KR20130031241A - 효능제 ｄｒ５ 결합 폴리펩티드 - Google Patents

효능제 ｄｒ５ 결합 폴리펩티드 Download PDF

Info

Publication number
KR20130031241A
KR20130031241A KR1020127023443A KR20127023443A KR20130031241A KR 20130031241 A KR20130031241 A KR 20130031241A KR 1020127023443 A KR1020127023443 A KR 1020127023443A KR 20127023443 A KR20127023443 A KR 20127023443A KR 20130031241 A KR20130031241 A KR 20130031241A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
sequences
sequence
seq
nos
Prior art date
Application number
KR1020127023443A
Other languages
English (en)
Inventor
카렌 크로미
브루노 돔브레흐트
세스 에텐버그
요스트 콜크만
징 리
크리스 메르샤에르트
데이비드 레이몬드 스토버
징신 장
Original Assignee
아블린쓰 엔.브이.
노파르티스 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43877025&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20130031241(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 아블린쓰 엔.브이., 노파르티스 아게 filed Critical 아블린쓰 엔.브이.
Publication of KR20130031241A publication Critical patent/KR20130031241A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)

Abstract

본 발명은 TRAIL 세포 표면 수용체 2 (본원에서 또한 "DR5")에 대해 작용하는 아미노산 서열, 및 그의 화합물 또는 구축물, 및 특히 단백질 및 폴리펩티드 및 이들 및 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 (본원에서 이들 전부가 "NB 작용제"로 언급됨), 및 그의 제약상 유효한 변이체, 및 DR5 연관 질환 및 장애의 진단 및 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

