RU2398882C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА Vh ИСПОЛЬЗОВАНИЕ - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА Vh ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2398882C2 RU2398882C2 RU2007106728/13A RU2007106728A RU2398882C2 RU 2398882 C2 RU2398882 C2 RU 2398882C2 RU 2007106728/13 A RU2007106728/13 A RU 2007106728/13A RU 2007106728 A RU2007106728 A RU 2007106728A RU 2398882 C2 RU2398882 C2 RU 2398882C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- heavy chain
- antigen
- domain
- binding
- antibodies
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 169
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 161
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 161
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 158
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 157
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 134
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 109
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 109
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 109
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 53
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 claims abstract description 52
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 33
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 21
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 98
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 39
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 claims description 23
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 23
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 19
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 claims description 15
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 claims description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 13
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 12
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 claims description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 5
- 238000002823 phage display Methods 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 36
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 35
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 30
- 230000006870 function Effects 0.000 description 28
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 24
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 23
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 21
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 20
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 17
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 16
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 15
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 15
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 11
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 10
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 9
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 9
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 9
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 101710120463 Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 6
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 6
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 6
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 6
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 6
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 6
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 4
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 4
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 4
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical group OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 3
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 3
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- -1 Ormonov Substances 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 101710101148 Probable 6-oxopurine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 3
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 150000003148 prolines Chemical class 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- VFTRKSBEFQDZKX-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diindolylmethane Chemical compound C1=CC=C2C(CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)=CNC2=C1 VFTRKSBEFQDZKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 2
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 2
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 208000025750 heavy chain disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- WKMPTBDYDNUJLF-UHFFFAOYSA-N 2-fluoroadenine Chemical compound NC1=NC(F)=NC2=C1N=CN2 WKMPTBDYDNUJLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010075348 Activated-Leukocyte Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100024210 CD166 antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004405 Collectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000909 Collectins Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001055311 Equus asinus Immunoglobulin heavy constant alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 241001363655 Jaton Species 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 1
- 101000839464 Leishmania braziliensis Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 208000014767 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000004459 Nitroreductase Human genes 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108050008568 SRCR domains Proteins 0.000 description 1
- 102000000185 SRCR domains Human genes 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000011230 antibody-based therapy Methods 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J calcium;potassium;sodium;2-hydroxypropanoic acid;sodium;tetrachloride Chemical compound [Na].[Na+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].CC(O)C(O)=O ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020001162 nitroreductase Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000008010 parenteral excipient Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000003087 receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000012899 standard injection Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
- C07K16/1054—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV gag-pol, e.g. p17, p24
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
- C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K16/1232—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Zoology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
Abstract
Способ получения антиген-связывающего домена VH, в котором отсутствует удлиненная CDR3 петля, подобная петле верблюда, включает трансформирование клетки млекопитающего гетерологичным локусом тяжелой цепи VH. Локус содержит ген, кодирующий вариабельную область, по меньшей мере содержащий один сегмент гена VH, один сегмент гена D, не являющийся верблюжьим, один сегмент гена J, не являющийся верблюжьим, одну константную область тяжелой цепи, при условии, что ни один из генов, кодирующих константные области, не кодирует функциональный домен Сн1. Сегменты генов V, D и J способны к рекомбинации с образованием кодирующей последовательности VDJ. Трансформированная клетка способна экспрессировать антитело только с тяжелыми цепями, содержащими антиген-связывающий домен VH и константную эффекторную область, лишенную функционального домена Сн1. Клетку используют для получения трансгенного животного, которое иммунизируют представляющим интерес антигеном. Далее выделяют клетки или ткани, экспрессирующие специфические антитела к интересующему антигену только с тяжелыми цепями, выделяют нуклеиновую кислоту, кодирующую домен VH специфического антитела только с тяжелыми цепями, и экспрессируют указанный антиген-связывающий домен VH. Указанные VH домены могут быть использованы для создания слитых белков или связывающих комплексов моновалентного, бивалентного или мультивалентного полипептида. Изобретение позволяет получать антигенспецифические антитела человека любого класса, обладающие высокой аффинностью. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 26 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к производству широкого набора функциональных антител, имеющих только тяжелую цепь, прошедших процесс созревания аффинности, и к их применению. Настоящее изобретение также относится к производству и применению широкого набора класс-специфических антител, имеющих только тяжелую цепь, и к производству и применению мультивалентных полипептидных комплексов с функциональными свойствами тяжелой цепи антител, предпочтительно, со связывающими функциональными свойствами тяжелой цепи антител, эффекторной активностью константной области и, необязательно, дополнительными эффекторными функциями.
Настоящее изобретение также относится к способу получения у трансгенных мышей антител, имеющих только тяжелую цепь и обладающих полными функциональными свойствами, в ответ на антигенную стимуляцию. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения антигенспецифических высокоаффинных антител человека, имеющих только тяжелую цепь, любого класса или смеси классов и выделению и экспрессии полностью функциональных VH антигенсвязывающих доменов.
Настоящее изобретение также относится к получению мультивалентных полипептидных комплексов, имеющих функциональные свойства тяжелых цепей, предпочтительно, эффекторную активность тяжелых цепей и имеющих другие связывающие и эффекторные функции.
Также описаны антитела, имеющие только тяжелую цепь, и другие мультивалентные связывающие комплексы, получаемые способами по настоящему изобретению, и их применение.
Уровень техники
Моноклональные антитела или их варианты будут составлять высокий процент новых лекарственных препаратов, которые будут выпускать в XXI веке. Терапия с использованием монокланальных антител уже принята в качестве предпочтительного способа лечения ревматоидного артрита и болезни Крона, и имеется значительный прогресс в лечении рака. Также на основе антител разрабатываются продукты для лечения сердечно-сосудистых и инфекционных заболеваний. Большинство продаваемых продуктов на основе моноклональных антител распознают и связывают один хорошо определяемый эпитоп на мишеневом лиганде (например, TNFα). Производство антител человека для терапии по-прежнему зависит от клеточных культур млекопитающих. Сборка комплекса, состоящего из двух тяжелых цепей и двух легких цепей (комплекса H2L2), и последующий процесс пост-трансляционного гликозилирования препятствуют использованию бактериальных систем. Стоимость продукции и высокие затраты для производства антител с помощью клеточной культуры млекопитающих являются высокими и могут ограничить потенциальные возможности терапии на основе антител при отсутствии приемлемых альтернатив. Множество трансгенных организмов способно экспрессировать полностью функциональные антитела. Такие организмы включают растения, насекомых, цыплят, коз и крупный рогатый скот, но никто из них до сих пор не использовался для производства коммерчески доступных терапевтических продуктов.
Функциональные фрагменты антител могут генерироваться E. coli, но продукт обычно имеет низкую стабильность в сыворотке, кроме пегилированного в процессе производства.
Комплексы биспецифических антител представляют собой молекулы на основе Ig, способные к связыванию двух различных эпитопов либо на одинаковых, либо на разных антигенах. Биспецифические антитела, содержащие связывающие белки, отдельно или в комбинации с другими связывающими агентами, обладают перспективой использования в способах лечения, в которых зарегистрированные иммунные функции человека вызывают терапевтический эффект, например элиминацию патогенов (Van Spriel et al., (1999) J. Infect. Diseases, 179, 661-669; Tacken et al., (2004) J. Immunol, 172, 4934-4940; патент США № 5487890), лечение рака (Glennie and van der Winkel, (2003) Drug Discovery Today, 8, 503-5100); и иммунотерапию (Van Spriel et al., (2000) Immunol. Today, 21, 391-397; Segal et al., (2001) J. Immunol. Methods, 248, 1-6; Lyden et al., (2001) Nat. Med., 7, 1194-1201).
Проблемы при производстве возникают, когда продукт биспецифических антител основан на двух или более комплексах H2L2. Например, коэкспрессия двух или нескольких наборов генов тяжелых и легких цепей может привести к образованию до 10 различных комбинаций, из которых только одна является желательным гетеродимером (Suresh et al., (1986) Methods Enzymol, 121, 210-228).
Для решения таких проблем разработано несколько стратегий получения биспецифических форматов IgG (BsIgG) полной длины в клетках млекопитающих, которые сохраняют эффекторную функцию тяжелых цепей. Для BsIgG требуются разработанные "knob and hole" тяжелые цепи для предотвращения образования гетеродимеров, и используются идентичные L-цепи, чтобы избежать ошибочного спаривания L-цепей (Carter, (2001) J. Immunol. Methods, 248, 7-15). Также описаны альтернативные химические методики перекрестного связывания для получения комплексов из фрагментов антител, каждый из которых узнает различные антигены (Ferguson et al., (1995) Arthritis and Rheumatism, 38, 190-200), или перекрестного связывания с фрагментами антител других связывающих белков, например коллектинов (Tacken et al., (2004) J. Immunol., 172, 4934-4940).
Разработка рекомбинантных димерных антител или миниантител (BsAb), обычно не обладающих эффекторными функциями тяжелых цепей, также преодолевает гетеродимерный избыток. Такие минитела содержат минимальные одноцепочечные антитела, имеющие VH и VL связывающие участки (scFv), которые впоследствии сворачиваются и димеризуются, формируя бивалентные биспецифические антитела, моновалентные к каждому из своих мишеневых антигенов (Holliger et al., (1993) PNAS, 90, 6444-6448; Muller et al., (1998) FEBS Lett, 422, 259-264). Одновременно, для образования биспецифических миниантител в качестве доменов гетеродимеризации использовали CH1 и L-константные домены (Muller et al., (1998) FEBS Lett., 259-264). Для получения BsAb разработано множество рекомбинантных способов, основанных на системах экспрессии E. сoli, (Hudson, (1999) Curr. Opin. Immunol., 11, 548-557), хотя очевидно, что стоимость и объем производства мультивалентных антител со степенью чистоты для клинического применения остаются основным препятствием для клинического применения (Segal et al., (2001) J. Immunol. Methods, 248, 1-6).
В последнее время концепция BsAb была расширена до рассмотрения двойных рекомбинантных биспецифических антител, тетравалентных биспецифических антител, в которых домены VH и VL в каждой из цепей H и L заменены разработанной парой связывающих доменов scFv. Такие конструкции, пока сложные для разработки, могут быть собраны в клетках млекопитающих в культуре в отсутствии гетеродимерной избыточности (Lu et al., (2003) J. Immunol. Methods, 279, 219-232).
Структура иммуноглобулинов хорошо известна. Большинство природных иммуноглобулинов содержат две тяжелые цепи и две легкие цепи. Тяжелые цепи соединены друг с другом при помощи дисульфидных связей между шарнирными доменами, расположенными приблизительно посередине каждой тяжелой цепи. Легкая цепь связана с каждой тяжелой цепью с N-терминальной стороны шарнирного домена. Каждая легкая цепь обычно связана с соответствующей тяжелой цепью дисульфидной связью, находящейся рядом с шарнирным доменом.
Если молекула Ig укладывается правильно, то каждая цепь укладывается в несколько отдельных глобулярных доменов, соединенных более линейной полипептидной последовательностью. Например, легкая цепь укладывается в вариабельный (VL) и константный (CL) домены. Тяжелые цепи имеют один вариабельный домен VH, смежный с вариабельным доменом легкой цепи, первый константный домен, шарнирный домен и два или три дополнительных константных домена. Взаимодействие вариабельных доменов тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей приводит к образованию антигенсвязывающей области (Fv). Обычно как VH, так и VL необходимы для связывания антигена, хотя показано, что димеры тяжелой цепи и аминотерминальные фрагменты сохраняют активность в отсутствии легкой цепи (Jaton et al., (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195).
С появлением новых молекулярных технологий идентифицировано наличие антител, имеющих только тяжелую цепь (лишенных легкой цепи), у человека при B-клеточных пролиферативных нарушениях (заболевание тяжелых цепей) и в системах мышиных моделей. Анализ заболевания тяжелых цепей на молекулярном уровне показал, что мутации и делеции на уровне генома могут приводить к несоответствующей экспрессии домена CH1 тяжелой цепи, увеличивая экспрессию антитела, имеющего только тяжелую цепь, которое лишено связывающей способности легкой цепи (смотрите Hendershot et al., (1987) J. Cell Biol, 104, 761-767; Brandt et al., (1984) Mol. Cell. Biol, 4, 1110-1211).
Независимые исследования выделенных доменов VH человека, полученных из фаговых библиотек, показали антигенспецифическое связывание доменов VH, но оказалось, что указанные домены VH имеют низкую растворимость. К тому же, было подтверждено, что селекцией доменов VH человека с характеристиками специфического связывания, показанными на фаговых матрицах, можно формировать связывающие блоки для разработанных антител (Ward et al., (1989) Nature, 341, 544-546).
Исследования, использующие другие виды позвоночных, показали, что у верблюдов в результате мутаций природного гена синтезируются функциональные димеры IgG2 и IgG3, имеющие только тяжелые цепи, которые не способны связываться с легкой цепью из-за отсутствия связывающей области CH1 легкой цепи (Hamers-Casterman et al., (1993) Nature, 363, 446-448), и что виды, такие как акула, продуцируют семейство связывающих белков, подобных только тяжелой цепи, которые вероятно относятся к Т-клеточному рецептору млекопитающих или легкой цепи иммуноглобулинов (Stanfield et al., (2004) Science, 305, 1770-1773).
Отличительной особенностью антитела верблюдов, имеющего только тяжелую цепь, является домен VH верблюда, который обеспечивает улучшенную растворимость по сравнению с доменом VH человека. Для улучшения характеристик растворимости может быть разработан VH человека (смотрите Davies and Riechmann, (1996) Protein Eng., 9 (6), 531-537; Lutz and Muyldermans, (1999) J. Immuno. Methods, 231, 25-38), или растворимость может быть достигнута посредством естественного отбора in vivo (смотрите Tanha et al., (2001) J. Biol. Chem., 216, 24114-24180). Однако там, если связывающие домены VH получены из фаговых библиотек, то присущая им аффинность к антигену сохраняется в диапазоне от низких микромолей до высоких наномолей несмотря на применение стратегий для улучшения аффинности, включающих, например, рандомизацию аффинности в “горячей точке” (Yau et al., (2005) J. Immunol Methods, 291, 213-224).
VH антитела верблюда также отличаются модифицированной петлей CDR3. Указанная петля CDR3 в среднем длиннее петли, обнаруженной в антителах других животных, и является особенностью, которая, как предполагается, главным образом влияет на общую аффинность к антигену и специфичность, которая компенсируется отсутствием домена VL у антител верблюда, имеющих только тяжелую цепь (Desmyter et al., (1996) Nat. Struct. Biol, 3, 803-811, Riechmann and Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 23, 25-28).
Структурные исследования, проведенные в последние годы, антител верблюда подтвердили, что такое многообразие антител в значительной степени запускается in vivo процессами созревания, зависящими от событий V(D)J-рекомбинации и соматической мутации (De Genst et al., (2005) J. Biol. Chem., 280 (14), 14114-14121).
В последние годы были разработаны способы получения антител, имеющих только тяжелые цепи, у трансгенных млекопитающих (смотрите WO02/085945 и WO02/085944). Функциональное антитело, имеющее только тяжелые цепи, вероятно, любого класса (IgM, IgG, IgD, IgA или IgE) и полученное от любого млекопитающего (включая человека) может быть продуцировано трансгенными млекопитающими (предпочтительно мышами) в результате антигенной стимуляции.
Обычный локус тяжелой цепи иммуноглобулина содержит множество генных сегментов V, несколько генных сегментов D и несколько генных сегментов J. Каждый генный сегмент V кодирует домен V от N-конца почти до C-конца. C-конец каждого домена V кодируется генным сегментом D и генным сегментом J. VDJ-перестройка в B-клетках, за которой следует созревание аффинности, дает связывающие домены VH, которые с связывающими доменами VL затем формируют участок узнавания антигена или участок связывания. Во взаимодействии тяжелой и легкой цепей участвует область CH1 тяжелой цепи и область κ или λ легкой цепи, которая облегчает взаимодействие.
Для получения антитела, имеющего только тяжелую цепь, локус тяжелой цепи в зародышевой линии содержит генные сегменты, кодирующие некоторые или все возможные константные области. Во время созревания перестроенный связывающий домен VH подвергается сплайсингу с образованием сегмента, кодирующего константную область CH2, обеспечивая перестроенный ген, кодирующий тяжелую цепь, которая лишена домена CH1 и, следовательно, не способна связываться с легкой цепью иммуноглобулина.
Моноклональные антитела, имеющие только тяжелую цепь, могут быть получены из B-клеток селезенки с помощью стандартной технологии клонирования или получены из B-клеточной мРНК с помощью технологии фагового дисплея (Ward et al., (1989) Nature, 341, 544-546). Антитела, имеющие только тяжелую цепь, полученные от верблюда или трансгенных животных, являются высокоаффинными. Анализ последовательности нормальных тетрамеров H2L2 показал, что многообразие, главным образом, является результатом комбинации VDJ-перестройки и соматической гипермутации (Xu and Davies, (2000) Immunity, 13, 37-45). Анализ последовательности экспрессированной мРНК только тяжелой цепи, продуцируемой только верблюдами либо трансгенными животными, подтверждает это наблюдение (De Genst et al., (2005) J. Biol. Chem., 280, 14114-14121).
Важная и общая особенность природных областей VH верблюда и человека заключается в том, что каждая область связывается в виде мономера, вне зависимости от димеризации, с областью VL для обеспечения оптимальной растворимости и аффинности связывания. Эта особенность рассматривается как особенно эффективная для продуцирования блокирующих агентов и агентов тканевой проницаемости.
Гомо- или гетеродимеры также могут быть сконструированы путем ферментативного расщепления антител, имеющих только тяжелую цепь, или синтетическими способами (Jaton et ah, (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195 и патент США №2003/0058074 A1). Однако полезные свойства связывающего домена мономерных антител до сих пор не были использованы для получения преимуществ при конструировании мультимерных протеинов в качестве терапевтических и диагностических реагентов.
VH человека или VHH верблюда, полученный технологией фагового дисплея, лишен преимуществ улучшенных характеристик в результате соматических мутаций и дополнительного разнообразия, обеспечиваемого рекомбинацией областей D и J в области CDR3 участка связывания нормального антитела (Xu and Davies, (2000) Immunity, 13, 37-45). Хотя VHH верблюда и имеет преимущества в растворимости по сравнению с VH человека, для человека он является антигенным и должен быть синтезирован при иммунизации верблюда или при помощи технологии фагового дисплея.
Введение связывающих доменов VH имеет явное преимущество над использованием scFv, которые необходимо конструировать из доменов VH и VL со связанной с этим потенциальной возможностью потери специфичности и авидности. Связывающие домены VH, полученные из семейств родственных генов, такие как T-клеточные рецепторы или семейство иммуноглобулинов акулы, также предоставляют альтернативные варианты scFv для генерации би- или мультиспецифических связывающих молекул. Также могут быть использованы другие природные связывающие белки и их домены, включая, например, растворимые фрагменты рецепторов.
Классы антител отличаются своими физиологическими функциями. Например, IgG играет решающую роль в зрелом иммунном ответе. IgM вовлечен в фиксирование и агглютинацию комплемента. IgA является обширным классом Ig в секретах, т.е. слезной жидкости, слюне, молозиве, слизи, и, таким образом, играет роль в местном иммунитете. Включение класс-специфических константных областей тяжелой цепи при конструировании мультивалентных связывающих комплексов обеспечивает терапевтические преимущества эффекторной функции in vivo в зависимости от требуемых функциональных свойств. Разработка отдельных эффекторных областей также может привести к добавлению или потере функционального свойства (Van Dijk and van der Winkel, Curr. Opin. Chem. Biol., (2001) Aug 5 (4), 368-374). По-видимому, для оптимальной продукции и селекции антител, имеющих только тяжелую цепь, которые содержат высокоаффинные связывающие домены VH (либо человека, либо верблюда, либо имеющие другое происхождение), будут использоваться альтернативные подходы для получения указанных антител в зависимости от выбора из рандомизированных фаговых библиотек, которые не облегчают in vivo рекомбинацию и созревание аффинности.
Таким образом, включение функционального свойства константной области IgA могло бы привести к улучшенному функционированию слизистой против патогенов (Leher et al., (1999) Exp. Eye. Res., 69, 75-84), хотя наличие функционального свойства константных областей IgG1 обеспечивает увеличение стабильности in vivo в сыворотке. Наличие константных доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи обеспечивает основу для стабильной димеризации, которую можно наблюдать в природных антителах, и обеспечивает участки узнавания для пост-трансляционного гликозилирования. Наличие CH2 и CH3 также обеспечивает возможность вторичного узнавания антител, если в качестве реагентов и диагностических средств используются биспецифические и мультивалентные комплексы.
Выделенные предварительно перестроенные последовательности вариабельных областей только тяжелых цепей верблюда предварительно клонируют перед шарнирной областью и эффекторным доменом IgG1 человека, встроенным в вектора и экспрессированным в клетках COS для продукции антитела. Антитела, экспрессированные в такой in vitro среде, уже были подвергнуты процессам переключения классов (изотипа) и созревания (гиперсозревания) аффинности in vivo у верблюда, и они могут связываться с антигеном (Riechmann and Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38).
