JP6219923B2 - Ｄｒ５受容体アゴニストの組み合わせ - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2012年3月28日に出願の米国仮特許出願第61/616,929号の利益を主張し、これは本明細書において参照により援用される。

発明の分野
本発明は、癌細胞によって発現されるDR5受容体に特異的に結合し、およびこれらの癌細胞における細胞死を誘導するように協調的に作用する治療薬の組み合わせを使用することによって哺乳動物における癌細胞の成長を阻害する組成物および方法に関する。

TRAIL（TNF関連アポトーシス誘発リガンド）は、サイトカインのTNF（腫瘍壊死因子）ファミリーのメンバーである。TNFファミリーのいくつかのその他のメンバーと共通して、TRAILは、ホモ三量体であり、表面結合型および可溶型の両方として存在し、およびTNF受容体スーパーファミリーのメンバーであるいくつかの受容体に結合する。これらの受容体の２つ、DR4（デスレセプター4）およびDR5（デスレセプター5）は、アポトーシスのシグナルを生じることができる。感受性の標的細胞の表面におけるDR4またはDR5に対するTRAILの結合は、死を誘導するシグナル伝達性に優れた複合体を形成するために重要なステップである受容体クラスター形成、および標的細胞のその後のアポトーシスを誘導する。

また、DR4またはDR5に対して作られる一定のアゴニスト性抗体は、標的細胞の死を誘導することができる。しかし、凝集体が本質的にないこれらの抗体の高度に精製された標品は、最適な受容体クラスター形成およびアポトーシスを誘導するためには、さらなる架橋を必要とする。この架橋は、抗IgG抗体またはタンパク質Gなどの抗体のFc（結晶化可能因子）領域に結合する多価因子によってインビトロにおいて提供することができる。たとえば、Miller et al, J. Immunol., 170：4854-4861 （2003）を参照されたい。前臨床動物モデルにおいて、アゴニスト性抗DR4またはDR5抗体の活性は、IgGのFc領域に結合する受容体とのこれらの相互作用に高度に依存的であり、インビボでの架橋がこれらのFcγ受容体によって媒介されることを示唆する。我々自身およびその他による研究は、ヒトにおける抗DR5抗体架橋を媒介するための重要なFcγRが、それぞれ骨髄およびナチュラルキラー（NK）細胞集団上に主に発現されるFcγRIIおよびFcγRIIIAである可能性が高いことを示した。たとえば、Wilson et al., Cancer Cell 19：101-113（2011）を参照されたい。

TRAIL受容体系によって誘導されるアポトーシスの治療可能性が、可溶性組換えヒトTRAILまたはDR4もしくはDR5に対して作られたアゴニスト性抗体でのヒト臨床試験において調査されてきた。第1相および１b相併合試験では、期待の持てる予備結果をもたらしたが、ランダム化された第２相試験からの所見では、デスレセプターアゴニスト療法からの全体的な統計的に有意な臨床的利益を証明することができなかった。これらの結果についての理由（複数可）は、完全に理解されていないが、1つの可能性のある説明は、可溶性TRAILも抗DR5抗体も、いずれも患者において最適な受容体クラスター形成およびしたがってアポトーシスのシグナリングを誘導しなかったことである。

抗DR抗体の場合では、FcγRを含む細胞との相互作用の必要性がこれらの有効性を制限した可能性がある。たとえば、特定の腫瘍の微小環境においてFcγRを有する細胞は、化学療法毒性の結果として、少なくなり、および／または減少され得る。加えて、座位F158VにおけるNK細胞上のFCGR3A受容体における多型性変異（SNP ID：rs396991）は、抗体のFcドメインとNK細胞との間の結合親和性に有意な相違を引き起こし、当然の帰結として、このような抗体がFcγRIIIA結合を介してアポトーシスを誘導する能力における有意な相違を生じ得る。大部分のヒト患者は、高親和性FCGR3A V158対立遺伝子についてホモ接合性でないため、この変異性は特に問題である。

インビトロにおいて腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する際の抗DR5抗体（AD5-10）とTRAILとの間の相乗作用の報告は、報告されている。Guo et al. (Journal of Biological Chemistry, 280(51): 41940-41952 (2005））。しかし、AD5-10を利用するEl-Gazzarらによるその後の研究は、ナチュラルキラー（NK）細胞の機能がDR5を媒介したアポトーシスの活性化のために必要であることを見いだした。El-Gazzar et al., Mol. Cancer Ther., 9（4）：1007-1018 （2010）。その研究において、NKコンピテントなヒト卵巣癌異種移植マウスモデルでは、腫瘍が根絶されたが、NK枯渇させたマウスでは、AD5-10の細胞毒性活性が消失した。

したがって、当該技術分野に必要であるものは、外来性架橋の必要性の非存在下において有効な受容体クラスター形成を誘導することができるアゴニスト性抗DR5療法である。本明細書では、相乗的に相互作用してDR4および／またはDR5を介してアポトーシスを誘導する、TRAILおよび抗DR結合ポリペプチドの、または結合ポリペプチドの対のアゴニストの組み合わせが提供される。したがって、本発明は、免疫細胞との相互作用の必要性とは独立した強力なアゴニストを提供する。

本発明は、DR5を発現する哺乳動物癌細胞のこの受容体を媒介したアポトーシスを誘導するための組成物を含む。このアポトーシス性組成物は、癌細胞のDR5受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する第1の抗DR5結合ポリペプチドを含む。また、組成物は、DR5受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する第２の抗DR5結合ポリペプチドの少なくとも1つを含む。第1の結合ポリペプチドおよび第２の結合ポリペプチドは、これらの同族受容体（複数可）に特異的に結合することを互いに競合的に阻害しない。第1の結合ポリペプチドおよび第２の結合ポリペプチドの特異的結合は、ナチュラルキラー（NK）細胞を媒介した架橋を必要とすることなく哺乳動物癌細胞のアポトーシスを協調的に誘導するように作用する。あるいは、または加えて、アポトーシス性組成物は、第1の結合ポリペプチドおよび腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（TRAIL）またはDR5受容体に特異的に結合するTRAIL変異体を含むことができる。TRAILまたはその変異体および第1の結合ポリペプチドは、これらの同族受容体に特異的に結合することを互いに競合的に阻害しない。これらの分子の特異的結合は、アポトーシスのナチュラルキラー（NK）媒介を必要とすることなく哺乳動物癌細胞のアポトーシスを協調的に誘導する。いくつかの態様において、哺乳動物癌細胞は、ヒト癌細胞である。いくつかの態様において、第1の抗DR5結合ポリペプチドおよび／または第２の抗DR5結合ポリペプチドは、抗体であり、これは完全ヒト抗体であることができる。いくつかの態様において、第1または第２の抗DR5結合ポリペプチドの少なくとも1つは、NK細胞のFCGR3Aに特異的に結合しない。本発明のアポトーシス性組成物は、ヒトなどの哺乳動物におけるDR5を発現する癌の成長を阻害するために、治療上有効な量で投与することができる。組成物は、化学療法剤の治療上有効な量と組み合わせて投与することができる。

抗DR5抗体（AMG 655）およびFc受容体（N297A）を結合することができないバージョンが、両方ともTRAILと協調して、H460腫瘍異種移植モデルにおいて腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができることを示す。野生型または突然変異体AMG 655のいずれも、このモデルにおいて何ら単剤活性を示さない。 図２Ａは、抗DR5抗体（AMG 655）が、外来性架橋の非存在下においてTRAILおよびLZ-TRAILを媒介したWM35細胞の死滅を増強することを示す。図２Ｂは、フローサイトメトリーによって解析したWM35細胞上の表面DR4およびDR5発現レベルのヒストグラムを示す。 抗DR5抗体（AMG 655）が、TRAILと協調して複数の腫瘍細胞株におけるアポトーシスを誘導することを示す。 抗DR5抗体（AMG 655）が、TRAILと協調して抗体に感受性であるがTRAILに耐性である肺腫瘍細胞株におけるアポトーシスを誘導することを示す。 H838肺癌細胞株において、抗DR5抗体（AMG 655）およびTRAILが、協調して全ての用量にていずれの薬剤単独をも上回る細胞死滅の増大を誘導することを示す。 図６Ａおよび６Ｃは、抗DR5抗体（AMG 655）およびTRAILが、協調せず、それぞれ正常ヒト単球または上皮細胞におけるアポトーシスを誘導しないことを示す。図６Ｂおよび６Ｄは、関連した細胞タイプ上のDR5発現レベルのヒストグラムを示す。 抗DR5抗体のサブセットだけがTRAILと協調してアポトーシスを誘導することができることを示す。 抗DR5抗体の二次元マトリックス、選択した抗体のビン(bin)および抗体の一定の対が協調作用を示すことを示す。 Colo205およびH460細胞における抗DR5抗体対または抗DR5抗体プラスTRAILのインビトロでの相対死滅活性を示す。 Colo205腫瘍異種移植モデルにおけるFc受容体と相互作用しない２つのIgG2抗DR5抗体間の協調作用を示す。

詳細な説明
本発明は、一つには、DR5および／またはDR4を発現する哺乳動物癌細胞のアポトーシスを誘導するための組成物および方法に関する。本発明の組み合わせは、FCGR3Aに対する特異的結合を必要とすることなく、およびしたがってNK細胞を媒介したアポトーシスの誘導を必要とすることなく、アポトーシスを誘導することができる。本発明は、NK細胞依存的およびNK細胞非依存的経路を介してアポトーシスを媒介するように作用することができる組み合わせを提供する。したがって、本発明は、腫瘍微小環境におけるNK細胞の量の変動に対し、並びにFCGR3Aの多型形態に対するIgG1抗体の親和性の相違に対し、さもなければ感受性であるNK細胞依存的な組成物よりも有効な抗癌治療薬を提供する。

節の見出しは、組織化目的のためにだけ本明細書において使用され、および形はどうあれ記述された主題を限定するように解釈されない。本明細書において引用した全ての特許、特許出願およびその他の文書の開示は、これらの全体が参照により本明細書に明白に援用される。具体的定義が提供されない限り、本明細書において記述される生化学および分子生物学と関連して利用される命名法、並びにその実験法および技術は、当該技術分野において周知および一般に使用されるものである。標準的技術を、生化学的合成、生化学的解析、医薬品調製、製剤および送達および患者の治療のために使用してもよい。提供した定義は、定義された用語およびその変形に及ぶ。

FcポリペプチドなどのFcとの関連における用語「非フコシル化」または「非フコシル化された」は、EUインデックス(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))に従って番号付けされたヒトIgG1 Fcの残基297、または非IgG1もしくは非ヒトIgG1免疫グロブリンにおける対応する残基に直接または間接的に共有結合で付着されるフコース部分の実質的欠如をいう。したがって、複数の非フコシル化されたFcポリペプチドを含む組成物において、Fcポリペプチドの少なくとも70%は、Fcの残基297にて、直接または間接的に（たとえば、介在糖を経て）フコシル化されていないだろうし、およびいくつかの態様において、少なくとも80%、85%、90%、95%または99%は、Fcの残基297にて直接または間接的にフコシル化されないだろう。当業者であれば、本発明との関連において、FCGR3Aに対する親和性を増大する際の非フコシル化と生物学的に類似する生物学的に不活性なFcのフコシル化を作ることができるであろうことを認識するだろう。このような構築物は、定義された用語の範囲内に含まれるものと理解される。