효능제 ＤＲ５ 결합 폴리펩티드{AGONIST DR5 BINDING POLYPEPTIDES}
종양 괴사 인자 (TNF)-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL)는 정상 세포에 대한 효과를 거의 또는 전혀 보이지 않으면서 다양한 종양 형성성 및 형질전환된 세포주에서 아폽토시스를 유도한다. TRAIL에 대한 적어도 5개의 수용체가 확인되었고, 그 중 2개, 즉 DR4 (사멸 수용체 4, TRAIL-R1) 및 DR5 (사멸 수용체 5, TRAIL-R2; KILLER 또는 TRICK 2)는 아폽토시스 신호를 전달할 수 있는 반면에, 다른 3개 (TRAIL-R3, TRAIL-R4 및 가용성 OPG)는 TRAIL-매개된 아폽토시스를 차단하기 위한 디코이 (decoy) 수용체로서 기능한다 (예를 들어, 문헌 [Ozoren and El-Deiry, Sem. Cancer Biol 13:135 (2003)]; [Yagita et al., Cancer Sci., 95(10): 777 (2004)] 참조).
TRAIL 또는 Apo2L은 C-말단이 세포의 세포외 표면 (타입 II 리간드)에 노출된, 세포질 막 내로 통합된 281개 아미노산의 세포독성 리간드이다. 소량의 가용성 TRAIL 리간드도 검출될 수 있다. TRAIL은 그의 각각의 수용체에 결합하여 신호전달 이벤트의 캐스케이드를 개시시키는 동종-삼량체 분자를 형성한다.
수용체 DR4 또는 DR5에 대한 TRAIL 리간드의 결합은 외인성 세포 사멸 경로를 개시하여, 어댑터 (adaptor) FADD (Fas-활성화 DD) 및 프로-카스파제 8 또는 프로-카스파제 10을 함유하는 사멸-유도 신호전달 복합체 (DISC)의 형성을 일으킨다. DISC에서의 상호작용 및 하류 캐스케이드의 활성화는 NFκB 및 Jun N-말단 키나제 경로 (JNK)의 활성화를 일으키는 FAS와 유사하다. 예를 들어, 문헌 [Mongkolsapaya et al., Nat. Struct. Biol., 6(11): 1048 (1999)]; [Cha et al., J. Biol. Chem., 275(40): 31171 (2000)])을 참조한다. DR4 또는 DR5에 대한 TRAIL 결합은 또한 BID 절단 (카스파제 8 또는 10에 의한), 미토콘드리아의 활성화 및 따라서 내인성 아폽토시스 경로의 활성화를 일으킨다.
정상 세포에는 효과가 거의 또는 전혀 없으면서 종양 세포 아폽토시스를 우선적으로 유도하는 TRAIL 리간드의 능력으로 인해 이것은 암 치료를 위한 잠재적으로 우수한 후보가 되었다. 그러나, 가용성 TRAIL은 시험관 내에서 정상 인간 간세포 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌고, 이것은 잠재적으로 독성 문제를 부각시킨다 (예를 들어, 문헌 [Jo et al., Nat Med. 6(5): 564 (2000)] 참조). 암 치료를 위한 보다 유익한 표적은 DR5이다. DR5는 정상 간세포 아폽토시스를 유도하기 위해 다수의 수용체를 필요로 하기 때문에, 아폽토시스의 유도를 책임지는 특이적 DR5에 대한 효능제의 개발은 종양 세포를 죽이는 능력을 보유하면서 정상 세포에 대한 상기 독성을 피하는 것으로 예측된다.
DR5의 펩티드 및 항체 효능제는 DR5를 발현하는 세포에서 아폽토시스를 유도하기 위해 사용되었다. 예를 들어, 문헌 [Li et al., J. Mol. Biol., 361, 522-536 (2006)]; [Kajiwara et al., Biochim. Biophys. Acta 1699: 131-137 (2004)]; [Yang et al., Cancer Cell, 5, 501-512 (2004)]를 참조한다. DR5의 효능제는 광범위한 암에 대한 암 치료에서 사용될 잠재력을 갖는다. 예를 들어, 렉사투무맙 (Lexatumumab; DR5에 대한 모노클로날 항체)은 DR5의 발현을 유도하고, 신세포 암종의 마우스 모델에서 아폽토시스를 촉진한다 (Zhang et al., Cancer Lett. 251(1): 146-57 (2007)). DR5에 대한 다른 효능제 모노클로날 항체, 또는 DR5에 대한 단일쇄 Fv 단편, 및 그의 살종양 활성은 예를 들어 문헌 [Takeda et al., Journal Exp. Medicine, 199, 437-448 (2004)]; [Guo et al., J. Biol. Chem., 280, 41940-41952 (2005)]; [Motoki et al., Clin. Cancer Res 11(8): 3126-35 (2005)]; 및 [Ichikawa et al., Nature Medicine, 7, 954-960 (2001)], [Chuntharapai et al., J. Immunol. 166(8): 4891-8 (2001)], [Shi et al., Cancer Res., 66(24): 11946-11953 (2006)]에 유사하게 기재되어 있다.
임상에서 사용하기 위해 다양한 DR5 특이적 항체가 개발되고 있지만 아직 어떤 것도 승인되지 않았다. DR5가 활성화되기 위해서는, 다수의 가교결합 항체가 필요한 것으로 생각되고, 재현가능한 치료 효과를 달성하기 위해 작용 부위에 대한 이들 항체의 충분한 전달이 과제로 남아 있다. 따라서, 연관 질환의 치료를 위해 개선된 DR5 특이적 효능제가 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 본원에서 제공되는 사멸 수용체 5 (본원에서 "DR5"로서 언급됨)에 대해 작용하는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 "NB 작용제", 및 하나 이상의 상기 아미노산 서열 (각각 "화합물" 및 "폴리펩티드"로도 칭함) 및 그의 단편, 및 그 구축물을 코딩하는 핵산을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는 특이적 화합물 또는 구축물, 특히 단백질 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 DR5 특이적 구축물의 단량체 및 다량체 변이체가 본원에서 제공된다. NB 작용제의 인간화 (humanized) 및 휴머니어드 (humaneered) 변이체가 제공된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약상 관련 NB 작용제는 TRAIL 수용체 DR5의 효능제로서 작용한다.
본 발명은 또한 상기 아미노산 서열 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 상기 아미노산 서열 및 폴리펩티드의 제조 방법; 상기 아미노산 서열 또는 폴리펩티드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 상기 아미노산 서열, 폴리펩티드, 핵산 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물, 특히 제약 조성물; 및 특히 예방, 치료 또는 진단 목적, 예컨대 본원에서 언급되는 목적을 위한, 상기 아미노산 서열 또는 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본원에서 NB 작용제로서 설명된 TRAIL 수용체 DR5의 효능제는 DR5와 연관된 광범위한 질환에 대한 치료에 사용될 잠재력을 갖는다. 따라서, 본 발명의 이들 NB 작용제는 예를 들어 암, 예컨대 고형 종양, 원발성 및 전이성 암, 예컨대 신세포 암종, 및 폐암 (예를 들어, 소세포 폐암 "SCLC" 및 비-소세포 폐암 "NSCLC"), 췌장암, 조혈 악성종양, 신경교종, 성상세포종, 중피종, 결장직장암, 전립선암, 골육종, 흑색종, 림프종 (비제한적으로 버킷 (Burkitt) 림프종 포함), 유방암, 자궁내막암, 간암, 위암, 피부암, 난소암 및 임의의 기원 (예를 들어, 폐, 두경부, 유방, 갑상선, 자궁경부, 피부, 식도 등)의 편평세포암, 및 액상 암, 예를 들어 백혈병 (예를 들어, 문헌 [Uno et al., Nature Medicine, 12(6): 693-698(2006)] 참조), 예를 들어 특히 T-세포 백혈병, 예컨대 급성 T-세포 백혈병 (T-ALL), 급성 B-세포 백혈병 (B-ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 (AML), 형질 세포 골수종 및 다발성 골수종 (MM)을 비롯한 증식성 질환의 치료시에 유용성을 갖는다. 또한, 본 발명의 이들 NB 작용제는 염증성 및 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스, 하시모토 (Hashimoto) 질환, 류마티스 관절염, 이식편-대-숙주 질환, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 악성 빈혈, 애디슨 (Addison) 질환, 경피증, 굿패스쳐 (Goodpasture) 증후군, 크론 (Crohn) 병, 자가면역 용혈성 빈혈; 불임, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 바세도우 (Basedow) 병; 혈전성 혈소판감소증, 혈소판감소성 자반증, 인슐린-의존성 당뇨병, 알레르기; 천식; 아토피성 질환; 아테롬성동맥경화증; 심근염; 심근병증; 사구체신염; 및 저형성 (hypoplastic) 빈혈을 비롯한 비-암 적응증의 치료시에 유용성을 갖는다.
본원에서 설명되는 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 임의의 DR5에 대해 작용하거나 특이적일 수 있다. 하나의 비제한적인 측면에 따르면, 본원에서 설명되는 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 DR5에 대해 작용한다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 DR5 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 일반적으로 DR5를 조정하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 DR5에 의해 매개된 신호전달을 촉발, 활성화 및/또는 증가 또는 향상시킬 것이다. 한 실시양태에서, NB 작용제에 의한 DR5의 효능작용은 DR5와 연관된 생물학적 메카니즘, 반응 및 효과, 그의 신호전달 및/또는 DR5가 관여하는 경로를 조정, 특히 촉발 또는 증가시킬 것이다.
한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 화합물, 폴리펩티드 및 조성물은 특정 세포 또는 조직에서 아폽토시스를 유도, 촉발, 증가 또는 향상시킨다. 한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 화합물, 폴리펩티드 및 조성물은 DR5에 의해 매개되는 신호전달이 유도, 촉발, 증가 또는 향상되는 방식으로 세포 표면 상의 DR5에, 특히 DR5에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 폴리펩티드 및 조성물은 DR5가 존재하는 세포에서 아폽토시스가 촉발 또는 유도되는 방식으로 DR5에 결합할 수 있는 것이다.
한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 NB 화합물, (1가 또는 다가) 폴리펩티드 및 조성물은 DR5 상의 TRAIL의 결합 부위에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 DR5에 대한 결합을 위해 TRAIL과 경쟁한다. 한 실시양태에서, 그러한 화합물 및 폴리펩티드의 DR5에 대한 결합은 DR5에 의해 매개되는 신호전달을 유도, 촉발, 증가 또는 향상시키고, 특히 DR5가 존재하는 세포에서 아폽토시스를 촉발 또는 유도한다.
본 발명의 다른 측면, 실시양태, 이점 및 용도는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 TNF 수용체 패밀리 구성원에 대한 다가 항-DR5 NB 작용제의 결합을 보여주는 ELISA 실험의 그래프이다.
도 2는 4가 항-DR5 NB 작용제의 종양 조직 PD (카스파제3/7 활성화)의 그래프이다.
도 3은 Colo205 종양 모델에서 4가 및 5가 항-DR5 NB 작용제의 생체내 효능의 그래프이다.
도 4a 및 4b는 CSF-1R 억제제의 부재 (도 4a) 또는 존재 (도 4b) 하에 NSG 숙주 (즉, 대식세포/NK 결핍 숙주)에서 성장한 MiaPaCa 췌장 종양 모델에서 항-종양 활성을 보이는 11H6 사량체의 그래프이다.
도 5는 DR5에 특이적인 뮤린 항체인 LCR211에 불감성인 환자-유래 췌장 종양 TPAN1-IFA를 퇴행시키는 11H6 사량체의 능력을 보여준다.
도 6a, 6b 및 6c는 NB 구축물 내의 증가된 수의 하위단위 (subunit)가 (도 6a) Colo205 세포에서 11H6 삼량체, 사량체 및 오량체; (도 6b) Colo205 세포에서 4E6 및 11H6 사량체 및 오량체; 및 (도 6c) H226 세포에서 4E6 및 11H6 사량체 및 오량체의 개선된 효력 및 효능에 상응함을 보여주는 그래프이다.
본원에서 설명되는 NB 작용제, 즉 화합물, 폴리펩티드 (1가 또는 다가) 및 조성물은 사멸 수용체 5 ("DR5")에 결합한다. 한 실시양태에서, 개시된 화합물 및 폴리펩티드의 DR5에 대한 결합은 DR5에 의해 매개되는 신호전달을 유도, 촉발, 증가 또는 향상시키고, 특히 DR5가 존재하는 세포에서 아폽토시스를 촉발 또는 유도한다.
본원에서 사용될 때, 본 발명의 "NB 작용제"는 DR5 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 그의 결합이 DR5 활성에 대한 효능제 효과를 생성하는 적어도 하나의 CDR3 서열을 함유하는 폴리펩티드, 또는 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드로서 규정된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 VH 도메인의 일반적인 구조를 갖는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 VHH 도메인의 일반적인 구조를 갖는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 VL 도메인의 일반적인 구조를 갖는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 CDR3 서열 이외에 적어도 하나의 CDR1 및 적어도 하나의 CDR2 서열을 함유한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 화학식 I에 대해 아래에서 규정되는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 구성을 갖는 적어도 하나의 1가 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 단량체 조성물이다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 다량체 조성물이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 1가 조성물이다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 다가 조성물이다. 한 실시양태에서, 프레임워크 영역은 인간에서 사용하기 위해 최적화된 서열인 잔기들을 함유한다. 본 발명의 NB 작용제의 다른 측면은 아래에서 설명한다.
용어 "NB 작용제"는 본 발명의 조성물의 전체 범위를 포함하는 것을 의미하는 일반적인 용어로서 사용되는 반면, 용어 "NB 서열" 또는 별법으로 "NB 구축물"은 본원에서 서열 96-99로서 구체적으로 개시된 것 및 서열 96-99와 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하지만 축퇴성 코드가 상이한 서열을 비롯하여, 서열 1-72, 87-88 및 103-104로서 본원에서 개시된 특이적 폴리펩티드 변이체 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드를 나타내기 위해 본원에서 사용된다.
본 발명의 NB 작용제
한 실시양태에서, NB 작용제는 11D1, 11H6, 10F1, 7A12, 및 4E6, 또는 그의 변이체의 군 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 그의 서열이 인간에서 사용하기 위해 최적화된, 예를 들어 인간화된 변이체이다. 한 실시양태에서, 인간화 NB 작용제는 비제한적으로 4E6hu 및 11H6hu의 군을 포함한다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 나열된 군의 단량체 변이체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 나열된 군의 다량체 변이체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 나열된 군의 다량체 변이체는 단일특이적 변이체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 나열된 군의 다량체 변이체는 다중특이적 변이체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 다중특이적 NB 작용제에 의해 인식되는 다수의 에피토프는 DR5 표적의 다양한 에피토프, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 다중특이적 NB 작용제에 의해 인식되는 다수의 에피토프는 DR5 표적의 적어도 하나의 에피토프, 및 DR5 폴리펩티드 이외의 다른 표적 상의 적어도 하나의 에피토프 또는 그의 변이체이다.
한 실시양태에서, NB 작용제는 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104, 또는 서열 96-99, 또는 그의 변이체 중의 하나 이상으로부터 선택된다. NB 작용제 11D1, 11H6, 10F1, 7A12, 및 4E6, 또는 그의 변이체의 구체적인 실시양태는 아래 및 표 1-4에 제공된다.
본 발명의 예시적인 NB 작용제는 다음 NB 폴리펩티드 구축물 및 그의 변이체를 포함한다.
4 E6 패밀리
한 실시양태에서, NB 작용제는 4E6, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 서열 1의 단량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 서열 26의 단량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 작동가능하게 연결된 서열 1의 2개 이상의 단량체를 포함하는 다량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 작동가능하게 연결된 서열 26의 2개 이상의 단량체를 포함하는 다량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 작동가능하게 연결된 서열 1 및 서열 26의 2개 이상의 단량체를 포함하는 다량체, 또는 그의 변이체이고, 여기서 단량체는 임의의 순서로 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, 4E6 다량체 구축물은 서열 1의 삼량체, 사량체 또는 오량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 4E6 다량체 구축물은 서열 26의 삼량체, 사량체 또는 오량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 4E6 다량체 구축물은 서열 1 및 서열 26의 조합물의 삼량체, 사량체 또는 오량체, 또는 그의 변이체이고, 여기서 단량체는 임의의 순서로 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 서열 6-8 및 27-29 중의 임의의 하나 이상에서 제공되는 다량체, 또는 그의 변이체이다. 보다 고차의 다량체, 예컨대 6 - 10개의 하위단위로 이루어지는 다량체도 또한 고려된다.
한 실시양태에서, 4E6 구축물은 서열 64, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 서열 65, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 서열 42의 CDR1 서열, 서열 52의 CDR2 서열 및 서열 64 및/또는 서열 65 중의 임의의 하나 이상의 CDR3 서열, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 인간화 또는 휴머니어드 서열, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 서열 28에 제시된 것, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 서열 29에 제시된 것, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 각각 서열 35, 42, 46, 52, 57, 64 및 70, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 4E6 구축물은 각각 서열 36, 42, 47, 52, 58, 65 및 71, 또는 그의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 1의 4E6 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 다량체 또는 단편을 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 26의 4E6Hu 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 다량체 또는 단편을 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 4E6Hu 폴리펩티드의 하나 이상의 CDR 영역, 즉 서열 42, 52 및 64, 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 4E6 폴리펩티드의 하나 이상의 CDR 영역, 즉 서열 42, 52 및 65, 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 64의 CDR3 영역 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 65의 CDR3 영역 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다.
7A12 패밀리
한 실시양태에서, NB 작용제는 7A12, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 7A12 구축물은 서열 2의 단량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 7A12 구축물은 작동가능하게 연결된 서열 2의 2개 이상의 단량체를 포함하는 다량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 7A12 다량체 구축물은 서열 2의 삼량체, 사량체 또는 오량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 7A12 구축물은 서열 9-11 중의 임의의 하나에 제시된 다량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 7A12 구축물은 서열 63을 포함한다. 한 실시양태에서, 7A12 구축물은 서열 41의 CDR1 서열, 서열 51의 CDR2 서열 및 서열 63의 CDR3 서열, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 7A12 구축물은 인간화 또는 휴머니어드 서열, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 7A12 구축물은 서열 10에 제시된 것, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 7A12 구축물은 서열 11에 제시된 것, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 7A12 구축물은 각각 서열 34, 41, 45, 51, 56, 63 및 69, 또는 그의 변이체를 포함한다. 보다 고차의 다량체, 예컨대 6 - 10개의 하위단위로 이루어지는 다량체도 또한 고려된다.
한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 2의 7A12 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 다량체 또는 단편을 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 41, 51 및 63 중의 하나 이상의 CDR 영역, 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 63의 CDR3 영역 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다.
10F1 패밀리
한 실시양태에서, NB 작용제는 10F1, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 10F1 구축물은 서열 3의 단량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 10F1 구축물은 작동가능하게 연결된 서열 3의 2개 이상의 단량체를 포함하는 다량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 10F1 다량체 구축물은 서열 3의 삼량체, 사량체 또는 오량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 10F1 구축물은 서열 12-16 중의 임의의 하나에 제시된 다량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 10F1 구축물은 서열 68, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 10F1 구축물은 서열 44의 CDR1 서열, 서열 55의 CDR2 서열 및 서열 68의 CDR3 서열, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 10F1 구축물은 인간화 또는 휴머니어드 서열, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 10F1 구축물은 서열 15, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 10F1 구축물은 서열 16, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 10F1 구축물은 각각 서열 40, 44, 50, 55, 62, 68 및 72, 또는 그의 변이체를 포함한다. 보다 고차의 다량체, 예컨대 6 - 10개의 하위단위로 이루어지는 다량체도 또한 고려된다.
한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 3의 10F1 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 다량체 또는 단편을 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 44, 55 및 68 중의 하나 이상의 CDR 영역, 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 68의 CDR3 영역 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다.
11 D1 패밀리
한 실시양태에서, NB 작용제는 11D1, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11D1 구축물은 서열 4의 단량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11D1 구축물은 작동가능하게 연결된 서열 4의 2개 이상의 단량체를 포함하는 다량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11D1 다량체 구축물은 서열 4의 삼량체, 사량체 또는 오량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11D1 구축물은 서열 17-19 중의 임의의 하나 이상에 제시되는 다량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11D1 구축물은 서열 67, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 11D1 구축물은 서열 43의 CDR1 서열, 서열 54의 CDR2 서열 및 서열 67의 CDR3 서열, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 11D1 구축물은 인간화 또는 휴머니어드 서열, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11D1 구축물은 서열 18, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 11D1 구축물은 서열 19, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 11D1 구축물은 각각 서열 39, 43, 49, 54, 61, 67 및 71, 또는 그의 변이체를 포함한다. 보다 고차의 다량체, 예컨대 6 - 10개의 하위단위로 이루어지는 다량체도 또한 고려된다.
한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 4의 11D1 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 다량체 또는 단편을 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 43, 54 및 67 중의 하나 이상의 CDR 영역, 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 67의 CDR3 영역 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다.
11 H6 패밀리
한 실시양태에서, NB 작용제는 11H6, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 서열 5의 단량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 서열 30의 단량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 작동가능하게 연결된 서열 5의 2개 이상의 단량체를 포함하는 다량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 작동가능하게 연결된 서열 30의 2개 이상의 단량체를 포함하는 다량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 작동가능하게 연결된 서열 5 및 서열 30의 2개 이상의 단량체를 포함하는 다량체, 또는 그의 변이체 (예를 들어, 서열 88)이고, 여기서 단량체는 임의의 순서로 존재할 수 있다. 보다 고차의 다량체, 예컨대 6 - 10개의 하위단위로 이루어지는 다량체도 또한 고려된다.
한 실시양태에서, 11H6 다량체 구축물은 서열 5의 삼량체, 사량체 또는 오량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11H6 다량체 구축물은 서열 30의 삼량체, 사량체 또는 오량체, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11H6 다량체 구축물은 서열 5 및 서열 30의 조합물의 삼량체, 사량체 또는 오량체, 또는 그의 변이체이고, 여기서 단량체는 임의의 순서로 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 서열 20-22 및 31-33 중의 임의의 하나 이상에 제시되는 다량체, 또는 그의 변이체이다.
한 실시양태에서, 11H6 구축물은 서열 66 또는 83, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 서열 43의 CDR1 서열, 서열 53의 CDR2 서열 및 임의의 하나 이상의 서열 66의 CDR3 서열, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 인간화 또는 휴머니어드 서열, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 서열 31에 제시된 것, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 서열 32에 제시된 것, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 서열 33에 제시된 것, 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 각각 서열 37, 43, 48, 53, 59, 66 및 70, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 11H6 구축물은 각각 서열 38, 43, 48, 53, 60, 66 및 71, 또는 그의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 5의 11H6 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 다량체 또는 단편을 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 30의 11H6Hu 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 다량체 또는 단편을 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 43, 53 및 66 중의 하나 이상의 CDR 영역, 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 구축물은 서열 66의 CDR3 영역 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이다.
NB 작용제의 다른 고려되는 변이체
한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 11D1, 11H6, 10F1, 7A12, 및 4E6의 군 중에서 선택된 적어도 2개의 상이한 하위단위를 포함하는 다량체 구축물, 또는 그의 변이체이다. 하나의 그러한 실시양태에서, 다량체 구축물의 특정 순서는 교대하는 하위단위를 포함한다. 예시적인 구축물은 서열 84에 제시된다. 다량체 NB 구축물 내의 하위단위의 다른 배열이 고려된다. 당업자는 일반적으로 본원의 개시내용을 기초로 하고, 임의로, 예를 들어 제한된 수의 가능한 치환을 도입하고 이렇게 수득한 NB 구축물의 특성에 대한 그의 영향을 결정하는 것을 수반할 수 있는 제한된 정도의 통상적인 실험을 수행한 후, 적합한 치환, 결실 또는 삽입, 또는 이들의 적합한 조합을 결정하고 선택할 수 있을 것이다.
본원에서 제공되는 개시된 예시적인 NB 폴리펩티드 구축물 이외에, 본 발명은 단독으로 또는 재조합 벡터 내의 DNA 및 RNA 서열 또는 그의 변이체 등, 및/또는 특히 개시된 NB 구축물의 CDR3 영역을 코딩하는 단편을 포함하는 코딩 영역 또는 단편을 비제한적으로 포함하는, 본 발명의 개시내용 내에 포함되는 임의의 NB 작용제를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 표 1-4에 제공된 서열 중의 임의의 하나의 NB 구축물을 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 서열 1-5, 2, 3, 4, 5, 26, 30 및 87 중의 임의의 하나의 4E6 구축물을 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 서열 41-44, 51-55 및 63-68 중의 임의의 하나를 코딩하는 핵산이다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 서열 41-44, 51-55 및 63-68 중의 임의의 하나를 코딩하는 핵산이다.
본 발명의 예시적인 서열은 아래 표 1-4에 제시된다. 표제 용어 "ID"는 제시된 서열 번호를 나타낸다. 각각의 NB 구축물에 대한 FR 및 CDR 서열의 바람직한 조합은 본원 전체에 걸쳐 교환가능하게 사용된다.
<표 1>
Figure pct00001
<표 2>
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
<표 3>
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
<표 4>
Figure pct00009
본 발명의 NB 작용제의 추가의 측면을 아래에서 제시한다.
본원에서 설명되는 화합물, (1가 또는 다가) 폴리펩티드 및 조성물은 이들이 DR5에는 결합하지만 DR5 상의 TRAIL의 결합 부위에는 결합하지 않고/않거나 DR5에 대한 결합을 위해 TRAIL과 경쟁하지 않는 것일 수 있다. 상기 화합물 및 폴리펩티드는 DR5에 대한 그의 결합이 DR5에 의해 매개되는 신호전달을 유도, 촉발, 증가 또는 향상시키고, 특히 DR5가 존재하는 세포에서 아폽토시스를 촉발 또는 유도하는 것일 수 있다. 또한, 상기 화합물 및 폴리펩티드는 TRAIL의 그의 수용체에 대한 결합시에 이들이 TRAIL 및 DR5에 의해 매개되는 신호전달을 증가 또는 향상시키는 것일 수 있다. 상기 측면에 따르면, 동일한 수용체에 대한 TRAIL 및 본원에서 설명되는 화합물/폴리펩티드 둘 모두의 결합은 상기 신호전달에 대해 상승적인 효과를 유발할 수 있다.
한 구체적인 측면에서, 본원에서 설명되는 화합물 및 폴리펩티드는 DR5에 대해 작용하는 다량체 화합물 및 폴리펩티드 (본원에서 설명되는 바와 같은)이다. 특히, 본원에서 설명되는 화합물 및 폴리펩티드는, 세포막 상의 DR5를 다량체화할 수 있고 따라서 DR5에 의해 매개되는 신호전달을 유도, 촉발, 증가 또는 향상시킬 수 있고, 보다 특히 DR5가 존재하는 세포에서 아폽토시스를 촉발 또는 유도할 수 있는 다량체 폴리펩티드일 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 상기 단량체 또는 다량체 화합물 또는 폴리펩티드는 DR5 상의 TRAIL의 결합 부위 또는 그 부근에서 DR5에 결합할 수 있고/있거나 DR5에 대한 결합을 위해 TRAIL과 경쟁할 수 있다. 한 실시양태에서, 이들은 DR5 상의 TRAIL에 대한 결합 부위에 결합하지 않고/않거나, 본질적으로 DR5에 대한 TRAIL의 결합을 방해 또는 억제하지 않고/않거나 DR5에 대한 결합을 위해 TRAIL과 경쟁하지 않고, 심지어 그의 수용체에 대한 TRAIL의 결합시에 TRAIL 및 DR5에 의해 매개되는 신호전달을 증가 또는 향상시키는 것이다 (이것은 다시 DR5에 의해 매개된 신호전달에 대한 상승적인 효과를 유발할 수 있다). 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 천연 발생 TRAIL 리간드로부터 유래된 부분을 함유하고, 즉, 천연 TRAIL 리간드 폴리펩티드 또는 상기 TRAIL-리간드의 임의의 TRAIL-수용체 결합 단편으로 이루어진 분절을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 DR5와 연관된 질환 및 장애의 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, "DR5와 연관된 질환 및 장애"는 그에 대한 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체 (즉, 질환 또는 장애 또는 그의 적어도 하나의 증상을 갖고/갖거나 질환 또는 장애를 초래하거나 발생할 위험이 있는)에게 본 발명의 폴리펩티드 또는 조성물 (특히 그의 제약 활성량) 및/또는 DN5-매개 신호전달의 조정, 즉, 효능작용 또는 길항작용을 유도하는, DR5 또는 DR5가 관여하는 생물학적 경로 또는 메카니즘에 대해 활성을 보이는 공지의 활성 성분 (특히 그의 제약 활성량)을 적합하게 투여함으로써 각각 예방 및/또는 치료될 수 있는 것으로서 규정된다. 아래에서 나열되는 바와 같이, 질환에서 표적화되는 세포 또는 조직에서 아폽토시스의 유도에 의해 치료가능한 질환 및 장애는 DR5와 연관된 것으로서 특히 본원에 포함된다.
DR5와 연관된 질환 및 장애는 특히 DR5가 관여하는 신호전달, 메카니즘, 반응 및 효과를 촉발, 개시, 증가 또는 향상시킴으로써 (즉, DR5에 대한 또는 DR5 매개 신호전달에 대한 효능제 효과를 달성함으로써) 치료될 수 있는 질환 및 장애일 수 있다. 보다 특히, DR5와 연관된 질환 및 장애는 치료할 대상체에서 하나 이상의 세포 또는 조직에서 아폽토시스를 촉발, 개시, 증가 또는 향상시킴으로써 치료될 수 있는 질환 및 장애일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 DR5와 연관된 광범위한 질환에 대한 치료에 사용될 잠재력을 갖는, TRAIL 수용체 DR5의 효능제이다. DR5와 연관된 질환 및 장애의 예는 본원의 개시내용을 기초로 하여 당업자에게 명백해질 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 예를 들어 암, 예컨대 고형 종양, 원발성 및 전이성 암, 예컨대 신세포 암종, 및 폐암 (예를 들어, 소세포 폐암 "SCLC" 및 비-소세포 폐암 "NSCLC"), 췌장암, 조혈 악성종양, 신경교종, 성상세포종, 중피종, 결장직장암, 전립선암, 골육종, 흑색종, 림프종 (비제한적으로 버킷 림프종 포함), 유방암, 자궁내막암, 간암, 위암, 피부암, 난소암 및 임의의 기원 (예를 들어, 폐, 두경부, 유방, 갑상선, 자궁경부, 피부, 식도 등)의 편평세포암, 및 액상 암, 예를 들어 백혈병, 예를 들어 특히 T-세포 백혈병, 예컨대 급성 T-세포 백혈병 (T-ALL), 급성 B-세포 백혈병 (B-ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 (AML), 형질 세포 골수종 및 다발성 골수종 (MM)을 비롯한 증식성 질환의 치료시에 유용성을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 예를 들어 염증성 및 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스, 하시모토 질환, 류마티스 관절염, 이식편-대-숙주 질환, 쇼그렌 증후군, 악성 빈혈, 애디슨 질환, 경피증, 굿패스쳐 증후군, 크론 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 불임, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 바세도우 질환, 혈전성 혈소판감소증, 혈소판감소성 자반증, 인슐린-의존성 당뇨병, 알레르기; 천식, 아토피성 질환; 아테롬성동맥경화증; 심근염; 심근병증; 사구체신염; 및 저형성 빈혈을 포함하고 이로 제한되지 않는 비-암 적응증의 치료시에 유용성을 갖는다.
따라서, 이로 제한되지 않으면서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 예를 들어 현재 본원에서 및 인용된 참고 문헌에서 언급된 것과 같은 DR5-매개 신호전달을 조정할 수 있는 활성 성분으로 예방 또는 치료되는 모든 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 활성 성분을 사용한 그에 대한 치료가 현재 개발되고 있거나, 제안되었거나, 또는 장래에 제안되거나 개발될 모든 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 추가로 본원에서 설명되는 그의 유리한 특성 때문에, 본원의 폴리펩티드는, 그에 대해 상기 공지의 활성 성분이 현재 사용되고 있거나 또는 장래에 제안되거나 개발될 것 이외의 다른 질환 및 장애의 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있고/있거나; 본 발명의 폴리펩티드는 본원에서 설명되는 질환 및 장애의 치료를 위한 새로운 방법 및 요법을 제공할 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드의 다른 용도 및 사용은 본원의 추가의 개시내용으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 DR5와 연관된 질환 및 장애의 및 본원에 언급된 추가의 질환 및 장애의 진단, 예방 및/또는 치료에서 사용될 수 있는 약리학상 활성제, 및 이를 포함하는 조성물 (본원에서 설명되는 완전한 폴리펩티드, 및/또는 단편 및/또는 상기 폴리펩티드 또는 단편의 다량체 변이체 (이 모두를 본원에서 "본 발명의 조성물"로서 넒게 칭함)); 및 그러한 활성제 및 조성물의 투여 및/또는 사용을 수반하는 그러한 질환 및 장애의 진단, 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 현재 사용된 및/또는 당업계에 공지된 활성제, 조성물 및/또는 방법에 비해 특정 이점을 갖는 상기 약리학상 활성제, 조성물 및/또는 방법을 제공한다. 이들 이점은 아래 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 DR5, 특히 온혈 동물로부터의 DR5, 보다 특히 포유동물로부터의 DR5, 특히 인간 DR5에 대해 작용하는 아미노산 서열을 제공하고; 적어도 하나의 상기 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이 서열로 이루어지는 단백질 및 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 온혈 동물, 특히 포유동물, 특히 인간에서 예방, 치료 및/또는 진단 용도에 적합한 상기 아미노산 서열 및 상기 단백질 및/또는 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 온혈 동물, 특히 포유동물, 보다 특히 인간에서 DR5와 연관되고/되거나 DR5에 의해 매개되는 하나 이상의 질환, 장애 또는 병태 (예컨대 본원에 언급된 질환, 장애 및 병태)의 예방, 치료, 완화 및/또는 진단을 위해 사용될 수 있는 상기 아미노산 서열 및 상기 단백질 및/또는 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 온혈 동물, 특히 포유동물, 보다 특히 인간에서 DR5와 연관되고/되거나 DR5에 의해 매개되는 하나 이상의 질환, 장애 또는 병태 (예컨대 본원에 언급된 질환, 장애 및 병태)의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 또는 수의학적 조성물의 제조에서 사용하기 위한 상기 본 발명의 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 DR5에 대해 작용하고/하거나 특이적으로 결합할 수 있는 본 발명의 조성물; 및 적어도 하나의 상기 아미노산 서열을 포함하는 화합물 및 구축물, 및 특히 단백질 및 폴리펩티드를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 예를 들어 NCBI 단백질 데이터베이스에서 발견되는 등록 번호 "BAA33723"으로 규정되는 DR5 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 제공한다. 특히, 본 발명은 예를 들어 NCBI 단백질 데이터베이스에서 등록 번호 "BAA33723"으로 규정되는 DR5 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합할 수 있고 적어도 또 다른 TRAIL-수용체, 예컨대 TRAIL-R3 및 TRAIL-R4에 결합하지 않는 아미노산 서열을 제공한다. 인간 DR5의 짧은 스플라이스 변이체도 알려져 있다 (진뱅크 (GenBank) 등록 NP_671716).
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 제시되는 제약상 허용되는 범위 내의 KD-값 (실제 또는 겉보기), KA-값 (실제 또는 겉보기), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 별법으로 IC50 값으로서 적합하게 측정된 및/또는 표현된 친화도로 DR5에 결합할 수 있는 아미노산 서열; 및 적어도 하나의 상기 아미노산 서열을 포함하는 화합물 및 구축물, 및 특히 단백질 및 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은
a) 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수 (KD)로 (즉, 105 내지 1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107 내지 1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108 내지 1012 리터/몰의 회합 상수 (KA)로) DR5에 결합하고/하거나;
b) 102 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1 내지 107 M-1s-1의 kon-속도로 DR5에 결합하고/하거나;
c) 1 s-1 (t1 /2=0.69 s) 내지 10-6 s-1 (수일의 t1 /2을 갖는 근 비가역적 (near irreversible) 복합체를 제공함), 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1 내지 10-6 s-1의 koff 속도로 DR5에 결합하는 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 (1가이든 다가이든)은 100 nM 미만, 및/또는 10 nM 미만, 및/또는 1 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 DR5에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 4가 조성물이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 5가 조성물이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 (1가이든 다가이든)은 100 nM 미만, 바람직하게는 10 nM 미만, 보다 바람직하게는 1 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 IC50으로 다양한 암 세포 종류 (예를 들어, 적어도 하나의 종류)에서 아폽토시스를 특이적으로 유도할 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 다가 아미노산 서열은 예를 들어 실험 부분에서 언급되는 비-종양 세포주, 예를 들어 Huvec, IMR-90 및 ARPE-19에서 측정될 때, 정상 (비-종양) 세포주에서보다 종양 세포주에서 적어도 10배 더 강하거나, 정상 (비-종양) 세포주에서보다 적어도 100배 더 강하다. 실시예와 표 13 참조.
DR5에 대한 결합을 위해, 본 발명의 조성물은 대체로 그를 통해 본 발명의 아미노산 서열이 DR5에 결합할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 하나 이상의 스트레치 (stretch) (즉, 각각의 "스트레치"는 아미노산 서열의 1차 (선형) 또는 3차 (입체형태적) 구조 내에 서로 인접하거나 또는 서로 매우 근접하는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함함)를 그의 아미노산 서열 내에 함유할 것이고, 상기 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 스트레치는 DR5에 대한 결합을 위한 "부위" (본원에서 또한 "항원 결합 부위" 또는 "에피토프"로서 칭함)를 형성한다. 에피토프 맵핑 (mapping) 실험을 본원에서 실시예에 제공한다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 본 발명의 조성물은 본질적으로 단리된 형태이거나, 또는 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어질 수 있는 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 일부를 형성한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 그러한 추가의 서열은 하나 이상의 적합한 링커를 통해 연결된다. 비제한적으로, 본 발명의 조성물은 상기 단백질 또는 폴리펩티드 내의 결합 단위로서 사용될 수 있다. 상기 본 발명의 조성물은 각각 본 발명의 1가, 다가 또는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하기 위해 추가의 결합 단위로서 (즉, DR5 이외의 하나 이상의 다른 표적에 대해) 기능할 수 있는 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 그러한 단백질 또는 폴리펩티드도 본질적으로 단리된 형태로 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 임의의 다른 아미노산 서열 또는 사슬에 디술피드 가교를 통해 연결되지 않은 단일 아미노산 사슬 (그러나, 하나 이상의 분자내 디술피드 가교를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있음) 또는 제약상 관련 조성물로 본질적으로 이루어진다. 분자내 디술피드 가교의 예로서, 낙타류 (camelid) VHH 구축물은 때로 CDR3 및 CDR1 또는 FR2 사이에 디술피드 가교를 함유할 수 있음이 알려져 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 서로 및/또는 다른 아미노산 서열에 연결되어 (예를 들어 디술피드 가교를 통해) 다른 펩티드 구축물 (예를 들어 Fab' 단편, F(ab')2 단편, ScFv 구축물, "디아바디 (diabody)" 및 다른 다가 및/또는 다중특이적 구축물을 제공할 수 있다. 문헌 [Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9): 1126-36]의 검토를 참조한다. 제약상 관련 조성물의 예는 질환을 치료하는 약물, 또는 반감기를 증가시키고, 특이적 조직을 표적화하고/하거나 표적 세포를 죽이는 조성물을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 임의의 다른 아미노산 서열 또는 사슬에 적어도 하나의 분자간 디술피드 가교를 통해 연결된 단일 아미노산 사슬 (하나 이상의 분자내 디술피드 가교를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있음) 또는 제약상 관련 조성물로 본질적으로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물이 대상체에 투여하도록 의도될 때 (예를 들어, 본원에서 설명되는 치료 및/또는 진단 목적을 위해), 조성물은 상기 대상체에서 천연 생성되지 않는 아미노산 서열이거나; 또는 상기 대상체에서 천연 생성되는 것일 경우에는 본질적으로 단리된 형태로 존재하는 아미노산 서열이다.
제약 용도를 위한 한 실시양태에서, 본 발명의 개시된 아미노산 서열 (및 이를 포함하는 화합물, 구축물 및 폴리펩티드)은 인간 DR5에 대해 작용한다. 한 실시양태에서, 수의학적 목적을 위해, 상기 개시된 조성물은 치료되는 종으로부터의 DR5에 대해 작용한다. 수의학적 목적을 위한 한 실시양태에서, 상기 개시된 조성물은 치료되는 종으로부터의 DR5와 교차반응성이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 아미노산 서열은 DR5에 대한 결합을 위한 적어도 하나의 결합 부위를 갖고, 다른 에피토프, 항원, 단백질 또는 표적에 대한 결합을 위한 하나 이상의 추가의 결합 부위를 함유할 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드, 및 그를 포함하는 조성물의 효능은 관련된 특이적인 질환 또는 장애에 따라 임의의 적합한 시험관내 검정, 세포-기반 검정, 생체내 검정 및/또는 자체로 공지된 동물 모델, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 시험할 수 있다. 이들은 예를 들어 종양에 대한 동물 모델에서 아폽토시스, 종양 세포의 증식, 및/또는 종양의 성장에 대한 본원에서 설명되는 아미노산 서열 또는 화합물의 영향을 측정하기 위한 검정 또는 모델일 수 있다. 적합한 검정 및 동물 모델은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 아래 실험 부분 및 본원에 인용된 관련 참고문헌에서 사용된 검정 및 동물 모델을 포함한다. 그 예는 결합 검정, 예컨대 ELISA, FACS 또는 표면 플라즈몬 공명 방법; 기능적 시험관내 검정, 예컨대 일군의 종양 및 정상 세포주를 사용한 시험관내 세포 생존 검정, 주르카트 (Jurkat) 세포 생존 검출을 사용한 시험관내 효능 검정; 기능적 생체내 검정, 예컨대 다양한 효능, PK 및 PD 데이터를 제공하는 카스파제 3/7 활성화 판독과 조합된 단일 용량 생체내 연구이다.
본 발명에 따른 한 실시양태에서, 온혈 동물의 제1 종으로부터의 DR5에 대해 작용하는 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 온혈 동물의 하나 이상의 다른 종으로부터의 DR5와 교차반응성을 보이거나 보이지 않을 수 있다. 예를 들어, 인간 DR5에 대해 작용하는 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 질환의 동물 모델 (예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 돼지 또는 개), 특히 DR5와 연관된 질환 및 장애의 동물 모델 (예컨대 본원에서 언급되는 종 및 동물 모델)에서 종종 사용되는, 영장류 (예컨대, 비제한적으로, 마카카 (Macaca) 속으로부터의 원숭이 (예컨대, 및 특히, 사이노몰거스 (cynomologus) 원숭이 ("사이노 (cyno)"로도 알려진 마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis)) 및/또는 붉은털 (rhesus) 원숭이 (마카카 물라타 (Macaca mulatta)) 및 개코원숭이 (파피오 우르시누스 (Papio ursinus)))의 하나 이상의 다른 종으로부터의 DR5 및/또는 동물의 하나 이상의 종으로부터의 DR5와 교차 반응성을 보이거나 보이지 않을 수 있다. 이와 관련하여, 인간 DR5에 대해 작용하는 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 그러한 질환 모델에서 시험될 수 있도록 하기 때문에, 존재할 경우 그러한 교차 반응성은 약물 개발 관점으로부터 이점을 가질 수 있다는 것은 당업자에게 명백해질 것이다. 본원에서 제공되는 다양한 본 발명의 구축물은 사이노 DR5와 특이적인 교차 반응성을 보인다.
한 실시양태에서, 다수의 종의 포유동물로부터의 DR5와 교차반응성인 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열 또는 폴리펩티드가 다수 종에 걸쳐 사용될 수 있도록 할 것이기 때문에 수의학적 용도에 사용하기 위해 대체로 이로울 것이다. 따라서, 한 실시양태에서 동물의 한 종으로부터의 DR5에 대해 작용하는 아미노산 서열 및 폴리펩티드 (예컨대 인간 DR5에 대해 작용하는 아미노산 서열 및 폴리펩티드)는 아미노산 서열 및/또는 폴리펩티드의 사용이 치료되는 종에서 목적하는 효과를 제공한다면 또 다른 종의 동물의 치료에서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 그의 가장 넓은 의미에서 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 작용하는 DR5의 특이적 항원 결정기, 에피토프, 일부, 도메인, 하위단위 또는 입체형태 (적용가능한 경우)로 특히 제한되거나 이로 규정되지 않는다. 그러나, 한 실시양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 DR5의 세포외 도메인에 대해 작용한다. 하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 DR5의 DR5-결합 도메인에 대해 작용하고, 본원에서 추가로 규정된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 1가 또는 다가 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 실험 부분에서 설명되는 바와 같이 경쟁적 결합 검정에서 DR5의 천연 리간드와 경쟁한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 1가 또는 다가 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 경쟁적 결합 검정에서 DR5의 천연 리간드와 상승적으로 결합한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 적용가능한 경우, 본 발명의 아미노산 서열은 DR5의 2개 이상의 항원 결정기, 에피토프, 일부, 도메인, 하위단위 또는 입체형태에 결합할 수 있다. 그러한 경우에, 본 발명의 아미노산 서열 및/또는 폴리펩티드가 결합하는 DR5의 항원 결정기, 에피토프, 일부, 도메인 또는 하위단위는 본질적으로 동일할 수 있거나 (예를 들어, DR5가 반복되는 구조적 모티프를 함유하거나 또는 다량체 형태로 발생할 경우) 또는 상이할 수 있다 (및 후자의 경우에, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 동일하거나 상이할 수 있는 친화도 및/또는 특이성으로 DR5의 그러한 상이한 항원 결정기, 에피토프, 일부, 도메인, 하위단위에 결합할 수 있다). 또한, 예를 들어, DR5가 활성화된 입체형태로 및 불활성 입체형태로 존재할 때, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 이들 입체형태 중 어느 하나에 결합할 수 있거나, 이들 입체형태 모두에 결합할 수 있다 (즉, 동일하거나 상이할 수 있는 친화도 및/또는 특이성으로). 또한, 예를 들어, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 관련 리간드에 결합하는 DR5의 입체형태에 결합할 수 있거나, 관련 리간드에 결합하지 않는 DR5의 입체형태에 결합할 수 있거나, 또는 그러한 입체형태 모두에 결합할 수 있다 (다시 동일하거나 상이할 수 있는 친화도 및/또는 특이성으로).
또한, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 DR5의 모든 천연 발생 또는 합성 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 일부 및 단편에; 또는 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 결합하는 DR5 내의 (예를 들어 야생형 DR5 내의) 항원 결정기(들) 또는 에피토프(들)과 본질적으로 동일한 하나 이상의 항원 결정기 또는 에피토프를 함유하는 적어도 DR5의 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 일부 및 단편에 일반적으로 결합할 것으로 예상된다. 다시, 그러한 경우에, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 본 발명의 아미노산 서열이 (야생형) DR5에 결합하는 친화도 및 특이성과 동일한 또는 상이한 (즉, 더 높거나 더 낮은) 친화도 및/또는 특이성으로 상기 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 일부 및 단편에 결합할 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 DR5의 일부 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 일부 및 단편에 결합하지만 다른 것에는 결합하지 않는 것도 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
일반적으로, DR5가 단량체 형태 및 하나 이상의 다량체 형태로 존재할 때, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 단량체 형태의 DR5에만 결합하거나, 다량체 형태의 DR5에만 결합하거나, 또는 단량체 및 다량체 형태 둘 모두에 결합하는 것은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 다시, 그러한 경우에, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 본 발명의 아미노산 서열이 다량체 형태에 결합하는 친화도 및 특이성과 동일한 또는 상이한 (즉, 더 높거나 더 낮은) 친화도 및/또는 특이성으로 단량체 형태에 결합할 수 있다.
또한, DR5가 다른 단백질 또는 폴리펩티드와 회합하여 단백질 복합체 (예를 들어 다수의 하위단위를 갖는 것)를 형성할 때, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 그의 비-회합 상태의 DR5에 결합하거나, 그의 회합 상태의 DR5에 결합하거나, 또는 둘 모두에 결합하는 것은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들 모든 경우에, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 그의 단량체 및 비-회합 상태의 DR5에 결합하는 친화도 및 특이성과 동일한 또는 상이할 수 있는 (즉, 더 높거나 더 낮은) 친화도 및/또는 특이성으로 그러한 다량체 또는 회합된 단백질 복합체에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 당업자에게 명백할 것인 바, DR5에 대해 작용하는 2개 이상의 아미노산 서열을 함유하는 본 발명의 조성물은 상응하는 단량체 아미노산 서열(들)보다 더 높은 결합력으로 DR5에 결합할 수 있다. 예를 들어, 및 비제한적으로, DR5의 동일한 또는 상이한 에피토프에 대해 작용하는 아미노산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10개 이상의 작동가능하게 연결된 단량체 단위를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드는 각각의 상이한 단량체보다 더 높은 결합력으로 결합할 수 있고 (및 대체로 결합할 것이고), DR5에 대해 작용하는 2, 3, 4개 이상의 아미노산 서열을 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 DR5의 다량체에 더 높은 결합력으로 결합할 수 있다 (및 대체로 결합할 것이다). 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 아미노산 링커에 의해 연결된, DR5에 대해 작용하는 4개의 단량체로 이루어진 단일 폴리펩티드 사슬이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 아미노산 링커에 의해 연결된, DR5에 대해 작용하는 5개의 단량체로 이루어진 단일 폴리펩티드 사슬이다.
일반적으로, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 당업자에게 명백할 것인 바 생물학적 및/또는 치료적 관점으로부터 가장 관련되는 DR5의 형태 (단량체, 다량체 및 회합 형태 포함)에 적어도 결합할 것이다.
본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드의 일부, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자 및/또는 유도체를 포함하는 조성물의 사용, 및/또는 본원에서 고려되는 용도에 적합한 하나 이상의 상기 조성물을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는 단백질 또는 폴리펩티드의 사용은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 DR5에 대한 결합을 위한 기능적 항원 결합 부위 (의 적어도 일부)를 함유할 것이다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 DR5에 특이적으로 결합할 수 있을 것이다. 한 실시양태에서, 그러한 조성물은 본원에 제공된 바와 같은 친화도 (KD-값 (실제 또는 겉보기), KA-값 (실제 또는 겉보기), kon-속도 및/또는 koff-속도로서, 또는 별법으로 본원에서 추가로 설명되는 IC50 값으로서 적합하게 측정된 및/또는 표현된)로 DR5에 결합할 수 있을 것이다. 그러한 조성물의 일부 비-제한적인 예는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다. 본 발명의 추가의 단편 또는 폴리펩티드는 또한 본원에서 설명되는 하나 이상의 (보다 작은) 조성물을 적합하게 조합함으로써 (즉, 연결 또는 유전자 융합에 의해) 제공될 수 있다.
본 발명의 하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드의 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자, 및/또는 유도체는 이들이 그로부터 유래된 아미노산 서열에 비해 증가된 혈청내 반감기 (추가로 본원에서 설명됨)를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 아미노산 서열은 반감기가 증가된 본 발명의 아미노산 서열의 유도체를 제공하기 위해 반감기를 연장하는 하나 이상의 기 또는 모이어티 (moiety) (예컨대 PEG)에 연결될 수 있다 (화학적으로 또는 다른 방식으로).
하나의 특정, 그러나 비제한적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열은 이뮤노글로불린 폴드를 포함하는 아미노산 서열일 수 있거나 또는 적합한 조건 (예컨대 생리학적 조건) 하에 이뮤노글로불린 폴드를 형성할 수 있는 (즉, 폴딩함으로써) 아미노산 서열일 수 있다. 특히 문헌 [Halaby et al., J. (1999) Protein Eng. 12, 563-71]의 검토를 참조한다. 한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 폴드를 형성하기 위해서 적절하게 폴딩될 때, 그러한 아미노산 서열은 DR5에 특이적으로 결합할 수 있다. 추가의 한 실시양태에서, 그러한 구축물은 본원에 제공된 바와 같은 친화도 (KD-값 (실제 또는 겉보기), KA-값 (실제 또는 겉보기), kon-속도 및/또는 koff-속도로서, 또는 별법으로 본원에서 추가로 설명되는 IC50 값으로서 적합하게 측정된 및/또는 표현된)로 DR5에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 아미노산 서열의 일부, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자 및/또는 유도체는 이뮤노글로불린 폴드를 포함하거나 또는 적합한 조건 하에 이뮤노글로불린 폴드를 형성할 수 있는 것이다.
특히, 그러나 비제한적으로, 본 발명의 아미노산 서열은 본질적으로 4개의 프레임워크 영역 (각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4) 및 3개의 사이에 배치된 상보성 결정 영역 (각각 CDR1, CDR2 및 CDR3)으로 이루어진 아미노산 서열; 또는 그러한 아미노산 서열의 임의의 적합한 단편 (본원에서 추가로 설명되는 적어도 하나의 CDR을 형성하는 적어도 일부의 아미노산 잔기를 대체로 함유할 것임)일 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 영역은 다음 화학식 I에 제시된 바와 같이 배열된다.
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 (화학식 I)
본 발명의 아미노산 서열은 특히 이뮤노글로불린 서열 또는 그의 적합한 단편일 수 있고, 보다 특히 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열 또는 그의 적합한 단편, 예컨대 경쇄 가변 도메인 서열 (예를 들어 VL 서열) 또는 그의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 영역 도메인 서열 (예를 들어 VH 서열) 또는 그의 적합한 단편일 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열이 중쇄 가변 영역 도메인 서열일 때, 이는 통상적인 4-사슬 항체로부터 유래된 중쇄 가변 영역 도메인 서열 (예컨대, 비제한적으로, 인간 항체로부터 유래된 VH 서열)일 수 있거나 또는 소위 "중쇄 항체"로부터 유래된 소위 VHH-서열일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 아미노산 서열 (또는 이를 발현하기 위해 사용된 본 발명의 뉴클레오티드 서열)의 기원이나, 본 발명의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 생성되거나 수득되는 (또는 생성되었거나 수득된) 방법에 대해 이로 제한되지 않음을 유의하여야 한다. 따라서, 본 발명의 아미노산 서열은 천연 발생 아미노산 서열 (임의의 적합한 종으로부터의) 또는 합성 또는 반합성 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 본 발명의 구체적인, 그러나 비제한적인 측면에서, 아미노산 서열은 천연 발생 이뮤노글로불린 서열 (임의의 적합한 종으로부터의) 또는 비제한적으로 "인간화" 이뮤노글로불린 서열 (예를 들어, 부분적으로 또는 완전히 인간화된 마우스, 토끼 또는 원숭이 이뮤노글로불린 서열 (또는 당업자에 의해 고려되는 임의의 다른 포유동물 종의 이뮤노글로불린 서열), 및 특히 부분적으로 또는 완전히 인간화된 낙타류 VHH 서열 또는 그의 단편), "낙타화 (camelization)" 이뮤노글로불린 서열, 및 친화도 성숙 (예를 들어, 합성, 무작위 또는 천연 발생 이뮤노글로불린 서열로부터 출발하는), CDR 그라프팅 (grafting), 베니어링 (veneering), 상이한 이뮤노글로불린 서열으로부터 유래된 단편의 조합, 겹치는 프라이머를 사용한 PCR 조립 (assembly), 및 당업자에게 공지된 이뮤노글로불린 서열의 조작을 위한 유사한 기술; 또는 임의의 상기 기술의 임의의 적합한 조합과 같은 기술에 의해 얻은 이뮤노글로불린 서열을 포함하는 합성 또는 반합성 이뮤노글로불린 서열이다. 예를 들어, 표준 안내서, 및 추가의 설명 및 본원에 언급된 관련 참고문헌을 참조한다.
유사하게, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 천연 발생 뉴클레오티드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있고, 예를 들어 적합한 천연 발생 주형 (예를 들어 세포로부터 단리된 DNA 또는 RNA)으로부터 PCR에 의해 단리된 서열, 라이브러리 (특히, 발현 라이브러리)로부터 단리된 뉴클레오티드 서열, 돌연변이를 천연 발생 뉴클레오티드 서열 내로 도입함으로써 (공지된 임의의 적합한 기술, 예컨대 미스매치 (mismatch) PCR을 사용하여) 제조된 뉴클레오티드 서열, 겹치는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조된 뉴클레오티드 서열, 또는 자체 공지된 DNA 합성을 위한 기법을 사용하여 제조된 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열은 특히 도메인 항체 (또는 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열), 단일 도메인 항체 (또는 단일 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열), "dAb" (또는 dAb로서 사용하기 적합한 아미노산 서열) 또는 낙타류 항체 (및 비제한적으로 VHH 서열 또는 그의 변이체 포함); 다른 단일 가변 도메인, 또는 그의 임의의 하나의 임의의 적합한 단편일 수 있다. (단일) 도메인 항체의 일반적인 설명에 대해서는, 상기 인용된 관련 참고문헌, 및 EP 0 368 684를 또한 참조한다. 용어 "dAb"에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Ward et al. (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6)], [Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11): 484-490]; 및 예를 들어, WO 06/030220, WO 06/003388 및 도만티스 엘티디 (Domantis Ltd)의 다른 공개된 특허 출원을 참조한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단일 도메인 항체 또는 단일 가변 도메인은 상어의 특정 종으로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 소위 "IgNAR 도메인", 예를 들어, WO 05/18629 참조).
특히, 본 발명의 아미노산 서열은 낙타류 중쇄 가변 영역 도메인 구축물 (예를 들어, VHH 또는 그의 변이체, 예를 들어 WO 2008/020079에 규정된, 예를 들어 인간 치료제로서 사용하기 위해 최적화된 변이체) 또는 그의 적합한 단편 또는 변이체일 수 있다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 나노바디 (NANOBODY)? 또는 그의 구축물이다. 나노바디™, 나노바디즈 (NANOBODIES)™ 및 나노클론 (NANOCLONE)™은 애블링스 엔.브이. (Ablynx N.V.)의 등록 상표이다. "인간화" 또는 다른 변경 또는 최적화 여부와 상관없이 DR5에 대해 작용하는 특이적 중쇄 가변 영역 도메인 구축물은 본원에서 본 발명의 "NB 서열"로 언급될 것이다.
본원에서 사용될 때, 문구 "서열 최적화된", 또는 별법으로 "변경된 또는 최적화된" 서열은, 그가 투여되는 대상체에 의한 NB 작용제에 대한 면역원성 반응의 발생을 감소시키기 위해 특히 프레임워크 영역 내의 NB 작용제의 잔기의 교체를 나타내도록 규정된다. 대상체가 인간인 경우에, 이 문구는 서열을 인간화하기 위한 당업계에 공지된 임의의 기술을 포함한다.
한 실시양태에서, NB 작용제는 소위 "VH3 클래스" (즉, VH3 클래스의 인간 배선 (germline) 서열, 예컨대 DP-47, DP-51 또는 DP-29에 대한 고도의 서열 상동성을 갖는 NB 구축물)이다. 한 실시양태에서, NB 구축물의 상기 VH3 클래스는 본 발명의 프레임워크 영역을 포함한다. 그러나, 본 발명은 그의 가장 넓은 의미에서 일반적으로 DR5에 대해 작용하는 임의의 종류의 NB 작용제를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 또한 소위 "VH4 클래스"에 속하는 NB 구축물 (즉, VH4 클래스의 인간 배선 서열, 예컨대 DP-78에 대한 고도의 서열 상동성을 갖는 NB 구축물)을 포함한다. 예를 들어, WO 07/118670을 참조한다.
한 실시양태에서, NB 구축물 (특히, 완전히 인간화된 및 부분적으로 인간화된 구축물)은 하나 이상의 프레임워크 서열 내의 하나 이상의 "홀마크 (Hallmark) 잔기"의 존재를 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 구축물 내에 존재하는 프레임워크 서열은 아미노산 서열이 낙타류 VHH 구축물의 변이체가 되도록 하는 것일 수 있다. 상기 프레임워크 서열 및 다른 홀마크 잔기 (의 적합한 조합)의 일부 비-제한적인 예는 예를 들어 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함되는 WO 2008/020079, 페이지 65-98에서 볼 수 있다. 당업계에 공지된 다른 인간화 또는 부분적으로 인간화된 잔기도 본 발명에 포함되는 것으로 고려된다.
일반적으로, VH 또는 VHH 구축물은 FR1 내지 FR4가 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 의미하고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하는 화학식 I의 (일반적인) 구조를 갖는 아미노산 서열로서 규정될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 카바트 (Kabat) 넘버링에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108의 하나 이상의 아미노산 잔기가 WO 2008/020079의 표 A-3에서 언급된 홀마크 잔기로부터 선택되고 상기 아미노산 서열이 WO 2008/020079 내의 서열 1 내지 22의 적어도 하나의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 동일성을 갖는, 화학식 I의 (일반적인) 구조를 갖는 아미노산 서열을 갖는 NB 구축물일 수 있고, 여기서 아미노산 동일성 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기 (서열에 X로 표시됨)는 무시한다.
비제한적으로 다양한 포맷 또는 스캐폴드를 포함하는 본 발명의 NB 작용제에서, CDR 서열은 일반적으로 표 1-3에서 제시되고 특히 표 4의 서열 번호에 의해 구체적으로 지정된 것이다. 특히, CDR1은 서열 41 내지 44 중의 임의의 하나일 수 있고; CDR2는 서열 51 내지 55 중의 임의의 하나일 수 있고; CDR3은 서열 63 내지 68 중의 임의의 하나일 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 DR5에 결합할 수 있고/있거나 이에 대해 작용하는 상기 VH 구축물, 그의 적합한 단편, 및 하나 이상의 상기 VH 구축물 및/또는 적합한 단편을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는 폴리펩티드에 관한 것이다.
일반적으로, 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104는 DR5에 대해 생성된 많은 NB 작용제의 아미노산 서열을 제공한다 (표 1-4 참조). 서열 96-99는 본원에서 제공되는 특이적인 NB 작용제를 코딩하는 특이적인 핵산 서열을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 DR5에 결합할 수 있고/있거나 이에 대해 작용하고 서열 1-22, 26-40, 87-88 및 103-104의 아미노산 서열 중의 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는, 예를 들어 표 1 내지 4에 제시된 바와 같은 NB 작용제이고, 여기서 아미노산 동일성 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시되고, 카바트 넘버링에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108의 하나 이상의 아미노산 잔기는 홀마크 잔기이다.
다양한 실시양태에서 및 표 4에 제시된 바와 같이, NB 구축물은 서열 34 내지 40의 프레임워크 1 서열, 서열 45 내지 50의 프레임워크 2 서열, 서열 56 내지 62의 프레임워크 3 서열 및 서열 69 내지 72의 프레임워크 4 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 서열 1-22, 26-40, 87-88 및 103-104의 NB 구축물의 프레임워크 1 서열의 위치 1 내지 4 및 27 내지 30의 아미노산 잔기는 아미노산 동일성 정도의 결정을 위해 무시된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제 및 조성물은 임의의 적합한 수단으로 및 임의의 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있고, 예를 들어 천연 발생 VHH 서열 (즉, 낙타류의 적합한 종으로부터의) 또는 비제한적으로 "인간화" NB 작용제, "낙타화" 이뮤노글로불린 서열 (특히, 낙타화 중쇄 가변 영역 도메인 서열), 및 친화도 성숙 (예를 들어, 합성, 무작위 또는 천연 발생 이뮤노글로불린 서열로부터 출발하는), CDR 그라프팅, 베니어링, 상이한 이뮤노글로불린 서열으로부터 유래된 단편의 조합, 겹치는 프라이머를 사용한 PCR 조립, 및 당업자에게 공지된 이뮤노글로불린 서열의 조작을 위한 유사한 기술; 또는 본원에서 추가로 설명되는 임의의 상기 기술의 임의의 적합한 조합과 같은 기술에 의해 얻은 NB 작용제를 포함하는 합성 또는 반합성 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물이 VHH 서열을 포함할 경우, 상기 조성물은 본 발명의 하나 이상의 추가의 (부분적으로 또는 완전히) 인간화된 조성물을 제공하기 위해 본원에 설명된 바와 같이 적합하게 인간화될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물이 합성 또는 반합성 서열 (예컨대 부분적으로 인간화된 서열)을 포함할 경우, 상기 조성물은 임의로 추가로 적합하게 인간화, 예를 들어, 다시 부분적으로 또는 완전히 인간화될 수 있다.
한 실시양태에서, 인간화 조성물은 인간화 치환이고/이거나 인간화 치환에 상응하는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 존재하는 (특히, 적어도 하나의 프레임워크 잔기 내에) 아미노산 서열이다. 그러한 비제한적인 실시양태에서, 인간화 치환 (및 그의 적합한 조합)은 본원의 개시내용을 기초로 하여 당업자에게 명백할 것이다. 한 실시양태에서, 잠재적으로 유용한 인간화 치환은 천연 발생 VHH 서열의 프레임워크 영역의 서열을 하나 이상의 밀접하게 관련된 인간 VH 서열의 상응하는 프레임워크 서열과 비교함으로써 확인할 수 있고, 이후에 이와 같이 결정된 하나 이상의 잠재적으로 유용한 인간화 치환 (또는 그의 조합)은 자체로 공지된 임의의 방식으로 상기 VHH 서열 내로 도입될 수 있다. 한 실시양태에서, 생성되는 인간화 VHH 서열은 표적에 대한 친화도, 안정성, 발현 용이성 및 수준, 및/또는 다른 목적하는 특성에 대해 시험된다. 상기 방식에서, 제한된 정도의 시행착오에 의해, 다른 적합한 인간화 치환 (또는 그의 적합한 조합)은 본원의 개시내용을 기초로 하여 당업자가 결정할 수 있다. 또한, 상기 내용을 기초로 하여, 본 발명의 조성물(의 프레임워크 영역)은 부분적으로 인간화 또는 완전히 인간화될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원의 인간화 조성물은 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의, 및 서열 96-99의 조성물의 인간화 변이체이다. 한 실시양태에서, 인간화 NB 구축물은 표 3에 제공된 바와 같다.
따라서, 본 발명의 일부 다른 바람직한 조성물은 (본원에 추가로 규정하는 바와 같이) DR5에 결합할 수 있고, (a) 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중의 하나의 인간화 변이체이고/이거나; (b) 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중의 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 조성물이다. 한 실시양태에서, 아미노산 동일성 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시한다.
한 실시양태에서, 카바트 넘버링에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108의 하나 이상의 아미노산 잔기는 WO 2008/020079의 표 A-3에서 언급된 홀마크 잔기로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 DR5에 대한 결합을 위해 특히 적합한 많은 아미노산 잔기의 스트레치 (즉, 작은 펩티드)를 제공한다. 이들 아미노산 잔기의 스트레치는 특히 이들이 본 발명의 아미노산 서열의 항원 결합 부위(의 일부)를 형성하는 방식으로 본 발명의 아미노산 서열에 존재하고/하거나 이 서열 내에 통합될 수 있다. 이들 아미노산 잔기의 스트레치는 먼저 DR5에 대해 생성된 중쇄 항체의 CDR 서열 또는 VHH 서열로서 생성되기 때문에 (또는 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이 상기 CDR 서열을 기초로 하고/하거나 이 서열로부터 유래될 수 있기 때문에), 상기 스트레치는 또한 본원에서 일반적으로 "CDR 서열"로서 (즉, 각각 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열로서) 언급될 것이다. 그러나, 그의 가장 넓은 의미에서 본 발명은, 이들 아미노산 잔기의 스트레치가 본 발명의 아미노산 서열의 DR5에 대한 결합을 허용하는 한, 이들 아미노산 잔기의 스트레치가 본 발명의 아미노산 서열에서 가질 수 있는 특이적인 구조적 역할 또는 기능으로 제한되지 않음을 주목하여야 한다. 따라서, 일반적으로, 본 발명은 그의 가장 넓은 의미에서 전체 아미노산 서열이 DR5에 결합할 수 있는 결합 도메인 및/또는 결합 단위를 형성하도록, DR5에 결합할 수 있고 본원에서 설명되는 하나 이상의 CDR 서열, 특히 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 통해 서로 적합하게 연결된 2개 이상의 상기 CDR 서열의 적합한 조합을 포함하는 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, 본 발명의 아미노산 서열 내의 단지 하나의 상기 CDR 서열의 존재가 DR5에 결합할 수 있는 본 발명의 아미노산 서열을 제공하기에 이미 충분할 수 있음을 또한 주목하여야 한다; 예를 들어, WO 03/050531에 기재된 소위 "촉진 (Expedite) 단편"을 다시 참조한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 아미노산 서열은 본원에서 설명되는 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열 (또는 임의의 그의 적합한 조합)로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. 특히, 본 발명의 아미노산 서열은 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 아미노산 서열일 수 있고, 상기 항원 결합 부위는 본원에서 설명되는 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열 (또는 임의의 그의 적합한 조합)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 아미노산 서열은 아미노산 잔기의 적어도 하나의 스트레치를 포함하는 임의의 아미노산 서열일 수 있고, 여기서 아미노산 잔기의 상기 스트레치는 본원에서 설명되는 CDR 서열 중 적어도 하나의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 그러한 아미노산 서열은 이뮤노글로불린 폴드를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 그러한 아미노산 서열은 적어도 하나의 상기 CDR 서열을 포함하지만 (완전한) 이뮤노글로불린 폴드를 형성할 정도로 충분히 크지는 않는 이뮤노글로불린 서열의 적합한 단편일 수 있다 (예를 들어, WO 03/050531에 기재된 "촉진 단편"을 다시 참조한다). 별법으로, 그러한 아미노산 서열은 그러한 CDR 서열에 상응하는 (즉, 그의 항원 결합 부위의 일부로서) 아미노산 잔기의 적어도 하나의 스트레치를 포함하는 적합한 "단백질 스캐폴드"일 수 있다. 아미노산 서열 제시에 적합한 스캐폴드는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 비제한적으로 이뮤노글로불린 (즉, 이미 본원에서 설명되는 이뮤노글로불린 서열 이외의)을 기초로 하거나 이로부터 유래된 결합 스캐폴드, 단백질 A 도메인으로부터 유래된 단백질 스캐폴드 (예를 들어, 예컨대 아피바디즈 (AFFIBODIES)™), 텐다미스타트, 피브로넥틴, 예를 들어 피브로넥틴 타입 III 도메인, 리포칼린, CTLA-4, T-세포 수용체, 설계된 안키린 반복체, 아비머 및 PDZ 도메인 (Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol. 23: 1257), 및 비제한적으로 DNA 또는 RNA 압타머를 비롯하여 DNA 또는 RNA를 기초로 한 결합 모이어티 (Ulrich et al., Comb Chem. High Throughput Screen 2006 9(8): 619-32)를 포함한다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 이들 CDR 서열을 포함하는 본원의 임의의 아미노산 서열은 DR5에 특이적으로 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 이것은 본원에 제공된 바와 같은 친화도 (KD-값 (실제 또는 겉보기), KA-값 (실제 또는 겉보기), kon-속도 및/또는 koff-속도로서, 또는 별법으로 IC50 값으로서 적합하게 측정된 및/또는 표현된)로 DR5에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본원에서 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 아미노산 서열일 수 있고, 여기서 상기 항원 결합 부위는 (1) 제1 아미노산 서열이 본원에서 설명되는 CDR1 서열로부터 선택될 경우, 제2 아미노산 서열은 본원에서 설명되는 CDR2 서열 또는 본원에서 설명되는 CDR3 서열로부터 선택되거나; (2) 제1 아미노산 서열이 본원에서 설명되는 CDR2 서열로부터 선택될 경우, 제2 아미노산 서열은 본원에서 설명되는 CDR1 서열 또는 본원에서 설명되는 CDR3 서열로부터 선택되거나; 또는 (3) 제1 아미노산 서열이 본원에서 설명되는 CDR3 서열로부터 선택될 경우, 제2 아미노산 서열은 본원에서 설명되는 CDR1 서열 또는 본원에서 설명되는 CDR3 서열로부터 선택되도록, 본원에서 설명되는 CDR1 서열, 본원에서 설명되는 CDR2 서열 및 본원에서 설명되는 CDR3 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 적어도 2개의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본원에서 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 아미노산 서열일 수 있고, 여기서 상기 항원 결합 부위는 제1 아미노산 서열이 본원에서 설명되는 CDR1 서열로부터 선택되고, 제2 아미노산 서열은 본원에서 설명되는 CDR2 서열로부터 선택되고, 제3 아미노산 서열은 본원에서 설명되는 CDR3 서열로부터 선택되도록 본원에서 설명되는 CDR1 서열, 본원에서 설명되는 CDR2 서열 및 본원에서 설명되는 CDR3 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 3개의 아미노산 서열을 포함한다. CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 바람직한 조합은 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다. 당업자에게 명백할 것인 바, 그러한 아미노산 서열은 바람직하게는 이뮤노글로불린 서열 (본원에서 추가로 설명되는)이지만, 또한 예를 들어 상기 CDR 서열을 제시하기 위한 적합한 스캐폴드를 포함하는 임의의 다른 아미노산 서열일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본원에서 DR5에 대해 작용하는, 특히 공공 데이터베이스에서 제공되는 DR5, 예컨대 예를 들어 NCBI 단백질 데이터베이스 등록 번호 BAA33723에 대해 작용하는 아미노산 서열에 관한 것이고, 여기서 아미노산 서열은 다음으로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 잔기의 하나 이상의 스트레치를 포함한다:
(a) 서열 41 내지 44의 아미노산 서열;
(b) 서열 41 내지 44의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(c) 서열 41 내지 44의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
(d) 서열 51 내지 55의 아미노산 서열;
(e) 서열 51 내지 55의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(f) 서열 51 내지 55의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
(g) 서열 63 내지 68의 아미노산 서열;
(h) 서열 63 내지 68의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(i) 서열 63 내지 68의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 또는 이들의 임의의 적합한 조합.
본 발명의 아미노산 서열이 b) 및/또는 c)에 따른 하나 이상의 아미노산 서열을 함유할 경우:
(1) b) 및/또는 c)에 따른 그러한 아미노산 서열 내의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는, a)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비해, 보존적 아미노산 치환이고/이거나;
(2) b) 및/또는 c)에 따른 아미노산 서열은 바람직하게는 a)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비해 단지 하나의 아미노산 치환을 함유하고, 아미노산 결실 또는 삽입은 함유하지 않고/않거나;
(3) b) 및/또는 c)에 따른 아미노산 서열은 그 자체가 공지된 하나 이상의 친화도 성숙 기법을 사용하여 친화도 성숙에 의해 a)에 따른 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열일 수 있다.
유사하게, 본 발명의 아미노산 서열이 e) 및/또는 f)에 따른 하나 이상의 아미노산 서열을 함유할 때:
(1) e) 및/또는 f)에 따른 그러한 아미노산 서열 내의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는, d)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비해, 보존적 아미노산 치환이고/이거나;
(2) e) 및/또는 f)에 따른 아미노산 서열은 바람직하게는 d)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비해 단지 하나의 아미노산 치환을 함유하고, 아미노산 결실 또는 삽입은 함유하지 않고/않거나;
(3) e) 및/또는 f)에 따른 아미노산 서열은 그 자체가 공지된 하나 이상의 친화도 성숙 기법을 사용하여 친화도 성숙에 의해 d)에 따른 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 유사하게, 본 발명의 아미노산 서열이 h) 및/또는 i)에 따른 하나 이상의 아미노산 서열을 함유할 때:
(1) h) 및/또는 i)에 따른 그러한 아미노산 서열 내의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는, g)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비해, 보존적 아미노산 치환이고/이거나;
(2) h) 및/또는 i)에 따른 아미노산 서열은 바람직하게는 g)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비해 단지 하나의 아미노산 치환을 함유하고, 아미노산 결실 또는 삽입은 함유하지 않고/않거나;
(3) h) 및/또는 i)에 따른 아미노산 서열은 그 자체가 공지된 하나 이상의 친화도 성숙 기법을 사용하여 친화도 성숙에 의해 g)에 따른 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열일 수 있다.
바로 위의 선행 문단은 또한 일반적으로 각각 a), b), c), d), e), f), g), h) 또는 i)에 따른 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 임의의 아미노산 서열에도 적용됨이 이해되어야 한다.
상기 구체적인 측면에서, 아미노산 서열은 바람직하게는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 잔기의 하나 이상의 스트레치를 포함한다:
(i) 서열 41 내지 44의 아미노산 서열;
(ii) 서열 51 내지 55의 아미노산 서열; 및
(iii) 서열 63 내지 68의 아미노산 서열; 또는 이들의 임의의 적합한 조합.
또한, 바람직하게는, 그러한 아미노산 서열에서, 상기 아미노산 잔기의 적어도 하나의 스트레치는 DR5에 대한 결합을 위한 항원 결합 부위의 일부를 형성한다.
하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명은 (1) 아미노산 잔기의 제1 스트레치가 하기 a), b) 또는 c)에 따른 아미노산 서열 중의 하나에 상응할 때, 아미노산 잔기의 제2 스트레치는 하기 d), e), f), g), h) 또는 i)에 따른 아미노산 서열 중의 하나에 상응하거나; (2) 아미노산 잔기의 제1 스트레치가 하기 d), e) 또는 f)에 따른 아미노산 서열 중의 하나에 상응할 때, 아미노산 잔기의 제2 스트레치는 하기 a), b), c), g), h) 또는 i)에 따른 아미노산 서열 중의 하나에 상응하거나; 또는 (3) 아미노산 잔기의 제1 스트레치가 하기 g), h) 또는 i)에 따른 아미노산 서열 중의 하나에 상응할 때, 아미노산 잔기의 제2 스트레치는 하기 a), b), c), d), e) 또는 f)에 따른 아미노산 서열 중의 하나에 상응하도록, 다음으로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 잔기의 2개 이상의 스트레치를 포함하는, DR5에 대해 작용하는 아미노산 서열에 관한 것이다:
a) 서열 41 내지 44의 아미노산 서열;
b) 서열 41 내지 44의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 41 내지 44의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
d) 서열 51 내지 55의 아미노산 서열;
e) 서열 51 내지 55의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 51 내지 55의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
g) 서열 63 내지 68의 아미노산 서열;
h) 서열 63 내지 68의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 63 내지 68의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열.
상기 구체적인 측면에서, 아미노산 서열은 (1) 아미노산 잔기의 제1 스트레치가 서열 41 내지 44의 아미노산 서열 중의 하나에 상응할 때, 아미노산 잔기의 제2 스트레치는 서열 51 내지 55 또는 서열 63 내지 68의 아미노산 서열 중의 하나에 상응하거나; (2) 아미노산 잔기의 제1 스트레치가 서열 51 내지 55의 아미노산 서열 중의 하나에 상응할 때, 아미노산 잔기의 제2 스트레치는 서열 41 내지 44 또는 서열 63 내지 68의 아미노산 서열 중의 하나에 상응하거나; 또는 (3) 아미노산 잔기의 제1 스트레치가 서열 63 내지 68의 아미노산 서열 중의 하나에 상응할 때, 아미노산 잔기의 제2 스트레치는 서열 41 내지 44 또는 서열 51 내지 55의 아미노산 서열 중의 하나에 상응하도록, 바람직하게는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함한다:
(i) 서열 41 내지 44의 아미노산 서열;
(ii) 서열 51 내지 55의 아미노산 서열; 및
(iii) 서열 63 내지 68의 아미노산 서열;
또한, 그러한 아미노산 서열에서, 바람직하게는 아미노산 잔기의 적어도 2개의 스트레치는 DR5에 대한 결합을 위한 항원 결합 부위의 일부를 형성한다.
한 실시양태에서, 특히 선행 문단들에 관련될 때, 본 발명은 각각 a), b), c), d), e), f), g), h) 또는 i)에 따른 2개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 NB 작용제의 이량체 변이체이다. 한 실시양태에서, 이량체를 구성하는 단량체는 단일 리딩 프레임으로 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 단량체를 연결하는 링커 서열은 서열 GGGGS (서열 81) 또는 GGGS (서열 82), 또는 이 둘의 조합물의 다량체이거나, 또는 서열 44, 45 또는 46으로서 본원에서 제공되거나, 또는 당업계에 공지된 바와 링커 서열로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 특히 선행 문단들에 관련될 때, 본 발명은 각각 a), b), c), d), e), f), g), h) 또는 i)에 따른 3개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 NB 작용제의 삼량체 변이체이다. 한 실시양태에서, 삼량체를 구성하는 단량체는 단일 리딩 프레임으로 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 단량체를 연결하는 링커 서열은 서열 GGGGS (서열 81) 또는 GGGS (서열 82), 또는 이 둘의 조합물의 다량체이거나, 또는 서열 44, 45 또는 46으로서 본원에서 제공되거나, 또는 당업계에 공지된 바와 링커 서열로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 특히 선행 문단들에 관련될 때, 본 발명은 각각 a), b), c), d), e), f), g), h) 또는 i)에 따른 4개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 NB 작용제의 사량체 변이체이다. 한 실시양태에서, 사량체를 구성하는 단량체는 단일 리딩 프레임으로 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 단량체를 연결하는 링커 서열은 서열 GGGGS (서열 81) 또는 GGGS (서열 82), 또는 이 둘의 조합물의 다량체이거나, 또는 서열 44, 45 또는 46으로서 본원에서 제공되거나, 또는 당업계에 공지된 바와 링커 서열로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 특히 선행 문단들에 관련될 때, 본 발명은 각각 a), b), c), d), e), f), g), h) 또는 i)에 따른 5개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 NB 작용제의 오량체 변이체이다. 한 실시양태에서, 오량체를 구성하는 단량체는 단일 리딩 프레임으로 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 단량체를 연결하는 링커 서열은 서열 GGGGS (서열 81) 또는 GGGS (서열 82), 또는 이 둘의 조합물의 다량체이거나, 또는 서열 44, 45 또는 46으로서 본원에서 제공되거나, 또는 당업계에 공지된 바와 링커 서열로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 특히 선행 문단들에 관련될 때, 본 발명은 각각 a), b), c), d), e), f), g), h) 또는 i)에 따른 6개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 NB 작용제의 육량체 변이체이다. 한 실시양태에서, 육량체를 구성하는 단량체는 단일 리딩 프레임으로 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 단량체를 연결하는 링커 서열은 서열 GGGGS (서열 81) 또는 GGGS (서열 82), 또는 이 둘의 조합물의 다량체이거나, 또는 서열 44, 45 또는 46으로서 본원에서 제공되거나, 또는 당업계에 공지된 바와 링커 서열로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 특히 선행 문단들에 관련될 때, 본 발명은 각각 a), b), c), d), e), f), g), h) 또는 i)에 따른 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 NB 작용제의 다량체 변이체이다. 한 실시양태에서, 다량체를 구성하는 단량체는 단일 리딩 프레임으로 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 단량체를 연결하는 링커 서열은 서열 GGGGS (서열 81) 또는 GGGS (서열 82) 중의 적어도 하나, 또는 이 둘의 조합물로부터 선택되거나, 또는 서열 44, 45 또는 46으로서 본원에서 제공되거나, 또는 당업계에 공지된 바와 링커 서열로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 아미노산 서열에서 CDR 서열은 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 CDR 서열에 대해 적어도 70% 아미노산 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 90% 아미노산 동일성, 예컨대 적어도 95% 아미노산 동일성 또는 그 초과 또는 심지어 본질적으로 100% 아미노산 동일성을 갖는다. 상기 아미노산 동일성 정도는 예를 들어 상기 아미노산 서열과 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 서열 중의 하나 이상 사이의 아미노산 동일성 정도를 결정함으로써 (본원에 기재된 방식으로) 결정할 수 있고, 여기서 프레임워크 영역을 형성하는 아미노산 잔기는 무시된다. 또한, 상기 아미노산 서열은 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이 인간화 또는 변형될 수 있다.
또한, 상기 아미노산 서열은, 바람직하게는 DR5에 특이적으로 결합할 수 있고; 보다 특히 본원에 제공된 바와 같은 친화도 (KD-값 (실제 또는 겉보기), KA-값 (실제 또는 겉보기), kon-속도 및/또는 koff-속도로서, 또는 별법으로 본원에서 추가로 설명되는 IC50 값으로서 적합하게 측정된 및/또는 표현된)로 DR5에 결합할 수 있는 것이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명은 본질적으로 4개의 프레임워크 영역 (각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역 (각각 CDR1 내지 CDR3)으로 이루어진 아미노산 서열에 관한 것이고, 여기서 상기 아미노산 서열의 CDR 서열은 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 CDR 서열에 대해 적어도 70% 아미노산 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 90% 아미노산 동일성, 예컨대 적어도 95% 이상의 아미노산 동일성, 적어도 98% 이상의 아미노산 동일성, 적어도 99% 이상의 아미노산 동일성, 또는 심지어 본질적으로 100% 아미노산 동일성을 갖는다. 상기 아미노산 동일성 정도는 예를 들어 상기 아미노산 서열과 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 서열 중의 하나 이상 사이의 아미노산 동일성 정도를 결정함으로써 (본원에 기재된 방식으로) 결정할 수 있고, 여기서 프레임워크 영역을 형성하는 아미노산 잔기는 무시된다. 본 발명의 그러한 아미노산 서열은 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이 변형될 수 있다.
본 발명의 그러한 아미노산 서열에서, 프레임워크 서열은 임의의 적합한 프레임워크 서열일 수 있고, 적합한 프레임워크 서열의 예는 예를 들어 표준 안내서 및 추가의 개시내용 및 본원에 언급된 관련 참고문헌에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다.
프레임워크 서열은 바람직하게는 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 이뮤노글로불린 프레임워크 서열로부터 (예를 들어, 인간화 또는 낙타화에 의해) 유래된 프레임워크 서열(의 적합한 조합)이다. 예를 들어, 프레임워크 서열은 경쇄 가변 도메인 (예를 들어 VL-서열) 및/또는 중쇄 가변 영역 도메인 (예를 들어 VH-서열)으로부터 유래된 프레임워크 서열일 수 있다. 하나의 특히 바람직한 측면에서, 프레임워크 서열은 VHH-서열로부터 유래된 프레임워크 서열이거나 (여기서, 상기 프레임워크 서열은 임의로 부분적으로 또는 완전히 인간화될 수 있다) 또는 낙타화된 통상적인 VH 서열이다.
프레임워크 서열은 바람직하게는 본 발명의 아미노산 서열이 도메인 항체 (또는 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열)이거나; 단일 도메인 항체 (또는 단일 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열)이거나; "dAb" (또는 dAb로서 사용하기 적합한 아미노산 서열)이거나; 또는 NB 작용제 (비제한적으로 VH 및/또는 VHH 서열 포함)이 되도록 하는 것이다. 다시, 적합한 프레임워크 서열은 예를 들어 표준 안내서 및 추가의 개시내용 및 본원에 언급된 관련 참고문헌을 기초로 하여 당업자에게 명백할 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 아미노산 서열에 대해 일반적으로 본원에서 설명되는 바와 같이, 임의의 상기한 것의 적합한 단편 (또는 단편의 조합), 예컨대 (예를 들어, 이들 CDR 및 프레임워크 서열이 단편이 유래된 전장 이뮤노글로불린 서열에서 발생할 수 있는 것과 동일한 순서로) 하나 이상의 프레임워크 서열이 적합하게 인접하고/하거나 이 서열을 통해 연결된 하나 이상의 CDR 서열을 함유하는 단편을 사용할 수 있다. 또한, 상기 단편은 이뮤노글로불린 폴드를 포함하거나 형성할 수 있도록 하는 것일 수 있거나, 또는 별법으로 이뮤노글로불린 폴드를 포함하지 않거나 형성할 수 없는 것일 수 있다.
한 측면에서, 그러한 단편은 프레임워크 서열(의 일부) (특히, 단편이 그로부터 유래되는 이뮤노글로불린 서열 내에서 상기 CDR 서열에 인접하는 프레임워크 서열(들)의 일부)가 각각의 측면에 인접하는, 본원에서 설명되는 단일 CDR 서열 (특히 CDR3 서열)을 포함한다. 예를 들어, CDR3 서열 앞에는 FR3 서열(의 일부)가 존재하고, 그 다음에는 FR4 서열(의 일부)가 존재할 수 있다. 그러한 단편은 또한 디술피드 가교, 및 특히 각각 CDR 서열의 앞뒤에 존재하는 2개의 프레임워크 영역을 연결하는 디술피드 가교를 함유할 수 있다 (그러한 디술피드 가교를 형성하기 위해, 상기 프레임워크 영역에서 천연 생성되는 시스테인 잔기가 사용될 수 있거나, 또는 별법으로 시스테인 잔기는 상기 프레임워크 영역에 합성에 의해 첨가되거나 도입될 수 있다). 한 실시양태에서, 그러한 구축물은 촉진 단편이다. 이들 "촉진 단편"의 추가의 설명에 대해서는, 다시 WO 03/050531 및 애블링스 엔.브이.의 미국 특허 가출원 (발명의 명칭: "Peptides capable of binding to serum proteins", 애블링스 엔.브이. (발명자: 레베츠(Revets) 등), 2006년 12월 5일 출원)을 참조한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열 (또는 그의 적합한 단편)을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지고, 임의로 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하는 NB 작용제, 및 특히 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본원의 추가의 개시내용으로부터 당업자에게 명백해질 바와 같이, 그러한 추가의 기, 잔기, 모이어티, 결합 단위 또는 아미노산 서열은 본 발명의 아미노산 서열에 (및/또는 그가 존재하는 화합물 또는 구축물에) 추가의 관능성을 제공하거나 제공하지 않을 수 있고, 본 발명의 아미노산 서열의 특성을 변경하거나 변경하지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 추가의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 화합물 또는 구축물이 (융합) 단백질 또는 (융합) 폴리펩티드가 되도록 하는 하나 이상의 추가의 아미노산 서열일 수 있다. 바람직한, 그러나 비제한적인 측면에서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 이뮤노글로불린 서열이다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, 또는 낙타류 VHH 구축물로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태에서, 상기 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 단독으로 생물학적 및/또는 약물학적 활성을 보이거나 보이지 않을 수 있는, 예를 들어 화학적 기, 잔기, 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 상기 기는 본원에서 추가로 설명되는 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드의 "유도체"를 제공하기 위해서 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열에 연결될 수 있다.
또한, 본 발명의 범위 내에는 본원에서 설명되는 하나 이상의 유도체를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지고 임의로 하나 이상의 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 임의로 추가로 포함하는 화합물 또는 구축물이 포함된다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 아미노산 서열이다.
상기 설명한 화합물 또는 구축물에서, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열 및 하나 이상의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 서로 직접 및/또는 하나 이상의 적합한 링커 또는 스페이서를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 아미노산 서열일 때, 링커는 또한 생성되는 화합물 또는 구축물이 융합 단백질 또는 융합 폴리펩티드가 되도록 아미노산 서열일 수 있다. 그러한 링커의 아미노산 서열은 본원에서 제시되는 것일 수 있거나, 또는 당업자에게 공지된 것일 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 일반적으로 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드를 제공하기 위해 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열을 임의로 하나 이상의 적합한 링커를 통해 하나 이상의 추가의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위에 적합하게 연결하는 적어도 하나의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공하고, 상기 핵산을 적합한 방식으로 발현시키고, 본 발명의 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 적어도 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 방법은 예를 들어 본원에서 추가로 설명되는 방법 및 기법을 기초로 하여 당업자에게 명백할 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열로부터 출발하여 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드를 설계/선택 및/또는 제조하는 과정은 또한 본원에서 본 발명의 상기 아미노산 서열의 "포매팅 (formatting)"으로 언급되고; 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 일부가 되는 본 발명의 아미노산은 "포매팅되거나" 또는 본 발명의 상기 화합물 또는 폴리펩티드의 "포맷으로" 존재한다고 언급된다. 본 발명의 아미노산 서열이 포매팅될 수 있는 방식의 예 및 상기 포맷의 예는 본원의 개시내용에 기반하여 당업자에게 명백할 것이고; 상기 포매팅된 아미노산 서열은 본 발명의 추가의 측면을 형성한다.
한 바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 화합물은 임의로 하나 이상의 적합한 링커 (본원에서 추가로 설명되는 바와 같을 수 있음)를 통해 또는 가교결합 기법 또는 당업자에게 공지된 방식으로 생성된 공유 결합을 통해 연결된 DR5에 대해 작용하는 2개 이상 (바람직하게는 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 8개 이상, 및/또는 10개 이상)의 아미노산 서열 (예를 들어 본원에서 제시되는 아미노산 서열)을 함유하는 다가 폴리펩티드이다. 하나 이상의 다른 실시양태에서, 다가 폴리펩티드는 DR5 이외의 표적에 결합하는 선택적인 하위단위를 함유한다.
특히, 본 발명의 화합물은 DR5에 의해 매개되는 신호전달을 유도, 촉발, 증가 또는 향상시킬 수 있고, 보다 특히 DR5가 존재하는 세포에서 아폽토시스를 촉발 또는 유도할 수 있는 그러한 다가 폴리펩티드일 수 있다. 한 실시양태에서, 다가 폴리펩티드는 작동가능하게 연결되어 삼량체 폴리펩티드를 생성하는 3개의 단량체 DR5 결합 단위로 이루어진다. 한 실시양태에서, 다가 폴리펩티드는 작동가능하게 연결되어 사량체 폴리펩티드를 생성하는 4개의 단량체 DR5 결합 단위로 이루어진다. 한 실시양태에서, 다가 폴리펩티드는 작동가능하게 연결되어 오량체 폴리펩티드를 생성하는 5개의 단량체 DR5 결합 단위로 이루어진다. 한 실시양태에서, 다가 폴리펩티드는 작동가능하게 연결되어 육량체 폴리펩티드를 생성하는 6개의 단량체 DR5 결합 단위로 이루어진다. 한 실시양태에서, 다가 폴리펩티드는 작동가능하게 연결되어 다량체 단백질의 추가의 변이체를 생성하는 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 단량체 DR5 결합 단위로 이루어진다.
본원에 이미 언급한 바와 같이, 상기 다량체 폴리펩티드는 추가로 DR5 상의 TRAIL의 결합 부위에 결합할 수 있고/있거나 DR5에 대한 결합을 위해 TRAIL과 경쟁할 수 있는 것일 수 있다.
다가 폴리펩티드는 DR5 상의 TRAIL에 대한 결합 부위에 결합하지 않고/않거나, 본질적으로 DR5에 대한 TRAIL의 결합을 억제 또는 저해하지 않고/않거나 DR5에 대한 결합을 위해 TRAIL과 경쟁하지 않고/않거나, 심지어 그의 수용체에 대한 TRAIL의 결합시에 TRAIL 및 DR5에 의해 매개되는 신호전달을 증가 또는 향상시키는 것일 수 있다 (이것은 다시 DR5에 의해 매개된 신호전달에 대한 상승적인 효과를 유발할 수 있다). 한 실시양태에서, 상기 다가 폴리펩티드는 1가 조성물보다 높은 친화도로 DR5에 결합한다.