В данной области техники остается необходимость в максимальном увеличении разнообразия антител, имеющих только тяжелую цепь, и в B-клеточном ответе in vivo и, в частности, в получении функционального набора класс-специфических антител человека, имеющих только тяжелую цепь, и функциональных связывающих доменов VH только тяжелой цепи, которые сохраняют максимальный антигенсвязывающий потенциал, для использования в разнообразных клинических, промышленных и научных применениях.
В данной области техники также остается необходимость в растворимых бивалентных или мультивалентных связывающих полипептидных комплексах, содержащих по меньшей мере часть тяжелой цепи антитела отдельно или в комбинации с эффекторной (легкой) цепью, которая является физиологически стабильной и имеет эффекторную функцию.
Краткое описание настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения антитела, имеющего только тяжелую цепь VH или только тяжелую цепь VH (VHH) верблюда, трансгенным млекопитающим, в котором предусмотрен этап экспрессии гетерологичного локуса тяжелой цепи VH или тяжелой цепи VH (VHH) верблюда у такого млекопитающего, причем указанный локус тяжелой цепи VH или тяжелой цепи VH (VHH) верблюда содержит константную область тяжелой цепи, которая не кодирует домен CH1, и локус, которой при экспрессии способен формировать антитела, имеющие только тяжелую цепь, определенного класса или классов.
Локус тяжелой цепи VH или локус тяжелой цепи VH (VHH) верблюда может содержать один или несколько генных сегментов V верблюда или другого животного. Предпочтительно, генный сегмент V отобран или разработан таким образом, чтобы обладать улучшенными характеристиками растворимости. Предпочтительно, V генный сегмент извлекают у человека.
Константаная область локуса тяжелой цепи может содержать ген константой области Cα1 и/или Cα2, Cε, Cδ, Cγ и/или Cµ тяжелой цепи. Кроме того, константная область локуса тяжелой цепи может содержать более одной из следующих константных областей: Cα1, Cα2, Cε, Cδ, Cγ, Cµ.
Предпочтительно локус тяжелой цепи VH содержит вариабельную область, содержащую по меньшей мере один генный сегмент V человека или верблюда, по меньшей мере один сегмент D и по меньшей мере один сегмент J, причем генный сегмент V человека или верблюда, генный сегмент D и генный сегмент J способны к рекомбинации, формируя VDJ-кодирующую последовательность. Локус тяжелой цепи, предпочтительно, содержит двадцать или более генных сегментов D и/или пять или более генных сегментов J. Предпочтительно, сегменты D и J являются генными сегментами позвоночного, предпочтительно человека. Петля CDR3 может быть получена путем использования генных сегментов D и J, полученных у позвоночного или, предпочтительно, человека.
Локус тяжелой цепи VH также может содержать рекомбинантную последовательность (rss), способную к рекомбинации генного сегмента J непосредственно с генной константной областью тяжелой цепи.
Константная область тяжелой цепи гетерологичного локуса тяжелой цепи является константной областью человека или позвоночного, например верблюда. В качестве альтернативы константная область может не являться константной областью тяжелой цепи имуноглобулина.
Предпочтительно, способы настоящего изобретения по существу приводят к нормальному B-клеточному созреванию. Настоящее изобретение также относится к антителу, имеющему только тяжелые цепи, или его фрагменту, или смеси классов антител, имеющих только тяжелые цепи, полученные или получаемые по способу настоящего изобретения. Такое антитело, имеющее только тяжелые цепи, может представлять собой моноклональное антитело или его фрагмент, такой как связывающий домен VH человека или верблюда. Связывающий домен VH по настоящему изобретению может не содержать верблюдоподобную удлиненную CDR3 петлю или, в качестве альтернативы, может содержать верблюдоподобную удлиненную CDR3 петлю.
Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему гетерологичный локус тяжелой цепи настоящего изобретения, и к клетке-хозяину, трансформированной таким вектором.
Настоящее изобретение также относится к трансгенному млекопитающему, экспрессирующему гетерологичный локус тяжелой цепи, описанному в настоящем описании. Предпочтительно, трансгенное млекопитающее по настоящему изобретению обладает пониженной способностью к продукции антител, содержащих легкие цепи.
Также изобретение относится к использованию антитела, имеющего только тяжелые цепи, или к его фрагменту, по настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для иммунотерапии. Антитела настоящего изобретения, имеющие только тяжелые цепи, также могут использоваться в качестве диагностических средств, реагентов, абзимов или ингибиторов. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело, имеющее только тяжелые цепи, или его фрагмент, по настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также относится к способу получения и селекции антител, имеющих только тяжелые цепи, в котором предусмотрены этапы:
(a) инъекции антигена трансгенному млекопитающему, как описано в настоящем описании;
(b) выделения клетки или ткани, экспрессирующей представляющее интерес антигенспецифическое антитело, имеющее только тяжелые цепи; и
(c) создания гибридомы из клетки или ткани этапа (b) и
(d) необязательно, клонирования мРНК антитела, имеющего только тяжелые цепи, из указанной гибридомы для последующей продукции в системе гетерологичной экспрессии, такой как система млекопитающих, растений, насекомых, бактерий, грибов, или в альтернативной системе.
Затем связывающие домены VH могут быть продуцированы путем идентификации и выделения антигенспецифического домена VH из клонированной мРНК из этапа c).
Связывающие домены VH по настоящему изобретению также могут быть получены путем:
(a) инъекции антитела трансгенному млекопитающему, описанному в настоящем описании;
(b) выделения клетки или ткани, экспрессирующей представляющее интерес антигенспецифическое антитело, имеющее только тяжелые цепи;
(c) клонирования локуса VH из мРНК, полученной из выделенной клетки или ткани;
(d) отображения кодируемого белока, используя фаговую или аналогичную библиотеку;
(e) идентификации антигенспецифического домена (доменов) VH; и
(f) экспрессии домена (доменов) VH отдельно или в виде слитого белка в бактериальных, дрожжевых или альтернативных системах экспрессии.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение позволяет преодолеть ограничения уровня техники и в нем показано, что трансгенные животные, в частности мыши, могут быть созданы при помощи "микролокусов" для продукции класс-специфических антител, имеющих только тяжелую цепь, или смеси различных классов антител, имеющих только тяжелую цепь, которые секретируются плазмой или B-клетками. Затем их можно использовать либо для получения надежной доставки класс-специфических антител, имеющих только тяжелые цепи, используя отлаженную технологию гибридом, либо в качестве источника функциональных связывающих доменов VH (VHH) верблюда или связывающих доменов VH только тяжелой цепи, предпочтительно растворимых связывающих доменов VH только тяжелой цепи человека, которые лишены эффекторных функций, но которые сохраняют связывающую функцию.
Антитела, имеющие только тяжелые цепи (включая антитела верблюда), которые могут быть получены способами настоящего изобретения, проявляют высокую аффинность связывания, которая является результатом перестроек генных сегментов V, D и J и соматических мутаций, обычно без удлиненной петли CDR3. По существу обычное B-клеточное созревание наблюдается при высоких уровнях антител, имеющих только тяжелые цепи, в выделенной плазме (предполагается, что домен CH1 отсутствует во всех классах антител, находящихся в рекомбинантном локусе). B-клеточное созревание и секреция собранных димеров (например, IgG) или мультимеров (например, IgM) не зависит от наличия или экспрессии генов легкой цепи.
Анализ нуклеотидной последовательности антигенспецифической мРНК, кодирующей антигенспецифическую тяжелую цепь, выделенную из гибридом, полученных от трансгенных мышей, показал, что разнообразие антител, имеющих только тяжелую цепь, в основном является функцией VDJ-рекомбинации. Кроме того, авторами настоящего изобретения было показано, что разнообразие антител образуется в области CDR3 функционального антигенсвязывающего домена антител, имеющих только тяжелые цепи, с более ограниченным вкладом соматических мутаций в доменах VH. Используя способы, раскрытые в настоящем описании, функциональные домены VН могут быть клонированы и могут быть экспрессированы в бактериальных системах для получения связывающих доменов VH, при этом полностью сохраняя антигенсвязывающую способность, специфичность и аффинность. Кроме того, класс-специфические димеры или мультимеры тяжелой цепи могут секретироваться в культуре гибридомных клеточных линий.
На основании настоящего изобретения также показано, что трансгенные мыши могут быть запрограммированы на продукцию предпочтительных классов антител, имеющих только тяжелую цепь, в ответ на антигенную стимуляцию, например только IgG или против только IgM, или смесь из, например, IgA, IgG и IgM.
Авторами настоящего изобретения ранее было описано (смотрите заявки на патент WO02/085945 и WO02/085944) создание трансгенных мышей, экспрессирующих минимальный лишенный экзона CН1 локус константной области тяжелой цепи IgG человека, соединенный сегментами человека D и J с двумя генами VHH ламы. При антигенной стимуляции они продуцировали функциональное высокоаффинное антигенспецифическое IgG антитело, имеющее только тяжелые цепи. Смеси классов антител (IgM и IgG), имеющих только тяжелые цепи, могут быть получены переключением классов in vivo путем использования генных конструкций, включая константные области тяжелой цепи в тандеме (при условии, что все гены константных областей лишены домена CH1 и, если имеется, CH4 домена).
Усовершенствования, описанные в настоящем описании, показывают, что мышь, сконструированная с таким же локусом константной области IgG, соединенным при помощи сегментов человека D и J с двумя генами VHH ламы, и локусом константной области IgM человека, лишенного экзона локуса CH1, который соединен при помощи таких же генных сегментов человека D и J с генами VHH ламы, также продуцирует высокомолекулярное (мультимерное) антитело IgM, имеющее только тяжелые цепи, и антитело IgG (димер), имеющее только тяжелые цепи. Интересно то, что по существу нормальное B-клеточное созревание и продукция антител зависит от полного отсутствия последовательностей CH1 в каждой константной области тяжелой цепи, которая имеется в трансгенном локусе. Более того, если имеется экзон CН4, то его удаление не требуется.
Таким образом, например, трансгенное животное, несущее локус тяжелой цепи IgM человека с функциональным экзоном CH1, соединенным при помощи таких же генных сегментов человека D и J с двумя генными сегментами V ламы, и локус константной области тяжелой цепи IgG, лишенный экзона CH1, который соединен при помощи таких же генных сегментов человека D и J с двумя генными сегментами V ламы, продуцирует незначительное количество антител, имеющих только тяжелые цепи, и не проявляет наличие B-клеточного созревания.
Другие эффекторные домены, включая домен CH4, могут быть включены или не включены, по желанию, с целью введения или удаления из полученного антитела, имеющего только тяжелые цепи, эффекторных свойств.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что продуктивную экспрессию антитела (то есть B-клеточное созревание) можно получить в результате использования любого генного сегмента V, находящегося в конструкции. Выделение и секвенирование мРНК антитела, полученного из B-клеток, показало, что происходит рекомбинация генных сегментов D и J, гененрируя разнообразие CDR3. Сравнение последовательностей полученных доменов VH выявило соматические мутации, указывающие, что в рекомбинантных генных сегментах D и J, а также в домене VH полученной экспрессированной мРНК антитела произошли события аффинного созревания.
Предпочтительные конструкции включают генные сегменты V, отобранные или разработанные для улучшенной растворимости и связанные с кластером цепей D и J для рекомбинации и генерации CDR3. Предпочтительно, VDJ-последовательности связаны с константным эффекторным доменом (доменами) выбора в тандеме, каждый из которых лишен экзона CН1.
Настоящее изобретение не ограничено получением и продукцией класс-специфического антитела человека или верблюда, имеющего только тяжелые цепи, или связывающих доменов VH человека (предпочтительно, растворимых связывающих доменов VH) (одиночных или связанных с эффекторным доменом по выбору), но охватывает продукцию химерных комбинаций любого генного сегмента V, полученного от позвоночного животного (необязательно, сконструированного с улучшенными характеристиками растворимости), связанного с генными сегментами D и J. Предпочтительно, генные сегменты V являются генными сегментами человека и не являются генными сегментами V верблюда. Полученные домены VH могут не содержать удлиненной верблюдоподобной петли CDR3, за исключением того, что сегменты D и J получены от верблюда. В результате это дает домен VH, проявляющий разнообразие CDR3 и аффинное созревание, необязательно связанное с эффекторной константной областью. Последняя гарантирует функциональную секрецию и, необязательно, сборку в родительском трансгенном позвоночном животном по выбору, а также обеспечивает последующий выбор эффекторной функции в случае, если это необходимо.
Эти сведения имеют важные результаты для улучшенной и упрощенной разработки класс-специфичкских антител, имеющих только тяжелые цепи, и получения высокоаффинных растворимых доменов VH, которое включает созревание аффинности посредством соматической мутации. Введение выбранных эффекторных функций константной области тяжелой цепи (лишенной CН1) или их смесей делает возможной продукцию антител, имеющих только тяжелые цепи, любого класса или любой смеси антител, имеющих только тяжелые цепи, без необходимости дополнительной разработки антител. Домены VH могут экспрессироваться отдельно в бактериальных системах или в системах других микроорганизмов или в виде функционального антитела, имеющего только тяжелые цепи и содержащего эффекторные домены, которое секретируется гибридомами или трансфецированными клетками в культуре. Антитела и связывающие домены VH человека широко применяются в области здравоохранения в виде лекарственных средств, диагностических средств и реагентов, а также находят применение в сельском хозяйстве, в областях, связанных с защитой окружающей среды, и в промышленной области.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антитела, имеющего только тяжелые цепи VH, трансгенными млекопитающими, в котором предусмотрен этап экспрессии гетерологичного локуса тяжелой цепи VH в указанном млекопитающем. Предпочтительно, локус тяжелой цепи VH содержит константную область тяжелой цепи, которая не кодирует домен CH1, и локус, которой способен формировать при экспрессии разнообразные наборы полных антител, имеющих только тяжелые цепи.
Первый аспект настоящего изобретения также относится к способу продукции антитела, имеющего только тяжелые цепи VH верблюда, трансгенными млекопитающими, в котором предусмотрен этап экспрессии локуса тяжелой цепи VH верблюда в таком млекопитающем, причем локус тяжелой цепи VH содержит константную область тяжелой цепи, которая не кодирует домен CH1, и локус которой при экспрессии способен формировать разнообразный набор полных антител, имеющих только тяжелые цепи, включая VDJ-перестройку и созревание аффинности в ответ на антигенную стимуляцию.
Эффекторные молекулы тяжелых цепей могут быть сконструированы таким образом, чтобы представлять собой свободные функциональные домены, например карбоксиконцевые домены CH4, при условии, что их создание не влияло на секреторные механизмы, предотвращающие сборку на клеточной поверхности и, следовательно, B-клеточное созревание. Из гетерологичного локуса удаляют или в этом локусе отсутствуют одни только экзоны CH1. В локусе могут быть разработаны дополнительные особенности, например, для улучшения гликозилирования или дополнительной функции.
Предпочтительно, гетерологичный локус при экспрессии способен формировать функциональные молекулы IgA, IgE, IgG, IgD или IgM или их изотопы. Также могут быть получены отдельные классы антител или смеси классов антител или их изотопы.
Следовательно, гетерологичный локус тяжелой цепи конструируют для продукции предпочтительных классов или смесей антител, имеющих только тяжелые цепи, в зависимости от требуемого класса(классов) антител, с по существу нормальным B-клеточным созреванием. Применение генных сегментов V, D и J верблюда и эффекторных областей верблюда будет давать антитела верблюда с особенностями, специфическими для верблюда, например антитела с удлиненными петлями CDR3. Использование генных сегментов человека V, D и J, содержащих генные сегменты V, выбранные произвольно или выбранные или сконструированные для усиления растворимости, будет продуцировать антитела человека, имеющие только тяжелые цепи.
Антитела, полученные по настоящему изобретению, имеют преимущества перед антителами предшествующего уровня техники, заключающиеся в том, что антитела по настоящему изобретению представляют собой любой один или известный класс и, предпочтительно, являются человеческими. Антитела являются высокоаффинными благодаря комбинации VDJ-рекомбинации и созреванию аффинности in vivo. Антитела и их фрагменты могут быть выделены, охарактеризованы и получены с помощью хорошо известных способов, известных специалистам в данной области техники.
Гетерологичный локус тяжелой цепи
В контексте настоящего изобртения термин “гетерологичный” относится к нуклетидной последовательности или локусу, как описано в настоящем описании, который не является эндогенным для млекопитающего, у которого он находится. “Локус тяжелой цепи VH” в контексте настоящего изобретения относится к минимальному микролокусу, кодирующему домен VH, содержащий один или несколько генных сегментов V, один или несколько генных сегментов D и один или несколько генных сегментов J, необязательно связанных с одной или несколькими эффекторными областями тяжелой цепи (каждая из которых лишена домена CH1). Предпочтительно, первичным источником изменчивости набора антител является область CDR3, сформированная посредством селекции генных сегментов D и J при помощи соединений V-D и D-J.
Преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что набор и разнообразие антител, получаемых в перестроенных генных последовательностях VH, можно максимально увеличить путем использования множества генных сегментов D и J. Последующая соматическая мутация достигается, хотя и используется минимальный локус (микролокус), без необходимости большого количества генных сегментов локусов V или VL и Lc (легкая цепь) иммуноглобулина.
Предпочтительно, локус тяжелой цепи VH содержит от двух до пяти (2, 3, 4 или 5) генных сегментов V, полученных от любого вида позвоночного животного.
Предпочтительно, генные сегменты V являются человеческими, необязательно, выбраны или сконструированы для улучшения растворимости.
Предпочтительно, локус тяжелой цепи VH содержит от двух до сорока (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30 или 40) или более генных сегментов D. Генные сегменты D могут быть получены от любого вида позвоночного животного, наиболее предпочтительно, генные сегменты D представляют собой генные сегменты человека D (обычно 25 функциональных генных сегмента D).
Предпочтительно, локус тяжелой цепи VH содержит от двух до двадцати (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 или 20) или более генных сегментов J. Генные сегменты J могут быть получены от любого вида позвоночного животного, но наиболее предпочтительно, генные сегменты J представляют собой генные сегменты J человека (обычно 6 генных сегментов J).
Предпочтительно, локус тяжелой цепи VH содержит два или несколько генных сегментов V, двадцать пять функциональных генных сегментов D человека и 6 генных сегментов человека J.
Термин “генный сегмент V” охватывает встречающийся в природе генный сегмент V, полученный от позвоночного животного, включая верблюда и человека, который не обязательно является отобранным, мутированным или разработанным для улучшения характеристик, таких как растворимость. Генные сегменты V также обнаружены у других видов, таких как акула (смотрите Kokubu et al., (1988) EMBO. J., 7, 3413-3422), или они эволюционировали для обеспечения разнообразных VH-подобных семейств связывающих белков, иллюстрацией чего, например, является эволюция набора иммуноглобулиновой легкой цепи VL или набора VH T-клеточных рецепторов.
Предпочтительные способы улучшения растворимости домена VH включают логические, в противоположность только случайным, средства и описаны Davies и Reichmann, (1996) Protein Eng., 9 (6), 531-537 и Riechmann и Muyldermans, (1999) J Immunol. Methods, 231, 25-38. Также может происходить естественная селекция in vivo в результате созревания аффинности и добавление полезных мутаций в ген VH после VDJ-перестройки.
Генный сегмент V должен быть способен к рекомбинации с генным сегментом D, генным сегментом J и константной (эффекторной) областью тяжелой цепи (которая может содержать несколько экзонов, но лишена экзона CH1) согласно настоящему изобретению для генерации антител, имеющих только тяжелые цепи VH, в случае экспрессии нуклеиновой кислоты.
Генный сегмент V согласно настоящему изобретению также включает в пределах своего объема любую генную последовательность, кодирующую гомологичный, модифицированный или белковый фрагмент, который способен к рекомбинации с генным сегментом D, генным сегментом J и константной областью тяжелой цепи (содержащей один или несколько экзонов, но не имеющей экзона CH1) согласно настоящему изобретению для генерации антитела, имеющего только тяжелую цепь, как определено в настоящем описании.
Таким образом, VH кодирующие последовательности могут быть получены от встречающегося в природе источника или они могут быть синтезированы при помощи способов, известных специалистам в данной области техники.