用語「アポトーシス」は、一般にDR4および／またはDR5受容体のアゴニストによって開始される特定のプログラムされた細胞死を誘導する機構をいう。理論によって拘束されないが、これらの受容体のアゴニズムによって誘導される細胞死は、アポトーシスを経て進行すると考えられる。しかし、定義された用語は、その特異的機構に限定されず、プログラムされた細胞死のその他の形態を介して進行し得る。

結合するポリペプチドの活性との関連において、用語「アゴニスト」または「アゴニスト性」または「アゴナイズする」は、細胞表面上にDR4および／またはDR5を発現するヒト癌細胞などのアポトーシス感受性の哺乳動物癌細胞におけるDR5および／またはDR4受容体を介したアポトーシスの誘導を媒介する際のその機能をいう。アポトーシスに感受性の例示的なヒト癌細胞は、Colo205（ATCC CCL-222）である。DR5アゴニストは、DR5を介してアポトーシスを誘導するだろうし、DR4アゴニストは、DR4を介してアポトーシスを誘導するだろうし、二重DR5/DR4アゴニスト（たとえば、TRAILリガンドまたは二重特異性アゴニスト性抗DR4/DR5抗体）は、DR4およびDR5の両方を介してアポトーシスを誘導することができる。アポトーシスの誘導がDR5および／またはDR4を介して媒介されるかどうかは、当該技術分野において公知の方法および試薬を使用して決定することができる。したがって、たとえば、アポトーシス感受性のDR特異的細胞株は、当該技術分野において公知である。例示的なDR5（+）/DR4（-）細胞株は、WM35（ATCC CRL-2807）である。例示的なDR5（-）/DR4（+）細胞株は、ST486（ATCC CRL 1647）である。

用語「抗体」は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方の単離された形態に対する言及を含み、このような抗体が、全体でまたは一部分で、免疫化を経て、組換え技術を介して、インビトロ合成の手段により、またはその他の方法で産生されるかどうかにかかわらず、1）ヒト、ヒト化およびキメラ抗体、2）単一特異的（たとえば、DR5またはDR4）または多重特異的抗体（たとえば、DR4およびDR5）、および3）モノクローナルまたはポリクローナル抗体の任意の組み合わせを含む。したがって、用語「抗体」は、（a）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（たとえば、マウス）から単離された抗体またはそこから調製されるB細胞もしくはハイブリドーマ、（b）抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞（たとえば、トランスフェクトーマ）から単離された抗体、（c）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体および（d）免疫グロブリン遺伝子配列のその他のDNA配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製され、発現され、作製され、または単離された抗体などの、組換え手段によって調製され、発現され、作製され、または単離された抗体を含む。また、抗体は、Fab、F（ab'）₂、scFv（単鎖Fv）およびダイアボディーなどの誘導体などの抗体断片を含む。いくつかの態様において、本発明の抗体は、ヒト化されたモノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体である。典型的には、本発明の抗体は、IgG1またはIgG2サブクラス抗体であるだろう。抗体は、約10nM、5nM、1nMまたは500pM未満のKdでその標的を結合し得る。

用語「結合ポリペプチド」は、哺乳動物DR5および／またはDR4などの標的に特異的に結合するポリペプチドを意味する。DR5に特異的に結合する結合ポリペプチドは、「抗DR5結合ポリペプチド」といわれ、一方DR4に特異的に結合する結合ポリペプチドは、「抗DR4結合ポリペプチド」といわれる。DR5およびDR4の両方に特異的に結合する結合ポリペプチド（二重特異性分子など）は、「抗DR4/抗DR5結合ポリペプチド」といわれる。結合ポリペプチドは、たとえば、溶解性または薬物動態学的特性を増加させるために、誘導体化（derivitized）させることができる。たいてい、結合ポリペプチドは、ヒトIgG1 FcなどのFCGR3Aに結合することができるFc（結晶化可能断片）を含む。例示的な結合ポリペプチドは、抗体、ペプチボディーおよびFcポリペプチドを含む。

用語「競合的に阻害する」は、特定の標的に対する結合ポリペプチドのある種の特異的結合の、標的に対する結合ポリペプチドの第２の種の特異的結合による測定可能な阻害（部分的または完全）を意味する。競合ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）アッセイなど、競合の程度を定量化するために様々な方法が公知である。Buxton et al., Infect Immun. 27（2）：405-10 （1980）を参照されたい。

結合ポリペプチドなどの治療薬の組み合わせ（すなわち、「アポトーシス性組成物」）による細胞死（たとえば、アポトーシス）の誘導との関連において、用語「協調する」、「協調的」または「協調的に」は、細胞死を誘導する際の組み合わせの活性が、いずれか一方の薬剤の活性を上回ることを意味する。したがって、協調作用は、組み合わせにおける各薬剤の活性の少なくとも部分的に相加的、少なくとも完全に相加的または完全に相加的を上回る（すなわち、相乗的）ことができる。協調作用は、有効性、作用強度または両方に関して評価することができる。

用語「架橋」は、DR5および／またはDR4受容体の一方または両方の受容体を発現する細胞上のクラスター形成を意味する。理論によって拘束されないが、デスレセプターのクラスター形成がアポトーシスの誘導の役割を担うと考えられる。架橋は、外来性架橋薬を使用してインビトロにおいて達成することができる。架橋は、FCGR3A NK細胞またはマクロファージなどの内因性（すなわち、天然に存在する）架橋剤を使用してインビボで達成することができる。

用語「誘導」または「誘導体」は、半減期、生物学的利用能、免疫原性、溶解性、毒性、作用強度または有効性などの特徴を変化させ、一方でその治療上の利益を保持する、または増強するように、それを直接または間接的に共有結合で連結することによる、結合ポリペプチド（抗体など）および／または化学療法剤の修飾をいう。誘導体は、グリコシル化、ペグ化および脂質化によって、またはタンパク質抱合によって作製することができる。例示的な誘導体化（derivitizing）薬は、直鎖状重合体（たとえば、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリリジン、デキストラン、その他）；分枝鎖重合体（たとえば、1981年9月15日に発行されたDenkenwalterらに対する米国特許第4,289,872号；1993年7月20日に発行されたTamに対する米国特許第5,229,490号；1993年10月28日に公開されたFrechetらによる国際公開第93/21259号を参照されたい；脂質またはリポソーム；コレステロール基（ステロイドなど）；炭水化物またはオリゴ糖を含む。

用語「DR4」または「デスレセプター4」または「TRAIL-R1」または「TR-1」は、米国特許第6,342,363号（参照により本明細書に援用される）の配列番号2に記載された468アミノ酸ポリペプチド、並びに対立遺伝子変異体、スプライス変異体およびポリペプチドの成熟形態（すなわち、リーダー配列を欠く）などの関連した天然の（すなわち、野生型）ヒトポリペプチドをいう。用語「DR4」または「デスレセプター4」または「TRAIL-R1」または「TR-1」は、非ヒト哺乳動物（複数可）に対する言及において、その哺乳動物の相同的受容体をいう。

用語「DR5」またはTRAIL-R」または「Apo-2」または「TR-2」または「TRAIL受容体-2」は、米国特許第7,528,239号の配列番号2に記載された440アミノ酸ポリペプチド、並びにポリペプチドの成熟形態を含む（すなわち、リーダー配列を欠いている）米国特許第6,342,369号の配列番号1に、および米国特許第6,743,625号（各特許は、参照により本明細書に援用される）の配列番号2にて記載された411アミノ酸アイソフォームなどの、しかし限定されない対立遺伝子変異体またはスプライス変異体などの関連した天然の（すなわち、野生型）ヒトポリペプチドをいう。用語「DR5」またはTRAIL-R」または「Apo-2」または「TR-2」または「TRAIL受容体-2」は、非ヒト哺乳動物（複数可）に対する言及において、その哺乳動物の相同的受容体をいう。

用語「有効量」または「治療上有効な量」は、DR5（および／またはDR4）感受性の癌の治療のために、単独（すなわち、単独療法として）または化学療法剤と組み合わせてエキソビボで（患者からの癌細胞との接触によって）またはインビボで（患者への投与によって）投与されたときに、癌進行の統計的に有意な阻害をもたらす結合ポリペプチドの量および／または濃度をいう。いくつかの実施形態において、患者は、ヒト患者である。本明細書に使用される、用語癌の「治療」または「阻害する」、「阻害すること」または「阻害」は：限定されないが、固形腫瘍のための応答評価基準（RECIST）などの標準的な基準によって測定したときの、腫瘍成長の速度における統計的に有意な減少、腫瘍成長の停止または腫瘍のサイズ、質量、代謝性活性もしくは体積の減少、または無増悪生存期間（PFS）もしくは全体生存率（OS）における統計的に有意な増大の少なくとも1つをいう。

「Fcポリペプチド」との関連における用語「Fc」は、ヒトFCGR3Aまたは非ヒト哺乳動物におけるその相同体に特異的に結合する免疫グロブリンのFc（結晶化可能断片）をいう。Fcは、天然に存在する（「天然の」）ヒトIgG1 Fcであることができるだけでなく、FCGR3A（またはその相同体）に特異的に結合するIgG1 Fcの切断型（「切断型Fc」）またはアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって作製された天然に存在するIgG1 Fcの変異体（「Fc変異体」）であって、変異体FcがFCGR3Aに特異的に結合するものを含む。切断型Fcは、全長Fcの少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%であることができる。切断型FcのまたはFc変異体の置換、欠失または付加の数は、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15または20であることができる。FCGR3Aに対する切断型FcまたはFc変異体の特異的結合は、ELISAなどの方法によって定量化したときに、一般に天然のFc特異的結合の少なくとも80%、85%、90%または95%である。

用語「FCGR3A」または「CD16a」「Fcγ受容体IIIA」または「FcγRIIIA」は、同じ指定のヒトFc受容体を意味する。「F158V」と称されるヒトIgG受容体FcγRIIIA（CD16a）の双対立遺伝子の多型は、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）一塩基多型（SNP）データベースにてクラスター報告rs396991にて同定された座位にて、アミノ酸バリン（V）またはフェニルアラニン（F）の存在によって区別することができる。これらの２つの対立遺伝子の形態は、一般にヒトFcγRIIIAのrs396991 SNP座位にて残基バリンを有する多型について「バリン158」または「V158」およびヒトFcγRIIIAのrs396991 SNP座位にて残基フェニルアラニンを有する多型について「フェニルアラニン158」または「F158」と文献において、および本明細書においていわれる。また、Leppers-van de Straat et al., J. Immunological Methods, 242: 127-132 (2000)およびRavetch and Perussia, J. Exp. Med., 170:481-497 (1989)を参照されたい。

用語「Fcポリペプチド」は、FcとDR5（抗DR5結合ポリペプチド）および／またはDR4（抗DR4結合ポリペプチド）に特異的に結合する少なくとも1つの結合ポリペプチドとの間の共有結合性付着の産物をいう。Fcおよびポリペプチドの融合は、直接の共有結合（たとえば、ペプチド結合を介する）または間接的な共有結合（たとえば、人工の化学的リンカーを介する）を介してもよい。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、アゴニストのFcポリペプチドである。例示的なFcポリペプチドは、抗体、ペプチボディー（国際公開第2000/24782号、参照により本明細書に援用される）、アビマー（avimers）（Nature Biotechnology 23, 1556-1561（2005）、Fc可溶性受容体抱合体、Covx体（国際公開第2008/056346号；ターゲティングペプチドに抱合された抗体、たとえば米国特許第7,521,425号、参照により本明細書に援用される）、または細胞毒、または治療薬（たとえば、抗体薬物抱合体（「ADC」））、またはFcヒトTRAILリガンド融合物を含む。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、二価である。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、二価の、および二重特異性である。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、２つのIgG1 Fcを含むホモ二量体であり、およびいくつかの態様において、Fcポリペプチドは、1つのIgG1 Fcおよび1つの非IgG1 Fcを含むヘテロ二量体である。いくつかの態様において、ホモ二量体およびヘテロ二量体は、完全ヒト抗体である。