본 발명의 다가 폴리펩티드에서, 결합 단위를 형성하는 본 발명의 아미노산 서열은 각각 DR5 수용체 상의 동일한 에피토프, 예를 들어, DR5의 에피토프에 대해, 또는 DR5 상의 상이한 에피토프에 대해 작용할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적인 측면에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 상응하는 아미노산 서열에 비해 증가된 반감기를 가질 수 있다. 상기 화합물 및 폴리펩티드의 몇몇의 비-제한적인 예는 본원의 추가의 개시내용을 기초로 하여 당업자에게 명백해질 것이고, 예를 들어, 그의 반감기를 증가시키기 위해 화학적으로 변형된 (예를 들어, peg화에 의해) 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드; 혈청 단백질 (예컨대 혈청 알부민)에 대한 결합을 위한 적어도 하나의 추가의 결합 부위를 포함하는 본 발명의 아미노산 서열; 또는 본 발명의 아미노산 서열의 반감기를 증가시키는 적어도 하나의 모이어티 (특히 적어도 하나의 아미노산 서열)에 연결된 본 발명의 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 반감기 연장 모이어티 또는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 예는 본원의 추가의 개시내용을 기초로 하여 당업자에게 명백해질 것이고; 예를 들어 비제한적으로 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열이 하나 이상의 혈청 단백질 또는 그의 단편 (예컨대 (인간) 혈청 알부민 또는 그의 적합한 단편)에 또는 혈청 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 단위 (예컨대, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체 (dAb)로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, dAb로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, 또는 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민 (예컨대 인간 혈청 알부민), 혈청 이뮤노글로불린, 예를 들어 IgG, 또는 트랜스페린에 결합할 수 있는 나노바디즈™; 추가의 설명 및 본원에 언급된 참조문헌을 참조한다)에 적합하게 연결된 폴리펩티드; 본 발명의 아미노산 서열이 Fc 부분 (예컨대 인간 Fc) 또는 그의 적합한 일부 또는 단편에 연결된 폴리펩티드; 또는 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열이, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 작은 단백질 또는 펩티드 (예컨대, 비제한적으로, WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489 및 애블링스 엔.브이.의 미국 특허 가출원 (발명의 명칭: "Peptides capable of binding to serum proteins"; 애블링스 엔.브이., 2006년 12월 5일 출원)에 기재된 단백질 및 펩티드)에 적절하게 연결된 폴리펩티드를 포함한다.
일반적으로, 반감기가 증가된 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 바람직하게는 본 발명의 상응하는 아미노산 서열 자체의 반감기보다 적어도 1.5배, 바람직하게는 적어도 2배, 예컨대 적어도 5배, 예를 들어, 적어도 10배 또는 20배 초과로 더 큰 반감기를 갖는다. 예를 들어, 반감기가 증가된 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 본 발명의 상응하는 아미노산 서열 자체에 비해 1시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과, 보다 바람직하게는 6시간 초과, 예컨대 12시간 초과, 또는 심지어 24, 48 또는 72시간 초과로 증가된 반감기를 갖는다.
본 발명의 바람직한, 그러나 비제한적인 측면에서, 본 발명의 상기 화합물 또는 폴리펩티드는 본 발명의 상응하는 아미노산 서열 자체에 비해 1시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과, 보다 바람직하게는 6시간 초과, 예컨대 12시간 초과, 또는 심지어 24, 48 또는 72시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한, 그러나 비제한적인 측면에서, 본 발명의 상기 화합물 또는 폴리펩티드는 인간에서 적어도 약 12시간, 바람직하게는 적어도 24시간, 보다 바람직하게는 적어도 48시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 72시간 이상의 혈청 반감기를 보인다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 적어도 5일 (예컨대 약 5 내지 10일), 바람직하게는 적어도 9일 (예컨대 약 9 내지 14일), 보다 바람직하게는 적어도 약 10일 (예컨대 약 10 내지 15일), 또는 적어도 약 11일 (예컨대 약 11 내지 16일), 보다 바람직하게는 적어도 약 12일 (예컨대 약 12 내지 18일 또는 그 초과), 또는 14일 초과 (예컨대 약 14 내지 19일)의 반감기를 가질 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 폴리펩티드 (또는 그의 적합한 단편)을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 그러한 핵산은 또한 본원에서 "본 발명의 핵산"으로서 언급될 것이고, 예를 들어 유전자 구축물, 예를 들어, CDR 단편의 형태이거나 또는 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이 벡터 내에 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 표 1 내지 4 중의 임의의 하나 이상에 개시된 임의의 하나 이상의 폴리펩티드의 NB 구축물을 코딩한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 서열 1-72, 81-82 및 87-92에 제공된 임의의 하나 이상의 구축물을 코딩한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 관심있는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 한 실시양태에서, 코돈 최적화는 포유동물 세포에서의 발현을 위한 것이다. 한 실시양태에서, 코돈 최적화는 효모 세포에서의 발현을 위한 것이다. 한 실시양태에서, 코돈 최적화는 이. 콜라이 (E. coli)에서의 발현을 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열 및/또는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 (또는 적합한 상황 하에 발현할 수 있고)/하거나; 본 발명의 핵산을 함유하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 그러한 숙주 또는 숙주 세포의 몇몇의 바람직한, 그러나 비-제한적인 예는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 적어도 하나의 아미노산 서열, 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드 (또는 그의 적합한 단편), 본 발명의 적어도 하나의 화합물 및/또는 본 발명의 적어도 하나의 핵산, 및 임의로 조성물의 의도된 용도에 따라 그 자체 공지된 상기 조성물의 하나 이상의 추가의 성분을 함유하거나 포함하는 생성물 또는 조성물에 관한 것이다. 그러한 생성물 또는 조성물은 예를 들어 제약 조성물 (본원에서 설명되는), 수의학적 조성물 또는 진단 용도 (또한 본원에서 설명되는)를 위한 생성물 또는 조성물일 수 있다. 상기 생성물 또는 조성물의 일부 비-제한적인 예를 본원에서 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 시험관 내에서 (예를 들어, 시험관내 또는 세포 검정) 또는 생체 내에서 (예를 들어, 단일 세포 또는 다세포 유기체에서, 및 특히 포유동물, 보다 특히 인간, 예컨대 DR5와 연관된 질환 및 장애의 위험이 있거나 이로 고통받는 인간에서) DR5를 조정하기 위한 방법 또는 조성물에서의 NB 구축물 또는 그를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 아미노산 서열, NB 구축물로 DR5를 조정하기에 적합한 방식 및 양으로 DR5를 본 발명의 적어도 하나의 아미노산 서열, NB 구축물, 또는 이를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 적어도 포함하는, 시험관 내에서 (예를 들어, 시험관내 또는 세포 검정에서) 또는 생체 내에서 (예를 들어, 단일 세포 또는 다세포 유기체에서, 및 특히 포유동물, 보다 특히 인간, 예컨대 DR5와 연관된 질환 및 장애의 위험이 있거나 이로 고통받는 인간에서) DR5를 조정하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 시험관 내에서 (예를 들어, 시험관내 또는 세포 검정에서) 또는 생체 내에서 (예를 들어, 단일 세포 또는 다세포 유기체에서, 및 특히 포유동물, 보다 특히 인간, 예컨대 DR5와 연관된 질환 및 장애의 위험이 있거나 이로 고통받는 인간에서) DR5를 조정하기 위한 조성물 (예컨대, 비제한적으로, 본원에서 추가로 설명되는 제약 조성물 또는 제제)의 제조에서 본 발명의 하나의 아미노산 서열, NB 구축물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 측면에서, "조정하는" 또는 "조정하기 위한"은 일반적으로 적합한 시험관내, 세포 또는 생체내 검정 (예컨대 본원에 언급된 것)을 사용하여 측정될 때 DR5의 활성의 감소 또는 완전한 억제, 또는 별법으로 활성의 증가를 의미한다. 특히, "조정하는" 또는 "조정하기 위한"은 적합한 시험관내, 세포 또는 생체내 검정 (예컨대 본원에 언급된 것)을 사용하여 측정될 때 동일한 조건 하에, 그러나 본 발명의 NB 구축물의 부재 하에서의 동일한 검정에서의 DR5의 활성에 비해 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 적어도 25%, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 이상의 DR5의 활성의 감소 또는 완전한 억제, 또는 별법으로 활성의 증가를 의미할 수 있다. 주요 실시양태에서, 특히 DR5-매개 신호전달을 비롯한 DR5 활성은 세포 표면 상의 DR5의 삼량체의 형성을 필요로 한다. 한 실시양태에서, 본원의 NB 구축물은 DR5 동종삼량체의 형성을 촉진하여, 예를 들어 외인성 세포 사멸 경로를 통한 아폽토시스의 DR5-매개 개시를 증가시킴으로써 DR5 활성을 조정하는 작용을 한다.
당업자에게 명백할 것인 바, "조정하는"은 또한 동일한 조건이지만 본 발명의 아미노산 서열, NB 구축물의 부재시에 비해 하나 이상의 그의 표적, 리간드 또는 기질에 대한 DR5의 친화도, 결합력, 특이성 및/또는 선택성의 변화 (증가 또는 감소일 수 있는)의 달성; 및/또는 DR5가 존재하는 배지 또는 환경 내의 하나 이상의 조건 (예컨대 pH, 이온 강도, 보조 인자의 존재 등)에 대한 DR5의 감수성의 변화 (증가 또는 감소일 수 있는)의 달성을 수반할 수 있다. 당업자에게 명백할 것인 바, 이것은 다시 임의의 적합한 방식으로 및/또는 공지된 임의의 적합한 검정, 예컨대 본원에서 또는 본원에 인용된 관련 참고문헌에서 설명되는 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
"조정하는"은 또한 DR5가 관여하는 하나 이상의 생물학적 또는 생리학적 메카니즘, 효과, 반응, 기능, 경로 또는 활성 (또는 그의 기질(들), 리간드(들) 또는 경로(들)이 관여하는, 예컨대 그의 신호전달 경로 또는 대사 경로 및 그의 관련 생물학적 또는 생리학적 효과)에 대한 변화 (즉, 각각 효능제 또는 길항제로서의 활성)의 달성을 의미한다. 다시, 당업자에게 명백할 것인 바, 그러한 효능제 또는 길항제로서의 작용은 임의의 적합한 방식으로 및/또는 공지된 임의의 적합한 (시험관내 및 대체로 세포 또는 검정내) 검정, 예컨대 본원에서 또는 본원에 인용된 관련 참고문헌에서 설명되는 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 특히, 효능제 또는 길항제로서의 작용은 동일한 조건 하에, 그러나 본 발명의 NB 구축물의 부재 하의 동일한 검정에서의 생물학적 또는 생리학적 활성에 비해 의도된 생물학적 또는 생리학적 활성이 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 적어도 25%, 예를 들어 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 그 초과로 각각 증가 또는 감소되도록 하는 것일 수 있다.
조정은 예를 들어 그의 기질 또는 리간드 중의 하나에 대한 DR5의 결합의 감소 또는 억제 및/또는 DR5에 대한 결합을 위해 천연 리간드, 기질과의 경쟁을 수반할 수 있다. 조정은 또한 DR5 또는 DR5가 관여하는 메카니즘 또는 경로의 활성화를 수반할 수 있다. 조정은 가역적 또는 비가역적일 수 있지만, 제약 및 약물학적 목적을 위해 대체로 가역적인 방식으로 이루어질 것이다.
본 발명은 추가로 본원에서 제공되는 아미노산 서열, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물의 제조 또는 생성 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 일부 바람직하지만 비-제한적인 예는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
일반적으로, 이들 방법은
a) 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리를 제공하고;
b) 상기 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리를 DR5에 결합할 수 있고/있거나 DR5에 대한 친화도를 가질 수 있는 아미노산 서열에 대해 스크리닝하고;
c) DR5에 결합하고/하거나 DR5에 대한 친화도를 갖는 아미노산 서열(들)을 단리하는 단계
를 포함할 수 있다.
그러한 방법에서, 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 아미노산 서열의 임의의 적합한 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 이뮤노글로불린 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리 (본원에 설명된 바와 같이), 예컨대 이뮤노글로불린 서열의 나이브 (naive) 세트, 집단 또는 라이브러리; 이뮤노글로불린 서열의 합성 또는 반합성 세트, 집단 또는 라이브러리; 및/또는 친화도 성숙에 적용된 이뮤노글로불린 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있다.
또한, 그러한 방법에서, 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 중쇄 가변 영역 도메인 (예컨대 VH 도메인 또는 VHH 도메인) 또는 경쇄 가변 도메인의 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체의 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있거나, 또는 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체로서 기능할 수 있는 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있다.
상기 방법의 바람직한 측면에서, 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 예를 들어 DR5로 또는 그를 기초로 하거나 그로부터 유래된 적합한 항원 결정기, 예컨대 그의 항원성 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 (loop) 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화시킨 포유동물로부터 유래된 이뮤노글로불린 서열의 면역 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있다. 한 특정 측면에서, 상기 항원 결정기는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
상기 방법에서, 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 예를 들어 스크리닝을 용이하게 하기 위해 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적합한 미생물 (예컨대 효모) 상에 디스플레이될 수 있다. 아미노산 서열(의 세트, 집단 또는 라이브러리)의 디스플레이 및 스크리닝에 적합한 방법, 기술 및 숙주 유기체는 예를 들어 본원의 추가의 개시내용을 기초로 하여 당업자에게 명백할 것이다. 문헌 [Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23(9): 1105-1116 (2005)]의 검토를 또한 참조한다.
또 다른 측면에서, 아미노산 서열을 생성하는 방법은 적어도
a) 아미노산 서열을 발현하는 세포의 집단 또는 샘플을 제공하고;
b) 상기 세포의 집단 또는 샘플을 DR5에 결합할 수 있고/있거나 DR5에 대한 친화도를 가질 수 있는 아미노산 서열을 발현하는 세포에 대해 스크리닝하고;
c) (1) 상기 아미노산 서열을 단리하거나; 또는 (2) 상기 세포로부터 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 단리한 후, 상기 아미노산 서열을 발현시키는 단계
를 포함한다.
예를 들어, 목적하는 아미노산 서열이 이뮤노글로불린 서열일 경우, 세포의 집단 또는 샘플은 예를 들어 B-세포의 집단 또는 샘플일 수 있다. 또한, 상기 방법에서, 세포의 샘플은 예를 들어 DR5로 또는 그를 기초로 하거나 그로부터 유래된 적합한 항원 결정기, 예컨대 그의 항원성 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화시킨 포유동물로부터 유래될 수 있다. 한 특정 측면에서, 상기 항원 결정기는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
상기 방법은 당업자에게 명백할 것인 바 임의의 적합한 방식으로 수행할 수 있다. 예를 들어, EP 0 542 810, WO 05/19824, WO 04/051268 및 WO 04/106377을 참조한다. 단계 b)의 스크리닝은 바람직하게는 유동 세포측정 기법, 예컨대 FACS를 이용하여 수행한다. 이를 위해, 예를 들어 문헌 [Lieby et al., Blood, 97(12), 3820 (2001)]을 참조한다.
또 다른 측면에서, DR5에 대해 작용하는 아미노산 서열의 생성 방법은 적어도
a) 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리를 제공하고;
b) 상기 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리를 DR5에 결합할 수 있고/있거나 DR5에 대한 친화도를 가질 수 있는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 대해 스크리닝하고;
c) 상기 핵산 서열을 단리한 후, 상기 아미노산 서열을 발현시키는 단계
를 포함할 수 있다.
그러한 방법에서, 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 예를 들어 이뮤노글로불린 서열의 나이브 세트, 집단 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리; 이뮤노글로불린 서열의 합성 또는 반합성 세트, 집단 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리; 및/또는 친화도 성숙에 적용된 이뮤노글로불린 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있다.
또한, 그러한 방법에서, 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 중쇄 가변 영역 도메인 (예컨대 VH 도메인 또는 VHH 도메인) 또는 경쇄 가변 도메인의 세트, 집단 또는 라이브러리를 코딩할 수 있다. 한 예에서, 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체의 세트, 집단 또는 라이브러리, 또는 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체로서 기능할 수 있는 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리를 코딩한다.
상기 방법의 한 측면에서, 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 예를 들어 DR5로 또는 그를 기초로 하거나 그로부터 유래된 적합한 항원 결정기, 예컨대 그의 항원성 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화시킨 포유동물로부터 유래된 핵산 서열의 면역 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있다. 한 특정 측면에서, 상기 항원 결정기는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 예를 들어 중쇄 가변 영역 도메인 또는 경쇄 가변 도메인의 면역 세트, 집단 또는 라이브러리를 코딩할 수 있다. 한 구체적인 측면에서, 뉴클레오티드 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 VHH 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리를 코딩할 수 있다.
상기 방법에서, 뉴클레오티드 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 예를 들어 스크리닝을 용이하게 하기 위해 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적합한 미생물 (예컨대 효모) 상에 디스플레이될 수 있다. 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(의 세트, 집단 또는 라이브러리)의 디스플레이 및 스크리닝에 적합한 방법, 기술 및 숙주 유기체는 예를 들어 본원의 추가의 개시내용을 기초로 하여 당업자에게 명백할 것이다. 문헌 [Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23(9): 1105-1116 (2005)]의 검토를 또한 참조한다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해, 또는 별법으로 상기 방법의 하나 및 추가로 상기 이뮤노글로불린 서열의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 결정하고; 상기 아미노산 서열을 공지의 방식으로, 예컨대 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현에 의해 또는 화학적 합성에 의해 발현시키거나 합성하는 단계를 적어도 포함하는 방법에 의해 얻은 아미노산 서열에 관한 것이다.
또한, 상기 단계 후에, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열은 적합하게 인간화 (또는 별법으로 낙타화)될 수 있고/있거나; 이렇게 얻어진 아미노산 서열(들)은 본 발명의 폴리펩티드를 제공하도록 서로 또는 하나 이상의 다른 적합한 아미노산 서열 (임의로 하나 이상의 적합한 링커를 통해)에 연결될 수 있다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 적합하게 인간화 (또는 별법으로 낙타화)되고 적합하게 발현될 수 있고/있거나; 본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열은 서로 또는 다른 적합한 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열에 연결될 수 있고 (임의로 하나 이상의 적합한 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 통해), 이어서 이렇게 얻어진 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 제공하도록 적합하게 발현될 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에서 설명되는 아미노산 서열, 화합물, 구축물, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물의 용도 및 사용, 및 DR5와 연관된 질환 및 장애에 대한 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 일부 바람직하지만 비-제한적인 용도 및 사용은 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 본원에서 설명되는 아미노산 서열, 화합물, 구축물, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 NB 작용제 또는 NB 구축물로서 본원에서 설명되는 제약상 유효량의 아미노산 서열, 화합물, 구축물 또는 폴리펩티드를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 예방 또는 치료될 수 있는 질환 또는 장애의 위험이 있거나 이로 고통받는 대상체의 치료에 사용하기 위한 본원에서 설명되는 하나 이상의 아미노산 서열, 화합물, 구축물, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 DR5와 연관된 질환 및 장애의 치료에 사용하기 위한 본원에서 설명되는 아미노산 서열, 화합물, 구축물, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면, 실시양태, 이점 및 용도는 본 발명이 설명되고 보다 상세하게 논의되는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제의 VHH 변이체는 일반적으로 "dAb" 또는 유사한 (단일) 도메인 항체 또는 이뮤노글로불린 서열에 비해 특정 이점 (본원에서 개요가 설명되는)을 제공하고, 이 이점은 또한 본 발명의 조성물에 의해서도 제공된다. 그러나, 하기 교시내용의 보다 일반적인 측면이 본 발명의 다른 아미노산 서열에도 (직접 또는 유사하게) 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
정의
달리 나타내지 않으면, 본원 명세서, 실시예 및 청구범위에서, 다음 정의가 일반적으로 적용된다. 아래에서 및 본원 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 단수 형태의 용어 또는 문구의 사용은 달리 나타내거나 문맥상 명백하지 않으면 복수의 의미를 포함함을 의미한다 (복수의 용어도 이와 동일하다).
달리 나타내거나 규정되지 않으면, 사용되는 모든 용어는 당업계에서 그의 통상적인 의미를 갖고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 표준 안내서, 예컨대 문헌 [Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ( 2nd. Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]; [F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]; [Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985)]; [Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981)]; [Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001)]; [Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10 Ed. Blackwell Publishing, UK (2001)]; 및 [Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)], 및 본원에 인용된 전반적인 배경 기술을 참조한다. 추가의 참조문은 예를 들어 단백질 조작을 위한 기술, 예컨대 친화도 성숙 및 단백질, 예컨대 이뮤노글로불린의 특이성 및 다른 목적하는 특성을 개선하기 위한 다른 기법을 설명하고 있는 문헌 [Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56]; [Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57]; [Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45]; [Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12], [Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43]을 포함한다.
달리 나타내지 않으면, 구체적으로 상세하게 설명되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행된다고 생각되고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 다시 예를 들어, 표준 안내서 및 본원에 언급된 일반적인 배경 기술 및 본원에 인용되는 추가의 참조문을 참조한다. 아미노산 잔기는 IUPAC 코드 표에 의해 제공되는 표준 3문자 또는 1문자 아미노산 코드에 따라 표시될 것이다.
달리 나타내지 않으면, 중쇄 항체 또는 통상적인 4-사슬 항체를 나타내기 위해 본원에서 사용된 용어 "이뮤노글로불린 서열"은 전장 항체, 그의 개개의 사슬, 및 그의 모든 일부, 도메인 또는 단편 (비제한적으로 항원 결합 도메인 또는 단편, 예컨대 각각 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인 포함)을 모두 포함하는 일반적인 용어로서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "서열" (예를 들어 "이뮤노글로불린 서열", "항체 서열", "가변 도메인 서열", "sdAb 서열", "VH 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열"과 같은 용어에서)은 일반적으로 문맥이 보다 제한된 해석을 필요로 하지 않는 한, 관련 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 모두 포함하기 위해 사용된다.
달리 나타내지 않으면, 용어 "뉴클레오티드 서열" 및 "핵산"은 일반적으로 문맥이 보다 제한된 해석을 필요로 하지 않는 한, 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)의 중합체를 나타내기 위해 교환가능하게 사용된다
2개 이상의 뉴클레오티드 서열을 비교하기 위해, 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이의 "서열 동일성"은 예를 들어 제2 뉴클레오티드 서열 내의 상응하는 위치의 뉴클레오티드와 동일한, 제1 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 수를 얻고, 이 수를 제1 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 총수로 나눈 후, 100%를 곱함으로써 계산되거나 결정될 수 있다. 제1 뉴클레오티드 서열에 비교할 때 제2 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 단일 뉴클레오티드 위치에서의 차이로 간주된다. 당업자는 또한 표준 설정을 사용하여 적합한 컴퓨터 알고리즘 또는 기술, 예컨대, 예를 들어, NCBI Blast v2.0을 사용할 수 있다.
프레임워크 1 (FR1)에 관하여, 아미노산 동일성 정도의 결정을 위해, 위치 1 내지 4 및 27 내지 30 상의 아미노산 잔기는 바람직하게는 무시됨이 당업자에게 명백할 것이다.
한 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성 정도를 결정할 때, 당업자는 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 치환은 당업계에 공지되어 있고, 한 아미노산이 공통 특성을 갖는 동일한 군 내의 또 다른 아미노산 잔기로 교체되는 치환이다. 보존된 아미노산 군 및 그의 공통 특성은 다음과 같다: (a) 작은 지방족, 비극성 또는 경미한 극성 잔기, 예를 들어 Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성, 음하전 잔기 및 그의 (비하전) 아미드, 예를 들어 Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성, 양하전 잔기, 예를 들어 His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족, 비극성 잔기, 예를 들어 Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기, 예를 들어 Phe, Tyr 및 Trp.
특히 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala의 Gly 또는 Ser으로; Arg의 Lys으로; Asn의 Gln 또는 His으로; Asp의 Glu으로; Cys의 Ser으로; Gln의 Asn으로; Glu의 Asp로; Gly의 Ala 또는 Pro으로; His의 Asn 또는 Gln으로; Ile의 Leu 또는 Val으로; Leu의 Ile 또는 Val으로; Lys의 Arg, Gln 또는 Glu으로; Met의 Leu, Tyr 또는 Ile; Phe의 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser의 Thr으로; Thr의 Ser으로; Trp의 Tyr으로; Tyr의 Trp으로; 및/또는 Phe의 Val, Ile 또는 Leu으로의 치환.
본원에서 설명되는 폴리펩티드에 적용되는 임의의 아미노산 치환은 또한 문헌 [Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978]에 의해 개발된 상이한 종의 상동성 단백질 사이의 아미노산 변이의 빈도의 분석, 문헌 [Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974] 및 [Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978]에 의해 개발된 구조 형성능의 분석, 및 문헌 [Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140-144, 1984]; [Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981], 및 [Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986]에 의해 개발된 단백질 내의 소수도 패턴의 분석을 기초로 할 수 있다. 낙타류 VHH 구축물의 1차, 2차 및 3차 구조에 대한 정보는 상기 인용된 일반적인 배경 기술에 제시되고, 라마 (llama)로부터의 그러한 VHH 구축물의 결정 구조는 예를 들어 문헌 [Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996)]; [Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757]; 및 [Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)]에 제시되어 있다. 통상적인 VH 도메인에서 VH/VL 계면 및 이들 위치에 대한 잠재적인 낙타화 치환을 형성하는 일부의 아미노산 잔기에 대한 추가의 정보는 상기 인용된 기술에서 발견할 수 있다.
아미노산 서열 및 핵산 서열은 이들이 그의 전체 길이에 걸쳐 100% 서열 동일성을 갖는 경우에 "정확히 동일한" 것으로 언급된다.
2개의 아미노산 서열을 비교할 때, 용어 "아미노산 차이"는 제2 서열에 비해 제1 서열의 위치 상의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 의미하고; 2개의 아미노산 서열은 1, 2개 또는 그 초과의 그러한 아미노산 차이를 함유할 수 있음이 이해된다.
뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 각각 또 다른 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 "포함하거나", 또는 또 다른 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어진다"고 언급될 때, 이것은 일반적으로 제1의 언급된 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이, 제1의 언급된 서열이 실제로 생성되거나 얻어지는 방법 (예를 들어 본원에서 설명되는 임의의 적합한 방법에 의해 얻어질 수 있음)에 상관없이 그의 서열 내에 각각 후자의 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 스트레치를 갖는다는 것을 의미한다.
용어 핵산 또는 아미노산 서열에 대한 "본질적으로 단리된 형태"는 그 서열이 얻어진 그의 천연 생물학적 공급원 및/또는 반응 배지 또는 배양 배지에 비해 대체로 공급원 또는 배지에서 회합되는 적어도 하나의 다른 성분으로부터 분리됨을 의미한다. "적어도 하나의 다른 성분"은 또 다른 핵산, 또 다른 단백질/폴리펩티드, 또 다른 생물학적 성분 또는 거대분자 또는 적어도 하나의 오염물질, 불순물 또는 미량 성분일 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 적어도 2배, 특히 적어도 10배, 보다 특히 적어도 100배, 및 1000배까지 또는 그 초과로 정제될 때 "본질적으로 단리된" 것으로 간주된다. "본질적으로 단리된 형태"의 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 바람직하게는 적합한 기술, 예컨대 적합한 크로마토그래피 기술, 예컨대 폴리아크릴아미드-겔 전기영동을 사용하여 결정할 때 본질적으로 균일하다.
용어 "도메인" 및 "결합 도메인"은 본원에서 사용될 때 일반적으로 항체 사슬의 구상 영역, 특히 중쇄 항체의 구상 영역, 또는 그러한 구상 영역으로 본질적으로 이루어지는 폴리펩티드를 의미한다. 대체로, 상기 도메인은 예를 들어 시트 (sheet)로서 또는 디술피드 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프 (예를 들어 3 또는 4개의 펩티드 루프)를 포함할 것이다.
또한 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있는 용어 "항원 결정기" 및 "에피토프"는 항원 결합 분자 (예컨대 본 발명의 NB 구축물)에 의해, 보다 특히 상기 분자의 항원 결합 부위에 의해 인식되는 항원 상의 에피토프를 의미한다.
특정 항원 결정기, 에피토프, 항원 또는 단백질 (또는 그의 적어도 하나의 일부, 단편 또는 에피토프)에 (특이적으로) 결합하고/하거나, 이에 대한 친화도를 갖고/갖거나, 이에 대한 특이성을 갖는 아미노산 서열 (예컨대 본 발명의 NB 구축물, VHH 또는 VH 구축물, 항체, 또는 일반적으로 항원 결합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그의 단편)은 상기 항원 결정기, 에피토프, 항원 또는 단백질"에 대한" 것이거나 또는 "이에 대해 작용하는" 것으로 언급된다.
본원에서 언급될 때 용어 "특이성"은 특정 항원 결합 분자 또는 항원 결합 단백질 (예컨대 본 발명의 NB 구축물) 분자가 결합할 수 있는 상이한 종류의 항원 또는 항원 결정기의 수를 의미한다. 항원 결합 단백질의 특이성은 친화도 및/또는 결합력을 기초로 하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 항원 결합 단백질 (예컨대 본 발명의 NB 구축물)은 10-5 내지 10-12 몰/리터 또는 그 미만, 및 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 또는 그 미만, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수 (KD)로 (즉, 105 내지 1012 리터/몰 또는 그 초과, 바람직하게는 107 내지 1012 리터/몰 또는 그 초과, 보다 바람직하게는 108 내지 1012 리터/몰의 회합 상수 (KA)로) 그의 항원에 결합할 것이다. 104 몰/리터 초과의 임의의 KD 값 (또는 104 M-1 미만의 임의의 KA 값) 리터/몰은 일반적으로 비-특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 바람직하게는, 본 발명의 NB 구축물은 그의 목적하는 항원에 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 결합할 것이다. 항원 결합 단백질의 항원 또는 항원 결정기에 대한 "특이적 결합"은 공지된 임의의 적합한 방식, 예를 들어, 스캐챠드 (Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정, 예컨대 방사성 면역검정 (RIA), 효소 면역검정 (EIA) 및 샌드위치 경쟁 검정, 및 당업계에 공지된 상이한 변형 기술; 및 본원에 언급된 다른 기법으로 결정할 수 있다.
항원의 항원 결합 단백질과의 해리에 대한 평형 상수 (KD)로 제시되는 "친화도"는 항원 결정기와 항원 결합 단백질 상의 항원 결합 부위 사이의 결합 강도의 척도이고: KD의 값이 작을수록, 항원 결정기와 항원 결합 분자 사이의 결합 강도가 더 강하다 (별법으로, 친화도는 또한 1/KD인 친화도 상수 (KA)로 표현될 수 있다). 당업자에게 명백할 것인 바, 친화도는 관심있는 특정 항원에 따라 공지된 방식으로 결정될 수 있다.
"결합력"은 항원 결합 분자 (예컨대 본 발명의 NB 구축물)와 관련 항원 사이의 결합 강도의 척도이다. 결합력은 항원 결정기와 항원 결합 분자 상의 그의 항원 결합 부위 사이의 친화도, 및 항원 결합 분자 상에 존재하는 관련 결합 부위의 수 모두에 관련된다.
해리 상수는 실제 또는 겉보기 해리 상수이다. 해리 상수의 결정 방법은 당업계에 공지되어 있다.
문구 "특이적으로 결합하는" 또는 "선택적으로 결합하는"은 항원 (예를 들어, 단백질)과 NB 구축물, 또는 예를 들어 항체, 항체 단편, 또는 항체-유래 결합제의 프레임워크에 개시된 CDR을 갖는 그의 기능적 단편 사이의 상호작용을 설명하는 맥락에서 사용될 때, 단백질 및 다른 생물학적 물질의 불균질 집단, 예를 들어 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장 또는 조직 샘플 내의 항원의 존재를 결정짓는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 특정 지정된 면역검정 조건 하에, 특정 결합 특이성을 갖는 NB 구축물, 항체 또는 결합제는 특정 항원에 배경의 적어도 2배로 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 항원에 유의한 양으로 실질적으로 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 지정된 면역검정 조건 하에, 특정 결합 특이성을 갖는 NB 구축물, 항체 또는 결합제는 특정 항원에 배경의 적어도 10배로 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 항원에 유의한 양으로 실질적으로 결합하지 않는다. 그러한 조건 하에 NB 구축물, 항체 또는 결합제에 대한 특이적 결합은 NB 구축물, 항체 또는 결합제가 특정 단백질에 대한 그의 특이성에 대해 선택된 것을 필요로 할 수 있다. 원하거나 적절한 경우에, 상기 선택은 예를 들어 다른 종 (예를 들어, 마우스 또는 래트)으로부터의 DR5 분자 또는 사멸 수용체 패밀리 구성원 또는 하위형인 다른 폴리펩티드와 교차반응하는 NB 구축물 또는 항체를 제거함으로써 달성될 수 있다. 별법으로, 일부 실시양태에서, 특정 목적하는 분자와 교차반응하는 NB 구축물, 항체 또는 항체 단편이 선택된다.
특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 NB 구축물을 선택하기 위해 다양한 면역검정 포맷을 사용할 수 있다. 예를 들어, 고상 ELISA 면역검정은 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해 통상적으로 사용되고 (예를 들어, 특이적인 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 면역검정 포맷 및 조건의 설명에 대해서 문헌 [Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)] 참조), 마찬가지로 NB 구축물 결합 분석을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 특이적 또는 선택적 결합 반응은 배경 신호보다 적어도 2배, 보다 일반적으로는 적어도 10 내지 100배 더 큰 신호를 생성할 것이다. 본원에서 설명되는 친화도 상수 (KA) 이외에, 본 발명의 DR5-결합 NB 구축물은 또한 일반적으로 5x10-2 M 미만, 10-2 M 미만, 5x10 -3 M 미만, 10-3 M 미만, 5x10-4 M 미만, 10-4 M 미만, 5x10-5 M 미만, 10-5 M 미만, 5x10-6 M 미만, 10-6 M 미만, 5x10-7 M 미만, 10-7 M 미만, 5x10-8 M 미만, 10-8 M 미만, 5x10-9 M 미만, 10-9 M 미만, 5x10-10 M 미만, 10-10 M 미만, 5x10-11 M 미만, 10-11 M 미만, 5x10-12 M 미만, 10-12 M 미만, 5x10-13 M 미만, 10-13 M 미만, 5x10-14 M 미만, 10-14 M 미만, 5x10-15 M 미만, 또는 10-15 M 미만 또는 이보다 작은 해리 속도 상수 (KD) (koff/kon)를 갖고, 비-특이적 항원 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 "HSA")에 대한 결합을 위한 그의 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화도로 DR5에 결합한다.
본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 반감기는 일반적으로 예를 들어, 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 천연 메카니즘에 의한 서열 또는 화합물의 청소 또는 제거 (sequestration)에 의해 생체 내에서 구축물의 혈청 농도가 50% 감소하는데 소요되는 시간을 의미한다. 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 생체내 반감기는 공지된 임의의 방식으로, 예컨대 약동학적 분석에 의해 결정될 수 있다. 적합한 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 반감기는 t1 /2-알파, t1 /2-베타와 같은 파라미터 및 곡선하 면적 (AUC)을 사용하여 표현될 수 있다. 아래 실험 부분 및 표준 안내서, 예컨대 문헌 [Kenneth et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists], 및 [Peters et al., Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)]; [Gibaldi & Perron, "Pharmacokinetics", published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]을 참조한다. 용어 "반감기의 증가" 또는 "증가된 반감기"는 t1 /2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 모두의 증가를 보이거나 보이지 않으면서 t1 /2-베타의 증가를 의미한다.
"DR5와 연관된 질환 및 장애"는 상기 및 명세서 전반에 걸쳐, 예를 들어 본원 식별번호 <0060>에서 규정된 바와 같다. 이론에 의해 제한되지 않지만, 그러한 질환 및/또는 장애에서 DR5의 작용 메카니즘은 예를 들어 본원 식별번호 <0061>에서 제시된 바와 같을 것으로 생각된다. 고려되는 DR5와 연관된 질환 및 장애의 비제한적인 예는 예를 들어 본원 식별번호 <0062>를 비롯하여 명세서 전반에 걸쳐 제시되고, 다른 예는 본원에서 제시되는 교시내용을 기초로 하여 당업자에게 분명해질 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "조정하는" 또는 "조정하기 위한"은 일반적으로 적합한 시험관내, 세포 또는 생체내 검정을 사용하여 측정될 때 표적 또는 항원의 활성의 감소 또는 억제, 또는 별법으로 활성의 증가를 의미한다. 특히, "조정하는" 또는 "조정하기 위한"은 동일한 조건 하에, 그러나 본 발명의 구축물의 부재 하에서의 동일한 검정에서의 표적 또는 항원의 활성에 비해 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 적어도 25%, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 이를 초과하는 정도로, 적합한 시험관내, 세포 또는 생체내 검정 (대체로 관련된 표적 또는 항원에 따라 결정되는)을 사용하여 측정된 표적 또는 항원의 활성을 감소 또는 억제하거나, 또는 별법으로 (관련 또는 의도된) 생물학적 활성을 증가시키는 것을 의미할 수 있다.
당업자에게 명백할 것인 바, "조정하는"은 또한 동일한 조건이지만 본 발명의 구축물의 부재시에 비해 동종다량체 또는 이종다량체 형태로의 회합을 위한 하나 이상의 그의 리간드, 결합 파트너, 파트너, 또는 기질에 대한 표적 또는 항원의 친화도, 결합력, 특이성 및/또는 선택성의 변화 (증가 또는 감소일 수 있는)의 달성; 및/또는 표적 또는 항원이 존재하는 배지 또는 환경 내의 하나 이상의 조건 (예컨대 pH, 이온 강도, 보조 인자의 존재 등)에 대한 표적 또는 항원의 감수성의 변화 (증가 또는 감소일 수 있는)의 달성을 수반할 수 있다. 당업자에게 명백할 것인 바, 이것은 다시 관련 표적 또는 항원에 따라 임의의 적합한 방식으로 및/또는 공지된 임의의 적합한 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, "조정하는"은 또한 표적 또는 항원이 관여하는 하나 이상의 생물학적 또는 생리학적 메카니즘, 효과, 반응, 기능, 경로 또는 활성 (또는 그의 기질(들), 리간드(들) 또는 경로(들)이 관여하는, 예컨대 그의 신호전달 경로 또는 대사 경로 및 그의 관련 생물학적 또는 생리학적 효과)에 대한 변화 (즉, 표적 또는 항원 및 목적하는 생물학적 또는 생리학적 효과에 따라, 각각 중화제, 효능제, 길항제 또는 역 (reverse) 효능제로서의 활성)의 달성을 의미할 수 있다. 당업자에게 명백할 것인 바, 그러한 중화제, 효능제 또는 길항제로서의 작용은 관련 표적 또는 항원에 따라 임의의 적합한 방식으로 및/또는 공지된 임의의 적합한 (시험관내 및 대체로 세포 또는 검정내) 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 특히, 효능제 또는 길항제로서의 작용은 동일한 조건 하에, 그러나 본 발명의 구축물의 부재 하의 동일한 검정에서의 생물학적 또는 생리학적 활성에 비해 의도된 생물학적 또는 생리학적 활성이 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 적어도 25%, 예를 들어 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 그 초과로 각각 증가 또는 감소되도록 하는 것일 수 있다.
조정은 예를 들어 표적 또는 항원의 알로스테릭 (allosteric) 조정; 그의 기질 또는 리간드 중의 하나에 대한 표적 또는 항원의 결합의 감소 또는 억제 및/또는 표적 또는 항원에 대한 결합을 위한 천연 리간드, 기질과의 경쟁을 수반할 수 있다. 조정은 또한 표적 또는 항원, 또는 이들이 관여하는 메카니즘 또는 경로의 활성화를 수반할 수 있다. 조정은 또한 예를 들어 표적 또는 항원의 폴딩 또는 입체형태, 또는 폴딩하는, 그의 입체형태를 변화시키는 (예를 들어, 리간드의 결합 시에), 다른 (하위)단위와 회합하는, 또는 해리되는 표적 또는 항원의 능력의 변화의 달성을 수반할 수 있다. 조정은 예를 들어 다른 화합물을 수송하는 또는 다른 화합물 (예컨대 이온)에 대한 채널로서 기능하는 표적 또는 항원의 능력의 변화의 달성을 수반할 수 있다.
조정은 가역적 또는 비가역적일 수 있지만, 제약 및 약물학적 목적을 위해 대체로 가역적인 방식으로 이루어질 것이다.
표적 또는 항원에 관하여, 용어 표적 또는 항원 상의 "상호작용 부위"는 리간드에 대한 결합을 위한 부위, 수용체 또는 다른 결합 파트너, 촉매 부위, 절단 부위, 알로스테릭 상호작용을 위한 부위, 표적 또는 항원의 다량체화 (예컨대 동종다량체화 (homomerization) 또는 이종다량체화 (heteromerization))에 관여하는 부위인 표적 또는 항원 상의 아미노산 잔기의 부위, 에피토프, 항원 결정기, 일부, 도메인 또는 스트레치; 또는 표적 또는 항원의 생물학적 작용 또는 메카니즘에 관여하는 표적 또는 항원 상의 아미노산 잔기의 임의의 다른 부위, 에피토프, 항원 결정기, 일부, 도메인 또는 스트레치를 의미한다. 보다 일반적으로, "상호작용 부위"는 표적 또는 항원 (및/또는 표적 또는 항원이 관여하는 임의의 경로, 상호작용, 신호전달, 생물학적 메카니즘 또는 생물학적 효과)이 조정될 수 있도록 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드가 결합할 수 있는 표적 또는 항원 상의 아미노산 잔기의 임의의 부위, 에피토프, 항원 결정기, 일부, 도메인 또는 스트레치일 수 있다.
아미노산 서열 또는 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열 또는 폴리펩티드가 제2 표적 또는 폴리펩티드에 결합하는 친화도보다 적어도 10배, 예컨대 적어도 100배, 및 바람직하게는 적어도 1000배, 및 10,000배까지 또는 그 초과로 더 양호한 친화도 (상기 설명된 바와 같이, 및 KD 값, KA 값, Koff 속도 및/또는 Kon 속도로서 적합하게 표현되는)로 제1 항원에 결합할 때 제2 표적 또는 항원에 비해 제1 표적 또는 항원에 "특이적인" 것으로 언급된다. 예를 들어, 제1 항원은 상기 아미노산 서열 또는 폴리펩티드가 제2 표적 또는 폴리펩티드에 결합하는 KD보다 적어도 10배 더 작은, 예를 들어, 적어도 100배 더 작은, 바람직하게는 적어도 1000배 더 작은, 예컨대 10,000배 더 작은 또는 심지어 이보다 더 큰 배수 차이의 KD 값으로 표적 또는 항원에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열 또는 폴리펩티드가 제2 표적 또는 항원에 비해 제1 표적 또는 항원에 "특이적인" 경우, 이는 상기 제1 표적 또는 항원에 대해 작용하지만, 상기 제2 표적 또는 항원에 대해서는 작용하지 않는다.
용어 "교차차단", "교차차단된" 및 "교차차단하는"은 본 발명의 다른 아미노산 서열 또는 결합제가 주어진 표적에 대한 결합을 저해하는 아미노산 서열 또는 다른 결합제 (예컨대 본 발명의 폴리펩티드)의 능력을 의미하기 위해 본원에서 교환가능하게 사용된다. 본 발명의 아미노산 서열 또는 다른 결합제가 또 다른 서열 또는 결합제의 DR5에 대한 결합을 저해하고 따라서 이들이 본 발명에 따라 교차차단한다고 언급될 수 있는 정도는 경쟁 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 특히 적합한 한 정량 검정은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 상호작용 정도를 측정할 수 있는 비아코어 (Biacore) 기기를 사용한다. 다른 적합한 정량적 교차차단 검정은 표적에 대한 그의 결합의 측면에서 아미노산 서열 또는 또 다른 결합제 사이의 경쟁을 측정하는 ELISA-기반 접근법을 사용한다.
아미노산 서열 또는 다른 결합제가 본 발명에 따라 교차차단하거나 또는 교차차단할 수 있는지를 결정하기 위한 적합한 검정은 예시적인 비아코어 검정 또는 예시적인 ELISA 검정이다.
아미노산 서열은 2개의 상이한 항원 또는 항원 결정기 (예컨대 포유동물의 2개의 상이한 종으로부터의 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민 및 사이노 혈청 알부민) 모두에 대해 특이적인 경우에 이들 상이한 항원 또는 항원 결정기에 대해 "교차반응성"인 것으로 언급된다.
"본질적으로 pH와 독립적인" 결합은 본원에서 일반적으로 동물 또는 인체의 세포에서 발생하는 pH 값(들) (본원에서 추가로 설명되는)에서 혈청 단백질 (예컨대 혈청 알부민)에 대한 아미노산 서열의 회합 상수 (KA)가 상기 세포의 외부에서 발생하는 pH 값(들)에서 동일한 혈청 단백질에 대한 아미노산 서열의 회합 상수 (KA)의 적어도 5%, 예컨대 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 60%, 예컨대 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70%, 예컨대 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 그 초과 (또는 심지어 100% 초과, 예컨대 110% 초과, 120% 초과 또는 심지어 130% 초과, 또는 심지어 150% 초과, 또는 심지어 200% 초과)임을 의미한다. 별법으로, "본질적으로 pH와 독립적인" 결합은 본원에서 일반적으로 동물 또는 인체의 세포에서 발생하는 pH 값(들) (본원에서 추가로 설명되는, 예를 들어 약 5.5, 예를 들어 5.3 내지 5.7의 pH)에서 혈청 단백질 (예컨대 혈청 알부민)에 대한 아미노산 서열의 koff 속도 (비아코어에 의해 측정됨 - 예를 들어 실험 2 참조)가 상기 세포의 외부에서 발생하는 pH 값(들), 예를 들어 pH 7.2 내지 7.4에서 동일한 혈청 단백질에 대한 아미노산 서열의 koff 속도의 적어도 5%, 예컨대 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 60%, 예컨대 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70%, 예컨대 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 그 초과 (또는 심지어 100% 초과, 예컨대 110% 초과, 120% 초과 또는 심지어 130% 초과, 또는 심지어 150% 초과, 또는 심지어 200% 초과)임을 의미한다. "동물 또는 인체의 세포에서 발생하는 pH 값(들)"은 세포, 특히 혈청 단백질의 재순환에 관여하는 세포 내에서 발생할 수 있는 pH 값(들)을 의미한다. 특히, "동물 또는 인체의 세포에서 발생하는 pH 값(들)"은 (예를 들어 음세포작용 (pinocytosis), 세포내이입, 세포전달작용 (transcytosis), 세포외배출 및 포식작용 또는 상기 세포 내로의 흡수 또는 내재화의 유사한 메카니즘의 결과로서) 혈청 단백질의 재순환에 관여하는 (하위)세포 구획 또는 베지클, 예컨대 엔도솜, 리소솜 또는 피노솜 (pinosome) 내에서 발생할 수 있는 pH 값(들)을 의미한다.
본원에 추가로 설명되는 바와 같이, NB 구축물 내의 아미노산 잔기의 총 수는 110-120, 바람직하게는 112-115, 가장 바람직하게는 113의 영역 내에 존재할 수 있다. 그러나, NB 구축물의 일부, 단편, 유사체 또는 유도체 (본원에서 추가로 설명되는)는 상기 일부, 단편, 유사체 또는 유도체가 본원에서 개요가 설명되는 추가의 요건을 충족하고 임의로 본원의 목적을 위해 적합하다면 그의 길이 및/또는 크기에 특히 제한되지 않음을 주지해야 한다.
본원에 언급될 때, "바람직한" (또는 "보다 바람직한", "훨씬 더 바람직한" 등)은 본원에 설명되는 다양한 실시양태, 또는 그와 같이 설명되는 특정 실시양태에 대한 구체적인 NB 화합물 또는 그의 변이체, 또는 그의 용도에 적용된다.
NB 구축물의 아미노산 잔기는 문헌 [Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195]에서 낙타류로부터의 VHH 도메인에 적용되는 바와 같이 문헌 [Kabat et al. "Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91]에 제시된 VH 도메인에 대한 일반적인 넘버링에 따라 넘버링된다 (예를 들어, 본원의 도 2 참조). 따라서, 일반적으로 NB 구축물의 FR1은 위치 1-30의 아미노산 잔기를 포함하고, NB 구축물의 CDR1은 위치 31-35의 아미노산 잔기를 포함하고, NB 구축물의 FR2는 위치 36-49의 아미노산 잔기를 포함하고, NB 구축물의 CDR2는 위치 50-65의 아미노산 잔기를 포함하고, NB 구축물의 FR3은 위치 66-94의 아미노산 잔기를 포함하고, NB 구축물의 CDR3은 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함하고, NB 구축물의 FR4는 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함한다. 그러나, 각각의 CDR 내의 아미노산 잔기의 총 수는 상이하고, 따라서 아미노산 잔기의 총 수에 대응하지 않을 수 있음이 VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당업계에 공지되어 있다. 예로서, 본원에 설명되는 본 발명의 NB 구축물에서, 그의 특정 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4에 대한 NB 구축물 내의 아미노산 잔기 및 그의 위치는 본원의 표 4에 제공된 바와 같다. 다른 방법, 예컨대 카바트 및 코티아 (Chothia)는 특정 CDR의 다른 버전을 규정하기 위해 사용될 수 있고, 접촉점 및 상호작용 부위의 결정학적 결정은 각각의 특정 CDR 및/또는 FR 영역의 정도에 대한 추가의 정보를 당업자에게 제시할 수 있다.
도면, 서열 목록 및 실험 부분/실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제시되고, 본원에서 명시적으로 다르게 나타내지 않는 한, 임의의 방식으로 본 발명의 범위 및/또는 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것으로서 해석되거나 간주되지 않아야 한다.
중쇄 항체 및 그의 가변 도메인의 일반적인 설명에 대해서는, 특히 본원에 인용된 관련 참고문헌을 참조한다.
관련 기술에서 사용되는 용어에 따르면, 천연 발생 중쇄 항체에 존재하는 가변 도메인은 또한 통상적인 4-사슬 항체에 존재하는 중쇄 가변 영역 도메인 (본원에서 "VH 도메인"으로 언급될 것임) 및 통상적인 4-사슬 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인 (본원에서 "VL 도메인"으로 언급될 것임)과 구별하기 위해서 "VHH 도메인"으로 본원에서 언급될 것이다. 일반적으로, VHH 도메인은 경쇄 가변 도메인의 부재 하에 및 이 도메인과의 임의의 상호작용 없이 본래 항원에 기능적으로 결합하도록 "설계된다".
상기 인용된 관련 참고문헌에 언급된 바와 같이, VHH 도메인은 많은 특유한 구조적 특징 및 기능적 특성을 갖는다. 이들은 단리된 VHH 도메인 (및 천연 발생 VHH 도메인과 상기 구조적 특징 및 기능적 특성을 공유하는, 그를 기초로 한 본 발명의 조성물) 및 그를 함유하는 단백질이 기능적 항원 결합 도메인 또는 단백질로서 사용하기에 매우 유리하도록 만든다. 특히 및 그에 제한되지 않으면서, VHH 도메인 및 본 발명의 조성물은 단일, 비교적 작은, 기능적 항원 결합 구조 단위, 도메인 또는 단백질로서 기능할 수 있다. 이를 통해, 일반적으로 홀로 단일 항원 결합 단백질 또는 도메인으로서의 실질적인 용도에 적합하지 않지만 기능적 항원 결합 단위를 제공하기 위해서 (예를 들어, 통상적인 항체 단편, 예컨대 Fab 단편; VL 도메인에 공유 연결된 VH 도메인으로 이루어진 ScFv 단편에서처럼) 일부 형태 또는 또 다른 형태로 조합될 필요가 있는 통상적인 4-사슬 항체의 VH 및 VL 도메인으로부터 VHH 도메인을 구별할 수 있다.
이들 특유한 특성 때문에, VHH 도메인, 및 본 발명의 NB 작용제 및 이를 기초로 한 조성물의 단일 항원 결합 단백질로서 또는 항원 결합 도메인 (즉, 보다 큰 단백질 또는 폴리펩티드의 일부로서)으로서의 사용은 통상적인 VH 및 VL 도메인, ScFv 또는 통상적인 항체 단편 (예컨대 Fab- 또는 F(ab')2-단편)의 사용에 비해 많은 유의한 이점을 제공한다. NB 구축물의 낙타류 VHH 변이체의 이점은 예를 들어 높은 친화도 및 높은 선택성으로 항원에 결합하기 위해 단일 도메인만이 필요하여, 다수의 별개의 도메인을 제조하거나 조합할 필요가 없고 이들 2개의 도메인이 올바른 공간적 입체형태 및 형상으로 존재하는지 보장할 필요가 없고; VHH 도메인은 단일 전사체로부터 발현될 수 있고, 번역후 폴딩 또는 변형을 필요로 하지 않고; VHH 도메인은 다가 및 다중특이적 포맷 (본원에서 추가로 논의되는 바와 같이)으로 쉽게 조작될 수 있고; VHH 도메인은 고도로 가용성이고, 응집 경향을 갖지 않고; VHH 도메인은 열, pH, 프로테아제 및 다른 변성제 또는 조건에 대해 고도로 안정하고; VHH 도메인은 제조 및 생산 규모 확대가 쉽고 비교적 비용이 적게 필요하고; VHH 도메인은 통상적인 4-사슬 항체 및 그의 항원 결합 단편에 비해 비교적 작고 (단량체는 약 15 kDa이고, 즉 통상적인 IgG보다 10배 더 작음), 따라서 상기 통상적인 4-사슬 항체 및 그의 항원 결합 단편보다 조직 (비제한적으로 고형 종양 및 다른 치밀한 조직 포함) 내로 (더) 높은 투과도를 보이고; VHH 도메인은 소위 공동 (cavity)-결합 특성 (특히 통상적인 VH 도메인에 비해 그의 연장된 CDR3 루프에 의한)을 보일 수 있고, 따라서 또한 통상적인 4-사슬 항체 및 그의 항원 결합 단편에 접근가능하지 않은 표적 및 에피토프에 접근할 수 있다는 것이다.
DR5 에 대한 NB 구축물
구체적인 및 바람직한 측면에서, 본 발명은 DR5에 대한 NB 작용제, 특히 온혈 동물로부터의 DR5에 대한 NB 작용제, 보다 특히 포유동물로부터의 DR5에 대한 NB 작용제, 및 특히 예컨대 공공 데이터베이스, 예를 들어 NCBI 단백질 데이터베이스 등록 번호 BAA33723 (서열 89)에서 제공되는 인간 DR5에 대한 NB 작용제; 및 적어도 하나의 상기 NB 작용제를 포함하는 단백질 및/또는 폴리펩티드를 제공한다.
특히, 본 발명은 DR5에 대한 통상적인 항체, 또는 그의 단편에 비해, 상기 통상적인 항체 또는 항체 단편 (예컨대 Fab' 단편, F(ab')2 단편, ScFv 구축물, "디아바디" 및 다른 다중특이적 구축물) (예를 들어, 문헌 [Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep; 23(9): 1126-36]의 검토 참조)를 기초로 할 수 있는 구축물에 비해, 및 또한 통상적인 항체의 가변 도메인으로부터 유래될 수 있는 소위 "dAb" 또는 유사한 (단일) 도메인 항체에 비해 개선된 치료적 및/또는 약물학적 특성 및/또는 다른 유익한 특성 (예를 들어, 제품의 개선된 제조 용이성 및/또는 감소된 비용)을 갖는 DR5에 대한 NB 작용제, 및 그를 포함하는 단백질 및/또는 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태에서, 및 치료상 유용한 본 발명의 아미노산 서열에 대해 일반적으로 본원에 설명되는 바와 같이, 본 발명의 NB 작용제 및 그의 변이체는 본질적으로 단리된 형태로 존재하거나, 또는 본 발명의 하나 이상의 NB 작용제를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 일부를 형성한다. 한 실시양태에서, NB 작용제 변이체는 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 아미노산 서열은 하나 이상의 적합한 링커를 통해 연결된다. 한 실시양태에서, 및 비제한적으로, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열은 각각 본 발명의 1가, 다가 또는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하도록 결합 단위 (즉, DR5 이외의 하나 이상의 다른 표적에 대한)로서 기능할 수 있는 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 임의로 함유할 수 있는, 상기 단백질 또는 폴리펩티드 내의 결합 단위로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 각각 1가, 다가 또는 다중특이적 NB 작용제를 제공하도록 모두가 임의로 하나 이상의 적합한 링커를 통해 연결된, 본 발명의 하나 이상의 NB 작용제 및 임의로 하나 이상의 (다른) 폴리펩티드 도메인 또는 에피토프 결합 조성물 (즉, DR5 이외의 다른 표적에 대해 작용하는)을 포함하거나 본질적으로 이로 구성될 수 있다.
한 실시양태에서, DR5에 대한 결합을 위한 결합 부위는 CDR 서열에 의해 형성된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 DR5에 대한 결합을 위한 적어도 하나의 결합 부위 이외에, 다른 항원, 단백질 또는 표적에 대한 결합을 위한 하나 이상의 추가의 결합 부위를 함유한다. 그러한 제2 결합 부위를 도입하기 위한 방법 및 위치에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Keck and Huston, Biophysical Journal, 71, October 1996, 2002-2011]; EP 0640 130; WO 06/07260 및 애블링스 엔.브이.의 미국 특허 가출원 발명의 명칭: "Immunoglobulin domains with multiple binding sites", 2006년 11월 27일 출원)을 참조한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 (또는 이를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드)이 대상체에게 투여되도록 의도될 때 (예를 들어, 본원에 설명된 바와 같이 치료 및/또는 진단 목적을 위해), 이것은 인간 DR5에 대해 작용한다. 한 실시양태에서, 수의학적 목적을 위해, 본 발명의 조성물은 치료되는 종으로부터의 DR5에 대해 작용한다. 본 발명의 조성물은 교차반응성 (즉, 포유동물의 2 이상의 종으로부터의 DR5에 대해, 예컨대 인간 DR5 및 본원에 언급된 포유동물의 종 중 적어도 하나로부터의 DR5에 대한 활성)일 수 있거나 교차반응성이지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 구축물은 DR5에 특이적으로 결합할 수 있지만, DR-4, TRAIL-R3 또는 TRAIL-R4에는 결합하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 일반적으로 DR5의 임의의 항원 결정기, 에피토프, 일부, 도메인, 하위단위 또는 입체형태 (적용가능한 경우)에 대해 작용한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 DR5의 세포외 도메인 부분에 대해 작용한다.
하나의 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본원에서 경쟁적 결합 검정에서 DR5의 천연 리간드와 경쟁한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 DR5에 대한 결합을 위해 TRAIL과 경쟁한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 DR5에 대한 결합을 위해 TRAIL과 경쟁하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제는 DR5에 대한 결합을 위해 TRAIL과 상승작용한다.
하나의 비제한적인 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 아미노산 서열 및 구조는 당업계에서 및 본원에서 각각 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1"로; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"로; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"으로; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로 언급되는 4개의 프레임워크 영역 또는 "FR" (또는 때로 "FW"로도 언급됨)로 이루어지고; 상기 프레임워크 영역에는 당업계에서 각각 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"로; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"로; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로 언급되는 3개의 상보성 결정 영역 또는 "CDR"이 그 사이에 존재한다. 한 실시양태에서, 프레임워크 서열 및 CDR (및 그의 조합)은 본원 및 특히 표 4에 설명되는 본 발명의 NB 구축물 내에 존재하는 것이다. 다른 적합한 CDR 서열은 본원에 설명되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
하나의 비제한적인 실시양태에서, 본 발명의 CDR 서열은
a) NB 구축물이 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수 (KD)로 (즉, 105 내지 1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107 내지 1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108 내지 1012 리터/몰의 회합 상수 (KA)로) DR5에 결합하고/하거나;
b) NB 구축물이 102 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1 내지 107 M-1s-1의 kon-속도로 DR5에 결합할 수 있고/있거나;
c) NB 구축물이 1 s-1 (t1 /2=0.69 s) 내지 10-6 s-1 (수일의 t1 /2을 갖는 근 비가역적 복합체를 제공함), 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1 내지 10-6 s-1의 koff 속도로 DR5에 결합할 수 있도록 하는 것이다.
한 실시양태에서, 본원에서 CDR 서열은 본 발명의 1가 조성물 (또는 단지 1개의 본 발명의 NB 구축물만을 함유하는 폴리펩티드)이 100 nM 미만, 바람직하게는 10 nM 미만, 보다 바람직하게는 1 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 DR5에 결합하도록 하는 것이다.
DR5에 대한 본 발명의 NB 작용제의 친화도는 그 자체로 공지된 방식으로, 예를 들어 본원에 언급된 KD, KA, koff 또는 kon을 측정하기 위한 일반적인 기법 및 본원에 설명되는 일부의 특정 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명은 4개의 프레임워크 영역 (각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역 (각각 CDR1 내지 CDR3)으로 이루어진 DR5에 대한 NB 작용제에 관한 것이다. 한 실시양태에서, NB 작용제는
CDR1이
a) 서열 41 내지 44의 아미노산 서열;
b) 서열 41 내지 44의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 41 내지 44의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
로 이루어지는 군 중에서 선택되고/되거나;
CDR2가
a) 서열 51 내지 55의 아미노산 서열;
b) 서열 51 내지 55의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 51 내지 55의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
로 이루어지는 군 중에서 선택되고/되거나;
CDR3이
a) 서열 63 내지 68의 아미노산 서열;
b) 서열 63 내지 68의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 63 내지 68의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
로 이루어지는 군 중에서 선택되는 NB 구축물 또는 그러한 아미노산 서열의 임의의 적합한 단편이다.
본 발명의 NB 작용제 중에서, 상기 명시적으로 나열된 하나 이상의 CDR을 포함하는 NB 구축물이 특히 바람직하고; 상기 명시적으로 나열된 2개 이상의 CDR을 포함하는 NB 구축물이 보다 특히 바람직하고; 상기 명시적으로 나열된 3개의 CDR을 포함하는 NB 구축물이 가장 특히 바람직하다.
CDR 서열의 일부 특히 바람직하지만 비-제한적인 조합, 및 CDR 서열 및 프레임워크 서열의 바람직한 조합은 많은 본 발명의 바람직한 (그렇지만 비-제한적인) NB 구축물에 존재하는 CDR 서열 및 프레임워크 서열을 제시하는 아래 표 4에 언급되어 있다. 당업자에게 명백할 것인 바, 동일한 클론에서 발생하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 (즉, 표 4의 동일한 행에 언급된, 및 특히 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104에 제공된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열)의 조합이 대체로 바람직할 것이다 (본 발명이 그의 가장 넓은 의미에서 그로 제한되지 않고, 또한 표 4에 언급된 CDR 서열의 다른 적합한 조합도 포함하지만). 또한, 동일한 클론에서 발생하는 CDR 서열 및 프레임워크 서열 (즉, 표 4의 동일한 행에 언급된, 및 특히 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104 내의 맥락에 제공된 CDR 서열 및 프레임워크 서열)의 조합이 대체로 바람직할 것이다 (그러나, 본 발명이 그의 가장 넓은 의미에서 그로 제한되지 않고, 또한 표 4에 언급된 CDR 서열 및 프레임워크 서열의 다른 적합한 조합, 및 상기 CDR 서열 및 다른 적합한 프레임워크 서열의 조합도 포함함).
한 실시양태에서, 표 4에 언급된 CDR의 조합을 포함하는 NB 구축물에서, 각각의 CDR은 언급된 CDR에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 CDR로 교체될 수 있다.
따라서, 본 발명의 NB 구축물에서, 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 적어도 하나는 각각 표 4에 나열된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 군 중에서; 또는 각각 표 4에 나열된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 적어도 하나에 대해 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99% "서열 동일성"을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 군 중에서; 및/또는 각각 표 4에 나열된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 적어도 하나와 각각 3, 2 또는 단지 1개의 "아미노산 차이(들)"를 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 군 중에서 적합하게 선택된다.
상기 맥락에서, "적합하게 선택된"은 적절한 경우에 각각 CDR1 서열이 적합한 CDR1 서열 (즉, 본원에서 규정된 바와 같이)로부터 선택되고, CDR2 서열이 적합한 CDR2 서열 (즉, 본원에서 규정된 바와 같이)로부터 선택되고, CDR3 서열이 적합한 CDR3 서열 (즉, 본원에서 규정된 바와 같이)로부터 선택됨을 의미한다. 한 실시양태에서, CDR 서열은 본 발명의 NB 구축물이 본원에 제공된 바와 같은 친화도 (KD-값 (실제 또는 겉보기), KA-값 (실제 또는 겉보기), kon-속도 및/또는 koff-속도로서, 또는 별법으로 본원에서 추가로 설명되는 IC50 값으로서 적합하게 측정된 및/또는 표현된)로 DR5에 결합하도록 선택된다.
본 발명의 NB 구축물의 한 실시양태에서, 적어도 존재하는 CDR3 서열은 표 4에 나열된 CDR3 서열로 이루어진 군 중에서 또는 표 4에 나열된 CDR3 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 CDR3 서열의 군 중에서; 및/또는 표 4에 나열된 CDR3 서열 중 적어도 하나에 대해 3개, 또는 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3 서열로 이루어진 군 중에서 적합하게 선택된다.
본 발명의 NB 구축물의 한 실시양태에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 적어도 2개는 각각 표 4에 나열된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 군 중에서 또는 각각 표 4에 나열된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 적어도 하나에 대해 각각 적어도 80%, 및/또는 적어도 90%, 및/또는 적어도 95%, 및/또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 군 중에서; 및/또는 표 4에 나열된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 적어도 하나에 대해 각각 3개, 2개 또는 단지 1개의 "아미노산 차이(들)"를 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 군 중에서 적합하게 선택된다.
본 발명의 NB 구축물의 한 실시양태에서, 존재하는 적어도 CDR3 서열은 표 4에 나열된 CDR3 서열로 이루어진 군 중에서 또는 각각 표 4에 나열된 CDR3 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 80%, 및/또는 적어도 90%, 및/또는 적어도 95%, 및/또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 CDR3 서열의 군 중에서 적합하게 선택되고; 존재하는 CDR1 및 CDR2 서열 중 적어도 하나는 각각 표 4에 나열된 CDR1 및 CDR2 서열로 이루어진 군 중에서 또는 각각 표 4에 나열된 CDR1 및 CDR2 서열 중 적어도 하나에 대해 각각 적어도 80%, 및/또는 적어도 90%, 및/또는 적어도 95%, 및/또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 CDR1 및 CDR2 서열의 군 중에서; 및/또는 각각 표 4에 나열된 CDR1 및 CDR2 서열 중 적어도 하나에 대해 각각 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1 및 CDR2 서열로 이루어진 군 중에서 적합하게 선택된다.
본 발명의 NB 구축물의 한 실시양태에서, 존재하는 3개의 모든 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 표 4에 나열된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 군 중에서 적합하게 선택된다.
한 실시양태에서, 표 4에 나열된 CDR (즉, 표 4에서 동일한 구축물에 대해 언급된 것)의 조합이 바람직하다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 NB 구축물 내의 CDR이 표 4에 언급된 CDR 서열이거나 또는 표 4에 나열된 CDR 서열에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 CDR 서열의 군 중에서; 및/또는 표 4에 나열된 CDR 서열에 대해 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR 서열로 이루어진 군 중에서 적합하게 선택될 때, 다른 CDR 중의 적어도 하나, 바람직하게는 두 개 모두는 표 4의 동일한 조합에 속하는 CDR 서열 (즉, 표 4의 동일한 행에 언급된)로부터 적합하게 선택되거나 또는 동일한 조합에 속하는 CDR 서열(들)에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 CDR 서열의 군 중에서 및/또는 동일한 조합에 속하는 CDR 서열(들)에 대해 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR 서열로 이루어진 군 중에서 적합하게 선택된다. 상기 문단에 표시된 다른 선호성은 또한 표 4에 언급된 CDR의 조합에도 적용된다.
본 발명의 NB 구축물의 한 실시양태에서, 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 표 4에 나열된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 조합 중의 하나로부터 적합하게 선택된다.
본 발명의 NB 구축물의 하나의 비제한적인 측면에 따르면, (a) CDR1의 길이는 1 내지 12개 아미노산 잔기, 대체로 2 내지 9개 아미노산 잔기, 예컨대 5, 6 또는 7개 아미노산 잔기이고/이거나; (b) CDR2의 길이는 13 내지 24개 아미노산 잔기, 대체로 15 내지 21개 아미노산 잔기, 예컨대 16 및 17개 아미노산 잔기이고/이거나; (c) CDR3의 길이는 2 내지 35개 아미노산 잔기, 대체로 3 내지 30개 아미노산 잔기, 예컨대 6 내지 23개 아미노산 잔기이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명은 CDR 서열이 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 CDR 서열에 대해 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예컨대 적어도 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 NB 구축물에 관한 것이다.
일반적으로, 상기 CDR 서열을 갖는 NB 작용제는 본원에서 추가로 설명되는 것일 수 있다. 한 실시양태에서, NB 작용제는 또한 본원에서 추가로 설명되는 프레임워크 서열을 갖는다. 따라서, 예를 들어, 및 본원에 언급될 때, 상기 NB 작용제는 천연 발생 단일 도메인 항체 (임의의 적합한 종으로부터의), 천연 발생 VHH 서열 (즉, 낙타류의 적합한 종으로부터의) 또는 합성 또는 반합성 아미노산 서열 또는 NB 작용제, 예를 들어 비제한적으로, 부분적으로 인간화된 NB 구축물 또는 VHH 서열, 완전히 인간화된 NB 구축물 또는 VHH 서열, 낙타화 중쇄 가변 영역 도메인 서열, 및 본원에 언급된 기법에 의해 얻어진 NB 작용제일 수 있다.
따라서, 하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명은 4개의 프레임워크 영역 (각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역 (각각 CDR1 내지 CDR3)으로 이루어지는 인간화 NB 작용제에 관한 것이고, 여기서 CDR1 내지 CDR3은 본원에서 규정된 바와 같고, 상기 인간화 NB 작용제는 적어도 하나의 인간화 치환, 특히 그의 프레임워크 서열 중 적어도 하나에 적어도 하나의 인간화 치환을 포함한다.
또 다른 바람직한, 그러나 비제한적인 측면에서, 본 발명은 CDR 서열이 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 CDR 서열에 대해 적어도 70% 아미노산 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 90% 아미노산 동일성, 예컨대 95% 아미노산 동일성 또는 그 초과 또는 심지어 본질적으로 100% 아미노산 동일성을 갖는 것인 NB 작용제에 관한 것이다. 상기 아미노산 동일성 정도는 예를 들어 상기 NB 작용제과 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 서열 중의 하나 이상의 사이의 아미노산 동일성 정도를 결정함으로써 (본원에 기재된 방식으로) 결정할 수 있고, 여기서 프레임워크 영역을 형성하는 아미노산 잔기는 무시된다. 또한, 상기 NB 작용제는 본원에서 추가로 설명되는 것일 수 있다.
하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명은 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104로 이루어진 군 중에서 또는 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예컨대 적어도 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 비제한적으로 NB 구축물을 비롯한 NB 작용제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 비제한적인 측면은 상응하는 천연 서열에 비해, 적어도 하나의 인간화 치환, 특히 그의 프레임워크 서열 중 적어도 하나 내의 적어도 하나의 인간화 치환을 포함하는, 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 NB 구축물의 인간화 또는 추가의 인간화 변이체에 관한 것이다.
1가 및 다가 결합 폴리펩티드
본 발명은 추가로 DR5에 대한, 및 보다 구체적으로 인간 DR5에 대한 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지고 임의로 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 포함하는, 아폽토시스를 향상시킬 수 있는 화합물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 일부 NB 작용제는 DR5 수용체에 대한 적어도 3, 4, 5 또는 그 초과의 1가 결합 폴리펩티드, 예컨대 DR5에 대해 작용하는 본 발명의 NB 작용제를 포함하는 단백질이다. 본원에 언급되는 바와 같이, 본 발명의 그러한 다가 폴리펩티드에서, 각각의 1가 결합 폴리펩티드, 예컨대 NB 구축물은 DR5 상의 동일한 에피토프에 대해, 또는 DR5 상의 상이한 에피토프에 대해 작용할 수 있다. 본 발명의 상기 NB 폴리펩티드의 일부 비-제한적인 예는 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104에 제시된다.
일반적으로, 단일 결합 폴리펩티드 (예컨대 본 발명의 NB 작용제의 단일 DR5 결합 하위단위)를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에서 "1가" 단백질 또는 폴리펩티드 또는 "1가 구축물"로 언급될 것이다. 2개 이상의 결합 폴리펩티드 (예컨대 본 발명의 적어도 2개의 연결된 NB 작용제 또는 본 발명의 적어도 하나의 NB 작용제 및 적어도 하나의 다른 NB 작용제 또는 폴리펩티드 구축물)를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는 단백질 및 폴리펩티드는 본원에서 "다가" 단백질 또는 폴리펩티드 또는 "다가 구축물"로 언급될 것이고, 이들은 본 발명의 대응하는 1가 결합 폴리펩티드에 비해 특정 이점을 제공할 수 있다. 상기 다가 구축물의 특정한 비-제한적인 예는 본원에 제공된 바와 같다.
다가 NB 작용제의 구체적인 예는 2개의 폴리펩티드 하위단위를 포함하는 이량체 또는 2가 구축물, 3개의 폴리펩티드 하위단위를 포함하는 삼량체 또는 3가 NB 작용제, 4개의 폴리펩티드 하위단위를 포함하는 사량체 또는 4가 NB 작용제, 5개의 폴리펩티드 하위단위를 포함하는 오량체 또는 5가 NB 작용제, 6개의 폴리펩티드 하위단위를 포함하는 육량체 또는 6가 NB 작용제, 또는 그의 추가의 다량체 변이체를 포함한다.
하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명의 삼량체 NB 작용제는 본 발명의 3개의 1가 폴리펩티드 하위단위를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, 삼량체 NB 작용제는 본 발명의 3개의 동일한 DR5 결합 1가 폴리펩티드 하위단위를 포함하고, 이 경우에 NB 작용제는 다가이지만 단일특이적인 삼량체이다. 한 실시양태에서, 삼량체 NB 작용제는 예를 들어 각각 임의로 상이한 에피토프 (DR5 상의 또는 또 다른 표적 상의)에 특이적으로 결합하는 하위단위인 제1 및/또는 제2 DR5 결합 하위단위 및 제2 또는 제3 하위단위를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지고, 이 경우에 NB 작용제는 다가 및 다중특이적인 삼량체이다.
하나의 비제한적인 실시양태에서, NB 작용제는 본 발명의 적어도 4개의 1가 DR5 결합 폴리펩티드 하위단위를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다. 상기 본 발명의 사량체 NB 작용제는 단일특이적일 수 있거나 또는 임의로 제1 하위단위로부터의 동일한 또는 상이한 DR5 에피토프에 및/또는 DR5 이외의 다른 표적에 특이적으로 결합하는 추가의 하위단위에 연결함으로써 다중특이적 구축물로 전환될 수 있다.
하나의 비제한적인 실시양태에서, NB 작용제는 본 발명의 적어도 5개의 1가 DR5 결합 폴리펩티드 하위단위를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다. 상기 본 발명의 오량체 NB 작용제는 단일특이적일 수 있거나 또는 임의로 제1 하위단위와 상이한 DR5 에피토프에 및/또는 DR5 이외의 다른 표적에 특이적으로 결합하는 추가의 하위단위에 연결함으로써 다중특이적 구축물로 전환될 수 있다.
하나의 비제한적인 실시양태에서, NB 작용제는 본 발명의 6, 8 또는 10개의 1가 DR5 결합 폴리펩티드 하위단위를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다. 상기 본 발명의 다량체 NB 작용제는 단일특이적일 수 있거나 또는 임의로 제1 하위단위와 상이한 DR5 에피토프에 및/또는 DR5 이외의 다른 표적에 특이적으로 결합하는 추가의 하위단위에 연결함으로써 다중특이적 구축물로 전환될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 다량체 NB 작용제는 단일특이적 또는 다중특이적이든 상관없이 본 발명의 단량체 NB 작용제를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는 단백질 또는 폴리펩티드에 비해 특정 이점을 제공한다. 한 실시양태에서, 이점은 예를 들어 인간 DR5에 대한 매우 개선된 결합력을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다량체 NB 작용제의 일부 구체적인, 그러나 비-제한적인 예는 서열 6 내지 22, 27-29, 31-33 및 88의 NB 구축물이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 적어도 하나의 NB 작용제, 임의로 하나 이상의 추가의 NB 작용제, 및 본 발명의 NB 작용제에 및/또는 생성되는 융합 단백질에 적어도 하나의 목적하는 특성을 부여하는 적어도 하나의 다른 아미노산 서열 (예컨대 단백질 또는 폴리펩티드)을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다. 다시, 상기 융합 단백질은 본 발명의 대응하는 1가 NB 작용제에 비해 특정 이점을 제공할 수 있다. 상기 아미노산 서열 및 상기 융합 구축물의 일부 비-제한적인 예는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
한 실시양태에서, 예를 들어 본 발명의 2개의 NB 작용제 및 1개의 다른 NB 작용제, 및 임의로 하나 이상의 다른 아미노산 서열을 포함하는 3가 이중특이적 구축물을 제공하기 위해 2개 이상의 상기 측면을 조합할 수 있다. 상기 구축물, 및 본 발명의 측면 내에서 특히 바람직한 일부 구축물의 추가의 비-제한적인 예는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
상기 구축물에서, DR5에 대한 하나 이상의 결합 폴리펩티드 및/또는 다른 아미노산 서열은 서로 작동가능하게 연결되고/되거나 서로 하나 이상의 링커 서열을 통해 적합하게 연결될 수 있다. 상기 링커의 몇몇의 적합한, 그러나 비-제한적인 예는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
한 구체적인 측면에서, 본 발명의 다가 화합물은 적어도 3, 4, 5 또는 그 초과의 1가 결합 폴리펩티드 (즉, 하위단위)를 포함하고, 예를 들어 Colo205 또는 주르카트 세포 생존 검정으로 측정될 때 100 nM 미만, 바람직하게는 10 nM 미만, 보다 바람직하게는 1 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게는 100 pM 미만, 예를 들어 10 pM 미만의 IC50을 갖는다. 다른 암 세포주는 예를 들어 실시예에서 언급되는 바와 같이 IC50을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 세포 생존 검정에 사용될 수 있는 가능한 암 세포주는 예를 들어, 주르카트, Molt4, Colo205, BxPC3, T24, Panc-1, M30, H226, H2122, H2052, 및 MiaPaCa-2를 포함하지만 그에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다가 화합물은 비-종양 세포주에서보다 종양 세포주에서 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 100배 더 강하고, 세포 생존 검정, 예컨대 Colo205 또는 주르카트 세포 생존 검정에서 측정된다.
본 발명의 한 구체적인 측면에서, 본 발명의 NB 작용제 또는 본 발명의 적어도 하나의 NB 작용제를 포함하는 본 발명의 화합물, 구축물 또는 폴리펩티드는 본 발명의 상응하는 아미노산 서열에 비해 증가된 반감기를 가질 수 있다. 상기 NB 작용제, 화합물 및 폴리펩티드의 일부 비-제한적인 예는 본원의 추가의 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백해질 것이고, 예를 들어 그의 반감기를 증가시키기 위해 화학적으로 변형된 (예를 들어, peg화에 의해) 본 발명의 NB 작용제 서열 또는 폴리펩티드; 혈청 단백질 (예컨대 혈청 알부민)에 대한 결합을 위한 적어도 하나의 추가의 결합 부위를 포함하는 본 발명의 아미노산 서열, 또는 본 발명의 NB 작용제의 반감기를 증가시키는 적어도 하나의 모이어티 (특히 적어도 하나의 아미노산 서열)에 연결된 본 발명의 적어도 하나의 NB 작용제를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 반감기를 연장하는 모이어티 또는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 예는 본원의 추가의 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백해질 것이고; 예를 들어 비제한적으로, 본 발명의 하나 이상의 NB 작용제가 하나 이상의 혈청 단백질 또는 그의 단편 (예컨대 혈청 알부민 또는 그의 적합한 단편)에 또는 혈청 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 단위 (예컨대, 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 혈청 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG, 또는 트랜스페린에 결합할 수 있는 NB 작용제, 낙타류 VHH 구축물 또는 (단일) 도메인 항체)에 적합하게 연결된 폴리펩티드; 본 발명의 NB 작용제가 Fc 부분 (예컨대 인간 Fc) 또는 그의 적합한 일부 또는 단편에 연결된 폴리펩티드; 또는 본 발명의 하나 이상의 NB 작용제가 혈청 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 작은 단백질 또는 펩티드 (예컨대, 비제한적으로, WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489 및 WO 2006/122787, WO 2008/028977, WO 2008/043821, WO 2008/068280 및 WO 2009/127691 (애블링스 엔.브이)에 기재된 단백질 및 펩티드)에 적합하게 연결된 폴리펩티드를 포함한다.
다시, 당업자에게 명백할 것인 바, 그러한 NB 작용제는 2중, 3중 또는 보다 고도의 다중특이적 NB 작용제 구축물을 제공하도록 하나 이상의 추가의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위, 예컨대 하나 이상의 추가의 아미노산 서열 및 특히 하나 이상의 추가의 NB 작용제 (즉, DR5에 대해 작용하지 않는)를 함유할 수 있다.
일반적으로, 반감기가 증가된 본 발명의 NB 작용제 (또는 그를 포함하는 화합물, 구축물 또는 폴리펩티드)는 바람직하게는 본 발명의 상응하는 아미노산 서열 자체의 반감기보다 적어도 1.5배, 바람직하게는 적어도 2배, 예컨대 적어도 5배, 예를 들어, 적어도 10배 또는 20배 초과로 더 큰 반감기를 갖는다. 예를 들어, 반감기가 증가된 본 발명의 NB 작용제, 화합물, 구축물 또는 폴리펩티드는 본 발명의 상응하는 아미노산 서열 자체에 비해 1시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과, 보다 바람직하게는 6시간 초과, 예컨대 12시간 초과, 또는 심지어 24, 48 또는 72시간 초과로 더 증가된 반감기기를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한, 그러나 비제한적인 측면에서, 본 발명의 상기 NB 작용제, 화합물, 구축물 또는 폴리펩티드는 인간에서 적어도 약 12시간, 바람직하게는 적어도 24시간, 보다 바람직하게는 적어도 48시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 72시간 또는 그 초과의 혈청 반감기를 보인다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 반감기는 적어도 5일 (예컨대 약 5 내지 10일), 바람직하게는 적어도 9일 (예컨대 약 9 내지 14일), 보다 바람직하게는 적어도 약 10일 (예컨대 약 10 내지 15일), 또는 적어도 약 11일 (예컨대 약 11 내지 16일), 보다 바람직하게는 적어도 약 12일 (예컨대 약 12 내지 18일 또는 그 초과), 또는 14일 초과 (예컨대 약 14 내지 19일)수 있다.
본 발명의 또 다른 한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 생성되는 폴리펩티드가 혈액 뇌 장벽을 가로지르도록 하는 하나 이상의 (예컨대 2개의 및 바람직하게는 1개의) 아미노산 서열에 연결된 (임의로 하나 이상의 적합한 링커 서열을 통해) 본 발명의 하나 이상의 (예컨대 2개의 또는 바람직하게는 1개의) NB 작용제를 포함한다. 특히, 본 발명의 생성되는 폴리펩티드가 혈액 뇌 장벽을 가로지르도록 하는 상기 하나 이상의 아미노산 서열은 하나 이상의 (예컨대 2개 및 바람직하게는 1개의) 나노바디즈™, 예컨대 WO 02/057445에 기재된 나노바디즈™일 수 있고, FC44 (WO 06/040153의 서열 189) 및 FC5 (WO 06/040154의 서열 190)가 그의 특정 예이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 NB 작용제를 포함하는 폴리펩티드는
a) 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수 (KD)로 (즉, 105 내지 1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107 내지 1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108 내지 1012 리터/몰의 회합 상수 (KA)로) DR5에 결합하고/하거나;
b) 102 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1 내지 107 M-1s-1의 kon-속도로 DR5에 결합하고/하거나;
c) 1 s-1 (t1 /2=0.69 s) 내지 10-6 s-1 (수일의 t1 /2을 갖는 근 비가역적 복합체를 제공함), 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1 내지 10-6 s-1의 koff 속도로 DR5에 결합하는 것이다.
한 실시양태에서, 단지 하나의 본 발명의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 DR5에 결합할 것이다. 이와 관련하여, 2개 이상의 본 발명의 NB 작용제를 함유하는 폴리펩티드는 단지 1개의 본 발명의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드에 비해 증가된 결합력으로 DR5에 결합할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 상기 바람직한 측면에 따른 다른 폴리펩티드는 서열 1-22, 26-40 및 87-88의 아미노산 서열 중의 하나 이상에 대해 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예컨대 적어도 99% 또는 그 초과의 "서열 동일성"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있고, 여기서 상기 아미노산 서열 내에 포함되는 NB 작용제는 바람직하게는 본원에서 추가로 규정된 바와 같다.
핵산, 숙주 세포 및 본 발명의 NB 구축물의 생성 방법
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 NB 작용제 또는 이를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 다시, 본 발명의 핵산에 대해 일반적으로 본원에서 설명되는 바와 같이, 상기 핵산은 본원에서 제공되는 바와 같은 유전자 구축물의 형태일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 NB 작용제 및/또는 그를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하거나 발현할 수 있고/있거나; 본 발명의 핵산을 함유하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 그러한 숙주 또는 숙주 세포의 일부 바람직하지만 비-제한적인 예는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 적어도 하나의 NB 작용제, 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 적어도 하나의 핵산, 및 임의로, 즉 조성물의 의도된 용도에 따라 그 자체로 공지된 그러한 조성물의 하나 이상의 추가의 성분을 함유하거나 포함하는 생성물 또는 조성물에 관한 것이다. 그러한 또는 조성물은 예를 들어 제약 조성물 (본원에서 설명되는 바와 같이), 수의학적 조성물 또는 진단 용도를 위한 생성물 또는 조성물 (또한 본원에 설명되는 바와 같이)일 수 있다. 상기 생성물 또는 조성물의 일부 바람직하지만 비-제한적인 예는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 추가로 본원에서 설명되는 NB 작용제, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물의 제조 또는 생성을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 일부 바람직하지만 비-제한적인 예는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 추가로 본원에서 설명되는 NB 작용제, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물의 용도 및 사용, 및 DR5와 연관된 질환 및 장애에 대한 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 비-제한적인 특정 용도 및 사용은 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 다른 측면, 실시양태, 이점 및 용도는 또한 아래의 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
일반적으로, 그의 가장 넓은 의미에서 본원에서 사용되는 용어 "NB 작용제"는 특정 생물학적 공급원 또는 특정 제조 방법으로 제한되지 않음을 유의하여야 한다. 예를 들어, 아래에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 발명의 NB 작용제는 일반적으로 WO 08/020079의 페이지 61 및 62에 언급된 기법 (1) 내지 (8) 중 어느 하나, 또는 그 자체로 공지된 임의의 다른 적합한 기법에 의해 얻을 수 있다. NB 작용제의 하나의 바람직한 클래스는 DR5에 대해 작용하는 천연 발생 중쇄 항체의 VHH 또는 VH 도메인에 대응한다. 본원에 추가로 설명되는 바와 같이, VHH 서열은 일반적으로 낙타류의 종을 DR5로 적합하게 면역화시킴으로써 (즉, 면역 반응 및/또는 DR5에 대해 작용하는 중쇄 항체를 생성하기 위해), 상기 낙타류로부터 적합한 생물학적 샘플 (예컨대 혈액 샘플, 혈청 샘플 또는 B-세포의 샘플)을 얻음으로써, 및 그 자체로 공지된 임의의 적합한 기법을 이용하여 상기 샘플로부터 출발하여 DR5에 대해 작용하는 VHH 서열을 생성함으로써 생성되거나 얻을 수 있다. 그러한 기법은 당업자에게 명백할 것이고/것이거나 본원에서 추가로 설명된다.
별법으로, 상기 DR5에 대한 천연 발생 VHH 도메인은 낙타류 VHH 서열의 나이브 라이브러리로부터, 예를 들어 그 자체로 공지된 하나 이상의 스크리닝 기법을 이용하여 DR5, 또는 그의 적어도 하나의 일부, 단편, 항원 결정기 또는 에피토프를 사용하여 그러한 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 상기 라이브러리 및 기술은 예를 들어, WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 및 WO 03/035694에 기재되어 있다. 별법으로, 나이브 VHH 라이브러리로부터 유래된 개선된 합성 또는 반합성 라이브러리, 예를 들어 WO 00/43507에 기재된 무작위 돌연변이 유발 및/또는 CDR 셔플링 (shuffling)과 같은 기술에 의해 나이브 VHH 라이브러리로부터 얻어진 VHH 라이브러리가 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 DR5에 대해 작용하는 NB 작용제의 생성 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 방법은 적어도
a) NB 작용제 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리를 제공하고;
b) 상기 NB 작용제 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리를 DR5에 결합할 수 있고/있거나 DR5에 대한 친화도를 가질 수 있는 NB 작용제 서열에 대해 스크리닝하고;
c) DR5에 결합할 수 있고/있거나 DR5에 대한 친화도를 가질 수 있는 아미노산 서열(들)을 단리하는 단계
를 포함한다.
그러한 방법에서, NB 작용제 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 NB 작용제 서열의 나이브 세트, 집단 또는 라이브러리; NB 작용제 서열의 합성 또는 반합성 세트, 집단 또는 라이브러리; 및/또는 친화도 성숙에 적용된 NB 작용제 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있다.
본 방법의 특정 측면에서, NB 작용제 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 DR5로 또는 그를 기초로 하거나 그로부터 유래된 적합한 항원 결정기, 예컨대 그의 항원성 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화시킨 낙타류의 종으로부터 유래된 NB 작용제 서열의 면역 세트, 집단 또는 라이브러리, 및 특히 VHH 서열의 면역 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있다. 한 특정 측면에서, 상기 항원 결정기는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
상기 방법에서, VHH 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 예를 들어 스크리닝을 용이하게 하기 위해 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적합한 미생물 (예컨대 효모) 상에 디스플레이될 수 있다. 서열(의 세트, 집단 또는 라이브러리)의 디스플레이 및 스크리닝에 적합한 방법, 기술 및 숙주 유기체는 예를 들어 본원의 추가의 개시내용을 기초로 하여 당업자에게 명백할 것이다. WO 03/054016 및 문헌 [Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23(9): 1105-1116 (2005)]의 검토를 또한 참조한다.
한 실시양태에서, VHH 서열의 생성 방법은 적어도
a) 이뮤노글로불린 서열을 발현하는 낙타류의 종으로부터 유래된 세포의 집단 또는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 세포의 집단 또는 샘플을 (1) DR5에 결합할 수 있고/있거나 DR5에 대한 친화도를 가질 수 있는 이뮤노글로불린 서열을 발현하는 세포; 및 (2) 중쇄 항체를 발현하는 세포에 대해 스크리닝하고, 여기서, 하위단계 (1) 및 (2)는 DR5에 결합할 수 있고/있거나 DR5에 대한 친화도를 가질 수 있는 중쇄 항체를 발현하는 적어도 하나의 세포를 제공하도록 본질적으로 단일 스크리닝 단계로서 또는 2개의 별개의 스크리닝 단계로서 임의의 적합한 순서로 수행할 수 있는 것인 단계;
c) (1) 상기 세포로부터 상기 중쇄 항체에 존재하는 VHH 서열을 단리하거나; 또는 (2) 상기 세포로부터 상기 중쇄 항체에 존재하는 VHH 서열을 코딩하는 핵산 서열을 단리한 후, 상기 VHH 도메인을 발현하는 단계
를 포함한다.
본 측면에 따른 방법에서, 세포의 집단 또는 샘플은 예를 들어 B-세포의 집단 또는 샘플일 수 있다. 또한, 상기 방법에서, 세포의 샘플은 DR5로 또는 그를 기초로 하거나 그로부터 유래된 적합한 항원 결정기, 예컨대 그의 항원성 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화시킨 낙타류로부터 유래될 수 있다. 한 특정 측면에서, 상기 항원 결정기는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
당업자에게 명백할 것인 바 상기 방법은 임의의 적합한 방식으로 수행할 수 있다. 예를 들어, EP 0 542 810, WO 05/19824, WO 04/051268 및 WO 04/106377을 참조한다. 단계 b)의 스크리닝은 바람직하게는 유동 세포측정 기법, 예컨대 FACS를 이용하여 수행한다. 이를 위해, 예를 들어 문헌 [Lieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820]을 참조한다. 예를 들어, 국제 출원 WO 06/079372 (애블링스 엔.브이.)에 기재된 소위 "나노클론™" 기법을 참조한다.
또 다른 측면에서, DR5에 대해 작용하는 아미노산 서열의 생성 방법은
a) 중쇄 항체 또는 VHH 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) 상기 핵산의 상기 세트, 집단 또는 라이브러리를 DR5에 결합할 수 있고/있거나 DR5에 대한 친화도를 가질 수 있는 중쇄 항체 또는 VHH 서열을 코딩하는 핵산 서열에 대해 스크리닝하는 단계;
c) 상기 핵산 서열을 단리한 후, 각각 상기 중쇄 항체에 존재하는 VHH 서열을 발현시키거나 또는 상기 NB 구축물 서열을 발현시키는 단계
를 포함할 수 있다.
그러한 방법에서, 중쇄 항체 또는 VHH 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 예를 들어 중쇄 항체 또는 VHH 서열의 나이브 세트, 집단 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리; VHH 서열의 합성 또는 반합성 세트, 집단 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리; 및/또는 친화도 성숙에 적용된 VHH 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 DR5로 또는 그를 기초로 하거나 그로부터 유래된 적합한 항원 결정기, 예컨대 그의 항원성 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화시킨 낙타류로부터 유래된 중쇄 항체 또는 VHH 서열을 코딩하는 핵산 서열의 면역 세트, 집단 또는 라이브러리일 수 있다. 한 측면에서, 상기 항원 결정기는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
상기 방법에서, 뉴클레오티드 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 예를 들어 스크리닝을 용이하게 하기 위해 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적합한 미생물 (예컨대 효모) 상에 디스플레이될 수 있다. 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(의 세트, 집단 또는 라이브러리)의 디스플레이 및 스크리닝에 적합한 방법, 기술 및 숙주 유기체는 예를 들어 본원의 추가의 개시내용을 기초로 하여 당업자에게 명백할 것이다. WO 03/054016 및 문헌 [Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]의 검토를 또한 참조한다.
한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법의 스크리닝 단계는 또한 선택 단계로서 수행될 수 있다. 따라서, 본원 설명에서 사용되는 용어 "스크리닝"은 선택, 스크리닝 또는 선택 및/또는 스크리닝 기법의 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다. 또한, 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리가 사용될 때, 이것은 임의의 적합한 수의 서열, 예컨대 1, 2, 3 또는 약 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 104, 105, 106, 107, 108 또는 그 초과의 서열을 함유할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 아미노산 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리 내의 하나 이상의 또는 모든 서열은 합리적인, 또는 반-경험적 (semi-empirical) 방법, 예컨대 컴퓨터 모델링 기술 또는 생물 정역학 (biostatics) 또는 데이터 마이닝 (mining) 기술에 의해 얻어지거나 규정될 수 있다.
추가로, 그러한 세트, 집단 또는 라이브러리는 1개 또는 서로 (예를 들어, 설계된 점 돌연변이 또는 무작위 위치에 의해) 변이체인 2개 이상의 서열, 천연적으로 다양한 서열의 다양한 세트 (예를 들어 면역 라이브러리) 또는 다양한 서열의 임의의 다른 공급원으로부터 유래하는 절충된 다수의 서열 (예를 들어, 문헌 [Hoogenboom et al, Nat Biotechnol 23: 1105, 2005] 및 [Binz et al, Nat Biotechnol 2005, 23: 1247]에 기재된 바와 같은)을 포함할 수 있다. 상기 서열의 세트, 집단 또는 라이브러리는 파지 입자의 표면, 리보솜, 박테리아, 효모 세포, 포유동물 세포 상에 디스플레이되고, 이들 운반체 내의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 이에 의해, 상기 세트, 집단 또는 라이브러리는 본 발명의 목적하는 아미노산 서열을 단리하기 위한 선택 절차에 적용될 수 있다. 보다 일반적으로, 서열이 적합한 숙주 또는 숙주 세포 상에 디스플레이될 때, 먼저 상기 숙주 또는 숙주 세포로부터 목적하는 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 단리한 후, 상기 뉴클레오티드 서열을 적합한 숙주 유기체 내에서 적합하게 발현시킴으로써 목적하는 서열을 얻는 것도 가능하다 (및 관례적이다). 다시, 이것은 당업자에게 명백할 것인 바 그 자체로 공지된 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다.
DR5에 대해 작용하는 VHH 서열, VH 서열, 또는 NB 작용제 서열의 일부 다른 변이체를 얻기 위한 또 다른 기법은 중쇄 항체를 발현할 수 있는 트랜스제닉 (transgenic) 포유동물을 적합하게 면역화시키고 (즉, 면역 반응 및/또는 DR5에 대해 작용하는 중쇄 항체를 생성하기 위해), 상기 서열 (이를 코딩하는 핵산 서열)을 함유하는 상기 트랜스제닉 포유동물로부터의 적합한 생물학적 샘플 (예컨대 혈액 샘플, 혈청 샘플 또는 B-세포의 샘플)을 얻고, 이어서 그 자체로 공지된 임의의 적합한 기술 (예컨대 본원에 기재된 임의의 방법 또는 하이브리도마 기법)을 이용하여 상기 샘플로부터 출발하여 DR5에 대해 작용하는 NB 작용제 서열을 생성하는 것을 수반한다. 예를 들어, 상기 목적을 위해, 중쇄 항체-발현 마우스 및 WO 02/085945, WO 04/049794 및 WO 06/008548 및 문헌 [Janssen's et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 Oct 10; 103(41): 15130-5]에 기재된 추가의 방법 및 기법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 그러한 중쇄 항체 발현 마우스는 임의의 적합한 (단일) 가변 도메인, 예컨대 천연 공급원으로부터의 (단일) 가변 도메인 (예를 들어 인간 (단일) 가변 도메인, 낙타류 (단일) 가변 도메인 또는 상어 (단일) 가변 도메인), 및, 예를 들어, 합성 또는 반합성 (단일) 가변 도메인을 갖는 중쇄 항체를 발현할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 상기 방법에 의해, 또는 별법으로 상기 방법 중의 하나 및 추가로 상기 NB 작용제 서열의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 결정하고; 그 자체로 공지된 방식으로, 예컨대 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현에 의해 또는 화학적 합성에 의해 상기 NB 작용제 서열을 발현시키거나 합성하는 단계를 적어도 포함하는 방법에 의해 얻은 NB 작용제 서열에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 천연 발생 라마 VHH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만, 예를 들어 상기 나타낸 바와 같이, 및 예를 들어, WO 08/020079의 페이지 63에 추가로 설명된 바와 같이 및 그에 언급된 기법을 사용하여 상기 천연 발생 VHH 서열의 아미노산 서열 (특히 프레임워크 서열, 그러나 또한 임의로 하나 이상의 CDR) 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간으로부터의 통상적인 4-사슬 항체로부터의 VH 도메인 내의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 교체함으로써 "인간화"된 아미노산 서열을 갖는 낙타류 VHH 구축물을 포함하는 NB 작용제의 클래스를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 천연 발생 VH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만, 예를 들어 WO 08/020079의 페이지 63에 추가로 설명된 바와 같이 및 그에 언급된 기법을 사용하여 통상적인 4-사슬 항체로부터의 천연 발생 VH 도메인의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인 내의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 교체함으로써 "낙타화"된 아미노산 서열을 포함하는 NB 작용제의 클래스를 제공한다.