“Домен VH” в контексте настоящего изобретения относится к продукту экспрессии генного сегмента V после рекомбинации с генным сегментом D и генным сегментом J, как определено выше. Предпочтительно, домен VH, как используется в настоящем описании, остается в растворе и является активным в физиологической среде без необходимости в каком-либо другом факторе для поддержания растворимости. Предпочтительно, способность растворимого домена VH связывать антиген улучшена благодаря VDJ-рекомбинации и соматической мутации. Отсутствует зависимость от наличия или отсутствия удлиненной петли CDR3, характерной для видов верблюдов. Домен VH также способен связывать антиген в виде мономера и в случае объединения с эффекторными константными областями может быть продуцирован в виде моноспецифических, биспецифических, мультиспецифических, бивалентных или мультивалентных форм, в зависимости от выбора и разработки используемых эффекторных молекул (например, IgG, IgA IgM и т.д.) или альтернативных механизмов димеризации и мультимеризации. Любая вероятность связывания с доменом VL в случае экспрессиии в виде части растворимого антитела, имеющего только тяжелую цепь, комплекс - элиминируется удалением экзона CH1 (смотрите Sitia et al., (1990) Cell, 60, 781-790). Один домен VH также может быть сконструирован с различными белковыми доменами для продуцирования слитых белков для целевых терапевтических и диагностических задач, например с токсинами, ферментами и агентами визуализации.
В контексте настоящего изобретения термины “генный сегмент D” и “генный сегмент J” включает встречающиеся в природе последовательности генных сегментов D и J. Предпочтительно, генные сегменты D и J получают от одного и того же позвоночного животного, от которого получают генный сегмент V. Например, если генный сегмент V получают от человека и затем повышают растворимость или разрабатывают его, генные сегменты D и J также предпочтительно получают от человека. В качестве альтернативы генные сегменты V могут быть получены, например, от верблюда, а генные сегменты D и J - от человека или наоборот.
Термины "генный сегмент D" и "генный сегмент J" также охватывают производные, гомологи и их фрагменты при условии, что полученный сегмент может рекомбинировать с оставшимися компонентами локуса тяжелой цепи антитела, как раскрыто в настоящем описании, для генерации антитела, имеющего только тяжелые цепи, как раскрыто в настоящем описании. Генные сегменты D и J могут быть получены из встречающихся в природе источников или они могут быть синтезированы при помощи способов, знакомых специалистам в данной области техники и раскрытых в настоящем описании. Генные сегменты V, D и J способны к рекомбинации и предпочтительно подвержены соматической мутации.
Генные сегменты V, D и J, предпочтительно, получают от одного вида позвоночного животного. Это может быть любое позвоночное животное, но предпочтительно - человек.
Кроме того, гетерологичный локус тяжелой цепи согласно настоящему изобретению содержит область ДНК, кодирующую константную область тяжелой цепи, которая обеспечивает эффекторные функции in vivo (например, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD или их изотипы).
Настоящее изобретение также предоставляет антигенспецифическое антитело, имеющее только тяжелую цепь, полученное или получаемое способами настоящего изобретения.
Константная область тяжелой цепи
Функционально, константная область тяжелой цепи кодируется природным или сконструированным генным сегментом, который способен к рекомбинации с генным сегментом V, генным сегментом D и генным сегментом J в B-клетке. Предпочтительно, константную область тяжелой цепи получают из иммуноглобулинового локуса.
Согласно этому аспекту настоящего изобретения каждая константная область тяжелой цепи по существу содержит по меньшей мере один ген константной области тяжелой цепи, который экспрессируется без функционального домена CH1 таким образом, чтобы было возможно получение антитела, имеющего только тяжелые цепи. Каждая константная область тяжелой цепи также может содержать один или несколько дополнительных экзонов константной области тяжелой цепи, которые выбирают из группы, состоящей из Сδ, Сγ1-4, Сµ, Сε и Сα1-2, с условием, что дополнительные гены константной области тяжелой цепи также не экспрессируют функциональный домен CH1. Генные сегменты константной области тяжелой цепи выбирают в зависимости от требуемого предпочтительного класса или смеси классов антител. Необязательно, гетерологичный локус тяжелой цепи лишен Cµ и Cδ.
Например, известно, что молекулы Ig класса M играют важную роль в активации макрофагов и пути комплемента. Поскольку их участки связывания находятся в непосредственной близости, IgM имеет высокую авидность к патогенам, включая вирусы. Однако также известно, что IgM трудно использовать в быстрых способах иммуноанализа, в то время как Ig класса G могут быть использованы в этих способах без труда. Для таких применений обычно полезно выбирать предпочтительный класс антител, то есть IgG или IgM.
Экспресия всего или части гетерологичного локуса тяжелой цепи Сγ, лишенного CН1, необязательно будет продуцировать некоторые или все изотипы IgG в зависимости от наличия в гетерологичном локусе IgG изотипов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В качестве альтернативы тяжелые цепи могут содержать гены Cε. В терапии также может быть использована полученная молекула IgE.
В качестве альтернативы могут быть получены выбранные смеси антител. Например, IgA и IgM могут быть получены, если константная область тяжелой цепи содержит гены Cα и Cµ.
Предпочтительно, константная область тяжелой цепи согласно настоящему изобретению имеет человеческое происхождение, в частности, если антитело, имеющее только тяжелые цепи, должно использоваться с целью терапевтических применений в отношении человека. Там, где антитела, имеющие только тяжелые цепи, должны использоваться с диагностической или ветеринарной целью, константную область тяжелой цепи предпочтительно получают от организма-мишени, позвоночного или млекопитающего, в отношении которого или над которым проводят диагностические исследования или ветеринарную терапию.
Во время экспрессии константная область тяжелой цепи лишается функционального домена CH1. Экзон CH1 и необязательно константные области Cµ и Cδ могут быть подвергнуты мутации, делеции или замене. Предпочтительно, экзон CH1 подвергается делеции. Наличие, например, IgM с функциональным доменом CH1 ингибирует B-клеточное созревание и, следовательно, ограничивает продуктивную экспрессию IgG (лишенного CH1), имеющего только тяжелые цепи в пределах того же локуса, поскольку B-клеточное созревание ингибировано.
“Экзон константной области тяжелой цепи” (“экзон CH”), как раскрыто в настоящем описании, включает последовательности встречающихся в природе экзонов CH позвоночного животного, но особенно млекопитающего. Экзон CH изменяется класс-специфическим образом. Например, IgG и IgA естественным образом лишены домена CH4. Термин “экзон CH” также включает в пределах своего объема производных гомологи и фрагменты, поскольку экзон CH способен формировать функциональное антитело, имеющее только тяжелую цепь, как определено в настоящем описании, если он представляет собой компонент константной области тяжелой цепи.
Необязательно, если присутствует, CH4 или другие функциональные домены могут быть разработаны или делетированы внутри трансгена, при условии, что такой процесс не ингибирует внутриклеточный секреторный процесс, B-клеточное созревание или связывающую активность полученного полипептида антитела.
Млекопитающие
Трансгенное млекопитающее, используемое в способах настоящего изобретения, не является человеком. Трансгенное млекопитающее предпочтительно представляет собой грызунов, таких как кролик, морская свинка, крыса или мышь. Особенно предпочтительны мыши. Также могут использоваться альтернативные млекопитающие, такие как козы, овцы, кошки, собаки или другие животные.
Предпочтительно трансгенных животных создают, используя общепринятую технологию инъецирования ооцитов и, в случае, если разработаны, ES-клеточную технологию или клонирование.
Преимущественно, согласно способам настоящего изобретения локусы тяжелой цепи и необязательно легкой цепи иммуноглобулинов, эндогенных относительно животного, подвергают делеции или сайлесингу, когда экспрессируется антитело, имеющее только тяжелые цепи.
Такой подход генерации антител, имеющих только тяжелые цепи, как описано выше, может иметь конкретное применение для генерации антител для терапевтического применения относительно человека в виде частого введения антител особи позвоночного, которое отличается происхождением от источника антител, что приводит к проявлению иммунного ответа против указанных введенных антител.
Следовательно, в дополнительном аспекте настоящее изобретение предоставляет трансгенное млекопитающее, экспрессирующее гетерологичный локус тяжелой цепи согласно настоящему изобретению.
Трансгенное млекопитающее может быть создано таким образом, чтобы оно имело пониженную способность продуцировать антитела, которые включают легкие цепи.
Антителопродуцирующие клетки могут быть получены от трансгенных животных согласно настоящему изобретению и использованы, например, при создании гибридов для продуцирования антител, имеющих только тяжелые цепи, как определено в настоящем изобретении. Дополнительно или в качестве альтернативы последовательности нуклеиновых кислот могут быть выделены от трансгенных млекопитающих согласно настоящему изобретению и использованы для продуцирования антител, имеющих только домены VH тяжелых цепей или их биспецифические/бифункциональные комплексы, используя технологии рекомбинантной ДНК, которые известны специалистам в данной области техники.
В качестве альтернативы или дополнительно согласно настоящему изобретению, антигенспецифические антитела, имеющие только тяжелые цепи, можно генерировать иммунизацией трансгенного животного.
Таким образом, в дополнительном аспекте настоящее изобретение представляет способ продуцирования антител, имеющих только тяжелые цепи, иммунизацией антигеном трансгенного млекопитающего согласно настоящему изобретению.
В предпочтительном варианте осуществления указанного аспекта настоящего изобретения млекопитающее является мышью.
Антитела, имеющие только тяжелые цепи, и их фрагменты
В дополнительном аспекте настоящее изобретение представляет антитело, имеющее только тяжелые цепи, получаемое согласно способу настоящего изобретения, и его функциональные фрагменты и производные. Фрагменты, охватывающие связывающий домен VH, могут быть получены ферментативным расщеплением или расщеплением цианогенбромидом антитела настоящего изобретения, имеющего только тяжелые цепи, то есть лишенного легких цепей (Jaton et al., (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195).
Предпочтительный функциональный фрагмент представляет собой антигенспецифический связывающий домен только тяжелой цепи, то есть связывающий домен VH, как экспрессируемый локусом VH в результате рекомбинации между единичными генными сегментами V, D и J, за которой позже следует соматическая мутация. Согласно этому аспекту настоящего изобретения локусы VH могут быть клонированы из, например, мРНК, выделенной из антителопродуцирующей клетки иммунизированного трансгенного животного, как описано выше. Клонированные последовательности могут быть затем отображены при помощи библиотек фагового (Ward et al., (1989) Nature, 341, 544-546) или аналогичного дисплея, например, путем использования систем на основе дрожжей (Boder and Wittrup, (1997) Nat. Biotechnol., 15, 553-7), а антигенспецифические связывающие домены VH идентифицированы. Антигенспецифические связывающие домены тяжелой цепи затем могут быть произведены либо отдельно, либо в виде слитых белков в размерно варьируемых бактериальных, дрожжевых или альтернативных системах экспрессии. Последовательности, кодирующие связывающие домены VH, также могут быть клонированы из охарактеризованных гибридом, полученных классическими процедурами от иммунизированных трансгенных мышей. Затем они могут использоваться для продуцирования связывающих доменов VH и их производных, включая разработку определенных классов антител (например, IgE или IgA), и их вариантов с различными эффекторными функциями.
Следовательно, настоящее изобретение также предоставляет способ продуцирования связывающего домена VH, содержащий этапы, на которых:
a) выделяют клетку или ткань, экспрессирующую представляющее интерес антигенспецифическое антитело, имеющее только тяжелые цепи (предпочтительно, представляющее интерес растворимое антигенспецифическое антитело, имеющее только тяжелые цепи);
b) клонируют последовательность, кодирующую связывающий домен VH из мРНК, полученной из выделенной клетки или ткани;
c) отображают кодированный белок, используя фаговую или аналогичную библиотеку;
d) идентифицируют антигенспецифические связывающие домены VH, и
e) экспрессируют связывающие домены VH отдельно или в виде слитого белка в системах экспрессии в бактериях, дрожжах, млекопитающих или альтернативных системах.
В качестве альтернативы фрагменты, содержащие домен VH, могут быть сгенерированы из антител настоящего изобретения, имеющих только тяжелые цепи, путем использования ферментативных или химических способов расщепления и последующим отделением фрагмента, содержащего домен VH, от других продуктов расщепления.
Там, где связывающий домен VH выделен из охарактеризованной гибридомы, клонированная последовательность связывающего домена VH, полученная из мРНК, может быть клонирована непосредственно в вектор экспрессии без источника дополнительных этапов селекции, использующих системы фагового или другого дисплея.
Системы продуцирования антитела, имеющего только тяжелые цепи, содержащего эффекторные области, включают клетки млекопитающих в культуре (например, клетки CHO), растений (например, маиса), трансгенных коз, кроликов, крупного рогатого скота, овец, цыплят и личинок насекомых, подходящих для технологии массового разведения. Другие системы продуцирования, включая инфицирование вирусом (например, бакуловирус в личинках насекомых и клеточные линии), представляют собой альтернативные подходы, использующие клеточные культуры и зародышевые линии. Другие способы продуцирования также хорошо известны специалистам в данной области техники. Там, где требуется сборка IgA или IgM, имеющих только тяжелые цепи, полезна коэкспрессия “цепи J”. Подходящие способы продуцирования антитела верблюда, имеющего только тяжелые цепи, или одних связывающих доменов VH известны в данной области техники. Например, связывающие домены VH верблюда были продуцированы в бактериальных системах, а гомодимеры верблюда, имеющие только тяжелые цепи, были продуцированы в гибридомах и трансфецированных клетках млекопитающих (смотрите Reichmann and Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38).
Также общепринятыми являются способы экспрессии разработанных связывающих доменов VH человека, полученных при помощи технологии фагового дисплея (Tanha et al., (2001) J. Biol. Chem., 276, 24774-24780 и ссылки, приведенные там).
Показано, что личинки насекомых от линий трансгенных мух продуцируют функциональные фрагменты антитела, имеющего только тяжелые цепи, в гемолимфе с признаками, неотличимыми от такого же антитела, продуцированного клетками млекопитающих (PCT/GB2003/0003319). Настоящее изобретение также предоставляет антигенспецифический мономерный или димерный связывающий домен VН, получаемый согласно способу этого аспекта настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также предоставляет полинуклеолтидную последовательность, состоящую из гетерологичного локуса тяжелой цепи, выделенного полинуклеотида, кодирующего антитело настоящего изобретения, имеющее только тяжелые цепи, и вектор, содержащий гетерологичный локус тяжелой цепи, или его фрагмент, или выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело, имеющее только тяжелые цепи, согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также предоставляет клетку-хозяина, трансформированную гетерологичным локусом тяжелой цепи или его фрагментом, или выделенным полинуклеотидом, кодирующим антитело, имеющее только тяжелые цепи, или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению.
Во втором аспекте настоящее изобретение предоставляет полипептидный комплекс, содержащий антигенспецифический связывающий домен VH согласно настоящему изобретению, имеющий прикрепленный к нему эффекторный участок, который обеспечивает эффекторную активность. Эта эффекторная активность может быть дополнительной к эффекторной активности, обеспечиваемой константной областью тяжелой цепи и может быть расположена на амино- или карбоксиконце молекулы. Такие полипептидные комплексы сохраняют физиологическую функцию, которой их наделяет антигенспецифический связывающий домен VH в комбинации с дополнительными нацеливающей функцией и эффекторной функцией эффекторных участков. Такие полипептидные комплексы могут быть в виде функциональных мономеров или в зависимости от разработки и взаимодействия эффекторных участков димерами, тетрамерами, пентамерами, мультимерами или другими комплексами, включающими различные связывающие домены VН, поэтому обеспечивая мультивалентность и мультиспецифичность. Связывающие домены VH могут находиться на амино- или карбоксиконце связывающей молекулы (смотрите фиг.1 для примера димера).
Если эффекторный участок содержит связывающий домен, он может иметь специфичность, отличную от антигенспецифического связывающего домена VH. Преимущество такой структуры заключается в том, что полипептидный комплекс может облегчить образование поперечных связей различных мишеней. Например, биспецифический полипептидный комплекс может быть использован для усиления взаимодействий клетка-клетка и взаимодействий клетка/патоген. В таком варианте осуществления полипептидный комплекс настоящего изобретения может использоваться, например, для образования мостика между двумя типами клеток, такими как патоген и макрофаг (смотрите Biburger et al., (2005) J. Mol. Biol, 346, 1299-1311). В таких биспецифических разработках использование связывающих доменов VH предпочтительнее использования связывающих доменов scFV. Связывающие домены VH имеют высокую аффинность связывания и могут быть введены в такие полипептидные комплексы при помощи минимальной векторной конструкции и без учета разработки, необходимой для поддержания специфичности и аффинности scFV относительно их тетрамерной родительской молекулы. Там, где предусмотрены димеры или мультимерные полипептидные комплексы, вводят домены димеризации, например включают домены CH2 и CH3, полученные из константных областей тяжелых цепей иммуноглобулинов (смотрите фиг.2).
Термин “эффекторный участок”, как используется в настоящем описании, включает любой участок, который опосредует в клетке желательный биологический эффект. Эффекторный участок предпочтительно является растворимым и может представлять собой пептид, полипептид или белок, или может иметь непептидную структуру. Например, эффекторный участок может представлять собой фермент, гормон, цитокин, лекарство, пролекарство, токсин, в частности белковый токсин, радионуклид в хелатной структуре, связывающий домен, домен димеризации или взаимодействия, агент визуализации, альбумин или ингибитор.
Альбумин может быть использован в качестве эффекторного участка для увеличечния стабильности или фармакокинетических, и/или фармакодинамических свойств антигенспецифического связывающего домена VH (Sung et al., (2003) J. Interferon Cytokine Res., 23 (1): 25-36). В качестве альтернативы эффекторный участок может представлять собой пэгилированную структуру или естественным образом гликозилированную структуру для улучшения фармакодинамических свойств.
Эффекторный участок может представлять собой пептид, связанный с антигенспецифическим связывающим доменом VH, или он может быть химически связан с антгенспецифическим доменом VH тяжелой цепи, например, при помощи химической связывающей структуры, такой как малеимидный линкер. В качестве альтернативы полипептидные комплексы настоящего изобретения могут быть экспрессированы в виде слитых белков. По существу настоящее изобретение также охватывает полинуклеотидную последовательность, состоящую из гетерологичного локуса тяжелой цепи или выделенного полинуклеотида, кодирующего антитело настоящего изобретения, имеющего только тяжелую цепь, причем полинуклеотид дополнительно содержит в рамке считывания один или несколько экзонов, кодирующих эффекторный участок. Такой экзон может находиться на 5'- или 3'-конце полинуклеотида. Например, полинуклеотид может содержать, в порядке следования и в рамке считывания, VH и генный сегмент связывающего домена/эффекторного участка. В случае генетических слияний прикрепление различных доменов может достигаться при помощи конструкции рекомбинантной ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность слитого белка, с ДНК, кодирующей различные домены, расположенные в той же рамке считывания. Такие конструкции являются ценными в качестве диагностических и терапевтических средств. В качестве диагностического средства эффекторный домен может представлять собой флуоресцентный белок (например, GFP) или фермент (например, β-gal). В качестве альтернативы эффекторный домен может представлять собой тэг для усиления связывания с субстратом (например, полигистидин или биотин) и антиген для обеспечения участка прикрепления для вторичных антител или лециновую молнию, или аналогичный связывающий мотив, который может служить в качестве участка прикрепления флуоресцентных маркеров.
Полипептидные комплексы
Авторы настоящего изобретения также предположили, что существует возможность продуцирования бивалентного или мультивалентного полипептидного комплекса, содержащего по меньшей мере часть тяжелой цепи антитела одного или в комбинации с отдельной эффекторной (легкой) цепью, содержащей комплементарный домен сборки и имеющей дополнительную эффекторную активность. Полипептидные комплексы согласно настоящему изобретению сохраняют физиологическую функцию, обеспечиваемую константной областью тяжелой цепи в комбинации с дополнительными функциями эффекторного участка, связанного с эффекторной цепью (фиг.3).
По существу в третьем аспекте полипептидный комплекс содержит тяжелые цепи в комбинации с одной или несколькими эффекторными цепями (легкими цепями). Второй аспект настоящего изобретения предоставляет полипептидный комплекс, содержащий пару тяжелых цепей и пару эффекторных цепей, причем:
тяжелые цепи пары связаны друг с другом;
одна из эффекторных цепей связана с одной из тяжелых цепей, а другая эффекторная цепь связана с другой тяжелой цепью;
каждая тяжелая цепь содержит связывающий домен, домен димеризации, предпочтительно содержащий по меньшей мере домены CH2, CH3 и необязательно CН4 константной области, и эффекторный участок, способный связываться с комплементарным доменом сборки эффекторной цепи; и
эффекторная цепь содержит комплементарный домен сборки, имеющий прикрепленный к нему эффекторный участок,
при этом домен сборки и комплементарный домен сборки связаны друг с другом при помощи нековалентных взаимодействий.
Предпочтительно, эффекторный участок в тяжелой цепи отличается от эффекторного участка в эффекторной цепи.
Необязательно, полипептидный комплекс включает гибкий шарнироподобный домен на карбоксильном конце домена CH3 (или домена CH4, если он присутствует), связывающий его с доменом сборки. Предпочтительно, полипептидный комплекс включает природный шарнирный домен или гибкий разработанный шарнироподобный домен между связывающим доменом и доменом CH2. Наличие шарнирных областей облегчает независимое функционирование связывающих доменов и эффекторных участков в полученных полипептидных комплексах.