Fcポリペプチドとの関連において、用語「高親和性である」は、Fcが、F158対立遺伝子についてホモ接合性であり、同一であるが非フコシル化されたヒトFcポリペプチド（たとえば、抗体）またはイソロイシンからグルタミン酸への置換などの残基332にてFCGR3A親和性を増大するような修飾を含む同一のヒトFcポリペプチドの少なくとも1つと同じ親和性で、天然の細胞（たとえば、ヒトNK細胞）によって発現されるヒトFCGR3Aに特異的に結合するように修飾され、または構築される（KabatのEUインデックスに準拠；米国特許第7,317,091号または米国特許第7,662,925号を参照されたい）。一般に、高親和性Fcポリペプチドは、V158対立遺伝子についてホモ接合性の天然の細胞によって発現されるヒトFCGR3Aに特異的に結合する天然のフコシル化されたFcポリペプチドと少なくとも同じ親和性で、ヒトFCGR3Aに特異的に結合する。結合親和性を測定する手段は、当該技術分野において公知であり、およびAlphaLISA（商標）（Perkin Elmer、Mass. USA）ELISAアッセイなどの競合アッセイを含むが、限定されない。Poulsen, J., et al. 2007. J. Biomol Screen. 12:240; Cauchon, E., et al. 2009. Anal Biochem.を参照されたい。

用語「宿主細胞」は、本発明の結合ポリペプチドをコードする核酸を発現するために使用することができる細胞をいう。宿主細胞は、原核生物（たとえば、大腸菌（E. coli））であることができる、またはそれは真核細胞、たとえば単細胞真核生物（たとえば、酵母またはその他の真菌）、植物細胞（たとえば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（たとえば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）またはハイブリドーマであることができる。宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはVeggie CHOおよび無血清培地において増殖する関連した細胞株（Rasmussen et al., Cytotechnology 28：31、1998を参照されたい）またはDHFRにおいて欠損があるCHO株DX-B11（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216-4220, 1980を参照されたい）などのこれらの派生物を含む。

用語「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」は、定常領域およびフレームワークの両方が完全に、または実質的にヒト配列からなり、その結果、ヒトに投与されたときにヒト抗体が典型的にはそれ自体に対して免疫原性反応を実質的に誘発せず、好ましくは、検出可能な免疫原性反応を誘発しない抗体をいう。したがって、定義した用語は、たとえば、改善された製剤、安定性または製造性（たとえば、不対システイン残基の除去）を可能にするために天然のヒト抗体配列に関して行われた軽微なアミノ酸の修飾（たいてい、1、2、3、4または5アミノ酸置換、付加または欠失を超えない）を想定する。

用語「ヒト化抗体」は、定常領域の実質的に全てがヒト免疫グロブリンに由来する、または対応し、一方で、1つまたは複数の可変領域の全部または一部が別の種（たとえば、マウス）に由来する単離された抗体をいう。

用語「単離された」は、化合物であって、：（1）それが発現された状態において混合されている細胞成分から実質的に精製され（たとえば、少なくとも60%、70%、80%または90%）、その結果それが存在する主な種である、（2）それが天然において連結されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたはその他の部分に抱合されている、（3）より大きなポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の一部として天然において存在しない、（4）明確に定義された組成物において異なる特異性を有するその他の化学的または生物学的薬剤と結合されている、または（5）天然において他に見いだされないヒトが操作した配列を含む、化合物をいう。

Fcポリペプチドなどの結合ポリペプチドに関して、用語「低親和性」は、これらがヒトNK細胞などの哺乳動物NK細胞上のFCGR3Aに対する特異的結合がない、または実質的にないことを意味する。いくつかの態様において、低親和性は、FcポリペプチドのFcの除去、切断または修飾によって（たとえば、非グリコシル化によって）生じ、その結果、それがFCGR3Aに特異的に結合する能力を欠き、または実質的に欠く。

用語「哺乳動物」は、具体的には、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、カニクイザル、イヌ、ネコ、マウスまたはラットの少なくとも1つに対する言及を含む。

用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、典型的には同じ核酸分子によってコードされる、（たとえば、グリコシル化および／またはシグナル配列切断などの翻訳後修飾によって生じる軽微な変異性にも関わらず）単一の分子組成物の単離された抗体分子の標品をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。一定の態様において、モノクローナル抗体は、単一のハイブリドーマまたはその他の細胞株（たとえば、トランスフェクトーマ）によって、またはトランスジェニックB細胞からのクローニングなどのトランスジェニック哺乳動物から産生される。用語「モノクローナル」は、抗体を作製するための任意の特定の方法に限定されない。いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。

用語「天然に存在する」または「天然の」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞および同様のものなどの生物学的材料に関して使用されるときに、天然において見いだされ、かつヒト介入によって修飾されないものをいう。

用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体またはそのキメラをいい、他に限定されない限り、参照配列の相補鎖を包含する。核酸配列は、調節配列が核配列の発現（たとえば、発現のレベル、タイミングまたは位置）に影響を及ぼす場合、調節配列に「作動可能に連結されている」。「調節配列」は、第２の核酸の発現（たとえば、発現のレベル、タイミングまたは位置）に影響を及ぼす核酸である。したがって、調節配列と第２の配列との間の機能的結合により、調節配列が第２の配列に対応するDNA配列の転写を開始し、および媒介するような場合、調節配列および第２の配列は、作動可能に連結されている。調節配列の例は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列のさらなる例は、たとえばGoeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CAおよびBaron et al., Nucleic Acids Res. 23: 3605-3606, 1995に記述されている。

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、全体に交換可能に使用され、およびペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸残基鎖を含む分子をいう。また、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、ヒドロキシル化およびADPリボシル化を含むが、限定されない修飾を含む。

用語「ペプチボディー」は、特定のタイプの結合ペプチドおよびより具体的には、あるタイプのFcポリペプチドをいう。いくつかの態様において、ペプチボディーのFcは、ヒトIgG1またはIgG2 Fcである。ペプチボディーの構造および産生は、2000年5月4日に公開されたPCT公開国際公開第00/24782号において一般に記述されており、参照により本明細書に援用される。例示的なペプチドは、ペプチドライブラリー（たとえば、ファージディスプレイライブラリー）に保有される、化学的合成によって生成される、タンパク質の消化に由来する、または組換えDNA技術を使用して産生されるなど、本明細書に記載した方法のいずれかによって産生してもよい。

用語「ペプチボディー断片」または「抗体断片」は、完全な無傷のペプチボディーまたは抗体未満を含むが、その標的分子（すなわち、ヒトDR5またはヒトDR4）に特異的に結合する能力を保持するペプチボディーまたは抗体のペプチドをいう。例示的な断片は、F（ab）またはF（ab'）2断片を含む。このような断片は、たとえば、アミノ末端における切断、カルボキシ末端における切断および／またはアミノ酸配列からの残基（複数可）の内部欠損によって生じ得る。断片は、オルタナティブRNAスプライシングにより、またはインビボもしくはインビトロプロテアーゼ活性により生じ得る。また、このような断片は、化学的ペプチド合成法によって、または抗体もしくはペプチボディーをコードするポリヌクレオチドを修飾することによって構築してもよい。

用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、全体に交換可能に使用され、およびDNA分子（たとえば、cDNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（たとえば、mRNA）およびそのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。

用語「特異的に結合する」は、特定の結合条件下で、本発明の結合ポリペプチドが標的（たとえば、ヒトDR5、ヒトDR4またはヒトFCGR3A）に対し、その親和性が十分な統計的サイズのランダムペプチドまたはポリペプチドの集まりに対する同じ分子の平均親和性の少なくとも10倍大きい、しかし任意に50倍大きい、100、250もしくは500倍大きいまたはさらに少なくとも1000倍大きいように結合する能力をいう。結合ポリペプチドは、単一の標的分子だけに結合する必要はないが、標的と非標的との間の構造的なコンフォメーション（たとえば、パラログまたはオルトログ）における類似性のため、対象外の分子に特異的に結合してもよい。当業者であれば、動物の異なる種において同じ機能を有する分子（すなわち、オルトログ）に対する、または標的分子と実質的に類似のエピトープを有する分子（たとえば、パラログ）に対する特異的結合が、独特の非標的（たとえば、ランダムポリペプチド）の統計学的に有効な集まりに関して決定される用語「特異的結合」の範囲内であることを認識するだろう。したがって、本発明の抗DR5結合ポリペプチドは、DR5およびDR4の両方に対する特異的結合（すなわち、交差反応）など、標的分子の複数の異なる種に特異的に結合してもよい。固相ELISA免疫アッセイを、特異的結合を決定するために使用することができる。一般に、特異的結合は、少なくとも約1×10⁷M^-1およびたいてい少なくとも1×10⁸M^-1、1×10⁹M^-1または1×10¹⁰M^-1の会合定数で進行する。

本発明の結合ポリペプチドなどの治療薬の組み合わせ（すなわち、「アポトーシス性組成物」）によるアポトーシスの誘導との関連において、用語「相乗作用」、「相乗作用性の」「相乗作用性に」または「相乗作用する」は、細胞死を誘導する際の（たとえば、アポトーシスを経て）組み合わせの活性が各薬剤の相加的効果を上回ることを意味する。相加性過剰は、相乗的活性が完全な相加性のものを超える量である。

用語「TRAIL」、「ガン腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド」または「Apo2リガンド」は、TNF受容体スーパーファミリーの4つのメンバー（TRAIL受容体1〜4）と、並びに可溶性オステオプロテジェリン（「OPG」）受容体と相互作用するホモ三量体リガンドである。本用語は、ヒトTRAIL（米国特許第6,046,046号；同第6,284,236号；同第6,998,116号を参照されたく、それらの全てが参照により本明細書に援用される）、並びに一般にマウス、ラットおよびカニクイザルを含む哺乳類において見いだされる相同体を含む。アゴニスト性（アポトーシス誘導する）TRAIL変異体は、生じる分子がDR4および／またはDR5を発現するアポトーシス感受性細胞（たとえば、Colo205）に関してアゴニスト活性を保持するように、TRAILの多量体形態（たとえば、二量体、三量体）、LZ（ロイシンジッパー）-TRAILなどのTRAILの切断されたバージョンまたはTRAILの誘導体化された、もしくは組換えで修飾されたバージョンを含む。TRAILおよびTRAIL変異体は、米国特許公開第20060141561号および米国特許第7,994,281号において詳述されており、その両方が参照により本明細書に援用される。

用語「ベクター」は、宿主細胞への本発明のポリヌクレオチドの導入に使用される核酸をいう。ベクターは、たいていレプリコンである。発現ベクターは、適切な宿主細胞に、または適切なインビトロ条件下に存在するときに、その中に挿入された核酸の転写を可能にする。

