB de la invención se enlaza a una porción Fe (tal como una Fe humana) o una parte o fragmento adecuado de los mismos; o los polipéptidos en donde el uno o más agentes NB de la invención se enlazan adecuadamente a una o más proteínas o péptidos pequeños que se pueden enlazar a las proteínas de suero (tales como, sin limitación, las proteínas y los péptidos descritos en las Publicaciones Internacionales Números WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489 y WO 2006/122787, WO 2008/028977, WO 2008/043821, WO 2008/068280 y WO 2009/127691 presentadas por Ablynx N.V.

Nuevamente, como quedará claro para la persona experta, los agentes NB pueden contener uno o más grupos, residuos, fracciones o unidades de enlace adicionales, tales como una o más secuencias de aminoácidos adicionales, y en particular uno o más agentes NB adicionales (es decir, no dirigidos contra el DR5), como para proporcionar una construcción de agente NB di-, tri-, o multi-específico más alto.

En términos generales, los agentes NB de la invención (o los compuestos, las construcciones, o los polipéptidos que las comprenden) con una mayor vida media, de preferencia tienen una vida media que es cuando menos 1.5 veces, de preferencia cuando menos 2 veces, tal como cuando menos 5 veces, por ejemplo, cuando menos 10 veces, o más de 20 veces, mayor de la vida media de la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención por sí mismos. Por ejemplo, los agentes NB, los compuestos, las construcciones o polipéptidos de la invención con una mayor vida media, pueden tener una vida media que aumenta con más de 1 hora, de preferencia más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o inclusive más de 24, 48 ó 72 horas, comparándose con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención por sí misma.

En un aspecto preferido, pero no limitante de la invención, los agentes NB, los compuestos, las construcciones, o los polipéptidos de la invención exhiben una vida media en suero en el ser humano, de cuando menos aproximadamente 12 horas, de preferencia de cuando menos 24 horas, más preferiblemente de cuando menos 48 horas, todavía más preferiblemente de cuando menos 72 horas o más. Por ejemplo, los compuestos o los polipéptidos de la invención pueden tener una vida media de cuando menos 5 días (tal como de aproximadamente 5 a 10 días), de preferencia de cuando menos 9 días (tal como de aproximadamente 9 a 14 días), más preferiblemente de cuando menos aproximadamente 10 días (tal como de aproximadamente 10 a 15 días), o de cuando menos aproximadamente 11 días (tal como de aproximadamente 11 a 16 días), más preferiblemente de cuando menos aproximadamente 12 días (tal como de aproximadamente 12 a 18 días o más), o más de 14 días (tal como de aproximadamente 14 a 19 días).

En otro aspecto de la invención, un polipéptido de la invención comprende uno o más (tal como dos o de preferencia uno) agentes NB de la invención enlazados (opcionalmente por medio de una o más secuencias enlazadoras adecuadas) a una o más (tal como dos y de preferencia una) secuencias de aminoácidos que permiten que el polipéptido resultante de la invención cruce la barrera hematoencefálica. En particular, estas una o más secuencias de aminoácidos que permiten que los polipéptidos resultantes de la invención crucen la barrera hematoencefálica, pueden ser uno o más (tal como dos y de preferencia uno) NANOBODIESMR (Nanocuerpos) , tales como los NANOBODIESMR descritos en la Publicación Internacional Número WO 02/057445, de los cuales, el FC44 (SEQ ID NO: 189 de la Publicación Internacional Número WO 06/040153), y el FC5 (SEQ ID NO: 190 de la Publicación Internacional Número WO 06/040154) son ejemplos particulares.

En una modalidad, los polipéptidos que comprenden uno o más agentes NB de la invención son tales que: a) se enlazan al DR5 con una constante de disociación (KD) de 10"5 a 10"12 moles/litro o menos, y de preferencia de 10"7 a 10'12 moles/litro o menos, y de una manera muy preferible de 1 O"8 a 10"12 moles/litro (es decir, con una constante de disociación (KA) de 105 a 1012 litros/moles o más, y de preferencia de 1 O7 a 1012 litros/moles o más, y de una manera muy preferible de 108 a 1012 litros/moles); y/o de tal manera que: b) se enlazan al DR5 con un índice kactiVado de entre 102 " 1s"1 y aproximadamente 1 O7 M"1s"1, de preferencia de entre 1 O3 M'1s"1 y 107 M"V1, más preferiblemente de entre 104 "V1 y 107 M"1s'1, tal como de entre 105 M"V1 y 107 M"1s"1; y/o de tal manera que: c) se enlazan al DR5 con un índice kdeSact¡vado de entre 1s'1 (t1 2=0.69 s), y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo casi irreversible con un ti 2 de múltiples días), de preferencia de entre 10"2 s"1 y 10"6 s"\ más preferiblemente de entre 10"3 s'1 y 10~6 s"1, tal como de entre 10"4 s"1 y 10-6 s \ En una modalidad, un polipéptido que contiene solamente una secuencia de aminoácidos de la invención es tal que se enlazará al DR5 con una afinidad menor de 500 nM, de preferencia menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. En este aspecto, estará claro para la persona experta que un polipéptido que contiene dos o más agentes NB de la invención se pueden enlazar al DR5 con una mayor avidez, comparándose con un polipéptido que contiene solamente una secuencia de aminoácidos de la invención.

Otros polipéptidos de acuerdo con este aspecto preferido de la invención, por ejemplo, se pueden seleccionar a partir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos que tienen más del 80 por ciento, de preferencia más del 90 por ciento, más preferiblemente más del 95 por ciento, tal como cuando menos el 99 por ciento o más "identidad de secuencia" con una o más de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40 y 87-88, en donde los agentes NB comprendidos dentro de estas secuencias de aminoácidos son de preferencia como se definen adicionalmente en la presente. Ácidos nucleicos, células huésped, y método para generar las construcciones de NB de la invención Otro aspecto de esta invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un agente NB de la invención o un polipéptido de la invención que lo comprende. Nuevamente, como se describe en términos generales en la presente, para los ácidos nucleicos de la invención, este ácido nucleico puede estar en la forma de una construcción genética, como se dispone en la presente.

En otro aspecto, la invención se refiere a un huésped o a una célula huésped que expresa o que es capaz de expresar un agente NB de la invención y/o un polipéptido de la invención que lo comprende; y/o que contiene un ácido nucleico de la invención.

Algunos ejemplos preferidos , pero no li mitantes, de estos huéspedes o células huésped l legarán a quedar más claros a parti r de la descripción adicional en la presente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un producto o una composición q ue contiene o que comprende cuando menos un agente N B de la i nvención , cuando menos un polipéptido de la invención , y/o cuando menos un ácido nucleico de la invención, y opcionalmente uno o más componentes adicionales de estas composiciones, conocido por s í mismos, es decir, dependiendo del uso pretendido de la composición . Este producto o composición, por ejemplo, puede ser una composición farmacéutica (como se descri be en la presente) , una composición o un producto veterinario, o una composición para utilizarse en diagnóstico (como se describe también en la presente) . Algunos ejemplos preferidos, pero no l imitantes, de estos productos o composiciones llegarán a quedar más claros a parti r de la descripción adicional en la presente.

La invención se refiere además a métodos para la preparación o la generación de los agentes N B, polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped , productos y las composiciones descritas en la presente. Algunos ejemplos preferidos, pero no l i mitantes , de los métodos , l legarán a quedar más claros a parti r de la descripción adicional en la presente .

La invención se refiere además a aplicaciones y usos de los agentes N B, poli péptidos, ácidos nucleicos, células huésped, productos y las composiciones descritas en la presente , así como a los métodos para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y los trastornos asociados con el DR5. Las aplicaciones y usos no limitantes particulares llegarán a quedar más claros a partir de la descripción adicional en la presente.

Otros aspectos, modalidades, ventajas y aplicaciones de la invención también llegarán a quedar claros a partir de la descripción adicional más adelante en la presente.

En términos generales, se debe observar que el término "agente NB", como se utiliza en la presente, en su sentido más amplio, no está limitado a una fuente biológica específica o a un método de preparación específico. Por ejemplo, como se discutirá con mayor detalle más adelante, los agentes NB de la invención se pueden obtener en términos generales mediante cualquiera de las técnicas (1) a (8) mencionadas en páginas 61 y 62 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079, o cualquier otra técnica adecuada conocida por sí mismo. Una clase preferida de los agentes NB corresponde a los dominios VHH O Vh de los anticuerpos de cadena pesada que se presentan naturalmente dirigidos contra el DR5. Como se describe adicionalmente en la presente, las secuencias VHH se pueden generar u obtener en términos generales mediante la inmunización adecuada de una especie de Camélido con el DR5 (es decir, como para provocar una respuesta inmunitaria y/o para reproducir anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra el DR5), mediante la obtención de una muestra biológica adecuada a partir de dicho Camélido (tal como una muestra de sangre, una muestra de suero, o una muestra de células-B), y mediante la generación de secuencias VHH dirigidas contra el DR5, empezando a partir de esa muestra, utilizando cualquier técnica adecuada conocida por sí misma. Estas técnicas estarán claras para la persona experta y/o se describen adicionalmente en la presente.

De una manera alternativa, los dominios VHH que se presentan naturalmente contra el DR5, se pueden obtener a partir de las bibliotecas puras de secuencias VHH de Camélido, por ejemplo, mediante el rastreo de esta biblioteca utilizando el DR5, o cuando menos una parte, fragmento, determinante antigénico o epítopo del mismo, utilizando uno o más técnicas de rastreo conocidas por sí mismas. Estas bibliotecas y técnicas, por ejemplo, se describen en las Publicaciones Internacionales Números WO 99/37681 , WO 01/90190, WO 03/025020 y WO 03/035694. De una manera alternativa, se pueden utilizar bibliotecas sintéticas o semi-sintéticas mejoradas derivadas a partir de las bibliotecas de VMH puras, tales como bibliotecas de VHH obtenidas a partir de las bibliotecas de VHH puras mediante técnicas tales como mutagénesis aleatoria y/o mezcla de CDR, como se describen, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 00/43507.

Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para generar agentes NB que se dirigen contra el DR5. En un aspecto, este método cuando menos comprende los pasos de: a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias del agente NB; b) rastrear este conjunto, colección, o biblioteca de secuencias del agente NB para buscar las secuencias del agente NB que se puedan enlazar a, y/o que tengan afinidad por, DR5; y c) aislar las secuencias de aminoácidos que se puedan enlazar a, y/o que tengan afinidad por, el DR5.

En este método, el conjunto, la colección o la biblioteca de secuencias del agente NB puede ser un conjunto, colección, o biblioteca pura de secuencias del agente NB; un conjunto, colección, o biblioteca sintética o semi-sintética de secuencias del agente NB; y/o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias del agente NB que se han sometido a maduración de afinidad.

En un aspecto particular de este método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias del agente NB, puede ser un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de secuencias del agente NB, y en particular un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de secuencias VHH. que se hayan derivado a partir de una especie de Camélido que se haya inmunizado adecuadamente con el DR5 o con un determinante antigénico adecuado basado en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, lazo antigénico u otro epítopo de los mismos. En un aspecto particular, el determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, lazo extracelular, u otros epítopos extracelulares.

En los métodos anteriores, el conjunto, la colección o la biblioteca de secuencias VHH se puede exhibir sobre un fago, fagémido, ribosoma, o microorganismo adecuado (tal como levadura), tal como con el objeto de facilitar el rastreo. Los métodos, técnicas y organismos huésped adecuados para exhibir y rastrear (un conjunto, colección o biblioteca de) secuencias estarán claros para la persona experta en este campo, por ejemplo, con base en la divulgación adicional en la presente. También se hace referencia a la Publicación Internacional Número WO 03/054016, y a la reseña por Hoogenboom en Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005).

En una modalidad, el método para generar secuencias VHH comprende cuando menos los pasos de: a) proporcionar una colección o muestra de las células derivadas a partir de una especie de Camélido que expresan secuencias de inmunoglobulina; b) rastrear la colección o la muestra de las células para determinar: (1) las células que expresen una secuencia de inmunoglobulina que se pueda enlazar a y/o que tenga afinidad por DR5; y (2) las células que expresen los anticuerpos de cadena pesada, en donde los subpasos (1) y (2) se pueden llevar a cabo esencialmente como un solo paso de rastreo o en cualquier orden adecuado como dos pasos de rastreo separados, como para proporcionar cuando menos una célula que exprese un anticuerpo de cadena pesada que se pueda enlazar a, y/o que tenga afinidad por DR5; y c) cualquiera de: (1) aislar a partir de la célula mencionada, la secuencia VHH presente en el anticuerpo de cadena pesada; o (2) aislar a partir de la célula mencionada, una secuencia de ácido nucleico que codifique la secuencia VHH presente en el anticuerpo de cadena pesada, seguido por la expresión del dominio VHH- En el método de acuerdo con este aspecto, la colección o la muestra de las células, por ejemplo, puede ser una colección o muestra de células-B. También, en este método, la muestra de las células se puede derivar a partir de un Camélido que se haya inmunizado adecuadamente con el DR5 ó un determinante antigénico adecuado basado en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, lazo antigénico u otro epítopo del mismo. En un aspecto particular, el determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, lazo extracelular, u otros epítopos extracelulares.

El método anterior se puede llevar a cabo de cualquier manera adecuada, como quedará claro para la persona experta. Se hace referencia, por ejemplo, a la Patente Europea Número EP 0 542 810, y a las Publicaciones Internacionales Números WO 05/19824, WO 04/051268 y WO 04/106377. La detección del paso b) de preferencia se lleva a cabo utilizando una técnica de citometría de flujo, tal como FACS. Para esto, se hace referencia, por ejemplo, a Lieby y colaboradores, Blood, Volumen 97, Número 12, 3820. Véase, por ejemplo, la técnica denominada como "NanocloneMR" descrita en la Solicitud Internacional Número WO 06/079372 por Ablynx N.V.

En otro aspecto, el método para generar una secuencia de aminoácidos dirigida contra el DR5 puede comprender cuando menos los pasos de: a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen los anticuerpos de cadena pesada o las secuencias VHH; b) rastrear el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos para buscar las secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen un anticuerpo de cadena pesada o una secuencia VHH que se pueda enlazar a, y/o que tenga afinidad por, DR5; y c) aislar la secuencia de ácido nucleico mencionada, seguido por la expresión de la secuencia VHH presente en el anticuerpo de cadena pesada o por la expresión de la secuencia de esta construcción de NB, respectivamente.

En este método, el conjunto, la colección o la biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de cadena pesada o secuencias VHH, por ejemplo, puede ser un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un conjunto, colección, o biblioteca pura de anticuerpos de cadena pesada o secuencias VHH! un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un conjunto, colección, o biblioteca sintética o semi-sintética de secuencias VHH; y/o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un conjunto, colección o biblioteca de secuencias VHH que se han sometido a maduración de afinidad.

En una modalidad de este método, el conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de secuencias de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de cadena pesada o secuencias VHH derivadas a partir de un Camélido que se haya inmunizado adecuadamente con el DR5 o con un determinante antigénico adecuado basado en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, lazo antigénico u otro epítopo del mismo. En un aspecto, el determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, lazo extracelular, u otros epítopos extracelulares.

En los métodos anteriores, el conjunto, colección o biblioteca de las secuencias de nucleótidos se puede exhibir sobre un fago, fagémido, ribosoma, o microorganismo adecuado (tal como levadura), tal como con el objeto de facilitar el rastreo. Los métodos, técnicas y organismos huésped adecuados para exhibir y rastrear (un conjunto, colección o biblioteca de) secuencias de nucleótidos que codifiquen las secuencias de aminoácidos estarán claros para la persona experta en este campo, por ejemplo, con base en la divulgación adicional en la presente. También se hace referencia a la Publicación Internacional Número WO 03/054016 y a Hoogenboom en Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005).

En una modalidad, el paso de detección de los métodos descritos en la presente también se puede llevar a cabo como un paso de selección. De conformidad con lo anterior, el término "rastreo", como se utiliza en la presente descripción, puede comprender la selección, el rastreo, o cualquier combinación adecuada de técnicas de selección y/o de rastreo. También, cuando se utiliza un conjunto, colección o biblioteca de las secuencias, puede contener cualquier número adecuado de secuencias, tal como 1, 2, 3, o aproximadamente 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 104, 105, 106, 107, 108 o más secuencias.

En una modalidad, una o más o todas las secuencias en el conjunto, colección o biblioteca anterior de las secuencias de aminoácidos, se pueden obtener o definir mediante planteamientos racionales o semi-empíricos, tales como técnicas de modelación por computadora o técnicas biostáticas o de cavado de datos.

Adicionalmente, este conjunto, colección o biblioteca puede comprender una, dos o más secuencias que son variantes unas de otras (por ejemplo, con mutaciones puntuales diseñadas o con posiciones aleatoriamente seleccionadas), comprometer múltiples secuencias derivadas a partir de un conjunto diverso de secuencias naturalmente diversificadas (por ejemplo, una biblioteca ¡nmunitaria)), o cualquier otra fuente de secuencias diversas (como se describen, por ejemplo, en Hoogenboom y colaboradores, Nat Biotechnol 23: 1105, 2005, y Binz y colaboradores, Nat Biotechnol 2005, 23: 1247). Este conjunto, colección o biblioteca de las secuencias se puede exhibir sobre la superficie de una partícula de fago, un ribosoma, una bacteria, una célula de levadura, una célula de mamífero, y se enlaza a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos dentro de estos vehículos. Esto hace que este conjunto, colección, o biblioteca susceptible a los procedimientos de selección para aislar las secuencias de aminoácidos deseadas de la invención. En términos más generales, cuando se exhibe una secuencia en un huésped o en una célula huésped adecuada, también es posible (y acostumbrado) aislar primero, a partir de este huésped o de esta célula huésped, una secuencia de nucleótidos que codifique la secuencia deseada, y entonces, obtener la secuencia deseada mediante la expresión adecuada de esta secuencia de nucleótidos en un organismo huésped adecuado. Nuevamente, esto se puede llevar a cabo de cualquier manera adecuada conocida por sí misma, como quedará claro para la persona experta.

Todavía otra técnica para obtener las secuencias VHH. las secuencias VH, o alguna otra variante de las secuencias del agente NB dirigidas contra el DR5 involucra inmunizar adecuadamente un mamífero transgénico que sea capaz de expresar anticuerpos de cadena pesada (es decir, como para provocar una respuesta inmunitaria y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra el DR5), obtener una muestra biológica adecuada a partir del mamífero transgénico que contenga (las secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen) estas secuencias (tales como una muestra de sangre, una muestra de suero, o una muestra de células-B), y entonces generar la secuencias del agente NB dirigidas contra el DR5, empezando a partir de esa muestra, utilizando cualquier técnica adecuada conocida por sí misma (tal como cualquiera de los métodos descritos en la presente o una técnica de hlbridoma). Por ejemplo, para este propósito, se pueden utilizar los ratones que expresan el anticuerpo de cadena pesada y los métodos y técnicas adicionales descritas en las Publicaciones Internacionales Números WO 02/085945, WO 04/049794 y WO 06/008548, y en Janssen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 10 de Octubre de 2006; 103(41): 15130-5. Por ejemplo, estos ratones que expresan el anticuerpo de cadena pesada pueden expresar los anticuerpos de cadena pesada con cualquier dominio variable (individual) adecuado, tal como los dominios variables (individuales) a partir de las fuentes naturales (por ejemplo, los dominios variables (individuales) humanos, los dominios variables (individuales) de Camélido, o los dominios variables (individuales) de tiburón), así como, por ejemplo, los dominios variables (individuales) sintéticos o semi-sintéticos.

En una modalidad, la invención se refiere a las secuencias del agente NB que se obtienen mediante los métodos anteriores, o de una manera alternativa, mediante un método que comprende uno de los métodos anteriores, y en adición, cuando menos los pasos de determinar la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos de la secuencia del agente NB; y de expresar o sintetizar la secuencia del agente NB de una manera conocida por sí misma, tal como mediante la expresión en una célula huésped o en un organismo huésped adecuado, o mediante síntesis química.

En una modalidad, la invención proporciona una clase de los agentes NB que comprende construcciones VHH de camélido con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH de llama que se presenta naturalmente, pero que se ha "humanizado", es decir, mediante el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de esta secuencia VHH que se presenta naturalmente (y en particular en las secuencias de estructura, pero también opcionalmente en una o más CDR) por uno o más de los residuos de aminoácidos que se presentan en las posiciones correspondientes en un dominio VH a partir de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional de un ser humano, por ejemplo, como se indica anteriormente, y por ejemplo, como se describe adicionalmente en, y utilizando las técnicas mencionadas en, la página 63 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079. En una modalidad, la invención proporciona una clase de los agentes NB que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH que se presenta naturalmente, pero que se ha "camelizado", es decir, mediante el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH que se presenta naturalmente a partir de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional por uno o más de los residuos de aminoácidos que se presentan en las posiciones correspondientes en el dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada, por ejemplo, como se describe adicionalmente en, y utilizando las técnicas mencionadas en, la página 63 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079.

Otros métodos y técnicas adecuadas para obtener los agentes NB de la invención (incluyendo los polipéptidos y/o los ácidos nucleicos que los codifican), empezando a partir de las secuencias VH o las secuencias VHH que se presentan naturalmente, quedarán claras para la persona experta y, por ejemplo, pueden incluir las técnicas que se mencionan en la página 64 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079.

Como se menciona en la presente, los agentes NB se pueden caracterizar en particular por la presencia de uno o más "residuos Hallmark" (como se describen en la Publicación Internacional Número WO 2008/020079, páginas 65-98) en una o más de las secuencias de estructura.

En una modalidad, los agentes NB, por ejemplo, pueden ser secuencias VHH O puede ser construcciones de NB humanizadas o adicionalmente humanizadas. Cuando las secuencias del agente NB son secuencias VHH, se pueden humanizar adecuadamente. Cuando los agentes NB son construcciones de NB parcialmente humanizadas, opcionalmente se pueden humanizar de manera adicional adecuadamente. En los agentes NB anteriores, uno o más de los residuos Hallmark adicionales son de preferencia como se describen (por ejemplo, cuando son secuencias VHH O construcciones de NB parcial o completamente humanizadas).

Los agentes NB de la presente, por ejemplo, pueden ser secuencias VHH O pueden ser humanizadas o humano-diseñadas (humaneered). Cuando las secuencias de los agentes NB anteriores son secuencias VHH> se pueden humanizar adecuadamente, como se dispone en la presente. Cuando los agentes NB son parcialmente humanizados, opcionalmente se pueden humanizar de manera adicional adecuadamente, como se describe en la presente. Se proporciona un método de humanización no limitante y de ejemplo en los Ejemplos, pero se pueden contemplar otros métodos conocidos en la técnica.

En una modalidad de los agentes NB anteriores, uno o más de los residuos Hallmark (adicionales) son como se describen en la presente (por ejemplo, cuando son secuencias VHH de camélido o construcciones VHH parcial o completamente humanizadas).

En un aspecto no limitante, la invención se refiere a agentes NB como se describen anteriormente, en donde las secuencias de CDR tienen cuando menos el 70 por ciento de identidad de aminoácidos, de preferencia cuando menos el 80 por ciento de identidad de aminoácidos, más preferiblemente cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos, tal como cuando menos el 95 por ciento de identidad de aminoácidos o más, o incluso esencialmente el 100 por ciento de identidad de aminoácidos con las secuencias de CDR de cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104. Este grado de identidad de aminoácidos, por ejemplo, se puede determinar mediante la determinación del grado de identidad de aminoácidos (de una manera descrita en la presente) entre los agentes NB y una o más de las secuencias de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104, en donde no se consideran los residuos de aminoácidos que forman las regiones de estructura. Los agentes NB se pueden modificar como se describe adicionalmente en la presente.

Como ya se mencionó en la presente, otro aspecto preferido pero no limitante de la invención se refiere a un agente NB con una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104, o a partir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos que tienen más del 80 por ciento, de preferencia más del 90 por ciento, más preferiblemente más del 95 por ciento, tal como cuando menos el 99 por ciento o más de identidad de secuencia con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104.

En las modalidades particulares de los agentes NB anteriores: i) cualquier sustitución de aminoácido (cuando no es una sustitución de humanización como se define en la presente) es de preferencia, y comparándose con la secuencia de aminoácidos correspondiente de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40 y 87-88, una sustitución de aminoácido conservadora; y/o: ii) su secuencia de aminoácidos de preferencia contiene ya sea solamente sustituciones de aminoácidos, o de otra manera de preferencia no más de 5, de preferencia no más de 3, y de una manera muy preferible solamente 1 ó 2 supresiones o inserciones de aminoácidos, comparándose con la secuencia de aminoácidos correspondiente de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40 y 87-88; y/o iii) las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) pueden ser CDRs que se deriven por medio de maduración de afinidad, por ejemplo, empezando a partir de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la secuencia de aminoácidos correspondiente de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40 y 87-88.

De preferencia, las secuencias de CDR y las secuencias de FR en los agentes NB de la invención son tales que los agentes NB de la invención (y los polipéptidos que las comprenden): a) se enlazan al DR5, por ejemplo, al DR5 humano, con una constante de disociación (KD) de 10"5 a 10"12 moles/litro o menos, y de preferencia de 1 O"7 a 10'12 moles/litro o menos, y de una manera muy preferible de 1 O"8 a 10"12 moles/litro (es decir, con una constante de disociación (KA) de 105 a 1012 litros/moles o más, y de preferencia de 107 a 1012 litros/moles o más, y de una manera muy preferible de 108 a 1012 litros/moles); y/o de tal manera que: b) se enlazan al DR5, por ejemplo, el DR5 humano, con un índice kactivado de entre 102 M" s"1 y aproximadamente 107 M"1s"1, de preferencia de entre 103 M"1s"1 y 107 M'1s"1, más preferiblemente de entre 104 M"1s"1 y 107 'V1, tal como de entre 105 M"V1 y 107 M'V1; y/o de tal manera que: c) se enlazan al DR5, por ejemplo, el DR5 humano, con un índice kdeSact¡Vado de entre 1s"1 (t1 2=0.69 s) y 10"6 s'1 (proporcionando un complejo casi irreversible con un t^ de múltiples días), de preferencia de entre 10"2 s"1 y 10"6 s"1, más preferiblemente de entre 103 s"1 y 10"6 s"1, tal como de entre 10"4 s"1 y 10"6 s'1.

En una modalidad, las secuencias de CDR y las secuencias de FR presentes en los agentes NB de la invención son tales que los agentes NB de la invención se enlazarán al DR5, por ejemplo, al DR5 humano, con una afinidad menor de 500 nM, de preferencia menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM.

En un aspecto no limitante de la invención, un agente NB puede ser como se dispone en la presente, pero con la condición de que tenga cuando menos "una diferencia de aminoácido" en cuando menos una de las regiones de estructura comparándose con la región de estructura correspondiente de un dominio VH que se presenta naturalmente, y en particular comparándose con la región de estructura correspondiente del DP-47. De una manera más específica, de acuerdo con un aspecto no limitante de la invención, un agente NB puede ser como se dispone en la presente, pero con la condición de que tenga cuando menos "una diferencia de aminoácido" en cuando menos uno de los residuos Hallmark (incluyendo aquéllos en las posiciones 108, 103 y/o 45) comparándose con la región de estructura correspondiente de un dominio VH que se presenta naturalmente, y en particular comparándose con la región de estructura correspondiente del DP-47. Usualmente, un agente NB tendrá cuando menos una diferencia de aminoácido con un dominio VH que se presenta naturalmente en cuando menos una de las FR2 y/o FR4, y en particular en cuando menos uno de los residuos Hallmark en las FR2 y/o FR4 (nuevamente, incluyendo aquéllos en las posiciones 108, 103 y/o 45).

En una modalidad, un agente NB humanizado de la invención puede ser como se dispone en la presente, pero con la condición de que tenga cuando menos "una diferencia de aminoácido" en cuando menos una de las regiones de estructura comparándose con la región de estructura correspondiente de un dominio VHH ue se presenta naturalmente. De una manera más específica, de acuerdo con un aspecto no limitante de la invención, un agente NB humanizado puede ser como se dispone en la presente, pero con la condición de que tenga cuando menos "una diferencia de aminoácido" en cuando menos uno de los residuos Hallmark (incluyendo aquéllos en las posiciones 108, 103 y/o 45) comparándose con la región de estructura correspondiente de un dominio VHH que se presenta naturalmente. Usualmente, un agente NB humanizado tendrá cuando menos una diferencia de aminoácido con un dominio V HH que se presenta naturalmente en cuando menos una de las FR2 y/o FR4, y en particular en cuando menos uno de los residuos Hallmark en las FR2 y/o FR4 (nuevamente, incluyendo aquéllos en las posiciones 108, 103 y/o 45).

Como estará claro a parti r de la divulgación en la presente , está dentro del alcance de la invención utilizar análogos , mutantes, variantes, alelos, homólogos , y ortólogos naturales o sintéticos (en la presente colectivamente referidos como "análogos") de los agentes N B de la i nvención , como se dispone en la presente , y en particular análogos de las construcciones de NB de las SEQ I D NOs: 1 -22 , 26-40, 87-88, y 1 03- 1 04, y de las S EQ I D NOs: 96-99. Por consiguiente , de acuerdo con un aspecto de la invención , el término "agentes N B de la invención" y el término "construcciones de NB de la invención" en su sentido más amplio, también cubren estos análogos.

En términos generales , en estos análogos, uno o más residuos de aminoácidos pueden haber sido reemplazados , suprimidos y/o agregados , comparándose con los agentes NB de la invención, como se dispone en la presente. Estas sustituciones , i nserciones o supresiones se pueden hacer en una o más de las regiones de estructu ra y/o en una o más de las regiones determinantes de complementariedad (C DRs). Cuando estas sustituciones, inserciones o supresiones se hacen en una o más de las regiones de estructura, se pueden hacer en uno o más de los residuos Hallmark y/o en una o más de las otras posiciones en los residuos de estructu ra, aunque las sustituciones, inserciones o supresiones en los residuos Hallmark son en general menos preferidas (a menos que éstas sean sustituciones de hu manización adecuadas, como se describen en la presente).

Por medio de los ejemplos no li mitantes , una sustitución , por ejemplo, puede ser una sustitución conservadora (como se describe en la presente), y/o un residuo de aminoácido puede ser reemplazado por otro residuo de aminoácido que se presente naturalmente en la misma posición en otro dominio VHH (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 2008/020079 para ver los ejemplos no limitantes de estas sustituciones), aunque la invención en general no está limitada a los mismos. Por consiguiente, cualquiera o más sustituciones, supresiones o inserciones, o cualquier combinación de las mismas, ya sea que mejoren las propiedades de los agentes NB de la invención, o bien que cuando menos no detracten demasiado las propiedades deseadas o el balance o la combinación de propiedades deseadas de los agentes NB de la invención (es decir, hasta el grado en que el agente NB ya no sea adecuado para su uso pretendido) se incluyen dentro del alcance de la invención. Una persona experta será capaz de determinar y seleccionar en general las sustituciones, supresiones o inserciones adecuadas, o las combinaciones adecuadas de las mismas, basándose en la divulgación de la presente, y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, la cual, por ejemplo, puede involucrar la introducción de un número limitado de posibles sustituciones, y determinar su influencia sobre las propiedades de los agentes NB obtenidos de esta manera.

En un aspecto, dependiendo del organismo huésped utilizado para expresar el agente NB (es decir, un polinucleótido o polipéptido de la invención) , estas supresiones y/o sustituciones se pueden diseñar de tal manera que se remueven uno o más sitios para la modificación posterior a la traducción (tales como uno o más sitios de glicosi lación) , como estará dentro de la capacidad de la persona experta en la materia. De una manera alternativa, se pueden diseñar sustituciones o inserciones como para introducir uno o más sitios para la unión de los grupos funcionales (como se describe en la presente) , por ejemplo, para permitir la pegi lación específica del sitio (nuevamente como se describe en la presente) .

Como se proporciona en la Publicación I nternacional N úmero WO 2008/020079 con respecto a las posibles sustituciones de aminoácidos y como se presenta anteriormente, algunos residuos de aminoácidos en las regiones de estructura están más conservados que otros. En un aspecto, aunque la invención en su sentido más amplio no está limitada a las mismas, cualesquiera sustituciones, supresiones o inserciones de preferencia se hacen en las posiciones que están menos conservadas . En un aspecto no limitante , se prefieren las sustituciones de aminoácidos sobre las supresiones o inserciones de aminoácidos.

En un aspecto no limitante , los análogos son tales que pueden enlazarse al DR5 con una afinidad (de una manera adecuada medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente), un índice ka ct¡vado y/o un índice kdesactivad0, o de una manera alternativa, como un valor I C50, como se describe adicionalmente en la presente) , que es como se dispone en la presente , para los agentes NB de la invención.

En un aspecto no limitante, los análogos son tales que conservan las propiedades favorables de los agentes NB, como se describe en la presente.

En una modalidad, los análogos tienen un grado de identidad de secuencia de cuando menos el 70 por ciento, de preferencia de cuando menos el 80 por ciento, más preferiblemente de cuando menos el 90 por ciento, tal como de cuando menos el 95 por ciento o el 99 por ciento o más; y/o de preferencia tienen cuando mucho 20, de preferencia cuando mucho 10, todavía más preferiblemente cuando mucho 5, tal como 4, 3, 2 o solamente 1 diferencia de aminoácido, con una de las construcciones de NB de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104.

En un aspecto no limitante, las secuencias de estructura y las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de los análogos tendrán: (a) un Q en la posición 108; y/o (b) un aminoácido cargado o un residuo de cisteína en la posición 45 y de preferencia un E en la posición 44, y de una manera muy preferible E en la posición 44 y R en la posición 45; y/o (c) P, R o S en la posición 103.

En un aspecto no limitante, una clase de análogos de los agentes NB de la invención comprenden los agentes NB que se han humanizado (es decir, comparándose con la secuencia de los agentes NB que se presentan naturalmente de la invención). Como se menciona en la técnica antecedente citada en la presente, la humanización en términos generales involucra reemplazar uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de una VHH que se presenta naturalmente, con los residuos de aminoácidos que se presentan en la misma posición en un dominio VH humano, tal como un dominio VH3 humano. Los ejemplos de las posibles sustituciones de humanización o combinaciones de las sustituciones de humanización quedarán claros para la persona experta, por ejemplo, a partir de las Tablas de la presente, a partir de las posibles sustituciones de humanización mencionadas en la técnica antecedente citada en la presente, y/o a partir de una comparación entre la secuencia de un agente NB y la secuencia de un dominio VH que se presenta naturalmente.