천연 발생 VH 서열 또는 VHH 서열로부터 출발하여 본 발명의 NB 작용제 (폴리펩티드 및/또는 그를 코딩하는 핵산 포함)을 얻기 위한 다른 적합한 방법 및 기법은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어, WO 08/020079의 페이지 64에 언급된 기술을 포함할 수 있다.
본원에 언급될 때, NB 작용제는 특히 하나 이상의 프레임워크 서열 내의 하나 이상의 "홀마크 잔기" (WO 2008/020079, 페이지 65-98에 기재된 바와 같이)의 존재를 특징으로 한다.
한 실시양태에서, NB 작용제는 예를 들어 VHH 서열일 수 있거나 또는 인간화 또는 추가로 인간화된 NB 구축물일 수 있다. NB 작용제 서열이 VHH 서열일 때, 이들은 적절하게 인간화될 수 있다. NB 작용제가 부분적으로 인간화된 NB 구축물일 때, 이들은 임의로 추가로 적합하게 인간화될 수 있다. 상기 NB 작용제에서, 하나 이상의 추가의 홀마크 잔기는 바람직하게는 설명된 바와 같다 (예를 들어, 이들이 VHH 서열 또는 부분적으로 또는 완전히 인간화된 NB 구축물일 때).
본원의 NB 작용제는 예를 들어 VHH 서열일 수 있거나 또는 인간화 또는 휴머니어드 서열일 수 있다. 상기 NB 작용제 서열이 VHH 서열인 경우에, 이들은 본원에서 제공된 바와 같이 적합하게 인간화될 수 있다. NB 작용제가 부분적으로 인간화된 경우에, 이들은 임의로 본원에서 설명되는 바와 같이 추가로 적합하게 인간화될 수 있다. 하나의 비제한적이고 예시적인 인간화 방법은 실시예에 제시되지만, 당업계에 공지된 다른 방법이 고려될 수 있다.
상기 NB 작용제의 한 실시양태에서에서, 하나 이상의 (추가의) 홀마크 잔기는 본원에서 설명되는 바와 같다 (예를 들어, 이들이 낙타류 VHH 서열 또는 부분적으로 또는 완전히 인간화된 VHH 구축물일 때).
하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명은 CDR 서열이 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 CDR 서열에 대해 적어도 70% 아미노산 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 90% 아미노산 동일성, 예컨대 적어도 95% 아미노산 동일성 또는 그 초과 또는 심지어 본질적으로 100% 아미노산 동일성을 갖는 것인 상기한 바와 같은 NB 작용제에 관한 것이다. 상기 아미노산 동일성 정도는 예를 들어 상기 NB 작용제와 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 서열 중의 하나 이상 사이의 아미노산 동일성 정도를 결정함으로써 (본원에 기재된 방식으로) 결정할 수 있고, 여기서 프레임워크 영역을 형성하는 아미노산 잔기는 무시된다. 상기 NB 작용제는 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이 변형될 수 있다.
본원에 이미 언급한 바와 같이, 본 발명의 또 다른 바람직한, 그러나 비제한적인 측면은 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104로 이루어지는 군 중에서 또는 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예컨대 적어도 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 NB 작용제에 관한 것이다.
상기 NB 작용제의 특정 실시양태에서:
i) 임의의 아미노산 치환 (본원에서 규정된 바와 같은 인간화 치환이 아닌 경우에)은 바람직하게는 서열 1-22, 26-40 및 87-88의 상응하는 아미노산 서열에 비해 보존적 아미노산 치환이고/이거나:
ii) 그의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열 1-22, 26-40 및 87-88의 상응하는 아미노산 서열에 비해 단지 아미노산 치환만을, 또는 바람직하게는 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 단지 1 또는 2개의 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하고/하거나;
iii) CDR은 예를 들어 서열 1-22, 26-40 및 87-88의 상응하는 아미노산 서열의 CDR로부터 출발하여 친화도 성숙에 의해 유래된 CDR일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 NB 작용제 내의 CDR 서열 및 FR 서열은 본 발명의 NB 작용제 (및 그를 포함하는 폴리펩티드)가
a) 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수 (KD)로 (즉, 105 내지 1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107 내지 1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108 내지 1012 리터/몰의 회합 상수 (KA)로) DR5, 예를 들어 인간 DR5에 결합하고/하거나;
b) 102 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1 내지 107 M-1s-1의 kon-속도로 DR5, 예를 들어 인간 DR5에 결합하고/하거나;
c) 1 s-1 (t1 /2=0.69 s) 내지 10-6 s-1 (수일의 t1 /2을 갖는 근 비가역적 복합체를 제공함), 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1 내지 10-6 s-1의 koff 속도로 DR5, 예를 들어 인간 DR5에 결합하도록 하는 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제에 존재하는 CDR 서열 및 FR 서열은 본 발명의 NB 작용제가 DR5, 예를 들어, 인간 DR5에 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 결합하도록 하는 것이다.
본 발명의 하나의 비제한적인 측면에서, NB 작용제는 본원에서 제공된 바와 같을 수 있지만, 천연 발생 인간 VH 도메인의 상응하는 프레임워크 영역, 특히 DP-47의 상응하는 프레임워크 영역에 비해 프레임워크 영역 중 적어도 하나에 적어도 "하나의 아미노산 차이"를 갖는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 하나의 비제한적인 측면에 따르면, NB 작용제는 본원에서 제공된 바와 같을 수 있지만, 천연 발생 인간 VH 도메인의 상응하는 프레임워크 영역에 비해, 특히 DP-47의 상응하는 프레임워크 영역에 비해 적어도 하나의 홀마크 잔기 (위치 108, 103 및/또는 45의 잔기 포함)에 적어도 "하나의 아미노산 차이"를 갖는다. 대체로, NB 작용제는 적어도 하나의 FR2 및/또는 FR4에서 천연 발생 VH 도메인과, 특히 FR2 및/또는 FR4 내의 적어도 하나의 홀마크 잔기 (다시, 위치 108, 103 및/또는 45의 잔기 포함)에서 적어도 하나의 상기 아미노산 차이를 가질 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 NB 작용제는 본원에서 제공된 바와 같을 수 있지만, 천연 발생 VHH 도메인의 상응하는 프레임워크 영역에 비해 프레임워크 영역 중 적어도 하나에 적어도 "하나의 아미노산 차이"를 갖는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 하나의 비제한적인 측면에 따르면, 인간화 NB 작용제는 본원에서 제공된 바와 같을 수 있지만, 천연 발생 VHH 도메인의 상응하는 프레임워크 영역에 비해 적어도 하나의 홀마크 잔기 (위치 108, 103 및/또는 45의 잔기 포함)에 적어도 "하나의 아미노산 차이"를 갖는다. 대체로, 인간화 NB 작용제는 적어도 하나의 FR2 및/또는 FR4에서 천연 발생 VHH 도메인과, 특히 FR2 및/또는 FR4 내의 적어도 하나의 홀마크 잔기 (다시, 위치 108, 103 및/또는 45의 잔기 포함)에서 적어도 하나의 상기 아미노산 차이를 가질 것이다.
본원의 개시내용으로부터 명백할 것인 바, 본원에서 제공된 바와 같은 본 발명의 NB 작용제의 천연 또는 합성 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자, 상동체 및 오르토로그 (ortholog) (본원에서 집합적으로 "유사체"로서 언급됨), 특히 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 및 서열 96-99의 NB 구축물의 유사체의 용도는 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면에 따르면, 용어 "본 발명의 NB 작용제" 및 용어 "본 발명의 NB 구축물"는 그의 가장 넓은 의미에서 또한 상기 유사체를 포함한다.
일반적으로, 상기 유사체에서는, 본원에 제공된 바와 같은 본 발명의 NB 작용제에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기가 교체, 결실 및/또는 부가될 수 있다. 상기 치환, 삽입 또는 결실은 하나 이상의 프레임워크 영역에서 및/또는 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다. 그러한 치환, 삽입 또는 결실이 하나 이상의 프레임워크 영역에서 이루어질 때, 이들은 하나 이상의 홀마크 잔기에서 및/또는 프레임워크 잔기 내의 하나 이상의 다른 위치에서 이루어질 수 있지만, 홀마크 잔기에서의 치환, 삽입 또는 결실은 (이들이 본원에 설명되는 바와 같은 적합한 인간화 치환이 아니라면) 일반적으로 덜 바람직하다.
비-제한적인 예로서, 치환은 예를 들어 보존적 치환 (본원에서 설명되는 바와 같이)일 수 있고/있거나 아미노산 잔기는 또 다른 VHH 도메인 내의 동일한 위치에서 천연 발생하는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 교체될 수 있지만 (예를 들어, 그러한 치환의 비-제한적인 예에 대해서는 WO 2008/020079 참조), 본 발명은 일반적으로 그로 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 NB 작용제의 특성을 개선하거나 또는 적어도 본 발명의 NB 작용제의 목적하는 특성 또는 목적하는 특성의 균형 또는 조합을 지나치게 (즉, NB 작용제가 더 이상 그의 의도된 용도에 적합하지 않은 정도로) 손상시키지 않는 임의의 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입, 또는 이들의 임의의 조합은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 당업자는 일반적으로 본원의 개시내용을 기초로 하고, 예를 들어 제한된 수의 가능한 치환을 도입하고 이렇게 수득한 NB 작용제의 특성에 대한 그의 영향을 결정하는 것을 수반할 수 있는 임의로 제한된 정도의 통상적인 실험 후에 적합한 치환, 결실 또는 삽입, 또는 이들의 적합한 조합을 결정하고 선택할 수 있을 것이다.
한 측면에서, NB 작용제 (즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)를 발현하기 위해 사용되는 숙주 유기체에 따라, 상기 결실 및/또는 치환은 번역후 변형을 위한 하나 이상의 부위 (예컨대 하나 이상의 글리코실화 부위)가 제거되도록 설계될 수 있고, 이것은 당업자의 능력 내에서 이루어질 것이다. 별법으로, 치환 또는 삽입은 예를 들어 부위-특이적 peg화 (다시 본원에 설명되는 바와 같이)를 허용하기 위해 관능기의 부착 (본원에 설명되는 바와 같이)을 위한 하나 이상의 부위를 도입하도록 설계될 수 있다.
가능한 아미노산 치환에 대해 WO 2008/020079에 제시되고 상기 제시된 바와 같이, 프레임워크 영역 내의 몇몇의 아미노산 잔기는 다른 잔기보다 더 보존된다. 한 측면에서, 본 발명은 그의 가장 넓은 의미에서 그로 제한되지 않지만, 임의의 치환, 결실 또는 삽입은 바람직하게는 덜 보존된 위치에서 이루어진다. 하나의 비제한적인 측면에서, 아미노산 치환은 아미노산 결실 또는 삽입보다 바람직하다.
하나의 비제한적인 측면에서, 유사체는 DR5에 본 발명의 NB 작용제에 대해 본원에서 제공된 바와 같은 친화도 (KD-값 (실제 또는 겉보기), KA-값 (실제 또는 겉보기), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 별법으로 본원에서 추가로 설명되는 IC50 값으로 적합하게 측정된 및/또는 표현된)로 결합할 수 있는 것이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 유사체는 본원에 설명되는 바와 같은 NB 작용제의 유리한 특성을 보유하는 것이다.
한 실시양태에서, 유사체는 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 NB 구축물 중의 하나에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 또는 99% 또는 그 초과의 서열 동일성 정도를 갖고/갖거나, 바람직하게는 최대 20개, 바람직하게는 최대 10개, 훨씬 더 바람직하게는 최대 5개, 예컨대 4개, 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이를 갖는다.
하나의 비제한적인 측면에서, 유사체의 프레임워크 서열 및 CDR은 (a) 위치 108에 Q; 및/또는 (b) 위치 45에 하전 아미노산 또는 시스테인 잔기 및 바람직하게는 위치 44에 E, 보다 바람직하게는 위치 44에 E 및 위치 45에 R; 및/또는 (c) 위치 103에 P, R 또는 S를 가질 것이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명의 NB 작용제의 유사체의 한 클래스는 인간화된 (즉, 본 발명의 천연 발생 NB 작용제의 서열에 비해) NB 작용제를 포함한다. 본원에 인용된 배경 기술에 언급된 바와 같이, 그러한 인간화는 일반적으로 천연 발생 VHH의 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간 VH 도메인, 예컨대 인간 VH3 도메인 내의 동일한 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 교체하는 것을 수반한다. 가능한 인간화 치환 또는 인간화 치환의 조합의 예는 예를 들어 본원의 표로부터, 본원에 인용된 배경 기술에 언급된 가능한 인간화 치환으로부터, 및/또는 NB 작용제의 서열과 천연 발생 인간 VH 도메인의 서열 사이의 비교로부터 당업자에게 명백할 것이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 인간화 치환은, 생성되는 인간화 NB 작용제가 본원에 제공된 바와 같은 NB 작용제의 유리한 특성을 여전히 보유하고, 또한 선행 문단의 유사체에 대해 설명된 바와 같도록 선택된다. 당업자는 본원의 개시내용을 기초로 하고, 예를 들어 제한된 수의 가능한 인간화 치환을 도입하고 이렇게 수득한 NB 작용제의 특성에 대한 그의 영향을 결정하는 것을 수반할 수 있는 임의로 제한된 정도의 통상적인 실험 후에 적합한 인간화 치환 또는 인간화 치환의 적합한 조합을 결정하고 선택할 수 있을 것이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 인간화의 결과로서, 본 발명의 NB 작용제는 본원에서 설명되는 바와 같은 본 발명의 NB 작용제의 유리한 특성을 여전히 보유하면서 보다 "인간-유사형"으로 될 수 있다. 그 결과, 그러한 인간화 NB 작용제는 대응하는 천연 발생 VHH 도메인에 비해 몇 가지의 이점, 예컨대 감소된 면역원성을 가질 수 있다. 다시, 본원의 개시내용을 기초로 하고 임의로 제한된 정도의 통상적인 실험 후에, 당업자는 한편으로 인간화 치환에 의해 제시되는 유리한 특성과 다른 한편으로 천연 발생 VHH 도메인의 유리한 특성 사이의 목적하는 또는 적합한 균형을 최적화하거나 달성하는 인간화 치환 또는 인간화 치환의 적합한 조합을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 NB 작용제는 임의의 프레임워크 잔기(들)에서, 예컨대 하나 이상의 홀마크 잔기에서 또는 하나 이상의 다른 프레임워크 잔기 (즉, 비-홀마크 잔기)에서 또는 임의의 그의 적합한 조합에서 적합하게 인간화될 수 있다. "P,R,S-103 군" 또는 "KERE 군"의 NB 작용제에 대한 하나의 바람직한 인간화 치환은 Q108의 L108로의 치환이다. "GLEW 클래스"의 NB 작용제는 또한 적어도 하나의 다른 홀마크 잔기가 낙타화 치환을 제공한다면 Q108의 L108 치환에 의해 인간화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 언급될 때, 인간화 NB 작용제의 하나의 특히 바람직한 클래스는 위치 44-47에 GLEW 또는 GLEW-유사 서열; 위치 103에 P, R 또는 S (특히 R), 및 위치 108에 L을 갖는다.
인간화 및 다른 유사체, 및 그를 코딩하는 핵산 서열은 그 자체로 공지된 임의의 방식으로, 예를 들어 WO 08/020079의 페이지 103 및 104에 언급된 기술 중 하나 이상을 사용하여 제공될 수 있다.
하나의 비제한적인 측면에서, 본 발명의 NB 작용제의 유사체의 한 클래스는 인간화된 (즉, 본 발명의 천연 발생 NB 작용제의 서열에 비해) NB 작용제를 포함한다. 본원에 인용된 배경 기술에 언급된 바와 같이, 그러한 인간화는 일반적으로 천연 발생 VHH의 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간 VH 도메인, 예컨대 인간 VH3 도메인 내의 동일한 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 교체하는 것을 수반한다. 가능한 인간화 치환 또는 인간화 치환의 조합의 예는 예를 들어 본원의 표로부터, 본원에 인용된 배경 기술에 언급된 가능한 인간화 치환으로부터, 및/또는 NB 작용제의 서열과 천연 발생 인간 VH 도메인의 서열 사이의 비교로부터 당업자에게 명백할 것이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 인간화 치환은, 생성되는 인간화 NB 작용제가 본원에 제공된 바와 같은 NB 작용제의 유리한 특성을 여전히 보유하고, 보다 바람직하게는 선행 문단의 유사체에 대해 설명된 바와 같도록 선택된다. 당업자는 본원의 개시내용을 기초로 하고, 예를 들어 제한된 수의 가능한 인간화 치환을 도입하고 이렇게 수득한 NB 작용제의 특성에 대한 그의 영향을 결정하는 것을 수반할 수 있는 임의로 제한된 정도의 통상적인 실험 후에 적합한 인간화 치환 또는 인간화 치환의 적합한 조합을 결정하고 선택할 수 있을 것이다.
일반적으로, 인간화의 결과로서, 본 발명의 NB 작용제는 본원에서 설명되는 바와 같은 본 발명의 NB 작용제의 유리한 특성을 여전히 보유하면서 보다 "인간-유사형"으로 될 수 있다. 그 결과, 그러한 인간화 NB 작용제는 대응하는 천연 발생 VHH 도메인에 비해 몇 가지의 이점, 예컨대 감소된 면역원성을 가질 수 있다. 다시, 본원의 개시내용을 기초로 하고 임의로 제한된 정도의 통상적인 실험 후에, 당업자는 한편으로 인간화 치환에 의해 제시되는 유리한 특성과 다른 한편으로 천연 발생 VHH 도메인의 유리한 특성 사이의 목적하는 또는 적합한 균형을 최적화하거나 달성하는 인간화 치환 또는 인간화 치환의 적합한 조합을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 NB 작용제는 임의의 프레임워크 잔기(들)에서, 예컨대 하나 이상의 홀마크 잔기 (WO 2008/020079에서 규정된)에서 또는 하나 이상의 다른 프레임워크 잔기 (즉, 비-홀마크 잔기)에서 또는 임의의 그의 적합한 조합에서 적합하게 인간화될 수 있다.
인간화 및 다른 유사체, 및 그를 코딩하는 핵산 서열은 그 자체로 공지된 임의의 방식으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 유사체는 천연 발생 VHH 도메인을 코딩하는 핵산을 제공하고, 치환되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 위한 코돈을 대응하는 목적하는 아미노산 잔기를 위한 코돈으로 변경하고 (예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 또는 적합한 미스매치 프라이머를 사용한 PCR에 의해), 이렇게 얻어진 핵산/뉴클레오티드 서열을 적합한 숙주 또는 발현 시스템에서 발현시키고; 임의로 상기 유사체를 본질적으로 단리된 형태 (예를 들어 본원에서 추가로 설명되는)로 제공하기 위해 단리 및/또는 정제함으로써 얻을 수 있다.
이것은 일반적으로 예를 들어 본원에 인용된 안내서 및 참조문, 본원에 인용된 배경 기술로부터 및/또는 본원의 추가의 설명으로부터 당업자에게 명백할 그 자체로 공지된 방법 및 기법을 이용하여 수행될 수 있다. 별법으로, 목적하는 유사체를 코딩하는 핵산은 그 자체로 공지된 방식으로 합성될 수 있고 (예를 들어 소정의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 합성하기 위한 자동화 장치를 사용하여), 이어서 본원에서 설명되는 바와 같이 발현될 수 있다. 또 다른 기법은 각각 목적하는 유사체의 일부를 코딩하는 하나 이상의 천연 발생 및/또는 합성 핵산 서열을 조합한 후, 본원에서 설명되는 바와 같이 조합된 핵산 서열을 발현시키는 것을 수반할 수 있다. 또한, 유사체는 그 자체로 공지된 펩티드 합성을 위한 기법, 예컨대 본원에 언급된 기법을 사용하여 관련 아미노산 서열의 화학적 합성을 사용하여 제공될 수 있다.
이와 관련하여, 또한 본 발명의 NB 작용제 (그의 유사체 포함)는 본 발명의 NB 작용제의 서열을 제공하도록 및/또는 이렇게 얻어진 서열에 NB 작용제의 유리한 특성을 부여하도록 인간 VH 서열 (즉, 아미노산 서열 또는 상응하는 뉴클레오티드 서열), 예컨대 인간 VH3 서열, 예컨대 DP-47, DP-51 또는 DP-29로부터 출발하여, 하나 이상의 낙타화 치환을 도입함으로써 (즉, 상기 인간 VH 도메인의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 VHH 도메인 내의 상응하는 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 변경함으로써) 설계 및/또는 제조될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 다시, 이것은 일반적으로 인간 VH 도메인에 대한 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오티드 서열을 출발점으로서 사용하여 다양한 방법 및 선행 문단에서 언급된 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
여기서 언급되는 바와 같이, 본 발명의 NB 작용제 (그의 유사체 포함)는 본 발명의 NB 작용제의 서열을 제공하도록 및/또는 이렇게 얻어진 서열에 NB 작용제의 유리한 특성을 부여하도록 인간 VH 서열 (즉, 아미노산 서열 또는 상응하는 뉴클레오티드 서열), 예컨대 인간 VH3 서열, 예컨대 DP-47, DP-51 또는 DP-29로부터 출발하여, 하나 이상의 낙타화 치환을 도입함으로써 (즉, 상기 인간 VH 도메인의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 VHH 도메인 내의 상응하는 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 변경함으로써) 설계 및/또는 제조될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 다시, 이것은 일반적으로 인간 VH 도메인에 대한 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오티드 서열을 출발점으로서 사용하여 다양한 방법 및 선행 문단에서 언급된 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
일부 비-제한적인 낙타화 치환은 WO 2008/020079로부터 유래될 수 있다. 하나 이상의 홀마크 잔기에서의 낙타화 치환은 일반적으로 하나 이상의 다른 아미노산 위치에서의 치환보다 목적하는 특성에 대한 더 큰 영향을 가짐이 명백할 것이지만, 그 둘 및 임의의 그의 적합한 조합은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 이미 적어도 몇몇의 목적하는 특성을 부여하는 하나 이상의 낙타화 치환을 부여한 후, 상기 특성을 추가로 개선하고/하거나 추가의 유리한 특성을 부여하는 추가의 낙타화 치환을 도입하는 것이 가능하다. 다시, 당업자는 일반적으로 본원의 개시내용을 기초로 하고, 예를 들어 제한된 수의 가능한 낙타화 치환을 도입하고 NB 작용제의 유리한 특성이 얻어지거나 개선되는지 (즉, 원래의 VH 도메인에 비해)를 결정하는 것을 수반할 수 있는 임의로 제한된 정도의 통상적인 실험 후에 적합한 낙타화 치환 또는 낙타화 치환의 적합한 조합을 결정하고 선택할 수 있을 것이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 상기 낙타화 치환은 생성되는 아미노산 서열이 적어도 (a) 위치 108에 Q; 및/또는 (b) 위치 45에 하전 아미노산 또는 시스테인 잔기 및 바람직하게는 또한 위치 44에 E, 보다 바람직하게는 위치 44에 E 및 위치 45에 R; 및/또는 (c) 위치 103에 P, R 또는 S; 및 임의로 하나 이상의 추가의 낙타화 치환을 함유하도록 하는 것이다. 하나의 비제한적인 측면에서, 낙타화 치환은 본 발명의 NB 작용제 및/또는 그의 유사체, 예컨대 인간화 유사체 및/또는 바람직하게는 선행 문단에서 제시된 바와 같은 유사체를 생성하는 것이다.
본원의 개시내용으로부터 또한 명백할 것인 바, 또한 본원에 제공된 바와 같은 본 발명의 NB 작용제의 일부 또는 단편, 또는 2개 이상의 일부 또는 단편의 조합, 및 특히 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 및 서열 96-99의 NB 작용제의 일부 또는 단편의 사용도 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면에 따르면, 용어 "본 발명의 NB 작용제"는 그의 가장 넓은 의미에서 또한 상기 일부 또는 단편을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 NB 작용제 (그의 유사체 포함)의 상기 일부 또는 단편은 본 발명의 상응하는 전장 NB 작용제 (또는 그의 유사체)의 아미노산 서열에 비해 N-말단부에서의 하나 이상의 아미노산 잔기, C-말단부에서의 하나 이상의 아미노산 잔기, 하나 이상의 연속적인 내부 아미노산 잔기, 또는 이들의 임의의 조합이 결실 및/또는 제거된 아미노산 서열을 갖는다.
상기 일부 또는 단편은 바람직하게는 본 발명의 NB 작용제에 대해 본원에 제공되는 바와 같은 친화도 (KD-값 (실제 또는 겉보기), KA-값 (실제 또는 겉보기), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 별법으로 본원에서 추가로 설명되는 IC50 값으로서 적합하게 측정된 및/또는 표현된)로 DR5, 예를 들어, 인간 DR5에 결합할 수 있는 것이다.
임의의 일부 또는 단편은 바람직하게는 본 발명의 상응하는 전장 NB 작용제의 아미노산 서열의 적어도 10개의 연속적인 아미노산 잔기, 바람직하게는 적어도 20개의 연속적인 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 적어도 30개의 연속적인 아미노산 잔기, 예컨대 적어도 40개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 것이다.
또한, 임의의 일부 또는 단편은 바람직하게는 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 중의 적어도 하나 또는 적어도 그의 일부 (특히 적어도 CDR3 또는 적어도 그의 일부)를 포함하는 것이다. 보다 바람직하게는, 임의의 일부 또는 단편은 바람직하게는 적합한 프레임워크 서열(들) 또는 적어도 그의 일부에 의해 연결된 적어도 하나의 CDR (및 바람직하게는 적어도 CDR3 또는 그의 일부) 및 적어도 하나의 다른 CDR (즉, CDR1 또는 CDR2) 또는 적어도 그의 일부를 포함하는 것이다. 보다 바람직하게는, 임의의 일부 또는 단편은 다시 바람직하게는 적합한 프레임워크 서열(들) 또는 적어도 그의 일부에 의해 연결된 적어도 하나의 CDR (바람직하게는 적어도 CDR3 또는 그의 일부) 및 나머지 2개의 CDR의 적어도 일부를 포함하는 것이다.
또 다른 특히 바람직하지만 비제한적인 측면에 따르면, 그러한 일부 또는 단편은 예를 들어 국제 특허 출원 WO 03/050531 (Lasters et al.)에 기재된 바와 같은 본 발명의 상응하는 전장 NB 작용제의 적어도 CDR3, 예컨대 FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다.
본원에 이미 언급한 바와 같이, 본 발명의 NB 작용제의 유사체를 제공하고/하거나 본 발명의 NB 작용제의 추가의 일부 또는 단편을 제공하기 위해서 2개 이상의 상기 일부 또는 단편 (즉, 본 발명의 동일한 또는 상이한 NB 작용제로부터의)을 조합하는 것도 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 NB 작용제의 하나 이상의 일부 또는 단편과 인간 VH 도메인의 하나 이상의 일부 또는 단편을 조합하는 것도 가능하다.
한 측면에 따르면, 일부 또는 단편은 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 NB 작용제 중의 하나에 대해, 및 서열 96-99에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 및/또는 적어도 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과의 서열 동일성 정도를 갖는다.
일부 및 단편, 및 그를 코딩하는 핵산 서열이 제공될 수 있고, 임의로 그 자체로 공지된 임의의 방식으로 조합될 수 있다. 예를 들어, 상기 일부 또는 단편은 정지 코돈을 본 발명의 전장 NB 작용제를 코딩하는 핵산에 삽입한 후, 이렇게 얻어진 핵산을 그 자체로 공지된 방식으로 (예를 들어 본원에 설명되는 바와 같이) 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 별법으로, 상기 일부 또는 단편을 코딩하는 핵산은 본 발명의 전장 NB 작용제를 코딩하는 핵산을 적합하게 제한하거나 또는 상기 핵산을 그 자체로 공지된 방식으로 합성함으로써 얻을 수 있다. 일부 또는 단편은 또한 그 자체로 공지된 펩티드 합성 기법을 이용하여 제공될 수 있다.
본 발명은 그의 가장 넓은 의미에서 또한 본 발명의 NB 작용제의 유도체를 포함한다. 상기 유도체는 일반적으로 본 발명의 NB 작용제의 및/또는 본 발명의 NB 작용제를 형성하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형, 특히 화학적 및/또는 생물학적 (예를 들어 효소적) 변형에 의해 얻을 수 있다.
그러한 변형의 예, 및 상기 방식으로 변형될 수 있는 NB 작용제 서열 내의 아미노산 잔기 (즉, 폴리펩티드 백본 상의, 그러나 바람직하게는 측쇄 상의)의 예, 상기 변형을 도입하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 기법 및 상기 변형의 잠재적인 용도 및 이점은 당업자에게 명백할 것이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 그러한 변형은 하나 이상의 관능기, 잔기 또는 모이어티, 특히 하나 이상의 목적하는 특성 또는 관능성을 본 발명의 NB 작용제에 부여하는 하나 이상의 관능기, 잔기 또는 모이어티의 본 발명의 NB 작용제 내로 또는 상에 도입하는 것 (예를 들어 공유 연결에 의해 또는 다른 적합한 방식으로)을 수반한다. 그러한 관능기의 예는 당업자에게 명백할 것이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 상기 변형은 본 발명의 NB 작용제의 반감기, 용해도 및/또는 흡수를 증가시키고/시키거나, 본 발명의 NB 작용제의 면역원성 및/또는 독성을 감소시키고/시키거나, 본 발명의 NB 작용제의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시키고/시키거나, 본 발명의 NB 작용제 및/또는 폴리펩티드에 다른 유리한 특성을 부여하고/하거나 바람직하지 않은 특성을 감소시키거나; 또는 상기한 것의 2개 이상의 임의의 조합을 수행하는 하나 이상의 관능기의 도입 (예를 들어 공유 결합에 의한 또는 임의의 다른 적합한 방식으로)을 포함한다. 그러한 관능기 및 이를 도입하는 기법의 예는 당업자에게 명백할 것이고, 일반적으로 상기 인용된 일반적인 배경 기술에 언급된 모든 관능기 및 기법, 및 제약 단백질의 변형, 특히 항체 또는 항체 단편 (ScFv 및 단일 도메인 항체 포함)의 변형을 위한 그 자체로 공지된 관능기 및 기법을 포함할 수 있고, 이에 대해서는 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)]을 참조한다. 그러한 관능기는 예를 들어 본 발명의 NB 작용제에 직접 (예를 들어, 공유), 또는 임의로 다시 당업자에게 명백할 바와 같은 적합한 링커 또는 스페이서를 통해 연결될 수 있다.
제약 단백질의 반감기 증가 및/또는 면역원성 감소를 위해 가장 널리 사용되는 기법 중 하나는 적합한 약물학상 허용되는 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 또는 그의 유도체 (예컨대 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 또는 mPEG)의 부착을 포함한다. 일반적으로, 임의의 적합한 형태의 peg화, 예컨대 항체 및 항체 단편 (비제한적으로 (단일) 도메인 항체 및 ScFv 포함)에 대해 당업계에서 사용되는 peg화를 사용할 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002)]; [Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003)], [Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003)] 및 WO 04/060965을 참조한다. 단백질의 peg화를 위한 다양한 시약은 또한 예를 들어 넥타르 테라퓨틱스 (Nektar Therapeutics, 미국)로부터 상업적으로 이용가능하다.
한 실시양태에서, 특히 시스테인-잔기를 통한 부위-지정 peg화가 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)] 참조). 다양한 실시양태에서, 상기 목적을 위해, PEG는 본 발명의 NB 작용제에서 천연 생성되는 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 NB 작용제는 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 적합하게 도입하기 위해 변형될 수 있거나, 또는 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열이 당업자에게 그 자체로 공지된 단백질 조작 기법을 사용하여 본 발명의 NB 작용제의 N- 및/또는 C-말단에 융합될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 NB 작용제 및 단백질에 대해, 분자량이 5000 초과, 예컨대 10,000 초과 및 200,000 미만, 예컨대 100,000 미만, 예를 들어 20,000-80,000 범위인 PEG가 사용된다.
한 실시양태에서, 변형은 대체로 본 발명의 NB 작용제 또는 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용된 숙주 세포에 따라 동시-번역 및/또는 번역후 변형의 일부로서 N-연결 또는 O-연결 글리코실화를 포함한다.
한 실시양태에서, 변형은 표지된 NB 작용제의 의도된 용도에 따라 하나 이상의 검출가능한 표지 또는 다른 신호-생성 기 또는 모이어티의 도입을 포함할 수 있다. 이들을 부착, 사용 및 검출하기 위한 적합한 표지 및 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어, 형광 표지, 인광 표지, 화학발광 표지, 생물발광 표지, 방사성-동위원소, 금속, 금속 킬레이트, 금속성 양이온, 발색단 및 효소, 예컨대 WO 08/020079의 페이지 109에 언급된 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 다른 적합한 표지는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 NMR 또는 ESR 분광법을 이용하여 검출할 수 있는 모이어티를 포함한다.
본 발명의 상기 표지된 NB 작용제 및 폴리펩티드는 예를 들어 특정 표지의 선택에 따라 시험관내, 생체내 또는 계내 (in situ) 검정 (그 자체로 공지된 면역검정, 예컨대 ELISA, RIA, EIA 및 다른 "샌드위치 검정" 등 포함) 및 생체내 진단 및 영상화 목적을 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 변형은 예를 들어 상기한 금속 또는 금속성 양이온 중의 하나를 킬레이트화하기 위한 킬레이트화 기의 도입을 수반할 수 있다. 적합한 킬레이팅 기는 예를 들어 비제한적으로, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 포함한다.
한 실시양태에서, 변형은 특이적 결합쌍, 예컨대 비오틴-(스트렙트)아비딘 결합쌍의 한 부분인 관능기의 도입을 포함할 수 있다. 그러한 관능기는 본 발명의 NB 작용제를 결합쌍의 형성을 통해 결합쌍의 다른 절반에 결합되는 또 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 화학적 화합물에 연결하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 NB 작용제는 비오틴에 접합되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합된 또 다른 단백질, 폴리펩티드, 화합물에 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 접합된 NB 작용제는 예를 들어 검출가능한 신호-생산제가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합된 진단 시스템에서 리포터로서 사용될 수 있다. 그러한 결합쌍은 예를 들어 또한 제약 목적에 적합한 담체를 비롯한 담체에 본 발명의 NB 작용제를 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 하나의 비제한적인 예는 문헌 [Cao and Suresh, Journal of Drug Targeting, 8, 4, 257 (2000)]에 기재된 리포솜 제형이다. 상기 결합쌍은 또한 치료 활성제를 본 발명의 NB 작용제에 연결하기 위해 사용될 수 있다.
일부 용도를 위해, 특히 본 발명의 NB 작용제가 작용하는 표적을 발현하는 세포를 죽이거나 (예를 들어 암의 치료에서), 또는 그러한 세포의 성장 및/또는 증식을 감소시키거나 느리게 하는 것이 의도되는 용도를 위해, 본 발명의 NB 작용제는 또한 독소에 또는 (세포)독성 잔기 또는 모이어티에 연결될 수 있다. 예를 들어 세포독성 화합물을 제공하기 위해 본 발명의 NB 작용제에 연결될 수 있는 독성 모이어티, 화합물 또는 잔기의 예는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 상기 인용된 관련 참고문헌 및/또는 본원의 추가의 설명에서 볼 수 있다. 한 예는 WO 03/055527에 기재된 소위 ADEPT™ 기술이다.
다른 잠재적인 화학적 및 효소적 변형은 당업자에게 명백할 것이고, 본 발명의 범위 내에 있다. 그러한 변형은 또한 연구 목적을 위해 도입될 수 있다 (예를 들어 기능-활성 관계를 연구하기 위해). 예를 들어, 문헌 [Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997)]을 참조한다.
하나의 비제한적인 측면에서, 유도체는 본 발명의 NB 작용제에 대해 본원에 제공된 바와 같은 친화도 (KD-값 (실제 또는 겉보기), KA-값 (실제 또는 겉보기), Kon-속도 및/또는 koff-속도로서, 또는 별법으로 본원에서 추가로 설명되는 IC50 값으로서 적합하게 측정된 및/또는 표현된)로 DR5, 예를 들어, 인간 DR5에 결합할 수 있는 것이다.
본원에 언급될 때, 본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 NB 작용제로 본질적으로 이루어지거나 이를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. "~로 본질적으로 이루어지는"은 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열이 본 발명의 NB 작용제의 아미노산 서열과 정확히 동일하거나 또는 NB 작용제의 아미노산 서열의 아미노 말단부에, 카르복시 말단부에, 또는 아미노 말단부 및 카르복시 말단부 모두에 부가된 제한된 수의 아미노산 잔기, 예컨대 1-20개의 아미노산 잔기, 예를 들어, 1-10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1-6개의 아미노산 잔기, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 잔기를 갖는 본 발명의 NB 작용제의 아미노산 서열에 상응함을 의미한다.
상기 아미노산 잔기는 NB 작용제의 (생물학적) 특성을 변화시키거나, 변경하거나 또는 평가가능하게 영향을 줄 수 있거나 주지 않을 수 있고, 추가의 관능성을 NB 작용제에 부가하거나 부가하지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 아미노산 잔기는
a) 예를 들어 이종성 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현의 결과로서 N-말단 Met 잔기를 포함할 수 있거나;
b) 합성시에 숙주 세포로부터 NB 작용제의 분비를 지시하는 신호 서열 또는 리더 서열을 형성할 수 있거나 (적합한 분비 리더 펩티드는 당업자에게 명백할 것이고, 본원에 추가로 설명되는 바와 같을 수 있다. 대체로, 그러한 리더 서열은 NB 작용제의 N-말단에 연결될 것이지만, 본 발명은 그의 가장 넓은 의미에서 그에 제한되지 않는다);
c) NB 작용제가 세포의 특정 장기, 조직, 세포, 또는 일부 또는 구획 (compartment)을 향하고/하거나 그 내부로 투과 또는 도입되도록 허용하고/하거나, NB 작용제가 생물학적 장벽, 예컨대 세포막, 세포층, 예컨대 상피 세포의 층, 고형 종양을 포함한 종양, 또는 혈액-뇌-장벽을 투과하거나 가로지르도록 허용하는 서열 또는 신호를 형성할 수 있거나 (그러한 아미노산 서열의 예는 당업자에게 명백할 것이고, WO 08/020079의 페이지 112 상의 문단 c)에 언급된 것을 포함한다);
d) "태그", 예를 들어 그 아미노산 서열 또는 잔기에 대한 친화도 기법을 사용하여 NB 작용제의 정제를 허용하거나 용이하게 하는 아미노산 서열 또는 잔기를 형성할 수 있거나 (이후에, 상기 서열 또는 잔기는 NB 작용제 서열을 제공하도록 제거될 수 있다 (예를 들어 화학적 또는 효소적 절단에 의해) (상기 목적을 위해, 태그는 임의로 절단가능 링커 서열을 통해 NB 작용제 서열에 연결되거나 절단가능 모티프를 함유할 수 있다). 상기 잔기의 일부 비-제한적인 예는 하나 이상의 각각의 cMyc 태그 (서열 91), 다수의 히스티딘 잔기, 예컨대 Hisx6 태그 (서열 92), 또는 cMyc 태그와 Hisx6 태그의 조합 (서열 93 또는 서열 94), PEG화 기질 태그 (서열 95), 글루타티온 잔기 및 다른 myc-태그 (예를 들어, WO 06/12282의 서열 31 참조)이다); 또는
e) 관능화된 및/또는 관능기의 부착을 위한 부위로서 기능할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기일 수 있다 (적합한 아미노산 잔기 및 관능기는 당업자에게 명백할 것이고, 본 발명의 NB 작용제의 유도체에 대해 본원에서 언급된 아미노산 잔기 및 관능기를 포함하지만 그로 제한되지 않는다).
한 측면에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 본 발명의 NB 작용제 및 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공하도록 그의 아미노 말단부에서, 그의 카르복시 말단부에서, 또는 그의 아미노 말단부 및 그의 카르복시 말단부 모두에서 적어도 하나의 추가의 아미노산 서열에 융합된 본 발명의 NB 작용제를 포함한다. 그러한 융합체를 본원에서 "NB 작용제 융합체"로서 칭한다.
하나 이상의 추가의 아미노산 서열은 임의의 적합한 및/또는 목적하는 아미노산 서열일 수 있다. 추가의 아미노산 서열은 NB 작용제의 (생물학적) 특성을 변화시키거나, 변경하거나 또는 영향을 줄 수 있거나 주지 않을 수 있고, 추가의 관능성을 본 발명의 NB 작용제 또는 폴리펩티드에 부가하거나 부가하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 추가의 아미노산 서열은 하나 이상의 목적하는 특성 또는 관능성을 본 발명의 NB 작용제 또는 폴리펩티드에 부여하는 것이다.
예를 들어, 추가의 아미노산 서열은 또한 임의의 목적하는 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정기 또는 에피토프 (비제한적으로 본 발명의 NB 작용제가 작용하는 것과 동일한 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정기 또는 에피토프, 또는 상이한 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정기 또는 에피토프 포함)에 대해 작용할 수 있는 제2 결합 부위를 제공할 수 있다.
그러한 아미노산 서열의 예는 당업자에게 명백할 것이고, 일반적으로 통상적인 항체 및 그의 단편 (비제한적으로 ScFv 및 단일 도메인 항체 포함)을 기초로 하여 펩티드 융합에 사용되는 모든 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005)]의 검토를 참조한다.
하나의 비제한적인 측면에서, 그러한 아미노산 서열은 본 발명의 NB 작용제 자체에 비해 본 발명의 폴리펩티드의 반감기, 용해도 또는 흡수를 증가시키고/시키거나, 면역원성 또는 독성을 감소시키고/시키거나, 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시키고/시키거나, 다른 유리한 특성을 부여하고/하거나 바람직하지 않은 특성을 감소시키는 아미노산 서열이다. 상기 아미노산 서열의 일부 비-제한적인 예는 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 (예를 들어, WO 00/27435 참조) 또는 합텐 분자 (예를 들어 순환 항체에 의해 인식되는 합텐, 예를 들어, WO 98/22141 참조)이다.
특히, 반감기를 증가시키기 위해 이뮤노글로불린의 단편 (예컨대 VH 도메인)을 혈청 알부민에 또는 그의 단편에 연결하는 것을 이용할 수 있음은 관련 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, WO 00/27435 및 WO 01/077137을 참조한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 NB 작용제는 바람직하게는 혈청 알부민에 (또는 그의 적합한 단편에) 직접 연결되거나 또는 적합한 링커를 통해, 특히 본 발명의 폴리펩티드가 유전자 융합체 (단백질)로서 발현될 수 있도록 연결된 적합한 펩티드를 통해 연결된다. 하나의 구체적인 측면에 따르면, 본 발명의 NB 작용제는 혈청 알부민의 도메인 III 또는 그의 일부를 적어도 포함하는 혈청 알부민의 단편에 연결될 수 있다. 예를 들어, WO 07/112940 (애블링스 엔.브이.)를 참조한다.
별법으로, 추가의 아미노산 서열은 증가된 혈청내 반감기를 제공하도록 혈청 단백질 (예컨대, 인간 혈청 알부민 또는 또 다른 혈청 단백질, 예컨대 IgG)에 대해 작용하는 제2 결합 부위 또는 결합 단위를 제공할 수 있다. 상기 아미노산 서열은 예를 들어 아래에서 설명되는 NB 작용제, 및 WO 91/01743, WO 01/45746 및 WO 02/076489에 기재된 작은 펩티드 및 결합 단백질 및 WO 03/002609 및 WO 04/003019에 기재된 dAb를 포함한다. 또한, 문헌 [Harmsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42, 2005], 및 EP 0 368 684, 및 WO 2006/122787, WO 2008/028977, WO 2008/043821, WO 2008/068280 및 WO 2009/127691 (애블링스 엔.브이.)을 참조한다
상기 아미노산 서열은 특히 혈청 알부민 (보다 특히 인간 혈청 알부민)에 대해 및/또는 IgG (보다 특히 인간 IgG)에 대해 작용할 수 있다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열은 (인간) 혈청 알부민에 대해 작용하는 아미노산 서열 및 FcRn에 대한 혈청 알부민의 결합에 관여하지 않는 (인간) 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 아미노산 서열 (예를 들어, WO 06/0122787 참조) 및/또는 혈청 알부민의 도메인 III의 일부를 형성하지 않는 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 아미노산 서열 (다시 예를 들어, WO 06/0122787 참조); 증가된 반감기를 갖거나 제공할 수 있는 아미노산 서열 (예를 들어, WO 08/028977 (애블링스 엔.브이.) 참조); 포유동물의 적어도 하나의 종, 특히 영장류의 적어도 하나의 종 (예컨대, 비제한적으로, 마카카 속의 원숭이 (예컨대, 및 특히, "사이노" (마카카 파시쿨라리스)로도 알려진 사이노몰거스 원숭이 및/또는 붉은털 원숭이 (마카카 물라타)) 및 개코원숭이 (파피오 우르시누스), 미국 특허 가출원 60/843,349를 다시 참조한다)으로부터의 혈청 알부민과 교차반응성인 인간 혈청 알부민에 대한 아미노산 서열; pH 의존 방식으로 혈청 알부민에 결합할 수 있는 아미노산 서열 (예를 들어, 애블링스 엔.브이.의 미국 특허 가출원 60/850,774 (발명의 명칭: "Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and uses thereof" (2006년 10월 11일 출원) 참조) 및/또는 조건부 결합제인 아미노산 서열 (예를 들어, 애블링스 엔.브이.의 미국 특허 가출원 60/850,775, 발명의 명칭 "Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner" (2006년 10월 11일 출원 참조) 및 WO 2006/122787, WO 2008/028977, WO 2008/043821, WO 2008/068280 및 WO 2009/127691 참조)일 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 하나 이상의 추가의 아미노산 서열은 통상적인 4-사슬 항체 (특히 인간 항체)의 및/또는 중쇄 항체의 하나 이상의 일부, 단편 또는 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대체로 덜 바람직하지만, 본 발명의 NB 작용제는 다시 임의로 링커 서열을 통해 (비제한적으로 다른 (단일) 도메인 항체, 예컨대 문헌 [Ward et al.]에 기재된 dAb 포함), 통상적인 (바람직하게는 인간) VH 또는 VL 도메인에 또는 VH 또는 VL 도메인의 천연 또는 합성 유사체에 연결될 수 있다.
적어도 하나의 NB 작용제는 임의로 링커 서열을 통해 하나 이상의 (바람직하게는 인간) CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결될 수 있다. 예를 들어, 적합한 CH1 도메인에 연결된 NB 작용제는 통상적인 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편에 유사하지만 통상적인 VH 도메인의 하나 또는 (F(ab')2 단편의 경우에) 하나 또는 둘 모두가 본 발명의 NB 작용제로 교체된 항체 단편/구조를 생성하기 위해 적합한 경쇄와 함께 사용할 수 있다. 또한, 2개의 NB 작용제는 증가된 생체내 반감기를 갖는 구축물을 제공하기 위해 CH3 도메인 (임의로 링커를 통해)에 연결될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 하나 이상의 본 발명의 NB 작용제는 본 발명의 폴리펩티드에 하나 이상의 효과기 기능을 부여하고/하거나 하나 이상의 Fc 수용체에 결합하는 능력을 부여할 수 있는 하나 이상의 항체 일부, 단편 또는 도메인에 연결된다. 예를 들어, 상기 목적을 위해 및 그로 제한되지 않으면서, 하나 이상의 추가의 아미노산 서열은 항체, 예컨대 중쇄 항체 (본원에 설명되는 바와 같이), 보다 바람직하게는 통상적인 인간 4-사슬 항체로부터의 하나 이상의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있고/있거나; 예를 들어 IgG, IgE로부터의 또는 또 다른 인간 Ig로부터의 Fc 영역 (의 일부)를 형성할 수 있다. 예를 들어, WO 94/04678에는 낙타류 VHH 도메인 또는 그의 인간화 유도체를 포함하는 중쇄 항체가 기재되어 있고, 여기서 낙타과 CH2 및/또는 CH3 도메인은 각각 VHH 및 인간 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 (CH1 도메인 미함유)로 이루어지는 이뮤노글로불린을 제공하도록 인간 CH2 및 CH3 도메인으로 교체되었고, 상기 이뮤노글로불린은 CH2 및 CH3 도메인에 의해 제공된 효과기 기능을 갖고, 이뮤노글로불린은 임의의 경쇄의 존재 없이도 기능할 수 있다. 효과기 기능을 제공하도록 본 발명의 NB 작용제에 적합하게 연결될 수 있는 다른 아미노산 서열은 당업자에게 명백할 것이고, 목적하는 효과기 기능(들)을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, WO 04/058820, WO 99/42077 및 WO 05/017148, 및 문헌 [Holliger and Hudson, 상기 문헌]의 검토를 참조한다. 본 발명의 NB 작용제의 Fc 부분에 대한 연결은 또한 본 발명의 대응하는 NB 작용제에 비해 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 용도를 위해, 임의의 생물학상 유의한 효과기 기능 없이 증가된 반감기를 부여하는 Fc 부분 및/또는 불변 도메인 (즉, CH2 및/또는 CH3 도메인)의 사용도 적합하거나 또는 심지어 바람직할 수 있다. 증가된 생체내 반감기를 갖는 하나 이상의 NB 작용제 및 하나 이상의 불변 도메인을 포함하는 다른 적합한 구축물은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 임의로 링커 서열을 통해 CH3 도메인에 연결된 2개의 NB 작용제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 반감기가 증가된 임의의 융합 단백질 또는 유도체의 분자량은 바람직하게는 신장 흡수를 위한 컷-오프 (cut-off) 값인 50 kD 초과이다.
추가의 아미노산 서열은 또한 합성시에 숙주 세포로부터 본 발명의 NB 작용제 또는 폴리펩티드의 분비를 지시하는 신호 서열 또는 리더 서열을 형성할 수 있다 (예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위해 사용된 숙주 세포에 따라 본 발명의 폴리펩티드의 프리-, 프로- 또는 프리프로-형태를 제공하기 위해).
한 측면에서, 추가의 아미노산 서열은 본 발명의 NB 작용제 또는 폴리펩티드가 세포의 특정 장기, 조직, 세포, 또는 일부 또는 구획을 향하고/하거나 그 내부로 투과 또는 도입되도록 허용하고/하거나, 본 발명의 NB 작용제 또는 폴리펩티드가 생물학적 장벽, 예컨대 세포막, 세포층, 예컨대 상피 세포의 층, 고형 종양을 포함한 종양, 또는 혈액-뇌-장벽을 투과하거나 가로지르도록 허용하는 서열 또는 신호를 형성한다. 그러한 아미노산 서열의 적합한 예는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어, WO 08/020079의 페이지 118에 언급된 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 용도를 위해, 특히 본 발명의 NB 작용제가 작용하는 표적을 발현하는 세포를 죽이거나 (예를 들어 암의 치료에서), 또는 그러한 세포의 성장 및/또는 증식을 감소시키거나 느리게 하는 것이 의도되는 용도를 위해, 본 발명의 NB 작용제는 또한 (세포)독성 단백질 또는 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 세포독성 폴리펩티드를 제공하기 위해 본 발명의 NB 작용제에 연결될 수 있는 상기 독성 단백질 및 폴리펩티드의 예는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 본원에 인용된 관련 참고문헌 및/또는 본원의 추가의 설명에서 볼 수 있다. 한 예는 WO 03/055527에 기재된 소위 ADEPT™ 기술이다.
하나의 비제한적인 측면에서, 상기 하나 이상의 추가의 아미노산 서열은 적어도 2개, 예컨대 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 NB 작용제를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 제공하도록 적어도 하나의 추가의 NB 작용제를 포함하고, 여기서 상기 NB 작용제는 임의로 하나 이상의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 예를 들어 WO 08/020079의 페이지 119 및 120에 기재된 바와 같은 1 또는 2개 또는 그 초과의 VHH 구축물, 및 본 발명의 적어도 하나의 NB 작용제를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드도 본원에서 "다가" 폴리펩티드로서 언급될 것이고, 상기 폴리펩티드에 존재하는 NB 작용제(들)도 본원에서 "다가 포맷"으로 존재하는 것으로 언급될 것이다.
적어도 하나의 NB 작용제는 제1 항원 (즉, DR5)에 대해 작용하고 적어도 하나의 NB 작용제는 제2 항원 (즉, DR5와 상이함)에 대해 작용하는 적어도 2개의 NB 작용제를 함유하는 폴리펩티드도 본 발명의 "다중특이적" 폴리펩티드로서 언급될 것이고, 상기 폴리펩티드에 존재하는 NB 작용제도 본원에서 "다중특이적 포맷"으로 존재하는 것으로 언급될 것이다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 "이중특이적" 폴리펩티드는 제1 항원 (즉, DR5)에 대해 작용하는 적어도 하나의 NB 작용제, 보다 바람직하게는 DR5에 대해 작용하는 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 NB 작용제 및 제2 항원 (즉, DR5와 상이함)에 대해 작용하는 적어도 하나의 추가의 NB 작용제를 포함하는 폴리펩티드이고, 본 발명의 "삼중특이적" 폴리펩티드는 제1 항원 (즉, DR5의 하나의 에피토프)에 대해 작용하는 적어도 하나의 NB 작용제, 제2 항원 (즉, DR5로부터의 에피토프 또는 TRAIIL-수용체와 상이한 항원)에 대해 작용하는 적어도 하나의 추가의 NB 작용제 및 제3 항원 (즉, DR5 및 제2 항원 둘 모두와 상이함)에 대해 작용하는 적어도 하나의 추가의 NB 작용제를 포함하는 폴리펩티드 등이다.
따라서, 그의 가장 단순한 형태에서, 본 발명의 이중특이적 폴리펩티드는 DR5에 대해 작용하는 제1 NB 작용제, 및 제2 항원에 대해 작용하는 제2 NB 작용제를 포함하는 본 발명의 2가 폴리펩티드이고, 여기서 상기 제1 및 제2 NB 작용제는 임의로 링커 서열을 통해 연결될 수 있고; 본 발명의 삼중특이적 폴리펩티드는 그의 가장 단순한 형태에서 DR5에 대해 작용하는 제1 NB 작용제, 제2 항원에 대해 작용하는 제2 NB 작용제 및 제3 항원에 대해 작용하는 제3 NB 작용제를 포함하는 본 발명의 3가 폴리펩티드이고, 여기서 상기 제1, 제2 및 제3 NB 작용제는 임의로 하나 이상 및 특히 1개 이상, 특히 2개의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다.
본원의 설명으로부터 명백할 것인 바, 본 발명은 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드가 DR5에 대한 적어도 하나 이상의 NB 작용제, 및 DR5와 상이한 하나 이상의 항원에 대해 작용하는 임의의 수의 NB 작용제를 포함할 수 있다는 의미에서 상기 내용으로 제한되지 않는다.
본 발명의 특이적인 다가 또는 다중특이적 폴리펩티드를 언급할 때, 이것은 명시적으로 달리 나타내지 않으면, 관련 NB 작용제의 임의의 순서 또는 배열을 포함함을 유의하여야 한다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드가 2개 이상의 NB 작용제 및 하나 이상의 추가의 아미노산 서열 (본원에 언급된 바와 같은)을 포함하는 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
하나 이상의 VHH 도메인을 함유하는 다가 및 다중특이적 폴리펩티드 및 그의 제제에 대해서는, 문헌 [Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001]; [Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302]; 및 예를 들어, WO 96/34103 및 WO 99/23221을 또한 참조한다. 본 발명의 몇몇의 특이적인 다중특이적 및/또는 다가 폴리펩티드의 몇몇의 다른 예는 본원에서 언급되는 애블링스 엔.브이.의 출원에서 볼 수 있다.
본 발명의 다중특이적 폴리펩티드의 하나의 비제한적인 예는 본 발명의 적어도 하나의 NB 작용제 및 증가된 반감기를 제공하는 적어도 하나의 NB 작용제를 포함한다. 그러한 NB 작용제는 예를 들어 혈청 단백질, 및 특히 인간 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 티록신-결합 단백질 (인간) 트랜스페린, 피브리노겐, 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG, IgE 또는 IgM, 또는 WO 04/003019에 나열된 혈청 단백질 중의 하나에 대해 작용하는 NB 작용제일 수 있다. 이들 중에서, 혈청 알부민 (특히 인간 혈청 알부민) 또는 IgG (특히 인간 IgG, 예를 들어, 문헌 [Muyldermans, 상기 문헌]에 기재된 나노바디™ VH-1을 참조한다)에 결합할 수 있는 NB 작용제가 특히 바람직하다 (하지만, 예를 들어, 마우스 또는 영장류에서의 실험을 위해, 각각 마우스 혈청 알부민 (MSA) 또는 상기 영장류로부터의 혈청 알부민에 대한 또는 이들과 교차반응성인 NB 작용제가 사용될 수 있다. 그러나, 제약 용도를 위해, 인간 혈청 알부민 또는 인간 IgG에 대한 NB 작용제가 대체로 바람직할 것이다). 증가된 반감기를 제공하고 본 발명의 폴리펩티드에 사용될 수 있는 NB 작용제는 WO 04/041865, WO 06/122787 및 애블링스 엔.브이.의 추가의 특허 출원, 예컨대 본원에 언급된 것에 기재된 혈청 알부민에 대해 작용하는 NB 작용제를 포함한다.
예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위해 증가된 반감기를 제공하는 몇몇의 바람직한 NB 작용제는 FcRn에 대한 혈청 알부민의 결합에 관여하지 않는 (인간) 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 나노바디즈™ (예를 들어, WO 06/0122787 참조); 혈청 알부민의 도메인 III의 일부를 형성하지 않는 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 나노바디즈™ (예를 들어, WO 06/0122787 참조); 증가된 반감기를 갖거나 제공할 수 있는 나노바디즈™ (예를 들어, 본원에 언급된 미국 특허 가출원 60/843,349 (애블링스 엔.브이.) 참조); 포유동물의 적어도 하나의 종, 특히 영장류의 적어도 하나의 종 (예컨대, 비제한적으로, 마카카 속의 원숭이 (예컨대, 및 특히, 사이노몰거스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) 및/또는 붉은털 원숭이 (마카카 물라타)) 및 개코원숭이 (파피오 우르시누스))로부터의 혈청 알부민과 교차반응성인 인간 혈청 알부민에 대한 나노바디즈™ (예를 들어, 미국 특허 가출원 60/843,349 (애블링스 엔.브이.) 참조); pH 비의존 방식으로 혈청 알부민에 결합할 수 있는 나노바디즈™ (예를 들어, 본원에 언급된 미국 특허 가출원 60/850,774 (애블링스 엔.브이.) 참조) 및/또는 조건부 결합제인 나노바디즈™ (예를 들어, 미국 특허 가출원 60/850,775 (애블링스 엔.브이.) 참조)를 포함한다.
증가된 반감기를 제공하고 본 발명의 폴리펩티드에 사용될 수 있는 몇몇의 특히 바람직한 나노바디즈™는 WO 06/122787 (표 II 및 III 참조)에 개시된 나노바디즈™ ALB-1 내지 ALB-10을 포함하고, 이 중에서 ALB-8 (WO 06/122787의 서열 62)이 특히 바람직하다.
본 발명의 구체적이지만 비제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 본 발명의 NB 작용제 이외에, 인간 혈청 알부민에 대한 적어도 하나의 NB 작용제를 함유한다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 NB 작용제를 함유하는 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 임의의 폴리펩티드, 및 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 NB 작용제의 또는 상기 폴리펩티드의 임의의 유도체는 본 발명의 상응하는 NB 작용제 자체의 반감기보다 적어도 1.5배, 및/또는 적어도 2배, 및/또는 적어도 5배, 예를 들어, 적어도 10배 또는 20배 초과로 더 큰 반감기를 갖는다. 예를 들어, 증가된 반감기를 갖는 그러한 유도체 또는 폴리펩티드는 본 발명의 대응하는 NB 작용제 자체에 비해 1시간 초과, 및/또는 2시간 초과, 및/또는 6시간 초과, 예컨대 12시간 초과, 또는 심지어 24, 48 또는 72시간 초과로 증가된 반감기를 갖는다.
본 발명의 하나의 비제한적인 측면에서, 그러한 유도체 또는 폴리펩티드는 인간에서 적어도 약 12시간, 및/또는 적어도 24시간, 및/또는 적어도 48시간, 및/또는 적어도 72시간 또는 그 초과의 혈청 반감기를 보인다. 예를 들어, 상기 유도체 또는 폴리펩티드는 적어도 5일 (예컨대 약 5 내지 10일), 및/또는 적어도 9일 (예컨대 약 9 내지 14일), 및/또는 적어도 약 10일 (예컨대 약 10 내지 15일), 및/또는 적어도 약 11일 (예컨대 약 11 내지 16일), 및/또는 적어도 약 12일 (예컨대 약 12 내지 18일 또는 그 초과), 및/또는 14일 초과 (예컨대 약 14 내지 19일)의 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 그러한 폴리펩티드는 생체 내에서 폴리펩티드의 반감기를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다.
본 발명의 그러한 폴리펩티드는 생체 내에서 안정화되고, 그의 반감기는 분해 및/또는 청소 또는 제거에 저항하는 분자에 대한 결합에 의해 증가한다. 일반적으로, 그러한 분자는 자체가 생체 내에서 긴 반감기를 갖는 천연 발생 단백질이다.
본 발명의 다중특이적 폴리펩티드의 또 다른 비-제한적인 예는 본 발명의 적어도 하나의 NB 작용제, 및 본 발명의 폴리펩티드가 세포의 특정 장기, 조직, 세포, 또는 일부 또는 구획을 향하도록 지시하고/하거나 그 내부로 투과 또는 도입되도록 허용하고/하거나, NB 작용제가 생물학적 장벽, 예컨대 세포막, 세포층, 예컨대 상피 세포의 층, 고형 종양을 포함한 종양, 또는 혈액-뇌-장벽을 투과하거나 가로지르도록 허용하는 적어도 하나의 NB 작용제를 포함한다. 그러한 NB 작용제의 예는 목적하는 장기, 조직 또는 세포의 특정 세포-표면 단백질, 마커 또는 에피토프 (예를 들어 종양 세포와 연관된 세포-표면 마커)에 대해 작용하는 NB 작용제, 및 WO 02/057445 및 WO 06/040153에 기재된 단일-도메인 뇌 표적화 항체 단편을 포함하고, 그 중 FC44 (WO 06/040153의 서열 189) 및 FC5 (WO 06/040154의 서열 190)가 바람직한 예이다.
링커
본 발명의 폴리펩티드 또는 화합물에서, DR5에 대한 하나 이상의 결합 폴리펩티드, 예컨대 NB 작용제 및 하나 이상의 폴리펩티드는 서로 직접 연결될 수 있고/있거나 (예를 들어, WO 99/23221에 기재된 바와 같이), 하나 이상의 적합한 스페이서 또는 링커, 또는 이들의 임의의 조합을 통해 서로 연결될 수 있다.
다가 및 다중특이적 폴리펩티드에 사용하기 적합한 스페이서 또는 링커는 당업자에게 명백할 것이고, 일반적으로 아미노산 서열을 연결하기 위해 당업계에서 사용되는 임의의 링커 또는 스페이서일 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커 또는 스페이서는 제약 용도를 위해 의도되는 단백질 또는 폴리펩티드의 제작에 사용하기 적합하다.
몇몇의 특히 바람직한 스페이서는 항체 단편 또는 항체 도메인을 연결하기 위해서 당업계에서 사용되는 스페이서 및 링커를 포함한다. 이들은 상기 인용된 일반적인 배경 기술에서 언급된 링커, 및, 예를 들어 디아바디 또는 ScFv 단편을 제작하기 위해 당업계에서 사용되는 링커를 포함한다 (그러나, 이와 관련하여, 디아바디 및 ScFv 단편에서, 사용된 링커 서열은 관련 VH 및 VL 도메인이 완전한 항원 결합 부위를 형성하기 위해 함께 회합되도록 하는 길이, 가요성 정도 및 다른 특성을 가져야 하지만, 각각의 NB 작용제는 그 단독으로 완전한 항원 결합 부위를 형성하기 때문에 본 발명의 폴리펩티드에 사용되는 링커의 길이 또는 가요성에 대한 특정 제한은 존재하지 않음을 유의하여야 한다).
예를 들어, 링커는 적합한 아미노산 서열, 특히 1 내지 50개, 예를 들어, 5 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 35개, 예컨대 1 내지 10개 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 아미노산 서열의 일부 바람직한 예는 예를 들어 WO 99/42077에 기재된 바와 같은 타입 (glyxSery)z의 gly-ser 링커, 예컨대 (예를 들어 (gly4ser)3 또는 (gly3ser2)3 및 본원에 언급된 애블링스의 출원 (예를 들어, WO 06/040153 및 WO 06/122825 참조)에 기재된 GS30, GS15, GS9 및 GS7 링커, 및 힌지-유사 영역, 예컨대 천연 발생 중쇄 항체의 힌지 영역 또는 유사한 서열 (예를 들어, WO 94/04678에 기재된 바와 같은)을 포함한다.
다른 특히 바람직한 일부 링커는 폴리-알라닌 (예컨대 AAA), 및 링커 GS30 (WO 06/122825의 서열 85) 및 GS9 (WO 06/122825의 서열 84)이다.
다른 적합한 링커는 일반적으로 유기 화합물 또는 중합체, 특히 제약 용도를 위한 단백질에 사용하기 적합한 것을 포함한다. 비제한적인 예는 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티, 예를 들어, 예컨대 항체 도메인을 연결하기 위해 사용되는 것을 포함한다. 예를 들어, WO 04/081026을 참조한다.
사용되는 링커(들)의 길이, 가요성 정도 및/또는 다른 특성 (중요하지 않지만, 대체로 ScFv 단편에 사용되는 링커에 대한)이 비제한적으로 DR5에 대한, 또는 하나 이상의 다른 항원에 대한 친화도, 특이성 또는 결합력을 비롯하여 본 발명의 최종 폴리펩티드의 특성에 일부 영향을 가질 수 있음이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본원의 개시내용을 기초로 하여, 당업자는 임의로 일부 제한된 통상적인 실험 후에 본 발명의 특정 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적 링커(들)을 결정할 수 있을 것이다.
한 실시양태에서, 예를 들어 다량체 항원 (예컨대 다량체 수용체 또는 다른 단백질)에 대해 작용하는 NB 작용제를 포함하는 본 발명의 다가 폴리펩티드에서, 링커의 길이 및 가요성은 폴리펩티드에 존재하는 본 발명의 각각의 NB 작용제가 다량체의 각각의 하위단위 상의 항원 결정기에 결합하도록 하는 것일 수 있다. 유사하게, 동일한 항원 상의 2개 이상의 상이한 항원 결정기에 대해 (예를 들어 항원의 상이한 에피토프 및/또는 다량체 수용체, 채널 또는 단백질의 상이한 하위단위에 대해) 작용하는 NB 작용제를 포함하는 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드에서, 링커의 길이 및 가요성은 각각의 NB 작용제가 그의 의도된 항원 결정기에 결합하도록 하는 것일 수 있다. 다시, 본원의 개시내용을 기초로 하여, 당업자는 임의로 일부 제한된 통상적인 실험 후에 본 발명의 특정 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적 링커(들)을 결정할 수 있을 것이다.
사용되는 링커(들)이 하나 이상의 다른 유리한 특성 또는 관능성을 본 발명의 폴리펩티드에 부여하고/하거나 유도체의 형성 및/또는 관능기의 부착을 위한 하나 이상의 부위 (예를 들어 본 발명의 NB 작용제의 유도체에 대해 본원에 설명되는 바와 같은)를 제공하는 것은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 하나 이상의 하전 아미노산 잔기를 함유하는 링커는 개선된 친수성 특성을 제공할 수 있는 반면에, 작은 에피토프 또는 태그를 형성하거나 함유하는 링커는 검출, 확인 및/또는 정제의 목적을 위해 사용될 수 있다. 다시, 본원의 개시내용을 기초로 하여, 당업자는 임의로 일부 제한된 통상적인 실험 후에 본 발명의 특정 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적 링커를 결정할 수 있을 것이다.
마지막으로, 2개 이상의 링커가 본 발명의 폴리펩티드에서 사용될 때, 이들 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 다시, 본원의 개시내용을 기초로 하여, 당업자는 임의로 일부 제한된 통상적인 실험 후에 본 발명의 특정 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적 링커를 결정할 수 있을 것이다.
대체로, 발현 및 생산의 용이성을 위해, 본 발명의 폴리펩티드는 선형 폴리펩티드일 것이다. 그러나, 본 발명은 그의 가장 넓은 의미에서 그로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드가 3개 이상의 NB 작용제를 포함할 때, 3개 이상의 "아암 (arm)"을 갖는 링커를 사용하여 이들을 연결하는 것이 가능하고, 각각의 "아암"은 "별 형상의" 구축물을 제공하도록 NB 작용제에 연결된다. 대체로 덜 바람직하지만, 환상 구축물을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명은 본원에 설명되는 바와 같은 본 발명의 NB 작용제의 유도체에 본질적으로 유사할 수 있는 본 발명의 폴리펩티드의 유도체를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드로 "본질적으로 이루어지는" 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다 (용어 "~로 본질적으로 이루어지는"은 본원에서 상기 지시한 바와 본질적으로 동일한 의미를 갖는다).
본 발명의 하나의 측면에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는 본원에서 규정된 바와 같이 본질적으로 단리된 형태로 존재한다.
본 발명의 NB 작용제의 제조 방법
본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제, 폴리펩티드, 화합물 및 핵산은 본원의 추가의 설명으로부터 당업자에게 명백할 것인 바 그 자체로 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 NB 작용제 및 폴리펩티드는 항체의 제조 및 특히 항체 단편 (비제한적으로 (단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편 포함)의 제조를 위해 그 자체로 공지된 임의의 방식으로 제조될 수 있다. 아미노산 서열, NB 작용제, 폴리펩티드 및 핵산의 제조를 위한 일부 바람직하지만 비-제한적인 방법은 본원에서 설명되는 방법 및 기법을 포함한다.
당업자에게 명백할 것인 바, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 및/또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 하나의 특히 유용한 방법은 일반적으로 다음 단계를 포함한다:
a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 (또한 본원에서 "본 발명의 숙주"로서 칭함)에서의 또는 상기 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (또한 본원에서 "본 발명의 핵산"으로서 칭함)의 또 다른 적합한 발현 시스템에서의 발현, 임의로 이어서
b) 이렇게 얻어진 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드의 단리 및/또는 정제.
특히, 그러한 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
a) 본 발명의 상기 숙주가 적어도 하나의 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 및/또는 폴리펩티드를 발현 및/또는 생산하도록 하는 조건 하에 본 발명의 숙주의 배양 및/또는 유지; 임의로 이어서
b) 이렇게 얻어진 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드의 단리 및/또는 정제.
본 발명의 핵산은 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 NB 작용제는 이중 가닥 DNA의 형태로 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 뉴클레오티드 NB 서열은 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA (예컨대 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현을 위해 특이적으로 변용된 코돈 사용빈도를 갖는 DNA)일 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명의 핵산은 본원에서 규정된 바와 같이 본질적으로 단리된 형태로 존재한다.
본 발명의 핵산은 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드 또는 YAC (다시 본질적으로 단리된 형태일 수 있음)의 형태로 존재하거나, 이들 내에 존재하고/하거나 이들의 일부일 수 있다.
본 발명의 핵산은 본원에 제시된 본 발명의 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열의 정보를 기초로 하여 그 자체로 공지된 방식으로 제조되거나 얻을 수 있고/있거나 적합한 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 유사체를 제공하기 위해, 천연 발생 VHH 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상기 유사체를 코딩하는 본 발명의 핵산을 제공하도록, 예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발에 적용할 수 있다. 당업자에게 명백할 것인 바, NB 작용제를 코딩하는 몇몇 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열 및 예를 들어 하나 이상의 링커를 코딩하는 핵산을 비롯하여 본 발명의 핵산을 제조하기 위해, 그러한 서열은 적합한 방식으로 함께 연결될 수 있다.
본 발명의 핵산의 생성 기법은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 자동화 DNA 합성; 부위-지정 돌연변이 유발; 2개 이상의 천연 발생 및/또는 합성 서열 (또는 2개 이상의 그의 일부)의 조합, 말단절단된 발현 산물의 발현을 유도하는 돌연변이의 도입; 하나 이상의 제한 부위의 도입 (예를 들어 적합한 제한 효소를 사용하여 쉽게 소화 및/또는 라이게이션될 수 있는 카세트 및/또는 영역을 생성하기 위한), 및/또는 하나 이상의 "미스매치된" 프라이머를 사용하고, 예를 들어, 천연 발생 형태의 DR5의 서열을 주형으로 사용하는 PCR 반응에 의한 돌연변이의 도입을 포함할 수 있지만 그로 제한되지 않는다. 이들 및 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 다시 표준 안내서, 예컨대 본원에 언급된 [Sambrook et al.] 및 [Ausubel et al.], 및 아래 실시예를 참조한다.
본 발명의 핵산은 당업자에게 명백할 것인 바 및 예를 들어, WO 08/020079의 페이지 131-134에 기재된 바와 같이 유전자 구축물의 형태로 존재하고/하거나, 유전자 구축물에 존재하고/하거나 그의 일부일 수 있다. 그러한 유전자 구축물은 일반적으로 그 자체로 공지된 유전자 구축물의 하나 이상의 요소, 예를 들어, 하나 이상의 적합한 조절 요소 (예컨대 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 종결인자(들) 등) 및 본원에서 언급되는 유전자 구축물의 추가의 요소에 임의로 연결된 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함하는 그러한 유전자 구축물은 또한 본원에서 "본 발명의 유전자 구축물"로서 칭할 것이다.
본 발명의 유전자 구축물은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 발명의 유전자 구축물은 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 형질전환에 적합한 형태로, 의도된 숙주 세포의 게놈 DNA 내로의 통합에 적합한 형태로 또는 의도된 숙주 유기체 내에서의 독립적인 복제, 유지 및/또는 유전에 적합한 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자 구축물은 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, YAC, 바이러스 벡터 또는 트랜스포존 (transposon)의 형태로 존재할 수 있다. 특히, 벡터는 발현 벡터, 즉, 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 (예를 들어 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템 내에서) 발현을 제공할 수 있는 벡터일 수 있다.
본 발명의 핵산은 유전자 구축물의 형태로 존재하고/하거나, 유전자 구축물에 존재하고/하거나 그의 일부일 수 있다. 그러한 유전자 구축물은 일반적으로 그 자체로 공지된 유전자 구축물의 하나 이상의 요소, 예를 들어, 하나 이상의 적합한 조절 요소 (예컨대 적합한 프로모터, 인핸서(들), 종결인자(들) 등) 및 본원에서 언급되는 유전자 구축물의 추가의 요소에 임의로 연결된 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 예를 들어 WO 08/020079의 페이지 131-134에 기재된 것을 비롯하여 당업계에 공지된 다른 적합한 유전자 구축물은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로서 고려된다. 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함하는 그러한 유전자 구축물은 또한 본원에서 "본 발명의 유전자 구축물"로서 칭할 것이다.
하나의 비제한적인 실시양태에서, 본 발명의 유전자 구축물은 a) 본 발명의 적어도 하나의 핵산; 상기 폴리뉴클레오티드 NB 작용제가 작동가능하게 연결된 b) 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 임의로 적합한 종결인자; 및 임의로 c) 그 자체로 공지된 유전자 구축물의 하나 이상의 추가의 요소를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 유전자 구축물에서, 상기 본 발명의 적어도 하나의 핵산 및 상기 조절 요소, 및 임의로 상기 하나 이상의 추가의 요소는 서로 "작동가능하게 연결"되고, 이것은 일반적으로 이들이 서로 기능적 관계로 존재함을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 상기 프로모터가 코딩 서열의 전사 및/또는 발현을 개시 또는 달리 제어/조절할 수 있다면 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주된다 (여기서, 상기 코딩 서열은 "상기 프로모터의 제어 하에 있는 것으로서 이해되어야 한다). 일반적으로, 2개의 뉴클레오티드 서열이 작동가능하게 연결될 때, 이들은 동일한 배향으로 및 대체로 또한 동일한 리딩 프레임으로 존재할 것이다. 이들은 대체로 본질적으로 연속적으로 존재할 것이지만, 이것은 필요하지 않을 수 있다. 문구 "작동가능하게 접속된" 및 "작동가능하게 연결된"은 서로 교환가능하게 사용된다.
용어 "조절 요소", "프로모터", "종결인자" 및 "작동가능하게 접속된"은 당업계에서 통상적인 그의 의미를 갖는다. 유전자 구축물에 존재하는 "추가의 요소"는 예를 들어, 3'- 또는 5'-UTR 서열, 리더 서열, 선택 마커, 발현 마커/리포터 유전자, 및/또는 형질전환 또는 통합(의 효능)을 촉진하거나 증가시킬 수 있는 요소일 수 있다. 이들 및 그러한 유전자 구축물에 적합한 다른 요소는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 사용되는 구축물의 종류, 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체; 관심있는 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 발현되는 방식 (예를 들어 구성적, 일시적 또는 유도가능 발현을 통해); 및/또는 사용되는 형질전환 기술에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체 및 항체 단편 (비제한적으로 (단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편 포함)의 발현 및 생산을 위해 그 자체로 공지된 조절 서열, 프로모터 및 종결인자는 본질적으로 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 유전자 구축물의 조절 및 추가의 요소는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체 내에서 그의 의도된 생물학적 기능을 제공할 수 있는 것이다.
예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 종결인자는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 "작동가능"하여야 하고, 이것은 (예를 들어) 상기 프로모터가, 작동가능하게 연결된 (본원에서 규정된 바와 같이) 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 코딩 서열의 전사 및/또는 발현을 개시 또는 달리 제어/조절할 수 있어야 함을 의미한다. 일부의 특히 바람직한 프로모터는 본원에 언급된 숙주 세포 내에서 발현을 위해 그 자체로 공지된 프로모터; 및 특히 박테리아 세포에서 발현을 위한 프로모터를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 유전자 구축물은 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 형질전환을 위해, 즉, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드의 발현 및/또는 생산을 위해 사용될 수 있다. 적합한 숙주 또는 숙주 세포는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 유기체, 예를 들어, WO 08/020079의 페이지 134 및 135에 기재된 것; 및 당업자에게 명백할, 항체 및 항체 단편 (비제한적으로 (단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편 포함)의 발현 및 생산을 위한 그 자체로 공지된 모든 다른 숙주 또는 숙주 세포일 수 있다. 상기 인용된 일반적인 배경 기술, 및 예를 들어, WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; 문헌 [Frenken et al., (1998), 상기 문헌]; [Riechmann and Muyldermans, (1999), 상기 문헌]; [van der Linden, (2000), 상기 문헌]; [Thomassen et al., (2002), 상기 문헌]; [Joosten et al., (2003), 상기 문헌]; [Joosten et al., (2005), 상기 문헌]; 및 본원에 인용된 추가의 참조문을 또한 참조한다.
본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 예를 들어 WO 08/020079의 페이지 135 및 136 및 WO 08/020079에 인용된 추가의 참조문에 추가로 설명된 바와 같은 예방 및/또는 치료 목적 (예를 들어, 유전자 요법으로서)을 위해 다세포 유기체의 하나 이상의 세포, 조직 또는 장기에 도입되어 발현될 수 있다.
세포 내에서 NB 작용제의 발현을 위해, 이들은 예를 들어 WO 94/02610, WO 95/22618 및 US-A-7004940; WO 03/014960; 문헌 [Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag]; 및 [Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170]에 기재된 바와 같은 소위 "인트라비다 (intrabody)"로서 발현될 수 있다.
본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 또한 예를 들어 트랜스제닉 포유동물의 젖, 예를 들어 토끼, 소, 염소 또는 양의 젖 (예를 들어, 도입유전자 (transgene)를 포유동물 내로 도입하기 위한 일반적인 기술에 대해서는 US6,741,957, US6,304,489 및 US6,849,992 참조), 식물 또는 식물의 일부, 예를 들어 비제한적으로 그의 잎, 꽃, 열매, 종자, 뿌리 또는 괴경 (예를 들어 담배, 옥수수, 대두 또는 알팔파) 또는 예를 들어 누에 봄빅스 모리 (Bombix mori) 번데기에서 생산될 수 있다.
또한, 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 세포-비함유 발현 시스템에서 발현 및/또는 생산될 수 있고, 그러한 시스템의 적합한 예는 당업자에게 명백할 것이다. 일부 비-제한적인 예는 맥아 시스템; 토끼 망상적혈구 용해물; 또는 이. 콜라이 주베이 (Zubay) 시스템에서의 발현을 포함한다.
본원에 언급된 바와 같이, 플라스미드 또는 벡터로부터 발현된 NB 작용제를 사용하는 이점 중 하나는 그를 기초로 한 폴리펩티드가 적합한 박테리아 시스템에서의 발현을 통해 제조될 수 있다는 것이고, 적합한 박테리아 발현 시스템, 벡터, 숙주 세포, 조절 요소 등은 예를 들어 본원에 인용된 참조문으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그러나, 본 발명은 그의 가장 넓은 의미에서 박테리아 시스템에서의 발현에 제한되지 않음을 알아야 한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 코돈 사용빈도는 특정 숙주 세포/숙주 유기체의 코돈 사용빈도를 참조함으로써 최적화된다. 생성되는 뉴클레오티드 서열은 "코돈 최적화된" NB 뉴클레오티드 서열이다. 코돈 최적화된 NB 서열은 원핵 또는 진핵 숙주 세포/숙주 유기체에서의 발현을 위해 제조될 수 있다. 특정 예는 본원에 제공된 발현 시스템을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 제약 용도에 적합한 형태로 제공하는 발현 시스템 (생체내 또는 시험관내), 예를 들어 박테리아 발현 시스템이 사용되고, 그러한 발현 시스템은 다시 당업자에게 명백할 것이다. 또한 당업자에게 명백할 것인 바, 제약 용도에 적합한 본 발명의 폴리펩티드는 펩티드 합성을 위한 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
산업적 규모의 생산을 위해, NB 작용제 또는 NB 작용제-함유 단백질 치료제의 (산업적) 생산에 바람직한 이종성 숙주는 대규모 발현/생산/발효, 및 특히 대규모 제약 (즉, GMP 등급) 발현/생산/발효에 적합한 이. 콜라이, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae)의 균주를 포함한다. 상기 균주의 적합한 예는 당업자에게 명백할 것이다. 상기 균주 및 생산/발현 시스템은 또한 바이오비트룸 (Biovitrum, 스웨덴 웁살라)과 같은 회사에 의해 이용가능하다.
별법으로, 포유동물 세포주, 특히 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포가 대규모 발현/생산/발효, 특히 대규모 제약 발현/생산/발효를 위해 사용될 수 있다. 다시, 그러한 발현/생산 시스템은 또한 본원에 언급된 일부 회사에 의해 이용가능하다.
특이적인 발현 시스템의 선택은 부분적으로는 특정 번역후 변형, 보다 특이적으로 글리코실화의 필요성에 의해 결정될 것이다. 글리코실화가 요구되거나 필요한 NB 작용제-함유 재조합 단백질의 생산은 발현된 단백질을 글리코실화하는 능력을 갖는 포유동물 발현 숙주의 사용을 필요로 할 것이다. 이와 관련하여, 얻어진 글리코실화 패턴 (즉, 부착된 잔기의 종류, 수 및 위치)이 발현을 위해 사용되는 세포 또는 세포주에 의해 결정될 것임은 당업자에게 명백할 것이다. 바람직하게는, 인간 세포 또는 세포주가 사용되거나 (즉, 본질적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 유도하거나) 또는 인간 글리코실화와 본질적으로 및/또는 기능상 동일한 또는 적어도 인간 글리코실화를 모방하는 글리코실화 패턴을 제공할 수 있는 또 다른 포유동물 세포주가 사용된다. 일반적으로, 원핵 숙주, 예컨대 이. 콜라이는 단백질을 글리코실화하는 능력을 갖지 않고, 저등 진핵생물, 예컨대 효모의 사용은 대체로 인간 글리코실화와 상이한 글리코실화 패턴을 유도한다. 그럼에도 불구하고, 얻어질 목적하는 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드에 따라 모든 상기한 숙주 세포 및 발현 시스템이 본 발명에서 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
따라서, 본 발명의 하나의 비제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드는 글리코실화된다. 또 다른 본 발명의 비제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드는 비-글리코실화된다.
본 발명의 하나의 바람직하지만 비제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드는 박테리아 세포, 특히 대규모 제약 생산에 적합한 박테리아 세포, 예컨대 본원에 언급된 균주의 세포에서 생산된다.
본 발명의 또 다른 바람직하지만 비제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드는 효모 세포, 특히 대규모 제약 생산에 적합한 효모 세포, 예컨대 본원에 언급된 종의 세포에서 생산된다.
본 발명의 또 다른 바람직하지만 비제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드는 포유동물 세포, 특히 인간 세포 또는 인간 세포주의 세포, 보다 특히 대규모 제약 생산에 적합한 인간 세포 또는 인간 세포주의 세포, 예컨대 본원에서 상기 언급된 세포주의 세포에서 생산된다.
본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 및 폴리펩티드를 생산하기 위해 숙주 세포에서의 발현을 사용할 때, NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 세포 내에서 (예를 들어 시토졸, 주변세포질 또는 봉입체 (inclusion body) 내에서) 생산된 후, 숙주 세포로부터 단리되고, 임의로 추가로 정제될 수 있거나; 또는 세포 외에서 (예를 들어 숙주 세포가 배양되는 배지 내에서) 생산된 후, 배양 배지로부터 단리되고, 임의로 추가로 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 비제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드는 세포 내에서 생산되고 숙주 세포, 특히 박테리아 세포에서 또는 박테리아 세포 내의 봉입체로부터 단리된 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드이다. 본 발명의 또 다른 비제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드는 세포 외에서 생산된 후, 숙주 세포가 배양된 배지로부터 단리된 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드이다.
발현 시스템에 대한 보다 자세한 논의는 예를 들어 WO 08/020079의 페이지 138 및 139에 제시되어 있다. 예를 들어 WO 08/020079의 페이지 139 및 140에서 언급된 것을 포함하여 이들 숙주 세포와 함께 사용하기 위한 프로모터의 비-제한적인 목록이 포함된다. 또한 예를 들어 WO 08/020079의 페이지 140에서 언급된 것을 포함하여 이들 숙주 세포와 함께 사용하기 위한 분비 서열의 비-제한적인 목록이 포함된다.
본 발명의 숙주 또는 숙주 세포의 형질전환에 적합한 기법은 당업자에게 명백할 것이고, 사용되는 의도된 숙주 세포/숙주 유기체 및 유전자 구축물에 따라 결정될 수 있다. 본원에 언급된 안내서 및 특허 출원을 다시 참조한다.
또한, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드가 (먼저) 미성숙 형태 (본원에 언급된 바와 같이)로 생성될 수 있고, 사용된 숙주 세포/숙주 유기체에 따라 번역후 변형에 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드는 다시 사용된 숙주 세포/숙주 유기체에 따라 글리코실화될 수 있다.
이어서, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드는 그 자체로 공지된 단백질 단리 및/또는 정제 기법, 예컨대 (예비) 크로마토그래피 및/또는 전기영동 기법, 분별 침전 기법, 친화도 기법 (예를 들어, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드과 융합된 특이적인 절단가능한 아미노산 서열 사용) 및/또는 예비 면역학적 기법 (즉, 단리할 아미노산 서열에 대한 항체를 사용하는)을 이용하여 숙주 세포/숙주 유기체로부터 및/또는 상기 숙주 세포 또는 숙주 유기체가 배양되는 배지로부터 단리될 수 있다.
제약 제제 또는 조성물
일반적으로, 제약 용도를 위해, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트 (adjuvant), 및 임의로 하나 이상의 추가의 제약 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 제약 제제 또는 조성물로서 제형화할 수 있다. 비-제한적인 예로서, 그러한 제형은 경구 투여, 비경구 투여 (예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 주사 또는 정맥내 주입에 의한), 국소 투여, 흡입, 피부 패치, 이식물, 좌제 등에 의한 투여에 적합한 형태로 존재할 수 있다. 투여 방식에 따라 고체, 반고체 또는 액체일 수 있는 그러한 적합한 투여 형태 및 그의 제조에 사용하기 위한 방법 및 담체는 당업자에게 명백할 것이고, 본원에 추가로 설명된다. 그러한 제약 제제 또는 조성물은 일반적으로 본원에서 "제약 조성물"로서 칭할 것이다. 비-인간 유기체에서 사용하기 위한 제약 제제 또는 조성물은 일반적으로 본원에서 "수의학적 조성물"로서 칭할 것이다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 아미노산, 본 발명의 적어도 하나의 NB 작용제 또는 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제 (즉, 제약 용도에 적합한), 및 임의로 하나 이상의 추가의 활성 물질을 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 그 자체로 공지된 임의의 적합한 방식으로 제형화되고 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 인용된 일반적인 배경 기술 (특히 WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 및 WO 08/020079) 및 표준 안내서, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)], [Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)]; 또는 [Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubet, Ed), Wiley, Weinheim, 2007 (예를 들어, 페이지 252-255 참조)]을 참조한다.
본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 통상적인 항체 및 항체 단편 (ScFv 및 디아바디 포함) 및 다른 제약 활성 단백질에 대해 그 자체로 공지된 임의의 방식으로 제형화되고 투여될 수 있다. 상기 제형 및 그를 제조하기 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 비경구 투여 (예를 들어 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 체강내, 동맥내 또는 경막내 투여) 또는 국소 (즉, 경피 또는 피내) 투여에 적합한 제제를 포함한다.
비경구 투여를 위한 제제는 예를 들어 주입 또는 주사에 적합한 멸균 용액, 현탁액, 분산액 또는 에멀젼일 수 있다. 상기 제제에 적합한 담체 또는 희석제는 예를 들어 비제한적으로 WO 08/020079의 페이지 143에 언급된 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 수용액 또는 수성 현탁액이다.
본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 유전자 요법 전달 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 그의 유전자 요법 전달 방법에 대해서는 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,399,346을 참조한다. 유전자 요법 전달 방법을 사용하여, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 형질감염된 1차 세포는 특이적 장기, 조직, 이식편, 종양, 또는 세포를 표적화하기 위해 조직 특이적 프로모터로 추가로 형질감염시킬 수 있고, 세포내 소기관 국소 발현을 위해 신호 및 안정화 서열로 추가로 형질감염시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 제약상 허용되는 비히클, 예컨대 불활성 희석제 또는 흡수가능한 식용 담체와 조합되어 전신적으로, 예를 들어, 경구로 투여될 수 있다. 이들은 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐 내에 봉입될 수 있거나, 정제로 타정될 수 있거나, 또는 직접 환자의 음식 내로 혼입될 수 있다. 치료적 경구 투여를 위해, 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 하나 이상의 부형제와 조합되어 삼킬 수 있는 정제, 구강정, 트로키 (troch), 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 상기 조성물 및 제제는 적어도 0.1%의 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드를 함유하여야 한다. 조성물 및 제제 내의 그의 비율은 물론 상이할 수 있고, 편리하게는 제시된 단위 투여 형태의 약 2 내지 약 60 중량%일 수 있다. 상기 치료상 유용한 조성물 내의 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드의 양은 효과적인 투여량 수준이 얻어지도록 하는 것이다.
정제, 트로키, 환제, 캡슐 등은 또한 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제 및 감미제 또는 향미제, 예를 들어 WO 08/020079의 페이지 143-144에 언급된 것을 함유할 수 있다. 단위 투여 형태가 캡슐일 경우, 이것은 상기 종류의 물질 이외에, 액체 담채, 예컨대 식물유 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질은 코팅으로서 또는 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태를 변형하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제, 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 쉘락 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드, 수크로스 또는 감미제로서 과당, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 향미제, 예컨대 체리 또는 오렌지 향미제를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태의 제조에 사용되는 임의의 물질은 사용된 양에서 제약상 허용되고, 실질적으로 비-독성이어야 한다. 추가로, 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 지속 방출 제제 및 장치 내로 도입될 수 있다.
또한, 경구 투여를 위한 제제 및 제형에는 본 발명의 구축물이 위장 환경을 견디고 장 내로 통과할 수 있도록 하는 장용 코팅이 제공될 수 있다. 보다 일반적으로, 경구 투여를 위한 제제 및 제형은 위장관의 임의의 목적하는 부분 내로의 전달을 위해 적합하게 제형화될 수 있다. 추가로, 적합한 좌제는 위장관 내로의 전달을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 또한 주입 또는 주사에 의해 정맥 내로 또는 복강 내로 투여될 수 있다. 특정 예는 WO 08/020079의 페이지 144 및 145에 추가로 기재되어 있다.
국소 투여를 위해, 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 순수한 형태로, 즉 이들이 액체일 때 적용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 이들을 고체 또는 액체일 수 있는 피부과상 허용되는 담체와 조합되어 조성물 또는 제형으로서 피부에 투여하는 것이 바람직할 것이다. 특정 예는 WO 08/020079의 페이지 145에 추가로 설명된 바와 같다.
일반적으로, 액체 조성물, 예컨대 로션 내의 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드의 농도는 약 0.1-25 wt%, 바람직하게는 약 0.5-10 wt%일 것이다. 반고체 또는 고체 조성물, 예컨대 겔 또는 분말 내의 농도는 약 0.1-5 wt%, 바람직하게는 약 0.5-2.5 wt%일 것이다.
치료에 사용하기 위해 요구되는 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드의 양은 선택되는 특정 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드뿐만 아니라 투여 경로, 치료되는 병태의 특성 및 환자의 연령 및 상태에 따라 상이할 것이고, 궁극적으로 담당의 또는 임상의의 판단에 따를 것이다. 또한, 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드의 투여량은 표적 세포, 종양, 조직, 이식편, 또는 장기에 따라 상이하다.
목적하는 용량은 단일 용량으로 또는 적절한 간격, 예를 들어 2, 3, 또는 4회 이상의 하위-용량/일로 투여되는 분할 용량으로 편리하게 제시될 수 있다. 하위-용량 자체는 예를 들어 많은 별개의 느슨한 간격의 투여; 예컨대 취입기로부터의 다수의 흡입 또는 눈 내로의 다수의 점적 적용으로 추가로 분할될 수 있다.
투여법은 장기, 매일 치료를 포함할 수 있다. "장기"는 적어도 2주, 바람직하게는 수주, 수개월, 또는 수년의 지속기간을 의미한다. 상기 투여량 범위 내의 필요한 변형은 본원의 교시내용을 고려하여 단지 통상적인 실험을 사용하여 당업자가 결정할 수 있다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA]를 참조한다. 투여량은 또한 임의의 합병증의 발생 시에 개체 담당의에 의해 조정될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상체에게 제약 활성량의 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 NB 작용제, 본 발명의 폴리펩티드, 및/또는 그를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, DR5와 연관된 적어도 하나의 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 설명에서, 용어 "예방 및/또는 치료"는 질환을 예방 및/또는 치료하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 또한 일반적으로 질환의 발병 억제, 질환 진행의 지연 또는 역전, 질환과 연관된 하나 이상의 증상의 발생의 억제 또는 지연, 질환과 연관된 하나 이상의 증상의 감소 및/또는 완화, 질환 및/또는 그와 연관된 임의의 증상의 중증도 및/또는 지속기간의 감소 및/또는 질환 및/또는 그와 연관된 임의의 증상의 중증도의 추가의 증가의 억제, 질환에 의해 야기되는 임의의 생리학적 손상의 억제, 감소 또는 역전, 및 일반적으로 치료되는 환자에 유익한 임의의 약물학적 작용을 포함한다.
치료할 대상체는 임의의 온혈 동물일 수 있지만, 특히 포유동물, 보다 특히 인간이다. 당업자에게 명백할 것인 바, 치료할 대상체는 특히 본원에 언급된 질환 및 장애로 고통받거나 그의 위험이 있는 사람일 것이다.
본 발명은 DR5, 그의 생물학적 또는 생리학적 활성, 및/또는 DR5가 관여하는 생물학적 경로 또는 신호전달과 연관된 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 제약 활성량의 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 NB 작용제, 본 발명의 폴리펩티드, 및/또는 그를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 DR5, 그의 생물학적 또는 약물학적 활성, 및/또는 DR5가 관여하는 생물학적 경로 또는 신호전달을 조정함으로써 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 제약 활성량의 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 NB 작용제, 본 발명의 폴리펩티드, 및/또는 그를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 제약상 유효량은 DR5, 그의 생물학적 또는 약물학적 활성, 및/또는 DR5가 관여하는 생물학적 경로 또는 신호전달을 조정하기에 충분한 양; 및/또는 DR5, 그의 생물학적 또는 약물학적 활성, 및/또는 DR5가 관여하는 생물학적 경로 또는 신호전달을 조정하기에 충분한, 순환계 내의 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 NB 작용제, 본 발명의 폴리펩티드의 수준을 제공하는 양일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 NB 아미노산 서열 또는 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 본 발명의 NB 뉴클레오티드 구축물, 및/또는 그를 포함하는 제약 조성물을 환자에게 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 방법은 제약 활성량의 본 발명의 NB 아미노산 서열 또는 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 본 발명의 NB 뉴클레오티드 구축물, 및/또는 그를 포함하는 제약 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료할 대상체의 특정 세포 또는 특정 조직에서 세포 아폽토시스를 증강시킴으로써 (특히, 치료할 대상체에 존재하는 암 세포 또는 종양에서 세포 아폽토시스를 증강시킴으로써) 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 제약 활성량의 본 발명의 NB 아미노산 서열 또는 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 본 발명의 NB 뉴클레오티드 구축물, 및/또는 그를 포함하는 제약 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 나열된 질환 및 장애로 이루어지는 군 중에서 선택된 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 NB 아미노산 서열 또는 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 본 발명의 NB 뉴클레오티드 구축물, 및/또는 그를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 언급된 질환 및 장애로 고통받거나 그 위험이 있는 대상체에게 제약 활성량의 본 발명의 NB 아미노산 서열 또는 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 본 발명의 NB 뉴클레오티드 구축물, 및/또는 그를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 면역치료, 특히 수동 면역치료를 위한 방법에 관한 것이다.
상기 방법에서, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 및/또는 폴리펩티드 및/또는 그를 포함하는 조성물은 사용되는 특정 제약 제형 또는 조성물에 따라 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 및/또는 폴리펩티드 및/또는 그를 포함하는 조성물은 예를 들어 다시 사용되는 특정 제약 제형 또는 조성물에 따라 경구, 복강 내로 (예를 들어 정맥 내로, 피하, 근육 내로, 또는 위장관을 회피하는 임의의 다른 투여 경로를 통해), 비내, 경피, 국소, 좌제에 의해, 흡입에 의해 투여될 수 있다. 임상의는 예방 또는 치료되는 질환 또는 장애 및 임상의에게 공지된 다른 인자에 따라 상기 투여에 사용되는 적합한 투여 경로 및 적합한 제약 제형 또는 조성물을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 및/또는 폴리펩티드 및/또는 그를 포함하는 조성물은 예방 또는 치료되어야 할 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하기 위해 적합한 치료 요법에 따라 투여된다. 임상의는 일반적으로 예컨대 예방 또는 치료되는 질환 또는 장애, 치료할 질환의 중증도 및/또는 그의 증상의 중증도, 사용되는 본 발명의 특정 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드, 사용되는 특정 투여 경로 및 제약 제형 또는 조성물, 환자의 연령, 성별, 체중, 식이, 전반적인 상태, 및 임상의에게 공지된 유사한 인자에 따라 적합한 치료 요법을 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 치료 요법은 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 및/또는 폴리펩티드, 또는 그를 포함하는 하나 이상의 조성물을 하나 이상의 제약상 유효량 또는 유효 용량으로 투여하는 것을 포함할 것이다. 투여되는 구체적인 양(들) 또는 용량은 다시 상기 언급된 인자에 따라 임상의에 의해 결정될 수 있다.
일반적으로, 본원에 언급된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 및 치료할 구체적인 질환 또는 장애, 사용되는 본 발명의 특정 아미노산 서열, NB 작용제 및 폴리펩티드의 효능, 사용되는 특정 투여 경로 및 특정 제약 제형 또는 조성물에 따라 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 일반적으로 1 g 내지 0.01 ㎍/kg 체중/일, 바람직하게는 0.1 g 내지 0.1 ㎍/kg 체중/일, 예컨대 약 1, 10, 100 또는 1000 ㎍/kg 체중/일의 양으로 연속적으로 (예를 들어 주입에 의해), 단일 1일 용량 또는 하루 동안 다수의 분할 용량으로서 투여될 것이다. 임상의는 일반적으로 본원에 언급된 인자에 따라 적합한 일일 용량을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 특정 경우에, 임상의는 예를 들어 상기 언급된 인자 및 그의 전문적인 판단을 기초로 하여 이들 양으로부터 벗어나는 양을 선택할 수 있음이 명백할 것이다. 일반적으로, 투여될 양에 대한 몇몇의 지침은 친화도/결합력, 효능, 생물분포, 반감기 및 당업자에게 공지된 유사한 인자의 차이를 고려하여, 본질적으로 동일한 경로를 통해 투여되는, 동일한 표적에 대한 대등한 통상적인 항체 또는 항체 단편에 대해 대체로 투여되는 양으로부터 얻을 수 있다.
한 실시양태에서, 단일 도메인 또는 다수의 1가 또는 다가 도메인을 함유하는지의 여부에 따라 본 발명의 하나의 연속적인 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드는 번역된 서열이 사용될 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 2개 이상의 아미노산 서열, NB 작용제 및/또는 폴리펩티드가 조합되어 제공된다.
본 발명의 NB 작용제, 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 하나 이상의 추가의 제약 활성 화합물 또는 성분과 조합되어, 즉, 상승적인 효과를 유도하거나 유도하지 않을 수 있는 조합 치료 요법으로서 사용될 수 있다. 다시, 임상의는 상기 언급된 인자 및 그의 전문적인 판단을 기초로 하여 상기 추가의 화합물 또는 성분, 및 적합한 조합 치료 요법을 선택할 수 있을 것이다.
특히, 본 발명의 NB 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 본원에 인용된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 사용되거나 사용될 수 있는 다른 제약 활성 화합물 또는 성분과 조합되어 사용될 수 있고, 그 결과로서 상승적인 효과가 얻어지거나 그렇지 않을 수 있다. 그러한 화합물 및 성분, 및 이를 투여하기 위한 경로, 방법 및 제약 제형 또는 조성물은 임상의에게 명백할 것이고, 일반적으로 대체로 치료할 종양의 치료를 위해 적용되는 세포증식 억제성 활성 성분을 포함한다.
본 발명의 NB 작용제과 사용하기 위한 고려되는 구체적인 조합은 예를 들어 탁솔; 겜시토빈; 시스플라틴; cIAP 억제제 (예컨대 cIAP1, cIAP2 및/또는 XIAP에 대한 억제제); 예를 들어, U0126, PD0325901을 포함하고 이로 제한되지 않는 MEK 억제제; 예를 들어, RAF265를 포함하고 이로 제한되지 않는 bRaf 억제제; 및 예를 들어 RAD001을 포함하고 이로 제한되지 않는 mTOR 억제제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 구체적인 조합은 본원 및 실시예에 제공된다.
2개 이상의 물질 또는 성분이 조합 치료 요법의 일부로서 사용되어야 할 때, 이들은 동일한 투여 경로를 통해 또는 상이한 투여 경로를 통해 본질적으로 동시에 또는 상이한 시점에 (예를 들어 본질적으로 동시에, 연속적으로, 또는 교대하는 방식으로) 투여될 수 있다. 물질 또는 성분이 동일한 투여 경로를 통해 동시에 투여되어야 할 때, 이들은 당업자에게 명백할 것인 바 상이한 제약 제형 또는 조성물 또는 조합 제약 제형 또는 조성물의 일부로서 투여될 수 있다.
또한, 2개 이상의 활성 물질 또는 성분이 조합 치료 요법의 일부로서 사용되어야 할 때, 각각의 물질 또는 성분은 화합물 또는 성분이 단독으로 사용될 때와 동일한 양으로 및 동일한 요법에 따라 투여될 수 있고, 상기 조합 사용은 상승 효과를 유도할 수 있거나 유도하지 않을 수 있다. 그러나, 2개 이상의 활성 물질 또는 성분의 조합 사용이 상승 효과를 유도할 때, 목적하는 치료 작용을 계속 달성하면서 투여되는 물질 또는 성분의 하나, 또는 그 초과 또는 그 전부의 양을 감소시킬 수도 있다. 이것은 예를 들어 여전히 목적하는 제약 또는 치료 효과를 얻으면서, 그의 통상적인 양으로 사용될 때 하나 이상의 물질 또는 성분의 사용과 연관된 임의의 원치 않는 부작용을 방지하거나 제한하거나 감소시키기 위해 유용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 치료 요법의 유효성은 임상의에게 명백할 것인 관련되는 질환 또는 장애에 대해 그 자체로 공지된 임의의 방식으로 결정 및/또는 수행될 수 있다. 임상의는 또한 적절한 경우 및 케이스에 따라, 목적하는 치료 효과를 달성하고 원치 않는 부작용을 방지하거나 제한하거나 감소시키기 위해 특정 치료 요법을 변경하거나 수정하고/하거나, 한편으로는 목적하는 치료 효과를 달성하고 다른 한편으로는 바람직하지 않은 부작용을 방지하거나 제한하거나 감소시키는 적절한 균형을 달성할 수 있을 것이다.