抗DR5結合ポリペプチドおよび前述のものをコードするポリヌクレオチド
本発明の結合ポリペプチドは、特定の結合条件下で、哺乳動物癌細胞などの哺乳動物細胞上に発現された哺乳動物DR5（抗DR5結合ポリペプチド）および／またはDR4（抗DR4結合ポリペプチド）の細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様において、結合ポリペプチドが特異的に結合するDR5および／またはDR4受容体は、ヒト、カニクイザル、ラットまたはマウス癌細胞上に発現されるだろう。いくつかの態様において、結合ポリペプチドは、2種以上の哺乳動物のDR4および／またはDR5受容体に特異的に結合するだろう。たとえば、本発明の結合ポリペプチドは、少なくともヒトおよびカニクイザルの両方のDR4および／もしくはDR5または少なくともヒトおよびネズミDR4および／もしくはDR5受容体に特異的に結合することができる。したがって、哺乳類の2種以上に対する結合ポリペプチドの交差反応性は、本発明の範囲内に含まれる。

いくつかの態様において、本発明の結合ポリペプチドは、それがターゲットされるDR5および／またはDR4受容体のアゴニストである。その他の態様において、これは、ターゲットされる受容体のアゴニストでない。したがって、たとえば、第1のFcポリペプチド単独では、特定のデスレセプターに向けてインビトロおよび／またはインビボにおいて検出可能なアゴニスト活性をそれ自体で示し得ない一方で、TRAILまたは第２のFcポリペプチドとの組み合わせにおいて、これらは、共同で協調して、TRAILまたは第２のFcポリペプチド単独によって示されるものを上回るそのDR5および／またはDR4受容体に向けたアゴニスト活性を示すだろう。しかし、その他の態様において、第1のFcポリペプチドは、TRAILまたは第２のFcポリペプチドと協調することに加えて、ある程度のそれ自体のアゴニスト活性を示すだろう。抗DR5結合ポリペプチドは、限定されないが：Colo205（結腸）、WM35（結腸）、H1975（肺）、SK-MES-1（肺）、HCC38（乳房）、H2122（肺）、SkLu1（肺）またはH460（肺）などのDR5を発現する哺乳動物細胞での周知のインビトロおよび／またはインビボアポトーシスアッセイを使用してアゴニストであることを証明することができる。

いくつかの態様において、本発明の結合ポリペプチドは、外因性架橋依存的であり、これらは、インビトロにおいてアポトーシス感受性細胞におけるアポトーシスを誘導するために、プロテインGなどの外来性架橋薬の存在を必要とする。逆に、いくつかの態様において、本発明の結合ポリペプチドは、外来性架橋に非依存的であり、これらは、外来性架橋薬を伴わずにインビトロにおいてアポトーシス感受性細胞におけるアポトーシスを誘導する。抗DR4および／または抗DR5結合ポリペプチドの外因性架橋依存性または非依存性についてアッセイする方法は、アポトーシス感受性のDR4および／またはDR5哺乳動物株化細胞（上記）であるとして当該技術分野において公知である。例示的な外来性架橋薬剤は、結合ポリペプチドに特異的に結合する二次抗体を含み、二次抗体は、固体支持体をコーティングする、またはリポソーム膜の成分である、またはプロテインAもしくはプロテインGの使用である。理論によって拘束されないが、デスレセプターのクラスター形成は、アポトーシスの誘導機構における役割を担うと考えられる。したがって、外因性架橋薬剤は、結合ポリペプチドに対して特異的に結合すること、およびそのクラスター形成することを介して、DR4および／またはDR5をクラスター形成するように作用する。

いくつかの態様において、本発明の結合ポリペプチドは、抗体またはペプチボディーなどのFcポリペプチドである。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、IgG1またはIgG2抗体などのヒト抗体である。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、二重特異性Fcポリペプチドであり、したがって、DR5またはDR4上の２つの異なる部位に特異的に結合する、またはDR4およびDR5の両方に特異的に結合する。Fcポリペプチドは、そのそれぞれが独特の部位に結合する結合ポリペプチドの２つの異なる種（二価）を含むことによってこれらの標的上の異なる部位に二重特異性を示すことができる。あるいは、Fcポリペプチドの二重特異性は、構造において十分な類似性を有する２つの独特の部位に対する結合ポリペプチドの単一種の（一価の）交差反応性によって生じ得る。このような交差反応性の結合ポリペプチドは、DR4およびDR5の両方上の領域に、これらの２つのデスレセプター間の実質的相同性のために、特異的に結合するように作製することができる。

当業者であれば、抗体などのFcポリペプチドのFcを、FCGR3A受容体に対する特異的結合親和性を増大する、または減少するように修飾することができることを認識するだろう。高親和性IgG1 Fcポリペプチドに関する組成物および方法は、2011年5月13日に国際出願されたGravesらの国際特許出願PCT/US2011/036521において考察されており、この全ての内容は、参照により本明細書に援用される。高親和性Fcポリペプチドは、哺乳動物（たとえば、ヒト）FCGR3Aに対する親和性を増大するために、非フコシル化されたFcを含むことができる。いくつかの態様において、Fcは、非フコシル化された完全ヒトIgG1 Fcである。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、非フコシル化された完全ヒトIgG1モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、非フコシル化された完全ヒトIgG1モノクローナル抗体は、ヒトDR5および／またはヒトDR4に特異的に結合する。したがって、いくつかの態様において、非フコシル化された完全ヒトIgG1モノクローナル抗体は、ヒトDR5およびヒトDR4に特異的に結合する二重特異性抗体である。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、ヒトDR5に特異的に結合するが、ヒトDR4に特異的に結合しない（すなわち、交差反応しない）完全ヒトIgG1モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、ヒトDR4に特異的に結合するが、ヒトDR5特異的に結合しない（すなわち、交差反応しない）。非フコシル化された抗体またはFc融合ペプチドを作製する方法は、当該技術分野において公知であり、細胞のフコシルトランスフェラーゼ機能または発現を阻害するために遺伝的（たとえば、siRNA）または化学的手段を使用する組換え発現、フコシルトランスフェラーゼのための遺伝子を欠損した（たとえば、fut8ノックアウト）宿主細胞を使用すること、またはインビトロにおける化学的または酵素的手段によってFcをフコシル化することを含むが、限定されない。たとえば、参照により本明細書に援用される米国特許第6,946,292号を参照されたい。当業者であれば、本発明の複数の高親和性Fcポリペプチドを含む組成物が増強された抗癌活性を示すために100%非フコシル化される必要はないが、一般に少なくとも40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%非フコシル化されたFcポリペプチドを含むことを認識するだろう。

もう一つのアプローチにおいて、本発明は、米国特許第7,317,091号（参照により本明細書に援用される）に記載されているように、Fcが、増強されたFCGR3A親和性をもたらす少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアゴニスト性高親和性Fcポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、上述したアミノ酸置換を含むFcは、ヒトIgG1 Fcである。いくつかの態様において、FCGR3A結合を増強するための少なくとも1つのアミノ酸置換を含むFcポリペプチドは、完全ヒトIgG1モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、完全ヒトIgG1モノクローナル抗体は、ヒトDR5および／またはヒトDR4に特異的に結合する。したがって、いくつかの態様において、完全ヒトIgG1モノクローナル抗体は、ヒトDR5およびヒトDR4に特異的に結合する二重特異性抗体である。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、ヒトDR5に特異的に結合するが、ヒトDR4に特異的に結合しない（すなわち、交差反応しない）完全ヒトIgG1モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、ヒトDR4に特異的に結合するが、ヒトDR5特異的に結合しない（すなわち、交差反応しない）。いくつかの態様において、Fcは、残基：230、233、234、235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、324、325、326、328、330、332および335の少なくとも1つの置換を含み、Fc領域における残基の番号付けは、KabatのEUインデックスのものである。いくつかの態様において、Fcは、P230A、E233D、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、N325T、K326I、K326T、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335RおよびT335Yからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、番号の前の文字は、置換残基を1文字アミノ酸コードで表し、番号は、KabatのEUインデックスに準拠して番号付けしたFcの残基を示し、および番号後の文字は、天然の残基を示す。いくつかの態様において、高親和性Fcポリペプチドは、上記の通りにFCGR3A親和性を増強するための非フコシル化されたFcおよびアミノ酸置換の両方を含む。いくつかの態様において、FcポリペプチドのFcは、FCGR3Aに対する親和性を増大するために1、2、3、4、5、6、7、8、9または10の置換を含む。

FcポリペプチドのFcは、FCGR3A受容体に対する特異的結合親和性を減少させるために修飾することができる。低親和性Fcポリペプチドは、NK細胞またはマクロファージなどのFCGR3Aを有する細胞によって架橋される能力の減少があり、およびしたがって、DR5および／またはDR4に特異的に結合する低親和性Fcポリペプチドは、NKもしくはマクロファージによって媒介されるアポトーシスを減少させる、または無くすように構築すること、および利用することができる。FCGR3Aに対するFcの特異的結合を減少させる、または実質的に無くす方法は、当該技術分野において公知である。低親和性Fcポリペプチドは、N297A 非グリコシル化突然変異を含むヒトIgG1 Fcを提供することによって、IgG2 Fcの使用、低親和性Fcポリペプチドをもたらすように酵素的および／もしくは化学的に非グリコシル化されたFcの使用または低親和性Fcポリペプチドをもたらすようにグリコシル化が阻害され、もしくは防止されている宿主細胞から、もしくは培地において作製されたFcポリペプチドの使用などの多様な手段によってFcポリペプチドのFcを構築すること、または修飾することによって得ることができる。したがって、一つの側面において、本発明は、Fcポリペプチドの非グリコシル化されたFcを提供する。いくつかの態様において、FcポリペプチドのFcは、IgG2 Fcである。いくつかの態様において、IgG1またはIgG2 Fcは、ヒトFcである。いくつかの態様において、FcポリペプチドのFcは、その位置にて非グリコシル化を生じるN297A置換を含む。Sazinsky, et al., PNAS 105：20167-20172 （2008）を参照されたい。一定の態様において、N297A置換を含むFcは、ヒトIgG1 Fcである。いくつかの態様において、本発明は、FCGR3Aに特異的に結合することができないようにFcが十分に切断されたFcポリペプチドを含む。

本発明のFcポリペプチドを同定する、単離する、またはその他に作製する方法は、当業者に公知である。本発明のFcポリペプチドのポリペプチド成分は、ファージまたはポリペプチドライブラリーなどの多数の供給源から得ることができる。ファージまたはポリペプチドライブラリーを作製する、およびスクリーニングする方法は、当該技術分野において周知である。また、ファージおよびポリペプチドライブラリーは、市販されている。所望の特異的結合特性を有するポリペプチドは、直接または間接的に（すなわち、リンカーを介して）Fcに共有結合してFcポリペプチドを得ることができる。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、完全ヒトモノクローナル抗体などの二価IgG1抗体である。いくつかの態様において、Fcポリペプチドのポリペプチドは、抗体のscFv（単鎖Fv）、FabまたはF（ab'）₂断片である。高親和性または低親和性Fcポリペプチドを得るために本発明の方法に従って修飾することができる代表的なFcポリペプチドは、抗DR5抗体コナツムマブ（conatumumab）（Amgen Inc.）を含む。一つの態様において、Fcポリペプチドは、ヒトTRAIL（TNF受容体アポトーシス誘発リガンド）、並びに抗DR5および／またはDR4ペプチドを含む二重特異性多価Fcポリペプチドである。