En un aspecto no limitante, las sustituciones de humanización se seleccionan de tal manera que los agentes NB humanizados resultantes todavía conservan las propiedades favorables de los agentes NB como se dispone en la presente, y además de tal manera que son como se describe para los análogos en los párrafos anteriores. Una persona experta será capaz de determinar y seleccionar las sustituciones de humanización generalmente adecuadas o las combinaciones adecuadas de las sustituciones de humanización, basándose en la divulgación de la presente, y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, la cual, por ejemplo, puede involucrar introducir un número limitado de las posibles sustituciones de humanización, y determinar su influencia sobre las propiedades de los agentes NB obtenidos de esta manera.

En un aspecto no limitante, como un resultado de la humanización, los agentes NB de la invención pueden llegar a ser más "tipo humanos", mientras que todavía conserven las propiedades favorables de los agentes NB de la invención, como se describe en la presente. Como un resultado, los agentes NB humanizados pueden tener varias ventajas, tales como una inmunogenicidad reducida, comparándose con los dominios VHH que se presentan naturalmente correspondientes. Nuevamente, basándose en la divulgación de la presente, y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, la persona experta será capaz de seleccionar las sustituciones de humanización o las combinaciones adecuadas de las sustituciones de humanización que optimizan o logran un equilibrio deseado o adecuado entre las propiedades favorables proporcionadas por las sustituciones de humanización por una parte, y las propiedades favorables de los dominios VHH que se presentan naturalmente, por otra parte.

Los agentes NB de la invención se pueden humanizar adecuadamente en cualesquiera residuos de estructura, tal como en uno o más residuos Hallmark, o en uno o más residuos de estructura diferentes (es decir, residuos que no son Hallmark) o cualquier combinación adecuada de los mismos. Una sustitución de humanización preferida para los agentes NB del "grupo P,R,S-103" o del "grupo KERE" es Q108 en L108. Los agentes NB de la "clase GLEW" también se pueden humanizar mediante una sustitución de Q108 en L108, en el entendido de que cuando menos uno de los otros residuos Hallmark contenga una sustitución de camélido (camelizante). Por ejemplo, como se menciona en la presente, una clase particularmente preferida de los agentes NB humanizados tiene una secuencia GLEW o una secuencia tipo GLEW en las posiciones 44-47; P, R o S (y en particular R) en la posición 103, y un L en la posición 108.

Los análogos humanizados y otros análogos, y las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, se pueden proporcionar de cualquier manera conocida por sí misma, por ejemplo, empleando una o más de las técnicas mencionadas en páginas 103 y 104 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079.

En un aspecto no limitante, una clase de análogos de los agentes NB de la invención comprende los agentes NB que se han humanizado (es decir, comparándose con la secuencia de un agente NB que se presenta naturalmente de la invención). Como se menciona en la técnica antecedente citada en la presente, la humanización en términos generales involucra reemplazar uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de una VHH que se presenta naturalmente, con los residuos de aminoácidos que se presentan en la misma posición en un dominio VH humano, tal como un dominio VH3 humano. Los ejemplos de las posibles sustituciones de humanización o de las combinaciones de las sustituciones de humanización, quedarán claros para la persona experta, por ejemplo, a partir de las Tablas de la presente, a partir de las posibles sustituciones de humanización mencionadas en la técnica antecedente citada en la presente, y/o a partir de una comparación entre la secuencia de un agente NB y la secuencia de un dominio VH que se presente naturalmente.

En un aspecto no limitante, las sustituciones de humanización se seleccionan de tal manera que los agentes NB humanizados resultantes todavía conservan las propiedades favorables de los agentes NB, como se dispone en la presente, y de una manera muy preferible, de tal manera que son como se describe para los análogos en los párrafos anteriores. Una persona experta será capaz de determinar y seleccionar las sustituciones de humanización generalmente adecuadas o las combinaciones adecuadas de las sustituciones de humanización, basándose en la divulgación de la presente, y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, la cual, por ejemplo, puede involucrar introducir un número limitado de las posibles sustituciones de humanización, y determinar su influencia sobre las propiedades de los agentes NB obtenidos de esta manera.

En términos generales, como un resultado de la humanización, los agentes NB de la invención pueden llegar a ser más "tipo humanos", mientras que todavía conservan las propiedades favorables de los agentes NB de la invención, como se describe en la presente. Como un resultado, los agentes NB humanizados pueden tener varias ventajas, tales como una inmunogenicidad reducida, comparándose con los dominios VHH que se presentan naturalmente correspondientes. Nuevamente, basándose en la divulgación de la presente, y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, la persona experta será capaz de seleccionar las sustituciones de humanización o las combinaciones adecuadas de las sustituciones de humanización que optimicen o logren un equilibrio deseado o adecuado entre las propiedades favorables proporcionadas por las sustituciones de humanización por una parte, y las propiedades favorables de los dominios VHH que se presentan naturalmente, por otra parte.

Los agentes NB de la invención se pueden humanizar adecuadamente en cualesquiera residuos de estructura, tal como en uno o más residuos Hallmark (como se definen en la Publicación Internacional Número WO 2008/020079) o en uno o más residuos de estructura diferentes (es decir, residuos que no son Hallmark), o cualquier combinación adecuada de los mismos.

Los análogos humanizados y otros análogos, y las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, se pueden proporcionar de cualquier manera conocida por sí misma. Por ejemplo, los análogos se pueden obtener proporcionando un ácido nucleico que codifique un dominio VHH que se presente naturalmente, cambiar los codones para el uno o más residuos de aminoácidos que van a ser sustituidos en los codones por los residuos de aminoácidos deseados correspondientes (por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio o mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores de malos emparejamientos adecuados), expresar la secuencia de ácido nucleico/de nucleótidos obtenida de esta manera en un huésped o sistema de expresión adecuado; y opcionalmente aislar y/o pu rificar el análogo obtenido de esta manera, para proporcionar este análogo en una forma esencialmente aislada (por ejemplo, como se describe adicionalmente en la presente) .

Esto se puede llevar a cabo en térmi nos generales empleando los métodos y las técnicas conocidas por sí mismas, las cuales quedarán claras para la persona experta, por ejemplo, a parti r de los libros de texto y las referencias citadas en la presente , la técnica antecedente citada en la presente, y/o a partir de la descripción adicional en la presente . De una manera alternativa, un ácido nucleico que codifique el análogo deseado se puede si ntetizar de una manera conocida por sí misma (por ejemplo utilizando un aparato automatizado para sintetizar las secuencias de ácidos nucleicos con u na secuencia de aminoácidos previamente definida) , y entonces se puede expresar como se describe en la presente. Todavía otra técnica puede i nvolucrar la combinación de una o más secuencias de ácidos nucleicos que se presentan natu ral mente y/o sintéticas, cada una codificando una parte del análogo deseado, y entonces expresar la secuencia de ácido n ucleico combi nada, como se describe en la presente. También , los análogos se pueden proporcionar utilizando una síntesis qu ímica de la secuencia de aminoácidos pertinente , empleando técnicas para la s íntesis de péptidos conocidas por sí mismas , tales como aquél las mencionadas en la presente .

En este aspecto, también quedará claro para la persona experta, que los agentes NB de la invención (incluyendo sus análogos) se pueden diseñar y/o preparar empezando a partir de las secuencias VH humanas (es decir, las secuencias de aminoácidos o las secuencias de nucleótidos correspondientes), tales como, por ejemplo, a partir de las secuencias VH3 humanas, tales como DP-47, DP-51 o DP-29, es decir, mediante la introducción de una o más sustituciones camelizantes (es decir, cambiar uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del dominio VH humano en los residuos de aminoácidos que se presentan en la posición correspondiente en un dominio VHH). como para proporcionar la secuencia de un agente NB de la invención y/o como para conferir las propiedades favorables de un agente NB a la secuencia obtenida de esta manera. Nuevamente, esto se puede llevar a cabo en términos generales empleando los diferentes métodos y técnicas referidas en el párrafo anterior, utilizando una secuencia de aminoácidos y/o una secuencia de nucleótidos para un dominio VH humano como un punto de partida.

Como se menciona, estará claro para la persona experta que los agentes NB de la invención (incluyendo sus análogos) se pueden diseñar y/o preparar empezando a partir de las secuencias VH humanas (es decir, las secuencias de aminoácidos o las secuencias de nucleótidos correspondientes), tales como, por ejemplo, a partir de las secuencias VH3 humanas, tales como DP-47, DP-51 o DP-29, es decir, mediante la introducción de una o más sustituciones camelizantes (es decir, cambiar uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del dominio VH humano en los residuos de aminoácidos que se presentan en la posición correspondiente en un dominio VHH), como para proporcionar la secuencia de un agente NB de la invención y/o como para conferir las propiedades favorables de un agente NB a la secuencia obtenida de esta manera. Nuevamente, esto se puede llevar a cabo en términos generales empleando los diferentes métodos y técnicas referidas en el párrafo anterior, utilizando una secuencia de aminoácidos y/o una secuencia de nucleótidos para un dominio VH humano como un punto de partida.

Algunas sustituciones camelizantes no limitantes se pueden derivar a partir de la Publicación Internacional Número WO 2008/020079. Quedará claro que las sustituciones camelizantes en uno o más de los residuos Hallmark tendrán en general una mayor influencia sobre las propiedades deseadas, que las sustituciones en una o más de las otras posiciones de aminoácidos, aunque se incluyen ambas y cualquier combinación adecuada de las mismas dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, es posible introducir una o más sustituciones camelizantes que ya confieran cuando menos algunas propiedades deseadas, y entonces introducir otras sustituciones camelizantes ya sea que mejoren adicionalmente esas propiedades y/o confieran propiedades favorables adicionales. Nuevamente, la persona experta será capaz de determinar y seleccionar las sustituciones camelizantes generalmente adecuadas o las combinaciones adecuadas de las sustituciones camelizantes, basándose en la divulgación de la presente, y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, la cual, por ejemplo, puede involucrar introducir un número limitado de posibles sustituciones camelizantes, y determinar si se obtienen o se mejoran las propiedades favorables de los agentes NB (es decir, comparándose con el dominio original VH original).

En un aspecto no limitante, las sustituciones camelizantes son tales que la secuencia de aminoácidos resultante cuando menos contiene: (a) un Q en la posición 108; y/o (b) un aminoácido cargado o un residuo de cisteína en la posición 45, y de preferencia también un E en la posición 44, y de una manera muy preferible E en la posición 44 y R en la posición 45; y/o (c) P, R o S en la posición 103; y opcionalmente una o más sustituciones camelizantes adicionales. En un aspecto no limitante, las sustituciones camelizantes son tales que dan como resultado un agente NB de la invención y/o un análogo del mismo, tal como un análogo humanizado y/o de preferencia un análogo que es como se proporciona en los párrafos anteriores.

Como también quedará claro a partir de la divulgación en la presente, también está dentro del alcance de la invención utilizar partes o fragmentos, o combinaciones de dos o más partes o fragmentos, de los agentes NB de la invención, como se dispone en la presente, y en particular partes o fragmentos de los agentes NB de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104, y de las SEQ ID NOs: 96-99. Por consiguiente, de acuerdo con un aspecto de la invención, el término "agentes NB de la invención", en su sentido más amplio, también cubre esas partes o f ragmentos .

En térmi nos generales , las partes o f ragmentos de los agentes NB de la invención (incl uyendo los análogos de los mismos) tienen secuencias de aminoácidos en donde , comparándose con la secuencia de ami noácidos del agente N B de longitud completa correspondiente de la invención (o del análogo del mismo) , se han supri mido y/o removido uno o más de los residuos de ami noácidos en el extremo N-termi nal , uno o más residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal , uno o más residuos de aminoácidos internos contiguos, o cualquier combinación de los mismos.

Las partes o los fragmentos son de preferencia tales que pueden enlazarse a un DR5, por ejemplo, el DR5 humano, con una afinidad (de una manera adecuada medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente) , u n valor KA (real o aparente) , un índice kactivado y/o un índice kd esactiVado > o de una manera alternativa, como un valor I C50 , como se describe adicionalmente en la presente) q ue es como se dispone en la presente , para los agentes NB de la invención .

Cualquier parte o fragmento es de preferencia tal que comprende cuando menos 1 0 residuos de aminoácidos contiguos , de preferencia cuando menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, más preferiblemente cuando menos 30 residuos de ami noácidos contiguos, tal como cuando menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, de la secuencia de aminoácidos del agente NB de longitud completa correspondiente de la invención .

También, cualquier parte o fragmento es tal que de preferencia comprende cuando menos una de las CDR1, CDR2 y/o CDR3, o cuando menos parte de las mismas (y en particular cuando menos la CDR3 o cuando menos parte de la misma). Más preferiblemente, cualquier parte o fragmento es tal que comprende cuando menos una de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) (y de preferencia cuando menos la CDR3 o parte de la misma), y cuando menos otra CDR (es decir, CDR1 o CDR2) o cuando menos parte de la misma, de preferencia conectadas por secuencias de estructura adecuadas o cuando menos parte de las mismas. Más preferiblemente, cualquier parte o fragmento es tal que comprende cuando menos una de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) (y de preferencia cuando menos la CDR3 o parte de la misma), y cuando menos parte de las dos CDRs restantes, nuevamente de preferencia conectadas por secuencias de estructura adecuadas o cuando menos parte de las mismas.

De acuerdo con otro aspecto particularmente preferido, pero no limitante, esa parte o fragmento comprende cuando menos la CDR3, tal como FR3, CDR3 y FR4 del agente NB de longitud completa correspondiente de la invención, es decir, como se describe, por ejemplo, en la Solicitud Internacional Número WO 03/050531 (Lasters y colaboradores).

Como ya se mencionó en la presente, también es posible combinar dos o más de esas partes o fragmentos (es decir, a partir de los mismos o diferentes agentes NB de la invención), es decir, para proporcionar un análogo y/o para proporcionar partes o fragmentos adicionales de un agente N B de la invención . Por ejemplo , también es posible combinar una o más partes o fragmentos de un agente N B de la invención con una o más partes o fragmentos de un dominio VH humano.

De acuerdo con un aspecto, las partes o los fragmentos tienen un grado de identidad de secuencia de cuando menos el 50 por ciento, de cuando menos el 60 por ciento , de cuando menos el 70 por ciento, de cuando menos el 80 por ciento, y/o de cuando menos el 90 por ciento , el 95 por ciento, o el 99 por ciento o más con uno de los agentes N B de las S EQ I D NOs : 1 -22 , 26-40, 87-88, y 1 03-1 04, y con las SEQ I D NOs: 96-99.

Las partes y fragmentos, y las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican , se pueden proporcionar y opcionalmente combinar de cualquier manera conocida por s í misma. Por ejemplo, esas partes o fragmentos se pueden obtener mediante la inserción de un codón de paro en un ácido nucleico que codifique un agente N B de tamaño completo de la invención , y entonces expresar el ácido nucleico obtenido de esta manera de una manera conocida por sí misma (por ejemplo, como se descri be en la presente) . De una manera alternativa, los ácidos nucleicos que codifican esas partes o fragmentos se pueden obtener mediante la restricción adecuada de un ácido nucleico que codifique un agente N B de tamaño completo de la invención , o mediante la s íntesis de este ácido n ucleico de una manera conocida por sí misma. También se pueden proporcionar partes o fragmentos empleando las técnicas para la s íntesis de péptidos conocidas por sí mismas.

La i nvención , en su sentido más amplio, también comprende derivados de los agentes N B de la invención. Estos derivados se pueden obtener en términos generales mediante la modificación , y en particular mediante la modificación química y/o biológica (por ejemplo, enzimática) , de los agentes NB de la invención y/o de uno o más de los residuos de aminoácidos que forman los agentes NB de la invención .

Los ejemplos de estas modificaciones, así como los ejemplos de los residuos de aminoácidos dentro de la secuencia del agente NB q ue se pueden modificar de esta manera (es deci r, ya sea sobre la estructura base del polipéptido, pero de preferencia sobre una cadena lateral) , los métodos y las técnicas que se pueden utilizar para introduci r estas modificaciones y los usos potenciales y las ventajas de estas modificaciones quedarán claros para la persona experta .

En un aspecto no limitante , está modificación invol ucra la introducción (por ejemplo, mediante enlace covalente o de otra manera adecuada) de uno o más grupos funcionales, de residuos o fracciones en o sobre el agente NB de la invención , y en particular de uno o más grupos funcionales, de residuos o fracciones que confie ran u na o más propiedades o funcionalidades deseadas al agente NB de la invención . Los ejemplos de estos grupos funcionales quedarán claros para la persona experta.

En un aspecto no limitante , esta modificación comprende la i ntroducción (por ejemplo , mediante en lace covalente o de cualquier otra manera adecuada) de uno o más grupos fu ncionales que aumenten la vida media , la solubilidad y/o la absorción del agente NB de la invención , que reduzcan la inmunogenicidad y/o la toxicidad del agente N B de la i nvención , que el iminen o atenúen cualesq uiera efectos secundarios indeseables del agente N B de la invención , y/o que confieran otras propiedades convenientes a, y/o que reduzcan las propiedades indeseadas de los agentes NB y/o de los polipéptidos de la invención ; o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. Los ejemplos de estos grupos funcionales y de las técnicas para introduci rlos quedarán claros para la persona experta, y en términos generales pueden comprender a todos los grupos funcionales y las técnicas mencionadas en la técnica antecedente general citada anteriormente en la presente , así como los grupos funcionales y las técnicas conocidas por s í mismas para la modificación de las proteínas farmacéuticas, y en particular para la modificación de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (incl uyendo ScFvs y los anticuerpos de un solo dominio) , para lo cual se hace referencia, por ejemplo, a Remi ngton's Pharmaceutical Sciences, 16a Edición , Mack Publishi ng Co. , Easton , PA ( 1 980) . Estos grupos funcionales, por ejemplo , se pueden enlazar di rectamente (por ejemplo, de una manera covalente) a un agente N B de la invención , u opcionalmente por medio de un en lazador o separador adecuado, como nuevamente quedará claro para la persona experta.

Una de las técnicas más ampliamente empleadas para aumentar la vida media y/o para reducir la inmunogenicidad de las proteínas farmacéuticas, comprende la unión dentro de un polímero farmacológicamente aceptable adecuado, tal como poli-(etilenglicol) (PEG) o derivados del mismo (tales como metoxi-poli-(etilenglicol) o mPEG). En términos generales, se puede utilizar cualquier forma adecuada de pegilacion, tal como la pegilacion utilizada en la materia para anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo, pero no limitándose a, los anticuerpos de (un solo) dominio y los ScFvs); véanse, por ejemplo, Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003), y la Publicación Internacional Número WO 04/060965. También hay diferentes reactivos para la pegilacion de proteínas comercialmente disponibles, por ejemplo, en Nektar Therapeutics, EUA.

En una modalidad, se utiliza la pegilacion dirigida al sitio, en particular por medio de un residuo de cisteína (véase, por ejemplo, Yang y colaboradores, Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)). En diferentes modalidades, para este propósito, el PEG está unido a un residuo de cisteína que se presenta naturalmente en un agente NB de la invención. Un agente NB de la invención se puede modificar como para introducir adecuadamente uno o más residuos de cisteína para la unión de PEG, o una secuencia de aminoácidos que comprenda uno o más residuos de cisteína para la unión de PEG, se puede fusionar con el término N y/o C de un agente NB de la invención, todos empleando las técnicas de diseño de proteínas conocida por sí misma para la persona experta.

En una modalidad, para los agentes NB y las proteínas de la invención, se utiliza un PEG con un peso molecular de más de 5,000, tal como de más de 10,000 y menor de 200,000, tal como menor de 100,000; por ejemplo, en el intervalo de 20,000 a 80,000.

En una modalidad, la modificación comprende una glicosilación enlazada por nitrógeno (N) o enlazada por oxígeno (O), usualmente como parte de la modificación junto con la traducción y/o posterior a la traducción, dependiendo de la célula huésped utilizada para expresar el agente NB o el polipéptido de la invención.

En una modalidad, la modificación puede comprender la introducción de una o más marcas detectables u otros grupos o fracciones generadoras de señales, dependiendo del uso pretendido del agente NB marcado. Las marcas y técnicas adecuadas para unirlas, usarlas, y detectarlas, quedarán claras para la persona experta y, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, marcas fluorescentes, marcas fosforescentes, marcas quimiluminiscentes, marcas bioluminiscentes, radio-isótopos, metales, quelatos de metales, cationes metálicos, cromóforos y enzimas, tales como aquéllos mencionados en la página 109 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079. Otras marcas adecuadas quedarán claras para la persona experta y, por ejemplo, incluyen las fracciones que se pueden detectar utilizando espectroscopia de RMN o ESR.

Los agentes NB marcados y los polipéptidos de la invención, por ejemplo, se pueden utilizar para los ensayos in vitro, in vivo o in situ (incluyendo los inmunoensayos conocidos por sí mismos, tales como ELISA, RIA, EIA y otros "ensayos de emparedado", etc.), así como para propósitos de diagnóstico y de toma de imágenes in vivo, dependiendo de la elección de la marca específica.

En una modalidad, la modificación puede involucrar la introducción de un grupo quelante, por ejemplo, para quelar uno de los metales o cationes metálicos referidos anteriormente. Los grupos quelantes adecuados incluyen, por ejemplo, sin limitación, ácido dietilen-triamina-penta-acético (DTPA) o ácido etilen-diamina-tetra-acético (EDTA).

En una modalidad, la modificación puede comprender la introducción de un grupo funcional que sea una parte de un par de enlace específico, tal como el par de enlace de biotina-(estrept)avidina. Este grupo funcional se puede utilizar para el enlace del agente NB de la invención a otra proteína, polipéptido o compuesto químico que se enlace a la otra mitad del par de enlace, es decir, a través de la formación del par de enlace. Por ejemplo, un agente NB de la invención se puede conjugar con biotina, y se puede enlazar a otra proteína, polipéptido, compuesto o vehículo conjugado con avidina o estreptavidina. Por ejemplo, este agente NB conjugado se puede utilizar como un reportero, por ejemplo, en un sistema de diagnóstico en donde se conjugue un agente productor de una señal detectable con avidina o estreptavidina. Estos pares de enlace , por ejemplo, también se pueden utilizar para enlazar el agente N B de la invención a un veh ículo , incluyendo los veh ículos adecuados para propósitos farmacéuticos. U n ejemplo no limitante es el de las formulaciones l i posomales descritas por Cao y Su resh , Journal of Drug Targeting, 8, 4, 257 (2000) . Estos pares de enlace también se pueden utilizar para enlazar un agente terapéuticamente activo con el agente N B de la i nvención .

Para algunas aplicaciones , en particular para las apl icaciones en donde se pretenda aniquilar una cél ula que exprese el objetivo contra el cual se dirijan los agentes N B de la invención (por ejemplo, en el tratamiento de cáncer) , o reduci r o hacer más lento el crecimiento y/o la proliferación de esta célula, los agentes NB de la invención también se pueden enlazar a una toxina o a un residuo o una fracción (cito)tóxica. Los ejemplos de las fracciones, los compuestos, o los residuos tóxicos que se pueden en lazar a un agente NB de la i nvención para proporcionar - por ejemplo - u n compuesto citotóxico, estarán claros para la persona experta y, por ejemplo , se pueden encontrar en las referencias de la técnica citadas anteriormente y/o en la descripción adicional en la presente . Un ejemplo es la tecnología denominada como ADE PTM R descrita en la Publicación I nternacional Número WO 03/055527.

Otras modificaciones qu ímicas y enzimáticas potenciales estarán claras para la persona experta y están dentro del alcance de la i nvención . Estas modificaciones también se pueden introduci r para propósitos de investigación (por ejemplo, para estudiar las relaciones de función-actividad). Se hace referencia, por ejemplo, a Lundblad y Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997).

En un aspecto no limitante, los derivados son tales que se enlazan al DR5, por ejemplo, al DR5 humano, con una afinidad (de una manera adecuada medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente), un valor KA (real o aparente), un índice kact¡vado y/o un índice kdesactivado, o de una manera alternativa, como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se dispone en la presente, para los agentes NB de la invención.

Como se menciona en la presente, la invención también se refiere a proteínas o polipéptidos que consisten esencialmente en, o que comprenden cuando menos un agente NB de la invención. "Consisten esencialmente en" significa que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención es ya sea exactamente igual a la secuencia de aminoácidos de un agente NB de la invención, o bien corresponde a la secuencia de aminoácidos de un agente NB de la invención que tiene un número limitado de residuos de aminoácidos, tal como de 1 a 20 residuos de aminoácidos, por ejemplo, de 1 a 10 residuos de aminoácidos, y de preferencia de 1 a 6 residuos de aminoácidos, tal como 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de aminoácidos, agregados en el extremo amino-terminal, en el extremo carboxi-terminal, o tanto en el extremo amino-terminal como en el extremo carboxi-terminal de la secuencia de aminoácidos del agente NB.

Estos residuos de aminoácidos pueden o no cambiar, alterar, o influenciar de otra manera apreciablemente las propiedades (biológicas) del agente NB, y pueden o no agregar u na funcionalidad adicional al agente NB. Por ejemplo, estos residuos de ami noácidos: a) pueden comprender un residuo Met N-terminal , por ejemplo, como resu ltado de la expresión en una célula huésped o un organismo huésped heterólogo; o b) pueden formar una secuencia de señal o secuencia líder que dirija la secreción del agente NB a partir de una célula huésped después de la síntesis . Los péptidos l íder secretores adecuados quedarán claros para la persona experta, y pueden ser como se describe adicionalmente en la presente. Usualmente , esta secuencia l íder se enlazará al térmi no N del agente N B, aunque la invención en su sentido más amplio no está limitada a lo mismo; o c) pueden formar una secuencia o señal que permita que el agente NB se di rija hacia y/o penetre o entre en órganos, tejidos, cél ulas, o partes o compartimientos específicos de las células , y/o que permita al agente NB penetrar o cruzar una barrera biológica, tal como una membrana celular, una capa celular, tal como una capa de células epitel iales , un tumor, incluyendo tumores sól idos, o la barrera hematoencefál ica. Los ejemplos de estas secuencias de aminoácidos estarán claras para la persona experta, e i ncluyen aquéllas mencionadas en el párrafo c) de la pági na 1 1 2 de la Publicación I nternacional Número WO 08/020079 ; o d) pueden formar una "marca", por ejemplo, una secuencia de aminoácidos o un residuo que permita o facilite la purificación del agente NB, por ejemplo, utilizando técnicas de afinidad dirigidas contra esa secuencia o residuo. Posteriormente, dicha secuencia o residuo se puede remover (por ejemplo, mediante disociación química o enzimática), para proporcionar la secuencia del agente NB (para este propósito, la marca se puede enlazar opcionalmente a la secuencia del agente NB por medio de una secuencia enlazadora disociable o puede contener un motivo disociable). Algunos ejemplos no limitantes de estos residuos son una o más de cada una de una marca cMyc (SEQ ID NO: 91), múltiples residuos de histidina tal como la marca Hisx6 (SEQ ID NO: 92), o una combinación de una marca cMyc y la marca Hisx6 (SEQ ID NO: 93 o SEQ ID NO: 94), la marca del sustrato de pegilación (SEQ ID NO: 95), residuos de glutationa y otra marca myc (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 31 de la Publicación Internacional Número WO 06/12282); o e) pueden ser uno o más residuos de aminoácidos que se hayan funcionalizado y/o que puedan servir como un sitio para la unión de los grupos funcionales. Los residuos de aminoácidos y grupos funcionales adecuados estarán claros para la persona experta, e incluyen, pero no se limitan a, los residuos de aminoácidos y grupos funcionales mencionados en la presente para los derivados de los agentes NB de la invención.

De acuerdo con un aspecto, un polipéptido de la invención comprende un agente NB de la invención que se fusiona en su extremo amino-terminal, en su extremo carboxi-terminal, o tanto en su extremo amino-terminal como en su extremo carboxi-terminal , a cuando menos una secuencia de ami noácidos adicional , es deci r, como para proporcionar una proteína de fusión que comprenda al agente N B de la invención y la una o más secuencias de aminoácidos adicionales . Esta fusión es referida en la presente como una "fusión del agente NB".

La una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden ser cualesquiera secuencias de aminoácidos adecuadas y/o deseadas. Las secuencias de aminoácidos adicionales pueden o no cambiar, alterar, o de otra manera infl uenciar las propiedades (biológicas) del agente N B, y pueden o no agregar una funcionalidad adicional al agente N B o al pol ipéptido de la invención . De prefe rencia, la secuencia de aminoácidos adicional es tal que confie re una o más propiedades o funcionalidades deseadas al agente NB o al polipéptido de la invención.

Por ejemplo, la secuencia de ami noácidos adicional también puede proporcionar un segundo sitio de enlace , cuyo sitio de enlace se puede di rigi r contra cualquier proteína, polipéptido , antígeno, dete rminante antigénico o ep ítopo deseado (incl uyendo, pero no limitándose a, la misma proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo contra el cual se di rija el agente N B de la invención , o contra una proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo diferente) .

Los ejemplos de tales secuencias de ami noácidos q uedarán claros para la persona experta , y en términos generales pueden comprender todas las secuencias de aminoácidos que se utilizan en las fusiones de péptidos, basándose en los anticuerpos convencionales y fragmentos de los mismos (incluyendo, pero no limitándose a, los ScFvs y los anticuerpos de un solo dominio). Se hace referencia, por ejemplo, a la reseña por Holliger y Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005).

En un aspecto no limitante, esta secuencia de aminoácidos es una secuencia de aminoácidos que aumenta la vida media, la solubilidad, o la absorción, reduce la inmunogenicidad o la toxicidad, elimina o atenúa los efectos secundarios indeseables, y/o confiere otras propiedades convenientes a, y/o reduce las propiedades indeseadas de, los polipéptidos de la invención, comparándose con el agente NB de la invención por sí mismo. Algunos ejemplos no limitantes de estas secuencias de aminoácidos son las proteínas de suero, tales como albúmina de suero humano (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 00/27435) o las moléculas hapténicas (por ejemplo, los haptenos que son reconocidos por los anticuerpos circulantes, véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 98/22141).

En particular, se ha descrito en la materia que se pueden utilizar fragmentos de enlace de inmunoglobulinas (tales como los dominios VH) a la albúmina de suero o a los fragmentos de la misma, para aumentar la vida media. Se hace referencia, por ejemplo, a las Publicaciones Internacionales Números WO 00/27435 y WO 01/077137. De acuerdo con la invención, un agente NB de la invención de preferencia se enlaza ya sea directamente a la albúmina de suero (o a un fragmento adecuado de la misma), o bien por medio de un enlazador adecuado, y en particular por medio de un péptido adecuado enlazado de tal manera que el polipéptido de la invención se puede expresar como una fusión genética (proteína). De acuerdo con un aspecto específico, el agente NB de la invención se puede enlazar a un fragmento de albúmina de suero que comprenda cuando menos el dominio III de la albúmina de suero o parte del mismo. Se hace referencia, por ejemplo, a la Publicación Internacional Número WO 07/112940 de Ablynx N.V.

De una manera alternativa, la secuencia de aminoácidos adicional puede proporcionar un segundo sitio de enlace o unidad de enlace que se dirige contra una proteína de suero (tal como, por ejemplo, albúmina de suero humano u otra proteína de suero, tal como IgG), como para proporcionar una mayor vida media en suero. Tales secuencias de aminoácidos, por ejemplo, incluyen el agente NB descrito más adelante, así como los péptidos pequeños y las proteínas de enlace descritas en las Publicaciones Internacionales Números WO 91/01743, WO 01/45746 y WO 02/076489 y los dAbS descritos en las Publicaciones Internacionales Números WO 03/002609 y WO 04/003019. También se hace referencia a Harmsen y colaboradores, Vaccina, 23 (41); 4926-42, 2005, así como a la Patente Europea Número EP 0 368 684, y a las Publicaciones Internacionales Números WO 2006/122787WO 2008/028977, WO 2008/043821, WO 2008/068280 y WO 2009/127691 por Ablynx N.V.

Tales secuencias de aminoácidos se pueden dirigir en particular contra la albúmina de suero (y más particularmente, contra la albúmina de suero humano) y/o contra la IgG (y más particularmente, contra la IgG humana). Por ejemplo, tales secuencias de aminoácidos pueden ser secuencias de aminoácidos que se dirigen contra la albúmina de suero (humano), y las secuencias de aminoácidos que se pueden enlazar a residuos de aminoácidos sobre la albúmina de suero (humano) que no estén involucradas en el enlace de la albúmina de suero al FcRn (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 06/0122787) y/o las secuencias de aminoácidos que son capaces de enlazarse a los residuos de aminoácidos sobre la albúmina de suero que no forman parte del dominio III de la albúmina de suero (véase nuevamente, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 06/0122787); la secuencias de aminoácidos que tienen o pueden proporcionar un aumento de la vida media (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 08/028977 por Ablynx N.V); las secuencias de aminoácidos contra la albúmina de suero humano que reaccionan cruzadamente con la albúmina de suero a partir de cuando menos una especie de mamífero, y en particular con cuando menos una especie de primate (tales como, sin limitación, monos a partir del género Macaca (tales como, y en particular, monos cinomolgos, conocidos como "ciño" {Macaca fascicularis) y/o monos Rhesus (Macaca mulatta)), y babuinos (Papio ursinus), nuevamente se hace referencia a la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 60/843,349) ; las secuencias de ami noácidos que se pueden enlazar a la albúmi na de suero de una manera independiente del pH (véase , por ejemplo , la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 60/850 ,774 por Ablynx N .V. titulada como "Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and uses thereof , presentada el 1 1 de Octubre de 2006) y/o las secuencias de aminoácidos que son aglutinantes condicionales (véase , por ejemplo, la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 60/850, 775 por Ablynx N .V . titulada como "Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner", presentada el 1 1 de Octubre de 2006) , y las Publ icaciones I nternacionales Números WO 2006/1 22787, WO 2008/028977, WO 2008/043821 , WO 2008/068280 y WO 2009/127691 .

De acuerdo con otro aspecto, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender una o más partes, fragmentos o dominios de anticuerpos de cuatro cadenas convencionales (y en particular, anticuerpos hu manos) y/o de anticuerpos de cadena pesada. Por ejemplo, au nque usual mente es menos pref erido, un agente NB de la invención se puede enlazar a un domi nio VH o VL convencional (de preferencia, humano) , o a un análogo natural o si ntético de un domi nio VH o Vu, de nuevo opcionalmente por medio de una secuencia enlazadora (i ncluyendo, pero no limitándose a, otros anticuerpos de (un solo) dominio, tales como los dAbs descritos por Ward y colaboradores).

El cuando menos un agente NB puede estar enlazado a uno o más dominios CH1, CH2 y/o CH3 (de preferencia humanos), opcionaimente por medio de una secuencia enlazadora. Por ejemplo, un agente NB enlazado a un dominio CH1 adecuado se podría utilizar - junto con las cadenas ligeras adecuadas - para generar fragmentos de anticuerpos/estructuras análogas a los fragmentos Fab o los fragmentos F(ab')2 convencionales, pero en donde uno o (en el caso de un fragmento F(ab')2) o ambos de los dominios VH convencionales han sido reemplazados por un agente NB de la invención. También, dos agentes NB se podrían enlazar a un dominio CH3 (opcionaimente por medio de un enlazador), para proporcionar una construcción con una mayor vida media in vivo.