Эффекторный участок в первой полипептидной тяжелой цепи необязательно имеет специфичность, отличную от специфичности эффекторного участка во второй полипептидной тяжелой цепи. Согласно настоящему изобретению эффекторный участок полипептидного комплекса может быть заменен связывающим доменом. Предпочтительно, связывающий домен содержит домен VH (как определено в первом аспекте настоящего изобретения) или домен, связывающий клеточный рецептор. Полученный тетравалентный димерный связывающий белок (полипептидный комплекс) может содержать до четырех различных эффекторных участков. Предпочтительно эффекторные участки на аминотерминальном конце тяжелой цепи идентичны, и эффекторные участки на карбоксильном терминальном конце идентичны (но узнают антиген или эпитоп, отличный от антигена или эпитопа на аминотерминальном конце), облегчая сборку единичного гомодимера. Такая молекула может оказаться более эффективной при захвате патогенов, при этом эффекторная функциональность обеспечивается включением подходящих функциональных доменов тяжелой цепи (например, IgA или IgM).
Иллюстративный полипептидный комплекс согласно третьему аспекту настоящего изобретения является полезным для цитохимического мечения, способов нацеливания или терапии, например, если эффекторная молекула содержит антигенспецифический связывающий домен VH, который нацеливается на поверхностный маркер раковой клетки, а эффекторный участок содержит связывающий домен, специфический для фермента, преобразующего пролекарство (эффекторная цепь). Антигенспецифический связывающий домен VH связывается с мишенью и доставляет эффекторный участок в непосредственную близость от мишени так, что при связывании эффекторной цепи он может оказывать биологическое влияние на мишень в присутствии пролекарства (например, нитроредуктаза с CB1954). Включение эффекторной функции тяжелой цепи иммуноглобулина в качестве домена димеризации также может быть полезным для элиминации мишеневой клетки.
Эффекторная цепь
Эффекторная цепь содержит комплементарный связывающий домен и эффекторный участок, который связан с тяжелой цепью при помощи эффекторного участка тяжелой цепи, образуя собранный связывающий полипептидный комплекс. Комплементарный домен сборки эффекторной цепи может представлять собой интегральный компонент эффекторного участка или белок, или альтернативный лиганд, слитый или химически связанный с эффекторным участком. Тяжелые цепи собранного связывающего полипептидного комплекса связываются с мишенью и доставляют участок эффекторной (легкой) цепи в непосредственную близость от мишени, так что могут оказывать влияние на мишень.
Эффекторный участок
Термин “эффекторный участок”, как используется в настоящем описании, включает любой участок, который опосредует желательное биологическое влияние на клетку. Эффекторный домен может представлять собой клетку, например T-клетку, пептид, полипептид или белок, или может представлять собой непептидную структуру. Например, эффекторный домен может представлять собой фермент, лекарство, пролекарство, токсин, в частности белковый токсин, радионуклид в хелатной структуре или связывающий домен. Эффекторный участок, связанный с комплементарным доменом сборки, может быть клеточным, белковоподобным, иметь органическое или неорганическое происхождение, в зависимости от желательного эффекта.
Термин “связывающий домен”, как используется в настоящем описании в отношении всех вышеуказанных аспектов настоящего изобретения, включает полипептидный домен, который является активным в физиологической среде. Такой связывающий домен также должен иметь способность к связыванию с мишенью в физиологических условиях.
Такие связывающие домены включают домены, которые могут опосредовать связывание или адгезию на клеточной поверхности. Подходящие домены, которые могут быть использованы в полипептидных комплексах настоящего изобретения, представляют собой молекулы адгезии клеток млекопитающих, прокариотических клеток или вирусов, цитокины, факторы роста, рецепторные антагонисты или агонисты, лиганды, рецепторы клеточной поверхности, регуляторные факторы, структурные белки и пептиды, белки сыворотки, секретируемые белки, белки, связанные с плазмалеммой, вирусные антигены, бактериальные антигены, протозойные антигены, антигены паразитов, липопротеины, гликопротеины, гормоны, нейротрансмиттеры, факторы свертывания крови, разработанную единичную цепь Fvs и т.п. Предпочтительно связывающий домен представляет собой домен VH позвоночного животного, более предпочтительно домен VH млекопитающего, такой как домен VH человека.
Связывающий домен может содержать домен VH (VHH) верблюда или может содержать домен VH, полученный от другого животного. Предпочтительно связывающий домен представляет собой домен VH человека. Связывающие домены VH предпочтительно происходят от B-клеток, полученных от трансгенных животных или верблюда (как описано выше), в противоположность доменам VH, полученным из синтетических фаговых библиотек, поскольку первый будет иметь более высокую аффинность в результате генерации в ответ на антигенную стимуляцию in vivo благодаря VDJ-перестройке и соматической мутации.
Если эффекторный участок содержит связывающий домен, он предпочтительно имеет специфичность, отличную от связывающего домена тяжелой цепи. Преимущество такого строения заключается в том, что полипептидный комплекс может облегчать перекрестное сшивание различных мишеней или связывать различные антигены на клетке-мишене (например, патоген).
Связывающий домен в первой тяжелой цепи может иметь специфичность, отличную от специфичности связывающего домена второй тяжелой цепи. Таким образом, полипептидный комплекс может быть по меньшей мере бивалентным и может перекрестно сшивать различные мишени, и эффекторный домен может оказывать влияние на обе мишени. Мультивалентный полипептидный комплекс может быть создан посредством связи таких тетравалентных тяжелых цепей с эффекторными цепями, содержащими эффекторные домены с различной специфичностью (специфичностями) и функциональностью. Также эффекторный участок первой тяжелой цепи может иметь специфичность, отличную от специфичности эффекторного участка второй тяжелой цепи, позволяя захватывать более одной эффекторной цепи, каждая из которых обладает отличной функциональностью.
Комплементарный домен сборки связывается с эффекторным участком
Если тяжелая цепь связана с эффекторной цепью, термины “эффекторный участок” и “комплементарный домен сборки”, как используются в настоящем описании, включают любые участки, которые могут формировать по меньшей мере прикрепление друг к другу нековалентным способом. Например, эффекторный участок и комплементарный домен сборки могут представлять собой белок, пептидный фрагмент или иметь консенсусную последовательность, способную формировать взаимодействие белок-белок, например, которое присутствует между доменом CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина и константной областью легкой цепи иммуноглобулина; в лейциновой молнии; VCAM и VLA-4; интегринами и внеклеточными белками матрикса; интегринами и молекулами клеточной поверхности, такими как CD54 или CD102; ALCAM и SRCR доменами; scFv и антигеном или связывающим доменом VH и антигеном.
Тяжелые цепи
Там, где домены димеризации тяжелых цепей содержат константные области тяжелых цепей иммуноглобулинов, константные области (экзоны CH) могут обеспечивать дополнительную физиологическую функциональность связывающего полипептидного комплекса. В частности, константные домены тяжелых цепей иммуноглобулинов могут обеспечивать, среди прочего, фиксацию комплемента, активацию макрофага и связывание с Fc-рецепторами в зависимости от класса или подкласса константных доменов антитела.
Как обсуждалось выше, хорошо известно, что класс экспрессированных тяжелых цепей играет большую роль в эффекторной функции in vivo. Созданная клеточная линия может продуцировать полипептидный комплекс, имеющий полезное нацеливание и биологический эффект, но константная область тяжелой цепи может относиться к классу, который является нежелательным с точки зрения диагностики или терапии, или он может не секретироваться в эффективных количествах. Соотвественно, константные домены тяжелой цепи полипептидных комплексов настоящего изобретения могут специфическим образом изменяться или частично, или полностью исключаться для введения или удаления компонентов тяжелых цепей иммуноглобулинов.
Например, известно, что молекулы Ig класса M играют важную роль в активации макрофагов и пути комплемента. Благодаря расположению в непосредственной близости от связывающих участков IgM имеет высокую авидность к патогенам, включая вирусы. Однако также известно, что IgM трудно использовать в быстрых способах иммуноанализа, тогда как Ig класса G можно без труда использовать в этих способах. Для таких применений было бы полезным переключение класса тяжелой цепи с µ- на γ-домены.
Экспрессия только локуса тяжелой цепи Cγ будет продуцировать IgG, включая изотипы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, некоторые из которых также будут активировать комплемент. IgG антитела связывают и активируют макрофаги и гранулоциты и могут проникать через плаценту.
Дополнительные применения классов различных антител обсуждались выше.
Константные области тяжелых цепей полипептидных комплексов настоящего изобретения могут происходить от человека, могут происходить от кроликов, крыс или мышей, как определено выше. Предпочтительно, они происходят от человека.
Полипептидные комплексы настоящего изобретения также могут быть использованы исключительно для блокирования связывания лигандов с их рецепторами при помощи доменов димеризации, которые не обеспечивают эффекторные фукции. При помощи мультиспецифического полипептидного комплекса может быть блокировано множество рецепторов.
В четвертом аспекте настоящего изобретения эффекторная молекула может содержать домен димеризации, такой, что эффекторная молекула может быть связана с отдельной эффекторной молекулой. Такой домен димеризации может содержать один или несколько доменов CH2, СH3 или CН4 константной области антитела и/или цепь J. В этом варианте осуществления настоящего изобретения две или более эффекторные молекулы могут быть связаны с продуцированием димера или мультимера эффекторных молекул. Эффекторные молекулы могут быть одинаковыми (позволяя продуцирование гомодимера или гомомультимера эффекторных молекул) или разными (позволяя продуцирование гетеродимера или гетеромультимера эффекторных молекул). Предпочтительно, димер или мультимер эффекторных молекул является бивалентным или мультивалентным. Предпочтительно, константные области двух или более эффекторных молекул (т.е. домены димеризации) являются идентичными, таким образом, уменьшая вероятность гетерогенности продукта.
Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения предоставляется полипептидный комплекс, содержащий димер, состоящий из первой тяжелой цепи полипептида и второй тяжелой цепи полипептида, причем:
каждая тяжелая цепь полипептида содержит связывающий домен и домен димеризации, который необязательно содержит по меньшей мере домены CH2, CH3 и необязательно CH4 константного участка антитела; и, необязательно, эффекторный участок, при этом предпочтительно:
связывающий домен первой тяжелой цепи полипептида имеет такую же специфичность, как и связывающий домен второй тяжелой цепи полипептида; и
константные области (домены димеризации) для двух тяжелых цепей полипептида идентичны.
Предпочтительно, первая и вторая цепи имеют одинаковые эффекторные участки.
Предпочтительно, домен димеризации содержит по меньшей мере домены CH2, CН3 и необязательно CН4 константной области антитела.
Четвертый аспект настоящего изобретения также предоставляет полипептидный комплекс, содержащий множество полипептидных димеров тяжелой цепи и цепь J, причем:
множество димеров полипептидной тяжелой цепи собраны при помощи цепи J;
каждая полипептидная тяжелая цепь содержит связывающий домен и идентичные домены CH2, CH3 и необязательно CH4 цепей µ, ε, α или γ; и
в полипептидном комплексе существует по меньшей мере два связывающих домена, имеющих различные специфичности (смотрите фиг.4 и 5).
Как определено выше для первого аспекта настоящего изобретения, каждая константная область тяжелой цепи предпочтительно содержит по меньшей мере один ген константной области тяжелой цепи, который экспрессируется без функционального домена CН1 так, что может происходить получение антитела, имеющего только тяжелые цепи. Каждая константная область тяжелой цепи также может содержать один или несколько дополнительных генов константной области тяжелой цепи, которые выбирают из группы, состоящей из Cδ, Cγ1-4; Cµ, Cε и Cα1-2 при условии, что дополнительные гены константных областей тяжелой цепи также не экспрессируют функциональный домен CH1. Гены константной области тяжелой цепи выбирают в зависимости от требуемого предпочтительного класса или смеси классов антител.
Предпочтительно, существует только два связывающих домена различных спцифичностей в экспрессированных IgA и IgM.
В одном из вариантов осуществления каждая из тяжелых цепей включает домен CH4, причем константные домены представляют собой домены α, а полипептидный комплекс включает цепь J.
В другом варианте осуществления каждая из тяжелых цепей включает домен CH4, причем константные домены представляют собой домены µ, а антитело включает цепь J.
Сборка полипептидного комплекса
Модульная доменная конструкция полипептидных комплексов настоящего изобретения дает возможность конструировать их с большим количеством возможных перестановок. Такие изменения в доменной архитектуре и аминокислотной последовательности полипептидного комплекса могут достигаться подходящей мутацией или неполным синтезом и заменой подходящих областей, соответствующих кодирующих последовательностей ДНК. Замена или дополнительные домены могут быть получены из совместимых рекомбинантных последовательностей ДНК. Например, тяжелые цепи могут включать природный шарнирный или разработанный гибкий полипептидный домен, оба из которых находятся между связывающим доменом и аминоконцом домена CH2 и между эффекторным доменом и C-терминальным концом тяжелой цепи (CH3 или CН4).
Тяжелые цепи в полипептидном комплексе настоящего изобретения экспрессируются в виде слитых белков. Эффекторные цепи в полипептидном комплексе указанного аспекта настоящего изобретения могут эксперссироваться в виде слитых белков или могут быть собраны при помощи химических средств или, в случае их клеточного происхождения, могут быть выделены из крови или ткани, или захвачены in vivo (например, альбумином).
В случае генетических слияний прикрепление различных доменов может достигаться при помощи рекомбинантной конструкции ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность слитого белка, с ДНК, кодирующей различные домены, находящиеся в той же рамке считывания.
Эффекторный участок, если присутствует в виде части слитого белка, может находиться либо на амино-, либо на карбоксиконце комплементарного домена сборки.
В качестве альтернативы домены эффекторной цепи могут быть собраны при помощи обычных способов химии пептидов, как известно в данной области техники, а не синтезированы в виде слитого белка.
Связь может быть сформирована при помощи пептидной связи или при помощи химической связи. Например, эффекторный участок может представлять собой пептид, связанный с комплементарным доменом сборки, или он может быть химически связан с комплементарным доменом сборки, например, при помощи химической связывающей структуры, такой как малеимидный линкер.
Эффекторный участок может быть расположен в любом месте тяжелой цепи. Например, эффекторный участок может быть расположен на C-терминальном конце тяжелой цепи или между связывающим доменом и либо доменом CH2, либо шарнирным доменом полипептидного комплекса. Предпочтительным является, чтобы домен сборки не находился между доменами CH2 и CH3, поскольку он может интерферировать с эффекторной функцией и доменами димеризации. Предпочтительно, чтобы эффекторный участок прикреплялся к аминоконцу или карбоксиконцу тяжелой цепи при помощи пептидного гибкого линкера или шарнироподобной области с тем, чтобы облегчить независимое связывание/функционирование эффекторных участков.
Полинуклеотидные последовательности, векторы и клетки-хозяева
Настоящее изобретение также предоставляет полинуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь любого одного из полипептидных комплексов настоящего изобретения, вектор, содержащий одну или несколько полинуклеотидных последовательностей, относящихся к вышеуказанной последовательности, и клетку-хозяина, трансформированную вектором, кодирующим тяжелую цепь полипептидного комплекса настоящего изобретения. Полинуклеотиды предпочтительно включают последовательности, которые позволяют секретирование экспрессированных тяжелых цепей в виде гомодимеров в среду, в которой растет клетка-хозяин. Клетка-хозяин может иметь любое происхождение, включая бактериальные и дрожжевые клетки, но предпочтительной является клетка-хозяин позвоночного животного, более предпочтительна клетка-хозяин млекопитающего.
Трансфекция одной и той же клетки-хозяина вторым вектором, кодирующим тяжелую цепь, содержащую связывающий домен со специфичностью к другой мишени, приводит к коэкспрессии двух конструкций и сборке смеси гомодимеров и гетеродимеров. Гомодимеры будут проявлять специфичность к родственному антигену, а гетеродимеры будут связывать оба антегена.
Настоящее изобретение также предоставляет клетку-хозяина, трансформированную вектором, кодирующим по меньшей мере одну эффекторную цепь полипептидного комплекса настоящего изобретения. Клетка-хозяин может иметь любое происхождение, включая бактериальную и дрожжевую клетки, но предпочтительной является клетка-хозяин позвоночного животного, более предпочтительна клетка-хозяин млекопитающего. В качестве альтернативы эффекторная цепь может быть синтезирована при помощи способов, известных в данной области техники.
Настоящее изобретение также предоставляет клетку-хозяина, трансформированную вектором, кодирующим по меньшей мере одну тяжелую цепь полипептидного комплекса настоящего изобретения. Клетка-хозяин может иметь любое происхождение, включая бактериальную и дрожжевую клетки, но предпочтительной является клетка-хозяин позвоночного животного, более предпочтительна клетка-хозяин млекопитающего. В качестве альтернативы тяжелая цепь может быть синтезирована при помощи способов, известных в данной области техники.
Настоящее изобретение также предоставляет клетку-хозяина, трансформированную вектором, кодирующим по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну эффекторную цепь полипептидного комплекса настоящего изобретения. Клетка-хозяин может иметь любое происхождение, включая бактериальную и дрожжевую клетки, но предпочтительной является клетка-хозяин позвоночного животного, более предпочтительна клетка-хозяин млекопитающего. В качестве альтернативы цепи могут быть синтезированы независимо и собраны при помощи способов, известных в данной области техники.
Помимо этого, настоящее изобретение предоставляет трансгенный организм, экспрессирующий по меньшей мере один гомо- или гетеродимерный полипептидный комплекс из тяжелых цепей настоящего изобретения. Трансгенный организм может представлять собой позвоночное животное или млекопитающее, не являющееся человеком, растение или насекомое.
Настоящее изобретение также предоставляет способ продуцирования класс-специфических антител, имеющих только тяжелые цепи, и их домены VH согласно первому аспекту настоящего изобретения путем иммунизации антигеном трансгенного организма настоящего изобретения. В предпочтительном варианте этого аспекта настоящего изобретения организм представляет собой мышь.
Продуцирование антител и полипептидных комплексов для применений в здравоохранении требует широкомасштабных систем производства, примеры которых более подробно обсуждались выше. Такие системы включают растения (например, маис), трансгенный крупный рогатый скот и овец, цыплят и личинок насекомых, подходящих для технологии массового разведения. Специалистам в данной области техники также знакомы другие системы продуцирования, включая инфицирование вирусом (например, бакуловирусом личинки насекомого и клеточные линии) в качестве альтернативы клеточным культурам и зародышевым линиям.
Эти способы и другие подходящие способы, известные в данной области техники, могут быть использованы для продуцирования связывающих полипептидных комплексов настоящего изобретения. Путем использования этих способов может быть достигнуто получение гомодимеров и/или гетеродимеров.
Применение антител, имеющих только тяжелые цепи, и полипептидных комплексов настоящего изобретения
Антитела, имеющие только тяжелые цепи и связывающие полипептидные комплексы настоящего изобретения, имеют множество применений.
Антитела, имеющие только тяжелые цепи, и полипептидные комплексы настоящего изобретения содержат би- и мультиспецифические полипептидные комплексы. Эти комплексы являются особенно полезными, например, в качестве терапевтических средств для лечения и предупреждения инфекционных заболеваний.
Антитела, имеющие только тяжелые цепи, и полипептидные связывающие комплексы настоящего изобретения полезны для цитохимического мечения, способов нацеливания, терапии и в качестве диагностических средств.
При терапии моноклональными антителами ускользание патогена, например, вследствие мутации, приводящей к потере одного связывающего участка, будет аннулировать терапевтический эффект антитела. Продуцирование гетеродимерных полинуклеотидных комплексов, узнающих различные антигены на одном и том же патогене, может решить эту задачу. Использование по меньшей мере двух связывающих доменов, имеющих различные специфичности, в полипептидных комплексах настоящего изобретения также может использоваться для усиления как взаимодействий клетка-клетка, так и взаимодействий клетка/патоген.
В таком варианте осуществления полипептидные комплексы настоящего изобретения могут использоваться, например, для образования мостиковых полипептидных комплексов между двумя клеточными типами, такими как патоген и макрофаг или раковая клетка и T-клетка. В качестве альтернативы полипептидный комплекс может узнавать два или несколько эпитопов на одном и том же патогене, при этом эффекторная функция обеспечивается только константной областью тяжелой цепи.
В качестве альтернативы биспецифические связывающие полипептидные комплексы могут использоваться для нацеливания на клетки и ткани in vivo, затем для захвата циркулирующих эффекторных молекул или агента визуализации. Например, биспецифические агенты, нацеленные на опухоли, могут использоваться для захвата комплексов, превращающих пролекарства, для последующего локализованного превращения пролекарства в агент визуализации. Би- и мультиспецифические связывающие комплексы в комбинации с эффекторными агентами также могут использоваться для связывания или разрушения одного или нескольких патогенов в зависимости от выбора связывающих доменов. В качестве альтернативы наличие двух или более связывающих доменов, которые узнают различные антигены на одном и том же патогене, обеспечивает клинические преимущества, уменьшает вероятность ускользания патогена и избыток лекарственных веществ как результат мутации патогена.