일반적으로, 치료 요법은 목적하는 치료 효과가 달성되고/되거나 목적하는 치료 효과가 유지되어야 하는 만큼 오랫동안 수행될 것이다. 다시, 이것은 임상의가 결정할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 DR5와 연관된 적어도 하나의 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물의 제조에 있어서; 및/또는 본원에 언급된 하나 이상의 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제 또는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
치료할 대상체는 임의의 온혈 동물일 수 있지만, 특히 포유동물, 보다 특히 인간이다. 수의학적으로 적용시에, 치료할 대상체는 상업적인 목적으로 키우거나 또는 애완동물로 기르는 임의의 동물을 포함한다. 당업자에게 명백할 것인 바, 치료할 대상체는 특히 본원에 언급된 질환 및 장애로 고통받거나 그 위험이 있는 사람일 것이다.
본 발명은 본 발명의 NB 아미노산 서열 또는 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 NB 뉴클레오티드, 및/또는 그의 제약 조성물을 환자에게 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 본 발명의 NB 아미노산 서열 또는 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 NB 뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은 DR5와 연관된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위한, 특히 하나 이상의 본원에 나열된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 본 발명의 NB 아미노산 서열 또는 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 NB 뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
다시, 그러한 제약 조성물에서, 본 발명의 하나 이상의 NB 아미노산 서열 또는 폴리펩티드, 또는 그를 포함하는 NB 뉴클레오티드, 및/또는 그의 제약 조성물은 또한 하나 이상의 다른 활성 성분, 예컨대 본원에 언급된 것과 적합하게 조합될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 예시적인 NB 작용제의 사용이 훨씬 바람직하지만, 본원의 설명에 기초하여, 당업자가 유사한 방식으로 DR5에 대한 다른 아미노산 서열 및 특히 (단일) 도메인 항체, 및 상기 (단일) 도메인 항체를 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드를 설계 및/또는 생성할 수 있을 것임이 명백할 것이다.
예를 들어, 본 발명의 NB 작용제에 대해 본원에 언급된 하나 이상의 CDR을 상기 (단일) 도메인 항체 또는 인간 스캐폴드 또는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 포함하고 이로 제한되지 않는 다른 단백질 스캐폴드 상에 "그라프팅"하는 것이 가능할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 그러한 CDR 그라프팅에 적합한 스캐폴드 및 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, WO 08/020079에 언급된 것을 참조한다. 예를 들어, 마우스 또는 래트 CDR을 인간 프레임워크 및 스캐폴드에 그라프팅하기 위한, 그 자체로 공지된 기술은 본 발명의 NB 작용제의 하나 이상의 CDR 및 하나 이상의 인간 프레임워크 영역 또는 서열을 포함하는 키메라 (chimera) 단백질을 제공하기 위해 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 NB 작용제가 본원에 언급된 바람직한 CDR 서열 이외의 다른 하나 이상의 CDR 서열을 함유할 때, 이들 CDR 서열은 그 자체로 공지된 임의의 방식으로, 예를 들어, WO 08/020079에 기재된 하나 이상의 기법을 이용하여 얻을 수 있음을 유의하여야 한다.
본 발명의 아미노산 서열, NB 작용제, 폴리펩티드, 핵산, 유전자 구축물 및 숙주 및 숙주 세포의 추가의 용도는 본원의 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 본 발명의 아미노산 서열은 그를 포함하는 조성물 및 제제로부터 DR5를 정제하기 위해 그 자체로 공지된 방식으로 사용될 수 있는 배지를 제공하기 위해 적합한 담체 또는 고체 지지체에 연결될 수 있다. 적합한 검출가능한 표지를 포함하는 본 발명의 아미노산 서열의 유도체는 또한 조성물 또는 제제 내에서 DR5의 존재를 (정성적으로 또는 정량적으로) 검출하기 위한 마커로서 또는 세포 또는 조직의 표면 상에서 DR5의 존재를 선택적으로 검출하기 위한 마커로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 적합한 세포 분류 기법과 조합되어).
본 발명을 다음 비제한적인 실험 부분에 의해 추가로 설명할 것이다.
1. 실시예 I
1.1. 인간 및 사이노 DR5 클로닝 및 단백질 제제
1.1.1. 인간 긴 형태 DR5 세포외 도메인 (ECD) 및 사이노 긴 및 짧은 형태 DR5 ECD의 클로닝
인간 긴 형태 DR5 ECD (aa55-213)를 RT-PCR에 의해 클로닝하였다. 퀴아젠 (Qiagen)의 RNeasy 미니 키트 (Cat No. 74104)에 의해 주르카트 및 라지 (Raji) 세포로부터 총 RNA를 단리하였다. 수퍼스크립트 (Superscript) II 퍼스트 스트랜드 (First Strand) 합성 시스템 (인비트로젠 (Invitrogen), Cat: 11904-018)에 의해 cDNA를 제조한 후, 표준 프로토콜을 이용하여 하이 피델리티 플래티넘 (High Fidelity Platinum) Taq DNA 폴리머라제 (인비트로젠, Cat no.11304-011)에 의해 증폭시켰다: 94℃에서 2 min, 이어서 95℃/30초, 55℃/30초, 72℃/60초의 30 사이클 및 72℃에서 7 min 최종 인큐베이션. PCR을 위해 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 다음과 같다: 5'-CTGATCACCC AACAAGACCT AG-3' (서열 83) 및 5'-GCCTGAGAGA GAACAGGGAG A-3' (서열 84). 이어서, 생성되는 476 bp 단편을 이. 콜라이 발현 벡터 pBAD/Thio-TOPO (인비트로젠, Cat No. K370-01) 내로 라이게이션시켰다. 양성 클론을 PCR에 의해 확인하고 DNA 서열결정에 의해 확정하였다.
전장 사이노 DR5 유전자를 PR-PCR에 의해 원래 사이노몰거스 간 cDNA (바이오체인 인스티튜트, 인크. (BioChain Institute, Inc. 미국))로부터 클로닝하였다. 정방향 (5'-CACCATGGAA CAACGGGGAC AGAACGCC-3') (서열 85) 및 역방향 (5'-TTAGGACATG GCAGAGTCTG CATTACCTTC-3') (서열 86) 프라이머를 각각 개시 (ATG) 및 중지 (TAA) 코돈을 포함한 인간 DR5 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 설계하였다. PCR을 위해 하이 피델리티 플래티넘 Taq DNA 폴리머라제 (인비트로젠, Cat no.11304-011)를 사용하고, 생성되는 단편을 pcDNA3.1 방향적 TOPO 벡터 내로 라이게이션시켰다. 양성 콜로니를 DNA 서열결정에 의해 확인하였다. 인간 DR5 유전자와 유사하게, 사이노 DR5 유전자의 2개의 스플라이싱 선택형 (splicing alternative)이 확인되었다. 하나는 긴 형태 ECD를 갖고, 다른 것은 짧은 형태 ECD를 갖는다.
사이노 긴 (aa55-213) 및 짧은 (aa55-174) 형태의 DR5 ECD를 모두 pBAD/Thio-TOPO 벡터 (인비트로젠, Cat No. K370-01) 내로 추가로 클로닝하였다. 양성 클론을 PCR에 의해 확인하고 DNA 서열결정에 의해 확정하였다.
1.1.2. 세포 표면 사이노 DR5를 발현하는 CHO 세포주의 확립
차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO-K1)를 90-95% 융합 (confluency)에서 FuGENE6 (로슈 어플라이드 사이언시스 (Roche Applied Sciences)) 및 1 ㎍ pcDNA3.1-사이노DR5 발현 벡터를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염시킨 세포를 500 ㎍/ml 게네티신 (G418)에 의해 선택하고, 세포 분류에 의해 서브클로닝하였다.
1.1.3. 이. 콜라이로부터 티오레독신-DR5ECD-His6 융합체의 발현 및 정제
DR5 ECD의 발현을 위해, pBAD/Thio-DR5ECD를 이. 콜라이 균주 TOP10 (인비트로젠, Cat No. C4040-03) 내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 사용하여 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 100 ml LB를 접종하였다. 상기 배양액을 225 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 3 리터의 LB/암피실린에 30 ml의 밤새 배양한 배양물을 접종하고 OD600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 진탕하였다. 이어서, 배양액을 0.02% 아라비노스로 3시간 동안 37℃에서 유도하였다. 박테리아 펠릿을 프로테아제 억제제 (로슈, Cat No. 1836153)를 함유하는 21 ml 용해 완충제 (0.3M NaCl, 0.4% 트리톤(Triton) X-100 및 10 mM 이미다졸을 함유하는 PBS) 내에 재현탁시켰다. 용해물을 60초 동안 2회 초음파처리한 후, 20,000 x g에서 20 min 동안 원심분리하였다. 가용성 Hisx6 태깅된 DR5 ECD를 니켈 킬레이트 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 가용성 Hisx6 태깅된 DR5 ECD는 서열 91 또는 92의 폴리펩티드 태그를 코딩하는 서열을 DR5 구축물의 리딩 프레임의 3' 말단에 삽입함으로써 생성시키고, 여기서 태그는 폴리펩티드의 C-말단부에서 발현된다. 정화한 용해물을 용해 완충제로 평형화시킨 6 ml의 Ni-NTA 아가로스 (퀴아젠, Cat No. 30210) 위해 통과시켰다. 칼럼을 20 ml의 용해 완충제, 이어서 50 mM 이미다졸 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 15 ml의 PBS로 세척하였다. 이어서, DR5 ECD 단백질을 100 mM 이미다졸 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 10 ml PBS에 이어 250 mM 이미다졸을 함유하는 동일한 완충제로 용리하였다. 분획을 4-12% NuPAGE 비스-트리스(Bis-Tris) 겔 (인비트로젠, Cat No. NP0329BOX) 상에서 점검하였다. DR5 ECD 단백질을 함유하는 양성 분획을 모으고, 농축하고, -20℃에서 보관하였다.
니켈 킬레이트 친화도 크로마토그래피 후에, 단백질을 소프트웨어 프로그램 유니콘 (Unicorn)이 있는 아머샴 (Amersham) AKTA 익스플로러 (explorer) 상에서 수행된 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 칼럼은 층 부피가 320 ml인 하이프렙 (HiPrep) 26/60 세파크릴 (Sephacryl) S-200 HR이었다 (아머샴, Cat No. 17-1195-01). 표준 파라미터는 제조자의 권장사항에 따라 사용하였다. 간단히 설명하면, 1xPBS 완충제 (pH 7.2)를 칼럼을 통해 0.5 ml/min로 유동시키고, 0.5 ml/분획을 4℃에서 수집하였다.
정제의 마지막 단계는 이온 교환 크로마토그래피이었다. 음이온 교환기 Mono Q 5/50 GL 칼럼 (아머샴, Cat No. 17-5166-01)을 유동 속도 1 ml/min에서 구배 용리와 함께 사용하고, 0.5 ml/분획을 4℃에서 수집하였다.
1.1.4. HEK293 세포로부터 DR5ECD-Fc 융합 단백질의 발현 및 정제
인간 및 사이노의 긴 형태 및 짧은 형태 DR5 ECD를 CMV 프로모터 및 인간 IgG1 Fc 유전자 단편을 함유하는 pRS5a-IgG 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 양성 클론을 PCR에 의해 확인하고 DNA 서열결정에 의해 확정하였다. HEK293 세포를 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 (깁코 (Gibco), lot no. 11317078)로 일시 형질감염시켰다. DR5ECD-Fc 융합 단백질을 함유하는 배지를 형질감염 7일 후에 수집하였다. 농축된 상청액을 pH 7.2로 조정하고, 여과에 의해 정화하고, 5 ml 단백질 A-세파로스 FF 칼럼 상으로 0.5 ml/min에서 로딩하였다. PBS, pH 7.3을 사용한 기준선 세척 후에, 결합된 물질을 50 mM 시트레이트/140 mM NaCl, pH 2.7로 용리시키고, 중화시키고, 멸균 여과하였다.
1.2. 면역화
3마리의 라마를 인간 DR5 항원으로 면역화시켰다. 1마리의 라마 (106)는 짧은 (133개 잔기) 재조합 인간 DR5 (페프로테크 (Peprotech, 미국 뉴저지주 록키 힐), 카탈로그 # 310-19)로 면역화시켰다. 2마리의 다른 라마는 전체 엑토도메인 인간 DR5-티오레독신 융합체로 면역화시켰다. 라마에게 50-100 ㎍의 항원 (아주반트로서 스티뮨 (Stimune) (세디 다이아그노스틱스 (Cedi Diagnostics, 네덜란드 레리스타트))를 사용한)을 근육내 주사한 후, 2주 후에 추가로 50 ㎍의 용량을 주사하여 7회 매주 용량을 투여하였다. 면역 혈액 샘플을 면역화의 시작 후 제47일 및 제88일에 채취하고, 림프절 조직을 제88일에 채취하였다.
1.3. 라이브러리 구축
cDNA 샘플을 면역 혈액 및 림프절 샘플의 총 RNA 제제로부터 제조하였다. DR5 NB 구축물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 프라이머 ABL051 (서열 73), ABL052 (서열 74) 및 ABL003 (서열 75)을 사용하는 1-단계 RT-PCR 반응으로 인간 DR5로 면역화시킨 3마리의 라마의 cDNA 샘플로부터 증폭시켰다. 프라이머 서열을 표 5에 제시한다. 샘플 내에서 IgG2 및 IgG3 cDNA로부터 증폭시킨 700 bp 앰플리콘 (amplicon)을 겔로부터 단리하고, SfiI 및 MfeI 제한 부위 및 ABL003 프라이머를 함유하는 ABL050-MfeI 프라이머 (서열 76)을 사용하는 네스티드 (nested) PCR 반응에서 주형으로서 후속적으로 사용하였다. PCR 생성물을 SfiI 및 BstEII (VHH 유전자의 FR4에서 천연 발생)로 후속적으로 소화시키고, 파지미드 벡터 pAX50의 대응하는 제한 부위 내로 라이게이션시켜 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) TG-1 내에서 전기천공 후에 라이브러리를 얻었다. pAX50은 LacZ 프로모터, 콜리파지 pIII 단백질 코딩 서열, 암피실린 또는 카르베니실린에 대한 내성 유전자, 다중 클로닝 부위 및 gen3 리더 서열을 함유한 pUC119로부터 유래된 발현 벡터이다. NB 구축물 코딩 서열과 인 프레임(in frame)으로, 벡터는 C-말단 c-myc 태그 및 (His)6 태그를 코딩한다. 파지미드 벡터는 개별 DR5 NB 구축물을 gene3 생성물과 융합 단백질로서 발현하는 파지 입자의 생산을 허용한다.
<표 5>
Figure pct00010
1.4. 선택
0 내지 1 ㎍/ml의 상이한 농도의 짧은 (182개 아미노산) 인간 DR5-Fc 융합 단백질 (알&디 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스, 카탈로그 # 631-T2/CF), 전체-엑토도메인 인간 DR5-Fc 융합 단백질 (인간 IgG1 Fc와 융합된 인간 DR5 아미노산 56 내지 213) 및 비오티닐화된 짧은 (133개 잔기) 재조합 인간 DR5 (페프로테크, 미국 뉴저지주 록키 힐, 카탈로그 # 310-19)를 각각 플레이트 및 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 상에 고정시켰다. 1% 카세인을 보충한 PBS를 사용하여 차단하였다. 상기 언급된 3가지 pAX50 라이브러리로부터 제조된 파지를 첨가하고 30분 동안 인큐베이션하였다 (0.1% 카세인 및 0.1% 트윈(tween)20을 보충한 PBS 내에서). 비결합된 파지는 세척 제거하고 (0.05% 트윈20을 보충한 PBS로); 결합된 파지는 트립신 (PBS 중 1 mg/ml)을 첨가하고 37℃에서 30 min 인큐베이션하여 용리시켰다. 용리된 파지로 지수 성장하는 TG-1 세포를 감염시킨 후, 암피실린 함유 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 선택된 생성물로부터 제조된 파지를 상기 설명된 바와 같이 전장 인간 DR5-Fc 융합 단백질 (인간 IgG1 Fc와 융합한 인간 DR5 아미노산 56 내지 213) 및 비오티닐화 짧은 (133개 잔기) 재조합 인간 DR5 (페프로테크, 미국 뉴저지주 록키 힐, 카탈로그 # 310-19)에 대한 제2 선택 라운드에서 투입물로서 사용하였다.
라운드 1 및 2 선택 생성물의 플라스미드 DNA를 제조하고, SfiI 및 BstEII로 소화시키고, 항-DR5 NB 구축물을 코딩하는 DNA 단편을 pAX51 벡터 내로 라이게이션시키고, TG-1 적격 (competent) 세포 내로 형질전환시켰다. pAX50은 LacZ 프로모터, 암피실린 또는 카르베니실린에 대한 내성 유전자, 다중 클로닝 부위 및 gen3 리더 서열을 함유한 pUC119로부터 유래된 발현 벡터이다. NB 구축물 코딩 서열과 인 프레임으로, 벡터는 C-말단 c-myc 태그 및 (His)6 태그를 코딩한다. 카르베니실린 내성 클론을 삽입체의 존재에 대해 분석하고, 양성 클론의 서열을 입증하였다. 관심있는 DR5 NB 구축물을 함유하는 TG-1 세포를 카르베니실린을 보충한 TB 배지 내에서 성장시키고, 발현을 위해 IPTG의 첨가에 의해 유도하였다. 발현을 37℃에서 4시간 동안 계속시켰다. 원심분리 후에, 세포 펠릿을 밤새 동결시킨 후, 1시간 동안 4℃에서 PBS (배양액 부피의 1/10) 내에 재현탁시킨 후, 다시 원심분리하였다. 생성되는 상청액을 주변세포질 추출물로서 사용하였다.
1.5. 스크리닝
주변세포질 추출물 (상기 설명된)을 ELISA에 의해 DR5 결합에 대해 분석하였다. 주변세포질 추출물의 10배 희석액을 짧은 (133개 잔기) 재조합 인간 DR5 (페프로테크, 미국 뉴저지주 록키 힐, 카탈로그 #310-19) 또는 사이노몰거스 DR5-Fc 융합 단백질 (인간 IgG1 Fc 아미노산 56 내지 213, IgG1 NVTS와 융합된 사이노 DR5 아미노산 56 내지 213)로 코팅된 플레이트에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다 (0.1% 카세인 및 0.1% 트윈20을 보충한 PBS 내에서). 비결합된 주변세포질 추출물을 세척 제거하고 (0.05% 트윈20을 보충한 PBS), 결합된 NB 구축물을 마우스 항-myc (로슈, 스위스 바젤, 카탈로그 # 11667149001)에 이어 토끼 항-마우스-알칼리성 포스파타제 (시그마 (Sigma), 미국 미주리주 세인트루이스, 카탈로그 # A-1902)를 사용하여 검출하였다.
또 다른 실험 세트에서, 인간 DR5 (Colo205) 또는 사이노몰거스 DR5 (CMV 프로모터의 하류에 전장 사이노DR5 유전자를 보유하는 발현 벡터로 형질감염된 CHO-K1 세포)를 발현하는 세포주를 주변세포질 추출물 (10% 소 태아 혈청을 보충한 PBS 내에 재현탁된)에 노출시켰다. 세포-결합된 DR5에 대한 NB 구축물의 결합은 마우스 항-myc (모노클로날 항체, 클론 9E10 ATCC (영국 테딩턴) 번호 CRL-1729는 마우스에서 복수 (ascite)로서 생산하고, 표준 친화도 크로마토그래피를 이용하여 사내 정제하였다)에 이어 항-마우스 IgG-피코에리트린 (잭슨 이뮤노리서치 래보래토리스 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브), 카탈로그 # 115-115-164)를 사용하여 검출하였다. 죽은 세포를 TO-PRO-3 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes, 미국 캘리포니아주 칼스바드), 카탈로그 # T3605)로 대조염색하였다. 결과를 표 6에 제시한다.
<표 6>
Figure pct00011
DR5에 대한 NB 구축물의 결합은 비아코어 3000 기기 상에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가하였다. 결합의 특이성은 주변세포질 추출물의 희석액을 270 RU 짧은 (133개의 잔기) 재조합 인간 DR5 (페프로테크, 미국 뉴저지주 록키 힐, 카탈로그 # 310-19)으로 코팅된 CM5 센서 칩 위로 통과시킴으로써 분석하였다. 해리상을 분석하고, 상응하는 오프-속도 (koff)를 표 7 및 표 8에 제공한다. 표 7은 FACS (평균 계수 형광)에 의한 세포-결합된 DR5에 대한 단량체 NB 구축물의 결합에 대한 결과를 보여준다. 표 8은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 오프-속도에 대한 결과를 보여준다. 서열은 표 1-4에 제공한다.
<표 7>
Figure pct00012
<표 8>
Figure pct00013
2. 실시예 II
2.1. 삼량체화
항-DR5 NB 구축물을 코딩하는 DNA 단편을 MfeI 및 BstEII로 소화시키고, 링커 서열과 함께 pAX73, pAX74 및 pAX75 벡터 내로 클로닝하였다. 이들을 TG-1 적격 세포 내로 형질전환시키고, 카나마이신 내성 클론을 삽입체의 존재에 대해 분석하고, 서열 입증하였다. 생성되는 구축물을 SfiI, BpuAI 및 NotI로 소화시키고, NB 구축물 함유 단편을 4-점 라이게이션을 통해 SfiI-NotI 소화된 pAX51 벡터 내로 클로닝하였다. 양성 카르베니실린 내성 클론, 즉, 3가 CMYC-HIS6-태깅된 NB 구축물을 코딩하는 것 (각각의 NB 구축물 빌딩 블록은 링커 서열에 의해 다음의 것에 융합됨)을 다시 서열 입증하였다. pAX73, pAX74, pAX75 및 pAX83은 카나마이신 또는 네오마이신에 대한 내성 유전자, 다중 클로닝 부위를 함유하는 pUC-유래된 클로닝 벡터이고, NB 구축물 코딩 서열과 함께, 이들 벡터는 GlySer 링커 서열을 코딩한다.
2.2. 사량체화
항-DR5 NB 구축물을 코딩하는 DNA 단편을 각각 M13Rev (서열 78) 및 Rev_30GlySer (서열 79) 또는 For_GlySer35 (서열 80) 및 M13Fwd (서열 77)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. Rev_30GlySer 및 For_GlySer35 모두는 링커 서열을 코딩한다 (표 5의 프라이머 서열). PCR 생성물을 MfeI, BamHI 및 BstEII로 소화시키고, 두 단편을 벡터 코딩된 링커 서열과 함께 3-점 라이게이션을 통해 pAX75 및 pAX83 내에 함께 클로닝하였다. 이들을 TG-1 적격 세포 내로 형질전환시키고, 카나마이신 내성 클론을 2가 NB 구축물 삽입체의 존재에 대해 분석하고, 서열 입증하였다. 이어서, 양성 2가 클론을 SfiI, BpuAI 및 NotI로 소화시킨 후, NB 구축물 함유 단편을 SfiI-NotI 소화된 pAX51 벡터 내로 클로닝하였다. 4가 NB 구축물을 코딩하는 양성 카르베니실린 내성 클론 (각각의 NB 구축물 빌딩 블록은 링커 서열에 의해 다음의 것에 융합됨)을 다시 서열 입증하였다.
2.3. 오량체화
제4 GlySer 링커 서열 및 제5 NB 빌딩 블록을 코딩하는 합성 유전자는 게네아트 아게 (GeneArt AG, 독일 레겐스부르크)에서 주문하였다. 이어서, 이들 단편을 HgaI 및 NotI로 소화시키고, BstEII-NotI 소화된 4가 NB 구축물 내로 라이게이션시켰다.
2.4. 소규모 발현
관심있는 다가 항-DR5 NB 구축물을 함유하는 TG-1 세포를 TB 배지 + 100 ㎍/ml 카르베니실린을 담은 배플이 달린 (baffled) 진탕기 플라스크 내에서 성장시키고, 1 mM IPTG의 첨가에 의해 발현을 유도하였다. 37℃에서 4시간 동안 계속 발현시켰다. 세포를 수집한 후, 주변세포질 추출물을 제조하고, HIS6-태깅된 NB 구축물을 PBS 중에서 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 (HisTrap FF Crude, 지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))에 이어 겔 여과 크로마토그래피 (수퍼덱스 (Superdex) 75 HR16/10, 지이 헬쓰케어)에 의해 정제하였다.
3. 실시예 III
3.1. 비아코어 상의 결합
비아코어 CM5 센서 칩을 짧은 (182개 아미노산) 인간 DR5-Fc 융합 단백질 (알&디 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스, 카탈로그 # 631-T2/CF) 또는 사이노몰거스 DR5-Fc 융합 단백질 (아미노산 56 내지 213, IgG1 NVTS)로 코팅하였다. 이어서, 상이한 농도 (1 내지 100 nM)의 1가 및 다가 항-DR5 NB 구축물을 결합 상호작용의 운동학 분석을 위해 칩 위로 부유시켰다. 모든 다가 항-DR5 NB 구축물은 인간 및사이노몰거스 DR5에 결합한다 (표 9).
<표 9>
Figure pct00014
3.2. FACS 상의 결합
또 다른 실험 세트에서, 인간 (Colo205) 또는 사이노몰거스 (CMV 프로모터의 하류에 전장 사이노DR5 유전자를 보유하는 발현 벡터로 형질감염된 CHO-K1 세포) DR5를 발현하는 세포주를 1 nM의 다가 항-DR5 NB 구축물 (10% 소 태아 혈청을 보충한 PBS 내에 재현탁된)에 노출시켰다. 세포-결합된 DR5에 대한 NB 구축물의 결합은 마우스 항-myc (모노클로날 항체, 클론 9E10 ATCC (영국 테딩턴) 번호 CRL-1729는 마우스에서 복수로서 생산하고, 표준 친화도 크로마토그래피를 이용하여 사내 정제하였다)에 이어 항-마우스 IgG-피코에리트린 (잭슨 이뮤노리서치 래보래토리스 (미국 펜실베니아주 웨스트 그로브), 카탈로그 # 115-115-164)를 사용하여 검출하였다. 죽은 세포는 TO-PRO-3 (몰레큘라 프로브스, 미국 캘리포니아주 칼스바드, 카탈로그 # T3605)로 대조염색하였다. 모든 다가 NB 구축물은 세포 결합된 인간 및 사이노몰거스 DR5에 특이적으로 결합한다. 짧은 형태 및 긴 형태의 DR5의 각각에 대한 NB 작용제의 결합은 대략 서로 동등하며, 이것은 모든 에피토프가 2가지 형태 사이에 공통으로 보유됨을 제안한다.
또 다른 실험에서, 겉보기 결합 상수를 세포 결합된 인간 및 사이노몰거스 DR5에 대한 10 내지 0.005 nM 4가 항-DR5 NB 구축물의 FACS (상기한 바와 같이) 상의 포화 결합 실험으로부터 추정한다. 겉보기 결합 상수는 그래프패드 프리즘 5 (GraphPad Prism 5, 그래프패드 소프트웨어 (GrafPad Software, 미국 캘리포니아주 샌 디에고))을 이용하여 계산하였다.
3.3. DR5 -특이성
DR5 특이성을 시험하기 위해 일군의 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원을 선택하였다 (표 10). TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 도메인을 pBadThioTopo 내로 클로닝하고, 이. 콜라이 균주 TOP10 (인비트로젠 #C4040-03) 내로 형질전환시켰다. 제조자의 프로토콜에 따라 단백질을 발현시켰다. ELISA 스크리닝을 위해 세포 용해물을 수집하였다. 25 ㎕의 20% BSA를 용해물 10 mL당 첨가하였다. His 포획 플레이트 (시그마 #S-5688)를 100 ㎕의 용해물로 코팅하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 나머지 용액을 흡인시키고, 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (PBST)로 3회 세척하였다. 1차 항체를 다음과 같이 차단 완충제 (10% FBS를 함유하는 PBS) 내에 희석하였다; LBY135 (양성 대조군, 항-DR5 항체, 노바티스 아게 (Novartis AG))를 0.24 mg/mL로 희석하고, 토끼 항-V5 (아브캄 (Abcam) #Ab9116-100)를 1:5000 희석하였다. 희석된 1차 항체 100 ㎕을 웰마다 첨가하였다. 검정 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체 (V5와 함께 인큐베이션하는 웰에 대해 염소 항-토끼 IgG-HRP (잭슨 이뮤노리써치 래보래토리스 #111-035-046) 및 LBY135와 함께 인큐베이션하는 웰에 대해 염소 항-인간 IgG-HRP (잭슨 이뮤노리써치 래보래토리스 #109-035-098))를 5% FBS 및 0.025% 트윈을 함유하는 PBS 내에 1:5000 희석하였다. 100 ㎕의 2차 항체를 적절한 웰에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 100 ㎕의 슈어 블루 (Sure Blue) (KPL #52-00-03)을 첨가하고, 일단 발색되면 플레이트를 650 nm의 흡광도에서 판독하였다.
<표 10>
Figure pct00015
모든 NB 구축물은 DR5에 특이적으로 결합하지만, 다른 TRAIL 및 TNF 수용체 패밀리 구성원에 대해서는 그렇지 않다. 예를 들어, 도 1을 참조한다.
3.4. 비아코어 에피토프 맵핑
짧은 (133개 잔기) 재조합 인간 DR5 (페프로테크, 미국 뉴저지주 록키 힐, 카탈로그 #310-19)에 대한 비아코어 오프-속도 스크리닝 (표 8)으로 모든 항-DR5 NB 구축물이 DR5의 세포외 도메인에 결합하지만 29개 잔기의 선택적 스플라이싱된 영역 (아미노산 잔기 185 내지 231)에 대해서는 그렇지 않음을 밝혔다.
또 다른 실험에서, 비아코어 CM5 센서 칩을 1가 항-DR5 NB 구축물 (230 내지 520 RU)로 코팅하였다. 이어서, 500 nM의 짧은 (133개 잔기) 재조합 인간 DR5 (페프로테크, 미국 뉴저지주 록키 힐, 카탈로그 # 310-19)를 포화에 도달할 때까지 칩 위로 부유시켰다. 이 시점에서, 50 nM 인간 TRAIL (알&디 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스, 카탈로그 # 375-TEC/CF)을 칩 위로 부유시키고, 결합 신호의 증가를 이용하여 TRAIL 에피토프에 비해 상이한 에피토프 클래스 내에 NB 구축물을 분류하였다 (표 11).
<표 11>
Figure pct00016
3.5. 시험관내 세포 생존
세포를 실험에 앞서 대수 성장기로 유지하였다. 검정 일에, 세포를 96-웰 플레이트 (코닝 인크. (Corning Inc., 미국 매사추세츠주 로웰), Cat#3917)에 5,000 - 20,000개 세포/웰로 전달한 후, 연속 희석시킨 항-DR5 NB 구축물을 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 24 내지 72시간의 인큐베이션 후에, 루시퍼라제-기반 ATP 정량 키트 (셀 타이터 글로 (Cell Titer Glo), 프로메가 (Promega, 미국 위스콘신주 매디슨), Cat#G7571))를 사용하여 생존하는 세포의 상대적인 수를 정량하고, 발광 플레이트 판독기 (플루오로스칸 아센트 FL (Fluoroskan Ascent FL), 써모 일렉트론 (Thermo Electron, 미국 매사추세츠주 월담)) 상에서 판독하였다.
3가 항-DR5 NB 구축물의 패널을 Colo205 세포를 사용하는 세포 생존 검정에서 스크리닝하였다. 모든 3가 구축물이 상기 검정에서 생물학상 활성이 아닌 그의 1가 대응물 (데이터를 제시하지 않음)과 대조적으로 Colo205에 대해 아폽토시스를 유도하였다 (표 12 참조). 비관련 (비-DR5 결합) NB 구축물의 4가 구축물은 아폽토시스를 유도하지 않았다.
<표 12>
Figure pct00017
또 다른 실험에서 (표 13), 선택된 3가 항-DR5 NB 구축물을 종양 및 정상 세포주의 패널에 대한 세포 생존 검정으로 스크리닝하였다.
<표 13>
Figure pct00018
또 다른 실험에서 (표 14), 선택된 4가 항-DR5 NB 구축물을 종양 및 정상 세포주의 패널에 대한 세포 생존 검정으로 스크리닝하였다.
<표 14>
Figure pct00019
다량체의 계층 증가가 효력 및 효능을 증가시킴을 보여주는 그래프를 도 6a, 6b 및 6c에 제시하고, 여기서 삼량체, 사량체 및 오량체 11H6 및 4E6 NB 구축물은 시험관 내에서 처리된 Colo205 및 H226 종양 세포에 대해 각각 증가하는 효능을 가진다.
다가 항-DR5 NB 구축물은 종양 세포주에 대해 아폽토시스-유도 활성을 보이지만, 정상 (건강한) 세포주에 대해서는 그렇지 않다. 일반적인 경향은 다량체 NB 조성 내의 증가된 수의 하위단위에 따라 증가한 아폽토시스-유도 활성이 보인다는 것이다. 사량체에서 오량체 형태의 NB로 증가시키면 세포주에 따라 달성된 IC50의 저하 또는 최대 세포 사멸의 증가에 의해 예시되는 바와 같이 세포 사멸 검정에서 효능의 추가의 증가의 증거를 제공한다.
3.6. 가교결합
또 다른 실험에서, cMYC 태그를 함유하는 다가 NB 구축물 (10 ㎍)를 실온에서 30분 인큐베이션 동안 그의 cMYC-태그를 통해 1.5 ㎍ 내지 150 ㎍의 마우스 항-myc (모노클로날 항체, 클론 9E10 ATCC (영국 테딩턴) 번호 CRL-1729는 마우스에서 복수로서 생산하고, 표준 친화도 크로마토그래피를 이용하여 사내 정제하였다)와 가교결합시켰다. 이어서, 가교결합된 NB 구축물을 시험관내 세포 생존 검정으로 평가하였다. 증가된 가교결합은 개선된 효능 및 효력과 상호관련되었다 (표 15-16 참조). 표 15는 주르카트 세포에 대한 상이한 양의 항체와 가교결합된 3가 항-DR5 NB 구축물의 시험관내 효능 (IC50 (M))을 제공한다. 표 16은 주르카트 세포에 대한 상이한 양의 항체와 가교결합된 4가 항-DR5 NB 구축물의 시험관내 효능 (% 죽은 세포)을 제공한다. 일반적인 경향은 태깅된 NB 다량체의 증가된 양의 가교결합에 의해 보다 많은 세포가 죽는다는 것이다.
<표 15>
Figure pct00020
<표 16>
Figure pct00021
3.7. 혈청 안정성
3.7.1. ELISA 에서 NB 구축물 및 DR5 결합
NB 구축물을 100% 신선한 인간 혈청과 함께 37℃에서 24시간 동안 예비-인큐베이션하였다. 편평 바닥 96-웰 ELISA 플레이트 (코스타 (Costar, 미국 매사추세츠주 캠브리지), 카탈로그 No.3590)를 4℃에서 50 ㎕ DR5-Fc 융합 단백질 (DR5 아미노산 56 내지 213)로 PBS 내에 1 ㎍/ml에서 밤새 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 1시간 동안 PBS 중의 2% BSA (깁코, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드, Cat#11018-025) 300 ㎕로 차단하고 3회 세척하였다. NB 구축물 샘플을 10% 인간 혈청을 함유하는 PBS 완충제 내에 연속 희석한 후, ELISA 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후에, 1:5000 HRP 접합된 항-myc 폴리클로날 항체 (인비트로젠: 460709) 또는 1:7000 토끼 항-VHH 항체에 이어 1:15000 HRP 접합된 항-토끼 IgG (잭슨 이뮤노리서치 래보래토리스, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브, Cat#115-035-072)을 플레이트 내에 첨가하였다. 최종 세척 세트 후에, 100 ㎕/웰의 TMB 마이크로웰 (Microwell) 퍼옥시다제 기질 (바이오에프엑스 (BioFX, 미국 메릴랜드주 오잉스 밀스), 카탈로그 No.TBNP-1000-01)을 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 100 ㎕ 중지 시약 (바이오에프엑스 (미국 메릴랜드주 오잉스 밀스), Cat#LSTP-0100-01)을 사용하여 중지시켰다. 생성물의 비색 검출은 스펙트라맥스 (SpectraMax) M5 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일))에서 450 nm에서 수행하였다. 데이터는 사용자 매뉴얼에 따라 소프트맥스 프로 (SoftMax Pro) 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시즈, 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 분석하였다.
인간 혈청은 항-Myc 또는 항-NB 구축물-항체에 의해 검출된, DR5에 대한 NB 구축물 삼량체 또는 사량체 결합을 거의 저해하지 않는다.
3.7.2. 세포 생존 검정에서 NB 구축물 기능
세포 생존 검정을 또한 약 10 - 15% 인간 혈청 알부민의 존재 및 부재 하에 수행하였다. 4가 항-DR5 NB 구축물은 10% 소 태아 혈청의 존재 하에 대조 검정에 비해 그의 시험관내 효능을 유지하였다.
4. 실시예 IV
4.1. 단일 용량 생체내 3가 항- DR5 NB 구축물
이계교배시킨 무흉선 (nu/nu) 암컷 마우스 (할란 스프라그 돌리 (Harlan Sprague Dawley, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 마취시키고, 1 x 106개 Colo205 세포를 각각의 동물의 우측 겨드랑이 (측면) 영역 내로 s.c. 이식하였다. 종양을 200 mm3의 크기까지 성장시킨 후, 투여를 개시하였다. NB 구축물은 PBS 중의 용액으로서 제형화하고, 볼루스 i.v. 주사에 의해 200 ug/마우스로 단일 용량으로 투여하였다. 종양 샘플은 1h, 2h, 4h 및 8h에서 동물의 군으로부터 수집하였다 (시점당 1개의 군, 군당 3마리 동물).
조직 샘플의 일부를 카스파제3의 면역조직화학적 (IHC) 염색을 위해 사용하였다. 조직을 즉시 10% 중성 완충 포르말린 (NBF, 피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific, 미국 펜실베니아주 피츠버그), 카탈로그 No.SF100-20) 내에 넣고, 처리하고, 파라핀 블록 내에 포매하였다. 4.0 ㎛의 절편을 수퍼프로스트 플러스 (SuperFrost Plus) 하전 슬라이드 (피셔 사이언티픽, 카탈로그 No.12-550-15)에 절단하였다. 절편을 크실렌 내에서 파라핀제거하고 (5분 x 2), 점진적 농도의 알콜 (5분 동안 100% 알콜, 2분 동안 95% 알콜, 2분 동안 70% 알콜, 및 5분 동안 탈이온수)로 수화시켰다. 수화시킨 절편을 슬라이드를 시트르산 완충제 (0.01 M, pH 6.0, 바이오제넥스 (BioGenex, 미국 캘리포니아주 샌 라몬), 카탈로그 N0.HK080-9K) 내에서 10분 동안 마이크로파 처리함으로써 수행하는 항원 부활로 처리하였다. 슬라이드를 탈이온수로 5분 동안 세척한 후 자동염색기 (다코 사이토메이션 (Dako Cytomation))의 염색 랙 상에 놓았다. 다음 단계들을 실온에서 다코 자동화 시스템을 사용하여 수행하였다. 각각의 단계 사이에서, 슬라이드를 세정 완충제 (옵티맥스 (OptiMax) 세척 완충제, 바이오제넥스, 카탈로그 No.HK583-5K)로 3회 세정하였다. 내인성 퍼옥시다제는 슬라이드를 과산화수소 (다코, 카탈로그 No.S2001)와 함께 10분 동안 인큐베이션함으로써 차단하였다. 비특이적 항원 반응은 10분 동안 블록 세럼 (Block Serum; 다코, 카탈로그 No.X0909)에 의해 차단하였다. 슬라이드를 절단된 카스파제3 토끼 폴리클로날 항체 (셀 시그널링 테크놀로지 (Cell Signaling Technology, 미국 캘리포니아주 비벌리), 카탈로그 No.9661)와 함께 60분 동안 인큐베이션한 후, 세정하고 퍼옥시다제 접합된 항체 (다코 엔비젼 시스템 (DAKO Envision 시스템), 카탈로그 No.K4003)에 30분 동안 노출시켰다. 검출을 위해, DAB (3,3'-디아미노벤지딘) 용액 (다코 사이토메이션, 카탈로그 No.K3468)을 2분 동안 적용하였다. 면역염색된 슬라이드를 해리스 헤마톡실린 (Harris Hematoxylin) (서지패쓰 (SurgiPath), 카탈로그 No.01560)로 가볍게 대조염색하고, 일련의 증가하는 알콜 농도 (70%, 95% 및 100% 알콜, 각각 1분) 및 크실렌 (5분 x 2)을 통해 탈수시키고, 커버글라스 (레이카 (Leica))를 장착하였다.
슬라이드를 아페리오 (Aperio) 시스템 (아페리오 테크놀로지스, 인크. (Aperio Technologies, Inc. 미국 캘리포니아주 비스타))을 사용하여 디지털화 슬라이드 데이터베이스로 스캐닝하고, 최적화된 양성 픽셀 계수 알고리즘 (아페리오)을 이용하여 영상 분석을 수행하였다. 영상화 시스템에 의해 제공된 도구를 사용함으로써 "표시한 (marked out)" 괴사성 영역 및 숙주 조직 부분을 제외한 전체 절편을 영상 분석을 위해 사용하였다. 모든 다가 항-DR5 NB 구축물은 카스파제3 활성화를 유도하였다.
조직 샘플의 일부를 T-per 완충제 (피어스 (Pierce, 미국 일리노이주 록포드), 카탈로그 No. 78510)와 혼합한 후, 즉시 티슈 라이서 (tissue lyser) (퀴아젠, 카탈로그 No. 85210) 내에서 균질화하였다. 조직 용해물의 상청액을 수집하고, 그의 단백질 농도를 표준 BCA 검정 (피어스, 카탈로그 No. 1856210)을 이용하여 결정하였다. 조직 용해물을 NB 구축물 및 항체 농도 + 종양에서 카스파제3 활성을 검토하기 위해 다음 검정에서 사용하였다.
NB 구축물 농도를 ELISA로 결정하였다. ELISA 플레이트 (넝크 (Nunc, 미국 뉴욕주 로체스터), 카탈로그 No. 439454)를 4℃에서 100 ㎕ 인간 DR5-Fc 융합 단백질 (DR5 아미노산 56 내지 213)로 PBS 내에 1 ㎍/ml에서 밤새 코팅한 후, PBS 내에서 1% BSA (깁코, 카탈로그 No.1018-025)로 실온에서 1시간 동안 차단한 후, 3회 세척하였다. 연속 희석한 혈청 또는 조직 용해물 샘플을 ELISA 플레이트로 함께 전달하고, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 세척 후에, 1/22500 희석시킨 항-VHH를 ELISA 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 더 세척한 후, 1시간 동안 100 ㎕/웰의 1/20000 희석된 HRP-염소-항-토끼 (피어스, 카탈로그 No. 31462)와 함께 인큐베이션하였다. 최종 세척 세트 후에, 100 ㎕/웰의 TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 (바이오에프엑스 (미국 메릴랜드주 오잉스 밀스), 카탈로그 No. TMBW-0100-01)을 10분 동안 첨가한 후, 100 ㎕ 중지 용액 (바이오에프엑스, 카탈로그 No. LSTP-1000-01)을 사용하여 반응을 중지시켰다. 생성물의 비색 검출은 스펙트라맥스 M5 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈, 미국 캘리포니아주 서니베일)에서 450 nm에서 수행하였다. 데이터는 사용자 매뉴얼에 따라 소프트맥스 프로 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시즈, 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 4-파라미터 모델로 분석하였다. 모든 NB 구축물은 혈청 및 종양 조직에서 빠른 청소율 및 신속한 조직 투과율을 보였다.
종양 조직 용해물에서 카스파제 3/7 활성을 사용자 매뉴얼에 따라 카스파제 글로 검정 (프로메가 카탈로그 no. G8092)에 의해 평가하였다. 발광을 스펙트라맥스 M5 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈, 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 판독하였다. IHC 결과와 일치하게, 모든 NB 구축물은 8시간 이내에 카스파제 3을 활성화시켰다.
4.2. 단일 용량 생체내 4가 항- DR5 NB 구축물
이계교배시킨 무흉선 (nu/nu) 암컷 마우스 (할란 스프라그 돌리, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 마취시키고, 1 x 106개 Colo205 세포를 각각의 동물의 우측 겨드랑이 (측면) 영역 내로 s.c. 이식하였다. 종양을 200 mm3의 크기까지 성장시킨 후, 투여를 개시하였다. NB 구축물은 PBS 중의 용액으로서 제형화하고, 볼루스 i.v. 주사에 의해 200 ug/마우스로 단일 용량으로 투여하였다. 혈청 및 종양 조직은 다음 시점에서 동물의 군으로부터 수집하였다 (시점당 1개의 군, 군당 3마리 동물): 0.25h, 0.5h, 1h, 2h, 4h, 8h, 24h 및 48h. 종양 조직 샘플을 T-per 완충제 (피어스, 미국 일리노이주 록포드, 카탈로그 No. 78510)와 혼합한 후, 즉시 티슈 라이서 (퀴아젠, 카탈로그 No. 85210) 내에서 균질화하였다. 조직 용해물의 상청액을 수집하고, 표준 BCA 검정 (피어스, 카탈로그 No. 1856210)를 이용하여 그의 단백질 농도를 결정하였다.
혈청 및 조직 용해물 내의 NB 구축물 농도를 상기한 바와 같이 ELISA로 결정하였다. 평균 혈청 농도-시간 프로파일을 윈놀린 프로페셔널 (WinNonlin Professional) 소프트웨어 버전 5.1 (파사이트 코퍼레이션 (Pharsight Corporation, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰)) 내에서 모델 7을 이용하여 2-구획 약동학 분석으로 처리하였다. 각각의 NB 구축물에 대해, 농도-시간 프로파일을 반복적 재가중 1/y.y (여기서, y는 예측된 농도이다)를 사용하여 피팅하였다. 상이한 NB 구축물의 평균 체류 시간 (MRT, 표 17)은 2.6 내지 13.5hr이었다. 상이한 NB 구축물의 분포 용적 (Vss)은 20 g 마우스의 혈장 부피 (대략 1.5 ml)보다 2-35배 더 크고, 이것은 혈관 공간 외부의 광범한 분포를 나타낸다. 상이한 NB 구축물의 총 청소율은 뮤린 사구체 여과율 (대략 15 ml/hr)보다 적어도 5배 더 적고, 따라서, 모든 4가 구축물은 신장의 수준에서 뇨 여과 및 후속 배출을 유의하게 감소시키는데 고도로 효과적이다.
<표 17>
Figure pct00022
종양 조직 용해물에서 카스파제 3/7 활성을 사용자 매뉴얼에 따라 및 상기 설명된 바와 같이 카스파제 글로 검정 (프로메가 카탈로그 no. G8092)에 의해 평가하였다. 모든 사량체는 유사한 PD 프로파일을 갖는다 (도 2).
상이한 NB 구축물의 약리학적 효과의 효능 (EC50), 효력 (Emax) 및 시간-경과를 설명하기 위해 간접적 반응 모델을 개발하였다. 이 모델은 DR5 수용체 결합 후 향상된 생산 속도로부터 생기는 세포성 카스파제 수준의 변화 (즉, 세포성 카스파제의 증가 (build-up)의 자극)를 설명한다. 세포성 카스파제의 속도 (반응, R)는 다음 식에 의해 설명된다.
Figure pct00023
여기서, kin은 0차 합성 속도이고, R은 카스파제 수준이고, Emax는 최대 자극이고, C는 종양에서 NB 구축물 농도이고, n은 반응 형상 인자이고, kout은 카스파제 1차 제거 속도 상수이다.
종양 농도-시간 프로파일을 먼저 농도-시간 데이터의 합당한 특성화을 제공하기 위해 최소로 필요한 약동학적 함수에 피팅한다 (윈놀린 소프트웨어 버전 5.1 내의 2-구획 모델 3 또는 모델 11). 이어서, 각각의 NB 구축물에 대해 얻어진 약동학적 함수를 식 1에 대한 입력 함수로서 사용한다. 얻어진 약동학적 파라미터를 표 18에 나열한다.
<표 18>
Figure pct00024
4.3. 이종이식편 모델을 사용하는 생체내 시험
이계교배시킨 무흉선 (nu/nu) 암컷 마우스 (할란 스프라그 돌리, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))에 100 ml의 총 부피로 100% 행크 (Hanks) 균형 염 용액 (HBSS) 내에 현탁시킨 약 1-2 x 106개의 COLO205 종양 세포를 우측 겨드랑이 (측면) 영역 내로 s.c. 이식하였다. 종양을 200 mm3까지 성장시킨 후, 투여를 개시하였다. NB 구축물은 PBS 중의 용액으로서 제형화하고, 매주 1회 또는 월요일, 수요일 및 금요일에 3회로 투여하였다. 두 치료를 4주 동안 i.v. 투여하였다. 종양을 측정하고, 개별 동물 체중을 매주 1 또는 2회 기록하였다. 실험은 초기 투여로부터 7주 후에 끝냈다. 항-종양 활성을 %T/C (처리군 대 비히클 대조군에 대한 종양 부피의 변화를 비교함)로서 표현한다. 퇴행은 다음 식을 이용하여 계산한다: (1-T/T0) x 100% (여기서, T는 실험의 끝에서 처리군에 대한 평균 종양 부피이고, T0은 실험의 시작에서 평균 종양 부피이다). 결과의 통계적 유의성은 일원 (one-way) ANOVA 시험 사후 투키 (Tukey) 분석을 이용하여 균일하게 평가하였다. 도 3에 제시된 바와 같이, NB 구축물은 Colo205 종양 모델에서 종양 정지 또는 퇴행을 유도하였다. NB 구축물의 오량체 형태는 사량체 형태보다 더 강한 효력을 갖는 경향이 있었다.
5. 실시예 V
5.1. 4 E6 의 인간화
5.1.1. 4 E6 인간화 변이체의 특성화
모 4E6의 단백질 서열을 인간 VH3-23 (DP-47) 및 JH5 배선에 정렬시켰다 (표 19). 인간 배선 서열에 비해 아미노산 차이는 문자로 나타내고, 동일한 아미노산은 점으로 나타낸다. 밑줄로 표시한 프레임워크 영역 내의 아미노산 차이는 인간 대응물로의 전환을 위해 선택된 반면, 다른 것들은 건드리지 않고 두었다.
<표 19>
Figure pct00025
정제된 1가의 물질을 4E6, 4E6-Hu 및 변이체 4E6hx (여기서, 4E6hx는 4E6-Hu과 동일한 인간화 FR 영역을 갖지만, 4E6의 CDR3을 가진다)로부터 생산하였다. 이어서, 이들 구축물을 인간 및 사이노몰거스 DR5에 대한 결합에 대해 많은 검정, 즉, FACS 포화 결합 (겉보기 Kd) 및 SPR 운동학으로 특성화하였다 (표 20 참조). 추가로, 변이체를 열 이동 (thermal shift) 검정으로 또한 분석하였다 (표 20). 5 ㎕의 각각의 정제된 1가 항-DR5 NB 구축물 (80 ㎍/ml)을 10 ㎕의 완충제 (100 mM 포스페이트, 100 mM 보레이트, 100 mM 시트레이트, 115 mM NaCl, 3.5 내지 9의 상이한 pH에서 완충된) 내에서 5 ㎕의 형광 프로브 사이프로 오렌지 (Sypro Orange) (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드, 카탈로그 # S6551) (최종 농도 10x)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 라이트사이클러 (LightCycler) 480II 기기 (로슈, 스위스 바젤) 내에서 37℃에서 90℃까지 4.4℃/s로 가열하고, 그 후 2.2℃/s로 37℃로 냉각시켰다. 열-유도된 언폴딩 시에, 단백질의 소수성 패치가 노출되고, 여기에 사이프로 오렌지가 결합하여 형광 강도를 증가시킨다. 형광 강도 곡선의 1차 미분의 변곡점이 용융 온도 (Tm)의 측정치로서 역할을 한다. 보다 상세한 내용에 대해서는 문헌 [Ericsson et al. 2006, Annals of Biochemistry, 357: 289-298)을 참조한다. 종합하면, 4E6-hx 변이체는 4E6 모체와 유사한 친화도를 보인다. 추가로, 상기 변이체는 4E6 모체에 비해 Tm이 7% 증가한다.
<표 20A>
Figure pct00026
<표 20B>
Figure pct00027
5.1.2. 인간화 4E6의 N-글리코실화 녹-아웃 변이체
피. 파스토리스 내에서 4E6-hx의 발현에 이은 SDS PAGE 및 항-VHH (폴리클로날 항-나노바디?) 웨스턴 (western)에 의해 이. 콜라이가 발현 숙주인 경우에 단지 하나의 16 kDa 생성물에 비해 2가지 생성물 (16 kDa 및 21 kDa)의 존재가 밝혀졌다. PNGaseF를 사용한 처리 및 콘카나발린을 사용한 염색에 의해 21 kDa 생성물이 16 kDa 생성물의 N-글리코실화된 형태임이 밝혀졌다. PNGaseF를 사용한 단백질로부터 N-글리코실화 모이어티의 절단은 제조자의 권장사항에 따라 수행하였다 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 입스위치), 카탈로그 # P0704S). PNGaseF는 N-연결된 당단백질로부터 고 만노스, 하이브리드, 및 복합 올리고당의 최내부 GlcNAc 및 아스파라긴 잔기를 절단하는 아미다제이다. 단백질 N-글리코실화의 검출은 콘카나발린 A (α-D-만노스, α-D-글루코스를 함유하는 당단백질을 인식하는 렉틴)를 사용하는 웨스턴 검정으로 수행하였다. 블로팅된 단백질을 차단 완충제 (PBS, 0.05% 트윈-20, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2)로 2시간 동안 차단시킨 후, 차단 완충제 내에서 4℃에서 5 ㎍ ml의 콘카나발린 A 비오틴 접합체 (시그마, 미국 미주리주 세인트루이스, 카탈로그 # C2272)와 함께 ON 인큐베이션하였다. 검출은 기질로서 DAB 및 차단 완충제 내의 엑스트라비딘-HRP 접합체의 1/2000 희석액을 사용하여 수행하였다 (시그마, 미국 미주리주 세인트루이스, 카탈로그 # E2886 및 D6815). 쿠마시 (coomassie) 염색된 겔에서 가시적인 36 kDa 밴드가 PNGaseF 효소이다. 인간 DR5에 대한 오프-속도 분석에 의해 피. 파스토리스 생산된 물질 대 이. 콜라이 생산된 물질에 대해 >8배 증가를 밝혔고, 이것은 N-글리코실화가 DR5에 대한 4E6-hu의 결합을 저해함을 제안한다.
잠재적인 N-글리코실화 모티프는 4E6 및 4E6-hx의 CDR3 내에 존재한다 (아미노산 "nrs"- 표 19에 굵은 이탤릭체로 제시됨). 4E6-Hu 변이체 (굵은 대문자로 제시된 교체된 "A" 잔기를 가진 CDR3 - 표 19)를 이. 콜라이 내에서 생성하여 생산시키고, 정제하고, FACS 포화 결합 검정 및 SPR 운동학을 이용하여 인간 및 사이노몰거스 DR5에 대한 결합에 대해 분석하였다 (표 20). 4E6-Hu는 4E6-hx에 비해 인간 및 사이노몰거스 DR5에 대해 동일한 결합 특징을 가진다. 피. 파스토리스 내에서 발현 시에, 4E6-Hu 변이체는 단지 16 kDa 생성물만을 생성시킨다. 이것은 글리코실화 모티프의 기능적 녹-아웃을 확정한다.
5.1.3. 4E6-Hu의 시험관내 특성화
정제된 4가의 물질을 야생형 4E6 및 그의 인간화 변이체 4E6-Hu로부터 생산하였다. 이어서, 이들을 Colo205 및 주르카트에서 세포 생존 검정으로 분석하였다 (표 21). 인간화 변이체의 효력 및 효능은 모 4E6 구축물과 비교적 동일하였다.
<표 21>
Figure pct00028
5.2. 11 H6 인간화
5.2.1. 11 H6 인간화 변이체의 특성화
야생형 11H6의 단백질 서열을 인간 VH3-23 (DP-47) 및 JH5 배선에 대해 정렬시켰다 (표 22). 인간 배선 서열에 비해 아미노산 차이는 문자로 나타내고, 동일한 아미노산은 점으로 나타낸다. 밑줄로 표시한 프레임워크 영역 내의 아미노산 차이는 인간 대응물로의 전환을 위해 선택된 반면, 다른 것들은 건드리지 않고 두었다.
<표 22>
Figure pct00029
정제된 1가의 물질을 11H6 및 11H6-Hu에 대해 생산하였고, 이어서 이들을 인간 및 사이노몰거스 DR5에 대한 결합에 대해 많은 검정, 즉, FACS 포화 결합 (겉보기 Kd) 및 SPR 운동학으로 특성화하였다 (표 23). 추가로, 변이체를 열 이동 검정으로 또한 분석하였다 (표 23). 11H6-hu 변이체는 모 11H6 결합 특징을 보유하였다. 이는 또한 모 11H6에 비해 용융 온도가 8% 증가하였다. Tm은 pH 7에서 결정하였다.
<표 23>
Figure pct00030
5.2.2. 11H6-Hu의 시험관내 특성화
정제된 4가의 물질을 모 클론 11H6 및 그의 인간화 변이체 11H6-Hu로부터 생산하였다. 이어서, 이들을 Colo205 및 주르카트에 대한 세포 생존 검정으로 분석하였다 (표 24). 인간화 변이체의 효력 및 효능은 모체와 동일하였다. 효능은 보이는 죽은 세포의 백분율을 나타낸다.
<표 24>
Figure pct00031
5.3. 11 H6 - Hu 및 4 E6 - Hu 사량체 및 오량체의 시험관내 특성화
세포를 약 75% 융합에 도달하도록 96 웰 플레이트 (코스타 # 3903 백색 투명 바닥)에 플레이팅하였다. 세포를 검정 전날에 100 ㎕ 배지 내에 7500-15000개 세포/웰의 범위 (세포주에 따라)로 플레이팅하였다. 검정일에, 배지를 제거하고, 신선한 배지를 첨가하였다. 이어서, 연속 희석시킨 NB 작용제를 대체로 1- 20 nM 출발 농도로 첨가하고 (출발 농도는 세포주에 따라 다를 수 있다), 이어서 일반적으로 150 ㎕의 최종 부피를 위해 10 희석에 걸쳐 3-4배 희석하였다. 이어서, 세포를 CO2 공급된 인큐베이터 내에서 37℃에서 24-72hr 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이팅된 세포 및 셀 타이터 글로 (프로메가 #G7571) 시약을 실온으로 하였다 (약 30 min). 이어서, 50 ㎕의 재구성된 셀 타이터 글로 시약을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2-3분 동안 진탕한 후, 암소에서 10분 동안 평형화하도록 정치한 후, 스펙트로맥스 (Spectromax) 상에서 발광을 판독하였다.
구체적인 예를 표 25에 제공한다.
<표 25>
Figure pct00032
6. 실시예 VI
6.1. 백혈병 환자에 대한 생체외 검정
백혈병 환자에 대한 생체외 검정을 환자가 NB 구축물을 사용한 치료에 반응할 것인지 예측하기 위한 방법으로서 제공하였다. 혈액 샘플을 치료 전의 환자로부터 얻고, 잠재적인 치료 반응을 검정하기 위해 사용하였다. 반응의 정도 및 방향은 치료를 위한 선택 기준으로서 사용한다.
T-세포 백혈병 (T-ALL)은 DR5 자극에 대해 일반적으로 감수성인 것으로 생각된다. T-ALL 샘플을 본 발명의 NB 구축물로 처리하고, 치료에 의해 백혈병 세포의 수가 감소하는지 (또는 아폽토시스를 겪는지) 결정하기 위해 평가하였다. 검정 약물 범위는 본 발명의 NB 구축물을 사용한 생체외 처리를 위해 약 20 nm 내지 약 0.0001 nM이었다.
다른 적응증으로 진단된 환자로부터 세포 샘플을 또한 얻고 유사하게 시험하였다.
6.2. 일반적인 생체외 감수성 검정:
환자가 하나 이상의 NB 작용제에 반응할 것인지 예측하는 것을 돕기 위한 방법으로서 실험실 환경에서 환자 외부에서 종양 샘플을 시험하였다.
혈액 또는 조직으로부터의 1차 환자 종양 물질을 종양 종류에 따라 상기 검정과 유사한 방식으로 처리하였다. 종양을 총 혈액 수집 또는 조직 생검을 통해 제거하고, 0-24시간 동안 적절한 조직 배양 플레이트 내로 플레이팅하였다. 이어서, 종양 시료를 연속 희석에 걸쳐 가변 농도의 NB 작용제(들)로 처리하였다 (예를 들어, 출발 농도는 10 희석에 걸쳐 3-4배 희석된 20 nM일 수 있다). 이어서, 조직 배양 플레이트를 NB 작용제(들)로 24-72 hr 동안 또는 수시간 (1-24) 동안 37℃에서 CO2 공급된 인큐베이터 내에서 처리하였다. 인큐베이션 후에, 플레이팅된 시료를 치료에 대한 시료의 반응을 검출하기 위한 방법을 이용하여 분석하였다. 상기 실시예에서와 같이; 세포 생존력 또는 카스파제 3/7 활성화를 위해 셀 타이터 글로 (프로메가 #G7571), 또는 성장, 사멸, 또는 NB 작용제 처리에 대한 반응을 결정하기 위해 아넥신 (Annexin) V 염색, 또는 세포 계수, 또는 FACS 분석 또는 다른 방법을 제공하였다.
NB 작용제-감수성 세포주 (예를 들어, 주르카트) 또는 NB 작용제-불감성 세포주 (BE13), 또는 PBMC (말초 혈액 단핵 세포, 예를 들어, 건강한 지원자의 혈액으로부터 새로 제조된) 또는 PBMC 내로 스파이킹 (spiking)된 세포 배양액 (세포주)의 조합물을 다양한 농도의 NB 작용제(들)로 3.5시간 동안 37℃에서 CO2 공급된 인큐베이터에서 처리하고, 그 후 카스파제 3/7 활성화를 제조자의 지시에 따라 평가하였다 (프로메가 #G7790).
7. 실시예 VII
7.1. RAF - MEK - ERK 경로 및 DR5 활성의 분석
사멸 수용체 5 (DR5)는 암 약물 발견에서 특히 중요하고, 그 이유는 그의 활성화가 많은 정상 세포를 남겨두면서 암 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도하기 때문이다. DR5 특이적 효능제 구축물은 리간드의 제한, 즉 디코이 수용체, 예컨대 DcR1, DcR2 및 OPG에 대한 결합을 피할 수 있다. DR5 효능제 항체의 임상 개발을 위한 주요 장애는 환자 하위군에서 효능의 예측이 되는 바이오마커를 확인하는데 있어서의 어려움이었다. 200개의 암 세포주로부터의 데이터의 분석에서는 RAS 및 RAF 내의 것을 비롯한 명백한 유전적 돌연변이가 LBY135 (DR5 효능제 항체, 노바티스 아게)에 대한 감수성과 상호관련되지 않음을 나타냈다.
DR5 감작/구조 (rescue)에 기반한 풀링된 (pooled) shRNA를 스크리닝하기 위한 전략이 유전자 교란 (perturbation) 후의 DR5 매개된 아폽토시스를 변형시키는 유전자 또는 경로를 확인하기 위해 사용된다. 스크린을 다양한 계열을 가로질러 7개의 암 세포주에서 수행하고, 통합된 헤어핀 (hairpin)의 솔렉사 (Solexa) 기반 심부 서열결정을 이용하여 shRNA 조성물을 디컨볼루션 (de-convolution)하였다.
공통 감작제 및 구조제의 세트는 공지의 경로 성분으로서 확인되어서, 카스파제 8, 카스파제 3 및 DR5 자체를 표적화하는 shRNA는 상위 구조제이고 BCLxl을 표적화하는 shRNA는 상위 감작제이고, 이것은 스크린의 강건함을 나타낸다. 흥미롭게도, 이들 공통 유전자 세트에 추가로, BRAF-MEK-ERK의 억제는 DR5 매개된 아폽토시스에 대해 반대되는 세포-맥락 (context)-의존적 표현형을 보인다. 구체적으로, BRAF-MEK-ERK 경로의 억제는 DR5 매개된 아폽토시스에 대해 Miapaca2 세포를 감작시키지만, 그로부터 Colo205 세포를 구조한다.
이들 반대 표현형은 카스파제 8 및 카스파제 9 활성의 상이한 운동학과 잘 상호관련되지만, DR5 발현 수준과 독립적인 것으로 보인다. 경로 해체는 내인성 아폽토시스 억제제 중 2개인 cFLIP 및 cIAP1이 DR5 매개된 아폽토시스 및 BRAF-MEK-ERK 경로 사이의 교차-대화 (cross-talk)를 매개함을 보여준다. Miapaca2 세포에서, U0126 (MEK 억제제) 및 DR5 항체의 조합은 cFLIP 및 cIAP1 단백질의 분해를 가속화하는 한편, colo205에서 cFLIP 및 cIAP1 mRNA는 모두 상향-조절된다. 이와 일치하게, shRNA 또는 화학적 억제에 의한 cFLIP 또는 cIAP1의 억제는 Colo205 세포에서 구조 표현형을 제거하고, DR5 매개된 아폽토시스에 대해 Miapaca2를 추가로 감작시킨다. MEK 억제제로 처리한 Miapaca2 및 Colo205 세포의 마이크로어레이 분석으로 ERK의 고전적 하류 표적인, DUSP6, ETV5 및 ERG1을 비롯하여 두 세포주 모두에서 하향-조절된 유전자가 밝혀졌다.
7.2. DR5 매개된 아폽토시스 의 세포-맥락 의존적 조절제로서 Bcl - xL , cIAP1 및 BRAF-MEK-ERK
많은 단백질은 넓게 규정된다면 세포-맥락 의존적 조절제로서 작용한다. 예를 들어, ABT737 (Bcl-xL 억제제)은 LBY135 유도된 아폽토시스에 대해 광범위한 표현형을 보였다. 검사할 35개 세포주 중에서 이것은 7개의 세포주에 대한 LBY135의 효과를 강하게 감작시키고, 9개의 세포주를 가볍게 감작시키지만, 다른 19개의 세포주에 대해서는 효과가 없었다. 타당한 이유 중 하나는 Bcl-xL의 억제를 보상하는 평행 경로가 몇몇 세포주 내에 존재한다는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 스크린의 분석으로 Bcl-xL에 대한 shRNA가 실제로 MCL1을 표적화하는 shRNA에 의해 감작되는 Miapaca2 세포를 제외한 모든 세포주를 감작시킴이 밝혀졌다. 그러한 종류의 조절제는 조합 요법의 개발을 방해하지 않을 것이다. 상기 측면에서, cIAP1에 대한 억제제는 다수의 세포주에서 DR5 효능제 항체를 감작시키는 유사한 조절제이다 (표 26 + 데이터를 제시하지 않음). 흥미롭게도, cIAP1은 DR5 및 BRAF-MEK-ERK 경로 사이의 교차-대화에 특이적으로 관여하지만 x-IAP는 그렇지 않다.
BRAF-MEK-ERK 경로는 세포-맥락-의존적 조절제에 대한 카테고리 내에 있다. 그의 세포-맥락 의존적 효과는 감작제로부터 길항제까지 다양하였다. 그러한 극적인 차이는 DR5 매개된 아폽토시스를 조절하는 신호전달 네트워크에 대한 통찰력을 얻는 기회를 제공한다. 그러나, 감작 효과가 강하고 바람직하더라도 바이오마커가 확인되어야 하거나, 그러한 조합이 개발하기 어려울 것이다. 실제로, DR5 내성 세포주, 예컨대 ES2 및 A375에 대해, BRAF/MEK 억제제는 강한 감작 효과를 보이는 아래 표의 유일한 파트너인 반면, Bcl-xL에 대한 억제제는 그렇지 않다. cIAP1의 하향조절은 다수의 세포주에서 감작 효과와 연관되고, 이는 그를 그러한 조합 전략에 대한 PD 바이오마커로서 제안한다. 본 발명자들의 결과는 DR5 효능제 항체와 c1 및 BRAF-MEK에 대한 억제제의 삼중 조합이 해결책일 수 있음을 제안한다.
표 26은 DR5 효능제 항체 및 cIAP1 또는 Bcl-xL에 대한 억제제 사이의 상승작용 효과를 보여준다. 35개의 세포주를 LBY135 (DR5 효능제 항체, 노바티스 아게) 단독으로 또는 LBW242 (cIAP1 억제제) 또는 ABT737 (Bcl-xL 억제제)와의 조합으로 처리하였다. 세포는 5 nM의 LBY135에서 생존력이 70%보다 높은 경우에 불감성으로 표지하였다. 조합 효과에 대해, 조합물이 세포 생존력을 30% 초과로 감소시키는 경우에 '+++'로서 표지하고; 조합물이 세포 생존력을 10-30% 감소시키는 경우에 '++'로 표지하였다. 조합 치료에서 상승작용이 관찰되지 않을 때 "없음"으로서 표지하였다.
<표 26>
Figure pct00033
Figure pct00034
추가로, 180개의 유전자가 또한 2개의 세포주 사이에서 MEK 억제에 의해 차별적으로 조절되는 것으로서 확인되었다. 이들 유전자를 조절하는 것을 책임질 수 있는 전사 인자의 세트는 유전자 세트 농축 (enrichment) 분석 (GSEA)에 이어, 그의 관련성을 확인하기 위해 shRNA를 사용한 개별 검사에 의해 예측한다. 많은 전사 인자 중에서, 단지 FOXO3 및 SP1만이 Colo205 세포 내에서 mRNA 수준에서 cFLIP 또는 cIAP1의 조절에서 그의 역할에 의해 보이는 바와 같이 2개의 경로 사이의 교차-대화에 직접 관련되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, Miapcaca2 세포에서, cFLIP 또는 cIAP1은 프로테아솜 및 카스파제 8 의존 방식으로 단백질 수준에서 조절된다. 마지막으로, 감소된 cIAP1 단백질 수준은 추가의 세포주에서 감작 효과와 연관된다. 이들 결과는 DR5 효능제 항체 LBY135에 대한 다수의 강력한 조합 전략을 확인하고, BRAF-MEK-ERK 경로에 의한 DR5 매개된 아폽토시스의 세포-맥락-의존적 조절을 밝힌다.
shRNA 결과를 입증하기 위해, BRAF-MEK-ERK 경로를 파괴하기 위해 BRAF 및 MEK에 특이적인 화학적 억제제를 사용하였다. 즉, RAF265 및 U0126이 각각 BRAF 및 MEK의 억제제이다. 두 화합물을 사용한 BRAF-MEK-ERK 경로의 억제는 LBY135 처리에 대해 Miapaca2 세포를 감작시켰지만, 그로부터 Colo205 세포를 구조하였다. 다른 BRAF 및 MEK 특이적 억제제는 유사한 표현형을 제공한다.
Miapaca2 세포는 활성화 KRAS 돌연변이 (G12C)를 갖는 반면, Colo205 세포는 활성 BRAF 돌연변이 (V600E)를 가진다. 따라서, 이들 돌연변이가 상이한 표현형에 대한 이유인 것이 가능하다. 그러나, Miapaca2에서와 동일한 KRAS 돌연변이를 갖는 H2122는 Miapaca2에서와 같이 임의의 감작 효과를 보이지 않았다. 또한, 모두 BRAF 돌연변이를 갖는 7개의 추가의 세포주의 스크리닝 후에, 본 발명자들은 MEK 억제제가 몇몇 세포주에 대해 효과를 보이지 않는 반면 다른 것들은 Miapaca2 세포에서와 같이 감작됨을 발견하였다. 함께 살펴보면, 본 발명의 결과는 BRAF 및 KRAS 돌연변이가 DR5 매개된 아폽토시스에 대한 BRAF-MEK-ERK 경로의 세포-맥락 의존적 역할을 설명하지 않음을 나타낸다.
종합하면, BRAF-MEK-ERK의 억제는 양날의 검으로서 - DR5 효능제와 조합으로 사용될 때 감작 또는 길항 효과를 일으킬 수 있다. DR5 효능제와 조합한 cIAP1 또는 XIAP의, Bcl-xL 또는 cFLIP의 억제제는 감작을 위해 충분하다. 그러나, BRAF 억제제 및 MEK 또는 ERK 억제제의 조합은 LBY135를 사용한 예비-처리의 효과를 길항하는 것으로 보인다. 이것이 임상에서 두 경로를 표적화하는 조합 요법에 대한 관심을 불러일으키지만, 데이터는 cIAP 억제제와의 삼중 조합물이 길항작용에 대한 해결책일 수 있음을 제안한다. 즉, DR5 효능제, cIAP 억제제 (cIAP1 또는 XIAP에 대한) 및 선택된 MEK 억제제 또는 BRAF 억제제의 삼중 조합물이 또한 세포 사멸의 상승적 유도를 일으킬 것이다.
7.3. 실험 프로토콜
shRNA 라이브러리 스크린을 위해, 표적 세포를 키놈 (kinome) 및 아포톰 (apotome) shRNA를 표적으로 하는 풀링된 shRNA 라이브러리로 감염시키고, 퓨로마이신을 사용하여 선택한 후, 가교결합된 LBY135 또는 PBS 대조군으로 처리하였다. 제0, 7 및 14일에 수집한 샘플을 DNA 추출, 통합된 shRNA의 PCR 증폭 및 정제로 처리한 후, 솔렉사 서열결정하였다. 동시점에서 처리들 사이의 비교에 의해 DR5 매개된 아폽토시스를 변형시키는 shRNA를 밝혔다. PBS 대조군 내에서 시점들 사이의 비교에 의해 세포 성장에 대한 shRNA의 효과를 밝혔다. 이어서, 이들 적중치 (hit)를 개별 입증하였다.
LIMK2의 녹-다운이 LBY135 유도된 아폽토시스에 대해 Miapaca2 및 Colo205를 감작시키는지 분석하기 위해, 세포를 LIMK2 또는 대조 헤어핀에대한 shRNA로 감염시키고, 5일 동안 퓨로마이신을 사용하여 선택한 후, 다음날 36시간 동안 가교결합된 LBY135의 연속 희석액으로 처리하기 위해 96-웰-플레이트에 접종하였다. 세포 생존력을 셀-타이터-글로우 (cell-titer-glow) 시약에 의해 측정하고, LBY135로 처리하지 않은 샘플에 대해 표준화하였다. 용량-반응 곡선을 생성하기 위해 세포 생존률을 농도의 함수로서 그래프로 그렸다. 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험 중 대표적인 실험의 삼중 시험의 평균±SD를 포함한다.
MEK 및 BRAF의 화학적 억제제를 스크린에서 shRNA의 표현형을 입증하기 위해 사용하였다. Miapaca2 및 Colo205를 DMSO, MEK 억제제 U0126 (10 μM) 또는 BRAF 억제제 RAF265 (1 μM)와 함께 밤새 예비-인큐베이션한 후, 가교결합된 LBY135의 연속 희석액으로 36시간 동안 처리하였다. 세포 생존력을 셀-타이터-글로우 시약에 의해 측정하고, LBY135로 처리하지 않은 샘플에 대해 표준화하였다. 용량-반응 곡선을 생성하기 위해 세포 생존률을 농도의 함수로서 그래프로 그렸다. 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험 중 대표적인 실험의 삼중 시험의 평균±SD를 포함한다.
DR5에 의한 ERK의 활성화가 두 세포주 모두에서 무손상으로 유지됨을 보여주기 위해, Miapaca2 및 Colo205 세포를 DMSO 또는 U0126 (10 μM)와 함께 밤새 예비-인큐베이션하고, 가교결합된 LBY135 (0.25 nM)로 처리하고, ERK 및 p-ERK에 대한 웨스턴 블롯 분석을 위해 0h, 1h, 3h 및 6h에 수집하였다. MEK 억제는 Colo205 세포에서 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-3/7의 DR5 유도된 활성을 감소시킨 반면, Miapaca2 세포에서는 이들을 증가시켰다. Colo205 및 Miapaca2를 가교결합된 LBY-135로 0 nM, 0.25 nM 또는 1 nM에서 7 hr 동안 처리하였다. 카스파제8, 카스파제9 및 카스파제3/7의 활성의 분석을 위해 세포를 용해시켰다. 카스파제 활성을 LBY135 농도의 함수로서 그래프로 그렸다. 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험 중 대표적인 실험의 것이다.
MEK에 의해 조절되는 유전자 중에서 Colo205 및 Miapaca2 세포 사이에 유의한 연관성을 가진 유전자를 밝히기 위해 마이크로어레이 분석을 이용하였다. Colo205 및 Miapaca2 세포를 5회의 독립적인 실험으로 DMSO 또는 U0126과 함께 밤새 예비-인큐베이션하였다. 마이크로어레이 분석을 위해 RNA를 추출하였다. U0126 대 DMSO 처리 세포 내에서 각각의 유전자에 대한 상대적인 발현 수준을 Y-축 상에 Colo205 세포 및 X-축 상에 Miapaca2의 함수로서 그래프로 그렸다.
7.4. DR5 및 RAF - MEK - ERK 사이의 교차-대화에 대한 작업 모델
작업 모델은 DR5 효능제를 사용한 처리가 카스파제-8 및 ERK를 모두 활성화시킴을 제안한다. 이들 2가지 경로 사이의 교차-대화는 다시 DR5 효능제에 의해 유도된 아폽토시스를 제어하는, 카스파제-8 및 카스파제-9의 활성화를 부정적으로 조절하는, cFLIP 및 cIAP1에 의해 매개된다. cFLIP 및 cIAP1은 세포-맥락 의존적인 방식으로 상이한 수준에서 조절된다. Colo205 세포에서, 이들은 자체가 BRAF-MEK-ERK 경로에 의해 조절되는 전사 인자 FOXO3 및 SP1을 통해 그의 RNA 수준에서 조절된다. Miapaca2 세포에서, cFLIP 및 cIAP1은 프로테아솜 및 카스파제 8 의존 방식으로 단백질 수준에서 BRAF-MEK-ERK 경로에 의해 조절된다.
8. 실시예 VIII
8.1. 예시적인 비아코어 검정
아미노산 서열 또는 다른 결합제가 교차차단하거나 교차차단할 수 있는지 결정하기 위한 적합한 검정은 비아코어 검정이다. 상기 검정은 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열 (또는 다른 결합제, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드)과 함께 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
비아코어 기기 (예를 들어 비아코어 3000)는 제조자의 권장사항에 따라 작동시킨다. 하나의 예시적인 교차차단 검정에서, 표준 아민 커플링 화학을 이용하여 표적 단백질을 CM5 비아코어 칩에 커플링시켜 표적으로 코팅된 표면을 생성시켰다. 대개, 200-800 공명 단위의 표적이 칩에 커플링될 것이다 (즉, 쉽게 측정가능한 수준의 결합을 제공하지만 사용되는 시험 시약의 농도에 의해 쉽게 포화가능한 양).
서로 교차차단하는 능력에 대해 평가할 2개의 시험 아미노산 서열 (A* 및 B*로 칭함)을 적합한 완충제 내에서 1:1 몰비의 결합 부위로 혼합하여 시험 혼합물을 생성하였다. 결합 부위에 기반한 농도를 계산할 때, 아미노산 서열의 분자량은 아미노산 서열의 총 분자량을 그 아미노산 서열 상의 표적 결합 부위의 수로 나눈 값으로 가정한다. 시험 혼합물 내의 아미노산 서열의 농도는 비아코어 칩 상에 포획된 표적 분자 상의 그 아미노산 서열에 대한 결합 부위를 쉽게 포화시키기 위해 충분히 높아야 한다. 혼합물 내의 아미노산 서열은 동일한 몰 농도 (결합 기초)이고, 그 농도는 대개 1.00 내지 1.5 μM (결합 부위 기초)일 것이다. A* 단독 및 B* 단독을 함유하는 별개의 용액을 또한 제조하였다. 이들 용액 내의 A* 및 B*는 시험 혼합물에서와 동일한 완충제 내에 존재하고 동일한 농도였다.
시험 혼합물을 표적-코팅된 비아코어 칩 위로 통과시키고, 결합의 총량을 기록하였다. 이어서, 칩을 칩-결합된 표적을 손상시키지 않으면서 결합된 아미노산 서열을 제거하는 방식으로 처리하였다. 일반적으로, 이것은 칩을 30 mM HCl로 60초 동안 처리함으로써 수행되었다. 이어서, A* 단독의 용액을 표적-코팅된 표면 위로 통과시키고, 결합의 양을 기록하였다. 다시 칩을 칩-결합된 표적을 손상시키지 않으면서 모든 결합된 아미노산 서열을 제거하기 위해 처리하였다. 이어서, B* 단독의 용액을 표적-코팅된 표면 위로 통과시키고, 결합의 양을 기록하였다.
이어서, A* 및 B*의 혼합물의 최대 이론적 결합을 계산하였고, 이것은 단독으로 표적 표면 위로 통과될 때 각각의 아미노산 서열의 결합의 합이다. 혼합물의 실제 기록된 결합이 상기 이론적 최대치보다 더 적으면, 2개의 아미노산 서열은 서로 교차차단한다. 따라서, 일반적으로, 교차차단하는 아미노산 서열 또는 본 발명에 따른 다른 결합제는 검정 동안 및 제2 아미노산 서열 또는 본 발명의 다른 결합제의 존재 하에 기록된 결합이 조합물 내의 2개의 아미노산 서열 또는 결합제의 최대 이론적 결합의 80% 내지 0.1% (예를 들어 80% 내지 4%), 구체적으로 최대 이론적 결합의 75% 내지 0.1% (예를 들어 75% 내지 4%), 보다 구체적으로 최대 이론적 결합의 70% 내지 0.1% (예를 들어 70% 내지 4%) (상기 규정된 바와 같이)이도록 상기 비아코어 교차차단 검정에서 표적에 결합할 아미노산 서열 또는 결합제이다.
상기 설명된 비아코어 검정은 아미노산 서열 또는 다른 결합제가 본 발명에 따라 서로 교차차단하는지 결정하기 위해 사용되는 1차 검정이다. 드물게, 특정 아미노산 서열 또는 다른 결합제는 아민 화학을 통해 CM5 비아코어 칩에 커플링된 표적에 결합하지 않을 수 있다 (이것은 대체로 표적 상의 관련 결합 부위가 칩에의 커플링에 의해 차례되거나 파괴되는 경우에 일어난다). 그러한 경우에, 교차차단은 태깅된 버전의 표적, 예를 들어, N-말단 His-태깅된 버전 (알앤디 시스템즈 (R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스); 2005 cat# 1406-ST-025)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 특정 포맷에서, 항-His 아미노산 서열을 비아코어 칩에 커플링시킨 후, His-태깅된 표적을 칩의 표면 위로 통과시키고, 항-His 아미노산 서열에 의해 포획시킬 것이다. 교차차단 분석은 본질적으로 상기한 바와 같이 수행할 것이지만, 단, 각각의 칩 재생 사이클 후에, 새로운 His-태깅된 표적을 다시 항-His 아미노산 서열 코팅된 표면 상으로 로딩할 것이다. N-말단 His-태깅된 DR5를 사용하는 주어진 예에 추가로, C-말단 His-태깅된 표적을 별법으로 사용할 수 있다. 추가로, 당업계에 공지된 다양한 다른 태그 및 태그 결합 단백질 조합을 상기 교차차단 분석을 위해 사용할 수 있다 (예를 들어, 항-HA 항체와 함께 HA 태그; 항-FLAG 항체와 함께 FLAG 태그; 스트렙타비딘과 함께 비오틴 태그).
9. 실시예 IX
9.1. 예시적인 ELISA 검정
다음은 표적에 대해 작용성인 아미노산 서열 또는 다른 결합제가 본원에서 규정된 바와 같이 교차차단하거나 교차차단할 수 있는지 결정하기 위한 ELISA 검정을 일반적으로 설명한다. 본 검정은 본원의 임의의 아미노산 서열 (또는 다른 결합제, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드)에서 사용할 수 있다.
검정의 일반적인 원리는 표적에 대해 작용성인 아미노산 서열 또는 결합제를 ELISA 플레이트의 웰 상에 코팅시키는 것이다. 과량의 제2의 잠재적으로 교차차단성인 항-표적 아미노산 서열을 용액 상태로 첨가한다 (즉, ELISA 플레이트에 결합되지 않은 상태). 이어서, 제한된 양의 표적을 웰에 첨가한다. 코팅된 아미노산 서열 및 용액 중의 아미노산 서열은 제한된 수의 표적 분자에 결합하기 위해 경쟁한다. 플레이트를 세척하여 코팅된 아미노산 서열에 결합되지 않은 과량의 표적을 제거하고, 또한 제2의 용액상 아미노산 서열, 및 제2의 용액상 아미노산 서열과 표적 사이에 형성된 임의의 복합체를 제거한다. 이어서, 표적을 검출하기 위해 적절한 시약을 사용하여 결합된 표적의 양을 측정한다. 코팅된 아미노산 서열을 교차차단할 수 있는 용액 중의 아미노산 서열은 제2의 용액상의 아미노산 서열의 부재 하에 코팅된 아미노산 서열이 결합할 수 있는 표적 분자의 수에 비해 코팅된 아미노산 서열이 결합할 수 있는 표적 분자의 수를 감소시킬 수 있을 것이다.
제1 아미노산 서열, 예를 들어 Ab-X가 고정된 아미노산 서열로 선택되는 경우에, 이를 ELISA 플레이트의 웰 상에 코팅시키고, 그 후 플레이트를 후속적으로 첨가되는 시약의 비-특이적 결합을 최소화하기 위해 적합한 차단 용액으로 차단시킨다. 이어서, 과량의 제2 아미노산 서열, 즉, Ab-Y를 ELISA 플레이트의 코팅 동안 웰 당 Ab-Y [표적] 결합 부위의 몰이 웰 당 사용되는 Ab-X [표적] 결합 부위의 몰보다 적어도 10배 더 크도록 ELISA 플레이트에 첨가한다. 이어서, [표적]을 웰 당 첨가된 [표적]의 몰이 각각의 웰을 코딩하기 위해 사용된 Ab-X [표적] 결합 부위의 몰보다 적어도 25배 더 적도록 첨가한다. 적합한 인큐베이션 기간 후에, ELISA 플레이트를 세척하고, 표적을 검출하기 위한 시약을 첨가하여 코팅된 항-[표적] 아미노산 서열 (이 경우에 Ab-X)에 의해 특이적으로 결합된 표적의 양을 측정한다.
검정에 대한 배경 신호는 코팅된 아미노산 서열 (이 경우에 Ab-X), 제2의 용액상 아미노산 서열 (이 경우에 Ab-Y), [표적] 완충제 단독 (즉, 표적 없음) 및 표적 검출 시약을 사용한 웰 내에서 얻어진 신호로서 규정한다. 검정에 대한 양성 대조군 신호는 코팅된 아미노산 서열 (이 경우에 Ab-X), 제2의 용액상 아미노산 서열 완충제 단독 (즉, 제2의 용액상 아미노산 서열 없음), 표적 및 표적 검출 시약을 사용한 웰 내에서 얻어진 신호로서 규정한다. ELISA 검정은 양성 대조군 신호가 배경 신호의 적어도 6배가 되도록 하는 방식으로 실행할 수 있다.
코팅 아미노산 서열로서 사용하는 아미노산 서열 및 제2 (경쟁자) 아미노산 서열로서 사용하는 아미노산 서열의 선택으로부터 생기는 임의의 인위물 (artifact) (예를 들어, [표적]에 대한 Ab-X 및 Ab-Y 사이의 유의하게 상이한 친화도)을 피하기 위해, 교차차단 검정을 2가지 포맷으로 실행할 수 있다: (1) 포맷 1은 Ab-X가 ELISA 플레이트 상에 코팅되는 아미노산 서열이고, Ab-Y가 용액으로 존재하는 경쟁자 아미노산 서열인 경우이고, (2) 포맷 2는 Ab-Y가 ELISA 플레이트 상에 코팅되는 아미노산 서열이고, Ab-X가 용액으로 존재하는 경쟁자 아미노산 서열인 경우이다. 포맷 1 또는 포맷 2에서, 용액상 항-표적 아미노산 서열이 용액상 항-표적 아미노산 서열의 부재 하에 얻어진 표적 검출 신호 (즉, 양성 대조군 웰)에 비해 표적 검출 신호 (즉, 코팅된 아미노산 서열에 의해 결합된 표적의 양)의 60% 내지 100%, 구체적으로 70% 내지 100%, 보다 구체적으로 80% 내지 100%의 감소를 유발할 수 있으면 Ab-X 및 Ab-Y는 교차차단하는 것으로 정의된다.
10. 실시예 X
10.1. 대식세포 고갈 실험
지금까지 임상 개발 중인 모든 항-DR5 항체는 시험관 내에서 및 생체 내에서 최적 효능을 달성하기 위해 교차결합을 필요로 한다. 생체 내에서, 상기 교차결합은 Fc 수용체 발현 면역 세포에 대한 항-DR5 항체의 Fc 부분의 결합을 통해 매개되는 것으로 생각된다. 상기 교차결합을 필요로 하지 않는 것으로 예상되는 NB 구축물에 비해 항-DR5 항체 LCR211의 생체내 교차결합 효과를 연구하기 위해, 마우스 IgG1 항-DR5 항체 LCR211의 활성을 NOD/LtSz-scid IL2R 감마 null 암컷 마우스 (NSG 마우스) 배경에서 MiaPaCa-2 이종이식편 모델에서 종양 연관된 대식세포 (TAM) 고갈 조건 하에 11H6 사량체에 비교하였다. NSG (NOD-SCID 감마) 마우스는 T 세포, B 세포가 결핍되고, IL-2R 감마-사슬의 결실의 결과로서 파괴된 시토카인 신호전달에 의해 유발된 NK 세포 세포독성 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않는다 (Shultz, J. of Immunology 2005). TAM의 고갈은 CSF-1 수용체를 통한 신호전달을 억제하는 소분자를 사용하여 달성하였다. 1일 1회 200 mg/kg의 3회 용량은 이전에 제시된 바와 같이 80%까지의 대식세포를 고갈시켰다. 연구 내내 계속 매일 투여하였다.
MiaPaCa 세포를 지수 성장기에 수거하였다. 마트리겔 (Matrigel)과 50:50 혼합한 5백만 개의 세포를 누드 마우스의 상부 우측 옆구리 내로 피하 이식하였다. 세포 이식을 위해, 마우스를 통합 멀티챔버 마취 센터 (IMCAC) 및 유도 챔버 (베티큅. 인크. (Vetequip. Inc., 미국 캘리포니아주 펠르전튼))을 이용하여 2-4% 이소플루란/산소 혼합물의 연속 유동으로 마취시켰다. 종양 흡수율은 >90%이고, 종양은 세포 이식 14일 후쯤에 약 150-350 mm3에 도달하였다. 동물을 평균 종양 부피 및 범위가 처리군들 사이에서 통계상 유사하도록 (스튜던트 (Student's) t-테스트에 의해 결정할 때) 종양 부피에 따라 무작위로 배정하였다. 종양을 디지털 캘리퍼스 (calipers)로 투여의 시작에서 매주 2회 측정하였다. 종양 부피는 타원 식: (길이 x 폭2)/2를 이용하여 계산하였다. 250 mg/kg qd po의 CSF1-R 억제제 (CSF-1Ri)와 함께 또는 그것 없이, LCR211은 10 mg/kg 3qw iv로 투여하고, 11H6 사량체는 10 mg/kg 및 40 mg/kg qw iv로 투여하였다.
% 처리군/대조군 (T/C) 값을 다음 식을 이용하여 계산하였다:
% T/C = 100 x ΔT/ΔC (ΔT>0인 경우)
% 퇴행 = 100 x ΔT/T초기 (ΔT<0인 경우)
식에서:
T = 연구의 최종일에 약물-처리군의 평균 종양 부피이고;
ΔT = 연구의 최종일에 약물-처리군의 평균 종양 부피 - 최초 투여일에 약물-처리군의 평균 종양 부피이고;
T초기 = 최초 투여일에 약물-처리군의 평균 종양 부피이고;
C = 연구의 최종일에 대조군의 평균 종양 부피이고;
ΔC = 연구의 최종일에 대조군의 평균 종양 부피 - 최초 투여일에 대조군의 평균 종양 부피이다.
%T/C 계산은 연구의 끝에 수행하였다.
표 27 및 도 4a와 4b에서 보이는 바와 같이, 11H6 사량체는 NSG 마우스 배경에서 TAM 고갈 조건 하에 MiaPaCa-2 이종이식편에서 강력한 단일 물질 활성을 유지한 반면, 동일한 조건 하에 뮤린 항-DR5 항체 LCR211은 효능을 잃었다.
<표 27>
Figure pct00035
10.2. LCR211 -불감성 환자-유래 종양 모델에서 DR5 작용제의 항-종양 활성
TPAN1-IFA (환자-유래 췌장 종양 (센테크 (Xentech))를 (80마리) 암컷 누드 마우스 (할란, 이식시 약 8주령)에 피하 (sc) 이식하였다. 치료의 개시 시에 동물을 9마리의 군으로 무작위로 배정하였다. 출발 종양 부피는 99 mm3 (범위 63-196 mm3)이었다. 처리군은 (1) 비히클, 매주 1회 (qw), 정맥내 (i.v.), (2) LCR211, 10 mg/kg, 매주 3회 (3qw), i.v., (3) 11H6 사량체, 10 mg/kg, qw, i.v., (4) 11H6, 40 mg/kg, qw, i.v., (5) 겜시타빈, 60 mg/kg, 매주 2회 (2qw), i.v이었다. 정맥내 투여 부피는 5 ml/kg이었다. 마우스를 매주 2회 칭량하였다. 종양을 매주 2회 캘리퍼스로 측정하고, 종양 부피 (TV)를 다음 식을 이용하여 계산하였다: TV (mm3) = [길이 (mm) x 폭 (mm)2]/2 (여기서, 길이 및 폭은 각각 각각의 종양의 최장 및 최단 직경이다).
도 5에 제시된 바와 같이, 투여 4주 후에, LCR211은 단일 작용제 활성을 보이지 않고, 여기서 대조군에 비해 처리군의 종양 부피의 평균 변화 (T/C) = 109%이었다. 이와 대조적으로, 10 mg/kg 매주 및 40 mg/kg 매주 투여한 11H6은 각각 1% 및 86% 퇴행을 일으켰다 (비히클에 대해 p<0.05). 겜시타빈 처리는 25%의 T/C를 생성시켰다 (비히클에 대해 p<0.05). LCR211 및 11H6 처리는 관찰된 유의한 체중 감소 없이 잘 용인되었다. 따라서, DR5의 통상적인 항체 표적화에 불감성인 환자-유래 암에서, NB 구축물은 강력한 종양 퇴행을 보인다. 본 실시예에서, NB 구축물은 상기 경로에 대한 통상적인 표적화 접근법에 불응성일 수 있는 보다 큰 부류의 환자를 치료할 가능성을 가진다.
11. 실시예 XI
11.1. 인간 DR5 / NB 구축물 복합체의 X-선 결정학적 구조 결정
단량체 구축물 11H6 (서열 103) 및 4E6 (서열 104)에 결합된 인간 DR5 ECD 단편의 결정 구조를 결정한다. 아래 상세히 설명하는 바와 같이, 개별 DR5 단백질 단편들을 발현시키고, 정제하고, 혼합하여 복합체를 형성한다. 단백질 결정학을 사용하여 2개의 예에 결합된 DR5 단백질에 대한 원자 단위 해상도 (atomic resolution) 데이터를 생성한다.
결정학을 위해 DR5 단백질의 2개의 변이체, 즉 DR5_54 및 DR5_61을 생성하였다. 인간 DR5 (진뱅크 등록 번호 BAA33723.1; 서열 89)의 서열 넘버링에 따라, DR5 서열들은 각각 잔기 54 내지 183, 및 잔기 61 내지 183에 상응한다. 표 28에 제시된 바와 같이, 소문자의 서열은 생산 동안 제거된다. DR5_54 (서열 100) 및 DR5_61 (서열 101)에서, 인간 DR5 서열은 밑줄로 표시한다. 표 28에서, "ID"는 서열 번호를 나타낸다.
<표 28>
Figure pct00036
상기 단백질을 GP67 신호 펩티드를 함유하는 발현 벡터를 사용한 바큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 SF9 세포 내에서 발현시켰다. 감염 2.5일 후에 세포 성장 배지로부터 DR5 단백질을 정제하였다. 배지에 5 mM CaCl2, 1 mM NiCl2, 50 mM 트리스(Tris) pH 8.0 및 1 μM PMSF를 첨가하여 정화하였다. 단백질을 중력 유동 칼럼을 이용하여 50 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl 내에 평형화시킨 Ni-NTA 수지 (퀴아젠) 상에 포획하였다. 칼럼을 50 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 30 mM 이미다졸로 세척한 후, 50 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸로 용리하였다. Ni 칼럼으로부터 용리된 DR5를 프리시션 (PreScission) 프로테아제 (지이 헬쓰케어)로 절단한 후, 50 mM HEPES pH 7.6, 150 mM NaCl 내에 평형화시킨 수퍼덱스 75 칼럼 (지이 헬쓰케어)을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피하였다. DR5를 20 칼럼 부피 구배의 0.03-1 M NaCl을 갖는 pH 7.5의 모노큐 (MonoQ) 칼럼 (지이 헬쓰케어)을 사용하는 이온 교환에 의해 추가로 정제하였다. 피크 분획을 SDS-PAGE 및 LCMS에 의해 분석한 후 풀링하였다.
11.2. DR5 를 사용한 4 E6 및 11 H6 결정화.
4E6 (pAX111-4E6, 서열 103) 및 11H6 (pAX100-11H6, 서열 102) 둘 모두를 각각 BL21(DE3)pLysS 세포 및 BL21(DE3)Star 세포를 사용하여 이. 콜라이 내에서 발현을 위해 단량체 NB 구축물로서 클로닝하였고, 상기 표 28에 제공된 바와 같이 둘 모두 주변세포질 국재화를 위한 신호 서열을 함유한다. 37℃에서 IPTG로 3시간 유도시킨 후에, 세포를 수거하고 용해시켰다. 단백질을 50 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl 내에 예비-평형화시킨 Ni-NTA 칼럼 상에 포획하였다. 칼럼을 50 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 50 mM 이미다졸로 세척한 후, 50 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸로 용리하였다. Ni 용리물을 수퍼덱스 75 칼럼 (지이 헬쓰케어)을 사용하는 겔 여과 크로마토그래피를 통해 추가로 정제하였다. 이것은 11H6에 대한 최종 정제 단계인 반면, 4E6은 MonoS 양이온 교환 칼럼 (지이 헬쓰케어)을 통한 추가의 정제 단계를 거쳤다.
DR5_61/4E6의 복합체는 DR5_61 및 4E6을 1:1 몰비 (LCUV를 통해 측정된 농도)로 혼합하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 복합체를 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl 내에 평형화시킨 수퍼덱스75 칼럼 (지이 헬쓰케어) 상에서 정제함으로써 제조하였다. 피크 분획을 SDS-PAGE 및 LCMS에 의해 분석하였다. DR5_61/4E6을 함유하는 분획을 결정화를 위해 약 10 mg/ml로 농축하였다.
DR5_54/11H6의 복합체는 DR5_54 및 11H6을 1:1.3의 몰비 (LCUV에 의해 추정된 농도)로 혼합하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 복합체를 25 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl 내에 평형화시킨 수퍼덱스75 칼럼 (지이 헬쓰케어) 상에서 정제함으로써 제조하였다. DR5_54/11H6 이량체를 함유하는 피크 분획을 모으고, 약 12.7 mg/ml로 농축하였다. 이어서, 이량체를 다음과 같이 트립신 처리하였다: 200 ㎕의 이량체 (약 2.5 mg)를 사용하여 20 ㎍의 동결건조된 트립신을 재현탁시키고, 이어서 이를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. DR5_54/11H6/트립신 혼합물을 원심분리한 후 결정화 스크린으로 세팅하였다.
동일 부피의 단백질 및 보관기 용액을 함유하는 액적으로부터 시팅 드롭 (sitting drop) 증기 확산에 의해 결정을 성장시켰다. DR5_61/4E6 복합체에 대해, 22% PEG 3350, 150 mM 아세트산칼슘, 100 mM HEPES pH 7.5의 보관기 용액은 20℃에서 인큐베이션 시에 결정을 생성하였다. 트립신-처리된 DR5_54/11H6 복합체에 대해, 0.2 M 황산암모늄, 0.1 M 트리스 pH 8.5, 25% PEG 3350의 보관기 용액은 20℃에서 인큐베이션 시에 결정을 생성하였다.
DR5_61/4E6 결정을 25% PEG 3350, 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM 아세트산칼슘, 15% 글리세롤, 10% 에틸렌 글리콜을 함유하는 냉동 용액에 옮기고, 액체 질소 내에서 급속 냉각시켰다. DR5_a54/11H6 결정을 추가의 22% 글리세롤을 함유하는 보관기 용액에 옮기고, 액체 질소 내에서 급속 냉각시켰다.
DR5_61/4E6 복합체에 대해, 스위스 라이트 소스 (Swiss Light Source) (폴 쉐러 인스티튜트 (Paul Scherrer Institut, 스위스 빌리겐))에서 스테이션 PXI-X06SA에서 회절 데이터를 수집하였다. 셀 치수 a=98.50Å, b=84.65Å, c=64.91Å, 알파=90°, 베타=99.38°, 감마=90°인 공간군 C121에서 autoPROC (글로벌 페이징, 엘티디 (Global Phasing, LTD))를 사용하여 데이터를 처리하고 1.9Å에서 크기 조정하였다. DR5_61/4E6 구조는 탐색 모델로서 DR5 구조 2H9G 및 낙타화 인간 VH 구조 1OL0을 사용하여 페이저 (Phaser) (McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40: 658-674)를 사용한 분자 교체에 의해 해결하였다. 비대칭 단위당 DR5_61/4E6 복합체의 2개의 분자를 함유하는 최종 모델을 COOT (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60: 2126-2132)에서 제작하고, 페닉스 (PHENIX) (Adams et al., Acta Cryst. D66, 213-221 (2010))를 이용하여 결합 길이 및 결합각에 대해 각각 0.003Å 및 0.69°의 rmsd를 사용하여 각각 22.2% 및 24.1%의 R 및 Rfree 값으로 개선하였다.
DR5_54/11H6 복합체에 대해, 어드밴스드 포톤 소스 (Advanced Photon Source) (알곤 내셔널 래보래토리 (Argonne National Laboratory, 미국))에서 빔라인 17-ID에서 회절 데이터를 수집하였다. 셀 치수 a=99.61Å, b=99.61Å, c=107.73Å, 알파=90°, 베타=90°, 감마=120°인 공간군 P65에서 오토프록 (autoPROC) (글로벌 페이징, 엘티디)를 사용하여 데이터를 처리하고 2.2Å에서 크기 조정하였다. DR5_54/11H6 구조는 탐색 모델로서 DR5 구조 2H9G 및 NB 구축물 4E6을 사용하여 페이저 (McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40: 658-674)를 사용한 분자 교체에 의해 해결하였다. 비대칭 단위당 DR5_54/11H6 복합체의 2개의 분자를 함유하는 최종 모델을 COOT (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60: 2126-2132)에서 제작하고, PHENIX (Adams et al., Acta Cryst. D66, 213-221 (2010))를 이용하여 결합 길이 및 결합각에 대해 각각 0.002Å 및 0.64°의 rmsd를 사용하여 각각 19.5% 및 22.0%의 R 및 Rfree 값으로 개선하였다.
11.3. 4 E6 및 11 H6 은 DR5 상의 특유한 에피토프를 인식한다
4E6/DR5_61 복합체의 결정 구조를 사용하여 4E6 구축물에 대한 DR5 에피토프를 확인하였다. DR5 상의 상호작용 표면은 표 29A에 상세히 기술된 바와 같이 3개의 불연속적인 (즉, 비연속적인) 서열: 즉, 잔기 77 내지 80, 잔기 87 내지 91, 및 잔기 105 내지 114에 의해 형성된다. 이들 잔기는 NB 구축물에 의해 인식되는 3차원 표면을 형성한다. 상호작용은 백본 상호작용, 용매 매개된 상호작용, 및 직접적 측쇄 상호작용을 포함한다. 그의 측쇄가 상호작용에 직접 기여하는 아미노산을 표 29A에 표시한다. 4E6 NB 구축물로부터의 상호작용 표면 기여는 그의 N-말단 잔기 2, 및 3개의 루프 영역: 잔기 28 내지 33, 잔기 53 내지 59, 및 잔기 99 내지 115에 의해 형성된다. 접촉 잔기를 표 29B에 열거한다.
표 29A에서, NB 구축물 4E6와 접촉하는 원자를 갖는 DR5 잔기를 열거한다. 접촉은 잠재적인 물 매개된 상호작용을 해명하는 NB 구축물의 5 옹스트롬 내에 있는 것으로 규정된다. 그의 측쇄가 상호작용 표면에 직접 기여하는 아미노산을 "+"로 표시한다.
<표 29A>
Figure pct00037
표 29B에서, DR5와 접촉하는 NB 구축물 4E6 내의 잔기를 열거한다. 접촉은 잠재적인 물 매개된 상호작용을 해명하는 NB 구축물의 5 옹스트롬 내에 있는 것으로 규정된다. 그의 측쇄가 상호작용 표면에 직접 기여하는 아미노산을 "+"로 표시한다.
<표 29B>
Figure pct00038
11H6/DR5_54 복합체의 결정 구조를 사용하여 11H6 구축물에 대한 DR5 에피토프를 확인하였다. DR5 상의 상호작용 표면은 표 30A에 상세히 기술된 바와 같이 2개의 불연속적인 서열, 즉, 잔기 86 내지 102 및 잔기 111 내지 118, 및 2개의 추가의 잔기 74 및 125에 의해 형성된다. 이들 잔기는 NB 구축물에 의해 인식되는 3차원 표면을 형성한다. 상호작용은 백본 상호작용, 용매 매개된 상호작용, 및 직접적인 측쇄 상호작용을 포함한다. 그의 측쇄가 상호작용에 직접 기여하는 아미노산을 표 30A에 표시한다. 11H6 구축물로부터의 상호작용 표면 기여는 4E6 구축물에 대해 관찰된 루프 영역을 넘어 연장한다. 잔기 30 내지 37, 잔기 44 내지 61 및 잔기 96 내지 112는 표 30B에 상세히 기술된 바와 같이 11H6 구축물의 결합 표면에 기여한다. 잔기 98 내지 110으로부터의 11H6 구축물 루프는 4E6 구축물로부터의 대응하는 루프와 매우 상이한 입체형태로 존재한다. 상기 대체 루프 위치는 DR5 결합을 위한 특유한 상호작용 표면을 제공한다.
표 30A에서, 11H6 구축물과 접촉하는 원자를 함유하는 DR5 잔기를 열거한다. 접촉은 잠재적인 물 매개된 상호작용을 해명하는 11H6의 5 옹스트롬 내에 있는 것으로 규정된다. 그의 측쇄가 상호작용 표면에 직접 기여하는 아미노산을 "+"로 표시한다. 파묻힌 (buried) 표면적을 백분율로서 결정한다.
<표 30A>
Figure pct00039
표 30B에서, DR5와 접촉하는 11H6 내의 잔기를 열거한다. 접촉은 잠재적인 물 매개된 상호작용을 해명하는 11H6 구축물의 5 옹스트롬 내에 있는 것으로 규정된다. 그의 측쇄가 상호작용 표면에 직접 기여하는 아미노산을 "+"로 표시한다.
<표 30B>
Figure pct00040
균등물
한 실시양태는 인간 DR5에 특이적으로 결합하는 NB 작용제의 단일 가변 도메인의 적어도 하나의 단량체를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0852>의 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인; b) 서열 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR3에 대해 90% 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인; 및 c) 서열 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR3에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0852>의 폴리펩티드를 제공하고, 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 41-44, 51-55 및 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인; b) 서열 41-44, 51-55 및 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인; 및 c) 적어도 90% 동일성을 갖는 서열 41-44, 51-55 및 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR3에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0852>의 폴리펩티드를 제공하고, 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인; 및 b) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 적어도 하나의 단일 가변 도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 인간 DR5에 특이적으로 결합하는 단일 가변 도메인의 적어도 3개의 단량체를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0856>의 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 단일 가변 도메인의 3개의 동일한 단량체를 포함하고, 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인; b) 서열 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR3에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인; 및 c) 적어도 90% 동일성을 갖는 서열 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR3에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0856>의 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 단일 가변 도메인의 3개의 동일한 단량체를 포함하고, 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 41-44, 51-55 및 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인; b) 서열 41-44, 51-55 및 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR3 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인; 및 c) 적어도 90% 동일성을 갖는 서열 41-44, 51-55 및 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR3에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0856>의 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 단일 가변 도메인의 3개의 동일한 단량체를 포함하고, 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인; b) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 적어도 하나의 단일 가변 도메인에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인; 및 c) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 적어도 하나의 단일 가변 도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 a) 서열 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 및 31의 아미노산 서열; 및 b) 서열 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 및 31의 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 본원 식별번호 <0856>의 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 a) 서열 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 및 31의 아미노산 서열; 및 b) 서열 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 및 31의 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 본원 식별번호 <0856>의 폴리펩티드를 제공한다.
a) 서열 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 및 31의 아미노산 서열; 및 b) 서열 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 및 31의 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 본원 식별번호 <0856>의 폴리펩티드.
한 실시양태는 인간 DR5에 특이적으로 결합하는 단일 가변 도메인의 적어도 4개의 단량체를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0863>의 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 4개의 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인; b) 상기 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인; 및 c) 상기 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인에 대해 95% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 단량체로부터 선택된다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0863>의 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 4개의 동일한 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인; b) 상기 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인; 및 c) 상기 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인에 대해 95% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0863>의 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 4개의 동일한 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인; 및 b) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 적어도 하나의 단일 가변 도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 a) 서열 88의 아미노산 서열; b) 서열 88의 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 c) 서열 88의 상기 아미노산 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 본원 식별번호 <0863>의 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 a) 서열 7, 10, 15, 18, 21, 28 및 32의 아미노산 서열; b) 서열 7, 10, 15, 18, 21, 28 및 32의 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 c) 서열 7, 10, 15, 18, 21, 28 및 32의 상기 아미노산 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 본원 식별번호 <0863>의 폴리펩티드를 제공한다.
a) 서열 28의 아미노산 서열; b) 서열 32의 아미노산 서열; 및 c) 서열 28 및 32의 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 인간화 아미노산 서열을 포함하는 본원 식별번호 <0863>의 폴리펩티드.
한 실시양태는 인간 DR5에 특이적으로 결합하는 단일 가변 도메인의 적어도 5개의 단량체를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0870>의 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 5개의 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인; b) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 상기 단일 가변 도메인에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인; 및 c) 적어도 90% 동일성을 갖는 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 상기 단일 가변 도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단량체로부터 선택된다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0870>의 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 5개의 동일한 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인; b) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 상기 단일 가변 도메인에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인; 및 c) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 상기 단일 가변 도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0870>의 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 5개의 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 단일 가변 도메인은 인간화 도메인이고, 상기 인간화 도메인은 a) 서열 26 및 30을 갖는 단일 가변 도메인; b) 서열 26 및 30을 갖는 적어도 하나의 단일 가변 도메인에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인; 및 c) 서열 26 및 30을 갖는 적어도 하나의 단일 가변 도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 a) 서열 8, 11, 16, 19, 22, 29 및 33을 갖는 아미노산 서열; b) 서열 8, 11, 16, 19, 22, 29 및 33을 갖는 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 c) 서열 8, 11, 16, 19, 22, 29 및 33을 갖는 상기 아미노산 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 본원 식별번호 <0870>의 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 a) 서열 29의 아미노산 서열; b) 서열 29의 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 c) 서열 29의 상기 아미노산 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 본원 식별번호 <0870>의 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 a) 서열 33을 갖는 아미노산 서열; b) 서열 33을 갖는 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 c) 서열 33을 갖는 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 본원 식별번호 <0870>의 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 인간 DR5에 특이적으로 결합하는 단일 가변 도메인의 3개 또는 4개 또는 5개의 단량체를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 Colo205, 주르카트, Molt4, H2122, H226 및 H2052로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 2개의 종양 세포주의 집단에 대해 100 nM 이하의 시험관내 효력 (IC50)을 갖는다.
한 실시양태는 상기 폴리펩티드의 시험관내 효력이 10 nM 이하인 본원 식별번호 <0877>의 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 상기 폴리펩티드의 시험관내 효력이 1 nM 이하인 본원 식별번호 <0877>의 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 상기 폴리펩티드의 시험관내 효력이 100 pM 이하인 본원 식별번호 <0877>의 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0877> 내지 <0880>의 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 Malme-3, WI-38, ARPE-19, 184A1, Huvec, HAAE-1로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 3개의 비-종양 세포주의 집단에 대해 20 nM 이상의 시험관내 효력 (IC50)을 갖는다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0877> 내지 <0880>의 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 Malme-3, WI-38, ARPE-19, 184A1, Huvec, HAAE-1로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 3개의 비-종양 세포주의 집단에 대해 100 nM 이상의 시험관내 효력 (IC50)을 갖는다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0877> 내지 <0882>의 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 단일 가변 도메인의 3개 또는 4개 또는 5개의 단량체를 포함하고, 상기 단일 가변 도메인은 a) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인; 및 b) 상기 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
본원 식별번호 <0877> 내지 <0882>의 폴리펩티드이며, 여기서 상기 폴리펩티드는 단일 가변 도메인의 3개 또는 4개 또는 5개의 단량체를 포함하고, 상기 단일 가변 도메인은 인간화 도메인이고, a) 서열 26 및 30을 갖는 단일 가변 도메인; b) 상기 서열 26 및 30을 갖는 단일 가변 도메인에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인; 및 c) 상기 서열 26 및 30을 갖는 단일 가변 도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0877> 내지 <0882>의 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 a) 서열 27, 28 및 29 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 폴리펩티드; b) 서열 27, 28 및 29 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드; c) 서열 31, 32 및 33 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 폴리펩티드; 및 d) 서열 31, 32 및 33 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 실시양태는 서열 1 내지 22, 26 내지 33, 87 및 88 중의 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 경쟁적 결합 검정에서 DR5의 천연 리간드와 완전히 또는 부분적으로 경쟁하지 않는, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중의 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 경쟁적 결합 검정에서 DR5의 천연 리간드와 완전히 또는 부분적으로 경쟁하는, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중의 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 임의의 서열 41 내지 44 (CDR1); 서열 51 내지 55 (CDR2); 서열 63 내지 68 (CDR3), 보다 바람직하게는 서열 51 내지 55 및 서열 63 내지 68에 제시된 적어도 하나의 CDR 영역에 대해 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는, 본원 식별번호 <0852>, <0856>, <0863>, <0870>, <0877> 또는 <0888>에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 임의의 서열 41 내지 44 (CDR1); 서열 51 내지 55 (CDR2); 서열 63 내지 68 (CDR3)에 제시된 CDR 영역에 대해 각각 적어도 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 갖는 CDR1 내지 CDR3 영역을 포함하는, 본원 식별번호 <0852>, <0856>, <0863>, <0870>, <0877> 또는 <0888>에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 서열 26 내지 33에 제시된 임의의 서열에 대해 적어도 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이 서열로 이루어지는, 본원 식별번호 <0852>, <0856>, <0863>, <0870>, <0877> 또는 <0888> 중 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 서열 64 또는 서열 66에 따른 CDR3 영역을 포함하는, 본원 식별번호 <0852>, <0856>, <0863>, <0870>, <0877> 또는 <0888> 중 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 서열 41 내지 44 (CDR1); 서열 51 내지 55 (CDR2); 서열 63 내지 68 (CDR3)에 제시된 CDR 영역에 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 또는 여기서 제시된 원래의 CDR 영역에 비해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 변이체 CDR 영역을 포함하는, 본원 식별번호 <0852>, <0856>, <0863>, <0870>, <0877> 또는 <0888> 중 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 이뮤노글로불린 또는 그의 단편인, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중의 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 인간화 이뮤노글로불린, 낙타화 이뮤노글로불린 또는 친화도 최적화 기법에 의해 얻을 수 있는 이뮤노글로불린, 또는 그의 단편인, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중의 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 본질적으로 경쇄 가변 도메인 서열, 예를 들어, VL-서열로; 또는 중쇄 가변 영역 도메인 서열, 예를 들어, VH-서열로 이루어지는, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중의 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 본질적으로 통상적인 4-사슬 항체로부터 유래된 중쇄 가변 영역 도메인 서열로 이루어지거나 또는 본질적으로 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 영역 도메인 서열로 이루어지는, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중의 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 본질적으로 도메인 항체, 단일 도메인 항체, dAb 및 비제한적으로 VHH 서열을 포함하는 낙타류 항체 또는 단편으로 이루어지는, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중의 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 본질적으로 VHH 서열로 이루어지는 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는