En un aspecto de la invención, uno o más agentes NB de la invención se enlazan a una o más partes, fragmentos o dominios de anticuerpos que confieran una o más funciones efectoras al polipéptido de la invención, y/o que puedan conferir la capacidad para enlazarse a uno o más receptores Fe. Por ejemplo, para este propósito, y sin limitarse a lo mismo, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender uno o más dominios CH2 y/o CH3 de un anticuerpo, tal como a partir de un anticuerpo de cadena pesada (como se describe en la presente), y de una manera muy preferible, a partir de un anticuerpo de 4 cadenas humano convencional; y/o pueden formar (parte de), la región Fe, por ejemplo, a partir de IgG, a partir de IgE, o a partir de otra Ig humana. Por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 94/04678 describe anticuerpos de cadena pesada que comprenden un dominio VHH de Camélido o un derivado humanizado del mismo, en donde los dominios CH2 y/o CH3 de Camélido han sido reemplazados por los dominios CH2 y CH3 humanos, como para proporcionar una inmunoglobulina que consiste en dos cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende un dominio VHH y los dominios CH2 y CH3 humanos (pero no el dominio CH1), cuya inmunoglobulina tiene la función efectora proporcionada por los dominios CH2 y CH3 y cuya inmunoglobulina puede funcionar sin la presencia de cadenas ligeras. Otras secuencias de aminoácidos que se pueden enlazar de una manera adecuada a los agentes NB de la invención como para proporcionar una función efectora quedarán claras para la persona experta, y se pueden seleccionar con base en las funciones efectoras deseadas. Se hace referencia, por ejemplo, a las Publicaciones Internacionales Números WO 04/058820, WO 99/42077 y WO 05/017148, así como a la reseña por Holliger y Hudson, supra. El acoplamiento de un agente NB de la invención a una porción Fe también puede conducir a una mayor vida media, comparándose con el agente NB correspondiente de la invención. Para algunas aplicaciones, el uso de una porción Fe y/o de los dominios constantes (es decir, los dominios CH2 y/o CH3) que confieren una mayor vida media sin ninguna función efectora biológicamente significativa, también puede ser adecuado o incluso preferido. Otras construcciones adecuadas que comprenden uno o más agentes N B y uno o más dominios constantes con una mayor vida media in vivo quedarán claras para la persona experta, y, por ejemplo , pueden comprender dos agentes N B enlazados a un dominio CH3, opcionalmente por medio de una secuencia enlazadora. En términos generales , cualquier proteína de fusión o sus derivados con una mayor vida media de preferencia tendrán un peso molecular de más de 50 kD , el valor de corte para la absorción renal .

Las secuencias de aminoácidos adicionales también pueden formar una secuencia de señal o una secuencia l íde r que di rija la secreción del agente NB o del polipéptido de la invención a partir de una cél ula huésped después de la síntesis (por ejemplo, para proporcionar una pre-, pro- o prepro- forma del polipéptido de la invención , dependiendo de la célula huésped util izada para expresar el polipéptido de la invención).

En un aspecto , una secuencia de aminoácidos adicional forma una secuencia o señal que permite al agente NB o al polipéptido de la invención di rigi rse hacia, y/o penetrar o entrar en los órganos, tejidos, cél ulas, o partes o compartimientos específicos de las células , y/o que permite al agente NB o al polipéptido de la invención penetrar o cruzar una barrera biológica, tal como una membrana celular, una capa cel ular, tal como una capa de cél ulas epiteliales, un tumor, incluyendo tumores sólidos , o la barrera hematoencefálica. Los ejemplos adecuados de estas secuencias de ami noácidos quedarán claros para la persona experta y , por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, aquéllos mencionados en la página 118 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079. Para algunas aplicaciones, en particular para las aplicaciones en donde se pretenda aniquilar una célula que exprese el objetivo contra el cual se dirijan los agentes NB de la invención (por ejemplo, en el tratamiento de cáncer), o reducir o hacer más lento el crecimiento y/o la proliferación de esta célula, los agentes NB de la invención también se pueden enlazar a una proteína o a un polipéptido (cito)tóxico. Los ejemplos de estas proteínas y polipéptidos tóxicos, los cuales se pueden enlazar a un agente NB de la invención para proporcionar - por ejemplo - un polipéptido citotóxico de la invención, estarán claros para la persona experta, y, por ejemplo, se pueden encontrar en las referencias de la técnica citadas anteriormente y/o en la descripción adicional en la presente. Un ejemplo es la tecnología denominada como ADEPTMR descrita en la Publicación Internacional Número WO 03/055527.

En un aspecto no limitante, estas una o más secuencias de aminoácidos adicionales comprenden cuando menos un agente NB adicional, como para proporcionar un polipéptido de la invención que comprende cuando menos dos, tal como tres, cuatro, cinco o más agentes NB, en donde los agentes NB se pueden enlazar opcionalmente por medio de una o más secuencias enlazadoras. Los polipéptidos de la invención que comprenden una, dos o más construcciones de VHH> por ejemplo, como se describe en las páginas 119 y 120 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079, y cuando menos un agente NB de la invención, también serán referidos en la presente como polipéptidos "multivalentes" de la invención, y los agentes NB presentes en estos polipéptidos también serán referidos en la presente como estando en un "formato multivalente".

Los polipéptidos que contienen cuando menos dos agentes NB, en donde cuando menos un agente NB se dirige contra un primer antígeno (es decir, contra el DR5,), y cuando menos un agente NB se dirige contra un segundo antígeno (es decir, diferente del DR5), también serán referidos como polipéptidos "multiespecíficos" de la invención, y el agente NB presente en estos polipéptidos también será referido en la presente como estando en un "formato multiespecífico". Por consiguiente, por ejemplo, un polipéptido "biespecífico" de la invención es un polipéptido que comprende cuando menos un agente NB dirigido contra un primer antígeno (es decir, DR5), más preferiblemente tres, cuatro, cinco o más agentes NB dirigidos contra el DR5, y cuando menos un agente NB adicional dirigido contra un segundo antígeno (es decir, diferente del DR5), mientras que un polipéptido "triespecífico" de la invención es un polipéptido que comprende cuando menos un agente NB dirigido contra a primero antígeno (es decir, un epítopo del DR5), cuando menos un agente NB adicional dirigido contra un segundo antígeno (es decir, un epítopo diferente del DR5 o un antígeno diferente del receptor de TRAIIL), y cuando menos un agente NB adicional dirigido contra un tercer antígeno (es decir, diferente de tanto el DR5 como el segundo antígeno); etc.

De conformidad con lo anterior, en su forma más si mple, un polipéptido biespecífico de la invención es un polipéptido bivalente de la i nvención , el cual comprende un primer agente NB di rigido contra el D R5 , y u n segundo agente N B di rigido contra un segundo antígeno, en donde los pri mero y segundo agentes N B se pueden enlazar opcionalmente por medio de una secuencia enlazadora; mientras que un pol ipéptido triespecífico de la invención en su forma más si mple es un polipéptido trivalente de la i nvención , el cual comprende un primer agente NB dirigido contra el DR5 , un segundo agente NB di rigido contra un segundo antígeno, y un tercer agente N B dirigido contra un tercer antígeno, en donde los pri mero, segundo, y tercer agentes N B se pueden enlazar opcional mente por medio de una o más, y en particular una y más , en particular dos , secuencias enlazadoras .

Como estará claro para parti r de la descripción en la presente , la invención no está li mitada a lo anterior, en el sentido de que un polipéptido multiespecífico de la invención puede comprender cuando menos uno o más agentes NB contra el DR5, y cualquier número de agentes NB dirigidos contra uno o más antígenos diferentes del DR5.

Cuando se hace referencia a un polipéptido específico multivalente o multiespecífico de la invención , se debe observar que esto abarca cualquier orden o configuración de los agentes NB relevantes, a menos que se indique expl ícitamente de otra manera.

Adicionalmente, está dentro del alcance de la invención que los polipéptidos de la i nvención contienen dos o más agentes NB y una o más secuencias de aminoácidos adicionales (como se menciona en la presente).

Para los polipéptidos multivalentes y multiespecíficos que contienen uno o más dominios VHH y su preparación, también se hace referencia a Conrath y colaboradores, J. Biol. Chem., Volumen 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; así como a, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Números WO 96/34103 y WO 99/23221. Algunos otros ejemplos de algunos polipéptidos específicos, multiespecíficos y/o multivalentes de la invención, se pueden encontrar en las solicitudes por Ablynx N.V. referidas en la presente.

Un ejemplo no limitante de un polipéptido multiespecífico de la invención comprende cuando menos un agente NB de la invención, y cuando menos un agente NB que proporciona una mayor vida media. Los agentes NB, por ejemplo, pueden ser agentes NB que se dirigen contra una proteína de suero, y en particular una proteína de suero humano, tal como albúmina de suero humano, proteína de enlace de tiroxina, transferrina (humana), fibrinógeno, una inmunoglobulina tal como IgG, I g E o IgM, o contra una de las proteínas de suero enlistadas en la Publicación Internacional Número WO 04/003019. De éstas, los agentes NB que se pueden enlazar a la albúmina de suero (y en particular a la albúmina de suero humano) o a la IgG (y en particular la IgG humana, véase, por ejemplo, NANOBODYMR VH-1 descrito en la reseña para Muyldermans, supra) son particularmente preferidos (aunque, por ejemplo, para los experimentos en los ratones o primates, se puede utilizar los agentes NB contra, o que reaccionan cruzadamente con, la albúmina de suero de ratón (MSA) o la albúmina de suero a partir de dicho primate, respectivamente. Sin embargo, para uso farmacéutico, normalmente se preferirán los agentes NB contra la albúmina de suero humano o la IgG humana). Los agentes NB que proporcionan una mayor vida media y que se pueden utilizar en los polipéptidos de la invención incluyen los agentes NB dirigidos contra la albúmina de suero que se describen en las Publicaciones Internacionales Números WO 04/041865 y WO 06/122787, y en las solicitudes de patente adicionales por Abiynx N.V., tales como aquéllas mencionadas en la presente.

Por ejemplo, algunos agentes NB preferidos que proporcionan una mayor vida media para utilizarse en la presente invención incluyen los NANOBODIESMR que se pueden enlazar a los residuos de aminoácidos sobre la albúmina de suero (humana) que no están involucrados en el enlace de la albúmina de suero al FcRn (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 06/0122787); los NANOBODIESMR que son capaces de enlazarse a los residuos de aminoácidos sobre la albúmina de suero que no forman parte del dominio III de la albúmina de suero (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 06/0122787); los NANOBODIESMR que tienen o pueden proporcionar un aumento de la vida media (véase, por ejemplo, la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 60/843,349 por Ablynx N.V mencionada en la presente); los NANOBODIES contra la albúmina de suero humano que reaccionan cruzadamente con la albúmina de suero a partir de cuando menos una especie de mamífero, y en particular con cuando menos una especie de primate (tales como, sin limitación, los monos a partir del género Macaca (tales como, y en particular, los monos cinomolgos (Macaca fascicularis) y/o los monos Rhesus (Macaca mulatta)), y los babuinos (Papio ursinus)) (véase, por ejemplo, la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 60/843,349 por Ablynx N.V); los NANOBODIESMR que se pueden enlazar a la albúmina de suero de una manera independiente del pH (véase, por ejemplo, la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 60/850,774 por Ablynx N.V. mencionada en la presente) y/o los NANOBODIESMR que son aglutinantes condicionales (véase, por ejemplo, la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 60/850,775 por Ablynx N.V.).

Algunos NANOBODI ESMR particularmente preferidos que proporcionan una mayor vida media, y que se pueden utilizar en los polipéptidos de la invención, incluyen los NANOBODI ESMR ALB-1 a ALB-10 que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 06/122787 (véanse las Tablas II y III de la misma) de los cuales, el ALB-8 (SEQ ID NO: 62 en la Publicación Internacional Número WO 06/122787) es particularmente preferido.

De acuerdo con un aspecto específico, pero no limitante de la invención, los polipéptidos de la invención contienen, además del uno o más agentes NB de la invención, cuando menos un agente NB contra la albúmina de suero humano.

En una modalidad, cualesquiera polipéptidos de la invención con una mayor vida media que contienen uno o más agentes NB de la invención, y cualesquiera derivados de agentes NB de la invención o de los polipéptidos que tienen una mayor vida media, tienen una vida media que es cuando menos 1.5 veces, y/o cuando menos 2 veces, y/o cuando menos 5 veces, por ejemplo, cuando menos 10 veces o más de 20 veces, mayor de la vida media del agente NB correspondiente de la invención por sí mismo. Por ejemplo, el derivado o los polipéptidos con una mayor vida media pueden tener una vida media que aumenta por más de 1 hora, y/o más de 2 horas, y/o más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, comparándose con el agente NB correspondiente de la invención por sí mismo.

En un aspecto no limitante de la invención, estos derivados o polipéptidos exhiben una vida media en suero humano de cuando menos aproximadamente 12 horas, y/o de cuando menos 24 horas, y/o cuando de menos 48 horas, y/o de cuando menos 72 horas o más. Por ejemplo, estos derivados o polipéptidos pueden tener una vida media de cuando menos 5 días (tal como de aproximadamente 5 a 10 días), y/o de cuando menos 9 días (tal como de aproximadamente 9 a 14 días), y/o de cuando menos aproximadamente 10 días (tal como de aproximadamente 10 a 15 días), y/o de cuando menos aproximadamente 11 días (tal como de aproximadamente 11 a 16 días), y/o de cuando menos aproximadamente 12 días (tal como de aproximadamente 12 a 18 días o más), y/o de más de 14 días (tal como de aproximadamente 14 a 19 días).

De acuerdo con un aspecto de la invención, estos polipéptidos son capaces de enlazarse a una o más moléculas que pueden aumentar la vida media del polipéptido in vivo.

Los polipéptidos de la invención se estabilizan in vivo y su vida media aumenta mediante el enlace con moléculas que resistan a la degradación y/o a la eliminación o al secuestro. Típicamente, estas moléculas son proteínas que se presentan naturalmente que por sí mismas tienen una larga vida media in vivo.

Otro ejemplo no limitante de un polipéptido multiespecífico de la invención comprende cuando menos un agente NB de la invención, y cuando menos un agente NB que dirige el polipéptido de la invención hacia, y/o que permite al polipéptido de la invención penetrar o entrar en los órganos, tejidos, células, o partes o compartimientos específicos de las células, y/o que permite al agente NB penetrar o cruzar una barrera biológica, tal como una membrana celular, una capa celular, tal como una capa de células epiteliales, un tumor, incluyendo tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica. Los ejemplos de los agentes NB incluyen agentes NB que se dirigen hacia proteínas de superficie celular, marcadores o epítopos específicos del órgano, tejido o célula deseada (por ejemplo, los marcadores de superficie celular asociados con las cél ulas tumorales) , y los fragmentos de anticuerpos de dirección al cerebro de un solo dominio descritos en las Publicaciones I nternacionales Números WO 02/057445 y WO 06/0401 53, de los cuales , los ejemplos preferidos son FC44 (SEQ I D NO : 1 89 de la Publ icación I nternacional N úmero WO 06/0401 53) , y FC5 (S EQ I D NO: 1 90 de la Publicación I nternacional Número WO 06/0401 54).

En lazadores En los polipéptidos o compuestos de la invención , uno o más polipéptidos de enlace contra el DR5 , tal como agentes N B y uno o más polipéptidos se pueden enlazar di rectamente unos a otros (como, por ejemplo, los descritos en la Publicación I nternacional Número WO 99/23221 ) y/o se pueden enlazar unos a otros por medio de uno o más espaciadores o enlazadores adecuados , o cualquier combinación de los mismos .

Los espaciadores y enlazadores adecuados para utilizarse en los polipéptidos multivalentes y multiespecíficos quedarán claros para la persona experta, y en términos generales puede ser cualquier enlazador o espaciador utilizado en la materia para enlazar secuencias de aminoácidos . De preferencia, el enlazador o espaciador mencionado será adecuado para utilizarse en proteínas o pol ipéptidos de construcción que se pretendan para uso farmacéutico.

Algunos espaciadores particularmente preferidos i ncluyen espaciadores y enlazadores que se utilizan en la materia para enlazar fragmentos de anticuerpos o dominios de anticuerpos. Éstos incluyen los enlazadores mencionados en los antecedentes generales de la materia citados anteriormente , así como , por ejemplo, los enlazadores que se uti l izan en la materia para la construcción de fragmentos de diacuerpos o ScFv (en este aspecto, sin embargo, se debería observar que, mientras que en los fragmentos de diacuerpos y ScFv, la secuencia enlazadora debería tener una longitud , un grado de flexibilidad y otras propiedades que permitan que los dominios VH y VL pertinentes estén juntos para formar el enlace completo del sitio del antígeno, no hay l i mitación particular en la longitud o flexibilidad del enlazador utilizado en el polipéptido de la invención , debido a que cada agente NB por sí mismo forma un enlace completo del sitio del antígeno) .

Por ejemplo, un enlazador puede ser una secuencia de aminoácidos adecuada , y en particular las secuencias de aminoácidos de entre 1 y 50 , por ejemplo, de entre 5 y 50 , de preferencia de entre 1 y 35 , tal como de entre 1 y 1 0 residuos de aminoácidos. Algunos de los ejemplos preferidos de estas secuencias de aminoácidos incluyen los enlazadores gly-ser, por ejemplo, del tipo (glyxsery)2, tales como, por ejemplo (gly4ser)3 o (gly3ser2)3, como se describen en la Publicación I nternacional Número WO 99/42077, y los enlazadores GS30 , GS 1 5, GS9 y GS7 descritos en las solicitudes por Abiynx mencionadas en la presente (véanse , por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Números WO 06/0401 53 y WO 06/1 22825) , así como las regiones tipo articulación, tales como las regiones de articulación de los anticuerpos de cadena pesada que se presentan naturalmente o en secuencias similares (por ejemplo, tal como se describe en la Publicación Internacional Número WO 94/04678).

Algunos otros enlazadores particularmente preferidos son poli-alanina (tal como AAA), así como los enlazadores GS30 (SEQ ID NO: 85 de la Publicación Internacional Número WO 06/122825), y GS9 (SEQ ID NO: 84 de la Publicación Internacional Número WO 06/122825).

Otros enlazadores adicionales en términos generales comprenden compuestos orgánicos o polímeros, en particular aquéllos adecuados para utilizarse en proteínas para uso farmacéutico. Los ejemplos no limitantes incluyen, por ejemplo, las fracciones de poli-(etilenglicol), por ejemplo, tales como aquéllas utilizadas para enlazar dominios de anticuerpos. Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 04/081026.

Se abarca dentro del alcance de la invención que la longitud, el grado de flexibilidad, y/u otras propiedades de los enlazadores utilizados (no es crítico, como es usualmente para los enlazadores utilizados en los fragmentos ScFv) pueden tener alguna influencia sobre las propiedades del polipéptido final de la invención, incluyendo, pero no limitándose a, la afinidad, especificidad o avidez para el DR5, o para uno o más de los otros antígenos. Basándose en la divulgación de la presente, la persona experta estará capacitada para determinar los enlazadores óptimos para utilizarse en un polipéptido específico de la invención , opcionalmente después de algunos experi mentos de ruti na limitados.

En una modalidad , en los polipéptidos multivalentes de la invención que comprenden , por ejemplo, los agentes N B dirigidos contra un antígeno multimérico (tal como un receptor m ultimérico u otra prote ína) , la longitud y flexibilidad del enlazador pueden ser tales que permitan que cada agente NB de la presente invención en el pol ipéptido se enlace al determinante antigénico sobre cada una de las subunidades del multímero. De una manera simi lar, en un pol ipéptido multiespecífico de la invención que comprende agentes NB di rigidos contra dos o más determinantes antigénicos diferentes sobre el mismo antígeno (por ejemplo contra ep ítopos diferentes de un antígeno y/o contra subunidades diferentes de un receptor, canal o proteína multimérica) , la longitud y flexibilidad del enlazador pueden ser tales que permitan que cada agente NB se enlace a su determi nante antigénico destinado. Nuevamente , basándose en la divulgación de la presente , la persona experta será capaz de determi nar los enlazadores óptimos para utilizarse en un pol ipéptido específico de la i nvención , opcional mente después de algunos expe rimentos de rutina limitados .

Está dentro del alcance de la i nvención que el enlazador uti l izado confiere una o más propiedades o funcionalidades favorables diferentes a los polipéptidos de la i nvención , y/o proporcionan uno o más sitios para la formación de derivados y/o para el enlace de los grupos funcionales (por ejemplo , como se describe en la presente para los derivados de los agentes N B de la invención) . Por ejemplo, los enlazadores que contienen uno o más residuos de aminoácidos cargados pueden proporcionar propiedades hidrof ílicas mejoradas , mientras que los enlazadores que forman o contienen epítopos o etiquetas pequeñas se puede utilizar para los propósitos de detección , identificación y/o purificación . Nuevamente , basándose en la divulgación de la presente , la persona experta será capaz de determinar los enlazadores óptimos para utilizarse en un polipéptido específico de la invención , opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.

Final mente , cuando dos o más enlazadores se utilizan en los polipéptidos de la invención , estos enlazadores pueden se r los mismos o diferentes. Nuevamente , basándose en la divulgación de la presente , la persona experta será capaz de determi nar los enlazadores ópti mos para utilizarse en un polipéptido específico de la invención , opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.

Usualmente , para la faci l idad de la expresión y producción , el polipéptido de la invención será un polipéptido lineal . Sin embargo , la invención en su sentido más amplio no está limitada al mismo. Por ejemplo, cuando u n polipéptido de la i nvención comprende tres o más agentes N B , es posible enlazarlos mediante el uso de un enlazador con tres o más "brazos", siendo cada "brazo" enlazado a un agente NB , como para proporcionar una construcción "en forma de estrella" . También es posible , aunque usualmente menos preferido, utilizar construcciones ci rculares .

La invención comprende además derivados de los polipéptidos de la invención , los cuales pueden ser esencialmente análogos a los derivados de los agentes NB de la invención , es deci r, como se describen en la presente .

La invención también comprende prote ínas o poli péptidos que "esencialmente consisten" en un polipéptido de la invención (en donde el término "esencialmente consiste en" tiene esencialmente el mismo significado q ue se indica anteriormente en la presente) .

De acuerdo con un aspecto de la i nvención , el polipéptido de la i nvención está en una forma esencial mente aislada, como se define en la presente .

Método para la elaboración de los agentes N B de la invención Las secuencias de ami noácidos, los agentes N B , los polipéptidos, los compuestos y ácidos nucleicos de la invención , se pueden preparar de una manera conocida por sí misma, como estará claro para la persona experta a parti r de la descripción adicional en la presente . Por ejemplo, los agentes NB y los polipéptidos de la invención se pueden preparar de cualquier manera conocida por sí misma para la preparación de anticuerpos y en particular para la preparación de fragmentos de anticuerpos (incluyendo, pero no limitándose a, los anticuerpos de (un solo) domi nio y los fragmentos ScFv) . Algunos métodos preferidos , pero no limitantes, para la preparación de las secuencias de ami noácidos, los agentes N B , los polipéptidos y ácidos nucleicos incl uyen los métodos y técnicas descritas en la presente.

Como quedará claro para la persona experta, un método particularmente útil para la preparación de una secuencia de aminoácidos, un agente NB y/o un polipéptido de la invención comprende en términos generales los pasos de: a) la expresión, en una célula huésped o en un organismo huésped adecuado (también referido en la presente como un "huésped de la invención") o en otro sistema de expresión adecuado, de un ácido nucleico que codifica esta secuencia de aminoácidos, agente NB, o polipéptido de la invención (también referido en la presente como un "ácido nucleico de la invención"), opcionalmente seguida por: b) aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos, el agente NB, o el polipéptido de la invención obtenido de esta manera.

En particular, este método puede comprender los pasos de: a) cultivar y/o mantener un huésped de la invención bajo condiciones que son tales que el huésped de la invención expresa y/o produce cuando menos una secuencia de aminoácidos, agente NB, y/o polipéptido de la invención; opcionalmente seguido por: b) aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos, el agente NB, o el polipéptido de la invención obtenido de esta manera.

Un ácido nucleico de la invención puede estar en la forma de ADN o ARN de una sola cadena o de doble cadena. En una modalidad, un agente NB de polinucleótido está en la forma de ADN de doble cadena. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de NB de la invención pueden ser ADN genómico, ADNc, o ADN sintético (tal como ADN con un uso de codones que se ha adaptado específicamente para la expresión en la célula huésped o en el organismo huésped pretendido).

De acuerdo con un aspecto de la invención, el ácido nucleico de la invención está en una forma esencialmente aislada, como se define en la presente.

El ácido nucleico de la invención puede estar en la forma de, puede estar presente en, y/o puede ser parte de un vector, tal como, por ejemplo, un plásmido, cósmido o YAC, el cual nuevamente puede estar en una forma esencialmente aislada.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar u obtener de una manera conocida por sí misma, basándose en la información sobre las secuencias de aminoácidos para los polipéptidos de la invención dada en la presente, y/o se puede aislar a partir de una fuente natural adecuada. Para proporcionar análogos, las secuencias de nucleótidos que codifiquen los dominios VHH que se presentan naturalmente, por ejemplo, se pueden someter a mutagénesis dirigida al sitio, como para proporcionar un ácido nucleico de la invención que codifique dicho análogo. Como quedará claro para la persona experta, para preparar un ácido nucleico de la invención, incluyendo varias secuencias de nucleótidos, por ejemplo, cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifique un agente NB y, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifiquen uno o más enlazadores, estas secuencias se pueden enlazar entre sí de una manera adecuada.

Las técnicas para generar los ácidos nucleicos de la invención estarán claras para la persona experta y, por ejemplo pueden incluir, pero no se limitan a, síntesis automatizada de ADN; mutagénesis dirigida al sitio; combinación de dos o más secuencias que se presenten naturalmente y/o sintéticas (o dos o más partes de las mismas), introducción de mutaciones que conduzcan a la expresión de un producto de expresión truncado; introducción de uno o más sitios de restricción (por ejemplo, para crear casetes y/o regiones que se pueden digerir y/o ligar fácilmente utilizando enzimas de restricción adecuadas), y/o la introducción de mutaciones por medio de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando uno o más cebadores "mal emparejados", utilizando, por ejemplo, una secuencia de una forma que se presente naturalmente del DR5 como una plantilla. Éstas y otras técnicas quedarán claras para la persona experta, y nuevamente se hace referencia a los libros de texto convencionales, tales como Sambrook y colaboradores, y Ausubel y colaboradores, mencionados en la presente, así como los Ejemplos más adelante.

El ácido nucleico de la invención puede estar en la forma de, puede estar presente en, y/o puede ser parte de una construcción genética, como estará claro para la persona experta en la materia y, por ejemplo, como se describe en las páginas 131-134 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079. Estas construcciones genéticas comprenden en términos generales cuando menos un ácido nucleico de la invención que está opcionalmente enlazado a uno o más elementos de las construcciones genéticas conocidas por sí mismas, tales como, por ejemplo, uno o más elementos reguladores adecuados (tales como promotores, potenciadores, terminadores adecuados, etc.), y los elementos adicionales de las construcciones genéticas referidas en la presente. Estas construcciones genéticas que comprenden cuando menos un ácido nucleico de la invención también serán referidas en la presente como "construcciones genéticas de la invención".

Las construcciones genéticas de la invención pueden ser ADN o ARN. Las construcciones genéticas de la invención pueden estar en una forma adecuada para la transformación de la célula huésped o el organismo huésped pretendido, en una forma adecuada para la integración en el ADN genómico de la célula huésped pretendida o en una forma adecuada para réplica independiente, mantenimiento y/o herencia en el organismo huésped pretendido. Por ejemplo, las construcciones genéticas de la invención pueden estar en la forma de un vector, tal como, por ejemplo, un plásmido, cósmido, YAC, un vector viral o transposón. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar la expresión in vitro y/o in vivo (por ejemplo, en una célula huésped, un organismo huésped, y/o un sistema de expresión adecuado).

El ácido nucleico de la invención puede estar en la forma de, puede estar presente en, y/o puede ser parte de, una construcción genética. Estas construcciones genéticas comprenden en térmi nos generales cuando menos un ácido nucleico de la i nvención q ue está opcionalmente en lazado a uno o más elementos de las construcciones genéticas conocidas por s í mismas , tales como, por ejemplo, uno o más elementos reguladores adecuados (tales como promotores , potenciadores, termi nadores adecuados, etc. ) , y los elementos adicionales de las construcciones genéticas referidas en la presente . Otras construcciones genéticas adecuadas conocidas en la materia se contemplan dentro del alcance de la invención , i ncluyendo, por ejemplo, aquéllas descritas en las páginas 1 31 - 1 34 de la Publicación I nternacional Número WO 08/020079. Estas construcciones genéticas que comprenden cuando menos un ácido nucleico de la invención también serán referidas en la presente como "construcciones genéticas de la invención" .

En una modalidad no limitante, una construcción genética de la invención comprende: a) cuando menos un ácido nucleico de la invención; en donde el agente NB de pol lnucleótido se conecta operativamente con b) uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y opcional mente un terminador adecuado; y opcionalmente c) uno o más elementos adicionales de las construcciones genéticas conocidas por s í mismas .

En una modalidad , en las construcciones genéticas de la invención , el cuando menos un ácido nucleico de la i nvención y los elementos reguladores mencionados, y opcionalmente el uno o más elementos adicionales, se "enlazan operativamente" u nos a otros, lo cual significa en general que están en una relación funcional unos con otros . Por ejemplo, un promotor se considera "operativamente enlazado" a una secuencia de codificación si este promotor es capaz de iniciar, o de otra manera controlar/regular, la transcri pción y/o la expresión de una secuencia de codificación (en donde esta secuencia de codificación se debe entender como estando "bajo el control de dicho promotor) . En términos generales , cuando dos secuencias de nucleótidos se enlazan operativamente , estarán en la misma orientación , y usual mente también en el mismo marco de lectu ra. Usualmente serán esencial mente contiguas, aunque esto puede no ser requerido. Las f rases "ope rativamente conectadas" y "operativamente enlazadas" se utilizan de forma alternativa.

Los términos "elemento regulador" , "promotor" , "terminador" y "operativamente conectados" tienen su significado usual en la materia. Los "elementos adicionales" presentes en las construcciones genéticas pueden ser, por ejemplo, una secuencia 3'-ó 5'-UTR , secuencias l íder, marcadores de selección , marcadores de expresión/genes reporteros, y/o elementos que pueden facilitar o aumentar (la eficiencia de) la transformación o integración . Éstos y otros elementos adecuados para estas construcciones genéticas quedarán claros para la persona experta, y, por ejemplo, pueden depender del tipo de construcción utilizada, de la célula huésped, o del organismo huésped pretendido; la manera en donde se vayan a expresar las secuencias de n ucleótidos de interés de la invención (por ejemplo, por medio de expresión constitutiva, transitoria, o i nducible) ; y/o la técnica de transformación que se vaya a emplear. Por ejemplo, las secuencias reguladoras, promotoras y terminadoras conocidas por sí mismas para la expresión y producción de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo, pe ro no limitándose a, los anticuerpos de (un solo) dominio y los fragmentos ScFv) se pueden utilizar de una manera esencial mente análoga.

En una modalidad, los elementos reguladores y adicionales de las construcciones genéticas de la invención son tales que son capaces de proporcionar su función biológica pretendida en la célula huésped o en el organismo huésped pretendido .

Por ejemplo, un promotor, potenciador o terminador debe ser "operativo" en la célula huésped o en el organismo huésped pretendido , lo cual significa que (por ejemplo) este promotor debe ser capaz de iniciar o de otra manera controlar/regular la transcripción y/o la expresión de una secuencia de nucleótidos - por ejemplo, u na secuencia de codificación - con la que se enlace operativamente (como se define en la presente) . Algunos promotores particularmente preferidos incl uyen , pero no se li mitan a, los promotores conocido por sí mismos para la expresión en las células huésped mencionadas en la presente; y en particular los promotores para la expresión en las cél ulas bacterianas .

Los ácidos nucleicos de la invención y/o las construcciones genéticas de la invención se pueden utilizar para transformar una célula huésped o un organismo huésped , es deci r, para la expresión y/o producción de la secuencia de aminoácidos, el agente N B , o el polipéptido de la invención. Los huéspedes o células huésped adecuadas quedarán claras para la persona experta y, por ejemplo, puede ser cualquier célula o línea celular fúngica, procariótica, o eucariótica adecuada, o cualquier organismo fúngico, procariótico, o eucariótico adecuado, por ejemplo, aquéllos descritos en las páginas 134 y 135 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079; así como todos los demás huéspedes o células huésped conocidas por sí mismas para la expresión y producción de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo, pero no limitándose a, los anticuerpos de (un solo) dominio y los fragmentos ScFv), las cuales quedarán claras para la persona experta. También se hace referencia a la técnica antecedente general citada anteriormente en la presente, así como, por ejemplo, a las Publicaciones Internacionales Números WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken y colaboradores (1998), supra; Riechmann y Muyldermans, (1999), supra; van der Linden, (2000), supra; Thomassen y colaboradores (2002), supra; Joosten y colaboradores (2003), supra; Joosten y colaboradores (2005), supra; y las referencias adicionales citadas en la presente.

Las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de NB de la invención se pueden introducir y expresar en una o más células, tejidos u órganos de un organismo multicelular, por ejemplo, para propósitos profilácticos y/o terapéuticos (por ejemplo, como una terapia genética), como se describe adicionalmente en las páginas 135 y 136 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079 y en las referencias adicionales citadas en la Publicación Internacional Número WO 08/020079.

Para la expresión de los agentes NB en una célula, se pueden expresar como los denominados "intracuerpos", como se describen, por ejemplo, en las Publicaciones Internacionales Números WO 94/02610 y WO 95/22618, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US-A-7004940; en la Publicación Internacional Número WO 03/014960; en Cattaneo, A. y Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes y Springer-Verlag; y en Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170.

Las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención, por ejemplo, también se pueden producir en la leche de mamíferos transgénicos, por ejemplo, en la leche de conejos, reses, cabras u ovejas (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US6,741,957, US6,304,489 y US6,849,992 para ver las técnicas generales para introducir transgenes en mamíferos), en plantas o en partes de plantas, incluyendo, pero no limitándose a, sus hojas, flores, frutas, semillas, raíces, o tubérculos (por ejemplo en tabaco, maíz, semilla de soya, o alfalfa) o, por ejemplo, en pupas del gusano de seda Bombix morí.

Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención se pueden expresar y/o producir en sistemas de expresión sin células, y los ejemplos adecuados de estos sistemas quedarán claros para la persona experta. Algunos ejemplos no limitantes incluyen la expresión en el sistema del germen de trigo; en los lisados de reticulocitos de conejo; o en el sistema de E. coli de Zubay.

Como se menciona en la presente, una de las ventajas del uso de los agentes NB expresados a partir de plásmidos o vectores es que los polipéptidos basados en los mismos se pueden preparar a través de la expresión en un sistema bacteriano adecuado, y los sistemas sistemas de expresión, vectores, células huésped, elementos reguladores bacterianos adecuados, etc., quedarán claros para la persona experta, por ejemplo, a partir de las referencias citadas anteriormente. Sin embargo, se debe observar que la invención, en su sentido más amplio, no está limitada a la expresión en los sistemas bacterianos.

En una modalidad, el uso de codones para una secuencia de polinucleótido de la invención es la optimización haciendo referencia a la frecuencia de uso de codones de la célula huésped/el organismo huésped particular. La secuencia de nucleótidos resultante es una secuencia de nucleótidos de NB de "codones optimizados". Se pueden hacer las secuencias de NB de codones optimizados para la expresión en células huésped/organismos huésped procarióticos o eucarióticos. Los ejemplos particulares incluyen los sistemas de expresión proporcionados en la presente.

En una modalidad de la invención, se utiliza un sistema de expresión (ya sea in vivo o in vitro), por ejemplo, tal como un sistema de expresión bacteriano, que proporciona los polipéptidos de la invención en una forma que es adecuada para uso farmacéutico, y estos sistemas de expresión nuevamente quedarán claros para la persona expe rta . Como también quedará claro para la persona experta, los pollpéptldos de la invención adecuados para uso farmacéutico se pueden preparar empleando técnicas para la síntesis de péptidos.

Para la producción a u na escala i ndustrial , los huéspedes heterólogos preferidos para la producción (industrial) de los agentes N B o de los productos terapéuticos de prote ína que contienen el agente NB i ncluyen las cepas de E. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae que son adecuados para la expresión / producción / fermentación a gran escala, y en particular, para la expresión / producción / fermentación farmacéutica a gran escala (es deci r, de grado GM P) . Los ejemplos adecuados de estas cepas quedarán claros para la persona experta. Estas cepas y los sistemas de producción/expresión también los pone a disposición las compañ ías tales como Biovitrum (Uppsala, Suecia) .

De una manera alternativa, se pueden utilizar líneas celulares de mam ífero, en particular células de ovario de hámster chino (CHO) , para la expresión / producción / fermentación a gran escala, y en particular para la expresión / producción / fermentación farmacéutica a gran escala. Nuevamente , estos sistemas de expresión/producción son también son puestos a disposición por algunas de las compañ ías mencionadas en la presente.

La elección del sistema de expresión espec ífico dependería en parte del requerimiento de ciertas modificaciones posteriores a la traducción , más específicamente glicosilación . La producción de una prote ína recombi nante que contenga un agente N B para la cual se desee o se necesite glicosilación , necesitaría del uso de huéspedes de expresión de mam ífero que tengan la capacidad para glicosilar la proteína expresada. En este aspecto, estará claro para la persona experta que el patrón de glicosilación obtenido (es deci r, la clase, el número, y la posición de los residuos unidos) dependerá de la célula o de la l ínea celular q ue se utilice para la expresión . De preferencia, se utiliza ya sea una célula o línea celular humana (es decir, que conduzca a una proteína que tenga esencial mente un patrón de glicosilación humano) u otra l ínea celular de mam ífero que pueda proporcionar un patrón de glicosi lación que sea esencial mente y/o funcionalmente el mismo que el de la glicosilación humana, o que cuando menos i mite la glicosilación humana. En térmi nos generales, los huéspedes procarióticos, tales como E. coli, no tienen la capacidad para gl icosilar proteínas, y el uso de eucariotes inferiores , tales como levadura, usualmente conduce a un patrón de glicosilación q ue difiere de la glicosilación humana . No obstante, se debe entender que todas las células huésped y sistemas de expresión anteriores se pueden utilizar en la invención , dependiendo de la secuencia de aminoácidos, del agente NB, o del polipéptido que se vaya a obtener deseados.

Por consiguiente , de acuerdo con un aspecto no l i mitante de la invención , la secuencia de aminoácidos , el agente N B, o el polipéptido de la i nvención está glícosilado. De acuerdo con otro aspecto no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, el agente NB, o el polipéptido de la invención, no está glicosilado.

De acuerdo con un aspecto preferido, pero no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, el agente NB, o el polipéptido de la invención se produce en una célula bacteriana, en particular una célula bacteriana adecuada para la producción farmacéutica a gran escala, tal como las células de las cepas mencionadas en la presente.

De acuerdo con otro aspecto preferido, pero no limitante, de la invención, la secuencia de aminoácidos, el agente NB, o el polipéptido de la invención se produce en una célula de levadura, en particular una célula de levadura adecuada para la producción farmacéutica a gran escala, tal como las células de las especies mencionadas en la presente.

De acuerdo con todavía otro aspecto preferido, pero no limitante, de la invención, la secuencia de aminoácidos, el agente NB, o el polipéptido de la invención se produce en una célula de mamífero, en particular en una célula humana o en una célula de una línea celular humana, y más particularmente, en una célula humana o en una célula de una línea celular humana que es adecuada para la producción farmacéutica a gran escala, tal como las líneas celulares mencionadas anteriormente en la presente.

Cuando se utiliza la expresión en una célula huésped para producir las secuencias de aminoácidos, los agentes NB y los polipéptidos de la invención, las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención se pueden producir ya sea intracelularmente (por ejemplo, en el citosol, en el periplasma, o en los cuerpos de inclusión), y entonces se aislan a partir de las células huésped y opcionalmente se purifican adicionalmente; o se pueden producir extracelularmente (por ejemplo, en el medio en donde se cultivan las células huésped), y entonces se aislan a partir del medio de cultivo, y opcionalmente se purifican adicionalmente. Por consiguiente, de acuerdo con un aspecto no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, el agente NB, o el polipéptido de la invención es una secuencia de aminoácidos, agente NB, o polipéptido que se ha producido intracelularmente, y que se ha aislado a partir de la célula huésped, y en particular a partir de una célula bacteriana o a partir de un cuerpo de inclusión en una célula bacteriana. De acuerdo con otro aspecto no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, el agente NB, o el polipéptido de la invención es una secuencia de aminoácidos, agente NB, o polipéptido que se ha producido extracelularmente, y que se ha aislado a partir del medio en donde se cultive la célula huésped.

Se proporciona una discusión más completa de los sistemas de expresión, por ejemplo, en las páginas 138 y 139 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079. Se incluye una lista no limitante de promotores para utilizarse con estas células huésped, por ejemplo, incluyendo aquéllos mencionados en las páginas 139 y 140 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079. También se incluye una lista no limitante de secuencias secretoras para uti lizarse con estas células huésped , por ejemplo, incluyendo aquéllas mencionadas en la página 140 de la Publicación I nternacional Número WO 08/020079.

Las técnicas adecuadas para transformar un huésped o una célula huésped de la invención estarán claras para la persona experta, y pueden depender de la célula huésped/del organismo huésped pretendido, y de la construcción genética util izada. N uevamente se hace referencia a los l ibros de texto y a las solicitudes de patente mencionadas en la presente.

También quedará claro para la persona experta q ue la secuencia de aminoácidos , el agente N B, o el polipéptido de la invención , se puede generar (primero) en una forma inmadura (como se menciona en la presente) , el cual se puede someter entonces a una modificación posterior a la traducción , dependiendo de la cél ula huésped/del organismo huésped utilizado. También , la secuencia de aminoácidos, el agente N B, o el polipéptido de la invención se puede glicosilar, nuevamente dependiendo de la célula huésped/del organismo huésped utilizado.

La secuencia de aminoácidos , el agente NB, o el polipéptido de la i nvención entonces se puede aislar a parti r de la célula huésped/del organismo huésped y/o a parti r del medio en donde se cultive esa célula huésped o ese organismo huésped, empleando técnicas de aislamiento y/o pu rificación de proteínas conocidas por s í mismas , tales como técnicas de cromatograf ía (de preparación) y/o electroforesis, técnicas de precipitación diferencial , técnicas de afinidad (por ejemplo, utilizando una secuencia de aminoácidos disociable específica fusionada con la secuencia de aminoácidos, el agente NB, o el polipéptido de la invención) y/o técnicas inmunológicas de preparación (es decir, utilizando anticuerpos contra la secuencia de aminoácidos que se vaya a aislar).

Preparación o composiciones farmacéuticas En términos generales, para uso farmacéutico, los polipéptidos de la invención se pueden formular como una preparación farmacéutica o como una composición que comprenda cuando menos un polipéptido de la invención, y cuando menos un vehículo, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Por medio de los ejemplos no limitantes, esta formulación puede estar en una forma adecuada para su administración oral, para su administración parenteral (tal como mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa), para su administración tópica, para su administración mediante inhalación, mediante un parche para la piel, mediante un implante, mediante un supositorio, etc. Las formas de administración adecuadas - las cuales pueden ser sólidas, semi-sólidas, o líquidas, dependiendo de la forma de administración - así como los métodos y vehículos para utilizarse en la preparación de las mismas, quedarán claras para la persona experta, y se describen adicionalmente en la presente. Esta preparación farmacéutica o una composición será referida en términos generales en la presente como una "composición farmacéutica". Una preparación o una composición farmacéutica para utilizarse en un organismo no humano, será referida en términos generales en la presente como una "composición veterinaria".

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene cuando menos un aminoácido de la invención, cuando menos un agente NB de la invención, o cuando menos un polipéptido de la invención, y cuando menos un vehículo, diluyente o excipiente adecuado (es decir, adecuado para uso farmacéutico), y opcionalmente una o más sustancias activas adicionales.

En términos generales, las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención se pueden formular y administrar de cualquier manera adecuada conocida por sí misma. Se hace referencia, por ejemplo, a la técnica antecedente general citada en lo anterior (y en particular a las Publicaciones Internacionales Números WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 y WO 08/020079), así como a los libros de texto convencionales, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, ack Publishing Company, EUA (1990), Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, Lippincott Williams y Wilkins (2005); o el Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Editor), Wiley, Weinheim, 2007 (véanse, por ejemplo, las páginas 252-255).

Las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención se pueden formular y administrar de cualquier manera conocida por sí misma para los anticuerpos convencionales y fragmentos de anticuerpos (incluyendo ScFvs y diacuerpos), y otras proteínas farmacéuticamente activas. Estas formulaciones y métodos para la preparación las mismas quedará claros para la persona experta y, por ejemplo, incluyen las preparaciones adecuadas para su administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraluminal, intra-arterial o intratecal), o para administración tópica (es decir, transdérmica o intradérmica).

Las preparaciones para su administración parenteral, por ejemplo, pueden ser soluciones, suspensiones, dispersiones o emulsiones estériles que sean adecuadas para infusión o inyección. Los vehículos o diluyentes adecuados para estas preparaciones, por ejemplo, incluyen, sin limitación, aquéllos mencionados en la página 143 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079. En una modalidad, la preparación es una solución o suspensión acuosa.

Las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención se pueden administrar empleando métodos de suministro de terapia genética. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,399,346, la cual se incorpora como referencia por sus métodos de suministro de terapia genética. Empleando un método de suministro de terapia genética, las células primarias transfectadas con el gen que codifica una secuencia de aminoácidos, un agente NB, o un polipéptido de la invención, se pueden transfectar adicionalmente con promotores específicos del tejido para dirigirse a órganos, tejidos, injertos, tumores, o células específicas del objetivo, y adicionalmente se pueden transfectar con secuencias de señales y estabilización para la expresión sub-celularmente localizada.

Por consiguiente, las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención se pueden administrar sistémicamente, por ejemplo, oralmente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un diluyente inerte, o un vehículo comestible asimilable. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, se pueden comprimir en tabletas, o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta del paciente. Para la administración terapéutica oral, las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención se pueden combinar con uno o más excipientes, y se pueden utilizar en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Estas composiciones y preparaciones deben contener cuando menos el 0.1 por ciento de la secuencia de aminoácidos, del agente NB, o del polipéptido de la invención. Su porcentaje en las composiciones y preparaciones, desde luego, se puede variar, y de una manera conveniente, puede ser de entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 60 por ciento del peso de una forma de dosificación unitaria dada. La cantidad de la secuencia de aminoácidos, del agente NB, o del polipéptido de la invención en estas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel de dosificación efectivo.

Las tabletas, trociscos, pildoras, cápsulas , y similares también pueden contener aglutinantes , excipientes , agentes desi ntegrantes , lubricantes y agentes edulcorantes o saborizantes, por ejemplo , aquéllos mencionados en las páginas 1 43- 1 44 de la Publicación I nternacional Número WO 08/020079. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, en adición a los materiales del tipo anterior, un vehículo l íquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol . Puede haber otros diferentes materiales presentes como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma f ísica de la forma de dosificación unitaria sól ida. Por ejemplo, las tabletas, p ildoras, o cápsulas se pueden recubrir con gelatina, cera, shellac o azúcar, y similares . Un jarabe o el íxir puede contener las secuencias de aminoácidos de N B y los polipéptidos de la i nvención , sacarosa o fructosa como un agente edulcorante , metil- y propi l-parabenos como conservadores , un ti nte y un saborizante , tal como un saborizante de cereza o de naranja. Desde luego, cualquier material util izado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancial mente no tóxico en las cantidades empleadas . En adición , las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención se pueden incorporar en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.

Las preparaciones y formulaciones para su administración oral tambi én pueden ser provistas con un recubrimiento entérico q ue permita que las construcciones de la invención resistan al medio ambiente gástrico y pasen hacia los intestinos. En términos más generales, las preparaciones y formulaciones para su administración oral se pueden formular de una manera adecuada para su suministro en cualquier parte deseada del tracto gastrointestinal. En adición, se pueden utilizar supositorios adecuados para el suministro en el tracto gastrointestinal.

Las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención también se pueden administrar intravenosamente o intraperitonealmente mediante infusión o inyección. Los ejemplos particulares son como se describen adicionalmente en las páginas 144 y 145 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079.

Para administración tópica, las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención se pueden aplicar en una forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, en términos generales, será deseable administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un vehículo dermatológicamente aceptable, el cual puede ser un sólido o un líquido. Los ejemplos particulares son como se describen adicionalmente en la página 145 de la Publicación Internacional Número WO 08/020079.

En términos generales, la concentración de las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención en una composición líquida, tal como una loción, será de aproximadamente el 0.1 al 25 por ciento en peso, de preferencia de aproximadamente el 0.5 al 10 por ciento en peso. La concentración en una composición semi-sólida o sólida, tal como un gel o un polvo, será de aproximadamente el 0.1 al 5 por ciento en peso, de preferencia de aproximadamente el 0.5 al 2.5 por ciento en peso.

La cantidad de las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención requerida para utilizarse en el tratamiento variará no solamente con la secuencia de aminoácidos, el agente NB, o el polipéptido particular seleccionado, sino también con la vía de administración, la naturaleza de la condición que se esté tratando, y la edad y condición del paciente, y, por último, estará a la discreción del asistente o médico que atienda. También, la dosificación de las secuencias de aminoácidos de NB y de los polipéptidos de la invención varía dependiendo de la célula, tumor, tejido, injerto, u órgano objetivo.

De una manera conveniente, la dosis deseada se puede presentar en una sola dosis o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis al día. La sub-dosis misma se puede dividir adicionalmente, por ejemplo, en un número de administraciones discretas cómodamente especiadas; tales como múltiples inhalaciones a partir de un insuflador, o mediante la aplicación de una pluralidad de gotas para los ojos.

Un régimen de administración podría incluir el tratamiento diario de largo plazo. "Largo plazo" significa cuando menos dos semanas y, de preferencia, varias semanas, meses, o años de duración. Las modificaciones necesarias en este intervalo de dosificación pueden ser determinadas por un experto ordinario en este campo uti lizando solamente experimentación de rutina, dadas las enseñanzas de la presente . Véase Remington's Pharmaceutical Sciences (Marti n , E .W. , Edición 4) , Mack Publishing Co. , Easton , PA. La dosificación también puede ser ajustada por el médico individual en el caso de cualquier complicación .

En otro aspecto , la invención se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de cuando menos las enfermedades y los trastornos asociados con el D R5 , comprendiendo este método, administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención , de un agente N B de la i nvención , de un polipéptido de la invención , y/o de una composición farmacéutica que los comprenda.

En el contexto de la presente i nvención , el término "prevención y/o tratamiento" no solamente comprende prevenir y/o tratar la enfermedad , pero también en términos generales comprende prevenir el establecimiento de la enfermedad, hacer más lento o revertir el progreso de la enfermedad, preveni r o hacer más lento el estableci miento de uno o más síntomas asociados con la enfermedad , reducir y/o aliviar uno o más síntomas asociados con la enfermedad , reduci r la gravedad y/o la du ración de la enfermedad y/o de cualquiera de los s íntomas asociados con la misma, y/o preveni r un aumento adicional en la gravedad de la enfermedad y/o de cualquie ra de los síntomas asociados con la misma, preveni r, reducir o reverti r cualq uier daño fisiológico causado por la enfermedad, y en términos generales , cualquier acción farmacológica que sea benéfica para el paciente que se esté tratando.

El sujeto que se vaya a tratar puede ser cualquier animal de sangre caliente , pero es en particular un mamífero, y más particularmente , un ser humano. Como quedará claro para la persona experta , el sujeto que se vaya a tratar será en particular una persona que padezca de, o que esté en riesgo de padecer de , las enfermedades y los trastornos mencionados en la presente .

La i nvención se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de cuando menos una enfermedad o un trastorno que está asociado con el DR5 , con su actividad biológica o farmacológica, y/o con las sendas biológicas o de señalización en donde esté involucrado el DR5, comprendiendo este método, administrar a un sujeto que lo necesite , una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención , de u n agente N B de la invención , de un polipéptido de la invención , y/o de una composición farmacéutica que los comprende. En una modalidad , la invención se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de cuando menos una enfermedad o u n trastorno que se puede tratar mediante la modulación del DR5, su actividad biológica o farmacológica, y/o las sendas biológicas o de señalización en donde el D R5 esté involucrado , comprendiendo este método, administrar a un sujeto que lo necesite , una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un agente N B de la i nvención , de un polipéptido de la invención , y/o de una composición farmacéutica que los comprende . En una modalidad, la cantidad farmacéuticamente efectiva puede ser una cantidad que sea suficiente para modular el D R5 , su actividad biológica o farmacológica, y/o las sendas biológicas o de señalización en donde esté involucrado el DR5; y/o una cantidad que proporcione un nivel de la secuencia de aminoácidos de la invención , de un agente N B de la invención , de un polipéptido de la invención en la circulación que sea suficiente para modular el DR5 , su actividad biológica o farmacológica, y/o las sendas biológicas o de señal ización en donde esté i nvolucrado el DR5.

En una modalidad, la invención se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de cuando menos una enfermedad o un trastorno que pueda ser prevenido y/o tratado mediante la administración de una secuencia de aminoácidos de N B o de un pol ipéptido de la invención, o de una construcción de nucleótidos de N B de la invención que los codifique, y/o de una composición farmacéutica que los comprenda, a un paciente. En una modalidad , el método comprende administrar una cantidad farmacéuticamente activa de u na secuencia de aminoácidos de NB o polipéptido de la invención , o una construcción de nucleótidos de N B de la invención que los codifiq ue, y/o de una composición farmacéutica que los comprenda, a un sujeto que lo necesite.

En una modalidad , la invención se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de cuando menos una enfermedad o un trastorno que pueda ser prevenido y/o tratado mediante la mejora de la apoptosis celular en células específicas o en un tej ido específico de un sujeto que se vaya a tratar (y en particular, mediante la mejora de la apoptosis celular en las células de cáncer o en un tumor presente en el sujeto que se vaya a tratar) , comprendiendo este método, administrar una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de ami noácidos de N B o polipéptido de la invención , o de una construcción de nucleótidos de N B de la i nvención que los codifique, y/o de u na composición farmacéutica que los comprenda, a un sujeto que lo necesite.

En una modalidad, la i nvención se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de cuando menos una enfermedad o un trastorno seleccionado a parti r del grupo que consiste en las enfermedades y los trastornos enlistados en la p resente , comprendiendo este método , admi nistrar a un sujeto que lo necesite , una secuencia de aminoácidos de NB o polipéptido de la invención , o una construcción de nucleótidos de N B de la i nvención que los codifique, y/o de una composición farmacéutica que los comprenda.

En una modal idad , la invención se refiere a un método para inmunoterapia, y en particular para inmunoterapia pasiva, cuyo método comprende administrar a un sujeto que padezca de , o que esté en riesgo de padecer, de las enfermedades y los trastornos mencionados en la presente , una cantidad farmacéuticamente activa de u na secuencia de aminoácidos de NB o polipéptido de la invención , o una construcción de nucleótidos de N B de la invención que los codifique , y/o de una composición farmacéutica que los comprenda.

En los métodos anteriores , las secuencias de aminoácidos, los agentes NB y/o los polipéptidos de la i nvención , y/o las composiciones que comprenden los mismos , se puede administrar de cualquier manera adecuada, dependiendo de la formulación o composición farmacéutica específica que se vaya a utilizar. Por consiguiente , las secuencias de aminoácidos, los agentes N B , y/o los polipéptidos de la invención , y/o las composiciones que comprenden los mismos , por ejemplo, se pueden administrar oralmente, intraperitonealmente (por ejemplo , intravenosamente , subcutáneamente , i ntramuscularmente, o por medio de cualquier otra vía de administración que ci rcunvenga el tracto gastrointestinal), intranasalmente , transdérmicamente, tópicamente, por medio de un supositorio, mediante inhalación , nuevamente dependiendo de la formulación o composición farmacéutica específica que se vaya a uti l izar. El médico será capaz de seleccionar u na vía de admi nistración adecuada y una formulación o una composición farmacéutica adecuada para utilizarse en esa adm inistración , dependiendo de la enfermedad o del trastorno que se vaya a prevenir o a tratar, y de otros factores bien conocidos por el médico.

Las secuencias de ami noácidos, los agentes N B y/o los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos, se administran de acuerdo con un régimen de tratamiento que es adecuado para prevenir y/o tratar la enfermedad o el trastorno q ue se vaya a prevenir o a tratar. El médico en general será capaz de determi nar un régimen de tratamiento adecuado, dependiendo de factores tales como la enfermedad o el trastorno que se vaya a prevenir o a tratar, de la g ravedad de la enfermedad que se vaya a tratar, y/o de la gravedad de los síntomas de la misma, de la secuencia de aminoácidos específica, del agente NB o polipéptido de la invención que se vaya a utilizar, de la vía de administración específica, y de la formulación o composición farmacéutica que se vaya a utilizar, de la edad , género, peso, dieta, condición general del paciente , y factores similares bien conocidos por el médico.

En términos generales, el régimen de tratamiento comprenderá la admi nistración de una o más secuencias de ami noácidos, los agentes NB y/o polipéptidos de la invención , o de una o más composiciones que comprendan los mismas, en una o más cantidades o dosis farmacéuticamente efectivas . Las cantidades o dosis específicas que se vayan a administrar pueden ser determinadas por el médico, nuevamente basándose en los factores citados anteriormente.

En términos generales , para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y los trastornos mencionados en la presente , y dependiendo de la enfermedad o trastorno espec ífico que se vaya a tratar, la potencia de la secuencia de ami noácidos específica, del agente N B y el polipéptido de la i nvención que se vaya a uti l izar, de la vía de administración espec ífica, y de la formulación o composición farmacéutica específica utilizada, las secuencias de aminoácidos de N B y los polipéptidos de la invención se administrarán en térmi nos generales en una cantidad de entre 1 gramo y 0.01 microgramos por kilogramo de peso corporal al día, de prefe rencia de entre 0.1 gramo y 0.1 microg ramos por ki logramo de peso corporal al día , tal como de aproximadamente 1 , 1 0, 1 00 ó 1 000 microgramos por ki logramo de peso corporal al d ía, ya sea continuamente (por ejemplo, mediante infusión) , como una sola dosis diaria, o como múltiples dosis divididas durante el d ía. El médico será capaz de determi nar en términos generales una dosis diaria adecuada, dependiendo de los factores mencionados en la presente . También estará claro que en los casos específicos, el médico puede elegi r desviarse de estas cantidades , por ejemplo, con base en los factores citados anteriormente y en su juicio experto. En términos generales, se puede obtener alguna gu ía sobre las cantidades para administrarse a parti r de las cantidades usual mente administradas para los anticuerpos convencionales o fragmentos de anticuerpos comparable contra el mismo objetivo administradas por medio de esencialmente la misma vía, tomando en cuenta, sin embargo , las diferencias en afinidad/avidez, eficacia, biodistribución , vida media, y factores similares bien conocidos por la persona experta.

En una modalidad , se uti l izará una sola secuencia de aminoácidos, agente N B o polipéptido de la invención contiguo, ya sea q ue las secuencias traducidas contengan un solo dom inio o bien múltiples dominios monovalentes o multivalentes . En u na modalidad , se proporcionan en combinación dos o más secuencias de aminoácidos, agentes N B y/o polipéptidos de la invención .

Los agentes NB, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención se pueden utilizar en combinación con uno o más compuestos o principios farmacéuticamente activos adicionales, es decir, como un régimen de tratamiento combinado, el cual puede o no conducir a un efecto sinérgico. Nuevamente, el médico será capaz de seleccionar estos compuestos o principios adicionales, así como un régimen de tratamiento combinado adecuado, basándose en los factores citados anteriormente y en su juicio experto.

En particular, las secuencias de aminoácidos de NB y los polipéptidos de la invención se pueden utilizar en combinación con otros compuestos o principios farmacéuticamente activos que son o se pueden utilizar para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y los trastornos citados en la presente, como un resultado de lo cual, se puede o no obtener un efecto sinérgico. Los ejemplos de estos compuestos y principios, así como las vías, los métodos, y las formulaciones farmacéuticas o composiciones para administrarlas, estarán claras para el médico, y en términos generales incluyen los principios activos citostáticos usualmente aplicados para el tratamiento del tumor que se vaya a tratar.

Las combinaciones específicas contempladas para utilizarse con los agentes NB de la invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, taxol; gemcitabina; cisplatina; inhibidores de clAP (tales como inhibidores de clAP1, clAP2 y/o XIAP); inhibidores de MEK incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, U0126, PD0325901; inhibidores de bRaf incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo , RAF265 ; e in hibidores de mTor, i ncluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, RAD001 . Se proporcionan combi naciones específicas en la presente , y en los Ejemplos.

Cuando dos o más sustancias o principios son para utilizarse como parte de un régimen de tratamiento combinado, se pueden administrar por medio de la misma vía de administración o por medio de diferentes vías de administración , esencialmente al mismo tiempo o en diferentes tiempos (por ejemplo, esencialmente de una manera simultánea, consecutiva, o de acuerdo con un régimen alternado) . Cuando las sustancias o pri ncipios son para administrarse simultáneamente por medio de la misma vía de administración , se pueden admi nistrar como diferentes formulaciones o composiciones farmacéuticas , o como parte de una formulación o composición farmacéutica combinada, como quedará claro para la persona expe rta.

También , cuando dos o más sustancias o pri nci pios activos son para utilizarse como parte de un régi men de tratamiento combi nado, cada una de las sustancias o principios se puede administrar en la misma cantidad y de acuerdo con el mismo régimen , como se utiliza cuando el compuesto o principio se utiliza por sí mismo, y este uso combinado puede o no conducir a un efecto si nérgico . Sin embargo, cuando el uso combinado de las dos o más sustancias o principios activos conduce a un efecto sinérgico, también puede ser posible reducir la cantidad de una, más , o todas las sustancias o principios que se vayan a admi nistrar, mientras que todavía se logre la acción terapéutica deseada . Esto, por ejemplo, puede ser útil para evitar, l i mitar, o reduci r cualesquiera efectos secundarios indeseados que estén asociados con el uso de una o más de las sustancias o principios cuando se utilizan en sus cantidades usuales, mientras que todavía se obtiene el efecto farmacéutico o terapéutico deseado.

La efectividad del régimen de tratamiento empleado de acuerdo con la invención se puede determinar y/o seguir de cualquier manera conocida por sí misma para la enfermedad o el trastorno involucrado, como quedará claro para el médico . El médico también será capaz , donde sea apropiado sobre una base de caso por caso, de cambiar o modificar un régimen de tratamiento particular, como para lograr el efecto terapéutico deseado, para evitar, l i mitar, o reducir los efectos secundarios i ndeseados, y/o para lograr un equil i brio apropiado entre el logro del efecto terapéutico deseado por una parte , y evitar, li mitar, o reduci r los efectos secundarios indeseados por otra parte .

En términos generales, se seguirá el régi men de tratamiento hasta que se logre el efecto terapéutico deseado y/o du rante tanto tiempo como se mantenga el efecto terapéutico deseado. N uevamente, esto puede ser determinado por el médico.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una secuencia de ami noácidos , un agente NB, o un polipéptido de la invención , en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de cuando menos las enfermedades y los trastornos asociados con el D R5; y/o para utilizarse en uno o más de los métodos para el tratamiento mencionado en la presente .

El sujeto que se vaya a tratar puede ser cualquier animal de sangre caliente , pero es en particular un mam ífero, y más particularmente , un ser humano . En las apl icaciones veteri narias , el sujeto que se vaya a tratar incluye cualquier animal reproducido para propósitos comerciales o mantenido como una mascota . Como quedará claro para la persona experta, el sujeto que se vaya a tratar será en particular u na persona que padezca de , o que esté en riesgo de padecer de, las enfermedades y los trastornos mencionados en la presente .

La i nvención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos de N B o polipéptido de la invención , o un nucleótido de N B que los codifique , en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de cuando menos una enfermedad o un trastorno que pueda ser prevenido y/o tratado mediante la administración una secuencia de aminoácidos de NB o polipéptido de la invención , o un nucleótido de NB que los codifique, y/o una composición farmacéutica de los mismos a un paciente.

Más particularmente , la invención se refiere al uso de una secuencia de ami noácidos de N B o polipéptido de la i nvención , o un nucleótido de N B que los codifique, en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y los trastornos asociados con el DR5 , y en particular para la prevención y el tratamiento de una o más de las enfermedades y los trastornos enlistados en la presente.

Nuevamente, en esta composición farmacéutica, la uno o más secuencias de ami noácidos de NB o polipéptido de la i nvención , o el nucleotido de N B que los codifica, y/o una composición farmacéutica de los mismos, también se pueden combinar de una manera adecuada con uno o más principios activos diferentes , tales como aquéllos mencionados en la presente.

En una modal idad , aunque se prefiere mucho el uso del los agentes NB de ejemplo de la invención, quedará claro que , con base en la descripción en la presente, la persona experta será capaz de diseñar y/o generar, de u na manera análoga, otras secuencias de aminoácidos, y en particular los anticuerpos de (un solo) domi nio contra el DR5, as í como los polipéptidos que comprenden esos anticuerpos de (un solo) dominio, y/o nucleótidos que los codifican .

Por ejemplo, estará claro para la persona experta que es posible "injertar" una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CD Rs) mencionadas en la presente, para los agentes N B de la invención , sobre los anticuerpos de (un solo) dominio u otros andamiajes de proteína, incluyendo, pero no limitándose a, andamiajes humanos o andamiajes que no sean de ¡nmunoglobul ina. Los andamiajes y técnicas adecuadas para este injerto de C DR estará claro para la persona experta y son bien conocidos en la materia, véanse, por ejemplo, aquéllos mencionados en la Publ icación I nternacional Número WO 08/020079. Por ejemplo, se pueden emplear de una manera análoga las técnicas conocidas por s í mismas para injertar regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de ratón o de rata sobre estructu ras y andamiajes humanos , para proporcionar proteínas quiméricas que comprendan una o más de las regiones determi nantes de complementariedad (CDRs) de los agentes IMB de la invención, y una o más regiones o secuencias de estructura humanas.

También se debe observar que , cuando los agentes NB de la invención contienen una o más secuencias de C D R adicionales que las secuencias de CDR preferidas mencionadas en la presente , y estas secuencias de C D R se pueden obtener de cualquier manera conocida por sí misma, por ejemplo , empleando una o más de las técnicas descritas en la Publicación I nternacional N úmero WO 08/020079.

Otros usos de las secuencias de ami noácidos , agentes N B , pol ipéptidos, ácidos nucleicos, construcciones genéticas , y huéspedes y células huésped de la invención , estarán claros para la persona experta basándose en la divulgación de la presente . Por ejemplo, y sin limitación , las secuencias de aminoácidos de la invención se pueden enlazar a un vehículo o soporte sólido adecuado , como para proporcionar un medio que se puede utilizar de una manera conocida por sí misma para purificar el D R5 a parti r de las composiciones y preparaciones que los comprenden . Los derivados de las secuencias de aminoácidos de la invención que comprenden u na marca detectable adecuada también se pueden util izar como marcadores para determi nar (cualitativamente o cuantitativamente) la presencia del DR5 en una composición o preparación, o como un marcador para detectar selectivamente la presencia del DR5 sobre la superficie de una célula o tejido (por ejemplo, en combinación con técnicas de selección celular adecuadas).

La invención se describirá ahora adicionalmente por medio de la siguiente parte experimental no limitante. 1. Ejemplo I 1.1 Clonación del DR5 humano y de cinomolqo, y preparación de la proteína 1.1.1 Clonación del dominio extracelular (ECD) del DR5 humano de forma larga, y del dominio extracelular del DR5 de cinomolgo de forma larga y corta El dominio extracelular del DR5 humano de forma larga (aa55-213) se clona mediante RT-PCR. El ARN total se aisla a partir de Células Jurkat y Raji, mediante un mini-kit RNeasy de Qiagen (Número de Catálogo 74104). el ADNc se hace mediante el Sistema de Síntesis de la Primera Cadena SuperScrit II (Invitrogen, Catálogo: 11904-018), entonces se amplifica mediante Polimerasa de ADN Taq Platino de Alta Fidelidad (Invitrogen, Número de Catálogo 11304-011) utilizando el protocolo estándar: 94°C durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos a 95°C/30 segundos, 55°C/30 segundos, 72°C/60 segundos, y una incubación final a 72°C durante 7 minutos. Los cebadores hacia adelante y en reversa utilizados para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) son: 5'-CTG ATCACCC AACAAGACCT AG-3' (SEQ ID NO: 83), y 5'-GCCTGAG AGA GAACAGGGAG A-3' (SEQ ID NO: 84), respectivamente. Entonces el fragmento de 476 pares de bases resultante se liga en el vector de expresión pBAD/Thio-TOPO de E. coli (Invitrogen, Número de Catálogo K370-01). Los clones positivos se identifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se confirman mediante la secuencia del ADN.