Настоящее изобретение предоставляет антитела, имеющие только тяжелые цепи, или их фрагменты согласно первому аспекту настоящего изобретения, полипептидные цепи и комплексы согласно второму аспекту настоящего изобретения; эффекторые цепи и полипептидные комплексы согласно третьему аспекту настоящего изобретения. Все они являются подходящими для фармацевтического использования в отношении человека, и таким образом настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую антитело, имеющее только тяжелые цепи, полипептидную цепь, эффекторную цепь или полипептидный комплекс настоящего изобретения. Настоящее изобретение также предоставляет применение антитела, имеющего только тяжелые цепи, полипептидную цепь, эффекторную цепь или полипептидный комплекс настоящего изобретения в изготовлении лекарственных средств для профилактики и/или лечения заболевания. Тяжелая и эффекторная цепи могут использоваться в лекарственной форме совместно или отдельно, в зависимости от способа введения или действия лекарственного средства.
Фармацевтические композиции и лекарственные средства обычно составляют в лекарственные формы до введения пациенту.
Например, антитела, имеющие только тяжелые цепи, или полипептидные комплексы могут быть смешаны со стабилизаторами, в частности, если они должны быть лиофилизированы. Обычно во время лиофилизации стабильность обеспечивает добавление сахаров (например, маннита, сахарозы или трегалозы), а предпочтительным стабилизатором является маннит. В качестве стабилизатора также может быть добавлен сывороточный альбумин человека (предпочтительно рекомбинантный). Также могут использоваться смеси сахаров, например сахарозы и маннита, трегалозы и маннита и т.д.
В композицию может быть добавлен буфер, например трис-буфер, гистидиновый буфер, глициновый буфер или предпочтительно фосфатный буфер (например, содержащий дигидрофосфат натрия и гидрофосфат натрия). Является предпочтительным добавление буфера для получения pH между 7,2 и 7,8, и более конкретно - pH, равного примерно 7,5.
Для восстановления после лиофилизации может быть использована стерильная вода для инъекций. Также лиофилизированную лепешку можно восстановить водной композицией, содержащей сывороточный альбумин человека (предпочтительно рекомбинантный).
Обычно антитела, имеющие только тяжелые цепи, и полипептидные комплексы используются в чистом виде совместно с фармакологически приемлемыми носителями.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ лечения пациента, содержащий введение пациенту фармацевтической композиции настоящего изобретения. Пациент предпочтительно представляет собой человека и может быть ребенком (например, ребенком ясельного возраста или младенцем), подростком или взрослым, но обычно является взрослым.
Настоящее изобретение также предоставляет антитела, имеющие только тяжелые цепи, полипептидные цепи, эффекторные цепи или полипептидный комплекс настоящего изобретения для использования в качестве лекарственного средства.
Настоящее изобретение также предоставляет применение антител, имеющих только тяжелые цепи, полипептидных цепей, эффекторных цепей или комплексов полипептидных цепей настоящего изобретения в производстве лекарственных средств для лечения пациента.
Эти применения, способы и лекарственные средства являются предпочтительными для лечения одного из следующих заболеваний или нарушений: заживление ран, клеточные пролиферативные заболевания, включая неоплазму, меланому, опухоль легкого, колоректальную опухоль, остеосаркому, ректальный рак, опухоль яичников, саркому, цервикальный рак, опухоль пищевода, опухоль молочной железы, опухоль поджелудочной железы, опухоль мочевого пузыря, опухоли головы и шеи и другие твердые опухоли; миелопролиферативные заболевания, такие как лейкемию, неходжкинскую лимфому, лейкопению, тромбоцитопению, нарушение ангиогенеза, саркому Капоши; аутоимунные/воспалительные нарушения, включая аллергию, воспалительные заболевания кишечника, артрит, псориаз и воспаление дыхательного тракта, астму, иммунные нарушения и отторжение трансплантированных органов; сердечно-сосудистые и сосудистые нарушения, включая гипертензию, отеки, ангину, атеросклероз, тромбоз, сепсис, шок, нарушение реперфузии и ишемию; нейроглиальные нарушения, включая заболевания центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, нарушения работы головного мозга, амиотрофный латеральный склероз и боль; нарушения в развитии; метаболические нарушения, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение, СПИД и почечную недостаточность; инфекции, включая вирусные инфекции, бактериальные инфекции, грибные инфекции и паразитические инфекции; патологические состояния, связанные с плацентой и другими патологическими условиями и для использования в иммунотерапии.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предоставляет использование антитела, имеющего только тяжелые цепи, или связывающего полипептидный комплекс настоящего изобретения в качестве диагностического, прогностического или терапевтического агента визуализации. Более того, настоящее изобретение предоставляет использование гомо- или гетеродимера тяжелых цепей настоящего изобретения отдельно или в комбинации с одной или несколькими эффекторными (легкими) цепями настоящего изобретения в качестве терапевтического агента визуализации, цитохимического реагента или диагностического агента.
Настоящее изобретение предоставляет использование антитела, имеющего только тяжелые цепи, или его фрагмента, как описано выше, в качестве межклеточного связывающего реагента или абзима. Предпочтительные фрагменты антител, имеющих только тяжелые цепи, представляют собой растворимые антигенспецифичиские связывающие домены VH.
Настоящее изобретение также предоставляет использование антитела, имеющего одну антигенспецифическую цепь, или связывающего домена VH согласно настоящему изобретению в качестве ингибитора фермента или рецепторного блокатора. Предпочтительные фрагменты антител, имеющих только тяжелые цепи, являются растворимыми антигенспецифическими связывающими доменами VH.
Настоящее изобретение также предоставляет использование домена VH, слитого с эффекторной молекулой, для использования в качестве терапевтического средства, агента визуализации, диагностического средства, абзима или реагента.
Краткое описание чертежей
Фиг.1A и 1B: показан полипептидный комплекс, содержащий домен димеризации (необязательно CH2, CH3 и CH4) связывающего домена (VH), и эффекторный участок (EM). Связывающие домены и эффекторные участки могут быть расположены на амино- или карбокситерминальных концах доменов димеризации.
Указаны гибкие линкеры (<-) и шарнирные () области.
Фиг.2A и 2B: показаны различные конфигурации связывающих доменов и замена эффекторного участка дополнительными связывающими доменами. A. Предпочтительная опция, поскольку продуцируются гомодимеры. Не требуется разделение продуктов. B. Продуцируется смесь гомодимеров и гетеродимеров. Требуется разделение продуктов.
Фиг.3: показан полипептидный комплекс тяжелых цепей, связанный с эффекторной цепью. Эффекторная цепь содержит комплементарный связывающий домен (CBD) и эффекторный участок (EM). CBD узнается EM тяжелой цепи. CBD является слитым с эффектором или представляет собой часть эффектора, например фермент, токсин, хелатор, агент визуализации. Эффекторная цепь может синтезироваться отдельно от тяжелой цепи.
На фиг.4 показан бивалентный секреторный IgA, связанный с цепью J.
На фиг.5 показан мультивалентный IgM-подобный полипептидный комплекс, имеющий только тяжелые цепи, собранный при помощи цепи J.
Фиг.6: показана стратегия создания трансгенных мышей, экспрессирующих локус IgG, и функциональная генерация антител, имеющих только тяжелые цепи, и доменов VH в результате антигенной стимуляции.
Фиг.7: показана стратегия создания трансгенных мышей, экспрессирующих локус IgM, и функциональная генерация антител, имеющих только тяжелые цепи, и доменов VH в результате антигенной стимуляции.
Фиг.8: показана стратегия создания трансгенных мышей, экспрессирующих локус IgA, и функциональная генерация антител, имеющих только тяжелые цепи, и доменов VH в результате антигенной стимуляции.
Фиг.9: последовательное выравнивание продуктов ПЦР, полученных из кДНК костного мозга при помощи праймеров VHH1 и VHH2 в комбинации с праймером человека Cγ2 от мышей, содержащих локус с константными областями, которые имеют мутацию сплайсинга верблюда для удаления CH1. Результаты показывают, что CH1 не удален.
Фиг.10-13: структура конструкции VH/конструкции VH (VHH) верблюда. 1-n поддерживает любое количество генов VH или сегментов D или J. Нормальный комплемент локуса человека имеет 51 ген V, 25 функциональных сегментов D (плюс 2 нефункциональных сегмента) и 6 сегментов J. В случае области Cµ (для IgM) или Cε (для IgE) отсутствует область H, и имеется дополнительный экзон CH4 между CH3 и M1. Ген (гены) VH мутировал для обеспечения растворимости, как описано в публично доступных источниках.
Гены VH, сегменты D и J и экзоны C предпочтительно являются от человека, но могут быть от любого другого вида, включая верблюда. В последнем случае гены VH (VHH) верблюда могут быть немутированными, поскольку они являются естественно растворимыми.
Фиг.14: график иммунизации мышей и анализ антител для получения IgG против HSP70 E. coli, имеющих только тяжелые цепи.
Фиг.15: поточно-цитометрический анализ и результаты иммунохимии для клеток селезенки, полученных от трансгенных мышей.
Фиг.16: результаты анализа ELISA трансгенных мышей, иммунизированных DKTP, и анализ последовательности, полученной библиотеки антител.
Фиг.17: примеры соматических мутаций и VDJ-перестройки, наблюдаемые у иммунизированных трансгенных мышей.
Фиг.18: результаты анализа иммуноокрашивания клеточной линии Tet-on, трансфецированной повышающей чувствительность плазмидой, содержащей антитело A5.
Фиг.19: результаты вестерн-блот анализа сывороток линий трансгенных мышей.
Фиг.20: фракционирование по размеру IgM человека, смешанного с IgM человека с одной цепью, продуцированного мышами, содержащими локус IgM плюс IgG.
Фиг.21: результаты анализа ELISA антител IgM и IgG с одной цепью, вырабатываемых против TNFα человека.
Фиг.22: показана стратегия создания гомодимерной плазмиды с аффинностью связывания для HSP70 и αGAG.
Фиг.23: функциональная экспрессия гомодимерного полипептидного комплекса в клетках CHO.
Фиг.24: показано функциональное связывание и одновременно гомодимерный полипептидный комплекс с альфа αGAG и HSP70. Схематичное представление бивалентного, биспецифического антитела. Вторая вариабельная область (VHH2 направленная против gag) клонирована в карбокситерминальном конце антитела, имеющего только тяжелые цепи, имеющего другую специфичность (VHH1, направленная против HSP70). Шарнирная область между CH3 и VHH2 замещена областью линкера, в которой все цистеины замещены пролином (стрелки). Планшет ELISA, покрытый Gag, блокировали 1% молоком/1% BSA в PBS, сначала инкубировали в среде с рекомбинантными биспецифическими антителами (разбавление 1:2) и затем в клеточном лизате BI21 (содержащем HSP70) (разбавление 1:2). Элюировали связанные белки буфером для образцов =2-меркаптоэтанол и разгоняли в 8% геле. Окрашивали поли/моноклональными антителами против Gag, рекомбинантного биспецифического антитела и HSP70. αGag: кроличьи поликлональные/свиные антикроличьи-AP (голубые). αHSP70: моноклональные/козьи античеловеческие IgG-HRP (коричневые), рекомбинантные биспецифические α антитела: козьи античеловеческие IgG-HRP (коричневые). Линия 1: Gag/рекомбинантное биспецифическое антитело/BI21 клеточный лизат. Линия 2: Gag/культуральная среда (представляет собой отрицательный контроль на рекомбинантное биспецифическое антитело)/BI21. Линия 3: -молоко-BSA/рекомбинантное биспецифическое антитело/BI21. Линия 4: -молоко-BSA/культуральная среда/BI21. Линия 5: Gag/рекомбинантное биспецифическое антитело/-молоко-BSA. Линия 6: Gag/культуральная среда/-молоко-BSA.
Фиг.25: показана стратегия создания гомодимерных полипептидных комплексов, необязательно связанных с эффекторными цепями, несущими IgA эффекторную функцию.
Фиг.26: показана стратегия создания гомодимерных полипептидных комплексов, необязательно связанных с эффекторными цепями, несущими IgA эффекторную функцию.
Основные технологии
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же самое значение, как они обычно понимаются специалистами в данной области техники (например, в области культур клеток, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, технологиях гибридизации и биохимии). В молекулярных, генетических, биохимических способах (смотрите обзор, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed., John Wiley & Sons, Inc.) и химических способах используются стандартные технологии. Дополнительно смотрите ссылки Harlow & Lane, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y в случае стандартных иммунологических технологий.
Может быть использована любая подходящая технология рекомбинантной ДНК для продуцирования би- и мультивалентных полипептидных комплексов, антител, имеющих одну тяжелую цепь, и их фрагментов согласно настоящему изобретению. Обычные векторы экспрессии, такие как плазмиды, сконструированы содержащими последовательности ДНК, кодирующие каждую из цепей полипептидного комплекса или антитела. Может быть использована любая подходящая разработанная технология для ферментативного или химического фрагментирования иммуноглобулинов и разделения полученных фрагментов.
Настоящее изобретение также предоставляет векторы, включающие конструкции для экспрессии антител, имеющих только тяжелые цепи, в трансгенных мышах, конструирование и экспрессию полипептидных комплексов настоящего изобретения.
Очевидно, что может быть сконструирован единичный вектор, который содержит последовательности ДНК, кодирующие более одной полипептидной цепи. Например, последовательности ДНК, кодирующие две различные тяжелые цепи, могут быть введены в разных позициях на одной и той же плазмиде.
В качестве альтернативы ДНК последовательность, кодирующая каждую полипептидную цепь, может быть отдельно вставлена в плазмиду, таким образом, продуцируя несколько сконструированных плазмид, каждая из которых кодирует конкретную полипептидную цепь. Предпочтительно, плазмиды, в которые вставлены последовательности, являются совместимыми.
Затем каждая плазмида используется для трансформации клетки-хозяина так, чтобы каждая клетка-хозяин содержала ДНК последовательность, кодирующую каждую из полипептидных цепей в полипептидном комплексе.
Подходящие векторы экспрессии, которые могут быть использованы для клонирования в бактериальных системах, включают плазмиды, такие как Col E1, pcR1, pBR322, pACYC 184 и RP4, ДНК фага, или любые производные от них.
Для использования при клонировании в дрожжевых системах подходящие векторы экспрессии включают плазмиды размером 2 микрона.
Любая плазмида, содержащая подходящую промоторную генную последовательность млекопитающего, может быть использована для клонирования в системах млекопитающих. Промоторные последовательности насекомых или бакуловируса могут быть использованы для генной экспрессии в клетках насекомых. Такие векторы включают плазмиды, полученные, например, из pBR322, бычьего вируса папилломы, ретровирусов, ДНК вирусов и вакцинных вирусов.
Подходящие клетки-хозяева, которые могут быть использованы для экспрессии полипептидного комплекса или антитела, включают бактерии, дрожжи и эукариотические клетки, такие как клеточные линии насекомых или млекопитающих, трансгенные растения, насекомые, млекопитающие и другие системы экспрессии позвоночных и непозвоночных животных.
Полипептидные комплексы и антитела, имеющие одну тяжелую цепь, настоящего изобретения
Необходимо отметить, что термины “полипептидный комплекс”, “антитело, имеющее одну тяжелую цепь” и “гетерологичный локус тяжелой цепи” настоящего изобретения также включают гомологичные полипептиды и нуклеиновые последовательности, полученные из любого источника, например соотвествующих клеточных гомологов, гомологов из других видов, и их варианты или производные.
Таким образом, настоящее изобретение охватывает варианты, гомологи или производные полипептидных комплексов и антител, как раскрыто в настоящем описании.
В контексте настоящего изобретения гомологичные последовательности включают аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9% идентичной, предпочтительно по меньшей мере на 98 или 99% идентичной на уровне аминокислот, в количестве более по меньшей мере 30, предпочтительно 50, 70, 90 или 100 аминокислот. Хотя гомологичность также может рассматриваться в терминах сходства (т.е. аминокислотных остатков, имеющих аналогичные химические свойства/функции), в контексте настоящего изобретения предпочтительно выражать гомологичность в терминах идентичности последовательностей.
Настоящее изобретение также включает сконструированные векторы экспрессии и трансформированные клетки-хозяева для использования при продуцировании полипептидных комплексов и антител настоящего изобретения.
После экспрессии отдельных цепей в одной и той же клетке-хозяине они могут быть восстановлены для обеспечения полного полипептидного комплекса или антитела, имеющего только тяжелые цепи в активной форме.
Имеется в виду, что в предпочтительных вариантах настоящего изобретения отдельные тяжелые цепи могут быть подвергнуты процессингу в клетке-хозяине для формирования полного полипептидного комплекса или антитела, которое преимущественно ею секретируется. Предпочтительно эффекторная цепь продуцируется отдельно либо клеткой-хозяином, либо синтетическими средствами.
Способы получения полипептидных комплексов рекомбинантных антител описаны в вышеприведенных ссылках, а также, например, в EP-A-0623679; EP-A-0368684 и EP-A-0436597.
Иммунизация трансгенного организма
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ продуцирования антител настоящего изобретения, содержащий введение антигена в трансгенный организм настоящего изобретения.
Антитела и полипептидные комплексы, продуцированные трансгенными животными настоящего изобретения, включают поликлональные и моноклональные антитела и их фрагменты. Если требуются поликлональные антитела, трансгенное животное (например, мышь, кролик, коза, лошадь и т.д.) может быть иммунизировано антигеном, и сыворотку иммунизированного животного собирают и обрабатывают известными процедурами. Если сыворотка, содержащая поликлональные антитела, содержит антитела к другим антигенам, представляющие интерес поликлональные антитела могут быть очищены при помощи иммунноаффинной хроматографии и подобными способами, которые известны специалистам в данной области техники. Способы продуцирования и обработки поликлональной антисыворотки также известны в данной области техники.
Применения связывающих полипептидных комплексов и антител настоящего изобретения
Полипептидные комплексы и антитела, включая их фрагменты, согласно настоящему изобретению могут быть использованы в: in vivo терапевтических и профилактических применениях, in vitro и in vivo диагностических применениях, анализах in vitro и применениях реагентов и т.п.
Терапевтические и профилактические применения полипептидных комплексов и антител настоящего изобретения включают введение вышеуказанному млекопитающему реципиенту, такому как человек.
По существу чистые полипептидные комплексы и антитела, включая их фрагменты по меньшей мере при 90-95% гомогенности, являются предпочтительными для введения млекопитающему, и при 98-99% или более гомогенность является наиболее предпочтительной для фармацевтического использования, особенно если млекопитающим является человек. После очистки, неполной или до гомогенности, по желанию, полипептидные комплексы и антитела, имеющие только тяжелые цепи, как раскрыто в настоящем описании, могут быть использованы для диагностики или терапии (включая экстрокорпоральное использование) или при разработке или выполнении процедур анализа при помощи способов, известных специалистам в данной области техники.
Обычно полипептидные комплексы и антитела настоящего изобретения используются в очищенном виде совместно с фармакологически приемлемыми носителями. Обычно такие носители включают водные или спиртовые/водные растворители, эмульсии или суспензии, которые могут включать физиологический раствор и/или забуференную среду. Парентеральные наполнители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия и лактат Рингера.
Подходящие физиологически приемлемые адьюванты, если необходимо поддерживать полипептидный комплекс в суспензии, могут быть выбраны из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.
Для внутривенного введения наполнители включают жидкости и питательные добавки и добавки-электролиты, такие как на основе декстрозы Рингера. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как противомикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).
Полипептидные комплексы и антитела, включая их фрагменты, согласно настоящему изобретению могут использоваться в виде отдельно вводимых композиций или в сочетании с другими агентами. Они могут включать различные иммунотерапевтические лекарственные вещества, такие как циклоспорин, метотрексат, адриамицин, цисплатину или иммунотоксин. В качестве альтернативы полипептидные комплексы могут быть использованы в сочетании с ферментами для превращения пролекарств в их участках активности.
Фармацевтические композиции могут включать “коктейли” различных цитотоксических или других агентов в сочетании с выбранными антителами настоящего изобретения или даже комбинациями выбранных антител настоящего изобретения.
Способ введения фармацевтических композиций настоящего изобретения может быть любым из способов, известных специалистам в данной области техники. Для терапии, включая без ограничений иммунотерапию, полипептидные комплексы или антитела настоящего изобретения могут вводиться любому пациенту согласно стандартным технологиям. Введение может осуществляться любым подходящим способом, включая парентеральное, внутривенное, внтуримышечное, интраперитонеальное, трансдермальное, через легочные пути или также соответствующим образом путем прямой инфузии при помощи катетера. Дозирование и частота введения будет зависеть от возраста, пола и состояния пациента, также учитываются конкурентное введение других лекарственных веществ, противопоказания и другие параметры.
Полипептидные комплексы и антитела настоящего изобретения могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед использованием. Могут быть использованы известные способы лиофилизации и восстановления. Специалистам в данной области техники очевидно, что лиофилизация и восстановление могут приводить к некоторой потере функциональной активности и указанные применяемые уровни должны быть слегка увеличены с целью компенсации такой потери.