本発明のFcポリペプチドのFcは、組換え発現方法、固相ペプチド合成法、ヒト免疫グロブリンなどの天然の供給源から単離させること、またはこれらの方法の組み合わせを含むが、限定されない、当該技術分野において周知の多様な方法によって得ることができる。いくつかの態様において、Fcは、ヒトIgG1である。一定の態様において、1つのアイソタイプのFcは、アイソタイプスイッチングによって異なるアイソタイプに変換される。アイソタイプスイッチングの方法は、とりわけ、直接の組換え技術および細胞-細胞融合技術（たとえば、米国特許第5,916,771号を参照されたい）を含むが、限定されない。一定の態様において、Fcは、ヒトIgG2、IgG3またはIgG4サブクラスからヒトIgG1サブクラスに変換される。当業者であれば、溶解性、製造性、安定性およびバイオ医薬品の製造に関連するその他の因子を最適化するために、天然のヒトIgG1のいくつかのアミノ酸残基を修飾することができるが、なおもヒトIgG1の定義内であることを認識するだろう。一般に、合計最大15を超えない残基が、欠失され、付加され、および／または置換され、たいてい10、9、8、7、6、5、4、3、2または1を超えない。しかし、FcポリペプチドのFcは、Fcポリペプチドの薬物動態学的または薬力学的特性を増強するために、標識、毒素、薬物、組織特異的結合剤および同様のものと直接または間接的に連結することができる。

いくつかの態様において、Fcポリペプチドの二価（すなわち、２つの抗原結合部位）、三価またはより高次の構造を作製するために、２つ以上のFcポリペプチドをシステイン-システインジスルフィド結合によってなど、共有結合で互いに結合することができる。抗体などの二価Fcポリペプチドは、単一特異的であること、および標的の単一のエピトープに特異的に結合すること、または同じ標的（たとえば、ヒトDR5またはヒトDR4）上の２つの独特のエピトープまたは異なる標的（たとえば、ヒトDR4およびヒトDR5）の２つの独特のエピトープに特異的に結合するように二重特異性であることができる。さらなる態様において、ヒトDR4および／またはヒトDR5に特異的に結合するポリペプチドの２つ以上の独特の、または同一の種が、Fcポリペプチドを形成するために単一のFcに共有結合される。したがって、いくつかの態様において、このようなポリペプチドの２、３または4つが、単一のFcに共有結合で連結される。このようなFcポリペプチドは、二量体化（たとえば、二価Fcポリペプチドを形成するためにFc鎖の間のジスルフィド結合による）、三量体化、その他をすることができる。ポリペプチドは、FcのN-もしくはC末端にて、もしくはその近くにて、またはFc内の内部残基にてFcに直接または間接的に付着することができる。その他のにおいて、ヒトDR4および／またはヒトDR5に特異的に結合する第２の、またはさらなるポリペプチドは、それ自体がFcに共有結合されているポリペプチドに共有結合される。したがって、Fcポリペプチドは、直接もしくは間接的にFcに、または直接もしくは間接的にFcにそれ自体が共有結合で付着されるポリペプチドに共有結合された複数のポリペプチドを含むことができる。

一定の態様において、本発明の結合ポリペプチドは、組換え法を使用して構築することができる。したがって、本発明のもう一つの側面は、本発明の結合ポリペプチドまたは本発明の結合ポリペプチドの成分要素をコードするポリヌクレオチドである。結合ポリペプチドの成分要素は、標準的な化学的、生化学的または組換え法によって結合ポリペプチドを形成するように完全に構築することができる。もう一つの側面において、本発明は、結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。一定の態様において、発現ベクターは、適切な宿主細胞における発現を補助するように、結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された制御配列（たとえば、プロモーター、エンハンサー）を含む。一定の態様において、発現ベクターは、また宿主細胞において染色体とは独立した複製ができるポリヌクレオチド配列を含む。例示的なベクターは、プラスミド、コスミッドおよびYACSを含むが、限定されない。さらにもう一つの側面において、本発明は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を含む。本発明の発現ベクターを適切な宿主細胞（たとえば、CHO細胞）にトランスフェクトする、およびFcポリペプチドの発現のために適切な状態下でトランスフェクトされた宿主細胞を培養する方法は、当該技術分野において公知である。使用されるトランスフェクション手順は、形質転換される宿主に依存し得る。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入のための一定の方法は、当該技術分野において公知であり、およびデキストランを媒介したトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンを媒介したトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームにおけるポリヌクレオチド（複数可）のカプセル化および核へのDNAの直接マイクロインジェクションを含むが、限定されない。発現のための宿主として利用できる一定の哺乳動物細胞株は、当該技術分野において公知であり、およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、E5細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌細胞（たとえば、Hep G2）および多数のその他の細胞株を含むが、限定されない、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から入手できる多くの不死化された細胞株を含むが、限定されない。一定の態様において、細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有し、および所望の抗原結合特性をもつFcポリペプチドを産生するかを決定することによって選択してもよい。Fcポリペプチドおよび具体的には抗体である結合ポリペプチドは、抗体産生のための多様な方法のいずれを使用して得ることもできる。ヒトモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体を作製する方法は、当該技術分野において周知である。

アポトーシス性組成物
本発明は、DR5および／またはDR4を発現する哺乳動物癌細胞におけるアポトーシスを誘導するようにインビトロおよび／またはインビボにおいて協調的に作用する組成物（「アポトーシス性組成物」）において本発明の結合ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、哺乳動物の癌細胞は、ヒト、マウスまたはカニクイザル癌細胞である。いくつかの態様において、アポトーシス性組成物は、少なくとも本発明の第1の抗DR5および／または抗DR4結合ポリペプチド、並びに特定の結合条件下で、少なくとも第1の結合ポリペプチドと同じ受容体に特異的に結合する第２の結合ポリペプチドを含む。この態様において、第1および第２の結合ポリペプチドは、特定の結合条件下で、標的受容体（DR5および／またはDR4）の細胞外ドメインに特異的に結合する。アポトーシス性組成物の第1の結合ポリペプチドおよび第２の結合ポリペプチドは、協調作用ができるように標的受容体に対して特異的に結合することを互いに実質的に競合的に阻害しない。競合的ELISAによるなどの、競合阻害を分析し、および定量化する計測手段および方法が、AlphaLISA（商標）システム（Perkin Elmer、Mass. USA）ELISAアッセイなどの技術において公知である。一般に、ある程度の競合阻害が許容されるものの、それは好ましくは最小限にされる。したがって、第1の結合ポリペプチドの特異的結合は、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または95%を超えるまで第２の結合ポリペプチドの特異的結合を減少させるべきでない（または逆もまた同じ）。本発明のアポトーシス性組成物のいくつかの態様において、少なくとも１、２、３、４またはより多くの結合ポリペプチドは、DR5および／またはDR4を発現するアポトーシス感受性の哺乳動物癌細胞に対する単剤としてのアゴニストである。このようなDR4および／またはDR5を発現するアポトーシス感受性の哺乳動物癌細胞の例は、上で、および多数の細胞株が開示されている実施例において考察してある。いくつかの態様において、第1の結合ポリペプチドおよび第２の結合ポリペプチドの特異的結合は、ナチュラルキラー（NK）細胞媒介のアポトーシスに非依存的な哺乳動物癌細胞のアポトーシスを協調的に誘導する。したがって、いくつかの態様において、第1および／または第２の結合ポリペプチドは、限定されないが低親和性抗体などの低親和性Fcポリペプチドなどの低親和性（FCGR3Aに対して）結合ポリペプチドである。ある程度のNKを媒介したアポトーシスが許容できるが、アポトーシス性組成物のNK依存的なアポトーシス活性は、たいてい総アポトーシス活性（すなわち、NK非依存的+ NK依存的アポトーシス）の10%未満およびいくつかの態様において5%、3%、2%、1%または0.5%未満である。FCGR3Aに対して低親和性を有する結合ポリペプチドは、切断されたFcを欠いている、または有することができ、その結果、結合ポリペプチドは、FCGR3Aに結合する能力を欠く。いくつかの態様において、本発明の結合ポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。具体的態様において、第1および第２の結合ポリペプチドは、抗体などのFcポリペプチドである。さらに具体的態様において、抗体は、ヒトDR5および／またはDR4に特異的に結合するヒト抗体である。第1および第２の抗DR5結合ポリペプチドは、同じ受容体（DR5またはDR4）に特異的に結合することができる。アポトーシス性組成物は、本発明の第1および第２の結合ポリペプチドを含む単一の二重特異性分子であることができる。一つの態様において、単一分子は、二重特異性抗DR5ヒトまたはヒト化抗体である。いくつかの態様において、アポトーシス性組成物は、コナツムマブ（AMG 655；Amgen Inc.）を含み、その構造は、2006年8月28日に出願されたGliniakらの米国特許第7,521,048号において提供され、本明細書において参照により援用され、および抗体「Ｏ」（配列番号：30および64）としてその中に開示される。アポトーシス性組成物は、本発明の２つの結合ポリペプチドをたいてい含むが、３、４、５またはより多くを利用することができる。いくつかの態様において、本発明の結合ポリペプチドは、直接または間接的に互いに抱合される。したがって、単一分子は、複数種の結合ポリペプチドを含むことができる。

もう一つの態様において、アポトーシス性組成物は、少なくとも本発明の第1の抗DR5および／または抗DR4結合ポリペプチド、並びに少なくとも1つの腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（TRAIL）またはLZ-TRAILなどのTRAIL変異体を含み、これはインビボおよび／またはインビトロにおいてアポトーシス感受性のDR4および／またはDR5を発現する癌細胞におけるアポトーシスを誘導するように協調する。この態様において、第1の結合ポリペプチドおよびTRAILは、標的デスレセプター（DR4および／またはDR5）の細胞外ドメインに対して特異的に結合することを互いに実質的に競合的に阻害しない。一般に、ある程度の競合阻害が許容されるものの、結合ポリペプチドおよびTRAILまたはTRAIL変異体の相互の特異的結合を逆に妨げないように、それは最小限にされるべきである。したがって、第1の結合ポリペプチド（またはTRAILもしくはTRAIL変異体）の特異的結合は、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または95%を超えるまでTRAILまたはTRAIL変異体（または第1の結合ポリペプチド）の特異的結合を減少させるべきでない。いくつかの態様において、アポトーシス性組成物は、ナチュラルキラー（NK）細胞媒介のアポトーシスに非依存的な哺乳動物癌細胞のアポトーシスを協調的に誘導する。したがって、いくつかの態様において、第1の結合ポリペプチドは、低親和性Fcポリペプチド、たいてい低親和性抗体などの、低親和性（FCGR3Aに対して）結合ポリペプチドである。したがって、いくつかの態様において、本発明の結合ポリペプチドのNK依存的なアポトーシス活性は、たいてい総アポトーシス活性（すなわち、NK非依存的+ NK依存的アポトーシス）の10%未満およびいくつかの態様において5%、3%、2%、1%または0.5%未満である。いくつかの態様において、アポトーシス性組成物の少なくとも１、２、３、４またはより多くの結合ポリペプチドは、アポトーシス感受性のDR5および／またはDR4を発現する哺乳動物癌細胞に対する単剤としてのアゴニストである。いくつかの態様において、哺乳動物の癌細胞は、ヒト癌細胞である。いくつかの態様において、アポトーシス感受性のDR5および／またはDR4を発現する癌細胞に対する第1の結合ポリペプチドは、アゴニスト性ではない。このようなDR4および／またはDR5を発現するアポトーシス感受性の哺乳動物癌細胞の例は、上で、および多数の細胞株が開示されている実施例において考察してある。具体的態様において、第1の結合ポリペプチドは、抗体などのFcポリペプチドである。さらにより具体的態様において、抗体は、ヒト抗体である。特定の態様において、アポトーシス性組成物は、ヒトTRAILおよびコナツムマブ（AMG 655）を含む。