El gen de DR5 de cinomolgo de longitud total se clona originalmente a partir del ADNc de hígado de cinomolgo (BioChain Institute, Inc. EUA) mediante PR-PCR. Los cebadores hacia adelante (5'-CACCATGGAA CAACGGGGAC AGAACGCC-3') (SEQ ID NO: 85), y en reversa (5'-TTAGGACATG GCAGAGTCTG CATTACCTTC-3') (SEQ ID NO: 86) se diseñan basándose en la secuencia de nucleótido del DR5 humano, incluyendo los codones de inicio (ATG), y de paro (TAA), respectivamente. Se utiliza la Polimerasa de ADN Taq Platino de Alta Fidelidad (Invitrogen, Número de Catálogo 11304-011 )para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los fragmentos resultantes se ligan en el vector TOPO direccional de pcDNA3.1. Las colonias positivas se identifican mediante secuenciación del ADN. De una manera similar al gen del DR5 humano, se identifican dos alternativas de empalme del gen del DR5 de cinomolgo. Una tiene el ECD de forma larga, y la otra tiene el ECD de forma corta.

Tanto la forma larga de cinomolgo (aminoácidos 55-213), como la forma corta (aminoácidos 55-174) del ECD de DR5 se clonan adicionalmente en el vector pBAD/Thio-TOPO (Invitrogen, Número de Catálogo K370-01). Los clones positivos se identifican mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se confirman mediante secuenciación del ADN. 1.1.2 Establecimiento de líneas celulares CHO que expresan el DR5 de cinomolgo de superficie celular La células de ovario de hámster chino (CHO-K1) se transfectan en el 90 al 95 por ciento de confluencia utilizando FuGENE6 (Roche Applied Sciences), y 1 microgramo del vector de expresión pcDNA3.1 -cynoDR5. Las células transfectadas se seleccionan con 500 microgramos/mililitro de Geneticina (G418), y se subclonan mediante selección celular. 1.1.3 Expresión y purificación de la fusión de tio-redoxina-DR5ECD-His6 a partir de E. coli Para la expresión del ECD de DR5, el vector pBAD/Thio-DR5ECD se transforma en la cepa TOP-10 de E. coli (Invitrogen, Número de Catálogo C4040-03). Se utiliza una colonia individual para inocular 100 mililitros de LB que contienen 100 microgramos/ mililitro de ampicilina. Este cultivo se incuba durante la noche a 37°C con agitación a 225 rpm. Se inoculan tres litros de LB/ampicilina con 30 mililitros del cultivo durante la noche, y se agitan a 37°C hasta que el OD60o alcanza 0.5. Entonces el cultivo se induce con arabinosa al 0.02 por ciento durante 3 horas a 37°C. El gránulo bacterial se vuelve a suspender en 21 mililitros de regulador de lisis (PBS con NaCI 0.3M, Tritón X-100 al 0.4 por ciento, e imidazol 10mM) que contiene inhibidores de proteasa (Roche, Número de Catálogo 1836153). El lisado se sónica dos veces durante 60 segundos, seguido por centrifugación a 20,000 x g durante 20 minutos. El ECD del DR5 marcado con Hisx6 soluble se purifica mediante cromatografía por afinidad de quelato de níquel. El ECD del DR5 marcado con Hisx6 soluble se crea insertando la marca de la secuencia de codificación del polipéptido de la SEQ ID NO: 91 ó 92 en el extremo 3' del marco de lectura de la construcción del DR5, en donde la marca se expresa en el extremo C-terminal del polipéptido. El lisado clarificado se pasa sobre 6 mililitros de Agarosa de Ni-NTA (Qiagen, Número de Catálogo 30210) equilibrada con regulador de lisis. La columna se lava con 20 mililitros de regulador de lisis, seguido por 15 mililitros de suero regulado con fosfato que contiene imidazol 50 mM y Tritón X-100 al 0.1 por ciento. Entonces la proteína ECD de DR5 se eluye con 10 mililitros de suero regulado con fosfato que contiene imidazol 100mM y Tritón X-100 al 0.1 por ciento, seguido por el mismo regulador que contiene imidazol 250 mM. Se revisan las fracciones en gel Bis-Tris de NuOAGE del 4 al 12 por ciento (Invitrogen, Número de Catálogo NP0329BOX). Las fracciones positivas que contienen la proteína de ECD de DR5 se reservan, se concentran, y se almacenan a -20°C.

Después de la cromatografía por afinidad de quelato de níquel, la proteína se purifica además mediante cromatografía por exclusión de tamaños hecha en un explorador Amersham AKTA con un programa de software Unicom. La columna es HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR con un volumen del lecho de 320 mililitros (Amersham, Número de Catálogo 17-1195-01). Se utilizan los parámetros estándares de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Dicho de una manera breve, el regulador 1xPBS (pH de 7.2) fluye a través de la columna a 0.5 mililitros/minuto, y se recolectan 0.5 mililitros/fracción a 4°C.

El último paso de la purificación es la cromatografía de intercambio de iones. Se utiliza la columna Mono Q 5/50 GL de intercambio de aniones (Amersham, Número de Catálogo 17-5166-01) con una elución en gradiente a una velocidad de flujo de 1 mililitro/minuto, y se recolectan 0.5 mililitros/fracción a 4°C. 1.1.4 Expresión y purificación de la proteína de fusión DR5ECD-FC a partir de células HEK293 Se clonan tanto el dominio extracelular del DR5 humano como de cinomolgo de forma larga y de forma corta en el vector de expresión pRS5a-lgG que contiene un promotor de CMV y un fragmento del gen de lgG1 Fe humano. Los clones positivos se identifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se confirman mediante la secuencia de ADN. Las células HEK293 se transfectan transitoriamente con Lipofectamina 2000 (Gibco, Número de lote 11317078). El medio que contiene la proteína de fusión DR5ECD-Fc se recolecta siete días después de la transfeccion. El sobrenadante concentrado se ajusta a un pH de 7.2, se aclara mediante filtración, y se carga en una columna de Proteína A-Sepharose FF de 5 mililitros a 0.5 mililitros/minuto. Después de que la línea base se lava con suero regulado con fosfato, pH de 7.3, el material enlazado se eluye con Citrato 50 mM/NaCI 140 mM, pH de 2.7, se neutraliza, y se filtra para esterilizarse. 1.2 Inmunizaciones Se inmunizan tres llamas con antígeno de DR5 humano. Una llama (106) se inmuniza con el DR5 humano recombinante corto (133 residuos) (Peprotech, Rocky Hill NJ, Número de Catálogo 310-19). Otras dos llamas se inmunizan con la fusión de DR5-tio-redoxina humana del ectodominio total. Las llamas reciben siete dosis por semana, se inyectan intramuscularmente con 50 a 100 microgramos de antígeno (con Stimune (Cedi Diagnostics, Lelystad NL) como un adyuvante), seguidas por una dosis de 50 microgramos adicionales dos semanas después. Las muestras de sangre inmune se toman en el día 47 y en el día 88 después de empezar las inmunizaciones, así como los tejidos del ganglio linfático en el día 88. 1.3 Construcciones de Bibliotecas Se hacen muestras de ADNc a partir de preparaciones de ARN total de la sangre inmune y las muestras de ganglio linfático. Las secuencias de nucleótidos que codifican las construcciones de DR5 NB se amplifican a partir de muestras de ADNc de las tres llamas inmunizadas con el DR5 humano en un paso de reacción de RT-PCR utilizando los cebadores ABL051 (SEQ ID NO: 73), ABL052 (SEQ ID NO: 74), y ABL003 (SEQ ID NO: 75). Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 5. Los amplicones de 700 pares de bases amplificados a partir de los ADNcs de lgG2 e lgG3 en la muestra se aislan a partir del gel y subsiguientemente se utilizan como plantillas en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada utilizando el cebador ABL050-Mfel (SEQ ID NO: 76) que contiene los sitios de restricción Sfi\ y Mfe\, y el cebador ABL003. Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) subsiguientemente se digieren con Sfi\ y BstEW (FR4 que se presenta naturalmente de los genes VHH), y se ligan en los sitios de restricción correspondientes del vector fagémido pAX50 para obtener una biblioteca después de la eletroporación en Escherichia coli TG-1. El pAX50 es un vector de expresión derivado a partir de pUC119, el cual contiene el promotor LacZ, una proteína plll de colífago, un gen de resistencia a la ampicilina o carbenicilina, un sitio de multi-clonación, y la secuencia líder del gen3. En el marco con la construcción de la secuencia de codificación de NB, el vector codifica para una marca c-myc C-terminal y una marca (His)6. El vector de fagémido permite la producción de partículas de fago, que expresan las construcciones de DR5 NB individuales como una proteína de fusión con el producto del gen3.

Tabla 5 Secuencias de cebador y enlazador, con SEQ ID NO 1.4 Selecciones Las diferentes concentraciones de entre 0 y 1 microgramo/ mililitro de proteína de fusión de DR5-Fc humano corto (182 aminoácidos) (R&D Systems, Minneapolis MN, Número de Catálogo 631-T2/CF), proteína de fusión de DR5-Fc humano de ectodominio total ((aminoácidos de DR5 humano 56 a 213 fusionados con Fe de la lgG1 humana), y DR5 humano recombinante corto biotinilado (133 residuos) (Peprotech, Rocky Hill NJ, Número de Catálogo 310-19) se inmovilizan en placas y en placas recubiertas de estreptavidina, respectivamente. El bloqueo se hace utilizando suero regulado con fosfato complementado con caseína al 1 por ciento. Se agregan los fagos preparados a partir de las tres bibliotecas de pAX50 anteriormente mencionadas, y se incuban durante 30 minutos (en suero regulado con fosfato complementado con caseína al 0.1 por ciento y Tween20 al 0.1 por ciento). Los fagos no enlazados se lavan (con suero regulado con fosfato complementado con Tween 20 al 0.05 por ciento); los fagos enlazados se eluyen mediante la adición de tripsina (1 miligramo/mililitro en suero regulado con fosfato), y 30 minutos de incubación a 37°C. Se permite que los fagos eluidos infecten las células TG-1 de crecimiento exponencial, que entonces se ponen sobre placas de agar LB que contiene ampicilina. Los fagos preparados a partir de las salidas seleccionadas se utilizan como entradas en una segunda ronda de selección sobre proteína de fusión de DR5-Fc humana de longitud completa (aminoácidos de DR5 humano 56 a 213 fusionados con Fe de la lgG1 humana), y DR5 humano recombinante corto biotinilado (133 residuos) (Peprotech, Rocky Hill NJ, Número de Catálogo 310-19) como se describe anteriormente.

Se prepara el ADN del plásmido de las salidas de las rondas de selección 1 y 2, se digiere con Sfi\ y físíEll, y los fragmentos de ADN que codifican las construcciones anti-DR5 NB se ligan en el vector pAX51 y se transforman en células competentes TG-1. El pAX50 es un vector de expresión derivado a partir de pUC119, el cual contiene al promotor LacZ, un gen de resistencia a la ampicilina o a la carbenicilina, un sitio de multiclonación, y la secuencia líder del gen3. En un marco con la construcción de la secuencia de codificación de NB, el vector codifica para una marca c-myc C-terminal, y una marca (His)6. Los clones resistentes a carbenicilina se analizan para determinar la presencia del inserto, y se verifican las secuencias de los clones positivos. Las células TG-1 que contienen las construcciones de interés de DR5 NB crecen en un medio TB complementado con carbenicilina, y se inducen mediante la adición de IPTG para la expresión. La expresión se deja continuar durante 4 horas a 37°C. Después de la centrifugación, los gránulos celulares se congelan durante la noche, entonces se vuelven a suspender durante 1 hora a 4°C en suero regulado con fosfato (1/10 de volumen de cultivo), otra vez seguido por centrifugación. Los sobrenadantes resultantes se utilizan como extracto periplásmico. 1.5 Rastreo Los extractos perlplásmicos (como se describen anteriormente) se analizan para determinar el enlace de DR5 mediante ELISA. Se agregan diluciones a 10 veces de los extractos periplásmicos a las placas recubiertas con DR5 humano recombinante corto (133 residuos) (Peprotech, Rocky Hill NJ, Número de Catálogo 310-19) o proteína de fusión DR5-Fc de cinomolgo (DR5 de cinomolgo, aminoácidos 56 a 213 fusionados con la lgG1 humana Fe), los aminoácidos 56 a 213, I gG 1 NVTS, y se incuban durante 2 horas (en suero regulado con fosfato complementado con caseína al 0.1 por ciento y Tween20 al 0.1 por ciento). Los extractos periplásmicos no enlazados se lavan (PBS complementado con Tween 20 al 0.05 por ciento), y se detectan las construcciones de NB enlazadas, utilizando anti-myc de ratón (Roche, Basilea CH, Número de Catálogo 11667149001), seguido por fosfatasa alcalina de conejo anti-ratón (Sigma, St. Louis MO, Número de Catálogo A-1902).

En otro conjunto de experimentos, las líneas celulares expresan el DR5 humano (Colo205) o el DR5 de cinomolgo (células CHO-K1 transfectadas con un vector de expresión que lleva la longitud total del gen del DR5 de cinomolgo corriente abajo de un promotor de CMV) se exponen a los extractos periplásmicos (se vuelven a suspender en suero regulado con fosfato complementado con suero fetal de becerro al 10 por ciento). Se detecta el enlace de las construcciones de NB al DR5 enlazado a células utilizando anti-myc de ratón (anticuerpo monoclonal, clon 9E10 ATCC (Teddington, Reino Unido) número CRL-1729, producido en los ratones como ascitas y purificado en la empresa utilizando cromatografía por afinidad estándar), seguido por IgG-fitoeritrina anti-ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, Número de Catálogo 115-115-164). Las células muertas se contra-tiñen con TO-PRO-3 (Molecular Probes, Carlsbad CA, Número de Catálogo T3605). Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6 Enlace de las construcciones monoméricas de NB al DR5 mediante ELISA (ABS4o5nm) Se evalúa el enlace de las construcciones de NB al DR5 mediante resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore 3000. Se analiza la especificidad de enlace permitiendo que las diluciones de los extractos periplásmicos pasen sobre un chip sensor CM5 recubierto con el DR5 humano recombinante corto 270 RU (133 residuos) (Peprotech, Rocky Hill NJ, Número de Catálogo 310-19). Se analizan las fases de disociación y se dan los valores fuera de índice correspondientes (kdeSact¡vado) en 'a Tabla 7 y en la Tabla 8. La Tabla 7 muestra los resultados para el enlace de las construcciones monoméricas de NB al DR5 enlazado a células mediante FACS (conteo promedio de fluorescencia). La Tabla 8 muestra los resultados para los valores fuera de índice como se determina mediante Resonancia de Plasmón Superficial. Las secuencias se proporcionan en las Tablas 1 a 4.

Tabla 7 Enlace de las construcciones monoméricas de NB al DR5 enlazado a células mediante FACS Tabla 8 Valores fuera de índice (1/s) como se determinan mediante Resonancia de Plasmón Superficial Ejemplo II 2.1 Trimerización Los fragmentos de ADN que codifican las construcciones de NB anti-DR5, se digieren con Mfe\ y SsfEII y se clonan en los vectores pAX73, pAX74 y pAX75 dentro del marco con las secuencias enlazadoras. Éstos se transforman en células competentes TG-1, y se analizan los clones resistentes a canamicina para determinar la presencia del inserto y verificar la secuencia. Las construcciones resultantes se digieren con Sfi\, BpuM y Not\, y entonces se clona la construcción de NB que contiene fragmentos a través de una ligación de cuatro puntos en el vector pAX51 digerido por Sfi\-Not\. Se verifica nuevamente la secuencia de los clones resistentes a la carbenicilina positivos, es decir, aquéllos que codifican las construcciones de NB marcadas con CMYC-HIS6 trivalentes (cada bloque de la construcción de NB se fusiona al siguiente mediante una secuencia enlazadora). Los pAX73, pAX74, pAX75 y pAX83 son vectores de clonación derivados de pUC que contienen un gen de resistencia para canamicina o neomicina, sitios de clonación múltiple, y están dentro del marco con la secuencia de codificación de la construcción de NB, y estos vectores codifican las secuencias enlazadoras de GlySer. 2.2 Tetramerización Los fragmentos de ADN que codifican las construcciones de NB anti-DR5 se amplifican por medio de PCR utilizando M13Rev (SEQ ID NO: 78), y Rev_30GlySer (SEQ ID NO: 79) o For_GlySer35 (SEQ ID NO: 80), y M13Fwd (SEQ ID NO: 77), respectivamente. Tanto Rev_30GlySer como For_GlySer35 codifican las secuencias enlazadoras (secuencias cebadoras en la Tabla 5). Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se digieren con Mfe\, BamHl y SsíEll, y ambos fragmentos se clonan conjuntamente a través de un ligamiento de tres puntos en pAX75 y en pAX83, dentro del marco con las secuencias enlazadoras codificadas por el vector. Éstos se transforman en células competentes TG-1, y los clones resistentes a la canamicina se analizan para determinar la presencia de construcciones bivalentes del inserto de NB, y se verifica la secuencia. Entonces los clones bivalentes positivos se digieren con Sfi\, BpuM y Not\, y entonces se clona la construcción de NB que contiene los fragmentos en el vector pAX51 digerido por Sfi\-Not\. Nuevamente se verifica la secuencia de los clones resistentes a la carbenicilina positivos, que codifican las construcciones de NB tetravalentes, estando cada bloque de construcción de NB fusionado al siguiente mediante una secuencia enlazadora. 2.3 Pentamerización Los genes sintéticos que codifican la cuarta secuencia del enlazador de GlySer y el quinto bloque de construcción de NB se ordenan de acuerdo con GeneArt AG (Regensburg, Alemania). Entonces, estos fragmentos se digieren con Hgal y Notl, y se ligan en las construcciones de NB tetravalentes digeridas por BstEII-Notl. 2.4 Expresión a pequeña escala Las células TG-1 que contienen las construcciones de NB anti-DR5 multivalentes de interés se cultivan en matraces de agitación con pantallas que contienen el medio TB más 100 microgramos/mililitro de carbenicilina, y se inducen mediante la adición de IPTG 1 mM para la expresión. Se deja continuar la expresión durante 4 horas a 37°C. Después de recolectar las células, se preparan los extractos periplásmicos y las construcciones de NB marcadas con HIS6 se purifican mediante cromatografía por afinidad de metales inmovilizados (HisTrap FF Crude, GE Healthcare), seguida por cromatografía de filtración de gel (Superdex 75 HR16/10, GE Healthcare) en PBS. 3. Ejemplo III 3.1 Enlace sobre Biacore Los chips sensores Biacore CM5 se recubren con la proteína de fusión del DR5 humano-Fc corta (182 aminoácidos) (R&D Systems, Minneapolis MN, catálogo # 631-T2/CF) o la proteína de fusión del DR5 de cinomolgo-Fc (aminoácidos 56 a 213, lgG1 NVTS). Entonces se flotan diferentes concentraciones (de 1 a 100 nM) de las construcciones de NB anti-DR5 monovalentes y multivalentes sobre los chips para un análisis cinético de la interacción de enlace. Todas las construcciones de NB anti-DR5 multivalentes se enlazan al DR5 humano y de cinomolgo (Tabla 9).

Tabla 9 Afinidades (M) de las construcciones de NB anti-DR5 como se determinan mediante resonancia de plasmón superficial ND: No determinado; BDL: debajo del límite de detección 3.2 Enlace sobre FACS En otro conjunto de experimentos, las líneas celulares que expresan el DR5 humano (Colo205) o de cinomolgo (células CHO-K1 de cinomolgo transfectadas con un vector de expresión que lleva el gen cynoDR5 de longitud completa corriente abajo de un promotor de C V) se exponen a 1 nM de las construcciones de NB anti-DR5 multivalentes (resuspendidas en suero regulado con fosfato complementado con suero fetal de becerro al 10 por ciento). El enlace de las construcciones de NB al DR5 enlazado a las células se detecta utilizando anti-myc de ratón (anticuerpo monoclonal, clon 9E10 ATCC (Teddington, Reino Unido) número CRL-1729, producido en los ratones como ascitas y purificado en la empresa utilizando cromatografía por afinidad convencional), seguido por IgG-fitoeritrina anti-ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, catálogo # 115-115-164). Las células muertas se contra-tiñen con TO-PRO-3 (Molecular Probes, Carlsbad CA, catálogo # T3605). Todas las construcciones de NB multivalentes se enlazan específicamente al DR5 humano y de cinomolgo enlazado a células. El enlace de los agentes NB a cada una de la forma corta y la forma larga del DR5 es aproximadamente equivalente para cada una, sugiriendo que todos los epítopos se mantienen en común entre las dos formas.

En otro experimento, se estiman las constantes de enlace evidente a partir de los experimentos de enlace de saturación sobre FACS (como se describe anteriormente) de 10 a 0.005 nM de las construcciones de NB anti-DR5 tetravalentes al DR5 humano y de cinomolgo enlazado a células. Las constantes de enlace evidente se calculan utilizando GraphPad Prism 5 (GrafPad Software, San Diego, CA). 3.3 Especificidad de DR5 Un grupo de miembros de la súper-familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) se seleccionan para probar la especificidad de DR5 (Tabla 10). El dominio extracelular de los miembros de la súper-familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) se clona en pBadThioTopo, y se transforma en E. coli cepa TOP10 (Invitrogen #C4040-03). La proteína se expresa de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los lisados celulares se recolectan para el rastreo mediante ELISA, se agregan 25 microlitros de albúmina de suero bovino (BSA) al 20 por ciento por 10 mililitros del lisado. Las placas de captura de His (Sigma #S-5688) se recubren con 100 microlitros del lisado, y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución restante se aspira y los pozos se lavan tres veces con suero regulado con fosfato + Tween al 0.05 por ciento (PBST). Los anticuerpos primarios se diluyen como sigue en regulador de bloqueo (suero regulado con fosfato (PBS) que contiene suero bovino fetal al 10 por ciento); el LBY135 (control positivo, anticuerpo anti-DR5, Novartis AG) se diluye hasta 0.24 miligramos/mililitro, y el anti-V5 de conejo (Abcam #Ab9116-100) se diluye a 1:5000. Se agregan 100 microlitros del anticuerpo primario diluido por pozo. Las placas de ensayo se Incuban a temperatura ambiente durante una hora, y luego se lavan tres veces con PBST. Los anticuerpos secundarios (IgG-HRP de cabra anti-conejo) (Jackson Immunoresearch Laboratories #111-035-046) para los pozos incubados con V5, e IgG-HRP de cabra anti-humano (Jackson Immunoresearch Laboratories #109-035-098) para los pozos incubados con LBY135) se diluyen a 1:5000 en suero regulado con fosfato que contiene suero bovino fetal (FBS) al 5 por ciento y Tween al 0.025 por ciento. Se agregan 100 microlitros del anticuerpo secundario a los pozos apropiados. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, las placas se lavan tres veces con PBST. Se agregan 100 microlitros de Sure Blue (KPL #52-00-03), y una vez que se ha revelado el color, las placas se leen a una absorbencia de 650 nanómetros.

Tabla 10 Miembros de la súper-familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) Todas las construcciones de NB específicamente se enlazan al DR5, pero no a otros miembros de TRAIL y TNF. Véase, por ejemplo, Figura 1. 3.4 Mapeo de Epítopos Biacore El rastreo fuera de índice Biacore (Tabla 8) sobre el DR5 humano recombinante (133 residuos) (Peprotech, Rocky Hill NJ, catálogo # 310-19) reveló que todas las construcciones de NB anti-DR5 se enlazan al dominio extracelular de DR5 pero no al residuo 29 de una región alternativamente empalmada (residuos de aminoácidos 185 a 231 ).

En otro experimento, los chips sensores Biacore CM5 se recubren con las construcciones de NB anti-DR5 monovalentes (230 a 520 RU). Entonces, se flotan 500 nM del DR5 humano recombinante corto (133 residuos) (Peprotech, Rocky Hill NJ, catálogo # 310-19) sobre los chips hasta que se alcanza la saturación. En este punto, se flotan 50 nM de TRAIL humano (R&D Systems, Minneapolis MN, catálogo # 375-TEC/CF) sobre los chips y se utiliza el aumento en la señal de enlace para categorizar las construcciones de NB en diferentes clases de epítopos comparándose con el epítopo de TRAIL (Tabla 11).

Tabla 11 Mapeo de epítopos de las construcciones de NB anti-DR5 comparándose con TRAIL 3.5 Sobrevivencia Celular In vitro Las células se mantienen en fase de crecimiento logarítmico antes de los experimentos. En el día del ensayo, las células se transfieren aplacas de 96 pozos (Corning Inc., Lowell, A, Cat#3917) a 5,000 - 20,000 células por pozo, entonces se agregan las construcciones de NB anti-DR5 diluidas en serie a 50 microlitros/pozo. Después de la incubación durante 24 a 72 horas, se cuantifica el número relativo de células sobrevivientes utilizando un Kit de cuantificación de ATP basada en luciferasa (Cell Titer Glo, Promega, Madison, Wl Cat # G7571), y se lee en un lector de placas de luminiscencia (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Electron, Waltham, MA).

Un panel de construcciones trivalentes de NB anti-DR5 se rastrea en un ensayo de sobrevivencia celular con las células Colo205. Todas las construcciones trivalentes indujeron la apoptosis en Colo205 (véase la Tabla 12) en contraste con sus contra-partes monovalentes (no se muestran los datos) que no son biológicamente activas en este ensayo. Una construcción tetravalente de una construcción de NB irrelevante (que no se enlaza al DR5) no indujo la apoptosis.

Tabla 12 Potencia in vitro (IC50 (M)) de las construcciones trivalentes de NB anti-DR5 en Colo205 En otro experimento (Tabla 13), las construcciones de NB anti-DR5 trivalentes seleccionadas se rastrean en los ensayos de sobrevivencia celular contra un panel de líneas celulares tumorales y normales.

Tabla 13 Potencia in vitro (IC50 ( )) de las construcciones de NB anti-DR5 trivalentes En otro experimento (Tabla 14), las construcciones de NB anti-DR5 tetravalentes seleccionadas se rastrean en los ensayos de sobrevivencia celular contra un panel de líneas celulares tumorales y normales.

Tabla 14 Potencia in vitro (IC50 (M)) de las construcciones de NB anti-DR5 tetravalentes Las representaciones gráficas que muestran que aumento de la jerarquía de los multímeros da como resultado mayor eficacia y potencia, se muestran en las Figuras 6A, 6B y 6C, en donde las construcciones de NB de 11 H6 y 4E6 triméricas, tetraméricas y pentaméricas tienen una mayor potencia, respectivamente, contra las células tumorales Colo205 y H226 tratadas in vitro.

Las construcciones de NB anti-DR5 multivalentes exhiben una actividad inductora de apoptosis en las líneas celulares tumorales pero no en las líneas celulares normales (sanas). La tendencia general es que se ve un aumento de la actividad inductora de apoptosis con un aumento en el número de subunidades en una composición de NB multimérica. El aumento desde las formas tetraméricas hasta pentaméricas del NB, proporciona evidencia del mayor incremento en la potencia en los ensayos de muerte celular, como se ejemplifica por la disminución de la IC50 o el aumento de la muerte celular máxima lograda dependiendo de la línea celular. 3.6 Reticulación En otro experimento, las construcciones de NB multivalentes (10 microgramos) que contienen una marca cMYC se reticulan a través de su marca CMYC con 1.5 microgramos a 150 microgramos de anti-myc de ratón (anticuerpo monoclonal, clon 9E10 ATCC (Teddington, Reino Unido) número CRL-1729, producido en los ratones como ascitas y purificado en la empresa utilizando cromatografía por afinidad convencional) durante una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Las construcciones de NB reticuladas se evalúan entonces en los ensayos de sobrevivencia celular in vitro. El aumento de la reticulación se correlacionó con la mayor potencia y eficacia (véanse las Tablas 15 y 16). La Tabla 15 proporciona la potencia in vitro (IC50 (M)) de las construcciones de NB anti-DR5 reticuladas trivalentes con diferentes cantidades de anticuerpo en células Jurkat. La Tabla 16 proporciona la eficacia in vitro (porcentaje de células muertas) de las construcciones de NB anti-DR5 tetravalentes reticuladas con diferentes cantidades de anticuerpo en células Jurkat. La tendencia general es que se aniquilan más células con las mayores cantidades de reticulación de los multímeros de NB marcados.

Tabla 15 Potencia in vitro (IC50 (M)) de las construcciones de NB anti-DR5 trivalentes reticuladas Proporción: Proporción en peso de anticuerpo reticulante construcciones de NB anti-DR5 tetravalentes.

Tabla 16 Eficacia in vitro (porcentaje de células muertas) de las construcciones de NB anti-DR5 tetravalentes reticuladas Proporción: Proporción en peso de anticuerpo reticulante / construcciones de NB anti-DR5 tetravalentes. 3.7 Estabilidad en Suero 3.7.1 Construcciones de NB y enlace de DR5 en ELISA Las construcciones de NB se incuban previamente con suero humano fresco al 100 por ciento a 37°C durante 24 horas. Las placas ELISA de 96 pozos de fondo plano (Costar, Cambridge, MA, Catálogo No.3590) se recubren durante la noche a 4°C con 50 microlitros de proteína de fusión DR5-Fc (DR5, aminoácidos 56 a 213) a 1 microgramo/mililitro en suero regulado con fosfato. Las placas entonces se bloquean con 300 microlitros de albúmina de suero bovino al 2 por ciento (Gibco, Grand Island, NY, Cat # 11018-025) en suero regulado con fosfato (PBS) durante una hora, y se lavan tres veces. Las muestras de construcciones de NB se diluyen en serie en el regulador de suero regulado con fosfato (PBS) que contiene suero humano al 10 por ciento, entonces se agregan a placas ELISA, y se incuban durante una hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se agregan a las placas 1:5000 de anticuerpo policlonal anti-myc conjugado con HRP (Invitrogen: 460709) o 1:7000 de anticuerpo anti-VHH de conejo, seguido por 1:15000 de IgG anti-conejo conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA, Cat # 115-035-072). Después de un conjunto final de lavados, se agregan 100 microlitros/pozo de sustrato de peroxidasa TMB Microwell (BioFX, Owings Mills, MD, Catálogo No. TBNP-1000-01 ), y se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción se detiene con 100 microlitros de reactivo de Paro (BioFX, Owings Mills, MD, Cat # LSTP-0100-01). Se hace la detección colorimétrica del producto a 450 nanometros en un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los datos se analizan con el software SoftMax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) de acuerdo con el manual del usuario.

El suero humano muestra poca interferencia con la construcción de los trímeros o tetrámeros de NB que se enlazan al DR5, detectado mediante el anticuerpo anti-Myc o bien anticonstrucción de N B . 3. 7.2 Función de la construcción de NB en el ensayo de sobrevivencia celular Los ensayos de sobrevivencia cel ular también se llevan a cabo en la presencia y en ausencia de albúmina de suero humano de aproximadamente el 1 0 al 1 5 por ciento. Las construcciones de N B anti-DR5 tetravalentes mantienen su potencia ¡n vitro comparándose con los ensayos de control en la presencia de suero fetal de becerro al 1 0 por ciento. 4. Ejemplo IV 4.1 Construcciones de NB anti-D R5 trivalentes de una sola dosis ¡n vivo Los ratones hembras (nu/nu) atímicos exógamos (Harían Sprague Dawley, I ndianápol is , I N) se anestesian y se implantan subcutáneamente en la región axilar (lateral) derecha de cada animal con 1 x 1 06 cél ulas Colo205. Los tumores se dejan crecer hasta el tamaño de 200 mm3 antes de iniciar la dosificación . La construcción de N B se formula como una sol ución en suero regulado con fosfato y se administra u na sola dosis a 200 microgramos/ratón mediante una inyección i ntravenosa de bolo. Se recolectan muestras de los tumores a partir de los grupos de animales (un grupo por punto del tiempo, 3 animales por g rupo) a las 1 hora, 2 horas , 4 horas , y 8 horas .

Parte de las muestras de tejido se utilizan para el teñido inmunohistoquímico (IHC) de la Caspasa3. Los tejidos se ponen inmediatamente en formalina regulada neutra al 10 por ciento (NBF, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Catálogo No. SF100-20), se procesan y se empotran en bloques de parafina. Se cortan secciones de 4.0 mieras sobre los portaobjetos SuperFrost más cargados (Fisher Scientific, Catálogo No. 12-550-15). Las secciones se desparafinizan en xileno (5 minutos, 2 veces), y se hidratan en una serie graduada de alcoholes (100 por ciento de alcohol durante 5 minutos, 95 por ciento de alcohol durante 2 minutos, 70 por ciento de alcohol durante 2 minutos, y agua desionizada durante 5 minutos). Las secciones hidratadas se sometieron a recuperación del antígeno, la cual se conduce mediante paso por microondas de los portaobjetos en regulador de ácido cítrico (0.01 M, pH de 6.0, BioGenex, San Ramón, CA, Catálogo No.HK080-9K) durante 10 minutos. Los portaobjetos se colocan sobre las rejillas de teñido del auto-teñidor (Dako Cytomation) después de lavarse con agua desionizada durante 5 minutos. Los siguientes pasos se hacen con el sistema automatizado Dako a temperatura ambiente. Entre cada paso, los portaobjetos se enjuagan con el regulador de enjuague (Regulador de Lavado OptiMax, Biogenex, Catálogo No. HK583-5K) tres veces. La peroxidasa endógena se bloquea mediante la incubación de los portaobjetos con peróxido de hidrógeno (Dako, Catálogo No. S2001) durante 10 minutos. La reacción del antígeno no específico se bloquea mediante el suero de bloqueo (Dako, Catálogo No . X0909) durante 1 0 minutos . Los portaobjetos se incuban con el anticuerpo policlonal de conejo con Caspasa3 disociada (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, Catálogo No. 9661 ) durante 60 minutos, entonces se enjuagan y se exponen al anticuerpo conjugado con peroxidasa (sistema DAKO Envision, Catálogo No. K4003) du rante 30 mi nutos . Para la detección , se aplica solución de DAB (3,3'-diamino-bencidina) (Dako Cytomation , Catálogo No. K3468) durante 2 minutos. Los portaobjetos inmunoteñidos se contra-tiñen l igeramente con Hematoxi lina de Harris (Surgi Path, Catálogo No. 01 560) , se deshidratan a través de una serie de concentraciones crecientes de alcohol (70 por ciento, 95 por ciento , y 1 00 por ciento de alcohol , cada una durante 1 mi nuto) , y xileno (5 minutos, 2 veces) , y se montan con u n cubreobjetos ( Leica) .