a) 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 가지며, 여기서, 아미노산 동일성 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시되고;
b) 임의로 카바트 넘버링에 따른 아미노산 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108 중의 하나 이상의 위치가 휴머니어드인,
VHH 서열로 본질적으로 이루어진, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중의 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는
a) 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 VHH 서열이며, 여기서, 아미노산 동일성 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시되고;
b) 임의로 DR5와 VHH 서열 사이의 접촉은
i) 표 29A의 잔기를 포함하는 DR5 입체형태적 에피토프;
ii) 표 30A의 잔기를 포함하는 DR5 입체형태적 에피토프;
iii) 표 29B에 나열된 VHH 아미노산의 상호작용 표면; 및
iv) 표 30B에 나열된 VHH 아미노산의 상호작용 표면으로부터 선택되는 것인
VHH 서열로 본질적으로 이루어진, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중의 임의의 하나 이상에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 본질적으로 인간화 VHH 서열로 이루어지는, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중의 임의의 문단에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 본질적으로 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중의 임의의 문단에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지고 임의로 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하는, 세포 아폽토시스를 증강시킬 수 있는 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 예를 들어 Colo205 세포 생존 검정에서 측정될 때 IC50이 100 nM 미만, 바람직하게는 10 nM 미만, 보다 바람직하게는 1 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게는 100 pM 미만, 예를 들어 10 pM 미만인 본원 식별번호 <0913>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상응하는 1가 결합 폴리펩티드가 예를 들어 Colo205 세포 기반 생존 검정에서 측정될 때 다가 폴리펩티드만큼 효력을 보이지 않는 것인, 본원 식별번호 <0913> 또는 <0914>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상기 적어도 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 1가 결합 폴리펩티드가 1가 포맷으로 각각 인간 DR5에 결합할 수 있는 것인, 본원 식별번호 <0913> 또는 <0915>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상기 적어도 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 1가 결합 폴리펩티드가 1가 포맷으로 각각 인간 DR5에 결합할 수 있지만 TRAIL-R3 및/또는 TRAIL-R4 수용체에는 결합하지 않는 것인, 본원 식별번호 <0913> 또는 <0915>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상기 적어도 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 1가 결합 폴리펩티드가 1가 포맷으로 각각 인간 DR5에 결합할 수 있고 결합 검정에서 천연 TRAIL 리간드와 경쟁하는 것인, 본원 식별번호 <0913> 또는 <0915>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상기 적어도 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 1가 결합 폴리펩티드가 모두 인간 DR5의 동일한 결합 영역에 대해 작용하는 것인, 본원 식별번호 <0913> 또는 <0915>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상기 적어도 하나의 1가 결합 폴리펩티드가 DR5의 하나의 결합 영역에 대해 작용하고 적어도 하나의 다른 1가 결합 폴리펩티드는 DR5의 또 다른 별개의 결합 영역 또는 또 다른 DR5의 결합 영역에 대해 작용하는 것인, 본원 식별번호 <0913> 또는 <0914>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상기 적어도 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 1가 결합 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인, 본원 식별번호 <0913> 또는 <0914>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 본질적으로 단일 사슬 폴리펩티드로 이루어지고 상기 적어도 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 1가 결합 단일 가변 도메인이 펩티드 링커를 통해 함께 연결되는 것인, 본원 식별번호 <0913> 또는 <0914>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상기 링커가 5 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드로 본질적으로 이루어지는 것인 본원 식별번호 <0922>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 임의로 하나 이상의 링커를 통해 연결된 폴리펩티드인, 본원 식별번호 <0913> 또는 <0915>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상기 하나 이상의 링커가 펩티드 또는 폴리펩티드 링커인, 본원 식별번호 <0852> 내지 <0924> 중의 어느 한 문단에 따른 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 도메인 항체, 단일 도메인 항체, dAb 및 비제한적으로 VHH 서열을 포함하는 낙타류 항체 또는 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인, 본원 식별번호 <0925>의 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 동일한 화합물에 비해 포유동물 유기체에 투여될 때 증가된 반감기를 갖는 화합물을 제공하는 것인, 본원 식별번호 <0913> 내지 <0927> 중의 임의의 문단에 따른 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 (1) 본원 식별번호 <0852>-<0912> 중의 임의의 문단에 규정된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 (2) 본원 식별번호 <0913> 내지 <0927> 중의 임의의 문단에 따른 화합물을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0928>의 핵산을 발현하거나 또는 적합한 환경 하에 그 핵산을 발현할 수 있는 숙주 세포를 제공한다.
한 실시양태는
a) 적합한 숙주 세포 또는 비-인간 숙주 유기체에서 본원 식별번호 <0928>의 핵산을 발현시키고;
b) 상기 DR5 결합 폴리펩티드 또는 화합물을 정제 및/또는 단리하는 것
을 포함하는, 본원 식별번호 <0852> 내지 <0912> 중 임의의 문단에 따른 DR5 결합 폴리펩티드, 또는 본원 식별번호 <0913> 내지 <0927> 중의 임의의 문단에 따른 화합물을 생산하기 위한 방법을 제공한다.
한 실시양태는 약물로서 사용하기 위한, 본원 식별번호 <0852> 내지 <0912> 중의 임의의 문단에 따른 폴리펩티드 또는 본원 식별번호 <0913> 내지 <0927> 중의 임의의 문단에 따른 화합물을 제공한다.
한 실시양태는 항암 치료제로서 사용하기 위한, 본원 식별번호 <0934>의 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 적어도 본원 식별번호 <0852> 내지 <0912> 중의 임의의 문단에 따른 폴리펩티드, 또는 본원 식별번호 <0913> 내지 <0927> 중의 임의의 문단에 따른 화합물 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 실시양태는 그를 필요로 하는 대상체에게, 제약상 유효량의 본원 식별번호 <0852>-<0912> 중의 임의의 문단에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드, 또는 본원 식별번호 <0913> 내지 <0927> 중의 임의의 문단에 따른 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 세포 아폽토시스의 증강에 의해 치료될 수 있는 장애의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
한 실시양태는 상기 장애가 증식성 질환인 본원 식별번호 <0937>의 방법을 제공한다.
한 실시양태는, 상기 증식성 질환이
a) 원발성 및 전이성 암, 예컨대 신세포 암종, 및 폐암 (예를 들어, 소세포 폐암 "SCLC" 및 비-소세포 폐암 "NSCLC"), 췌장암, 조혈 악성종양, 신경교종, 성상세포종, 중피종, 결장직장암, 전립선암, 골육종, 흑색종, 림프종 (비제한적으로 버킷 림프종 포함), 유방암, 자궁내막암, 간암, 위암, 피부암, 난소암 및 임의의 기원 (비제한적으로, 폐, 두경부, 유방, 갑상선, 자궁경부, 피부, 및/또는 식도 포함)의 편평세포암으로부터 선택된 하나 이상의 고형 암; 및
b) 백혈병, 예를 들어 특히 T-세포 백혈병, 예컨대 급성 T-세포 백혈병 (T-ALL), 급성 B-세포 백혈병 (B-ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 (AML), 형질 세포 골수종 및 다발성 골수종 (MM)으로부터 선택된 하나 이상의 액상 암
으로부터 선택되는 것인, 본원 식별번호 <0938>의 방법을 제공한다.
한 실시양태는 상기 증식성 질환이 하나 이상의 염증성 및 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스, 하시모토 질환, 류마티스 관절염, 이식편-대-숙주 질환, 쇼그렌 증후군, 악성 빈혈, 애디슨 질환, 경피증, 굿패스쳐 증후군, 크론 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 불임, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 바세도우 질환, 혈전성 혈소판감소증, 혈소판감소성 자반증, 인슐린-의존적 당뇨병, 알레르기; 천식, 아토피성 질환; 아테롬성동맥경화증; 심근염; 심근병증; 사구체신염; 및 저형성 빈혈을 포함하는 하나 이상의 비-암 적응증인, 본원 식별번호 <0938>의 방법을 제공한다.
한 실시양태는 증식성 질환이 췌장암인 본원 식별번호 <0939>-<0942>의 방법을 제공한다.
한 실시양태는 증식성 질환이 T-ALL인 본원 식별번호 <0939>-<0942>의 방법을 제공한다.
한 실시양태는 증식성 질환이 중피종인 본원 식별번호 <0939>-<0942>의 방법을 제공한다.
한 실시양태는 증식성 질환이 임의의 조직 기원의 편평 세포 암종인 본원 식별번호 <0939>-<0942>의 방법을 제공한다.
한 실시양태는 증식성 질환이 AML인 본원 식별번호 <0939>-<0942>의 방법을 제공한다.
한 실시양태는 증식성 질환이 흑색종인 본원 식별번호 <0939>-<0942>의 방법을 제공한다.
한 실시양태는 증식성 질환이 골수종인 본원 식별번호 <0939>-<0942>의 방법을 제공한다.
한 실시양태는 본원 식별번호 <0852>-<0912> 중의 임의의 문단에 따른 폴리펩티드 또는 본원 식별번호 <0913> 내지 <0927> 중의 임의의 문단에 따른 적어도 하나의 화합물을 포함하고, cIAP1, cIAP2, XIAP, cFLIP 및 Bcl-xL 중에서 선택되는 임의의 하나 이상의 유전자의 적어도 하나의 억제제와 조합되는 조성물을 제공한다.
한 실시양태는 억제제가 cIAP1의 억제제인 본원 식별번호 <0951>의 조성물을 제공한다.
한 실시양태는 MEK의 억제제를 추가로 포함하는 본원 식별번호 <0952>의 조성물을 제공한다.
한 실시양태는 BRAF의 억제제를 추가로 포함하는 본원 식별번호 <0952>의 조성물을 제공한다.
한 실시양태는 억제제가 XIAP의 억제제인 본원 식별번호 <0951>의 조성물을 제공한다.
한 실시양태는 억제제가 cFLIP의 억제제인 본원 식별번호 <0951>의 조성물을 제공한다.
한 실시양태는 억제제가 LCL161 및 ABT263으로부터 선택된 저분자량 화합물인 본원 식별번호 <0951>의 조성물을 제공한다.
한 실시양태는 억제제가 shRNA인 본원 식별번호 <0951>의 조성물을 제공한다.
한 실시양태는 그를 필요로 하는 대상체에게 제약상 유효량의 상기 조성물 또는 그의 조합물을 DR5 연관 질환의 치료를 위해 투여하는 것을 포함하는, 본원 식별번호 <0936>의 임의의 하나 이상의 조성물의 사용 방법을 제공한다.
한 실시양태는 DR5 연관 질환이 다음 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 본원 식별번호 <0959>의 방법을 제공한다:
a) 고형 및 액상 암으로부터 선택된 하나 이상의 증식성 질환
(i) 여기서, 고형 종양은 원발성 및 전이성 암, 예컨대 신세포 암종, 및 폐암 (예를 들어, 소세포 폐암 "SCLC" 및 비-소세포 폐암 "NSCLC"), 췌장암, 조혈 악성종양, 신경교종, 성상세포종, 중피종, 결장직장암, 전립선암, 골육종, 흑색종, 림프종 (비제한적으로 버킷 림프종 포함), 유방암, 자궁내막암, 간암, 위암, 피부암, 난소암 및 임의의 기원의 편평세포암 (비제한적으로, 폐, 두경부, 유방, 갑상선, 자궁경부, 피부, 및/또는 식도의 편평세포암 포함)을 포함하고;
(ii) 액상 암은 백혈병, 예를 들어 특히 T-세포 백혈병, 예컨대 급성 T-세포 백혈병 (T-ALL), 급성 B-세포 백혈병 (B-ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 (AML), 형질 세포 골수종 및 다발성 골수종 (MM)을 포함함; 및
b) 하나 이상의 염증성 및 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스, 하시모토 질환, 류마티스 관절염, 이식편-대-숙주 질환, 쇼그렌 증후군, 악성 빈혈, 애디슨 질환, 경피증, 굿패스쳐 증후군, 크론 질환, 자가면역 용혈성 빈혈; 불임, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 바세도우 질환, 혈전성 혈소판감소증, 혈소판감소성 자반증, 인슐린-의존적 당뇨병, 알레르기; 천식, 아토피성 질환; 아테롬성동맥경화증; 심근염; 심근병증; 사구체신염; 및 저형성 빈혈을 포함하는 비-암 적응증.
한 실시양태는 CDR이 카바트 및/또는 코티아 규칙에 따라 계산된 것인, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중 임의의 하나 이상에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태는 폴리펩티드가 표 29A 및/또는 30A에 제시된 하나 이상의 에피토프에 결합하고/하거나, 표 29B 및/또는 30B에 제시된 상호작용성 표면 잔기를 포함하는 것인, 선행 본원 식별번호 <0852> 내지 본 문단 중 임의의 하나 이상에 따른 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 다음 청구항은 비제한적이다. 제형화, 전달, 인간화, 발현 시스템 등에서 변화를 포함하지만 그로 제한되지 않는 본 발명에 대한 특정 변동은 당업자의 능력 내에 있는 것으로 고려될 수 있다. 그러한 변동은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로서 고려된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG CROMIE, Karen DOMBRECHT, Bruno ETTENBERG, Seth KOLKMAN, Joost LI, Jing MEERSCHAERT, Kris STOVER, David ZHANG, Jingxin <120> Biologic Compounds <130> PAT054056A <160> 103 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Ile 20 25 30 Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro Val Gly 100 105 110 Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Leu Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 126 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr Met Thr 100 105 110 Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Glu Ile Thr Pro Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Val Arg Glu Arg Gly Thr Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 448 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Ile 20 25 30 Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro Val Gly 100 105 110 Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly 165 170 175 Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser 180 185 190 Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 195 200 205 Val Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 210 215 220 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 225 230 235 240 Tyr Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro Val 260 265 270 Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 325 330 335 Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly 340 345 350 Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu 355 360 365 Phe Val Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp 370 375 380 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 385 390 395 400 Val Tyr Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 405 410 415 Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro 420 425 430 Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 435 440 445 <210> 7 <211> 609 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Ile 20 25 30 Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro Val Gly 100 105 110 Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly 165 170 175 Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser 180 185 190 Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 195 200 205 Val Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 210 215 220 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 225 230 235 240 Tyr Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro Val 260 265 270 Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 325 330 335 Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly 340 345 350 Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu 355 360 365 Phe Val Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp 370 375 380 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 385 390 395 400 Val Tyr Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 405 410 415 Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro 420 425 430 Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln 485 490 495 Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe 500 505 510 Gly Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg 515 520 525 Glu Phe Val Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala 530 535 540 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 545 550 555 560 Thr Val Tyr Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val 565 570 575 Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val 580 585 590 Pro Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 595 600 605 Ser <210> 8 <211> 770 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Ile 20 25 30 Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro Val Gly 100 105 110 Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly 165 170 175 Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser 180 185 190 Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 195 200 205 Val Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 210 215 220 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 225 230 235 240 Tyr Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro Val 260 265 270 Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 325 330 335 Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly 340 345 350 Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu 355 360 365 Phe Val Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp 370 375 380 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 385 390 395 400 Val Tyr Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 405 410 415 Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro 420 425 430 Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln 485 490 495 Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe 500 505 510 Gly Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg 515 520 525 Glu Phe Val Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala 530 535 540 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 545 550 555 560 Thr Val Tyr Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val 565 570 575 Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val 580 585 590 Pro Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 595 600 605 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 610 615 620 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 625 630 635 640 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val 645 650 655 Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr 660 665 670 Phe Gly Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu 675 680 685 Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr 690 695 700 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 705 710 715 720 Asn Thr Val Tyr Met Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 725 730 735 Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg 740 745 750 Val Pro Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 755 760 765 Ser Ser 770 <210> 9 <211> 442 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Leu Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 180 185 190 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 195 200 205 Ala Leu Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 210 215 220 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 225 230 235 240 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 245 250 255 Ala Ala Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp Tyr 260 265 270 Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 305 310 315 320 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu 325 330 335 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met 340 345 350 Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala 355 360 365 Leu Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 370 375 380 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 385 390 395 400 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 405 410 415 Ala Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp Tyr Trp 420 425 430 Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 435 440 <210> 10 <211> 601 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Leu Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 180 185 190 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 195 200 205 Ala Leu Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 210 215 220 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 225 230 235 240 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 245 250 255 Ala Ala Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp Tyr 260 265 270 Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 305 310 315 320 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu 325 330 335 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met 340 345 350 Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala 355 360 365 Leu Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 370 375 380 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 385 390 395 400 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 405 410 415 Ala Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp Tyr Trp 420 425 430 Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 450 455 460 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 465 470 475 480 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg 485 490 495 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly 500 505 510 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Leu 515 520 525 Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg 530 535 540 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 545 550 555 560 Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala 565 570 575 Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp Tyr Trp Gly 580 585 590 Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 595 600 <210> 11 <211> 760 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Leu Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 180 185 190 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 195 200 205 Ala Leu Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 210 215 220 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 225 230 235 240 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 245 250 255 Ala Ala Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp Tyr 260 265 270 Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 305 310 315 320 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu 325 330 335 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met 340 345 350 Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala 355 360 365 Leu Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 370 375 380 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 385 390 395 400 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 405 410 415 Ala Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp Tyr Trp 420 425 430 Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 450 455 460 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 465 470 475 480 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg 485 490 495 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly 500 505 510 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Leu 515 520 525 Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg 530 535 540 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 545 550 555 560 Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala 565 570 575 Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp Tyr Trp Gly 580 585 590 Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 595 600 605 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 610 615 620 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 625 630 635 640 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu 645 650 655 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly Trp 660 665 670 Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Leu Asn 675 680 685 Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 690 695 700 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn 705 710 715 720 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly 725 730 735 Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Lys 740 745 750 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 755 760 <210> 12 <211> 396 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr Met Thr 100 105 110 Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 145 150 155 160 Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro 165 170 175 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp 180 185 190 Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 195 200 205 Asn Phe Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu 210 215 220 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe 225 230 235 240 Ser Leu Ile Arg Thr Met Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln 245 250 255 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val 260 265 270 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 275 280 285 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Met 290 295 300 Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 305 310 315 320 Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Arg Gly 325 330 335 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 340 345 350 Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 355 360 365 Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr Met Thr Val Asp 370 375 380 Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 385 390 395 <210> 13 <211> 418 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr Met Thr 100 105 110 Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 145 150 155 160 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 165 170 175 Arg Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 180 185 190 Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp 195 200 205 Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr 210 215 220 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr 245 250 255 Met Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 290 295 300 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 305 310 315 320 Phe Ser Arg Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 325 330 335 Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr 340 345 350 Arg Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys 355 360 365 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala 370 375 380 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile 385 390 395 400 Arg Thr Met Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 405 410 415 Ser Ser <210> 14 <211> 448 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr Met Thr 100 105 110 Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg 180 185 190 Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 195 200 205 Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser 210 215 220 Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu 225 230 235 240 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr Met 260 265 270 Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 325 330 335 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 340 345 350 Arg Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 355 360 365 Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp 370 375 380 Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr 385 390 395 400 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 405 410 415 Tyr Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr 420 425 430 Met Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 435 440 445 <210> 15 <211> 609 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr Met Thr 100 105 110 Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg 180 185 190 Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 195 200 205 Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser 210 215 220 Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu 225 230 235 240 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr Met 260 265 270 Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 325 330 335 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 340 345 350 Arg Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 355 360 365 Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp 370 375 380 Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr 385 390 395 400 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 405 410 415 Tyr Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr 420 425 430 Met Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 485 490 495 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 500 505 510 Ser Arg Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 515 520 525 Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg 530 535 540 Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn 545 550 555 560 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val 565 570 575 Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg 580 585 590 Thr Met Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 595 600 605 Ser <210> 16 <211> 770 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr Met Thr 100 105 110 Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg 180 185 190 Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 195 200 205 Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser 210 215 220 Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu 225 230 235 240 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr Met 260 265 270 Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 325 330 335 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 340 345 350 Arg Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 355 360 365 Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp 370 375 380 Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr 385 390 395 400 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 405 410 415 Tyr Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr 420 425 430 Met Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 485 490 495 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 500 505 510 Ser Arg Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 515 520 525 Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg 530 535 540 Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn 545 550 555 560 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val 565 570 575 Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg 580 585 590 Thr Met Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 595 600 605 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 610 615 620 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 625 630 635 640 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 645 650 655 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 660 665 670 Phe Ser Arg Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 675 680 685 Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr 690 695 700 Arg Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys 705 710 715 720 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala 725 730 735 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile 740 745 750 Arg Thr Met Thr Val Asp Pro Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 755 760 765 Ser Ser 770 <210> 17 <211> 436 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Glu Ile Thr Pro Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Val Arg Glu Arg Gly Thr Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn Asn Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile 195 200 205 Thr Pro Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys Ser Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Val 245 250 255 Arg Glu Arg Gly Thr Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 325 330 335 Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg 340 345 350 Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile Thr Pro Arg 355 360 365 Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser 370 375 380 Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys 385 390 395 400 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Val Arg Glu Arg 405 410 415 Gly Thr Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 420 425 430 Thr Val Ser Ser 435 <210> 18 <211> 593 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Glu Ile Thr Pro Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Val Arg Glu Arg Gly Thr Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn Asn Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile 195 200 205 Thr Pro Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys Ser Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Val 245 250 255 Arg Glu Arg Gly Thr Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 325 330 335 Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg 340 345 350 Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile Thr Pro Arg 355 360 365 Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser 370 375 380 Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys 385 390 395 400 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Val Arg Glu Arg 405 410 415 Gly Thr Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 420 425 430 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 485 490 495 Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro 500 505 510 Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile Thr Pro Arg Gly Arg Thr 515 520 525 Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 530 535 540 Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 545 550 555 560 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Val Arg Glu Arg Gly Thr Ser 565 570 575 Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 580 585 590 Ser <210> 19 <211> 750 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Glu Ile Thr Pro Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Val Arg Glu Arg Gly Thr Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn Asn Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile 195 200 205 Thr Pro Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys Ser Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Val 245 250 255 Arg Glu Arg Gly Thr Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 325 330 335 Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg 340 345 350 Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile Thr Pro Arg 355 360 365 Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser 370 375 380 Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys 385 390 395 400 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Val Arg Glu Arg 405 410 415 Gly Thr Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 420 425 430 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 485 490 495 Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro 500 505 510 Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile Thr Pro Arg Gly Arg Thr 515 520 525 Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 530 535 540 Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 545 550 555 560 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Val Arg Glu Arg Gly Thr Ser 565 570 575 Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 580 585 590 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 595 600 605 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 610 615 620 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 625 630 635 640 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile 645 650 655 Asp Ser Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln 660 665 670 Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile Thr Pro Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Ala 675 680 685 Asp Ser Glu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg 690 695 700 Thr Val Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val 705 710 715 720 Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Val Arg Glu Arg Gly Thr Ser Trp Tyr Arg 725 730 735 Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 740 745 750 <210> 20 <211> 436 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile 195 200 205 Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile 245 250 255 Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 325 330 335 Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg 340 345 350 Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly 355 360 365 Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 370 375 380 Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys 385 390 395 400 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg 405 410 415 Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 420 425 430 Thr Val Ser Ser 435 <210> 21 <211> 593 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile 195 200 205 Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile 245 250 255 Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 325 330 335 Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg 340 345 350 Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly 355 360 365 Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 370 375 380 Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys 385 390 395 400 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg 405 410 415 Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 420 425 430 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 485 490 495 Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro 500 505 510 Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr 515 520 525 Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 530 535 540 Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 545 550 555 560 Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile 565 570 575 Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 580 585 590 Ser <210> 22 <211> 750 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile 195 200 205 Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile 245 250 255 Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 325 330 335 Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg 340 345 350 Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly 355 360 365 Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 370 375 380 Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys 385 390 395 400 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg 405 410 415 Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 420 425 430 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 485 490 495 Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro 500 505 510 Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr 515 520 525 Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 530 535 540 Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 545 550 555 560 Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile 565 570 575 Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 580 585 590 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 595 600 605 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 610 615 620 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 625 630 635 640 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe 645 650 655 Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln 660 665 670 Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala 675 680 685 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp 690 695 700 Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val 705 710 715 720 Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr 725 730 735 Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 740 745 750 <210> 23 <211> 35 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 23 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 26 <211> 126 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 26 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Ile 20 25 30 Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val Pro Val Gly 100 105 110 Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 27 <211> 448 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 27 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Ile 20 25 30 Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val Pro Val Gly 100 105 110 Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser 180 185 190 Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe 195 200 205 Val Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 210 215 220 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 225 230 235 240 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val Pro Val 260 265 270 Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 325 330 335 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly 340 345 350 Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu 355 360 365 Phe Val Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp 370 375 380 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 385 390 395 400 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 405 410 415 Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val Pro 420 425 430 Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 435 440 445 <210> 28 <211> 609 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 28 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Ile 20 25 30 Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val Pro Val Gly 100 105 110 Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser 180 185 190 Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe 195 200 205 Val Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 210 215 220 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 225 230 235 240 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val Pro Val 260 265 270 Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 325 330 335 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly 340 345 350 Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu 355 360 365 Phe Val Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp 370 375 380 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 385 390 395 400 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 405 410 415 Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val Pro 420 425 430 Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 485 490 495 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe 500 505 510 Gly Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg 515 520 525 Glu Phe Val Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala 530 535 540 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 545 550 555 560 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val 565 570 575 Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val 580 585 590 Pro Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 595 600 605 Ser <210> 29 <211> 770 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 29 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Ile 20 25 30 Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val Pro Val Gly 100 105 110 Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser 180 185 190 Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe 195 200 205 Val Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 210 215 220 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 225 230 235 240 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val Pro Val 260 265 270 Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 325 330 335 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly 340 345 350 Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu 355 360 365 Phe Val Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp 370 375 380 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 385 390 395 400 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 405 410 415 Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val Pro 420 425 430 Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 485 490 495 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe 500 505 510 Gly Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg 515 520 525 Glu Phe Val Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala 530 535 540 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 545 550 555 560 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val 565 570 575 Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val 580 585 590 Pro Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 595 600 605 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 610 615 620 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 625 630 635 640 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 645 650 655 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr 660 665 670 Phe Gly Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 675 680 685 Arg Glu Phe Val Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr 690 695 700 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 705 710 715 720 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala 725 730 735 Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg 740 745 750 Val Pro Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 755 760 765 Ser Ser 770 <210> 30 <211> 122 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 30 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 436 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 31 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile 195 200 205 Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile 245 250 255 Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 325 330 335 Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg 340 345 350 Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly 355 360 365 Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 370 375 380 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 385 390 395 400 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg 405 410 415 Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 420 425 430 Thr Val Ser Ser 435 <210> 32 <211> 593 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 32 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile 195 200 205 Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile 245 250 255 Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 325 330 335 Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg 340 345 350 Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly 355 360 365 Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 370 375 380 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 385 390 395 400 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg 405 410 415 Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 420 425 430 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 485 490 495 Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro 500 505 510 Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr 515 520 525 Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 530 535 540 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 545 550 555 560 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile 565 570 575 Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 580 585 590 Ser <210> 33 <211> 750 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 33 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile 195 200 205 Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile 245 250 255 Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 325 330 335 Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg 340 345 350 Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly 355 360 365 Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 370 375 380 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 385 390 395 400 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg 405 410 415 Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 420 425 430 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 485 490 495 Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro 500 505 510 Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr 515 520 525 Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 530 535 540 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 545 550 555 560 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile 565 570 575 Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 580 585 590 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 595 600 605 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 610 615 620 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 625 630 635 640 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe 645 650 655 Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln 660 665 670 Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala 675 680 685 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 690 695 700 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val 705 710 715 720 Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr 725 730 735 Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 740 745 750 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 35 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 35 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly 20 25 30 <210> 36 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly 20 25 30 <210> 37 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 37 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys 20 25 30 <210> 38 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys 20 25 30 <210> 39 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser 20 25 30 <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 41 Asn Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 42 Ser Ile Arg Val Gly 1 5 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 43 Ile Asn Asn Met Gly 1 5 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 44 Arg Tyr Trp Met Tyr 1 5 <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 45 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 46 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ser 1 5 10 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 47 Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 48 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala 1 5 10 <210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 49 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 50 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 51 Ala Leu Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 52 Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 53 Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 54 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 54 Glu Ile Thr Pro Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Glu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 55 Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 56 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 56 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 57 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 57 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 58 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 58 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Met Gln 1 5 10 15 Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 59 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 59 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala 20 25 30 <210> 60 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala 20 25 30 <210> 61 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 61 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Asn Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala 20 25 30 <210> 62 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 62 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 63 Ala Gly Ser Phe Ser Leu Gly Gly Arg Pro Tyr Gly Asp Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 64 Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp Arg Val Pro Val Gly Ala Val 1 5 10 15 Tyr <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 65 Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro Val Gly Ala Val 1 5 10 15 Tyr <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 66 Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 67 Glu Val Arg Glu Arg Gly Thr Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Tyr 1 5 10 <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 68 Ala Glu Gly Pro Pro Thr Phe Ser Leu Ile Arg Thr Met Thr Val Asp 1 5 10 15 Pro <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 69 Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 70 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 71 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 72 Gly Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 73 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 73 Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Cys Cys Thr Gly Gly 20 <210> 74 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 74 Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Cys Cys Thr Gly Gly 20 <210> 75 <211> 23 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 75 Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala 1 5 10 15 Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys 20 <210> 76 <211> 55 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 76 Cys Ala Thr Thr Thr Gly Ala Gly Thr Thr Gly Gly Cys Cys Thr Ala 1 5 10 15 Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Gly Thr Gly Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Thr 35 40 45 Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly 50 55 <210> 77 <211> 18 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 77 Thr Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala 1 5 10 15 Gly Thr <210> 78 <211> 18 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 78 Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr Gly Ala 1 5 10 15 Cys Cys <210> 79 <211> 88 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 79 Thr Cys Ala Gly Thr Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Cys Cys 1 5 10 15 Cys Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr 20 25 30 Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys 35 40 45 Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys 50 55 60 Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Cys Gly 65 70 75 80 Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly 85 <210> 80 <211> 84 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 80 Ala Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys 1 5 10 15 Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly 20 25 30 Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly 35 40 45 Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Gly Ala Gly 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Thr 65 70 75 80 Cys Thr Gly Gly <210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 81 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 82 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 82 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 83 <211> 22 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 83 Cys Thr Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ala Cys Cys Thr Ala Gly 20 <210> 84 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 84 Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ala Gly Ala 20 <210> 85 <211> 28 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 85 Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Ala Cys Gly Cys Cys 20 25 <210> 86 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 86 Thr Thr Ala Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly 1 5 10 15 Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys 20 25 30 <210> 87 <211> 122 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 87 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 88 <211> 593 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 88 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile 195 200 205 Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile 245 250 255 Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 325 330 335 Ala Ala Ser Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg 340 345 350 Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly 355 360 365 Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 370 375 380 Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys 385 390 395 400 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg 405 410 415 Ala Tyr Ile Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 420 425 430 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 485 490 495 Gly Thr Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro 500 505 510 Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr 515 520 525 Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 530 535 540 Ala Lys Asp Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 545 550 555 560 Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile 565 570 575 Asp Val Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 580 585 590 Ser <210> 89 <211> 440 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu 20 25 30 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu 35 40 45 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 50 55 60 Gln Arg Val Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Ala Pro 180 185 190 Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro 195 200 205 Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val 210 215 220 Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val 225 230 235 240 Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu 245 250 255 Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu 260 265 270 Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu 275 280 285 Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser 290 295 300 Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser 305 310 315 320 Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu 325 330 335 Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp 340 345 350 Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile 355 360 365 Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr 370 375 380 Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His 385 390 395 400 Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln 405 410 415 Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu 420 425 430 Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 435 440 <210> 90 <211> 126 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(115) <223> Wherein X is any amino acid <400> 90 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 91 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 1 5 10 <210> 92 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 92 His His His His His His 1 5 <210> 93 <211> 23 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 93 Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 1 5 10 15 Ala His His His His His His 20 <210> 94 <211> 23 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 94 Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 1 5 10 15 Ala His His His His His His 20 <210> 95 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 95 Gly Gly Gly Cys 1 <210> 96 <211> 378 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 96 gaggtgcagc tgctggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggccg gaccttcggc tccatcagag tgggctggtt ccggcaggcc 120 cctggcaagg gccgggagtt cgtgtccgcc atcaaccgga acgacggcac cacctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccgtgtac 240 ctgcagatga actccctgcg gcccgaggac accgccgtgt actactgcgc cgctggcctg 300 cagtacaaca gagccgccga cagagtgcct gtgggcgctg tgtactgggg ccagggcacc 360 ctggtgaccg tgtcctct 378 <210> 97 <211> 1827 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 97 gaggtgcagc tgctggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggccg gaccttcggc tccatcagag tgggctggtt ccggcaggcc 120 cctggcaagg gccgggagtt cgtgtccgcc atcaaccgga acgacggcac cacctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccgtgtac 240 ctgcagatga actccctgcg gcccgaggac accgccgtgt actactgcgc cgctggcctg 300 cagtacaaca gagccgccga cagagtgcct gtgggcgctg tgtactgggg ccagggcacc 360 ctggtgaccg tgtcctctgg cggcggagga tctggagggg gaggaagcgg cggaggagga 420 tctggcggcg gaggaagtgg gggcggaggg agtggcggag gtggaagtgg tggagggggc 480 agcgaggtgc agctgctgga gagcggcgga ggactggtgc agccaggcgg atctctgcgc 540 ctgagctgcg ccgccagcgg cagaaccttt ggcagcatcc gcgtgggatg gttcagacag 600 gctcccggaa agggacgcga gtttgtgtct gctatcaatc gcaatgatgg caccacatac 660 tatgctgata gcgtgaaggg aagattcacc atcagccgcg acaatagcaa gaatacagtg 720 tatctgcaga tgaatagcct gcgcccagag gatacagctg tgtattactg tgctgccgga 780 ctgcagtata accgggctgc cgatcgggtg cccgtgggag ccgtgtattg gggacaggga 840 acactggtga cagtgtcctc tggcggcgga ggatctgggg gtggcggatc tggcggcgga 900 ggaagcggtg gcggaggatc tggcggcgga ggaagcggag ggggaggatc tggcggcgga 960 ggatctgagg tgcagctgct ggagtccggc ggaggactgg tgcagccagg cggcagcctg 1020 cggctgtctt gcgccgcttc tggcagaaca ttcggctcta tccgcgtggg ctggtttagg 1080 caggctccag gcaagggacg cgagttcgtg agcgctatca acagaaacga tggcacaacc 1140 tattatgctg attctgtgaa gggcaggttt acaatcagca gggataattc taagaatacc 1200 gtgtacctgc agatgaactc tctgaggcca gaggataccg ctgtgtacta ttgcgctgcc 1260 ggcctgcagt ataatagggc cgctgaccgc gtgccagtgg gcgccgtgta ttggggccag 1320 ggcaccctgg tgacagtgtc ctctggcgga ggtggcagcg gcggtggcgg atctggcggc 1380 ggaggaagtg ggggcggagg atctggcggc ggaggaagcg gcggaggggg atctggcggc 1440 ggaggatctg aggtgcagct gctggagtct ggcggaggac tggtgcagcc tggcggaagc 1500 ctgagactga gctgtgctgc ttctggccgc accttcggaa gcatcagagt gggatggttt 1560 cgccaggctc caggaaaggg ccgggagttc gtctctgcta tcaatagaaa tgacggaaca 1620 acatattacg ccgacagcgt gaagggacgc tttacaatct ctagggataa cagcaagaac 1680 accgtgtatc tgcagatgaa cagcctgcgg cccgaggata ccgccgtgta ttattgtgcc 1740 gctggactgc agtacaatcg ggccgctgat agagtgcctg tgggagccgt gtactggggc 1800 cagggcacac tggtgacagt gtctagc 1827 <210> 98 <211> 366 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 98 gaggtgcagc tgctggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggcac cttcgacaag atcaacaaca tgggctggta caggcaggcc 120 cctggcaagc agagggacct ggtggcccag atcacccctg gcggcatcac cgactacgcc 180 gactccgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240 cagatgaact ccctgcggcc cgaggacacc gccgtgtact actgcaacgc cgagatcctg 300 aagcgggcct acatcgacgt gtacgtgaac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360 tcctct 366 <210> 99 <211> 1779 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 99 gaggtgcagc tgctggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggcac cttcgacaag atcaacaaca tgggctggta caggcaggcc 120 cctggcaagc agagggacct ggtggcccag atcacccctg gcggcatcac cgactacgcc 180 gactccgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240 cagatgaact ccctgcggcc cgaggacacc gccgtgtact actgcaacgc cgagatcctg 300 aagcgggcct acatcgacgt gtacgtgaac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360 tcctctggcg gcggaggatc tggaggggga ggaagcggcg gaggaggatc tggcggcgga 420 ggaagtgggg gcggagggag tggcggaggt ggaagtggtg gagggggcag cgaggtgcag 480 ctgctggaga gcggcggagg actggtgcag ccaggcggat ctctgcgcct gagctgcgcc 540 gccagcggca catttgataa gatcaataat atgggatggt atcgccaggc tccaggcaag 600 cagcgcgatc tggtggctca gatcacacca ggcggaatca cagattatgc cgatagcgtg 660 aagggaagat tcaccatcag ccgcgacaat agcaagaata cactgtatct gcagatgaat 720 agcctgcgcc cagaggatac agctgtgtat tactgtaatg ctgagatcct gaagcgcgct 780 tatatcgatg tgtatgtgaa ttattgggga cagggaacac tggtgacagt gtcctctggc 840 ggcggaggat ctgggggtgg cggatctggc ggcggaggaa gcggtggcgg aggatctggc 900 ggcggaggaa gcggaggggg aggatctggc ggcggaggat ctgaggtgca gctgctggag 960 tccggcggag gactggtgca gccaggcggc agcctgcggc tgtcttgcgc cgcttctggc 1020 accttcgata agatcaacaa tatgggatgg tacagacagg ctcccggaaa gcagcgggat 1080 ctggtggccc agatcacccc aggcggcatc acagattacg ctgattctgt gaagggcagg 1140 tttacaatca gcagggataa ttctaagaat accctgtacc tgcagatgaa ctctctgagg 1200 ccagaggata ccgctgtgta ctattgtaac gccgagatcc tgaagagggc ttacatcgat 1260 gtgtacgtga attattgggg ccagggcacc ctggtgacag tgtcctctgg cggaggtggc 1320 agcggcggtg gcggatctgg cggcggagga agtgggggcg gaggatctgg cggcggagga 1380 agcggcggag ggggatctgg cggcggagga tctgaggtgc agctgctgga gtctggcgga 1440 ggactggtgc agcctggcgg aagcctgaga ctgagctgtg ctgcttctgg caccttcgac 1500 aagatcaata atatgggctg gtatagacag gccccaggaa agcagaggga cctggtcgct 1560 cagatcacac ccggcggaat caccgactac gctgacagcg tgaagggacg ctttacaatc 1620 tctagggata acagcaagaa caccctgtat ctgcagatga acagcctgcg gcccgaggat 1680 accgccgtgt attattgcaa tgctgagatc ctgaagaggg cctatatcga cgtgtatgtg 1740 aattactggg gccagggcac actggtgaca gtgtcctct 1779 <210> 100 <211> 188 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 100 Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 1 5 10 15 Ser Ala Phe Ala Ala Asp Leu Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Ala 20 25 30 Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln 35 40 45 Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His 50 55 60 Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp 65 70 75 80 Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg 85 90 95 Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn 100 105 110 Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro 115 120 125 Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys 130 135 140 Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu 145 150 155 160 Ser Ala Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser Ser Gly Lys 165 170 175 Leu Gly His His His His His His His His His His 180 185 <210> 101 <211> 186 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 101 Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 1 5 10 15 Ser Ala Phe Ala Ala Asp Leu Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly 20 25 30 Pro Ser Met Ala Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys 35 40 45 Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser 50 55 60 Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser 65 70 75 80 Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp 85 90 95 Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val 100 105 110 Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met 115 120 125 Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly 130 135 140 Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Ala 145 150 155 160 Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser Ser Gly Lys Leu Gly 165 170 175 His His His His His His His His His His 180 185 <210> 102 <211> 166 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 102 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr 35 40 45 Phe Asp Lys Ile Asn Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gln Arg Asp Leu Val Ala Gln Ile Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 85 90 95 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Ile Asp Val 115 120 125 Tyr Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 145 150 155 160 His His His His His His 165 <210> 103 <211> 153 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 103 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Thr Phe Gly Ser Ile Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Arg Glu Phe Val Ser Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Ala Asp 115 120 125 Arg Val Pro Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 130 135 140 Val Ser Ser His His His His His His 145 150