また、本発明は、互いにまたはTRAILもしくはLZ-TRAILなどのTRAIL変異体と組み合わせて、アポトーシス感受性のDR5および／またはDR4を発現する哺乳動物癌細胞のアポトーシスを協調的に誘導する結合ポリペプチドを同定し、および単離するための方法を提供する。本発明のアポトーシス性組成物を同定するために使用することができるアポトーシス感受性の腫瘍細胞株は、当該技術分野において公知であり、およびColo205（結腸）、WM35（結腸）、H1975（肺）、SK-MES-1（肺）、HCC38（乳房）、H2122（肺）、SkLu1（肺）またはH460（肺）を含むが、限定されない。アポトーシス性組成物の有効性および／または作用強度を評価するためのアポトーシスアッセイは、当該技術分野において公知である。たとえば、Kaplan-Lefko et. Al., Cancer Biology & Therapy, 9：8、1-14、（2010）におけるカスパーゼ活性化および細胞生存度アッセイを参照されたい。都合よく、効率的に候補結合ポリペプチドを評価するために、結合ポリペプチドが協調作用を示す能力について評価されるこれらの二次元またはより高次元のマトリックスを作製することができる。二次元マトリックスにおいて、たとえば、多数の結合ポリペプチド（または結合ポリペプチドおよびTRAILもしくはTRAIL変異体）を各次元に並べることができ、これにより協調作用を示すペアをなす組み合わせを効率的かつ容易に同定することができる。いくつかの態様において、アポトーシスの協調作用についてのアッセイにおいて利用される抗DR5および／または抗DR4結合ポリペプチドを所望の特徴に基づいてあらかじめ選択して、協調的な対形成の頻度を改善する。したがって、いくつかの態様において、アッセイにおいて利用される結合ポリペプチド（または結合ポリペプチドおよびTRAILもしくはTRAIL変異体）は、上でより詳細に考察したように、これらの標的（すなわち、DR4および／またはDR5）に対する互いの特異的結合を競合的に阻害しない。いくつかの態様において、アッセイにおいて、およびアポトーシス性組成物において利用される結合ポリペプチドの少なくとも1つは、DR4および／またはDR5に対するアゴニスト性結合ポリペプチドである。いくつかの態様において、スクリーニングにおいて利用される結合ポリペプチドは、抗体などのFcポリペプチドである。いくつかの態様において、スクリーンに利用される抗体は、インビボにおいて感受性の癌細胞のアポトーシスを誘導するために、プロテインGなどの架橋剤を必要とするだろう。いくつかの態様において、これらの抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、架橋依存的な抗体の1つは、コナツムマブである（AMG 655；Amgen Inc）。

治療適用
本発明のアポトーシス性組成物は、単独療法として（すなわち、単剤として）、少なくとも1つの化学療法剤と組み合わせて（すなわち、併用療法）、および／または放射線治療と組み合わせて、哺乳動物、特に（particulary）ヒト、癌細胞の成長を阻害する「治療組成物」として使用することができる。治療組成物の有効な量が、DR4および／またはDR5を媒介したアポトーシスに感受性である癌の進行を阻害する、停止する、または逆転するために投与される。ヒト癌細胞をインビボまたはエキソビボにおいて治療することができる。ヒト患者のエキソビボ治療では、癌細胞を含む組織または液体を体外で処理し、次いで、組織または液体を患者の中に再導入して戻される。いくつかの態様において、癌は、患者に対する治療組成物の投与によってインビボでヒト患者において治療される。したがって、本発明は、エキソビボおよびインビボで、腫瘍の進行を阻害する、停止する、もしくは逆転する、またはさもなければ対照での治療に比べて無進行生存（すなわち、患者がさらに悪化しない膵臓癌を伴って生きている治療の間および後の延べ時間）もしくは全体的な生存率（「生存率」とも呼ばれる；すなわち、研究または治療群における癌と診断され、またはそれが治療された後の一定の期間の間生きている人のパーセント）の統計的に有意な増大を生じる方法を提供する。

本発明の方法によって治療することができる癌は、肝癌、脳癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌（腺癌）、結腸直腸癌、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、脾臓癌、胸腺癌または血液細胞（すなわち、白血病）、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌腫、頭頸部扁平細胞癌腫、メラノーマおよびリンパ腫を含むが、限定されない。いくつかの態様において、癌は、非小細胞肺癌（NSCLC）である。

医薬組成物
本発明の治療組成物は、それぞれ単独で単独療法として、または併用療法として、すなわちその他の薬剤（たとえば、抗血管新生薬剤、化学療法剤、放射線治療）と組み合わせて投与することができる。例示的な化学療法剤は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、ドセタキセル、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、パクリタキセル、メトトレキセート、ゲムシタビン、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン、メルファランおよびその他の関連したナイトロジェンマスタードを含むが、限定されない。

本発明の化学療法薬は、本発明の特異的に結合する薬剤の前に、および／またはその後に（ひとまとめにして、「逐次的治療」）、またはそれと同時に（「同時治療」）投与することができる。また、組み合わせの逐次的治療（前処置、後処理または重なっている治療など）は、薬物が交替され、または1つの成分が長期投与され、およびその他（複数可）が断続的に投与される処方計画を含む。組み合わせの成分は、同じまたは別の組成物において、および同じまたは異なる投与経路によって投与されてもよい。

本発明の治療組成物と同時投与してもよい例示的な癌療法は、以下を含む：HERCEPTIN（商標）（トラスツズマブ）、これは、乳癌および癌のその他の形態を治療するために使用され得る；RITUXAN（商標）（リツキシマブ）、ZEVALIN（商標）（イブリツモマブチウキセタン）およびLYMPHOCIDE（商標）（エプラツズマブ）、これは、非ホジキンリンパ腫および癌のその他の形態を治療するために使用され得る；GLEEVEC（商標）（イマチニブメシラート）、これは、慢性骨髄性白血病および消化管間質腫瘍を治療するために使用され得る；およびBEXXAR（商標）（トシツモマブ）、これは、非ホジキンリンパ腫の治療のために使用され得る。また、一定の例示的な抗体は、ERBITUX（商標）；VECTIBIX（商標）、IMC-C225；IRESSA（商標）（ゲフィチニブ）；TARCEVA（商標）（エルチノリブ）；KDR（キナーゼドメイン受容体）阻害剤；抗VEGF抗体およびアンタゴニスト（たとえば、AVASTIN（商標）およびVEGFトラップ）；抗VEGF（血管内皮成長因子）受容体抗体、ペプチボディーおよび抗原結合領域；抗Ang-1およびAng-2抗体、ペプチボディー（たとえば、AMG 386、Amgen Inc）および抗原結合領域；Tie-2、並びにその他のAng-1およびAng-2受容体に対する抗体；Tie-2リガンド；Tie-2キナーゼ阻害剤に対する抗体；およびCAMPATH（商標）（アレムツズマブ）を含む。

医薬品製剤
本発明の治療組成物を含む医薬組成物は、たとえば、組成物のpH、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色、等張性、匂い、無菌、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または透過を修飾する、維持する、または保存するための製剤材料を含んでいてもよい。医薬組成物における主要媒体または担体は、天然において水性でも、または水を含まなくても、いずれでもよい。たとえば、適切な媒体または担体は、可能であるなら非経口投与のための組成物において一般的なその他の材料を補った、注射用水または生理食塩水でもよい。さらなる媒体の例には、中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水がある。その他の例示的な医薬組成物は、約pH 7.0〜8.5のTris緩衝液または約pH 4.0〜5.5の酢酸緩衝液を含み、したがって、これはソルビトールまたは適切な代用品をさらに含んでいてもよい。本発明の一つの態様において、結合剤組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥されたケーキまたは水性溶液の形態で、随意の製剤（Remington's Pharmaceutical Science、上記）と混合することによって貯蔵のために調製してもよい。さらに、結合剤製品は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化してもよい。

製剤成分は、投与の部位に対して許容される濃度で存在する。たとえば、生理的pHにて、またはわずかにより低いpHにて、典型的には約5〜約8のpH範囲内に組成物を維持するために緩衝液が使用される。非経口投与のための特に適切な媒体は、結合剤が適切に保存される無菌の、等張性溶液として製剤化されている無菌の蒸留水である。さらにもう一つの製剤は、製品の徐放性放出または持効性放出を提供する、注射可能なマイクロスフェア、生物浸食性粒子、重合体化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームなどの薬剤と共に所望の分子の製剤を含むことができ、次いでこれを、デポー注射を介して送達し得る。

もう一つの側面において、非経口投与のために適した医薬品製剤は、水性溶液中に、好ましくはハンクス液、リンゲル液または生理緩衝食塩水などの生理的に適合性の緩衝液中に製剤化してもよい。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘性を増加させる物質を含んでいてもよい。持効性または徐放性送達製剤において結合剤分子を含む製剤を含む、さらなる医薬組成物が当業者に明らかになるだろう。また、リポソーム担体、生物浸食性微小粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射などのその他の持効性または徐放性の多様な送達手段の製剤化のための技術が当業者に公知である。インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には無菌でなければならない。これは、無菌の濾過膜を通す濾過によって達成してもよい。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前に、またはその後のいずれかに行われてもよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形で、または溶液において貯蔵されてもよい。加えて、非経口組成物は、一般に無菌のアクセスポートを有する容器、たとえば皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル内に置かれる。

一旦医薬組成物が製剤化されると、これを溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体または脱水もしくは凍結乾燥された粉末として無菌のバイアルに貯蔵してもよい。このような製剤は、すぐ使用できる形態で、または投与前に再構成を必要とする（たとえば、凍結乾燥された）形態で貯蔵してもよい。治療的に使用される医薬組成物の有効量は、たとえば治療の状況および目的に依存するだろう。当業者であれば、したがって、治療のための適切な投薬量レベルが、一部において、送達される分子、結合剤分子が使用される適応症、投与の経路、並びに患者のサイズ（体重、体表面または器官サイズ）および状態（年齢および一般的な健康）に依存して変化するだろうことを認識するだろう。したがって、臨床医は、投薬量を設定し、および最適な治療効果を得るように投与の経路を変更し得る。典型的な投薬量は、上で言及した要因に依存して、約0.1mg/kg〜約50mg/kgまたはそれ以上の範囲であってもよい。いくつかの態様において、投薬量は、1、3、5、10、15、20、25または30 mg/kgであることができる。

任意の化合物について、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイにおいて、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタもしくはサルなどの動物モデルにおいて、最初に見積もることができる。また、適切な投与の濃度範囲および経路を決定するために、動物モデルを使用してもよい。次いで、ヒトにおける投与のために有用な用量および経路を決定するために、このような情報を使用することができる。正確な投薬量は、治療を必要とする被験体に関連した要因を考慮して決定されるだろう。投薬量および投与は、活性化合物の十分なレベルを提供する、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る要因は、疾患状態の重症度、被験体の一般的な健康、被験体の年齢、重量および性別、投与の回数および頻度、薬物併用（複数可）、反応感受性および療法に対する反応を含む。長時間作用性医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率に依存して、3〜4日毎、毎週または隔週に投与してもよい。投薬の頻度は、使用される製剤の分子の薬物動態学的パラメーターに依存するだろう。典型的には、組成物は、所望の効果を達成する投薬量が到達されるまで投与される。したがって、組成物は、単一用量として、または時間とともに複数用量（同じまたは異なる濃度/投薬量にて）として、または連続輸液として投与してもよい。適切な投薬量のさらなる改良がルーチンで行われる。適切な投薬量は、適切な用量反応データを使用することにより確認してもよい。