Кроме того, полипептидные комплексы и антитела настоящего изобретения могут быть использованы для диагностических целей. Например, антитела, как раскрыто в настоящем описании, могут быть образованы или получены против антигенов, которые специфическим образом экспрессируются во время болезненных состояний или чьи уровни меняются во время данных болезненных состояний.
Для некоторых целей, например с целью диагностики или регистрации, могут быть добавлены метки. Подходящие метки включают, без ограничений, любые из следующего: радиоактивные метки, ЯМР спиновые метки и флуоресцентные метки. Средства детектирования меток хорошо известны специалистам в данной области техники.
Композиции, содержащие полипептидные комплексы и антитела настоящего изобретения или их коктейли, могут быть введены для профилактического и/или терапевтического лечения.
Композиции, содержащие один или несколько полипептидных комплексов или антител настоящего изобретения, могут быть использованы в профилактических или терапевтических наборах с целью изменения, инактивации, уничтожения или удаления выбранной мишеневой клеточной популяции у млекопитающих. Кроме того, выбранные наборы полипептидных комплексов и антител, раскрытых в настоящем изобретении, могут быть использованы экстракорпорально или in vitro селективно с целью уничтожения, очищения или каким-либо иным способом эффективного удаления мишеневой клеточной популяции из гетерогенной коллекции клеток.
Пример 1
В подготовительных экспериментах трансгенных мышей подготавливали для экспрессии локуса тяжелой цепи, в котором два экзона VHH ламы соединяли с сегментами человека вариабельными (D) и соединяющими (J) тяжелой цепи и, затем генами человека Cµ, Cδ, Cγ2, Cγ3 константных областей и 3'-LCR человека тяжелой цепи иммуноглобулина. Гены человека Cγ2 и Cγ3 содержали G-A мутацию сплайсинга. Наличие участка Frt давало возможность создания трансгенной мыши c единичной копией трансгена из мультикопийного трансгенного массива при помощи рекомбинации, опосредованной Flp. Однако последовательности из трансгенного локуса с G-A мутацией сплайсинга показывали неправильный сплайсинг, но имели полностью удаленный CH1 (фиг.9).
Конструкции
Для решения этой проблемы скринировали космидную геномную библиотеку для клонов, содержащих гены VH, используя стандартные способы. Один (или несколько) различных VH зародышевой линии выбирали случайным образом, исходя из их последовательности (классы пяти семейств в случае VH человека). Гидрофильные аминокислотные кодоны вводили в позиции 42, 49, 50 и 52 согласно нумерации IMGT (Lefranc et al., (1999)). Гены VH объединяли в вектор BAC при помощи стандартных процедур, таких как прямое клонирование, при помощи изготовленных на заказ линкеров или гомологичной рекомбинации.
Отбирали два клона геномной Pac библиотеки RPCI-11 человека (BACPAC Recource Center, USA): клон 1065 N8, содержащий сегменты D и J тяжелой цепи, Cµ (IgM) и Cδ (IgD), и клон 1115 N15, содержащий гены Cγ3 (IgG3). Bac клон 11771 из другой геномной библиотеки человека (Incyte Genomics, CA, USA) использовали в качестве источника гена Cγ2 (IgG2) и LCR тяжелой цепи иммуноглобулина (Mills et al., (1997) J. Exp Med., 15;186(6):845-58).
Используя стандартные технологии, гены Cγ3 и Cγ2 отдельно субклонировали в вектор pFastBac (Invitrogen). Аналогично любую из других константных областей Ig можно было клонировать из этих BAC (IgA, IgE). Полная делеция экзона CH1 была достигнута путем гомологичной рекомбинации (Imam et al., (2001)) при помощи последовательностей, которые располагались с обоих концов экзона CH1 каждой константной области. Необязательно можно было вводить участок frt перед областью Cµ переключения для обеспечения возможности генерации однокопийных локусов из многокопийных локусов обработкой flp рекомбиназой in vivo стандартными способами, например путем выведения мышей rosa-flp (фиг.10).
Отдельные гены VH, сегменты D и J и экзоны C и LCR клонировали в один BAC либо при помощи обычного рестрикционного расщепления и лигирований, либо при помощи гомологичной рекомбинации (или комбинацией обоих), либо при помощи любой другой технологии клонирования.
Затем могли быть созданы дополнительные конструкции.
Локус, содержащий только IgM
Для получения конструкции IgM (фиг.11) один или несколько генов VH (предпочтительно разработанных генов VH человека для обеспечения растворимости или генов VHH верблюда), за которыми следовали сегменты человека D и J тяжелой цепи и Cµ, клонировали в BAC. Методологию смотрите выше. В этом случае в конечный BAC клонировали только область Cµ.
Локус IgM плюс IgG (Cδ является необязательным)
Для получения конструкции IgM плюс IgG (фиг.12) один или несколько генов VH (предпочтительно разработанных сегментов VH человека для обеспечения растворимости или генов VHH верблюда), за которыми следовали сегменты человека D и J тяжелой цепи, Cµ (без экзона CH1, но с экзоном CH4), (необязательно Cδ) и модифицированные гены человека Cγ2 и Cγ3 и 3'-LCR, клонировали в BAC. Для генерации локуса, содержащего только IgG, участки loxP вводили во время стандартных этапов клонирования (описано выше) и BAC размножали в линии E. coli 294 Cre (Buscholz et al.), и посредтвом cre-опосредованной рекомбинации получали бактерии, продуцирующие локус, содержащий только IgG. Подробности относительно дополнительных конструкций смотрите выше.
Локус IgM плюс IgG (Cδ является необязательным)
Для получения конструкции IgM плюс IgG (фиг.13) один или несколько генов VH (предпочтительно разработанных генов VH человека для обеспечения растворимости или генов VHH верблюда), за которыми следовали сегменты человека D и J тяжелой цепи, Cµ (с CH1 и CH4), (необязательно Cδ) и модифицированные гены человека Cγ2 и Cγ3 и 3'-LCR, клонировали в BAC. Для генерации локуса, содержащего только IgG, участки loxP вводили во время стандартных этапов клонирования (описано выше) и BAC размножали в линии E. coli 294 Cre (Buscholz et al.), и посредством cre-опосредованной рекомбинации получали бактерии, продуцирующие локус, содержащий только IgG.
Трансгенные мыши, выведение и генотипирование
Конечный BAC вводили трансгенным мышам при помощи стандартной инъекции в оплодотворенные яйцеклетки или при помощи технологии трансфецирования эмбриональных стволовых клеток.
Трансгенные локусы проверяли на целостность и количество копий при помощи саузерн-блот анализа ДНК из хвостов мышей (Southern 1975), используя зонды для 5'- и 3'-концов локуса. Основателей разводили в виде линий на фоне µМТ-/-. Генотипирование проводили стандартным ПЦР анализом, используя праймеры для каждой из различных областей указанного локуса. Анализ последовательностей RT-ПЦР продуктов, полученных из BM кДНК трансгенных мышей, у которых был делетирован весь экзон CH1 из обоих Cγ2 и Cγ3 (один с генами Cµ и Cδ (линии HLL) и один без этих генов), показал, что трансгенные локусы были не только способны к VDJ рекомбинации, но и что IgG транскрипты похожи на IgG транскрипты, обнаруженные в HCAb ламы и верблюда.
Иммуногистохимия
Помещали селезенки в среду OCT. Замороженные 5-мкм криостатные срезы фиксировали в ацетоне и вводили одинарную или двойную метку, как описано ранее (Leenen et al., 1998). Анти-B220/RA3-6B2, анти-CD11c/N418 моноклональные антитела (Steinman et al., 1997) использовали в виде супернатантов культур гибридомных клеток. Использовали пероксидазу, связанную с козьими античеловеческими IgG и античеловеческими IgM производства Sigma. Реагенты второго этапа представляли собой меченные пероксидазой козьи антикрысиные Ig (DAKO5 Glostrup, Denmark) или антихомячьи Ig (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) и щелочную фосфатазу с козьими антикрысиными Ig (Southern Biotechnology, Birmingam, AL, USA).
На фиг.15 показан иммуногистохимический анализ 5-мкм замороженных срезов селезенки из µMT-/-, WT и HLL и HLL-MD трансгенных мышей на фоне µMT-/-. Срезы окрашивали анти-B220 (голубой) для B-клеток и анти-CD11c/N418 (коричневый) для дендритных клеток. Стрелки указывают на положение небольших кластеров B-клеток.
Поточный цитометрический анализ
Суспензии из единичных клеток получали из лимфоидных органов в PBS, как описано ранее (Slieker et al., 1993). Приблизительно 1×106 клеток инкубировали с антителами в PBS/0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 96-луночных планшетах в течение 30 минут при 4°C. Клетки дважды промывали PBS/0,5% BSA. Для каждого образца отсчитывали 3×104 событий, используя анализатор FACScan (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Данные FACS анализировали, используя программное обеспечение CellQuest, версия 1.0. Четырехцветный анализ выполняли на Becton Dickinson FACS Calibur. Следующие mAb получали из BD Pharmingen (San Diego, CA): FITC-конъюгированные анти-B220-RA3-6B2, PE-конъюгированные анти-CD19. Данные FACS сканирования клеток селезенки, окрашенные анти-CD19 и анти-B220, показаны в нижней части фиг.15.
В левой части фигуры представлена Flp-рекомбинация in vivo, полученная в результате выведения HLL линий в трансгенную линию FlpeR, и подтверждающие данные FACS сканирования рекомбинантов клеток селезенки, показывающие выживание B-клеток, наблюдаемое в непосредственно созданных исходных линиях HLL-MD. В правой части представлена Cre-рекомбинация in vivo, полученная в результате выведения в трансгенную линию Cag Cre, и данные FACS однокопийного рекомбинанта клеток селезенки.
Иммунизация и продуцирование гибридом (фиг.14)
Создавали трансгенных мышей, содержащих локус антитела, имеющего только тяжелые цепи, состоящий из двух доменов VHH ламы, областей человека D и J и константных областей IgG2 и 3 (без CH1 домена).
Восьминедельных мышей иммунизировали любым белком теплового шока 70 (hsp70) E. сoli. 20 мкг или 5 мкг антигена с адьювантом Specol (IDDLO, Lelystadt, NL), инъецировали соответственно s.c. на 0, 14, 28, 42 дни и i.p. на 50 день. Кровь брали на 0, 14 и 45 дни. После трех бустер-инъекций низкий титр антигенспецифических антител детектировали у 1 из 3 мышей HLL-MD1, иммунизированных Hsp70 (фиг.14).
Проводили стандартную фузию клеток селезенки с клеточной линией миеломы, получая моноклональную гибридомную клеточную линию, генерирующую моноклональные антитела против hsp70 белка. Анти-HSP 70 HCAb состоял из сегмента VHH ламы, расположенного в непосредственной близости от области D (VHH 2), рекомбинированного с сегментом IgHD3-10 человека (acc.num. X13972) и сегментом IgHJ4-02 человека (acc.num.X86355). Хотя и не с высокой частотой, VHH имел несколько мутаций, которые приводили к аминокислотным заменам, как показано на фиг.9A, по сравнению с конфигурацией зародышевой линии. Анализ RT-ПЦР также показал только один продуктивный транскрипт IgH в гибридоме, подтверждая, что другие транскрипты не образовывались. IgG2 антитело αHSP70 секретировалось в виде димера, имеющего только тяжелые цепи (вестерн-блот в денатурирующем геле (димер) и неденатурирующем геле (мономер), фиг.14). Клетки селезенки сливали с клетками миеломы Sp2-O-Ag14 (предоставленные R. Haperen) на 56 день, используя набор ClonalCellTM-HY (StemCell Technologies, UK) согласно инструкции производителя.
Трансгенных мышей, содержащих локус антитела, имеющего только тяжелые цепи, состоящий из двух доменов VHH ламы, областей человека D и J, константных областей человека IgM и IgG2 и 3 (все без CH1 домена, фиг.12), иммунизировали TNFα для получения антител HC-IgM. У одной из трех мышей выявили сыворотки, положительные в стандартном анализе ELISA. Стандартное слияние миеломы дало положительную IgM гибридому (фиг.16). После гель-фильтрации на сефарозе 6B в невосстанавливающих условиях каждую фракцию, присутствующую в колонке, загружали в гель в восстанавливающих условиях и детектировали α IgM-HRP человека (фиг.20). Фракционирование в невосстанавливающих условиях показало, что HC-IgM секретируется в виде мультимерного антитела такого же размера, как и контрольный IgM человека (после вычитания молекулярного веса легких цепей и домена CH1, который отсутствовал в HC-IgM). Гель-фракционирование каждой фракции в колонке в восстанавливающих условиях выявило ожидаемый мономер (фиг.20).
ELISA Ig в сыворотке
Кровь от 15-25-недельных мышей собирали в пробирки, покрытые ЭДТА, центрифугировали в течение 15 минут при комнатной температуре, и супернатант разбавляли 1:5 в PBS. 96-луночный планшет покрывали на 2 часа 5 мг/мл козьими античеловеческими IgG (YES Biotechnology) или козьими античеловеческими IgM (Sigma), промывали PBS, блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре блокирующим раствором (1,5% BSA/1,5% порошковое молоко/0,1% Tween-20/PBS) и промывали три раза PBS. Загружали серии разбавлений образцов сыворотки и стандартов (IgG2 человека или IgM человека (Sigma, Zwijndrecht, NL)) и инкубировали в течение 2-4 часов, и планшеты промывали 6 раз PBS перед добавлением вторичного антитела (1:2000 разбавленного козьего античеловеческого IgG или козьего античеловеческого IgM, связанного с HRP (Sigma, Zwijndrecht, NL)). Все разведения были сделаны в блокирующем растворе. После 1-2 часов инкубации при комнатной температуре и промывки в PBS добавляли субстрат POD (Roche).
ELISA для детектирования антигенспецифических растворимых sdAb из IgG2 фаговой библиотеки показаны на фиг.16. Растворимые sdAb использовали в качестве первичных антител на планшетах, покрытых антигеном, за которыми следовали мышиные антитела αmyc и HRP-конъюгированные козьи антимышиные антитела. POD использовали в качестве субстрата. В нижней части фигуры показаны пептидные карты клонов с рестрикционным ферментом Hinf I, показывающие 5 различных вставок, кодирующих sdAb против B. Pertusis.
Конструирование и скрининг библиотеки антител
Тотальную РНК выделяли из селезенок иммунизированных DKTP мышей, имеющих однокопийный IgG (фиг.12 после обработки сre), используя систему выделения РНК Ultraspec (Biotecx Laboratories Inc, Houston, Texas, USA). Получали кДНК, используя олиго-dT. Фрагменты ДНК, кодирующие фрагменты VHHDJ, амплифицировали ПЦР, используя специфические праймеры: обратный Sfi I праймер vh1 (Dekker et al., 2003) в комбинации с праймером hIgG2hingrev (5'-AATCTGGGCAGCGGCCGCCTCGACACAACATTTGCGCTC-3'). Амплифицированные VHH DJ (~400 п.о.) расщепляли Sfi I/Not I, очищали с помощью геля и клонировали в вектор фагемиды pHEN-1, расщепленный Sfi I/Not I.
Трансформация в электрокомпетентные клетки TG1 давала библиотеку антител человека с одним доменом. Выполняли два этапа селекции, используя пэннинг на антигены вакцины, адсорбированные на пластике (иммунопробирках, покрытых неразбавленной вакциной). Рестрикционный анализ и секвенирование проводили стандартными способами.
RT-ПЦР локуса только тяжелой цепи
Затем исследовали, функционирует ли локус HLL-MD как нормальный локус при продуцировании набора разнообразных антител, путем секвенирования RT-ПЦР продуктов, полученных при помощи IgG2- и IgG3-специфических праймеров для кДНК из пейеровых бляшек. На фиг.17 показано несколько примеров соматических мутаций клонов неиммунизированных мышей (левая часть фигуры) и иммунизированных мышей (правая часть фигуры). Мыши имели локусы, содержащие только IgG, и были иммунизированы hsp70 E. coli, лизатом Pertussis, столбнячным токсином. Серым тоном отмечена шарнирная область IgG2, начиная с ERKCCV.
Хотя анализ RT-ПЦР на пейеровых бляшках показал, что используются оба VH, все секвенированные антитела имели перестроенный VH2. Источник изменчивости набора заключается в CDR3 области, формируемой при помощи селекции сегментов D и J и при помощи соединений V-D и D-J. Использование сегментов человека J аналогично таковому, наблюдаемому в перестройках у человека, причем сегменты JH4 и JH6 используются наиболее часто.
Этот анализ показал, что оба VH, различные сегменты человека D и все сегменты человека J дают вклад в создание разнообразного набора антител. Это также показывает наличие IgG3-переключаемых B-клеток и наличие соматических мутаций при сравнении каждого перестроенного гена с его аналогом в зародышевой линии, т.e. оригинальным VH в трансгенной конструкции (смотрите фиг.17). Следовательно, антигенный рецептор IgG человека, имеющего только тяжелые цепи, может предоставлять необходимые сигналы для B-клеточного созревания.
Иммуноокрашивание
На фиг.18 показаны результаты иммуноокрашивания одной из клеточных линий Tet-on, дополнительно трансфецированной повышающей чувствительность плазмидой, содержащей A5 антитело (Dekker et al., 2003). В верхней части фигуры показано доксициклин-индуцированное продуцирование A5 антитела (красный) в цитоплазме и окрашивание ядер клеток DAPI (синий). В нижней части фигуры показано, что клетки, экспрессирующие rtTA в ядрах, представляют собой клетки, при индукции продуцирующие A5 (верхняя часть фигуры). Окрашивание проводили одним из HCAb человека против rtTA (зеленый), имеющего приведенную ниже последовательность. FITC-конъюгированный козий античеловеческий IgG использовали на втором этапе. A5 детектировали, как описано ранее у Dekker et al., 2003. rTTA антитело представляло собой IgG3, имеющего следующую последовательность:
Шарнир IgG3 начинается с аминокислоты 198 ELKTPL. Для сравнения смотрите шарнирную область IgG2 на фиг.17.
Вестерн-блот анализ
На фиг.19 показаны данные вестерн-блот анализа сывороток различных линий трансгенных мышей, содержащих локус IgM плюс IgG (фиг.10) после обработки cre (то есть IgM делетирован, оставлен только IgG). Сыворотки очищали при помощи белка G, фракционировали в геле в восстанавливающих условиях (фиг.19, справа) и в невосстанавливающих условиях (фиг.19, слева). Контроли представляли собой мышей с фоном KO и образец нормальной сыворотки человека. Следует отметить разницу размеров между двумя гелями, демонстрирующую, что IgG человека, имеющий только тяжелые цепи, представляет собой димер.
Сигнал, показанный на фиг.19, детектировали, используя античеловеческое IgG-антитело при помощи стандартных процедур.
Фракционирование по размеру IgM человека, продуцированного мышью, имеющей локус IgM плюс IgG
Сыворотку мыши, имеющей IgM плюс IgG (фиг.13), фракционировали гель-фильтрацией в невосстанавливающих условиях после смешивания с образцом сыворотки человека в качестве контроля. Результаты приведены на фиг.20. Молекулярные веса комплексов в колонке уменьшаются с каждой полосой (представляющей каждую фракцию) слева направо. Фракции (каждую линию) анализировали гель-электрофорезом в восстанавливающих условиях.
Анализ ELISA выполняли на нескольких гибридомах, созданных из иммунизированных человеческим TNFα мышей, содержащих локус IgM плюс IgG (фиг.13). Результаты показаны на фиг.21. Два верхних ряда на фиг.21 анализировали, используя античеловеческий IgG, следующие два ряда - используя античеловеческий IgM. Образцы сыворотки (стрелки) показали, что мышь генерировала как IgG, так и IgM антитела против TNFα. Одиночная стрелка показывает положительную IgM гибридому. Лунки покрывали коммерчески доступным TNFα человека. Все используемые процедуры были стандартными.
Пример 2
Биспецифическое бивалентное антитело генерировали путем комбинации двух моноспецифических антител, имеющих только тяжелые цепи. Первое антитело формировало каркас, привнося первую специфичность и эффекторные функции (вариабельный участок и константный участок, соответственно). Его объединяли со вторым антителом со второй специфичностью при помощи заново разработанного шарнира. Этот шарнир был аналогичен существующей шарнирной последовательности IgG2, но был изменен заменой цистеинов пролинами для предотвращения поперечного связывания цистеинов в димер антитела и для предоставления дополнительной гибкости благодаря пролинам, что исключало пространственное ограничение второго антитела, что в противном случае могло ингибировать его функционирование.