Claims (31)

  1. 인간 DR5에 특이적으로 결합하는 NB 작용제의 단일 가변 도메인의 적어도 하나의 단량체를 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 a) 서열 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인; b) 서열 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR3에 대해 90% 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인; 및 c) 서열 63-68 중의 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR3에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열을 포함하는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 a) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인; 및 b) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 적어도 하나의 단일 가변 도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 폴리펩티드.
  4. 인간 DR5에 특이적으로 결합하는 단일 가변 도메인의 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 단량체 하위단위를 포함하고, 상기 하위단위는 폴리펩티드 링커에 의해 임의로 연결된 것인 단리된 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 단일 가변 도메인의 동일한 단량체를 포함하고, 상기 단일 가변 도메인이 a) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 단일 가변 도메인; b) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 적어도 하나의 단일 가변 도메인에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인; 및 c) 서열 1-5, 26, 30 및 87을 갖는 적어도 하나의 단일 가변 도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 폴리펩티드.
  6. 제4항에 있어서, a) 서열 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 및 31을 갖는 아미노산 서열; 및 b) 서열 6, 9, 12-14, 17, 20, 27 및 31을 갖는 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군 중의 하나 이상의 하위단위에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  7. 제4항에 있어서, 인간 DR5에 특이적으로 결합하고, Colo205, 주르카트 (Jurkat), Molt4, H2122, H226 및 H2052로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 2개의 종양 세포주의 집단에 대해 100 nM 이하의 시험관내 효력 (IC50)을 갖는 것인 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 100 pM 이하의 시험관내 효능을 갖는 폴리펩티드.
  9. 서열 1 내지 22, 26 내지 33, 87 및 88 중의 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  10. 제1항에 있어서, 임의의 서열 41 내지 44 (CDR1); 서열 51 내지 55 (CDR2); 서열 63 내지 68 (CDR3), 보다 바람직하게는 서열 51 내지 55 및 서열 63 내지 68에 제시된 적어도 하나의 CDR 영역에 대해 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 이뮤노글로불린, 낙타화 (camelized) 이뮤노글로불린 또는 친화도 최적화 기법에 의해 얻을 수 있는 이뮤노글로불린, 또는 그의 단편인 단리된 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 본질적으로 경쇄 가변 도메인 서열, 예를 들어, VL-서열로 또는 중쇄 가변 영역 도메인 서열, 예를 들어, VH-서열로 이루어지거나, 또는 도메인 항체, 단일 도메인 항체, dAb 및 비제한적으로 VHH 서열을 포함하는 낙타류 항체 또는 단편인 단리된 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 1-22, 26-40, 87-88, 및 103-104의 아미노산 서열 중, 또는 서열 96-99 중 적어도 하나에 의해 코딩되는 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 가지며, 여기서, 아미노산 동일성 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시되고;
    b) 임의로 카바트 넘버링에 따른 아미노산 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108 중의 하나 이상의 위치가 휴머니어드 (humaneered)인
    VHH 서열로 본질적으로 이루어진 단리된 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지고, 임의로 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하는, 세포 아폽토시스를 증강시킬 수 있는 화합물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 적어도 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 1가 결합 폴리펩티드가 모두 인간 DR5의 동일한 결합 영역에 대해 작용하는 것인 화합물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 적어도 하나의 1가 결합 폴리펩티드가 DR5의 하나의 결합 영역에 대해 작용하고 적어도 하나의 다른 1가 결합 폴리펩티드가 DR5의 또 다른 별개의 결합 영역 또는 또 다른 DR5의 결합 영역에 대해 작용하는 것인 화합물.
  17. 제1항에 있어서, 약물로서 사용하기 위한 폴리펩티드.
  18. 제17항에 있어서, 항암 치료제로서 사용하기 위한 폴리펩티드.
  19. 제18항에 따른 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트.
  20. 세포 아폽토시스의 증강에 의해 치료될 수 있는 장애의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 제약상 유효량의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 세포 아폽토시스의 증강에 의해 치료될 수 있는 장애의 예방 및/또는 치료 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 장애가 DR5 활성의 효능작용에 반응성인 증식성 질환인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 증식성 질환이
    a) 원발성 및 전이성 암, 예컨대 신세포 암종, 및 폐암 (예를 들어, 소세포 폐암 "SCLC" 및 비-소세포 폐암 "NSCLC"), 췌장암, 조혈 악성종양, 신경교종, 성상세포종, 중피종, 결장직장암, 전립선암, 골육종, 흑색종, 림프종 (비제한적으로 버킷 림프종 포함), 유방암, 자궁내막암, 간암, 위암, 피부암, 난소암 및 임의의 기원의 편평세포암 (비제한적으로, 폐, 두경부, 유방, 갑상선, 자궁경부, 피부, 및/또는 식도의 편평세포암 포함)으로부터 선택된 하나 이상의 고형 암;
    b) 특히 T-세포 백혈병, 예컨대 급성 T-세포 백혈병 (T-ALL), 급성 B-세포 백혈병 (B-ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함하는 백혈병, 형질 세포 골수종 및 다발성 골수종 (MM)으로부터 선택된 하나 이상의 액상 암; 및
    c) 하나 이상의 염증성 및 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스, 하시모토 질환, 류마티스 관절염, 이식편-대-숙주 질환, 쇼그렌 증후군, 악성 빈혈, 애디슨 질환, 경피증, 굿패스쳐 증후군, 크론 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 불임, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 바세도우 질환, 혈전성 혈소판감소증, 혈소판감소성 자반증, 인슐린-의존성 당뇨병, 알레르기; 천식, 아토피성 질환; 아테롬성동맥경화증; 심근염; 심근병증; 사구체신염; 및 저형성 빈혈을 포함하는 하나 이상의 비-암 적응증
    으로부터 선택된 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 증식성 질환이 췌장암인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 증식성 질환이 T-ALL인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 증식성 질환이 중피종인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 증식성 질환이 임의의 조직 기원의 편평 세포 암종인 방법.
  27. 제22항에 있어서, 증식성 질환이 AML인 방법.
  28. 제22항에 있어서, 증식성 질환이 흑색종인 방법.
  29. 제22항에 있어서, 증식성 질환이 골수종인 방법.
  30. CDR이 카바트 및/또는 코티아 규칙에 따라 계산된 것인, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩티드.
  31. 표 29A에 제시된 DR5 에피토프에 결합하거나 또는 표 30A에 제시된 DR5 에피토프에 결합하는, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 NB 구축물.
KR1020127023443A 2010-02-10 2011-02-10 효능제 ｄｒ５ 결합 폴리펩티드 KR20130031241A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30317310P 2010-02-10 2010-02-10
US61/303,173 2010-02-10
US30859910P 2010-02-26 2010-02-26
US61/308,599 2010-02-26
PCT/EP2011/051958 WO2011098520A1 (en) 2010-02-10 2011-02-10 Agonist dr5 binding polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20130031241A true KR20130031241A (ko) 2013-03-28