Los portaobjetos se exploran en la base de datos de portaobjetos digitalizada utilizando el sistema Aperio (Aperio Technologies , I nc. Vista, CA) , y se hace el análisis de imágenes util izando el Algoritmo de Conteo de Pixeles Positivos de Aperio. Se utilizan las secciones enteras excluyendo las áreas necróticas y la porción de tejido del huésped "marcada como fuera" , util izando las herramientas proporcionadas por el sistema de toma de imágenes, para el análisis de las imágenes . Todas las construcciones de N B anti-D R5 multivalentes inducen la activación de Caspasa3.

Parte de las muestras de tejido se mezclan con el regulador T-per (Pierce, Rockford, IL, Catálogo No. 78510), entonces inmediatamente se homogeneízan en el Msador de tejido (Qiagen, Catálogo No. 85210). El sobrenadante del lisado de tejido se recolecta, y se determina su concentración de proteína utilizando un ensayo BCA convencional (Pierce, Catálogo No. 1856210). Los Usados de tejido se utilizan en los siguientes ensayos para verificar la concentración de la construcción de NB y anticuerpo más la actividad de Caspasa3 en el tumor.

La concentración de la construcción de NB se determina en un ELISA. Las placas ELISA (Nunc, Rochester NY, Catálogo No. 439454) se recubren durante la noche a 4°C con 100 microlitros de la proteína de fusión de DR5 humano-Fc (DR5, aminoácidos 56 a 213) a 1 microgramo/mililitro en suero regulado con fosfato, entonces se bloquean con albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento (Gibco, Catálogo No. 11018-025) en suero regulado con fosfato durante 1 hora a temperatura ambiente, y luego se lavan tres veces. Las muestras de suero o de lisado de tejido diluidas en serie se transfieren a las placas ELISA y se incuban durante 1.5 horas a temperatura ambiente. En seguida de tres lavados, se agrega anti-VHH diluido a 1/22500 a las placas ELISA, y se incuban durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan tres veces más, y entonces se incuban durante una hora con 100 microlitros/pozo de HRP-cabra-anti-conejo diluido a 1/20000 (Pierce, Catálogo No. 31462). Después de un conjunto final de lavados, se agregan 100 microlitros/pozo de sustrato de peroxidasa TMB Microwell (BioFX, Owings Mills, MD, Catálogo No. TMBW-0100-01 ), durante 10 minutos, y la reacción entonces se detiene con 100 microlitros de solución de paro (BioFX, Catálogo No. LSTP-1000-01 ). La detección colorimétrica del producto se hace a 450 nanometros en lector de microplacas SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los datos se analizan en el modelo de 4 parámetros con el software SoftMax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) de acuerdo con su manual del usuario. Todas las construcciones de NB muestran una rápida liberación en suero y en el tejido tumoral, y una rápida penetración.

La actividad de Caspasa 3/7 en el lisado de tejido tumoral se evalúa mediante el ensayo Caspasa glo (Promega Catálogo No. G8092) de acuerdo con su manual del usuario. La luminiscencia se lee utilizando el lector de microplacas SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). De una manera consistente con los resultados de IHC, todas las construcciones de NB activan la Caspasa 3 dentro de 8 horas. 4.2 Una sola dosis in vivo de las construcciones de NB anti-DR5 tetravalentes Los ratones hembras (nu/nu) atímicos exógamos (Harían Sprague Dawley, Indianápolis, IN) se anestesian y se implantan subcutáneamente en la región axilar (lateral) derecha de cada animal con 1 x 106 células Colo205. Los tumores se dejan crecer hasta el tamaño de 200 mm3 antes de iniciar la dosificación. La construcción de NB se formula como una solución en suero regulado con fosfato (PBS), y se administra una sola dosis a 200 microgramos/ratón mediante una inyección intravenosa de bolo. El suero y el tejido tumoral se recolectan a partir de los grupos de animales (un grupo por punto del tiempo, 3 animales por grupo) en los siguientes puntos del tiempo: 0.25 horas, 0.5 horas, 1 horas, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 24 horas, y 48 horas. La muestra del tejido tumoral se mezcla con regulador T-per (Pierce, Rockford, IL, Catálogo No. 78510), entonces inmediatamente se homogeneiza en el lisador de tejido (Qiagen, Catálogo No. 85210). El sobrenadante del Usado de tejido se recolecta, y se determina su concentración de proteína utilizando un ensayo BCA convencional (Pierce, Catálogo No. 1856210).

La concentración de la construcción de NB en suero y del lisado de tejido se determina en un ELISA, como se describe anteriormente. Los perfiles promedio de concentración en suero-tiempo se someten a un análisis farmacocinético de dos compartimientos utilizando el modelo 7 en el Software WinNonlin Professional Versión 5.1 (Pharsight Corporation, Mountain View California, EUA). Para cada construcción de NB, se ajusta el perfil de concentración-tiempo utilizando reponderación iterativa 1/y.y, en donde y es la concentración predicha. El tiempo de residencia promedio (MRT, Tabla 17) de las diferentes construcciones de NB estuvo en el intervalo de 2.6 a 13.5 horas. El volumen de distribución (Vss) de las diferentes construcciones de NB es de 2 a 35 veces mayor que el volumen de plasma de un ratón de 20 gramos (aproximadamente 1.5 mililitros), indicando una extensa distribución fuera del espacio vascular. El índice de liberación global de las diferentes construcciones de NB es cuando menos 5 veces menor que el índice de filtración glomerular de murino (aproximadamente 15 mililitros/hora), y por consiguiente, todas las construcciones tetravalentes son altamente efectivas para reducir de una manera significativa la filtración urinaria y la subsiguiente excreción al nivel del riñon.

Tabla 17 Parámetros farmacocinéticos de las construcciones de NB anti DR5 tetravalentes La actividad de Caspasa 3/7 en el lisado del tejido tumoral se evalúa mediante el ensayo Caspasa glo (Promega Catálogo No. G8092) de acuerdo con su manual del usuario, y se describe como anteriormente. Todos los tetrámeros tienen un perfil farmacodinámico similar (Figura 2).

Se desarrolla un modelo de respuesta indirecta para describir la potencia (EC50), la eficacia (Emax), y el transcurso del tiempo del efecto farmacológico de las diferentes construcciones de NB. El modelo describe un cambio en el nivel de caspasa celular que resulta de un mayor índice de producción en seguida del enlace del receptor de DR5 (es decir, estimulación de la acumulación de la caspasa celular). El índice de caspasa celular (Respuesta, R) se describe mediante la siguiente ecuación.

(Ecuación 1) en donde kentrada es el índice de síntesis de cero orden, R es el nivel de caspasa, Emax es la máxima estimulación, C es la concentración de la construcción de NB en el tumor, n es el factor de forma de respuesta, y ksai¡da es la constante de índice de eliminación de primer orden de caspasa.

Los perfiles de concentración de tumor-tiempo se ajustan primero a la función farmacocinética que es mínimamente necesaria para proporcionar una caracterización razonable de los datos de concentración-tiempo (modelo 3 o modelo 11 de dos compartimientos en el Software WinNonlin Versión 5.1). Entonces se utiliza la función farmacocinética obtenida para cada construcción de NB como la función de entrada para la ecuación 1. Los parámetros farmacodinámicos obtenidos se enlistan en la Tabla 18.

Tabla 18 Parámetros farmacocinéticos/farmacodinámicos (PK/PD) de una sola dosis de las construcciones de NB anti-DR5 tetravalentes 4.3 Prueba In vivo utilizando un modelo de xeno-injerto Los ratones hembras (nu/nu) atímicos exógamos (Harían Sprague Dawley, Indianápolis, IN) se implantan subcutáneamente en la región axilar (lateral) derecha con aproximadamente 1-2 x 106 células tumorales Colo205 suspendidas en solución de sal balanceada de Hanks al 100 por ciento (HBSS) en un volumen total de 100 mililitros. Los tumores se dejan crecer hasta 200 mm3 antes de iniciar la dosificación. Las construcciones de NB se formulan como una solución en suero regulado con fosfato, y se dosifican ya sea una vez por semana o bien tres veces por semana en lunes, miércoles y viernes. Ambos tratamientos se administran intravenosamente durante cuatro semanas. Los tumores se miden, y se registran los pesos corporales de los animales individuales una o dos veces por semana. Los experimentos se concluyen después de siete semanas desde la dosificación inicial. La actividad anti-tumoral se expresa como %T/C (comparando el cambio en el volumen del tumor para el grupo de tratamiento contra el grupo de control con vehículo). La regresión se calcula utilizando la fórmula: (1-T/T0) x 100%, en donde T es el volumen tumoral promedio para el grupo de tratamiento al final del experimento, y T0 es el volumen tumoral promedio al principio del experimento. El significado estadístico de los resultados se evalúa uniformemente utilizando la prueba ANOVA de una vía post-hoc análisis de Tukey. Como se muestra en la Figura 3, las construcciones de NB inducen la estasis o regresión del tumor en el modelo de tumor Colo205. Las formas pentaméricas de las construcciones de NB tienden hacia una eficacia más potente que las formas tetraméricas. 5. Ejemplo V 5.1 Humanización de 4E6 5.1.1.Caracterización de variante de humanización 4E6 La secuencia de proteína del 4E6 progenitor se alinea con las líneas germinales humanas VH3-23 (DP-47) y JH5 (Tabla 19). La diferencia de aminoácidos en relación con la secuencia de la línea germinal humana está representada mediante letras, y los aminoácidos idénticos mediante puntos. La diferencia de aminoácidos en las regiones de estructura que están subrayadas se seleccionan para la conversión en la contra-parte humana, mientras que los otros se dejan sin tocar.

Tabla 19 Alineación de 4E6 progenitor y variantes con eliminación genética de N-glicosilación humanizadas Kabat #: 1 10 20 30 40 50 60 1— - ----i ----i ----i ----i — -|--a—¦ ---1 VH3 -23/JH5 : EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA SWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYA 4E6 : ....v s..a.d r .. g . irvg . f .. t ... er . f . a .. nrnd. t .... 4E6-hu : r..g.irvg.f r . f .... nrnd . t ....

Kabat #: 60 70 80 90 100 110 I I I --abe I |abcdefghi | --- VH3-23/JH5: DSV GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK WGQGTLVTVSS 4E6 : a ...v.m. ,a..kp aglqynrsadrvpvgavy g 4E6-Hu : v p aglqynrAadrvpvgavy VH3-23/JH5 = SEQ ID NO: 90 4E6 = SEQ ID NO: 1 4E6-Hu = SEQ ID NO: 26 El material monovalente purificado se produce a partir de 4E6, 4E6-Hu y de la variante 4E6hx (en donde 4E6hx tiene las regiones FR humanizadas idénticas a 4E6-Hu, pero tiene la CDR3 de 4E6). Estas construcciones se caracterizan entonces en un número de ensayos para enlazarse sobre DR5 humano y de cinomolgo, es decir, enlace de saturación FACS (Kd aparente), y cinética SPR (véase la Tabla 20). En adición, las variantes se analizan en el ensayo de cambio térmico también (Tabla 20). 5 microlitros de cada construcción de NB anti-DR5 monovalente purificada (80 microgramos/mililitro) se incuban con 5 microlitros de la sonda fluorescente Sypro Orange (Invitrogen, Carlsbad, CA, catálogo # S6551) (concentración final 10x) en 10 microlitros de regulador (fosfato 100 mM, borato 100 mM, citrato 100 mM, NaCI 115 mM, regulados a diferentes pHs en el intervalo desde 3.5 hasta 9).

Las muestras entonces se calientan en una máquina LightCiclor 48011 (Roche, Basilea, Suiza), desde 37°C hasta 90°C a 4.4°C/segundo, después de lo cual, se enfrían hasta 37°C a 2.2°C/segundo. Después del despliegue inducido por calor, se exponen los parches hidrofóbicos de las proteínas, a los que se enlaza el Sypro Orange, dando como resultado un aumento en la intensidad de fluorescencia. El punto de inflexión del primer derivado de la curva de intensidad de fluorescencia sirve como una medida de la temperatura de fusión (Tm). Para mayores detalles, por favor véase Ericsson y colaboradores, 2006 (Annals of Biochemistry, 357: 289-298). Globalmente, la variante 4E6-hx exhibe afinidades similares al 4E6 progenitor. En adición, esta variante tiene un aumento del 7 por ciento en la Tm comparándose con el 4E6 progenitor.

Tabla 20A Variantes monovalentes de humanización de 4E6 y eliminación genética de N-glicosilación Tabla 20B Variantes monovalentes de humanización de 4E6 y eliminación genética de N-glicosilación 5.1.2. Variante de eliminación genética de N-glicosilación del 4E6 humanizado La expresión de 4E6-hx en P. pastoris, seguida por SDS-PAGE y Western anti-VHH (policlonal anti-Nanobody®), revela la presencia de dos productos (16kDa y 21kDa) comparándose con solamente un producto de 16kDa cuando E. coli es el huésped de expresión. El tratamiento con PNGasaF y el teñido con concanavalina revelan que el producto de 21kDa es la forma N-glicosilada del producto de 16kDa. La disociación de las fracciones de N-glicosilación a partir de las proteínas utilizando PNGasaF se hace de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA, catálogo # P0704S). La PNGasaF es una amidasa que se disocia entre los residuos más internos de GIcNAc y asparagina de los oligosacáridos superiores de mañosa, híbridos, y complejos a partir de las glicoproteínas N-enlazadas. La detección de la N-glicosilación de proteína se hace en un ensayo Western con Concanavalina A, una lectina que reconoce las glicoproteínas que contienen a-D-manosa, a-D-glucosa. Las proteínas transferidas se bloquean durante 2 horas con regulador de bloqueo (suero regulado con fosfato (PBS), Tween-20 al 0.05 por ciento, CaCI2 1 mM, MnCI2 1 mM), seguido por incubación durante la noche con 5 microgramos/mililitro de conjugado de Concanavalina A / biotina (Sigma, St. Louis MO, catálogo # C2272) a 4°C en regulador de bloqueo. La detección se hace utilizando una dilución de 1/2000 de conjugado de estravidina-HRP en regulador de bloqueo y DAB como sustrato (Sigma, St. Louis MO, catálogo # E2886 y D681 5). La banda de 36 kDa visible en el gel teñido con Coomassie es la enzima PNGasaF. El análisis fuera de índice sobre el DR5 humano reveló un aumento >8 veces para el material producido por P. pastoris contra el material producido por E. coli, sugiriendo que la N-glicosilación interfiere con el enlace de 4E6-hu al DR5.

Está presente un motivo de N-glicosilación potencial en el CDR3 de 4E6 y 4E6-hx (ami noácidos "n rs"- mostrados en neg rillas e itálicas en la Tabla 1 9) . La variante 4E6-H u (CD R3 con un residuo "A" reemplazado mostrado en letra mayúscula con negrillas - Tabla 1 9) se genera y se produce en E. coli, se purifica y se ensaya para enlazarse al D R5 humano y de cinomolgo utilizando el ensayo de enlace de saturación FACS y la cinética S P R (Tabla 20) . El 4E6-Hu tiene características de enlace iguales al D R5 tanto humano como de cinomolgo, comparándose con el 4E6-hx. Después de la expresión en P. pastoris, la variante 4E6-Hu proporciona solamente el producto de 1 6 kDa. Esto confi rma la eliminación genética funcional del motivo de glicosilación . 5. 1.3 Caracterización in vitro de 4E6-Hu El material tetravalente pu rificado se produce a partir de 4E6 de tipo silvestre y su variante humanizada 4E6-Hu . Entonces éstos se ensayan en los ensayos de sobrevivencia celular en Colo205 y J urkat (Tabla 21 ) . La potencia y eficacia de la variante humanizada es relativamente igual a la de la construcción progenitora 4E6.

Tabla 21 Potencia y eficacia in vitro de 4E6 de tipo silvestre y 4E6-Hu tetravalentes 5.2 Humanización de 11 H6 5.2.1.Caracterización de variante de humanización de 11H6 La secuencia de proteína de 11 H6 de tipo silvestre se alinea al a las líneas germinales VH3-23 humana (DP-47) y JH5 (Tabla 22). La diferencia de aminoácidos en relación con la secuencia de la línea germinal humana están representadas mediante letras, y los aminoácidos idénticos mediante puntos. La diferencia de aminoácidos en las regiones de estructura que están subrayadas se seleccionan para la conversión en la contra-parte humana, mientras que los otros se dejan sin tocar.

Tabla 22 Alineación del 11H6 progenitor y variante de humanización Kabat # 10 20 30 40 50 60 VH3-23/JH5 : EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS VRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYA 11H6 tfdkinn .g . y qrdl . aq . t-p 11H6- tfdkinn .g . y qrdl . aq . t-p Kabat # 60 70 80 90 100 110 I i . -abe I I abedef VH3-23/JH5 DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK WGQGTLVTVSS 11HS a .d.m !SP f .naeilkrayidvyvny g llH6-hu p naeilkrayidvyvny VH3-23/JH5 = SEQ ID NO: 90 11 H6 = SEQ ID NO: 5 11 H6-hu = SEQ ID NO: 30 Se produce el material monovalente purificado para 11H6 y 11H6-Hu, el cual entonces se caracteriza en un número de ensayos para enlazarse sobre el DR5 humano y de cinomolgo, es decir, enlace de saturación FACS (Kd aparente), y cinética SPR (Tabla 23). En adición, las variantes se analizan en el ensayo de cambio térmico (Tabla 23). La variante 11H6-hu retiene las características de enlace del 1 1 H6 progenitor. También tiene un aumento del 8 por ciento en la temperatura de fusión , comparándose con el 1 1 H6 progenitor. La Tm se determi na a un pH de 7.

Tabla 23 Caracterización de 1 1 H6 progenitor monovalente y variantes de h uman ización 5.2.2 Caracterización in vitro de 1 1 H6-Hu El material tetravalente purificado se produce a partir del clon progenitor 1 1 H6 y su variante humanizada 1 1 H6-Hu. Éstos entonces se ensayan en los ensayos de sobrevivencia celular contra Colo205 y Ju rkat (Tabla 24). La potencia y la eficacia de la variante humanizada es igual a la del progenitor. La eficacia representa el porcentaje de las células muertas vistas.

Tabla 24 Potencia y eficacia in vitro de 11H6 de tipo silvestre y 11H6- humano tetravalentes 5.3 Caracterización in vitro de tetrámeros v pentámeros de 11H6-Hu y 4E6-Hu Las células se aplican a una placa de 96 pozos (Costar # 3903 de fondo blanco transparente) con la intención de alcanzar una confluencia de aproximadamente el 75 por ciento. Las células se aplican en un intervalo de 7500 a 15000 células/pozo (dependiendo de la línea celular) en 100 microlitros del medio el día anterior al ensayo. El día del ensayo, se remueve el medio, y se agrega medio fresco. Entonces se agrega el agente NB diluido en serie (las concentraciones iniciales pueden variar dependiendo de la línea celular), usualmente en una concentración inicial de entre 1 y 20 nM, el cual entonces se diluye de 3 a 4 veces en 10 diluciones en general para un volumen final de 150 microlitros. Las células se incuban entonces durante 24 a 72 horas a 37°C en la incubadora suministrada con CQ2. Después de la incubación, las células aplicadas y los reactivos Cell Titer Glo (Promega #G7571) se llevan hasta la temperatura ambiente (en aproximadamente 30 minutos). Entonces se agregan a cada pozo 50 microlitros del reactivo Cell Titer Glo reconstituido. La placa se agita durante 2 a 3 minutos, y entonces se deja equilibrar en la oscuridad durante 10 minutos antes de leer la luminiscencia en el Spectromax.

Los ejemplos específicos se proporcionan en la Tabla 25.

Tabla 25 Caracterización in vitro de tetrámeros y pentámeros de 11H6-hu y 4E6-hu 6. Ejemplo VI 6.1 Ensayo ex-v¡vo para pacientes con leucemia Se proporciona un ensayo ex-vivo para los pacientes con leucemia, como un método para predecir cuáles pacientes responderán al tratamiento con una construcción de NB. Se obtiene una muestra de sangre a partir de un paciente antes del tratamiento, y se utiliza para ensayar la respuesta potencial al tratamiento. Se utilizan el grado y la dirección de respuesta como criterios para el tratamiento.

Se cree que la leucemia de células-T (T-ALL) es en general sensible a la estimulación del DR5. Las muestras de T-ALL se tratan con las construcciones de NB de la invención , y se evalúan para determinar si el número de células de leucemia disminuye (o sufren apoptosis) con el tratamiento. El intervalo del fármaco del ensayo es de aproximadamente 20 n M a aproximadamente 0.0001 nM para los tratamientos ex-vivo con las construcciones de N B de la invención .

También se pueden obtener muestras de células a parti r de los pacientes diagnosticados con otras indicaciones , y se prueban de una manera simi lar. 6.2. Ensayo general de sensibi l idad ex-vivo: Las muestras de tumores se prueban afuera de un paciente en un establecimiento de laboratorio, como un método para ayudar a predeci r cuáles pacientes pueden responder a uno o más agentes N B.

El material tumoral del paciente primario a parti r de la sangre o del tejido , se trata de una manera similar a los ensayos anteriores , dependiendo del tipo de tumor. El tumor se remueve por medio de recolección de sangre total o de biopsia de tejido, y se aplica en una placa de cultivo de tej ido apropiada durante 0 a 24 horas . La muestra del tumor se trata entonces con concentraciones variables de agentes N B sobre una serie de di lución (por ejemplo, la concentración inicial pod ría ser de 20 nM dil uido de 3 a 4 veces en 1 0 diluciones) . La placa de cultivo de tejido se trata entonces con los agentes NB durante 24 a 72 horas o durante varias horas (de 1 a 24) a 37°C en la incubadora suministrada con C02. Después de la incubación, la muestra emplacada se analiza empleando un método para detectar la respuesta de la muestra al tratamiento. Tal como en los ejemplos anteriores, se proporcionan: Cell Titer Glo (Promega #G7571) para la viabilidad celular, o activación de Caspasa 3/7, o teñido con AnexinaV, o conteo de células, o análisis FACS, u otro método para determinar el crecimiento, muerte, o respuesta al tratamiento con el agente NB.

Ya sea una línea celular sensible al agente NB (por ejemplo, Jurkat) o bien línea celular insensible al agente NB (BE13), o PBMC (células mononucleares de sangre periférica, por ejemplo, frescas a partir de la sangre de un voluntario sano), o la combinación del cultivo celular (línea celular) salpicada en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), se tratan con diferentes concentraciones de agentes NB durante 3.5 horas a 37°C en la incubadora suministrada con C02, después de lo cual, se evalúa la activación de Caspasa 3/7 (Promega #G7790) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. 7. Ejemplo VII 7.1 Análisis de la senda de RAF-MEK-ERK y la actividad del DR5 El Receptor de Muerte 5 (DR5) es de particular interés en el descubrimiento de fármacos para cáncer, debido a que su activación selectiva induce la apoptosis en las células de cáncer mientras que pasa por alto muchas de las células normales. La construcción agonista especifica del DR5 puede evitar las limitaciones del ligando, es decir, el enlace a Receptores de Señuelo tales como DcR1, DcR2 y OPG. Un obstáculo mayor para los desarrollos clínicos de anticuerpos agonistas de DR5 ha sido la dificultad para identificar los biomarcadores predictivos de eficacia en los subgrupos de pacientes. El análisis de datos a partir de 200 líneas celulares de cáncer, indica que las mutaciones genéticas no obvias, incluyendo aquéllas en RAS y RAF, son correlativas a la sensibilidad a LBY135, el anticuerpo agonista de DR5 (Novartis AG).

Se utiliza una estrategia para rastrear los shARNs reservados basándose en la sensibilización/rescate del DR5 para identificar genes o sendas que modifiquen la apoptosis mediada por el DR5 después de la perturbación genética. Los rastreos se conducen en siete líneas celulares de cáncer a través de varios linajes, y se utiliza secuenciación a profundidad basada en Solexa de las horquillas integradas para desconvolucionar las composiciones de shARN.

Se identifica un conjunto de sensibilizantes y rescatadores como los componentes de la senda conocidos, de tal manera que los shARNs que se dirigen a caspasa 8, caspasa 3 y DR5 por sí mismos, son los rescatadores superiores, y aquéllos que se dirigen a BCLxl son los sensibilizantes superiores, indicando la robustez de los rastreos. Es interesante que, en adición a estos conjuntos de genes comunes, la inhibición de BRAF-MEK-ERK exhibe la oposición de fenotipos dependientes del contexto celular sobre la apoptosis mediada por DR5. De una manera específica, la inhibición de la senda de BRAF-MEK-ERK sensibiliza las células Miapaca2 a la apoptosis mediada por DR5, pero rescata las células Colo205 de la misma.

Estos fenotipos opuestos se correlacionan bien con las cinética diferente de la actividad de caspasa 8 y caspasa 9, pero parecen ser independientes del nivel de expresión de DR5. La disección de la senda revela que cFLIP y clAP1, dos de los inhibidores de apoptosis endógenos, median la interferencia entre la apoptosis mediada por DR5 y la senda de BRAF-MEK-ERK. En las células Miapaca2, la combinación de U0126 (inhibidor de MEK), y el anticuerpo de DR5, acelera la degradación de las proteínas cFLIP y clAP1, mientras que, en colo205, se sobre-regulan los mARNs tanto de cFLIP como de clAP1. Consistentemente, la inhibición de cFLIP o clAP1 mediante los shARNs o la inhibición química, eliminan el fenotipo de rescate en las células Colo205, y además sensibiliza a Miapaca2 a la apoptosis mediada por DR5.

El análisis de microarreglo de las células Miapaca2 y Colo205 tratadas con inhibidor de MEK revela genes que se sub-regulan en ambas líneas celulares, incluyendo DUSP6, ETV5 y ERG1, las cuales son los objetivos canónicos corriente abajo de ERK. 7.2 Bcl-xL. clAP1 Y BRAF-MEK-ERK como reguladores dependientes del contexto celular de la apoptosis mediada por DR5 Muchas proteínas funcionan como reguladores dependientes del contexto celular, si se define ampliamente. Por ejemplo, ABT737, un inhibidor de Bcl-xL, mostró un intervalo de fenotipos sobre la apoptosis inducida por LBY135. Entre 35 líneas celulares a examinar, sensibilizó fuertemente el efecto de LBY135 sobre 7 líneas celulares, sensibilizó levemente 9 líneas celulares, pero no tuvo efecto alguno sobre las otras 19 líneas celulares. Una de las razones plausibles es que están presentes sendas paralelas en algunas líneas celulares que compensan la inhibición de Bcl-xL. Por ejemplo, el análisis de nuestros rastreos revela que los shARNs contra Bcl-xL sensibilizan a todas las líneas celulares, excepto por las células Miapaca2, las cuales son realmente sensibilizadas por los shARNs que se dirigen a MCL1. Esta clase de reguladores no impediría el desarrollo de la terapia de combinación. En este aspecto, un inhibidor para clAP1 es un regulador similar que sensibiliza al anticuerpo agonista de DR5 en un gran número de líneas celulares (Tabla 26, más no se muestran los datos). Es interesante que clAP1, y no x-IAP, está específicamente involucrado en la interferencia entre DR5 y la senda de BRAF-MEK-ERK.

La senda de BRAF-MEK-ERK cae en una categoría para los reguladores dependientes del contexto celular. Sus efectos dependientes del contexto celular está en el intervalo desde como sensibilizante hasta como antagonista. Estas diferencias dramáticas proporcionan una oportunidad para obtener una visualización de las redes de señalización que regulan la apoptosis mediada por DR5. Sin embargo, se debería identificar el biomarcador, o esa combinación será difícil de desarrollar, inclusive cuando los efectos sensibilizantes sean fuertes y deseables. Realmente, para las líneas celulares resistentes a DR5, tales como ES2 y A375, los inhibidores de BRAF/MEK son los únicos componentes de la siguiente tabla que muestran fuertes efectos sensibilizantes, mientras que los inhibidores para Bcl-xL no lo hacen. La sub-regulación de clAP1 está asociada con los efectos sensibilizantes en múltiples líneas celulares, sugiriéndolo como un biomarcador de PD en esta estrategia de combinación. Nuestros resultados sugieren que una solución podría ser una combinación triple del anticuerpo agonista de DR5 con los inhibidores para c1 y BRAF-MEK.

La Tabla 26 muestra el efecto sinérgico entre el anticuerpo agonista de DR5 y los inhibidores para clAP1 o Bcl-xL. Treinta y cinco líneas celulares se tratan con LBY135 (anticuerpo agonista de DR5, Novartis AG) solo o en combinación con LBW242 (inhibidor de clAP1) o ABT737 (inhibidor de Bcl-xL). Las células se marcan como insensibles cuando la viabilidad es mayor del 70 por ciento a 5 nM de LBY135. Para los efectos de la combinación, está etiquetado como '+++' cuando la combinación reduce la viabilidad celular por más del 30 por ciento; y está etiquetado como '++' cuando la combinación reduce la viabilidad celular por entre el 10 y el 30 por ciento. Está etiquetado como "ninguno" cuando no se observa sinergismo con el tratamiento de combinación.

Tabla 26 Efecto sinérgico entre el agonista de DR5 y los inhibidores de clAP1 o Bcl-xL. ++: sensibilización; +++: fuerte sensibilización; En adición, también se identifican 180 genes como diferencialmente regulados por la inhibición de MEK entre las dos líneas celulares. Se predice un conjunto de factores de transcripción que podrían ser responsables de la regulación de estos genes, mediante el análisis de enriquecimiento de conjunto de genes (GSEA), seguido por el examen individual utilizando el shARN para confirmar su involucramiento. Entre muchos factores de transcripción, se encuentra que solamente FOX03 y SP1 están directamente involucrados en el cruce entre las dos sendas, como se muestra por su función en la regulación de cFLIP o clAP1 al nivel del ARNm en las células Colo205. Sin embargo, en las células Miapcaca2, cFLIP o clAP1 son regulados al nivel de la proteína en el proteasoma y de maneras dependientes de la caspasa 8. Finalmente, los niveles reducidos de proteína clAP1 están asociados con los efectos sensibilizantes en las líneas celulares adicionales. Estos resultados identifican múltiples estrategias de combinación potentes para el anticuerpo LBY135 agonista del DR5, y revelan una regulación dependiente del contexto celular de la apoptosis mediada por el DR5 mediante la senda de BRAF-MEK-ERK.

Con el fin de validar los resultados del shARN, se utilizan inhibidores químicos específicos para BRAF y MEK con el objeto de alterar la senda de BRAF-MEK-ERK. Es decir, RAF265 y U0126 son inhibidores de BRAF y MEK, respectivamente. La inhibición de la senda de BRAF-MEK-ERK con cualquier compuesto, sensibilizó a las células Miapaca2 al tratamiento con LBY135, pero rescató a las células Colo205 del mismo. Otros inhibidores específicos de BRAF y MEK dieron fenotipos similares.

Las células Miapaca2 tienen una mutación de KRAS activadora (G12C), mientras que las células Colo205 tienen una mutación de BRAF activa (V600E). De modo que es posible que estas mutaciones sean responsables de los diferentes fenotipos. Sin embargo, H2122, que tiene la misma mutación de KRAS que las células Miapaca2, no mostró ningún efecto sensibilizante como en M¡apaca2. Adicionalmente, después del rastreo de siete líneas celulares adicionales, todas con las mutaciones de BRAF, encontramos que los inhibidores de MEK no mostraron efecto alguno en algunas líneas celulares, mientras que las otras se sensibilizaron como las células Miapaca2. Tomados juntos, nuestros resultados indican que las mutaciones de BRAF o de KRAS no explican las funciones dependientes del contexto celular de la senda de BRAF-MEK-ERK sobre la apoptosis mediada por DR5.

Globalmente, la inhibición de BRAF-MEK-ERK es una espada de dos filos - puede conducir a ya sea un efecto sensibilizante o bien antagonizante cuando se utiliza en combinación con el agonista de DR5. Los inhibidores de clAP1 o XIAP, de Bcl-xL o de cFLIP en combinación con al agonista de DR5, son suficientes para la sensibilización. Sin embargo, la combinación de un inhibidor de BRAF y cualquiera de un inhibidor de MEK o ERK, parece antagonizar el efecto del tratamiento previo con LBY135. Aunque esto provoca preocupaciones para la terapia de combinación que se dirija hacia ambas sendas en la clínica, los datos sugieren que una triple combinación con inhibidores de clAP podría ser una solución para el antagonismo. Es decir, una triple combinación del agonista de DR5, un inhibidor de clAP (ya sea para clAP1 o para XIAP), y la elección de un inhibidor de MEK o de un inhibidor de BRAF, también debería dar como resultado la inducción sinérgica de la muerte celular. 7.3 Protocolos Experimentales Para el rastreo de la biblioteca de shARN, las células objetivo se infectan con una biblioteca de shARN reservada que se dirige al shARN de quinoma y apotoma, seleccionada con purimicina, y entonces se trata con LBY135 reticulado o con un control de suero regulado con fosfato (PBS). Las muestras recolectadas en el Día 0, 7 y 14 se someten a extracción del ADN, amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los shARNs integrados, y purificación, seguida por secuenciación Solexa. Las comparaciones entre los tratamientos en los mismos puntos del tiempo revelan los shARNs que modulan la apoptosis mediada por DR5. Las comparaciones entre los puntos del tiempo en los controles de suero regulado con fosfato (PBS) revelan efectos de los shARNs sobre el crecimiento celular. Entonces estos impactos se someten a validación individual.

Para analizar la eliminación genética de las células Miapaca2 y Colo205 sensibilizadas a LIMK2 a la apoptosis inducida por LBY135, las células se infectan con shARNs contra LIMK2 o contra las horquillas de control, se seleccionan con puromicina durante 5 días, entonces se siembran en placas de 96 pozos para los tratamientos con diluciones en serie de LBY135 reticulado al día siguiente durante 36 horas. Las viabilidades celulares se miden mediante el reactivo Cell-Titer-Glo, y se normalizan con las muestras no tratadas con LBY135. El índice de sobrevivencia celular se gráfica como una función de las concentraciones para generar una curva de respuesta a la dosis. Los datos incluyen el promedio ± SD de los triplicados de un experimento representativo de cuando menos dos experimentos independientes.

Se utilizan inhibidores químicos de EK y BRAF para validar el fenotipo de los shARNs en el rastreo. Las células Miapaca2 y Colo205 se incuban previamente con sulfóxido de dimetilo, inhibidor de MEK, U0126 (10 µ?) o inhibidor de BRAF, RAF265 (1 µ?) durante la noche, entonces se tratan con diluciones en serie de LBY135 reticulado durante 36 horas. Las viabilidades celulares se miden mediante el reactivo Cell-Titer-Glo, y se normalizan con las muestras no tratadas con LBY135. El índice de sobrevivencia celular se gráfica como una función de las concentraciones para generar una curva de respuesta a la dosis. Los datos son el promedio ± SD de los triplicados de un experimento representativo de cuando menos dos experimentos independientes.