Начальное каркасное антитело представляло собой антитело, вырабатываемое против белка HSP70 E. coli. Антиген HSP70 инъецировали трансгенным мышам, которые содержали локус антитела, имеющего только тяжелые цепи, как описано выше (смотрите фиг.14). Моноклональное антитело создавали от этих животных при помощи стандартной технологии гибридомного слияния (смотрите выше). Затем клонировали кДНК, кодирующую αHSP-антитело, стандартными методами RT-ПЦР рекомбинантной ДНК, получая плазмиду, содержащую кДНК полной длины, которая включает 5'-конец - 3'-конец (в белке от N-конца до COOH-конца) старт-кодон ATG, сигнальную пептидную последовательность, вариабельный домен VHH1 (смотрите Janssens et al.), рекомбинированную область D и J и константную область Cγ2 (без области CH1), но включая стоп-кодон и поли-A-участок (фиг.22 слева вверху). кДНК, кодирующую αHSP70-антитело, амплифицировали ПЦР для клонирования, используя прямой праймер и обратный праймер.
Прямой праймер представлял собой: , обеспечивая участок EcoRI с целью клонирования (подчеркнутый) последовательности (жирный шрифт), достаточной для начала трансляции, и нормальный старт-кодон (обозначен серым).
Обратный праймер представлял собой: , обеспечивая участок клонирования (подчеркнутый) HindIII и сохраняя нормальный старт-кодон.
Следовательно, амплификация дает фрагмент EcoRI/HindIII, содержащий участок EcoRI (подчеркнутый), последовательность (жирный шрифт), достаточную для начала трансляции, и нормальный старт-кодон гена антитела αHSP (обозначен серым, смотрите фиг.22).
Обратный 3'-концевой праймер представлял собой: , обеспечивая участок клонирования HindIII (подчеркнутый) и удаляя нормальный стоп-кодон. Это дает фрагмент (фиг.22 сверху, второй слева) с участком EcoRI для клонирования в последовательность промотора и участком HindIII для клонирования 5'-конца в плазмиду для экспрессии и 3'-конца в новой шарнирной последовательности (смотрите ниже). Наконец, фрагмент разрезали EcoRI и HindIII для обеспечения подходящих однонитевых концов для клонирования.
Второе клонированное антитело, привносящее вторую специфичность, содержало домен VHH антитела ламы к gag антигену ретровируса (PERV) свиньи (Dekker et ah, (2003) J Virol, 11 (22): 12132-9, фиг.22 сверху справа). αgag амплифицировали при помощи стандартной ПЦР амплификации, используя следующие праймеры:
прямой: и обратный праймер: . Это дает амплифицированный фрагмент (фиг.22 справа, второй сверху) с участком XhoI (обозначен серым) для клонирования 5'-конца в рамке с новым шарниром (смотрите ниже) и участком EcoRI (подчеркнутый) для клонирования 3'-конца в плазмиду для экспрессии (фиг.22, справа в центре). Наконец, фрагмент разрезали EcoRI и XhoI для получения однонитевых концов для клонирования.
Две последовательности антител объединяли в одну последовательность рекомбинантного биспецифического антитела при помощи нового шарнира. Новый шарнир создавали из двух олигонуклеотидов, которые вместе формировали двухнитевой олигонуклеотид с 5'- и 3'-липкими концами (соответственно HindIII и XhoI-совместимые) с целью клонирования. Он был разработан так, чтобы находился в рамке, которая заканчивалась последовательностью αHSP70 и начиналась последовательностью αgag. Образование сульфидных мостиков, обычно присутствующее в шарнире IgG2 человека, предотвратили заменой цистеинов (обозначены серым) пролинами (подчеркнутые). Пролины добавляли экстрагибкость шарниру, позволяя должное функционирование домена вторичного антитела, который связывается с COOH-концом первого антитела при помощи шарнира.
Нормальная шарнирная последовательность IgG (цистеиновые кодоны, обозначены серым, пролиновые кодоны, подчеркнуты) и ее комплемент замещали и ее комплементом ). Это также предоставляло фрагмент (шарнир в белом прямоугольнике, фиг.22, в центре) с двумя однонитевыми концами, совместимыми с участками HindIII (жирный шрифт) и XhoI (наклонный шрифт) для клонирования.
Три фрагмента (αHSP70 IgG2, шарнир и αgag) последовательно лигировали в плазмиду экспрессии bluescript (Pbluescript11 sk+), которая содержала актиновый промотр цыпленка и последовательность CMV энхансера (фиг.22, плазмида экспрессии), при помощи стандартной технологии рекомбинантной ДНК. При экспрессии этой плазмиды (смотрите ниже) получается рекомбинантное биспецифическое антитело, показанное в нижней части фиг.22.
Плазмиду экспрессии рекомбинантного биспецифического антитела размножали и котрансфецировали плазмидой pGK-hygro (чтобы обеспечить селекцию трансферцированных клеток) стандартными способами (Superfect) в клетках CHO (фиг.23). Позитивные клоны отбирали в среде, содержащей гидромицин, и позитивно идентифицировали как экспрессирующие рекомбинантное биспецифическое антитело путем выполнения стандартного αgag ELISA (Dekker et al., J.Virol. 2003) среды роста, содержащей рекомбинантное биспецифическое антитело, секретируемое клетками CHO, используя детектирование α IgG-HRP человека. Позитивное тестирование α-gag активности указывает на наибольшую вероятность того, что данный клон экспрессирует полное рекомбинантное биспецифическое антитело, поскольку gag-специфичность находится на заднем конце (COOH-конец) рекомбинантного биспецифического антитела. Последующий ELISA для HSP70 также был позитивным. Вестерн-блот этих клонов, выбранных при помощи ELISA, в невосстанавливающих и в восстанавливающих условиях выполняли, чтобы показать, что белок, экспрессированный из плазмиды, представляет собой димер 110 кДа (как показано в нижней части фиг.23) по сравнению с мономером 55 кДа (в невосстанавливающих и в восстанавливающих условиях и вестерн-блот, фиг.23 справа). Таким образом, ELISA и вестерн-блот вместе показали, что рекомбинантное биспецифическое антитело экспрессируется и секретируется в среде в виде димера при помощи трансфецированных клеток CHO (при >70 нг/мл), и что антитело может связывать антигены HSP70 и gag. Однако не показано, что такая же димерная молекула рекомбинантного биспецифического антитела может связывать оба антигена в одно и то же время.
Соответственно, был осуществлен следующий эксперимент. Первый антиген gag фиксировали на дне пластиковых лунок (первая лунка фиг.24, в центре). Затем захватывали рекомбинантное биспецифическое антитело (фиг.24, сверху) первым антигеном (gag) после нанесения CHO клеточного супернтатанта из 1 клона (вторая лунка, фиг.24, в центре). Затем интенсивно промывали и наносили второй антиген (HSP 70, фиг.24, третья лунка в центре), после чего снова интенсивно промывали. Если молекула рекомбинантного биспецифического антитела могла связать оба антигена, она должна была быть захваченной на дне лунки путем связывания первым антигеном (gag) и затем захватом вторым антигеном (HSP70). Когда затем элюировали полный комплекс из лунки (фиг.24, в центре, правая лунка) на вестерн-блоте были видны как рекомбинантное биспецифическое антитело, так и антигены (фиг.24, внизу).
Чтобы собрать секретированное рекомбинантное биспецифическое антитело, клоны CHO выращивали в тех же самых стандартных условиях и в среде (среда SIGMA для гибридом, без сыворотки), используемой для сбора антител из гибридом.
Способы: Лунки планшета Nunc-иммуно (Maxisorp) покрывали очищенным рекомбинантным белком gag (12,5 мкг/мкл в PBS) O/N 4C. Блокировали в течение двух часов 1% молоко/1% BSA в PBS. Среду CHO-DB клона-1, наполовину разбавленную PBS-молоко-BSA (или контроли), инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре. Бактериальный клеточный лизат Bl21 (содержащий белок HSP70), наполовину рабавленный PBS-молоко-BSA, инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре и промывали. Связанные белки элюировали буфером Laemmli для образцов, содержащим 2-меркаптоэтанол. Образцы анализировали вестерн-блот анализом и после этого прогоняли в 10% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Блот блокировали в течение двух часов PBS-молоко-BSA и инкубировали с первичными антителами. Продукты визуализировали стандартными способами, используя вторичные антитела, соединенные с ферментами, которые позволяли визуальное окрашивание. Использовались следующие реагенты:
αGag: кроличье поликлональное (1:2000), 2 часа, комнатная температура
рекомбинантное биспецифическое α антитело: козьи античеловеческие IgG-HRP (1:2500), 2 часа, комнатная температура
αHSP70: моноклональное G20-380 среднее (1:2), 2 часа, комнатная температура.
Вторичные антитела: козьи антикроличьи-AP (1:2000), 2 часа, комнатная температура, и козьи античеловеческие IgG-HRP (1:2500), 2 часа, комнатная температура, против моноклонального HSP70.
Для визуализации белковых полос использовали первый субстрат NBT/BCIP (красный), реагирующий с щелочной фосфатазой (AP), и второй субстрат DAB (коричневый), реагирующий с пероксидазой хрена (HRP).
Все этапы промывания проводили PBS-0,05% Tween-20.
Контроль выполняли путем исключения одного из компонентов или добавления среды из клеток CHO, не продуцирующих рекомбинантные биспецифические антитела (фиг.24), то есть без нанесения рекомбинантных биспецифических антител (среда из нетрансфецированных клеток CO) и, следовательно, имели только gag (дорожка 2); не имели gag на дне лунки (заменен белком молока) и, следовательно, не должны были иметь продукты (дорожка 3); отсутствие gag и рекомбинантного биспецифического антитела и отсутствие продукта (дорожка 4); отсутствие антигена HSP70 (заменен белком молока) и, следовательно, должны были иметь только рекомбинантное биспецифическое антитело и gag (дорожка 5); отсутствие HSP70 и рекомбинантное биспецифическое антитело должно было иметь только gag (дорожка 6).
Тот факт, что все три компонента (рекомбинантное биспецифическое антитело плюс оба антигена) находились только в лунке дорожки 1, которая получила все три компонента (смотрите также маркированное дно фиг.24), показывает, что единичное рекомбинантное биспецифическое антитело одновременно связывает оба антигена.
Генерация биспецифических IgA или мультиспецифических IgM
Генерация биспецифического IgA по существу является такой, как описано для IgG (выше), но используя дополнительно Vhsol, D и J, константную область Cα, приводящую к генерации IgA (фиг.25).
Генерация IgM в значительной степени является аналогичной, но проявляет дополнительную возможность, поскольку молекулы IgM могут формировать большие мультимеры (с или без J цепей). Таким образом, дополнительно к молекулам, аналогичным молекулам, описанным выше (фиг.26, внизу справа, после элиминирования последовательностей мультимеризации), также можно генерировать мультимеры, просто коэкспрессируя IgM с различными специфичностями (фиг.26, слева внизу).
Пример 3
Вектор экспрессии, кодирующий полипептидный комплекс, содержащий тяжелую цепь, включая связывающий домен, который связывается с PSCA (антиген стволовых клеток предстательной железы), домен сборки, содержащий мотив лейциновой молнии Jun и шарнир антитела, домены CH2 и CH3; и легкую цепь, включающую комплементарный домен сборки, состоящий из мотива лейциновой молнии Fos, конструировали, используя технологии молекулярной биологии, как описано у Sambrook et al., ((1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Вектор экспрессии затем трансфецировали в подходящую клетку-хозяин при помощи технологии превращений для продуцирования трансфецированной клетки-хозяина для оптимизированной экспрессии вектора. Трансфецированную или трансформированную клетку-хозяина затем культивировали, используя любую подходящую технологию, известную специалистам в данной области техники, для продуцирования полипептидного комплекса настоящего изобретения.
После продуцирования полипептидные комплексы очищали стандартными процедурами в данной области техники, включая перекрестную фильтрацию, преципитацию сульфата аммония и аффинную колоночную хроматографию (например, белок A).
Растворимый эффекторный домен, состоящий из 3,3'-дииндолилметана (DIM), затем сливали с комплементарным доменом сборки, используя технологии, известные специалистам в данной области техники.
Пример 4
Вектор экспрессии, кодирующий тяжелую цепь полипептидного комплекса настоящего изобретения, содержащий растворимый связывающий домен VHH, который связывается с AFP (Alpha-Fetoprotein), и домен сборки, содержащий мотив лейциновой молнии Jun, и шарнир антитела, домены CH2 и CH3, сконструировали, используя технологии молекулярной биологии, как описано Sambrook et al.
Второй вектор экспрессии, кодирующий легкую цепь полипептидного комплекса настоящего изобретения, также сконструировали. Он содержал комплементарный домен сборки, состоящий из мотива лейциновой молнии Fos.
Векторы экспрессии затем трансфецировали в подходящую клетку-хозяин обычной технологией для продуцирования котрансфецированной клетки-хозяина для оптимизированной экспрессии вектора. Трансфецированную или трансформированную клетку-хозяин затем культивировали, используя любую подходящую технологию, известную специалистам в данной области техники для продуцирования полипептидного комплекса настоящего изобретения.
После продуцирования полипептидные комплексы очищали стандартными процедурами данной области техники, включая перекрестную фильтрацию, преципитацию сульфата аммония и аффинную колоночную хроматографию (например, белок A).
Растворимый эффекторный домен, состоящий из 3,3'-дииндолилметана (DIM), затем сливали с комплементарным доменом сборки, используя технологии, известные специалистам в данной области техники.
Пример 5. VCAM и VLA-4
Вектор экспрессии, кодирующий полипептидный комплекс, содержащий тяжелую цепь, включающую связывающий домен, который связывается с PSCA (антиген стволовых клеток простаты), домен сборки, содержащий VCAM и шарнир антитела, домены CH2 и CH3; и легкую цепь, включающую комплементарный домен сборки, состоящий из VLA-4, слитый с токсином A лицина, сконструировали, используя технологии молекулярной биологии, как описано Sambrook et al.
Затем вектор экспрессии трансфецировали в подходящую клетку-хозяин обычной технологией для продуцирования трансфецированной клетки-хозяина, для оптимизированной экспрессии вектора. Трансфецированную или трансформированную клетку-хозяин затем культивировали, используя любую подходящую технологию, известную специалистам в данной области техники, для продуцирования полипептидного комплекса настоящего изобретения.
После продуцирования полипептидные комплексы очищали стандартными процедурами данной области техники, включая перекрестную фильтрацию, преципитацию сульфатом аммония и аффинную колоночную хроматографию (например, белок A).
Пример 6
Вектор экспрессии, кодирующий полипептидный комплекс, содержащий тяжелую цепь, включающую связывающий домен, который связывается с PSCA (антиген стволовых клеток простаты), домен сборки, содержащий мотив лейциновой молнии Jun и шарнир антитела, домены CH2 и CH3; и легкую цепь, включающую комплементарный домен сборки, состоящий из мотива лейциновой молнии Fos и растворимый эффекторный домен, кодирующий пурин-нуклеозид-фосфорилазу (PNP), сконструировали, используя технологии молекулярной биологии, как описано Sambrook et al.
Вектор экспрессии затем трансфецировали в подходящую клетку-хозяин обычными технологиями для продуцирования трансфецированной клеткой-хозяином для оптимизированной экспрессии вектора. Трансфецированную или трансформированную клетку-хозяин затем культивировали, используя любую подходящую технологию, известную специалистам в данной области техники, для продуцирования полипептидного комплекса настоящего изобретения. После продуцирования полипептидные комплексы очищали стандартными процедурами настоящего изобретения, включая перекрестную фильтрацию, преципитацию сульфатом аммония и аффинную колоночную хроматографию (например, белок A).
PNP превращает флударабин в токсический метаболит 2-фтораденин, который убивает клетки, содержащие PNP фермент, и дополнительно диффундирует, убивая окружающие неинфицированные клетки, локальный эффект наблюдателя.
Пример 7
Вектор экспрессии, кодирующий первую тяжелую цепь полипептидного комплекса настоящего изобретения, содержащий растворимый связывающий домен VHH, который связывается с областью V3-PND гликопротеинового антигена gp120, и домен сборки, содержащий мотив лейциновой молнии Jun и шарнир антигена, домены CH2 и CH3, сконструировали, используя технологии молекулярной биологии, как описано Sambrook et al.
Второй вектор экспрессии, кодирующий вторую тяжелую цепь полипептидного комплекса настоящего изобретения, который также сконструировали, содержит растворимый связывающий домен VHH, который связывается с GP-41, домен сборки, состоящий из мотива лейциновой молнии Jun и шарнира антитела, доменов CH2 и CH3.
Третий вектор экспрессии, кодирующий легкую цепь полипептидного комплекса настоящего изобретения, также сконструировали. Он содержит комплементраный домен сборки, состоящий из мотива лейциновой молнии Fos. Затем векторы экспрессии трансфецировали в подходящую клетку-хозяин обычной технологией для продуцирования котрансфецированной клетки-хозяина для оптимизированной экспрессии вектора. Трансфецированную или трансформированную клетку-хозяин затем культивировали, используя любую подходящую технологию, известную специалистам в данной области техники, для продуцирования полипептидного комплекса настоящего изобретения.
После продуцирования полипептидный комплекс очищали стандартными процедурами данной области техники, включая перекрестную фильтрацию, преципитацию сульфатом аммония и аффинную колоночную хроматографию (например, белок A).
Растворимый эффекторный домен, содержащий HIV-1 MN V3 (PND), пептидный иммуноген затем сливали с комплементарным доменом сборки, используя технологии, известные специалистам в данной области техники.
Пример 8
Вектор экспрессии, кодирующий первую тяжелую цепь полипептидного комплекса настоящего изобретения, содержащий растворимый связывающий домен VHH, который связывается с областью V3-PND гликопротеинового антигена, сконструированного при помощи технологии молекулярной биологии, описанной Sambrook et al., ((1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Второй вектор экспрессии, кодирующий вторую тяжелую цепь полипептидного комплекса настоящего изобретения, который также сконструирован, содержит растворимый связывающий домен VHH, который связывается с GP-41.
Две тяжелые цепи отличались тем, что константные области двух тяжелых цепей содержали идентичные домены µ, CH2, CH3 и CH4.
Затем векторы экспрессии трансфецировали в клетку-хозяин, которая конститутивно экспрессировала цепь J, при помощи обычной технологии для продуцирования котрансфецированной клетки-хозяина для оптимизированной экспресии вектора. Трансфецированную или трансформированную клетку-хозяин затем культивировали, используя любую подходящую технологию, известную специалистам в данной области техники для продуцирования полипептидного комплекса настоящего изобретения.
После продуцирования полипептидный комплекс очищали стандартными процедурами данной области техники, включая перекрестную фильтрацию, преципитацию сульфатом аммония и аффинную колоночную хроматографию (например, белок A).
Растворимый эффекторный домен, состоящий из HIV-1 MN V3 (PND), пептидного иммуногена, затем сливали с комплементарным доменом сборки, используя технологии, известные специалистам в данной области техники.
Все упомянутые выше публикации включены в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки.
Различные модификации и изменения описанных способов и систем настоящего изобретения очевидны специалистам в данной области техники без отступления от объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение описано в связи с предпочтительными вариантами осуществления, необходимо отметить, что настоящее изобретение, как заявлено в формуле изобретения, не является ограниченным ненадлежащим конкретными вариантами осуществления. Напротив, различные модификации описанных вариантов осуществления настоящего изобретения, которые очевидны специалистам в биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии или родственных областях, следует срассматривать как входящие в объем нижеприведенной формулы изобретения.
Claims (11)
1. Способ получения антиген-связывающего домена VH, в котором отсутствует удлиненная CDR3 петля, подобная CDR3 петле верблюда, включающий:
трансформирование клетки млекопитающего, не являющегося человеком, гетерологичным локусом тяжелой цепи VH, причем:
локус тяжелой цепи VH содержит ген, кодирующий вариабельную область, содержащий по меньшей мере один сегмент гена VH, по меньшей мере один сегмент гена D, не являющегося верблюжьим, по меньшей мере один сегмент гена J, не являющегося верблюжьим, и по меньшей мере одну константную область тяжелой цепи;
ни один из генов, кодирующих константные области, не кодирует функциональный домен Сн1;
сегмент гена V, сегмент гена D и сегмент гена J способны к рекомбинации с образованием кодирующей последовательности VDJ;
при экспрессии локус способен образовывать антитело только с тяжелыми цепями, содержащими антиген-связывающий домен VH и константную эффекторную область, лишенную функционального домена Сн1;
культивирование клетки млекопитающего, не являющегося человеком, для последующего получения трансгенного млекопитающего;
иммунизацию указанного трансгенного млекопитающего, не являющегося человеком, представляющим интерес антигеном;
выделение клетки или ткани, экспрессирующей интересующие специфичные в отношении антигена антитела только с тяжелыми цепями,
где антитело имеет домен VH, в котором отсутствует удлиненная CDR3 петля, подобная CDR3 петле верблюда;
идентификацию и выделение из выделенных клеток или тканей нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VH, интересующего специфичного в отношении антигена антитела только с тяжелыми цепями; и
экспрессию указанного антиген-связывающего домена VH указанной выделенной нуклеиновой кислоты.