Family

ID=43877025

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127023443A KR20130031241A (ko) 2010-02-10 2011-02-10 효능제 ｄｒ５ 결합 폴리펩티드

Country Status (30)

Country Link
US (2) US9120855B2 (ko)
EP (1) EP2534176A1 (ko)
JP (1) JP2013519364A (ko)
KR (1) KR20130031241A (ko)
CN (1) CN102884083A (ko)
AR (1) AR080158A1 (ko)
AU (1) AU2011214355B2 (ko)
BR (1) BR112012019924A2 (ko)
CA (1) CA2789251A1 (ko)
CL (1) CL2012002217A1 (ko)
CO (1) CO6561836A2 (ko)
CR (1) CR20120415A (ko)
CU (1) CU24133B1 (ko)
EA (1) EA201201114A1 (ko)
GE (1) GEP20146176B (ko)
GT (1) GT201200236A (ko)
IL (1) IL221289A0 (ko)
MA (1) MA34053B1 (ko)
MX (1) MX2012009328A (ko)
MY (1) MY156337A (ko)
NI (1) NI201200134A (ko)
NZ (1) NZ601582A (ko)
PE (1) PE20121703A1 (ko)
SG (1) SG183210A1 (ko)
TN (1) TN2012000393A1 (ko)
TW (1) TWI480051B (ko)
UA (1) UA106900C2 (ko)
UY (1) UY33222A (ko)
WO (1) WO2011098520A1 (ko)
ZA (1) ZA201205864B (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2636736T1 (sl) 2010-10-29 2016-09-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Novo anti-dr5 protitelesce
GB201118359D0 (en) 2011-10-25 2011-12-07 Univ Sheffield Pulmonary hypertension
EP2831116A1 (en) * 2012-03-28 2015-02-04 Amgen Inc. Dr5 receptor agonist combinations
SI2970473T1 (sl) 2013-03-14 2017-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Kombinacija dr5 agonista in anti-pd-1 antagonista in postopek uporabe
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
WO2015100409A2 (en) * 2013-12-26 2015-07-02 Tufts University Methods, compositions and kits for treating a subject using a recombinant neutralizing binding protein
KR20160103007A (ko) 2014-01-10 2016-08-31 각코호진 데이쿄 헤이세이 다이가쿠 재조합 편성 혐기성 그램 양성균
EP3250601A4 (en) * 2015-01-26 2018-07-11 MacroGenics, Inc. Multivalent molecules comprising dr5-binding domains
CN104826121A (zh) * 2015-02-11 2015-08-12 嘉兴学院 肿瘤靶向基因递送系统及其应用
EP3798232A1 (en) 2015-07-16 2021-03-31 Inhibrx, Inc. Multivalent and multispecific dr5-binding fusion proteins
CN109195626B (zh) * 2015-10-30 2022-09-13 银河生物技术有限责任公司 结合死亡受体4和死亡受体5的抗体
NO2768984T3 (ko) 2015-11-12 2018-06-09
KR101926834B1 (ko) 2017-03-21 2018-12-07 동아에스티 주식회사 항-dr5 항체 및 그의 용도
EP3710477A1 (en) * 2017-11-13 2020-09-23 Crescendo Biologics Limited Single domain antibodies that bind to cd137
US20190234933A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-01 Genadam Therapeutics, Inc. Compositions and assays
US20240052065A1 (en) 2022-07-15 2024-02-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Binding molecules for the treatment of cancer

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
AU675223B2 (en) 1992-05-08 1997-01-30 Creative Biomolecules, Inc. Chimeric multivalent protein analogues and methods of use thereof
DE69334095T2 (de) 1992-07-17 2007-04-12 Dana-Farber Cancer Institute, Boston Verfahren zur intrazellulären Bindung von zielgerichteten Molekülen
DK1589107T3 (da) 1992-08-21 2010-04-26 Univ Bruxelles Immonuglobuliner uden lette kæder
DK0702721T3 (da) 1993-06-09 2001-05-21 Unilever Nv Fremgangsmåde til fremstilling af fusionsproteiner, der omfatter ScFv fragmenter, ved hjælp af en transformeret skimmelsvamp
US6091639A (en) 1993-08-27 2000-07-18 Kabushiki Kaisha Toshiba Non-volatile semiconductor memory device and data programming method
EP0745134A1 (en) 1994-02-22 1996-12-04 Danafarber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
AU7298398A (en) 1996-11-19 1998-06-10 Sangstat Medical Corporation Enhanced effects for hapten conjugated therapeutics
US6342369B1 (en) 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
EP1027439B1 (en) 1997-10-27 2010-03-17 Bac Ip B.V. Multivalent antigen-binding proteins
EP1051493A2 (en) 1998-01-26 2000-11-15 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
BR9907950A (pt) 1998-02-19 2001-12-18 Xcyte Therapies Inc Composições e processos para regulagem deativação de linfócitos
GB9824632D0 (en) 1998-11-10 1999-01-06 Celltech Therapeutics Ltd Biological compounds
AU2291700A (en) 1999-01-19 2000-08-07 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
US7608681B2 (en) 1999-12-24 2009-10-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
PL357939A1 (en) 2000-04-11 2004-08-09 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
AU2001266557A1 (en) 2000-04-12 2001-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US7279160B2 (en) 2000-05-02 2007-10-09 The Uab Research Foundation Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
WO2001090190A2 (en) 2000-05-26 2001-11-29 National Research Council Of Canada Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
US6741957B1 (en) 2000-07-21 2004-05-25 Daimlerchrysler Corporation Analytical tire model for vehicle durability and ride comfort analysis
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
AU2002335930B2 (en) 2001-03-09 2005-07-28 Morphosys Ag Serum albumin binding moieties
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
WO2003014960A2 (en) 2001-08-03 2003-02-20 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
JP4213586B2 (ja) 2001-09-13 2009-01-21 株式会社抗体研究所 ラクダ抗体ライブラリーの作製方法
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
ES2357225T3 (es) 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.
DE60238560D1 (de) 2001-11-01 2011-01-20 Uab Research Foundation Kombinationen aus anti-dr5-antikörpern und anti-dr4-antikörpern und weiteren therapeutischen agentien
KR100599789B1 (ko) 2001-12-03 2006-07-12 삼성에스디아이 주식회사 방열효율이 향상된 플라즈마 디스플레이 장치 및 그 제조방법
US20050214857A1 (en) 2001-12-11 2005-09-29 Algonomics N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
JP4323317B2 (ja) 2001-12-21 2009-09-02 フラームス・インテルウニフェルシタイル・インステイチュート・フォール・ビオテヒノロヒー・ヴェーゼットウェー（ヴェーイーベー・ヴェーゼットウェー） 可変領域配列のクローニング方法
JP2005517674A (ja) 2002-01-03 2005-06-16 フラームス・インテルウニフェルシタイル・インステイチュート・フォール・ビオテヒノロヒー・ヴェーゼットウェー 腫瘍の処置に有用な新規免疫コンジュゲート
ATE328906T1 (de) 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
US7004940B2 (en) 2002-10-10 2006-02-28 Ethicon, Inc. Devices for performing thermal ablation having movable ultrasound transducers
EP1558647B1 (en) 2002-11-08 2015-06-10 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
EP3299393A1 (en) 2002-11-08 2018-03-28 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
KR100915257B1 (ko) 2002-11-27 2009-09-03 아이알엠 엘엘씨 단일클론 항-ｄｒ５ 효능제 항체, 그 항체를 발현하는 단리된 세포, 그 항체를 포함하는 제약 조성물 및 그 항체를 사용하는 방법
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
EP1570267B1 (en) 2002-12-03 2011-10-12 UCB Pharma, S.A. Assay for identifying antibody producing cells
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
AU2003300133B2 (en) 2002-12-31 2008-11-13 Nektar Therapeutics Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
ATE414106T1 (de) 2003-06-30 2008-11-15 Domantis Ltd Pegylierte single-domain-antikörper (dab)
JP2007521234A (ja) 2003-08-12 2007-08-02 ウィリアム エム ヤーブロー 尋常性ざ瘡の治療薬及び使用方法
EP1658500B1 (en) 2003-08-20 2012-04-18 UCB Pharma, S.A. Methods for obtaining antibodies
GB0328261D0 (en) * 2003-12-05 2004-01-07 Univ Groningen Improved cytokine design
KR20070010046A (ko) 2004-04-06 2007-01-19 제넨테크, 인크. Ｄｒ5 항체 및 그의 용도
WO2005114187A2 (en) 2004-04-23 2005-12-01 The United States Of America As Represented By Thesecretary, Department Of Health And Human Services Methods and compositions for diagnosing aids and other diseases and conditions involving immune system activation
WO2005122741A2 (en) 2004-06-21 2005-12-29 Washington University Antibodies against west nile virus and therapeutic and prophylactic uses thereof
US20060008601A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Zeik Douglas B Flexible laminate having an integrated pressure release valve
RU2398882C2 (ru) 2004-07-22 2010-09-10 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА Vh ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
WO2006040153A2 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti -amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as alzheimer's disease
WO2006040154A2 (en) 2004-10-14 2006-04-20 Dublin City University Prokaryotic two hybrid system
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1844073A1 (en) 2005-01-31 2007-10-17 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
GB2424983A (en) 2005-04-07 2006-10-11 Autoliv Dev Seatbelt pretensioner control system
PL1888641T3 (pl) 2005-05-18 2012-05-31 Ablynx Nv Białka wiążące albuminę surowicy
NZ563392A (en) 2005-05-20 2009-12-24 Ablynx Nv Improved Nanobodies(TM) for the treatment of aggregation-mediated disorders
WO2007112940A2 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Ablynx N.V. Albumin-derived amino acid sequence, use thereof for increasing the half-life of therapeutic proteins and of other therapeutic compounds and entities, and constructs comprising the same
EP2010568A1 (en) 2006-04-14 2009-01-07 Ablynx N.V. Dp-78-like nanobodies
EP2057191A1 (en) 2006-08-18 2009-05-13 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
WO2008028977A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
CN101528767A (zh) 2006-10-11 2009-09-09 埃博灵克斯股份有限公司 以基本不依赖pH的方式结合血清蛋白的氨基酸序列、包括其的化合物、及其用途
WO2008066854A2 (en) 2006-11-28 2008-06-05 Novartis Ag Methods and compositions for inducing apoptosis in cancer cells
EP2097449A1 (en) 2006-12-05 2009-09-09 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
JP5302519B2 (ja) 2007-08-03 2013-10-02 倉敷紡績株式会社 ヒトパピローマウイルスを検出するためのプライマーセット及びプローブ
WO2009030285A1 (en) 2007-09-07 2009-03-12 Ablynx N.V. Binding molecules with multiple binding sites, compositions comprising the same and uses thereof
CA2721202A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Hilde Adi Pierrette Revets Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same

Also Published As

Publication number Publication date
IL221289A0 (en) 2012-10-31
ZA201205864B (en) 2013-05-29
US20150259426A1 (en) 2015-09-17
MX2012009328A (es) 2012-11-30
BR112012019924A2 (pt) 2017-05-02
UA106900C2 (uk) 2014-10-27
TWI480051B (zh) 2015-04-11
TN2012000393A1 (en) 2014-01-30
CR20120415A (es) 2013-01-09
AU2011214355B2 (en) 2014-05-22
EA201201114A1 (ru) 2013-03-29
PE20121703A1 (es) 2012-12-11
TW201130513A (en) 2011-09-16
CO6561836A2 (es) 2012-11-15
CN102884083A (zh) 2013-01-16
AR080158A1 (es) 2012-03-21
MY156337A (en) 2016-02-15
EP2534176A1 (en) 2012-12-19
CU20120116A7 (es) 2014-02-28
US20110318366A1 (en) 2011-12-29
WO2011098520A1 (en) 2011-08-18
UY33222A (es) 2011-09-30
NI201200134A (es) 2012-10-30
CL2012002217A1 (es) 2014-01-31
JP2013519364A (ja) 2013-05-30
CU24133B1 (es) 2015-11-27
AU2011214355A1 (en) 2012-08-30
GT201200236A (es) 2015-05-20
GEP20146176B (en) 2014-10-10
SG183210A1 (en) 2012-09-27
NZ601582A (en) 2014-07-25
CA2789251A1 (en) 2011-08-18
US9120855B2 (en) 2015-09-01
MA34053B1 (fr) 2013-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9120855B2 (en) Biologic compounds directed against death receptor 5
EP2621953B1 (en) Biological materials related to c-met
CN107098971B (zh) 抗il-17a，il-17f和/或il17-a/f的氨基酸序列以及包含其的多肽
EP2571901B1 (en) Biological materials related to her3
US20100136018A1 (en) Anti-FC-receptor single domain antibodies (nanobodies-tm) and therapeutic use
US10544216B2 (en) P2X7 receptor antagonists and agonists
JP2011516520A (ja) Ｎｏｔｃｈ経路に指向性を有するアミノ酸配列及びその使用
WO2010066836A2 (en) Amino acid sequences directed against the angiopoietin/tie system and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders related to angiogenesis
US20110282033A1 (en) Amino acid sequences directed against growth factor receptors and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with growth factors and their receptors
EP2313436A1 (en) Amino acid sequences directed against multitarget scavenger receptors and polypeptides
WO2010040736A2 (en) Amino acid sequences directed against il18 and/or the il-18 receptor and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and/or disorders associated with il-18 mediated signaling
WO2010037818A1 (en) Amino acid sequences directed against il-15 and/or the il-15 receptor and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-15 mediated signalling
AU2015264802B2 (en) Biological materials related to HER3
AU2013201446B2 (en) Biological materials related to c-Met

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application