Con el objeto de mostrar que la activación de ERK mediante DR5 sigue intacta en ambas líneas celulares, las células Miapaca2 y Colo205 se incuban previamente con sulfóxido de dimetilo, o con U0126 (10 µ?) durante la noche, se tratan con LBY135 reticulado (0.25 nM), y se recolectan a las 0 horas, 1 hora, 3 horas, y 6 horas para el análisis Western Blot para ERK y p-ERK. La inhibición de MEK disminuye las actividades de caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-3/7 inducidas por DR5 en las células Colo205, mientras que las aumenta en las células Miapaca2. Las células Colo205 y Miapaca2 se tratan con LBY-135 reticulado a 0 nM, 0.25 nM o 1 nM durante 7 horas. Las células se lisan para el análisis de las actividades de caspasa8, caspasa9 y caspasa3/7. Las actividades de Caspasa se grafican como una función de las concentraciones de LBY135. Los datos son del experimento representativo de cuando menos dos experimentos independientes.

Se utiliza el análisis de microarreglo para revelar los genes con una correlación significativa entre las células Colo205 y Miapaca2 entre los genes regulados por MEK. Las células Colo205 y Miapaca2 se incuban previamente con sulfóxido de dimetilo o con U0126 durante la noche en cinco experimentos independientes. Se extrae el ARN para el análisis del microarreglo. Se gráfica el nivel de expresión relativa para cada gen en las células tratadas con U0126 contra las células tratadas con sulfóxido de dimetilo, como una función de las células Colo205 sobre el eje-Y y de las células Miapaca2 sobre el eje-X. 7.4 Modelo de procesamiento para el cruce entre DR5 v RAF-MEK-ERK Un modelo de procesamiento propone que el tratamiento con el agonista de DR5 activa tanto la caspasa-8 como la ERK. Los cruces entre estas dos sendas son mediados por cFLIP y clAP1, los cuales regulan negativamente la activación de caspasa-8 y caspasa-9, que a su vez controlan la apoptosis inducida por el agonista de DR5. cFLIP y clAP1 se regulan en diferentes niveles, de una manera que es dependiente del contexto celular. En las células Colo205, se regulan en sus niveles de ARN a través de los factores de transcripción FOX03 y SP1, que ellos mismos son regulados por la senda de BRAF-MEK-ERK. En las células iapaca2, cFLIP y clAP1 son regulados por la senda de BRAF-MEK-ERK al nivel de la proteína en el proteasoma y de una manera dependiente de la caspasa 8. 8. Ejemplo VIII 8.1 Ensayo Biacore de Ejemplo Un ensayo adecuado para determinar si una secuencia de aminoácidos u otro agente de enlace bloquea cruzadamente o es capaz de bloquear cruzadamente, es un ensayo Biacore. Se apreciará que el ensayo se puede utilizar con cualquiera de las secuencias de aminoácidos (u otros agentes de enlace, tales como los polipéptidos de la invención) descritos en la presente.

La máquina Biacore (por ejemplo la Biacore 3000) se opera en línea con las recomendaciones del fabricante. En un ensayo de bloqueo cruzado de ejemplo, la proteína objetivo se acopla a un chip CM5 Biacore utilizando la química convencional de acoplamiento de amina para generar una superficie que se recubre con el objetivo. T ípicamente se acoplarían de 200 a 800 u nidades de resonancia del objetivo al chip (es decir, una cantidad que da niveles fácilmente mensu rables de enlace , pero que es puede ser fácil mente saturada por las concentraciones del reactivo de prueba que se esté utilizando) .

Dos secuencias de aminoácidos de prueba (denomi nadas como A* y B*) que se van a evaluar con el fin de determinar su capacidad para tener bloqueo cruzado , se mezclan una con la otra a una proporción molar de los sitios de enlace en un regulador adecuado para crear la mezcla de prueba .. Cuando se calculan las concentraciones sobre una base del sitio de enlace, se asume que el peso molecular de una secuencia de aminoácidos es el peso molecular total de la secuencia de aminoácidos dividido entre el número de sitios de enlace objetivo sobre esa secuencia de aminoácidos. La concentración de cada secuencia de ami noácidos en la mezcla de prueba debe ser suficientemente alta para satu rar fácilmente los sitios de enlace para esa secuencia de aminoácidos sobre las moléculas objetivo capturadas en el chip Biacore . Las secuencias de aminoácidos en la mezcla están en la misma concentración molar (sobre una base de enlace), y esa concentración típicamente sería de entre 1 .00 y 1 .5 micromolar (sobre una base del sitio de enlace) . También se preparan soluciones separadas que contienen A* sola y B* sola. A* y B* en estas sol uciones están en el mismo regulador y a la misma concentración que la mezcla de prueba.

La mezcla de prueba se pasa sobre el chip Biacore recubierto con el objetivo, y se registra la cantidad total de enlace . El chip se trata entonces de tal manera que se remueven las secuencias de aminoácidos enlazadas sin dañar el objetivo enlazado al chip . Típicamente, esto se hace mediante el tratamiento del chip con HCI 30 mM durante 60 segundos. La solución de A* sola se pasa entonces sobre la superficie recubierta con el objetivo, y se registra la cantidad de enlace. El chip se trata nuevamente para remover todas las secuencias de aminoácidos enlazadas si n dañar el objetivo enlazado al chip . La solución de B* sola se pasa entonces sobre la superficie recubierta con el objetivo, y se registra la cantidad de enlace.

En seguida se calcula el máximo enlace teórico de la mezcla de A* y B* , y es la suma del enlace de cada secuencia de aminoácidos cuando se pasa sobre la superficie objetivo sola. Si el enlace registrado real de la mezcla es menor que este máximo teórico, entonces las dos secuencias de aminoácidos se bloquean cruzadamente una a la otra. Por consiguiente , en general , una secuencia de aminoácidos u otro agente de enlace de bloqueo cruzado de acuerdo con la invención , es uno que se enlazará al objetivo en el ensayo de bloqueo cruzado Biacore anterior, de tal manera que, du rante el ensayo y en la presencia de una segunda secuencia de ami noácidos o de otro agente de enlace de la invención , el enlace registrado es de entre el 80 por ciento y el 0.1 por ciento (por ejemplo, del 80 por ciento al 4 por ciento) del máximo enlace teórico, específicamente de entre el 75 por ciento y el 0.1 por ciento (por ejemplo, del 75 por ciento al 4 por ciento) del máxi mo enlace teórico , y más específicamente de entre el 70 por ciento y el 0.1 por ciento (por ejemplo, del 70 por ciento al 4 por ciento) del máxi mo enlace teórico (como se definió justo en lo anterior) de las dos secuencias de ami noácidos o los agentes de enlace en combi nación .

El ensayo Biacore descrito anteriormente es un ensayo primario uti lizado para determinar si las secuencias de aminoácidos u otros agentes de enlace se bloq uean cruzadamente unos a otros de acuerdo con la invención . En raras ocasiones, algunas secuencias de aminoácidos particulares u otros agentes de enlace pueden no enlazarse al objetivo acoplado por medio de la qu ímica de amina a un chip CM5 Biacore (esto ocurre usualmente cuando el sitio de enlace relevante sobre el objetivo es enmascarado o destruido por el acoplamiento al chi p) . En tales casos , el bloqueo cruzado se puede dete rminar utilizando una versión marcada del objetivo , por ejemplo, un sistema marcado con His N-terminal ( R & D Systems, Minneapol is , MN , EUA; 2005 cat # 1 406-ST-025) . En este formato particular, se podría acoplar una secuencia de aminoácidos anti-His al chip Biacore, y entonces el objetivo marcado con His se pasaría sobre la superficie del chip, y sería capturado por la secuencia de aminoácidos anti-His. El análisis de bloqueo cruzado se llevaría a cabo esencialmente como se describe anteriormente, excepto que después de cada ciclo de regeneración del chip, se cargaría un nuevo objetivo marcado con His de regreso sobre la superficie recubierta con la secuencia de aminoácidos anti-His. En adición al ejemplo dado utilizando el DR5 marcado con His N-terminal, se podría utilizar de una manera alternativa el objetivo marcado con His C-terminal. Adicionalmente, se podrían utilizar otras diferentes marcas y combinaciones de enlace de marcas que se conocen en la técnica, para este análisis de bloqueo cruzado (por ejemplo, marca HA con anticuerpos anti-HA; marca FLAG con anticuerpos anti-FLAG; marca de biotina con estreptavidina). 9. Ejemplo IX 9.2 Ensayo ELISA de ejemplo Lo siguiente describe en términos generales un ensayo ELISA para determinar si una secuencia de aminoácidos o otro agente de enlace dirigido contra un objetivo bloquea cruzadamente o es capaz de bloquear cruzadamente como se define en la presente. Este ensayo se puede utilizar con cualquiera de las secuencias de aminoácidos (u otros agentes de enlace, tales como los polipéptidos de la invención) de la presente.

El principio general del ensayo es tener una secuencia de aminoácidos o agente de enlace que se dirija contra el objetivo recubierto sobre los pozos de una placa ELISA. Se agrega una cantidad excesiva de una segunda secuencia de aminoácidos contra el objetivo, que se potencialmente de bloqueo cruzado, en solución (es decir, no enlazada a la placa ELISA). Entonces se agrega a los pozos una cantidad limitada del objetivo. La secuencia de aminoácidos recubierta y la secuencia de ami noácidos en solución compiten para enlazarse al número l i mitado de moléculas objetivo. La placa se lava para remover el exceso de objetivo que no se haya enlazado con la secuencia de aminoácidos recubierta, y también para remover la segunda secuencia de aminoácidos en fase de solución , así como cualesquiera complejos formados entre la segunda secuencia de ami noácidos en fase de solución y el objetivo. Entonces se mide la cantidad de objetivo enlazado utilizando un reactivo que sea apropiado para detectar el objetivo. Una secuencia de ami noácidos en solución que sea capaz de bloquear cruzadamente la secuencia de aminoácidos recubierta, será capaz de provocar u na dismi nución en el número de moléculas objetivo con las que se puede enlazar la secuencia de aminoácidos recubierta, en relación con el n úmero de moléculas objetivo con las que se puede enlazar la secuencia de aminoácidos recubierta en ausencia de la segunda secuencia de aminoácidos en fase de solución .

En el caso en donde la pri mera secuencia de aminoácidos, por ejemplo, u na Ab-X , se seleccione como la secuencia de aminoácidos inmovil izada, se recubre sobre los pozos de la placa E LI SA, después de lo cual , las placas se bloquean con una solución de bloqueo adecuada, para minimizar un enlace no espec ífico de los reactivos que se agreguen subsiguientemente. Entonces se agrega una cantidad excesiva de la segunda secuencia de aminoácidos, es decir, Ab-Y , a la placa ELI SA, de tal manera que los moles de sitios de enlace de Ab-Y [objetivo] por pozo sean cuando menos 1 0 veces más altos que los moles de sitios de enlace de Ab-X [objetivo] que se utilicen , por pozo, para el recubrimiento de la placa ELISA. Entonces se agrega el [objetivo] de tal manera que los moles de [objetivo] agregados por pozo sean cuando menos 25 veces menores que los moles de sitios de enlace de Ab-X [objetivo] que se utilicen para el recubrimiento de cada pozo. En seguida de un período de incubación adecuado , se lava la placa E LI SA, y se agrega un reactivo para detectar el objetivo, con el fin de medir la cantidad de objetivo específicamente enlazado por la secuencia de aminoácidos anti-[objetivo] recubierta (en este caso Ab-X) .

La señal del fondo para el ensayo se defi ne como la señal obtenida en los pozos con la secuencia de aminoácidos recubierta (en este caso Ab-X) , la segunda secuencia de aminoácidos en fase de sol ución (en este caso Ab-Y) , el regulador [objetivo] solamente (es decir, sin objetivo) , y los reactivos de detección de objetivo. La señal de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en los pozos con la secuencia de aminoácidos recubierta (en este caso Ab-X) , el regulador de la segunda secuencia de aminoácidos en fase de sol ución solamente (es deci r, si n la segunda secuencia de ami noácidos en fase de solución) , el objetivo, y los reactivos de detección de objetivo. El ensayo ELI SA se puede ejecutar de una manera tal como para hacer que la señal de control positivo sea cuando menos seis veces la señal del fondo.

Para evitar cualesquiera artificios (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para el [objetivo]) resultantes de la elección de cuál secuencia de aminoácidos utilizar como la secuencia de aminoácidos de recubrimiento y cuál utilizar como la segunda secuencia de aminoácidos (competidora), el ensayo de bloqueo cruzado se puede ejecutar en dos formatos: (1) el formato 1 es en donde Ab-X es la secuencia de aminoácidos que se recubre sobre la placa ELISA, y Ab-Y es la secuencia de aminoácidos competidora que está en solución, y (2) el formato 2 es en donde Ab-Y es la secuencia de aminoácidos que se recubre sobre la placa ELISA, y Ab-X es la secuencia dé aminoácidos competidora que está en solución. Ab-X y Ab-Y se definen como de bloqueo cruzado si, ya sea en el formato 1 o en el formato 2, la secuencia de aminoácidos anti-objetivo en fase de solución es capaz de provocar una reducción de entre el 60 por ciento y el 100 por ciento, específicamente de entre el 70 por ciento y el 100 por ciento, y más específicamente de entre el 80 por ciento y el 100 por ciento, de la señal de detección de objetivo {es decir, la cantidad de objetivo enlazado por la secuencia de aminoácidos recubierta), comparándose con la señal de detección de objetivo obtenida en ausencia de la secuencia de aminoácidos anti-objetivo en fase de solución (es decir, los pozos de control positivo). 10. Ejemplo X 10.1 Experimento de agotamiento de macrófaqos Todos los anticuerpos anti-DR5 en desarrollo clínico hasta la fecha requieren de reticulación para lograr una potencia óptima in vitro e in vivo. Se cree que esta reticulación in vivo es mediada por medio del enlace de la porción Fe del anticuerpo anti-DR5 con las células inmunes que expresan el receptor de Fe. Con el fin de investigar los efectos de la reticulación in vivo del anticuerpo anti-DR5 LCR211, comparándose con una construcción de NB, que se espera que no requiera de esta reticulación, se compara la actividad del lgG1 anticuerpo anti-DR5 de ratón LCR211 con el 11 H6 tetra bajo condiciones de agotamiento de macrófagos asociados con el tumor (TA ) en el modelo de xeno-injerto de MiaPaCa-2 en los ratones hembras NOD/LtSz-sc/'d IL2R gamma"3"3 (ratón NSG). Los ratones NSG (NOD-SCID gamma) son deficientes en células-T, en células-B, y tienen poca o ninguna actividad de citotoxicidad de células NK causada por la señalización alterada de la citoquina, como un resultado de la supresión de la cadena gamma de IL-2R (Shultz, J. of Immunology 2005). El agotamiento de los macrófagos asociados con el tumor (TAMs) se lleva a cabo utilizando una molécula pequeña que inhibe la señalización a través del receptor de CSF-1. Tres dosis a 200 miligramos/kilogramo una vez al día, agotan hasta el 80 por ciento de los macrófagos, como se muestra anteriormente. La dosificación diaria se continúa a través de todo el estudio.

Las células MiaPaCa se cosechan en el crecimiento exponencial. Cinco millones de células mezcladas a 50:50 con Matrigel se implantan subcutáneamente en el flanco derecho superior de los ratones sin pelo. Para el implante de las células, los ratones se anestesian con un flujo continuo del 2 al 4 por ciento de una mezcla de isoflurano/oxígeno, utilizando el centro de anestesia de múltiples cámaras integrado (IMCAC) y la cámara de inducción (Vetequip. Inc., Pleasanton, CA). La velocidad de absorción del tumor es >90 por ciento, y los tumores alcanzan de aproximadamente 150 a 350 mm3 alrededor de 14 días después de la implantación de las células. Los animales se seleccionan aleatoriamente de acuerdo con el volumen del tumor, de tal manera que el volumen tumoral promedio y el intervalo son estadísticamente similares entre los grupos de tratamiento (como se determina mediante una prueba-t de Student). Los tumores se miden con calibres digitales dos veces por semana al principio de la dosificación. Los volúmenes tumorales se calculan utilizando la fórmula elipsoidal: (longitud x anchura2)/2. LCR211 se dosifica a 10 miligramos/kilogramo 3 veces por semana (3qw) intravenosamente, y 11 H6 tetra se dosifica a 10 miligramos/kilogramo y a 40 miligramos/kilogramo por semana (qw) intravenosamente, con o sin el inhibidor de CSF1-R (CSF-1RÍ) a 250 miligramos/kilogramo al día (qd) oralmente.

Los valores del porcentaje de tratamiento/control (T/C) se calculan utilizando la siguiente fórmula: % T/C = 100 x ??/?? si ?? >0 % Regresión = 100 x AT/T¡n¡c¡ai si ?? <0 en donde: T = volumen tumoral promedio del grupo tratado con fármaco en el día final del estudio; ?? = volumen tumoral promedio del grupo tratado con fármaco en el día final del estudio - volumen tumoral promedio del grupo tratado con fármaco en el día inicial de la dosificación; iniciai = volumen tumoral promedio del grupo tratado con fármaco en el día inicial de la dosificación; C = volumen tumoral promedio del grupo de control en el día final del estudio; y AC = volumen tumoral promedio del grupo de control en el día final del estudio - volumen tumoral promedio del grupo de control en el día inicial de la dosificación.

% T/C se hacen cálculos al final del estudio.

Como se ve en la Tabla 27 y en las Figuras 4A y 4B, 11H6 tetra mantiene una potente actividad de un solo agente en el xeno-injerto de MiaPaCa-2 bajo condiciones de agotamiento de TAM en el fondo del ratón NSG, mientras que, bajo las mismas condiciones, el anticuerpo de murino anti-DR5, LCR211 pierde eficacia.

Tabla 27 Sumario de la eficacia de 11H6 bajo condiciones de agotamiento de TAM 10.2 Actividad anti-tumoral del agente DR5 en el modelo de tumor derivado del paciente insensible a LCR211 TPAN1-IFA, un tumor pancreático derivado del paciente (Xentech), se implanta subcutáneamente (se) en (80) ratones sin pelo hembras (Harían, aproximadamente 8 semanas de edad en el implante). Los animales se seleccionan aleatoriamente al principio del tratamiento en grupos de nueve. El volumen tumoral inicial es de 99 mm3 (intervalo de 63 a 196 mm3). Los grupos de tratamiento son: (1) Vehículo, una vez a la semana (qw), intravenosamente (i.v.), (2) LCR211, 10 miligramos/kilogramo, tres veces por semana (3qw), intravenosamente (i.v.), (3) 11 H6 tetrámero, 10 miligramos/ kilogramo una vez a la semana (qw), intravenosamente (i.v.), (4) 11H6, 40 miligramos/kilogramo, una vez a la semana (qw), intravenosamente (i.v.), 5. Gemcitabina, 60 miligramos/kilogramo, dos veces por semana (2qw), intravenosamente (i.v.). El volumen de la dosificación intravenosa es de 5 mililitros/kilogramo. Los ratones se pesan dos veces por semana. Los tumores se miden con calibres dos veces por semana, y se calcula el volumen tumoral (TV) utilizando la fórmula: TV (mm3) = [longitud (mm) x anchura (mm)2] / 2, en donde la longitud y la anchura son los diámetros de prueba más largo y más corto de cada tumor, respectivamente.

Como se muestra en la Figura 5, después de 4 semanas de la dosificación, LCR211 no muestra actividad de un solo agente, con el cambio promedio en el volumen tumoral del grupo de tratamiento sobre el control (T/C) = 109 por ciento. En contraste, 11H6 dosificado a 10 miligramos/kilogramo semanalmente, y a 40 miligramos/kilogramo semanalmente, da como resultado el 1 por ciento y el 86 por ciento de regresión, respectivamente (p<0.05 contra el vehículo). El tratamiento con gemcitabina da como resultado un T/C del 25 por ciento (p<0.05 contra el vehículo). El tratamiento con LCR211 y 11H6 es bien tolerado, sin pérdida de peso corporal significativa observada. Por consiguiente, en un cáncer derivado del paciente que es insensible a la dirección convencional del anticuerpo al DR5, las construcciones de NB muestran una potente regresión del tumor. En este ejemplo, la construcción de NB tiene el potencial para tratar una mayor clase de pacientes que podrían ser refractarios a los planteamientos de dirección convencionales para esta senda. 11. Ejemplo XI 11.1 Determinación de la estructura cristalográfica de rayos X de los complejos de DR5 humano/construcción de NB Se determinan las estructuras de cristal de un fragmento de ECD de DR5 humano enlazado a construcciones monoméricas de 11H6 (SEQ ID NO: 103) y 4E6 (SEQ ID NO: 104). Como se detalla más adelante, los fragmentos de proteína de DR5 individuales se expresan, se purifican y se mezclan para formar complejos. Se emplea cristalografía de proteínas para generar los datos de resolución atómica para el enlace de proteína de DR5 a los dos ejemplos.

Se producen dos variantes de proteína de DR5 para la cristalografía, es decir, DR5_54 y DR5_61. Siguiendo la numeración de la secuencia del DR5 humano, Número de Acceso GenBank BAA33723.1 (SEQ ID NO: 89), las secuencias del DR5 corresponden a los residuos 54 a 183, y 61 a 183, respectivamente. Como se muestra en la Tabla 28, las secuencias en letras minúsculas se remueven durante la producción. Para DR5_54 (SEQ ID NO: 100), y DR5_61 (SEQ ID NO: 101), se subraya la secuencia del DR5 humano. En la Tabla 28, "ID" representa la SEQ ID NO.

Tabla 28 Proteínas utilizadas para la determinación de la estructura del cristal Las proteínas anteriores se expresan en células SF9 utilizando un sistema de expresión de baculovirus, con el vector de expresión que contiene el péptido de señal GP67. La proteína de DR5 se purifica a partir del medio de crecimiento celular, seguido por una infección de 2.5 días. Se aclara el medio con la adición de CaCI2 5 mM, NiCI21 mM, Tris 50 mM, pH de 8.0, y PMSF 1 µ?. La proteína se captura en resina de Ni-NTA (Qiagen) equilibrada en Tris 50 mM, pH de 8.0, NaCI 300 mM, utilizando una columna de flujo por gravedad. La columna se lava con Tris 50 mM, pH 8.0, NaCI 300 mM, imidazol 30 mM, seguido por elución con Tris 50 mN, pH de 8.0, NaCI 300 mM, imidazol 300 mM. Se disocia el DR5 eluido a partir de la columna de Ni con proteasa PreScission (GE Healthcare), seguido por cromatografía de filtración de gel utilizando una columna Superdex 75 (GE Healthcare) equilibrada en HEPES 50 mM, pH de 7.6, NaCI 150 mM. Además se purifica el DR5 mediante intercambio de iones utilizando una columna MonoQ (GE Healthcare) a un pH de 7.5 con un gradiente de volumen en la columna 20 de NaCI 0.03-1M. Se analizan las fracciones pico mediante SDS-PAGE y LCMS antes de reservarse. 11.2 Cristalización de 4E6 y 11 H6 con el DR5.

Ambos 4E6 (pAX111-4E6, SEQ ID NO:103), y 11 H6 (pAX100-11 H6, SEQ ID NO.102), se clonan como las construcciones monoméricas de NB para la expresión de E. coli en células BL21 (DE3)pLysS y células BL21 (DE3)Star, respectivamente, y ambas contienen secuencias de señal para la localización periplásmica, como se proporciona en la Tabla 28 anterior. Siguiendo a una inducción de 3 horas con IPTG a 37°C, se cosechan y se Usan las células. Se captura la proteína sobre una columna de Ni-NTA previamente equilibrada en Tris 50 mM, pH de 8.0, NaCI 300 mM. La columna se lava con Tris 50 mM, pH de 8.0, NaCI 300 mM, imidazol 50 mM, seguido por elución con Tris 50 mN, pH de 8.0, NaCI 300 mM, imidazol 300 mM. Además se purifica el eluido de Ni por medio de cromatografía de filtración de gel utilizando una columna Superdex 75 (GE Healthcare). Mientras que éste es el paso de purificación final para el 11H6, el 4E6 se sometió a un paso de purificación adicional mediante una columna de intercambio de cationes MonoS (GE Healthcare).

Se prepara un complejo del DR5_61/4E6 mediante la mezcla de DR5_61 y 4E6 en una proporción molar de 1:1 (concentración medida por medio de LCUV), incubando sobre hielo durante 1 hora, y purificando el complejo sobre una columna Superdex75 (GE Healthcare) equilibrada en HEPES 20 mM, pH de 7.5, NaCI 150 mM. Se analizan las fracciones pico mediante SDS-PAGE y LMCS. Las fracciones que contienen DR5_61/4E6 se concentran hasta aproximadamente 10 miligramos/mililitro para la cristalización.

Se prepara un complejo de DR5_54/11H6 mediante la mezcla de DR5_54 y 11H6 en una proporción molar de 1:1.3 (se estima la concentración mediante LCUV), incubando sobre hielo durante 1 hora, y purificando el complejo en una columna Superdex75 (GE Healthcare) equilibrada en HEPES 25 mM, pH de 7.5, NaCI 150 mM. Las fracciones pico que contienen el dímero DR5_54/11H6 se reservan y se concentran hasta aproximadamente 12.7 miligramos/mililitro. Entonces el dímero se trata con Tripsina como sigue: se utilizan 200 microlitros de dímero (aproximadamente 2.5 miligramos) para volver a suspender 20 microgramos de tripsina liofilizada, la cual entonces se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla de DR5_54/11 H6/tripsina se centrifuga antes de establecerse los rastreos de cristalización.

Los cristales crecen mediante la difusión de vapor por goteo asentado a partir de gotas que contienen volúmenes iguales de proteína y solución de depósito. Para el complejo DR5_61/4E6 se produce una solución de depósito de PEG 3350 al 22 por ciento, acetato de calcio 150 mM, Hepes 100 m , pH de 7.5, se producen cristales sobre la incubación a 20°C. El complejo de DR5_54/11G6 tratado con tripsina, una solución de depósito de sulfato de amonio 0.2M. Tris 0.1M, pH de 8.5, PEG 3350 al 25 por ciento, produce cristales después de la incubación a 20°C.

Los cristales de DR5_61/4E6 se transfieren a una solución criogénica que contiene PEG 3350 al 25 por ciento, HEPES 50 mM, pH de 7.5, acetato de calcio 150 mM, glicerol al 15 por ciento, etilenglicol al 10 por ciento, y se enfría por evaporación en nitrógeno líquido. Los cristales de DR5_a54/11H6 se transfieren a una solución de depósito que contiene glicerol al 22 por ciento adicional y se enfría por evaporación en nitrógeno líquido.

Para el complejo DR5_61/4E6, se recolectan los datos de difracción en la estación PXI-X06SA en la Swiss Light Source (Paul Scherrer Instituí, Villigen, Suiza). Se procesan y se escalan los datos a 1.9Á utilizando autoPROC (Global Phasing, LTD) en el grupo de espacio C121 con dimensiones celulares de a = 98.50Á, b = 84.65Á, c = 64.91Á, alfa = 90°, beta = 99.38°, gama = 90°. La estructura de DR5_61/4E6 se disuelve mediante reemplazo molecular utilizando Phaser (McCoy y colaboradores (2007) J. Appl. Cryst. 40: 658-674) con la estructura del DR5, 2H9G, y la estructura 1OL0 de VH humana camelizada, como modelos de búsqueda. El modelo final que contiene 2 moléculas del complejo DR5_61/4E6 por unidad asimétrica, se construye en COOT (Emsiey y Cowtan (2004) Acta Cryst. 60: 2126-2132), y se refina hasta valores R y Rnbre del 22.2 por ciento y del 24.1 por ciento, respectivamente, con un rmsd de 0.003Á y 0.69° para las longitudes de enlace y los ángulos de enlace, respectivamente, utilizando FENIX (Adams y colaboradores, Acta Cryst. D66, 213-221 (2010)).

Para el complejo DR5_54/11H6, se recolectan los datos de difracción en la línea del haz 17-ID en la Advanced Photon Sourse (Argonne National Laboratory, EUA). Los datos se procesan y se escalan a 2.2Á utilizando autoPROC (Global Phasing, LTD) en un grupo de espacio P65 con dimensiones celulares de a = 99.61Á, b = 99.61 Á, c = 107.73Á, alfa = 90°, beta = 90°, gamma = 120°. Se disuelve la estructura DR5_54/11H6 mediante reemplazo molecular utilizando Phaser (McCoy y colaboradores (2007) J. Appl. Cryst. 40: 658-674) con la estructura de DR5, 2H9G y la construcción 4E6 de NB como modelos de búsqueda. El modelo final, que contiene 2 moléculas del complejo DR5_54/11H6 por unidad asimétrica, se construye en COOT (Emsiey y Cowtan (2004) Acta Cryst. 60: 2126-2132), y se definen los valores R y R|ibre del 19.5 por ciento y del 22.0 por ciento, respectivamente, con un rmsd de 0.002 Á y 0.64° para las longitudes de enlace y los ángulos de enlace, respectivamente, utilizando FENIX (Adams y colaboradores, Acta Cryst. D66, 213-221 (2010)). 1 1 .3 4E6 y 1 1 H6 reconocen los ep ítopos únicos en DR5 La estructu ra de cristal del complejo 4E6/D R5_61 se ha utilizado para identificar el epítopo de DR5 para la construcción de 4E6. La superficie de interacción sobre el D R5 se forma mediante tres secuencias discontin uas (es deci r, no contiguas) secuencias: es decir, los residuos 77 a 80, los residuos 87 a 91 , y los residuos 1 05 a 1 1 4 , como se detalla en la Tabla 29A. Estos residuos forman la superficie tridimensional que se reconoce mediante la construcción de NB . Las interacciones incluyen interacciones de la estructura base, interacciones mediadas por solventes, e i nteracciones de cadena lateral di rectas . Los ami noácidos cuyas cadenas laterales contribuyen di rectamente a las interacciones anotadas en la Tabla 29A. La contribución de la superficie de i nteracción a parti r de la construcción 4E6 de N B se forma mediante su residuo 2 N-terminal , y tres regiones de lazos: los residuos 28 a 33 , los residuos 53 a 59, y los residuos 99 a 1 1 5. Los residuos de contacto se enlistan en la Tabla 29B.

En la Tabla 29A, se enlistan los residuos de DR5 que contienen átomos en contacto con la construcción de N B, 4E6. El contacto se define para estar dentro de 5 Angstroms de la construcción de N B para contabilizar las i nteracción mediadas por agua potenciales . Los aminoácidos cuyas cadenas laterales contribuyen di rectamente a la superficie de interacción se anotan con un "+".

Tabla 29A Epítopo conformacional de DR5 para 4E6 En la Tabla 29B , se enlistan los residuos en la construcción de N B 4E6 que están en contacto con el DR5. El contacto se define dentro de 5 Angstroms de la construcción de N B para contabilizar las i nteracciones mediadas por agua potenciales. Los ami noácidos cuyas cadenas laterales contribuyen di rectamente a la superficie de interacción se anotan con "+".

Tabla 29B Aminoácidos 4E6 en contacto con el DR5 La estructura de cristal del complejo 11H6/DR5_54 se utiliza para identificar el epítopo de DR5 para la construcción del 11H6. La superficie de interacción sobre el DR5 se forma mediante dos secuencias discontinuas, los residuos 86 a 102 y los residuos 111 a 118, y dos residuos adicionales 74 y 125 como se detalla en la Tabla 30A. Estos residuos forman la superficie tridimensional que se reconoce mediante la construcción de NB. Las interacciones incluyen interacciones de la estructura base, interacciones mediadas por solvente, e interacciones de cadena lateral directas. Los aminoácidos cuyas cadenas laterales contribuyen directamente a las interacciones se anotan en la Tabla 30A. La contribución a la superficie de interacción a partir de la construcción 11H6 se extiende más allá de las regiones de lazo observadas para la construcción 4E6. Los residuos 30 a 37, los residuos 44 a 61, y los residuos 96 a 112 contribuyen a la superficie de enlace de la construcción del 11H6 como se detalla en la Tabla 30B. El lazo de la construcción 11 H6 a partir de los residuos 98 a 110 está en una conformación muy diferente del lazo correspondiente a partir de la construcción 4E6. Esta posición de lazo alternativa proporciona una superficie de interacción única para el enlace de DR5.

En la Tabla 30A, se enlistan los residuos de DR5 que contienen átomos en contacto con la construcción del 11H6. El contacto se define para estar dentro de 5 Angstroms del 11H6, para contabilizar las interacciones mediadas por agua potenciales. Los aminoácidos cuyas cadenas laterales contribuyen directamente a la superficie de interacción se anotan con un "+". El área superficial enterrada se determina como un porcentaje.

Tabla 30A Epítopo Conformacional del DR5 para 11H6 En la Tabla 30B, se enlistan los residuos en 1H6 que están en contacto con el DR5. El contacto se define para estar dentro de 5 Angstroms de la construcción del 11 H6 para contabilizar las interacciones mediadas por agua potenciales. Los aminoácidos cuya cadena lateral contribuye directamente a la superficie de interacción se anotan con un "+".