特に明記しない限り、全ての細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）またはAmgen細胞バンク由来であった。臨床的等級AMG 655を全てのインビトロおよびインビボ研究のために使用した。全てのインビトロおよびインビボ実験には、研究目的のためにAmgenにて作製されたタグがないヒトTRAIL（アミノ酸114〜281）を利用した。本出願において開示した以下の抗体のポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、米国特許第7,521,048号（国際公開第2007/027713号）において見いだすことができ、このような抗体の名称を補足的に示してある。以下の抗体のポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列、並びにこれらのそれぞれのCDR（相補性決定領域）は、参照により本明細書に援用される。AMG 655=XG1-048=（抗体Ｏ）；1.10.3=（抗体G）；2.57.3=（抗体H）；2.32.1=（抗体L）；2.1.3=（抗体D）；2.13.2=（抗体C）；2.3.3=（抗体I）；2.32.2=（抗体J）；2.8.3=（抗体E）；2.35.2=（抗体A）。抗体2.67.1の可変重鎖は、配列番号1（DNA）および配列番号2（ポリペプチド）にて提供してある；抗体2.67.1のための可変軽鎖は、配列番号3（DNA）および配列番号4（ポリペプチド）にて提供してある。抗体2.11.1の可変重鎖は、配列番号5（DNA）および配列番号6（ポリペプチド）にて提供してある；抗体2.11.1のための可変軽鎖は、配列番号7（DNA）および配列番号8（ポリペプチド）にて提供してある。

実施例1-FcγR（Fcガンマ受容体）に結合することができない抗体を使用して腫瘍異種移植モデルにおいて協調作用を証明する
インビボにおいてTRAILとアゴニスト性抗DR5抗体AMG 655との間の協調作用を観察することができるかどうかを決定するために、TRAIL、AMG 655および２つの組み合わせをH460肺癌異種移植モデルにおいて試験した。加えて、FcγRsに結合することができず、およびしたがってがインビボにおいて架橋することができないので固有活性を欠いているAMG 655の非グリコシル化された突然変異体（N297A）を含めた。H460での以前のインビボ研究は、この腫瘍がTRAILに感受性であるが、AMG 655にほぼ完全に耐性であることを示している。TRAILの有無におけるAMG 655またはAMG 655 N297Aの有効性を比較した。この実験について、およそ6週齢のCB17-SCIDマウスに、5×10⁶のNCI-H460細胞で右側腹部に皮下注射した（s.c.）。腫瘍が150〜200mm³に到達したとき、マウスをhIgG1（ヒトIgG1）、AMG 655（100μg）、AMG 655-N297A（100μg）、TRAIL（60mg/kg）またはAMG 655およびTRAILの組み合わせまたはAMG 655-N297AおよびTRAIL（n = 10マウス/群）の組み合わせで処理した。全ての抗体は、2週間の間、週に2回、腹腔内投与（i.p.）を介して投与した。TRAILおよび生理食塩水対照は、2週間、5日間毎日i.p.で投与した。腫瘍寸法をデジタルノギスによって2〜3回/週で測定し、および腫瘍体積を長さ×（幅）²/2として算出した。図1は、TRAILが有意な、および実質的な腫瘍増殖阻害を誘導したのに対して、抗腫瘍効果は、AMG 655またはAMG 655-N297Aのいずれか単独で観察されなかったことを示す。しかし、両方の組み合わせ治療群における腫瘍増殖阻害は、TRAIL単独（p=0.001）で見られたものを著しく上回った。これらの結果は、AMG 655およびAMG655-N297Aの両方がインビボにおいてTRAILと協調することができること、およびこの協調作用がFcγRを媒介した架橋に非依存的であることを示す。

実施例2−AMG 655は、外因性架橋の非存在下においてTRAILおよびLZ-TRAILを媒介したWM35細胞の死滅を増強する
DR5に結合するTRAILおよびAMG 655の関係を検討するために、WM35細胞における効果を評価した。WM35細胞は、表面DR5を、しかしDR4の検出不可能な程度のレベルを発現し（図2B）、TRAILは、DR5を介してのみシグナル伝達し得るが、およびDR4を介さないことを確証する。この実験において、2×10^4 WM35細胞/ウェルをプレートにまいた。翌日、細胞をいずれかの培地、hIgG（1=g/mL）またはAMG 655（1=g/mL）で処理した。次いで、細胞を、示したように（図2A）、AMG655、TRAILまたはLZ-TRAILのいずれかの用量設定で処理した。示したように、タンパク質G（1μg/mL）を添加した。さらに24時間のインキュベーション後、細胞生存度を、CellGlo（登録商標）システム（Promega、USA）を使用して決定した。データは、相対発光ユニットとして表してある。この実験を少なくとも3回繰り返し、類似の結果であった。LZ-TRAILは、TRAILの極めて強力なバージョンであり、ロイシンジッパードメインの付加によってオリゴマー形成されるが、TRAIL + AMG 655の組み合わせは、WM35細胞の死滅についてLZ-TRAILより強力であった（図2A）。WM35細胞上の表面DR4およびDR5発現レベルをフローサイトメトリーによって解析した（図2B）。水平軸および垂直軸は、それぞれ、細胞の蛍光強度および相対数を示す。黒の実線ヒストグラムは、アイソタイプ対照である。線影ヒストグラムは、DR4（M271 Ab）およびDR5（M413 Ab）に対する抗体である。

実施例3-複数の腫瘍細胞株における協調作用
TRAILとAMG 655との間の相乗作用を複数の腫瘍細胞株において観察することができるかどうかに取り組んだ。大部分の細胞株が、DR5およびDR4を発現するので、AMG 655の有無においてTRAILによって生じるアポトーシスのシグナルの構成成分は、DR4を介するだろう。試験した細胞は、肺、結腸および乳房株の範囲を含んだ。これらの細胞株は、単剤TRAILおよびAMG 655（+外来性架橋剤タンパク質G）に対するこれらの反応性が変化する。示した全ての細胞株について、2×10^4細胞/ウェルをプレートにまいた。翌日、細胞を培地、hIgG（1μg/mL）またはAMG 655（1μg/mL）で処理した。次いで、細胞を、示したように（図3）、タンパク質G（1μg/mL）でTRAILまたはAMG 655の用量設定で処理した。さらに24時間のインキュベーション後、細胞生存度を、CellGlo（登録商標）アッセイを使用して決定した。データは、対照未治療細胞のパーセントとして表してある。この実験を少なくとも3回繰り返し、類似の結果であった。図3の結果は、TRAILとAMG 655との間の協調作用がDR5+/DR4-（WM35）細胞に限定されず、およびTRAILまたはAMG 655（+プロテイン G）に反応しないいくつかの細胞は、TRAIL+AMG 655の組み合わせによって感作され得ることを示す。

実施例4-AMG 655に感受性であるが、TRAILに耐性である肺腫瘍細胞株における協調作用
単剤としてAMG 655（+プロテイン G）対TRAILに対する感受性の増大を示したいくつかの株化細胞を、組み合わせに対するこれらの感受性について評価した。2×10^4 Sk-Lu-1、SW1573、EKVXまたは1×10^4 Hop62細胞/ウェルをプレートにまいた。翌日、細胞をいずれかの培地、hIgG（1μg/mL）またはAMG 655（1μg/mL）で処理した。次いで、細胞を、示したように（図4）、TRAILまたはタンパク質G（1μg/mL）とAMG 655の用量設定で処理した。さらに24時間のインキュベーション後、細胞生存度をCellGlo（登録商標）アッセイシステムを使用して決定した。示したデータは、相対発光ユニットとして表してある。この実験を少なくとも3回繰り返し、類似の結果であった。図4の結果は、TRAILに応答しないいくつかの細胞がTRAIL+AMG 655の組み合わせによって感作され得ることを示す。最も分極化した応答を示した株化細胞の1つは、SK-Lu-1であった。SK-Lu-1は、可溶性TRAILに応答しないが、AMG 655（+プロテイン G）に応答することが確認された。可溶性TRAIL単独に非応答性であることにもかかわらず、TRAIL + AMG 655は、AMG 655（+タンパク質G）単独で見られるものよりの強力であった強力なアポトーシス応答を誘導した。合計8つの株化細胞株をこの応答群（AMG 655＞TRAIL）から試験して、全てがAMG 655とTRAILとの間に強力な協調的な相互作用を示す。

実施例5−H838肺癌細胞におけるTRAILとAMG 655との間の協調作用は、総細胞死の増大をまねく
試験した細胞株の大多数において、TRAILとAMG 655との間の協調作用が、作用強度の増大（より低量の薬物での細胞死滅がより多い）を示すが、より多くの全体の細胞死滅を必ずしも生じるというわけではない。H838肺癌細胞は、TRAILおよびAMG 655の組み合わせが作用強度を増加させ、並びに全体の細胞死滅を増加させる例の一つである。この実験では、1×10^4 H838細胞/ウェルをプレートにまいた。翌日、細胞をいずれかの培地、hIgG（1μg/mL）またはAMG 655（1μg/mL）で処理した。次いで、細胞を、示したように（図5）、TRAILまたはタンパク質G（1μg/mL）とAMG 655の用量設定で処理した。さらに24時間のインキュベーション後、細胞生存度を、CellGlo（登録商標）アッセイシステムを使用して決定した。示したデータは、相対発光ユニットとして表してある。この実験を少なくとも3回繰り返し、類似の結果であった。図5の結果は、H383細胞は、TRAILおよびAMG655と協調作用して、作用強度の増大、並びに総細胞死滅の増大をまねくことを示す。

実施例6−正常細胞上のTRAIL+AMG 655の協調作用の増強はない
TRAIL + AMG 655が複数の腫瘍細胞株に対する単剤のいずれよりも強力なアゴニストであることが示されており、この増強された感受性が初代正常細胞に拡張されるかどうかを決定した。1つの実験について、ヒトPBMC（末梢血単核細胞）白血球パックからのネガティブ選択によって調製した1×10^5初代ヒト単球を1×10^6/mLでプレートにまき、24時間後にTRAILまたはAMG 655 +タンパク質G（1 μ/mL）の用量設定で処理した。次いで、示した細胞はAMG 655（5μg/mL）を受けた（図6）。細胞をATPLite（登録商標）発光ATP検出アッセイシステム（PerkinElmer、USA）を使用して処理の48時間後に生存度について解析した。示したデータは、相対発光ユニットとして表してある。DR5発現を、実施例2に記載されているようにフローサイトメトリーによって確認した。図6Aおよび6Bにおける結果は、初代ヒト単球が、発現するDR5の表面レベルにもかかわらず、TRAILまたはAMG 655（+タンパク質G）単独または組み合わせのいずれにも応答しないことを示す。類似の結果を4人の独立したドナーから得た細胞において観察した。