Tabla 30B Aminoácidos de 11H6 en contacto con el DR5 EQ UIVALE NTES 1 . U na modalidad proporciona un polipéptido aislado, el cual comprende cuando menos un monómero de un solo dominio variable de un agente NB que se enlaza específicamente al D R5 humano . 2. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 1 , en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en : a) los domi nios variables individuales , los cuales comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) seleccionadas a parti r de cualquiera o más de las SEQ I D NOs: 63-68; b) los dominios variables i ndividuales que comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) con el 90 por ciento de identidad con cuando menos una C DR3 seleccionada a parti r de cualquiera o más de las S EQ I D NOs: 63-68; y c) los dominios variables individuales que comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos una CDR3 seleccionada a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 63-68. 3. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 1, en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales, los cuales comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) seleccionadas a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 41-44, 51-55, y 63-68; b) los dominios variables individuales que comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) con cuando menos el 90 por ciento de identidad con cuando menos una CDR3 seleccionada a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 41-44, 51-55 y 63-68; y c) los dominios variables individuales que comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos una CDR3 seleccionada a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 41-44, 51-55 y 63-68 con cuando menos el 90 por ciento de identidad. 4. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 1, en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; y b) los dominios variables individuales con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos un solo dominio variable de las S EQ I D NOs: 1 -5 , 26, 30 y 87. 5. Una modal idad proporciona un polipéptido aislado , el cual comprende cuando menos tres monómeros de un solo dominio variable que se enlaza específicamente al DR5 humano. 6. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 5, en donde el pol ipéptido mencionado comprende tres monómeros idénticos del único dominio variable , y en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en : a) un solo dominio variable, el cual comprende una o más secuencias de la región determi nante de complementariedad 3 (C DR3) seleccionadas a partir de cualquiera o más de las S EQ I D NOs : 63-68 ; b) los domi nios variables individuales que comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (C DR3) con cuando menos el 90 por ciento de identidad con cuando menos una CDR3 seleccionada a parti r de cualquiera o más de las SEQ I D NOs : 63-68 ; y c) los dominios variables individuales que comprenden una o más secuencias de la región determi nante de complementariedad 3 (CD R3) con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos una CD R3 seleccionada a parti r de cualquiera o más de las S EQ I D NOs: 63-68 con cuando menos el 90 por ciento de identidad. 7. Una modalidad proporciona el pol ipéptido del párrafo 5, en donde el polipéptido mencionado comprende tres monómeros idénticos del único dominio variable , y en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales, los cuales comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) seleccionadas a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 41-44, 51-55 y 63-68; b) los dominios variables individuales que comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) con cuando menos el 90 por ciento de identidad con cuando menos una CDR3 seleccionada a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 41-44, 51-55 y 63-68; y c) los dominios variables individuales que comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos una CDR3 seleccionada a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 41-44, 51-55 y 63-68 con cuando menos el 90 por ciento de identidad. 8. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 5, en donde el polipéptido mencionado comprende tres monómeros idénticos del único dominio variable, y en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; b) los dominios variables individuales con cuando menos el 90 por ciento de identidad con cuando menos un solo dominio variable de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87, y c) los dominios variables individuales con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos un solo dominio variable de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87. 9. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 5, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 y 31; y b) las secuencias de aminoácidos con cuando menos el 90 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 y 31. 10. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 5, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 y 31; y b) las secuencias de aminoácidos con cuando menos el 90 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 y 31. 11. El polipéptido del párrafo 5, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 y 31; y b) las secuencias de aminoácidos con cuando menos el 95 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 y 31. 12. Una modalidad proporciona un polipéptido aislado, el cual comprende cuando menos cuatro monómeros de un solo dominio variable que se enlaza específicamente al DR5 humano. 13. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 12, en donde el polipéptido mencionado comprende cuatro dominios variables individuales, y en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir de uno, dos, tres o cuatro monómeros a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; b) los dominios variables individuales con cuando menos el 90 por ciento de identidad con el único dominio variable mencionado de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; y c) los dominios variables individuales con el 95 por ciento de identidad con el único dominio variable mencionado de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87. 14. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 12, en donde el polipéptido mencionado comprende cuatro dominios variables individuales idénticos, y en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; b) los dominios variables individuales con cuando menos el 90 por ciento de identidad con el único dominio variable mencionado de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; y c) los dominios variables individuales con el 95 por ciento de identidad con el único dominio variable mencionado de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87. 15. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 12, en donde el polipéptido mencionado comprende cuatro dominios variables individuales idénticos, y en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; y b) los dominios variables individuales con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos un solo dominio variable de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87. 16. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 12, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88; b) las secuencias de aminoácidos con cuando menos el 90 por ciento de identidad con esta secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88; y c) las secuencias de aminoácidos con el 95 por ciento de identidad con esta secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88. 17. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 12, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos con las SEQ ID NOs: 7, 10, 15, 18, 21, 28 y 32; b) las secuencias de aminoácidos con cuando menos el 90 por ciento de identidad con esta secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 7, 10, 15, 18, 21, 28 y 32; y c) las secuencias de aminoácidos con el 95 por ciento de identidad con esta secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 7, 10, 15, 18, 21 , 28 y 32. 18. El polipéptido del párrafo 12, el cual comprende una secuencia de aminoácidos humanizada que se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos con la SEQ ID NO: 28; b) las secuencias de aminoácidos con la SEQ ID NO: 32; y b) las secuencias de aminoácidos con cuando menos el 95 por ciento de identidad con esta secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 28 y 32. 19. Una modalidad proporciona un polipéptido aislado, el cual comprende cuando menos cinco monómeros de un solo dominio variable que se enlaza específicamente al DR5 humano. 20. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 19, en donde el polipéptido mencionado comprende cinco dominios variables individuales, y en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir de uno, dos, tres, cuatro o cinco monómeros del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; b) los dominios variables individuales con cuando menos el 90 por ciento de identidad con el único dominio variable mencionado de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; y c) los dominios variables individuales con cuando menos el 95 por ciento de identidad con el único dominio variable mencionado de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87 con cuando menos el 90 por ciento de identidad. 21. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 19, en donde el polipéptido mencionado comprende cinco dominios variables individuales idénticos, y en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; b) los dominios variables individuales con cuando menos el 90 por ciento de identidad con el único dominio variable mencionado de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; y b) los dominios variables individuales con el 95 por ciento de identidad con el único dominio variable mencionado de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87. 22. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 19, en donde el polipéptido mencionado comprende cinco dominios variables individuales, y en donde el único dominio variable mencionado está humanizado, y este dominio humanizado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 26 y 30; b) los dominios variables individuales con cuando menos el 90 por ciento de identidad con cuando menos un solo dominio variable de las SEQ ID NOs: 26 y 30; y b) los dominios variables Individuales con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos un solo dominio variable de las SEQ ID NOs: 26 y 30. 23. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 19, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos con las SEQ ID NOs: 8, 11, 16, 19, 22, 29 y 33; b) las secuencias de aminoácidos con cuando menos el 90 por ciento de identidad con esta secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 8, 11, 16, 19, 22, 29 y 33; y c) las secuencias de aminoácidos con el 95 por ciento de identidad con esta secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 8, 11, 16, 19, 22, 29 y 33. 24. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 19, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29; b) las secuencias de aminoácidos con cuando menos el 90 por ciento de identidad con esta secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29; y b) las secuencias de aminoácidos con el 95 por ciento de identidad con esta secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29. 25. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 19, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos con la SEQ ID NO: 33; b) las secuencias de aminoácidos con cuando menos el 90 por ciento de identidad con esta secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33; y b) las secuencias de aminoácidos con cuando menos el 95 por ciento de identidad con esta secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33. 26. Una modalidad proporciona un polipéptido aislado, el cual comprende tres o cuatro o cinco monómeros de un solo dominio variable que se enlaza específicamente al DR5 humano, y en donde el polipéptido mencionado tiene una potencia in vitro (IC50) contra un panel de cuando menos 2 líneas celulares tumorales seleccionadas a partir del grupo que consiste en Colo205, Jurkat, Molt4, H2122, H226, y H2052, que es igual o menor de 100nM. 27. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 26, en donde el polipéptido mencionado tiene una potencia in vitro que es igual o menor de 10 nM. 28. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 26, en donde el polipéptido mencionado tiene una potencia in vitro que es igual o menor de 1 nM. 29. Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 26, en donde el polipéptido mencionado tiene una potencia in vitro que es igual o menor de 100 pM. 30. Una modalidad proporciona el polipéptido de los párrafos 26 a 29, en donde el polipéptido mencionado tiene una potencia in vitro (IC50) contra un panel de cuando menos 3 líneas celulares no tumorales seleccionadas a partir del grupo que consiste en Malme-3, WI-38, ARPE-19, 184A1, Huvec, HAAE-1 que es igual o mayor de 20nM. 31. Una modalidad proporciona el polipéptido de los párrafos 26 a 29, en donde el polipéptido mencionado tiene una potencia in vitro (IC50) contra un panel de cuando menos 3 líneas celulares no tumorales seleccionadas a partir del grupo que consiste en Malme-3, WI-38, ARPE-19, 184A1, Huvec, HAAE-1 que es igual o mayor de 100 nM. 32. Una modalidad proporciona el polipéptido de los párrafos 26 a 31, en donde el polipéptido mencionado comprende tres o cuatro o cinco monómeros de un solo dominio variable, y en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87; y b) los dominios variables individuales con cuando menos el 90 por ciento de identidad con el único dominio variable mencionado de las SEQ ID NOs: 1-5, 26, 30 y 87. 33. El polipéptido de los párrafos 26 a 31, en donde el polipéptido mencionado comprende tres o cuatro o cinco monómeros de un solo dominio variable, y en donde el único dominio variable mencionado está humanizado y se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 26 y 30; b) los dominios variables individuales con cuando menos el 90 por ciento de identidad con el único dominio variable mencionado de las SEQ ID NOs: 26 y 30; y b) los dominios variables individuales con cuando menos el 95 por ciento de identidad con el único dominio variable mencionado de las SEQ ID NOs: 26 y 30. 34. Una modalidad proporciona el polipéptido de los párrafos 26 a 31 , en donde el polipéptido mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) el polipéptido seleccionado a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 27, 28 y 29; b) un polipéptido con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos un polipéptido seleccionado a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 27, 28 y 29; c) el polipéptido seleccionado a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 31, 32 y 33; y d) un polipéptido con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos un polipéptido seleccionado a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 31 , 32 y 33. 35. Una modalidad proporciona un polipéptido aislado, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en una o más secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1 a 22, 26 a 33, 87 y 88. 36. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores 1 al presente, en donde el polipéptido mencionado no compite total o parcialmente con el ligando natural del DR5 en un ensayo de enlace competitivo. 37. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores 1 al presente, en donde el polipéptido mencionado sí compite total o parcialmente con el ligando natural del DR5 en un ensayo de enlace competitivo. 38. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con los párrafos 1, 5, 12, 19, 26, ó 37, el cual comprende cuando menos una región determinante de complementariedad (CDR) que tiene cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95 ó 100 por ciento de identidad de secuencia con cuando menos una de las regiones CDR ilustradas en cualquiera de las SEQ ID NOs: 41 a 44 (CDR 1 ); SEQ ID NOs: 51 a 55 (CDR2); SEQ ID NOs: 63 a 68 (CDR3), más preferiblemente SEQ ID NOs: 51 a 55 y SEQ ID NOs: 63 a 68. 39. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con los párrafos 1, 5, 12, 19, 26, ó 37, el cual comprende las regiones CDR1 a CDR3 que tienen cuando menos el 90, 95 ó 100 por ciento de identidad de secuencia, respectivamente, con las regiones CDR ilustradas en cualquiera de las SEQ ID NOs: 41 a 44 (CDR1); SEQ ID NOs: 51 a 55 (CDR2); SEQ ID NOs: 63 a 68 (CDR3). 40. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1, 5, 12, 19, 26, ó 37, el cual comprende o esencialmente consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos el 90, 95 ó 100 por ciento de identidad de secuencia con cualquiera de secuencias como se ilustran en las SEQ ID NOs: 26 a 33. 41. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1, 5, 12, 19, 26, ó 37, el cual comprende una región CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 64 o con la SEQ ID NO: 66. 42. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1, 5, 12, 19, 26, ó 37, una región CDR1, CDR2 y CDR3 idéntica respectivamente a las regiones CDR ilustradas en las SEQ ID NOs: 41 a 44 (CDR1); SEQ ID NOs: 51 a 55 (CDR2); SEQ ID NOs: 63 a 68 (CDR3) o las regiones CDR variantes con 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos sustituidos, suprimidos, o insertados cuando se comparan con las regiones CDR originales como se ilustran en la presente. 43. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores 1 al presente, que es una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. 44. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores 1 al presente, que es una inmunoglobulina humanizada, una inmunoglobulina camelizada, o una inmunoglobulina que se puede obtener mediante la técnica de optimización de afinidad, o un fragmento de la misma. 45. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores 1 al presente, que esencialmente consiste en una secuencia del dominio variable de la cadena ligera, por ejemplo, una secuencia VL; o en una secuencia del dominio variable de la cadena pesada, por ejemplo, una secuencia VH. 46. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores 1 al presente, que esencialmente consiste en una secuencia del dominio variable de la cadena pesada que se deriva a partir de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o que esencialmente consiste en una secuencia del dominio variable de la cadena pesada que se deriva a partir de un anticuerpo de cadena pesada. 47. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores 1 al presente, que esencialmente consiste en un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de un solo dominio, un dAb y un anticuerpo de camélido o fragmento, incluyendo, pero no limitándose a, una secuencia VHH- 48. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores 1 al presente, que esencialmente consiste en una secuencia VHH- 49. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores 1 al presente, que esencialmente consiste en una secuencia VHH que: a) tiene cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104, en donde, para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, no se consideran los residuos de aminoácidos que forman las secuencias de CDR; y en donde: b) opcionalmente una o más de las posiciones de aminoácidos 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat están humano-diseñadas (humaneered). 50. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera o más de los párrafos anteriores 1 al presente, que esencialmente consiste en una secuencia VHH que: a) tiene cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104, en donde, para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, no se consideran los residuos de aminoácidos que forman las secuencias de CDR; y en donde: b) opcionalmente los contactos entre DR5 y la secuencia VHH se seleccionan a partir de: i) el epítopo conformacional del DR5, el cual comprende los residuos de la Tabla 29A; ii) el epítopo conformacional del DR5, el cual comprende los residuos de la Tabla 30A; iii) la superficie de interacción de los aminoácidos VHH como se enlistan en la Tabla 29B; y iv) la superficie de interacción de los aminoácidos VHH como se enlistan en la Tabla 30B. 51. Una modalidad proporciona el polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores 1 al presente, que esencialmente consiste en una secuencia VHH humanizada. 52. Una modalidad proporciona el compuesto que comprende o que consiste esencialmente en uno o más polipéptidos de acuerdo con cualquiera de cualquiera de los párrafos anteriores 1 al presente, y opcionalmente comprende además uno o más grupos, residuos, fracciones o unidades de enlace adicionales, en donde el compuesto mencionado es capaz de mejorar la apoptosis celular. 53. Una modalidad proporciona el compuesto del párrafo 52, el cual tiene una IC50 menor de 100 nM, de preferencia menor de 10 nM, más preferiblemente menor de 1 nM, todavía más preferiblemente menor de 100 pM, por ejemplo, debajo de 10 pM como se mide, por ejemplo, en el ensayo de sobrevivencia celular de Colo205. 54. Una modalidad proporciona el compuesto de los párrafos 52 ó 53, en donde el polipéptido de enlace monovalente correspondiente no es tan potente como el polipéptido multivalente, como se mide, por ejemplo, en el ensayo de sobrevivencia basado en células Colo205. 55. Una modalidad proporciona el compuesto de cualquiera de los párrafos 52 ó 54, en donde los cuando menos tres, cuatro, cinco o más polipéptidos de enlace monovalentes mencionados, pueden enlazarse cada uno al DR5 humano en un formato monovalente. 56. Una modalidad proporciona el compuesto de cualquiera de los párrafos 52 ó 54, en donde los cuando menos tres , cuatro, cinco o más polipéptidos de enlace monovalentes mencionados, pueden enlazarse cada uno al D R5 humano en un formato monovalente pero no se enlazan a los receptores TRAI L- R3 y/o TRAI L- R4. 57. Una modalidad proporciona el compuesto de cualquiera de los párrafos 52 ó 54, en donde los cuando menos tres , cuatro, cinco o más polipéptidos de enlace monovalentes se pueden enlazar cada uno al D R5 en un formato monovalente , y compiten en un ensayo de enlace con el ligando TRAI L natural . 58. Una modal idad proporciona el compuesto de cualquiera de los párrafos 52 ó 54, en donde los cuando menos tres , cuatro, cinco o más polipéptidos de enlace monovalentes mencionados, se dirigen todos contra la misma región de enlace del D R5 hu mano. 59. Una modalidad proporciona el compuesto de cualquiera de los párrafos 52 ó 53, en donde el cuando menos un polipéptido de enlace monovalente mencionado se di rige contra una región de enlace del D R5 , y cuando menos otro polipéptido de enlace monovalente se dirige contra otra región de enlace distinta del D R5 o contra una región de enlace de otro DR5. 60. U na modalidad proporciona el compuesto de cualquie ra de los párrafos 52 ó 53, en donde los cuando menos tres, cuatro, ci nco o más poli péptidos de enlace monovalentes mencionados tienen secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas . 61 . Una modalidad proporciona el compuesto de cualquiera de los párrafos 52 ó 53, el cual consiste esencialmente en un polipéptido de una sola cadena, y en donde los cuando menos tres, cuatro, cinco o más dominios variables individuales de enlace monovalente se enlazan entre sí por medio de un enlazador peptídico. 62. Una modalidad proporciona el compuesto del párrafo 61, en donde el enlazador mencionado consiste esencialmente en un péptido, el cual comprende entre 5 y 50 residuos de aminoácidos. 63. Una modalidad proporciona el compuesto de cualquiera de los párrafos 52 ó 54, en donde el uno o más grupos, residuos, fracciones o unidades de enlace adicionales son polipéptidos, opcionalmente enlazados por medio de uno o más enlazadores. 64. Una modalidad proporciona el compuesto de cualquiera de los párrafos 1 a 63, en donde el uno o más enlazadores son enlazadores peptídicos o polipeptídicos. 65. Una modalidad proporciona el compuesto del párrafo 64, en donde el uno o más grupos, residuos, fracciones o unidades de enlace adicionales se seleccionan a partir del grupo que consiste en un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de un solo dominio, un dAb y un anticuerpo de camélido, o un fragmento de los mismos, incluyendo, pero no limitándose a, una secuencia VHH- 66. Una modalidad proporciona el compuesto de cualquiera de los párrafos 52 a 66, en donde el uno o más grupos, residuos, fracciones o unidades de enlace adicionales proporcionan el compuesto con un aumento de la vida media cuando se administran en un organismo de mamífero, comparándose con el mismo compuesto sin el uno o más grupos, residuos , fracciones o unidades de enlace adicionales. 67. Una modalidad proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de: (1 ) un polipéptido que comprende la secuencia de ami noácidos del polipéptido, como se define en cualquiera de los párrafos 1 a 51 , o (2) un compuesto de acuerdo con cualquiera de los párrafos 52 a 66. 68. Una modalidad proporciona una cél ula huésped que expresa, o que, bajo circunstancias adecuadas, es capaz de expresar el ácido nucleico del párrafo 67. 69. Una modalidad proporciona un método para produci r el polipéptido de enlace de D R5 de cualquiera de los párrafos 1 a 51 , o el compuesto de cualquiera de los párrafos 52 a 66, el cual comprende: a) expresar, en una célula huésped adecuada o en un organismo huésped no humano, el ácido nucleico del párrafo 67; y b) aislar y/o pu rificar el polipéptido de enlace de D R5 o el compuesto mencionados. 70. Una modalidad proporciona el polipéptido de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 51 o el compuesto de acuerdo con cualquiera de los párrafos 52 a 66 , para uti l izarse como un fármaco. 71 . Una modalidad proporciona el polipéptido del párrafo 70, para uti lizarse como un producto terapéutico contra el cáncer. 72. Una modalidad proporciona una composición que comprende cuando menos un polipéptido de cualquiera de los párrafos 1 a 51 , o un compuesto de cualquiera de los párrafos 52 a 66, y cuando menos un veh ículo, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 73. U na modalidad proporciona un método para la prevención y/o el tratamiento de un trastorno que se pueda tratar mediante la mejora de la apoptosis celular, comprendiendo este método, administrar a u n sujeto que lo necesite, una cantidad farmacéuticamente efectiva de cuando menos un poli péptido de acue rdo con cualqu iera de los párrafos 1 a 51 , o de cuando menos un compuesto de acuerdo con cualquiera de los párrafos 52 a 66. 74. Una modalidad proporciona el método del párrafo 73, en donde el trastorno mencionado es una enfermedad proliferativa. 75. Una modal idad proporciona el método del párrafo 74, en donde la enfermedad proliferativa mencionada se selecciona a parti r de : a) uno o más cánceres sólidos seleccionados a parti r de cánceres pri marios y metastásicos, tales como carcinoma de células renales, y cánceres del pulmón (por ejemplo, cáncer pulmonar microcelular "SCLC" y cáncer pulmonar no microcel ular "NSCLC") , páncreas, malignidad hematopoiética, glioma, astrocitoma, mesotelioma, cánceres colo-rectales , cánce r de próstata, osteosarcoma, melanoma, linfoma (i ncl uyendo, pero no limitándose a , linfoma de Burkitt) , cáncer de mama, cáncer endometrial , cáncer de hígado, cáncer gástrico , cáncer de piel , cáncer de ovario, y cánceres de células escamosas de cualquier origen (incluyendo, pero no limitándose a, cánceres de células escamosas del pulmón, cabeza y cuello, mama, tiroides, cérvix, piel, y/o esofágico); y b) uno o más cánceres líquidos seleccionado a partir de leucemias, incluyendo en especial una leucemia de células-T, tal como leucemia de células-T aguda (T-ALL), leucemia de células-B aguda (B-ALL), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mielógena aguda (AML), mieloma de células de plasma, y mieloma múltiple (MM). 76. Una modalidad proporciona el método del párrafo 74, en donde la enfermedad proliferativa mencionada es una o más indicaciones que no son de cáncer, comprendiendo estas indicaciones una o más de las enfermedades inflamatorias y autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Hashimoto, artritis reumatoide, enfermedad del injerto contra el huésped, síndrome de Sjogren, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, esclerodermia, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Crohn, anemia hemolítica autoinmune, esterilidad, miastenia grave, esclerosis múltiple, enfermedad de Basedow, trombocitopenia trombótica, trombocitopenia purpúrea, diabetes mellitus dependiente de insulina, alergia; asma, enfermedad atópica; arterieesclerosis; miocarditis; cardiomiopatía; nefritis glomerular; y anemia hipoplásica. 77. Una modalidad proporciona el método del párrafo 75, en donde la enfermedad proliferativa es cáncer pancreático. 78. Una modal idad proporciona el método del párrafo 75 , en donde la enfermedad proliferativa es T-ALL. 79. U na modalidad proporciona el método del párrafo 75 , en donde la enfermedad prol iferativa es mesotelioma. 80. Una modalidad proporciona el método del párrafo 75 , en donde la enfermedad proliferativa es carcinoma de cél ulas escamosas de cualquier origen de tej ido. 81 . Una modalidad proporciona el método del párrafo 75, en donde la enfermedad proliferativa es AML. 82. Una modal idad proporciona el método del párrafo 75, en donde la enfermedad proliferativa es melanoma. 83. Una modalidad proporciona el método del párrafo 75, en donde la enfermedad proliferativa es mieloma. 84. Una modal idad proporciona una composición que comprende el polipéptido de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 51 o cuando menos u n compuesto de acuerdo con cualquie ra de los párrafos 52 a 66, estando esta composición en combinación con cuando menos un inhibidor de cualquiera o más genes seleccionados a parti r de c lAP1 , c lAP2 , XIAP, c FLI P y Bcl-xL. 85. Una modalidad proporciona la composición del párrafo 84, en donde el inhibidor es un inhibidor de clAP 1 . 86. U na modal idad proporciona la composición del párrafo 85, que además comprende un inhibidor de M EK. 87. U na modalidad proporciona la composición del párrafo 85 , que además comprende un inhibidor de B RAF, 88. Una modalidad proporciona la composición del párrafo 84, en donde el i nhibidor es un inhibidor de XIAP. 89. U na modalidad proporciona la composición del párrafo 84 , en donde el i nhibidor es un inhibidor de cFLI P . 90. U na modalidad proporciona la composición del párrafo 84, en donde el inhibidor es un compuesto de bajo peso molecular seleccionado a parti r de LCL 1 61 y ABT263. 91 . Una modal idad proporciona la composición del párrafo 84, en donde el inhi bidor es un shARN . 92. Una modalidad proporciona un método para utilizar cualquiera o más de las composiciones del párrafo 72, comprendiendo el método admi nistrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad farmacéuticamente efectiva de esta composición o de una combinación de la misma, para el tratamiento de una enfermedad asociada con el DR5. 93. Una modalidad proporciona el método del párrafo 92 , en donde la enfermedad asociada con el DR5 se selecciona a parti r de una o más de las siguientes: a) una o más enfermedades proliferativas seleccionadas a partir de cánceres sólidos y líquidos, (i) en donde los tumores sólidos i ncluyen cánceres pri marios y metastásicos, tales como carcinoma de células renales, y cánceres del pulmón (por ejemplo, cáncer pulmonar microcel ular "SCLC" y cáncer pulmonar no microcelular "NSCLC") , páncreas, malignidad hematopoiética, glioma, astrocitoma, mesotelioma, cánceres colo-rectales, cáncer de próstata, osteosarcoma, melanoma, linfoma (incluyendo, pero no limitándose a, linfoma de Burkitt), cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer de piel, cáncer de ovario, y cánceres de células escamosas de cualquier origen (incluyendo, pero no limitándose a, cánceres de células escamosas del pulmón, cabeza y cuello, mama, tiroides, cérvix, piel, y/o esofágico); y (ii) en donde los cánceres líquidos comprenden leucemias, incluyendo en especial una leucemia de células-T, tal como leucemia de células-T aguda (T-ALL), leucemia de células-B aguda (B-ALL), leucemia mielógena crónica (CIVIL), leucemia mielógena aguda (AML), mieloma de células de plasma, y mieloma múltiple (MM); y b) indicaciones que no son de cáncer, las cuales comprenden una o más de las enfermedades inflamatorias y autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Hashimoto, artritis reumatoide, enfermedad del injerto contra el huésped, síndrome de Sjogren, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, esclerodermia, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Crohn, anemia hemolítica autoinmune; esterilidad, miastenia grave, esclerosis múltiple, enfermedad de Basedow, trombocitopenia trombótica, trombocitopenia purpúrea, diabetes mellitus dependiente de insulina, alergia; asma, enfermedad atópica; arterieesclerosis; miocarditis; cardiomiopatía; nefritis glomerular; y anemia hipoplásica. 94. Una modalidad proporciona los polipéptidos aislados de acuerdo con cualquiera o más de los párrafos anteriores 1 al presente , en donde las CDRs se calculan de acuerdo con las reglas ya sea de Kabat y/o de Chotia. 95. U na modalidad proporciona los polipéptidos aislados de acuerdo con cualquiera o más de los párrafos anteriores 1 al presente , en donde el polipéptido se enlaza a uno o más epítopos como se proporcionan en las Tablas 29A y/o 30A, y/o comprende los residuos superficiales interactivos como se proporcionan en las Tablas 29B y/o 30B .

Las siguientes reivindicaciones de la invención no son limitantes. Se pueden contemplar ciertas variaciones de la invención que están dentro de las capacidades de un experto en este campo, i ncl uyendo, pero no limitándose a, cambios en las formulaciones, suministro, humanización , sistemas de expresión , y similares . Estas variaciones se consideran dentro del alcance de la invención .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado, el cual comprende cuando menos un monómero de un solo dominio variable de un agente NB que se enlaza específicamente al DR5 humano.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) dominios variables individuales, los cuales comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) seleccionadas a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 63-68; b) los dominios variables individuales que comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) con el 90 por ciento de identidad con cuando menos una CDR3 seleccionada a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 63-68; y c) los dominios variables individuales que comprenden una o más secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos una CDR3 seleccionada a partir de cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 63-68.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 1 - 5, 26, 30 y 87; y b) los dominios variables individuales con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos un solo dominio variable con las SEQ ID NOs: 1 - 5, 26, 30 y 87.

4. Un polipéptido aislado, el cual comprende cuando menos tres, cuando menos cuatro, o cuando menos cinco subunidades monoméricas de un solo dominio variable que se enlaza específicamente al DR5 humano, en donde estas subunidades se enlazan opcionalmente mediante un enlazador de polipéptido.

5. El polipéptido de la reivindicación 4, en donde el polipéptido mencionado comprende monómeros idénticos del único dominio variable, y en donde el único dominio variable mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) los dominios variables individuales con las SEQ ID NOs: 1 - 5, 26, 30 y 87; b) los dominios variables individuales con cuando menos el 90 por ciento de identidad con cuando menos un solo dominio variable con las SEQ ID NOs: 1 - 5, 26, 30 y 87, y c) los dominios variables individuales con cuando menos el 95 por ciento de identidad con cuando menos un solo dominio variable con las SEQ ID NOs: 1 - 5, 26, 30 y 87.

6. El polipéptido de la reivindicación 4, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir de una o más subunidades del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos con las SEQ ID NOs: 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 y 31; y b) las secuencias de aminoácidos con cuando menos el 90 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos con las SEQ ID NOs: 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 y 31.

7. El polipéptido de la reivindicación 4, el cual se enlaza específicamente al DR5 humano, y en donde el polipéptido mencionado tiene una potencia in vitro (IC50) contra un panel de cuando menos 2 líneas celulares tumorales seleccionadas a partir del grupo que consiste en Colo205, Jurkat, Molt4, H2122, H226, y H2052, que es igual o menor de 100nM.

8. El polipéptido de la reivindicación 7, en donde el polipéptido mencionado tiene una potencia in vitro que es igual o menor de 10 nM, que es igual o menor de 1 nM, o que es igual o menor de 100 pM.

9. Un polipéptido aislado, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona a partir del grupo que consiste en una o más secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 a 22, 26 a 33, 87 y 88.

10. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende cuando menos una región determinante de complementariedad (CDR) que tiene cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95 ó 100 por ciento de identidad de secuencia con cuando menos una de las regiones CDR ilustradas en cualquiera de las SEQ ID NO: 41 a 44 (CDR 1 ); SEQ ID NO: 51 a 55 (CDR2); SEQ ID NO: 63 a 68 (CDR3), más preferiblemente SEQ ID NO: 51 a 55 y SEQ ID NO: 63 a 68.

11. El polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual es una inmunoglobulina humanizada, una inmunoglobulina camelizada o una inmunoglobulina que se puede obtener mediante la técnica de optimización de afinidad, o un fragmento de la misma.

12. El polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual consiste esencialmente en una secuencia de dominio variable de cadena ligera, por ejemplo, una secuencia VL; o en una secuencia del dominio variable de la cadena pesada, por ejemplo, una secuencia VH, o es un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de un solo dominio, un dAb y un anticuerpo de camélido o fragmento, incluyendo, pero no limitándose a, una secuencia VHH-

13. El polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual consiste esencialmente en una secuencia VHH que: (a) tiene cuando menos el 90 por ciento de identidad de aminoácidos con cuando menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1-22, 26-40, 87-88, y 103-104, o de las secuencias de aminoácidos codificadas por cuando menos una de las SEQ ID NOs: 96-99, en donde, para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, no se consideran los residuos de aminoácidos que forman las secuencias de CDR; y en donde: (b) opcionalmente una o más de las posiciones de aminoácidos 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat están humano-diseñadas (humaneered).

14. El compuesto que comprende o que consiste esencialmente en uno o más polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y opcionalmente comprende además uno o más grupos adicionales, residuos, fracciones o unidades de enlace , en donde el compuesto mencionado es capaz de mejorar la apoptosis celular.

15. El compuesto de la reivindicación 14, en donde los cuando menos tres , cuatro, cinco o más polipéptidos de enlace monovalentes mencionados se dirigen todos contra la misma región de enlace del DR5 humano.

1 6. El compuesto de la reivindicación 1 4, en donde el cuando menos un polipéptido de enlace monovalente mencionado se di rige contra una región de enlace del DR5, y cuando menos otro polipéptido de enlace monovalente se dirige contra otra región de enlace distinta del DR5 o una región de enlace de otro D R5.

1 7. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 , para utilizarse como un fármaco.

1 8. El polipéptido de la reivindicación 1 7, para utilizarse como un producto terapéutico contra el cáncer.

1 9. Un polipéptido de la reivindicación 1 8 y cuando menos un veh ículo , diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

20. Un método para la prevención y/o el tratamiento de un trastorno que se pueda tratar mediante la mejora de la apoptosis celular, comprendiendo este método, administrar, a un sujeto que lo necesite , una cantidad farmacéuticamente efectiva de cuando menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores .

21. El método de la reivindicación 20, en donde el trastorno mencionado es una enfermedad proliferativa que responde al agonismo de la actividad del DR5.

22. El método de la reivindicación 21, en donde la enfermedad proliferativa mencionada se selecciona a partir de: a) uno o más cánceres sólidos seleccionados a partir de cánceres primarios y metastásicos, tales como carcinoma de células renales, y cánceres del pulmón (por ejemplo, cáncer pulmonar microcelular "SCLC" y cáncer pulmonar no microcelular "NSCLC"), páncreas, malignidad hematopoiética, glioma, astrocitoma, mesotelioma, cánceres colo-rectales, cáncer de próstata, osteosarcoma, melanoma, linfoma (incluyendo, pero no limitándose a, linfoma de Burkitt), cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer de piel, cáncer de ovario, y cánceres de células escamosas de cualquier origen (incluyendo, pero no limitándose a, cánceres de células escamosas del pulmón, cabeza y cuello, mama, tiroides, cérvix, piel, y/o esofágico); b) uno o más cánceres líquidos seleccionado a partir de leucemias, incluyendo en especial una leucemia de células-T, tal como leucemia de células-T aguda (T-ALL), leucemia de células-B aguda (B-ALL), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mielógena aguda (AML), mieloma de células de plasma, y mieloma múltiple (MM); y c) una o más indicaciones que no son de cáncer, comprendiendo estas indicaciones una o más de enfermedades inflamatorias y autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Hashimoto, artritis reumatoide , enfermedad del injerto contra el huésped, síndrome de Sjogren , anemia perniciosa, enfermedad de Addison , esclerodermia, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Crohn , anemia hemolítica autoinmune , esterilidad , miastenia grave, esclerosis múltiple , enfermedad de Basedow, trombocitopenia trombótica, trombocitopenia purpú rea, diabetes mellitus dependiente de insulina, alergia; asma, enfermedad atópica; arterieesclerosis ; miocarditis; cardiomiopatía; nefritis glomerular; y anemia hipoplásica.

23. El método de la reivindicación 22 , en donde la enfermedad proliferativa es cáncer pancreático.

24. El método de la reivindicación 22 , en donde la enfermedad proliferativa es T-ALL.

25. El método de la reivi ndicación 22 , en donde la enfermedad proliferativa es mesotelioma.

26. El método de la reivindicación 22 , en donde la enfermedad prol iferativa es carcinoma de cél ulas escamosas de cualquier origen de tejido.

27. El método de la reivindicación 22 , en donde la enfermedad proliferativa es AM L.

28. El método de la reivindicación 22 , en donde la enfermedad proliferativa es melanoma.

29. El método de la reivindicación 22 , en donde la enfermedad proliferativa es mieloma.

30. Los pol ipéptidos aislados de acue rdo con cualquiera o más de las reivindicaciones anteriores , en donde las CDRs se calculan de acuerdo con las reglas ya sea de Kabat y/o de Chotia.

31 . La construcción de NB de acuerdo con cualquiera o más de las reivindicaciones anteriores, la cual se enlaza al epítopo del DR5 como se proporciona en la Tabla 29A, o la cual se enlaza al ep ítopo del D R5 como se proporciona en la Tabla 30A.