関連した実験において、市販の初代ヒト腎臓の上皮細胞（Lonza、Walkersville, MD）を2×10^4細胞/ウェルにてプレートにまき、24時間後に、TRAIL、AMG 655 +タンパク質G（1μg/mL）またはスタウロスポリンの用量設定で処理した。次いで、細胞は、AMG 655（5μg/mL）を受けた。24時間のインキュベーション後、細胞生存度をATPlite（登録商標）発光ATP検出アッセイシステム（PerkinElmer、USA）によって決定した。データは、未処置細胞に対する対照のパーセントとして表してある。DR5発現を実施例2に記載されているようにフローサイトメトリーによって確認した。図6Cに示したように、ヒト初代腎臓上皮細胞は、TRAIL、AMG 655（+プロテインG）または組み合わせに非感受性であったが、これらは、スタウロスポリンの量の増大に感受性だった。感受性の欠如は、図6Dに示したように、DR5の乏しい発現のためではなかった。この実験を2回繰り返し、類似の結果であった。

以前の報告は、組換えTRAILの異なるバージョンが差動的肝細胞毒性を誘発することを証明したので（Lawrence et al, 2001）、3人の異なるドナーからの初代ヒト肝細胞におけるTRAIL、AMG 655または組み合わせの感受性を評価した。予想通りに、TRAILおよびAMG 655（+プロテイン G）の両方が、肝細胞に対していくつかの用量依存的死滅活性を示した（データ示さず）。以前の観察を確認するように、LZ-TRAILは、TRAILまたはAMG 655（+プロテインG）より強力であった。TRAIL + AMG 655の組み合わせがTRAIL単独より強力だったが、組み合わせの最大死滅は、一貫してAMG 655 +（タンパク質G）またはLZ-TRAIL未満であった。これは、インビトロにおいて、肝細胞がいずれの薬剤単独と比較して、TRAILおよびAMG 655（+プロテインG）の組み合わせに対して中間の反応を有することを示唆する。

実施例7-抗DR5抗体のサブセットは、TRAIL と協調する
AMG 655に加えてその他の抗DR5抗体がTRAILと協調的な関係を示すかを試験した。試験したさらなる抗体は、マウス抗ヒトDR5モノクローナル抗体M410、M411、M412、M413およびM415であった。この実験では、2×10^4 WM35細胞/ウェルをプレートにまいた。翌日、細胞を、hIgG（1μg/mL）または示したDR5抗体（1μg/mL）のいずれかで処理した（図7）。次いで、細胞をTRAILの用量設定で処理した。さらに24時間のインキュベーション後、細胞生存度をCellGlo（登録商標）アッセイシステムを使用して決定した。データは、相対発光ユニットとして表してある。この実験を少なくとも3回繰り返し、類似の結果であった。図7は、以前にDR5に対する結合についてTRAILと競合することが示された（データ示さず）、M411またはM413でのWM35細胞の処理がTRAILによって媒介される死滅を遮断したことを示す。M415は、TRAILと競合もせず、協調もしなかった。しかし、M410およびM412は、TRAILと協調的な挙動を示し、AMG 655で観察されたものに類似した。これらの結果は、全ての抗DR5抗体がTRAILと協調することができるというわけではないことを示す。抗DR5 mAb M413は、TRAILによって媒介される死滅をアンタゴナイズし、DR5に対する結合についてリガンドと競合する抗体がTRAILとの相乗作用を示す可能性が低いことを示唆した。

実施例8-抗DR5抗体対の協調作用
AMG 655を最初に採取したプールからの抗体が、AMG 655と、または互いとの協調作用の証拠を示したかどうかに取り組んだ。一連の17の入手できる抗DR5 IgG2（特に明記しない限り）抗体およびAMG 655を、これらが細胞生存度アッセイにおいて互いと協調する能力を試験した。これらの実験では、2×10^4 Colo205細胞/ウェルをプレートにまいて、5時間後に、細胞を1μg/mLのそれぞれの示したDR5抗体で処理した（図8）。さらに24時間のインキュベーション後、細胞生存度を、CellGlo（登録商標）アッセイシステムを使用して決定した。表のデータは、パーセント残りの生存細胞として表してある。黒いボックスは、最高の協調作用度を示した抗体対を示す。ビン番号は、固有のエピトープビンに対応する。ビン情報は、全ての抗体に利用できるというわけではなかった。図8において示した結果は、図7における所見と類似して、抗体のサブセットのみが互いと協調作用を示すことができることを示す。抗体1.10.3は、残りの生存可能な細胞を示す黒いボックスによって示したように、複数のその他の抗体と協調することができた。抗体対1.10.3および2.67.1は、最も大きな協調作用を示し、および実験の最後に残っている21%の生存可能な細胞を生じた。抗体2.1.3および2.11.1は、AMG 655といくらかの協調作用を示したが、これらの組み合わせのいずれも、1.10.3および2.67.1対ほど強力でなかった。

実施例9-抗DR5抗体対およびTRAILと抗DR5抗体の協調作用
一連の最初のAMG655プールからの抗DR5抗体を、これらがTRAILと協調する能力を、およびさらなる細胞株（H460）で試験した。これらの実験では、2×10^4 Colo205またはH460細胞/ウェルをプレートにまき、および5時間後に、細胞を5μg/mLのそれぞれの示したDR5抗体単独（Abのみ）；1μg/mLのTRAILと5μg/mLのそれぞれの抗体（Ab + TRAIL）；5μg/mLのそれぞれの示した抗体対（Ab + Ab）；または抗体+ 1μg/mLプロテインGのいずれかで処理した（図9）。さらに24時間のインキュベーション後、細胞生存度を、CellGloを（登録商標）アッセイシステムを使用して決定した。データは、パーセント細胞生存として表してある。図9の結果は、両方の細胞株において、全ての抗体がプロテインG架橋剤の非存在下においてほとんどまたは全く死滅活性を示さないが、プロテインGの存在下において全てがいくらかの活性を示すことを示す。両方の細胞株において、AMG 655および2.11.1の両方がTRAILとの協調作用を示す。1.10.3および2.67.1抗体対は、Colo205細胞で最も大きな協調作用を示すが、H460細胞では限定された活性のみを示す。1.10.3および2.67.1抗体対は、互いと優れた協調作用を示すが、いずれの抗体もTRAILと協調することができず、これらの抗体がTRAILと重複したエピトープを共有し得ることを示唆する。

実施例10-Colo205異種移植モデルにおける1.10.3および2.67.1抗DR5抗体対の協調作用
インビトロにおいて最も優れた協調作用を示した抗体対（図8を参照されたい）が、腫瘍異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性の増強を示すことができるかどうかを決定した。およそ8週齢の雌NOD-SCID（非肥満の糖尿病-重篤な複合免疫不全）マウスには、1×10⁶のColo205細胞を右側腹部に皮下注射した（s.c.）。腫瘍細胞移植の13日後、マウスをヒトIgG2（200 μg、n=10/群）、2.67.1（IgG2アイソタイプ）+ IgG2（各100μg、n=8/群）、1.10.1（IgG2アイソタイプ）+ IgG2（各100μg、n=8/群）または1.10.1 +2.67.1（各100μg、n=8/群）のいずれかで処理した（図10）。全ての抗体は、腹腔内投与（i.p.）を介して投与した。全ての抗体は、2週間の間、週に2回、腹腔内投与（i.p.）を介して投与した。腫瘍寸法をデジタルノギスによって2回/週で測定し、および腫瘍体積を長さ×（幅）²/2として算出した。図10に示したように、抗腫瘍効果は、1.10.1または2.67.1抗体単独のいずれでも観察されなかった。しかし、1.101および2.67.1を組み合わせたときに、有意な腫瘍増殖阻害が観察された（p＜000.1）。これらの結果は、1.10.1および2.67.1が、インビボにおいて協調することができること、およびIgG2抗体は、Fc受容体サブタイプに対して低い親和性を有するまたは全く親和性を有さないので、この協調作用は、FcγRを媒介した架橋に非依存的であることを示す。

Claims (20)

1. 哺乳動物における癌細胞のDR5を媒介したアポトーシスを誘導するための組成物であって、以下：
   a）前記癌細胞のDR5受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する、第1の抗DR5結合抗体；および
   b）以下の少なくとも1つ：
   i）前記DR5受容体の前記細胞外ドメインに特異的に結合する第２の抗DR5結合抗体であって、ここで前記第1の抗体および前記第２の抗体は、前記DR5受容体に対して特異的に結合することを互いに競合的に阻害せず、そしてここで前記第1の抗体および前記第２の抗体の特異的結合は、前記哺乳動物のナチュラルキラー（NK）細胞を必要とすることなく前記哺乳動物癌細胞のアポトーシスを協調的に誘導する、前記第２の抗DR5結合抗体；または、
   ii）腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（TRAIL）であって、ここで前記TRAILは、前記DR5受容体に特異的に結合し、前記第1の抗体および前記TRAILは、前記DR5受容体に対して特異的に結合することを互いに競合的に阻害せず、そしてここで前記第1の抗体および前記TRAILの特異的結合は、前記哺乳動物のナチュラルキラー（NK）細胞を必要とすることなく前記哺乳動物癌細胞のアポトーシスを協調的に誘導する、前記TRAIL；
   を含む、前記組成物。
2. 前記哺乳動物癌細胞は、ヒト癌細胞である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記抗体は、それぞれ完全ヒト抗体である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記第1の抗DR5抗体または前記第２の抗DR5抗体は、架橋することなくインビトロにおいてColo205細胞におけるアポトーシスを誘導する、請求項３に記載の組成物。
5. 前記組成物は、薬学的に許容される製剤中に前記第1の抗DR5抗体および前記第２の抗DR5抗体又は前記TRAILを含む、請求項１に記載の組成物。
6. 前記第1の抗DR5結合抗体または前記第２の抗DR5結合抗体の少なくとも1つは、前記NK細胞のFCGR3Aに特異的に結合しない、請求項１に記載の組成物。
7. 前記第1の抗DR5結合抗体は、前記第２の抗DR5結合抗体または前記TRAILと組み合わせて協調的にアポトーシスを誘導する、請求項１に記載の組成物。
8. 前記第1の抗DR5結合抗体および前記TRAILを含む、請求項１に記載の組成物。
9. 前記TRAILは、LZ-TRAILである、請求項８に記載の組成物。
10. 薬学的に許容される担体中に製剤化された、請求項７に記載の組成物。
11. 前記抗体は、完全ヒトIgG1またはIgG2抗体である、請求項５及び７〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 前記抗体は、N297A置換を含むヒトIgG1抗体である、請求項５及び７〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
13. 前記第1の抗DR5結合抗体または前記第２の抗DR5結合抗体の少なくとも1つは、非グリコシル化されたFcを含む、請求項５及び７〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
14. 前記第1の抗DR5結合抗体は、AMG 655である、請求項５及び７〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
15. 前記抗体は、FCGR3Aに対して高親和性で結合する、請求項５及び７〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
16. 前記抗体は、非フコシル化されている、請求項１４に記載の組成物。
17. 哺乳動物におけるDR5を発現する癌の成長を阻害するための、治療上有効な量の請求項１に記載の組成物。
18. 前記組成物は、化学療法剤の治療上有効な量と組み合わせて投与される、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記癌は、膵臓癌、結腸直腸癌または肺癌である、請求項１７に記載の組成物。
20. 哺乳動物におけるDR5を発現する癌の成長を阻害するための、治療上有効な量の請求項５及び７〜１０のいずれか１項に記載の組成物。