трансформирование клетки млекопитающего, не являющегося человеком, гетерологичным локусом тяжелой цепи VH, причем:
локус тяжелой цепи VH содержит ген, кодирующий вариабельную область, содержащий по меньшей мере один сегмент гена VH, по меньшей мере один сегмент гена D, не являющегося верблюжьим, по меньшей мере один сегмент гена J, не являющегося верблюжьим, и по меньшей мере одну константную область тяжелой цепи;
ни один из генов, кодирующих константные области, не кодирует функциональный домен Сн1;
сегмент гена V, сегмент гена D и сегмент гена J способны к рекомбинации с образованием кодирующей последовательности VDJ;
при экспрессии локус способен образовывать антитело только с тяжелыми цепями, содержащими антиген-связывающий домен VH и константную эффекторную область, лишенную функционального домена Сн1;
культивирование клетки млекопитающего, не являющегося человеком, для последующего получения трансгенного млекопитающего;
иммунизацию указанного трансгенного млекопитающего, не являющегося человеком, представляющим интерес антигеном;
выделение клетки или ткани, экспрессирующей интересующие специфичные в отношении антигена антитела только с тяжелыми цепями,
где антитело имеет домен VH, в котором отсутствует удлиненная CDR3 петля, подобная CDR3 петле верблюда;
идентификацию и выделение из выделенных клеток или тканей нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VH, интересующего специфичного в отношении антигена антитела только с тяжелыми цепями; и
экспрессию указанного антиген-связывающего домена VH указанной выделенной нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п.1, в котором после иммунизации указанного трансгенного млекопитающего, не являющегося человеком, происходит созревание аффинности антитела за счет соматической мутации в антиген-связывающем домене VH.
3. Способ по п.1 или 2, в котором экспрессия указанного гетерологичного локуса тяжелой цепи VH у указанного трансгенного млекопитающего, не являющегося человеком, не зависит от наличия или экспрессии генов легкой цепи.
4. Способ по п.1, в котором указанное трансгенное млекопитающее, не являющееся человеком, имеет пониженную способность продуцировать эндогенные антитела, которые содержат легкие цепи.
5. Способ по п.1, в котором:
указанное трансгенное млекопитающее, не являющееся человеком, иммунизируют антигеном с помощью инъекции;
нуклеиновая кислота, кодирующая антиген-связывающий домен VH, представляет собой мРНК, клонированную из гибридомы, продуцируемой клеткой или тканью, продуцирующими специфичные в отношении антигена антитела только с тяжелыми цепями; и антиген-специфичный антиген-связывающий домен VH экспрессируется в гетерологичной системе экспрессии.
указанное трансгенное млекопитающее, не являющееся человеком, иммунизируют антигеном с помощью инъекции;
нуклеиновая кислота, кодирующая антиген-связывающий домен VH, представляет собой мРНК, клонированную из гибридомы, продуцируемой клеткой или тканью, продуцирующими специфичные в отношении антигена антитела только с тяжелыми цепями; и антиген-специфичный антиген-связывающий домен VH экспрессируется в гетерологичной системе экспрессии.
6. Способ по п.1, в котором:
указанное трансгенное млекопитающее, не являющееся человеком, иммунизируют антигеном с помощью инъекции;
нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген-связывающий домен VH, получают путем клонирования антиген-связывающего домена VH из мРНК антитела только с тяжелыми цепями, полученного из выделенной клетки или ткани;
кодированный антиген-связывающий домен VH выбирают с помощью фагового дисплея или аналогичной библиотеки; и
экспрессируют антиген-связывающий домен VH отдельно или в виде слитого белка в бактериальной, дрожжевой или альтернативной системе экспрессии.
указанное трансгенное млекопитающее, не являющееся человеком, иммунизируют антигеном с помощью инъекции;
нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген-связывающий домен VH, получают путем клонирования антиген-связывающего домена VH из мРНК антитела только с тяжелыми цепями, полученного из выделенной клетки или ткани;
кодированный антиген-связывающий домен VH выбирают с помощью фагового дисплея или аналогичной библиотеки; и
экспрессируют антиген-связывающий домен VH отдельно или в виде слитого белка в бактериальной, дрожжевой или альтернативной системе экспрессии.
7. Способ по п.1, в котором локус тяжелой цепи VH содержит природные сегменты гена V, D и J человека.
8. Способ по п.1, в котором локус тяжелой цепи VH содержит более одного сегмента гена V, более одного сегмента гена D и более одного сегмента гена J.
9. Способ по п.1, где по меньшей мере один сегмент гена V, выбранный или полученный способами генной инженерии, обладает улучшенными свойствами растворимости.
10. Способ по п.1, где по меньшей мере один из сегментов гена V, присутствующий в локусе тяжелой цепи, получен из домена VH, в который введены предпочтительные мутации при созревании аффинности, после перетасовки VDJ.
11. Применение одного или нескольких связывающих доменов VH одного и того же или различных специфично-связывающихся антигенов, полученных способами по любому из пп.1-10, вместе или без дополнительных эффекторных доменов, для создания слитых белков или связывающих комплексов моновалентного, бивалентного или мультивалентного полипептида.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0416392.9 | 2004-07-22 | ||
GB0416392A GB2416768A (en) | 2004-07-22 | 2004-07-22 | Heavy chain immunoglobulin complexes |
GB0511881.5 | 2005-06-10 | ||
GB0511881A GB0511881D0 (en) | 2005-06-10 | 2005-06-10 | Binding molecules |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2007106728A RU2007106728A (ru) | 2008-08-27 |
RU2398882C2 true RU2398882C2 (ru) | 2010-09-10 |
Family
ID=35431831
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007106728/13A RU2398882C2 (ru) | 2004-07-22 | 2005-07-22 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА Vh ИСПОЛЬЗОВАНИЕ |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US20090285805A1 (ru) |
EP (6) | EP1978032A3 (ru) |
JP (3) | JP2008512987A (ru) |
KR (4) | KR101457753B1 (ru) |
CN (2) | CN102659940B (ru) |
AU (2) | AU2005263994B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0513577A (ru) |
CA (1) | CA2580336C (ru) |
CY (2) | CY1115762T1 (ru) |
DK (3) | DK2311874T3 (ru) |
ES (3) | ES2635497T3 (ru) |
HU (1) | HUE034335T2 (ru) |
LT (1) | LT2311874T (ru) |
MX (2) | MX2007000921A (ru) |
PL (2) | PL1776383T3 (ru) |
PT (2) | PT2311874T (ru) |
RU (1) | RU2398882C2 (ru) |
SG (1) | SG188080A1 (ru) |
SI (2) | SI2311874T1 (ru) |
WO (1) | WO2006008548A2 (ru) |
ZA (3) | ZA200701186B (ru) |
Families Citing this family (121)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
MX2007000921A (es) | 2004-07-22 | 2007-11-09 | Univ Erasmus Medical Ct | Moleculas de union. |
NI200800032A (es) | 2005-07-25 | 2009-03-23 | Reducción de célula b utilizando moléculas de unión específicas cd37 y cd20 | |
GB0601513D0 (en) * | 2006-01-25 | 2006-03-08 | Univ Erasmus Medical Ct | Binding molecules 3 |
CA2638117A1 (en) * | 2006-01-25 | 2007-08-30 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals |
GB0618345D0 (en) * | 2006-09-18 | 2006-10-25 | Univ Erasmus | Binding molecules |
MX2008015524A (es) * | 2006-06-12 | 2009-01-13 | Trubion Pharmaceuticals Inc | Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora. |
EP2102244A2 (en) | 2006-12-19 | 2009-09-23 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the adam family and polypeptides comprising the same for the treatment of adam-related diseases and disorders |
US20100062004A1 (en) | 2006-12-19 | 2010-03-11 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against gpcrs and polypeptides comprising the same for the treatment of gpcr-related diseases and disorders |
GB0706628D0 (en) * | 2007-04-04 | 2007-05-16 | Univ Erasmus | Germ-line manipulation 1 |
AU2008259939B2 (en) | 2007-06-01 | 2014-03-13 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies |
WO2009013620A2 (en) * | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Homologous recombination |
EP2173772A2 (en) * | 2007-07-03 | 2010-04-14 | Ablynx N.V. | Providing improved immunoglobulin sequences by mutating cdr and/or fr positions |
CA2706425A1 (en) | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Ablynx N.V. | Method for obtaining polypeptide constructs comprising two or more single domain antibodies |
CA2710471C (en) | 2007-12-26 | 2018-06-05 | Biotest Ag | Immunoconjugates targeting cd138 and uses thereof |
CN101945892B (zh) | 2007-12-26 | 2017-11-24 | 生物测试股份公司 | 用于改进对表达cd138的肿瘤细胞的靶向的方法和试剂 |
KR101626416B1 (ko) | 2007-12-26 | 2016-06-01 | 바이오테스트 아게 | Cd138 표적 물질 및 이의 용도 |
CA2720763A1 (en) | 2008-04-07 | 2009-10-15 | Ablynx Nv | Amino acid sequences directed against the notch pathways and uses thereof |
SI2132228T1 (sl) | 2008-04-11 | 2011-10-28 | Emergent Product Dev Seatle | CD37 imunoterapevtik in kombinacija z njegovim bifunkcionalnim kemoterapevtikom |
BRPI0911984A2 (pt) | 2008-05-16 | 2016-09-20 | Ablynx Nv | sequências de aminoácidos direncionadas contra cxcr4 e outros compostos gpcrs compreendendo os mesmos |
EP2669298A3 (en) | 2008-05-23 | 2014-02-26 | Ablexis, LLC | Single variable immunoglobulin domain comprising VL-DH-JL |
SI2285408T1 (sl) | 2008-06-05 | 2019-02-28 | Ablynx N.V. | Aminokislinska zaporedja usmerjena proti proteinom ovojnicam virusa in polipeptidi, ki zaporedja vsebujejo za zdravljenje virusnih bolezni |
US20100136584A1 (en) * | 2008-09-22 | 2010-06-03 | Icb International, Inc. | Methods for using antibodies and analogs thereof |
CN112715482B (zh) | 2008-12-18 | 2022-11-11 | 伊拉兹马斯大学鹿特丹医学中心 | 表达人源化抗体的非人转基因动物及其用途 |
WO2010070145A2 (en) | 2008-12-19 | 2010-06-24 | Ablynx N.V. | Method for generation of immunoglobulin sequences |
WO2010079149A1 (de) | 2009-01-09 | 2010-07-15 | Ipk Gatersleben | Fusionsantikörper |
GB0905023D0 (en) * | 2009-03-24 | 2009-05-06 | Univ Erasmus Medical Ct | Binding molecules |
PL2564695T3 (pl) | 2009-07-08 | 2015-10-30 | Kymab Ltd | Modele zwierzęce i cząsteczki terapeutyczne |
US20120204278A1 (en) | 2009-07-08 | 2012-08-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
US9445581B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-09-20 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
CN110079550A (zh) | 2009-12-10 | 2019-08-02 | 瑞泽恩制药公司 | 生产重链抗体的小鼠 |
US8962807B2 (en) | 2009-12-14 | 2015-02-24 | Ablynx N.V. | Single variable domain antibodies against OX40L, constructs and therapeutic use |
US9120855B2 (en) | 2010-02-10 | 2015-09-01 | Novartis Ag | Biologic compounds directed against death receptor 5 |
TWI586806B (zh) * | 2010-04-23 | 2017-06-11 | 建南德克公司 | 異多聚體蛋白質之製造 |
CN113150121A (zh) | 2010-08-02 | 2021-07-23 | 瑞泽恩制药公司 | 制造包含vl结构域的结合蛋白的小鼠 |
AR083784A1 (es) | 2010-11-08 | 2013-03-20 | Novartis Ag | Polipeptidos de enlace de los receptores de quimiocina |
WO2012122512A1 (en) * | 2011-03-10 | 2012-09-13 | Hco Antibody, Inc. | Recombinant production of mixtures of single chain antibodies |
UA117218C2 (uk) | 2011-05-05 | 2018-07-10 | Мерк Патент Гмбх | Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f |
US9433620B2 (en) | 2011-05-13 | 2016-09-06 | Cadila Healthcare Limited | Pharmaceutical compositions of lurasidone |
CA2846322A1 (en) | 2011-09-19 | 2013-03-28 | Kymab Limited | Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics |
EP2761008A1 (en) | 2011-09-26 | 2014-08-06 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
WO2013121440A1 (en) | 2012-02-13 | 2013-08-22 | Cadila Healthcare Limited | Process for preparing benzisothiazol-3-yl-peperazin-l-yl-methyl-cyclo hexyl-methanisoindol-1,3-dione and its intermediates |
ES2728301T3 (es) * | 2012-03-13 | 2019-10-23 | Novimmune Sa | Anticuerpos biespecíficos fácilmente aislados con formato de inmunoglobulina nativa |
US10251377B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-04-09 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies |
GB2502127A (en) * | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
KR102229945B1 (ko) | 2012-04-11 | 2021-03-18 | 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 | B-세포 성숙 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체 |
US9328174B2 (en) | 2012-05-09 | 2016-05-03 | Novartis Ag | Chemokine receptor binding polypeptides |
DK2931030T4 (da) | 2012-12-14 | 2024-04-22 | Omniab Inc | Polynukleotider, der koder for graver-antistoffer med humane idiotyper, og dyr, der omfatter disse |
PL2967012T3 (pl) | 2013-03-14 | 2021-04-19 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Transgeniczne ssaki inne niż człowiek do wytwarzania przeciwciał |
US10993420B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-05-04 | Erasmus University Medical Center | Production of heavy chain only antibodies in transgenic mammals |
US9788534B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-10-17 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
US11707056B2 (en) | 2013-05-02 | 2023-07-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires and methods |
US9783593B2 (en) | 2013-05-02 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains and chains tailored for human use |
WO2015053887A1 (en) * | 2013-09-05 | 2015-04-16 | Igm Biosciences, Inc. | Constant chain modified bispecific, penta- and hexavalent ig-m antibodies |
CA2925723A1 (en) | 2013-10-01 | 2015-04-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
BR112016018313A8 (pt) | 2014-02-10 | 2018-06-12 | Igm Biosciences Inc | Moléculas de ligação multiespecíficas iga |
CA2942697A1 (en) | 2014-03-21 | 2015-09-24 | Lynn Macdonald | Non-human animals that make single domain binding proteins |
RU2723940C2 (ru) | 2014-03-21 | 2020-06-18 | Экс-Боди, Инк. | Биспецифические антигенсвязывающие полипептиды |
CA2941514A1 (en) | 2014-03-21 | 2015-09-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics |
EP3125920B1 (en) | 2014-04-04 | 2020-12-23 | Del Mar Pharmaceuticals | Dianhydrogalactitol, diacetyldianhydrogalactitol or dibromodulcitol to treat non-small-cell carcinoma of the lung and ovarian cancer |
PT3209698T (pt) | 2014-10-22 | 2018-12-14 | Crescendo Biologics Ltd | Ratinhos transgénicos |
EP3271403A1 (en) | 2015-03-19 | 2018-01-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen |
RU2749674C2 (ru) | 2015-07-29 | 2021-06-16 | Аллерган, Инк. | Антитела против ang-2, содержащие только тяжелую цепь |
CN105384825B (zh) | 2015-08-11 | 2018-06-01 | 南京传奇生物科技有限公司 | 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用 |
JP2018523673A (ja) | 2015-08-14 | 2018-08-23 | アラーガン、インコーポレイテッドAllergan,Incorporated | Pdgfに対する重鎖のみ抗体 |
WO2017053469A2 (en) | 2015-09-21 | 2017-03-30 | Aptevo Research And Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
EP3356415B1 (en) | 2015-09-29 | 2024-05-01 | Amgen Inc. | Asgr inhibitors for reduzing cholesterol levels |
WO2018014260A1 (en) | 2016-07-20 | 2018-01-25 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof |
RU2021137547A (ru) | 2016-08-24 | 2022-01-11 | Тенеобио, Инк. | Трансгенные животные, отличные от человека, продуцирующие модифицированные антитела, содержащие только тяжелые цепи |
CR20220578A (es) | 2016-09-14 | 2023-01-17 | Teneobio Inc | Anticuerpos de unión a cd3 |
WO2018068201A1 (en) | 2016-10-11 | 2018-04-19 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4 |
EP3332637A1 (en) * | 2016-12-09 | 2018-06-13 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf | Vhh-containing heavy chain antibody and production thereof |
BR112019012354A2 (pt) | 2016-12-21 | 2019-11-26 | Teneobio Inc | anticorpos apenas de cadeia pesada anti-bcma |
CN110662421B (zh) | 2017-01-19 | 2023-03-24 | 欧莫诺艾比公司 | 来自具有多个重链免疫球蛋白基因座的转基因啮齿类动物的人抗体 |
CA3059634A1 (en) | 2017-04-13 | 2018-10-18 | Senti Biosciences, Inc. | Combinatorial cancer immunotherapy |
US11427642B2 (en) | 2017-06-20 | 2022-08-30 | Teneoone, Inc. | Anti-BCMA heavy chain-only antibodies |
JP7303126B2 (ja) | 2017-06-20 | 2023-07-04 | テネオバイオ, インコーポレイテッド | 抗bcma重鎖のみ抗体 |
CN111133007A (zh) | 2017-09-13 | 2020-05-08 | 特尼奥生物股份有限公司 | 与胞外酶结合的重链抗体 |
RU2756100C1 (ru) | 2017-12-20 | 2021-09-28 | Харбор Байомед (Шанхай) Ко., Лтд | Антитела, связывающие ctla-4, и их применение |
AU2018392088A1 (en) | 2017-12-22 | 2020-08-13 | Teneobio, Inc. | Heavy chain antibodies binding to CD22 |
CN111699198B (zh) | 2017-12-28 | 2023-09-05 | 南京传奇生物科技有限公司 | 针对tigit的单域抗体和其变体 |
US11713353B2 (en) | 2018-01-15 | 2023-08-01 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Single-domain antibodies and variants thereof against PD-1 |
KR20200138720A (ko) | 2018-03-30 | 2020-12-10 | 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. | Lag-3에 대한 단일-도메인 항체 및 이의 용도 |
KR102115300B1 (ko) * | 2018-06-01 | 2020-05-26 | 재단법인 목암생명과학연구소 | 항체 라이브러리 및 이를 이용한 항체 스크리닝 방법 |
EP3806630A4 (en) * | 2018-06-13 | 2022-02-23 | Crystal Bioscience Inc. | PRODUCTION OF ANTIBODIES BY MODIFICATION OF AUTONOMOUS HEAVY CHAIN VARIABLE DOMAINS THROUGH GENE CONVERSION |
WO2020018922A1 (en) | 2018-07-20 | 2020-01-23 | Teneobio, Inc. | Heavy chain antibodies binding to cd19 |
GB2576914A (en) | 2018-09-06 | 2020-03-11 | Kymab Ltd | Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals |
US11419898B2 (en) | 2018-10-17 | 2022-08-23 | Senti Biosciences, Inc. | Combinatorial cancer immunotherapy |
WO2020087065A1 (en) | 2018-10-26 | 2020-04-30 | Teneobio, Inc. | Heavy chain antibodies binding to cd38 |
WO2020169755A2 (en) | 2019-02-20 | 2020-08-27 | Harbour Antibodies Bv | Antibodies |
BR112021019334A2 (pt) | 2019-04-05 | 2021-12-07 | Teneobio Inc | Anticorpos de cadeia pesada que se ligam ao psma |
WO2020247854A1 (en) | 2019-06-07 | 2020-12-10 | Amgen Inc. | Bispecific binding constructs with selectively cleavable linkers |
AU2020291938A1 (en) | 2019-06-14 | 2022-01-20 | Teneobio, Inc. | Multispecific heavy chain antibodies binding to CD22 and CD3 |
US20220378822A1 (en) * | 2019-08-28 | 2022-12-01 | Senti Bioscience, Inc. | Combinatorial cancer immunotherapy |
JP2023507120A (ja) | 2019-12-18 | 2023-02-21 | テネオフォー, インコーポレイテッド | Cd38に結合する重鎖抗体 |
GB202003632D0 (en) | 2020-03-12 | 2020-04-29 | Harbour Antibodies Bv | SARS-Cov-2 (SARS2, COVID-19) antibodies |
TW202330622A (zh) | 2020-04-29 | 2023-08-01 | 美商泰尼歐生物公司 | 具有經修飾重鏈恆定區之多特異性重鏈抗體 |
EP4121172A1 (en) | 2020-04-29 | 2023-01-25 | Teneobio, Inc. | Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions |
EP4142791A1 (en) | 2020-04-29 | 2023-03-08 | TeneoOne, Inc. | Methods of treating multiple myeloma |
CA3184351A1 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Amgen Inc. | Bispecific binding constructs |
CR20220656A (es) | 2020-06-30 | 2023-03-01 | Teneobio Inc | Unión de anticuerpos multiespecíficos a bcma |
IL301137A (en) | 2020-09-11 | 2023-05-01 | Regeneron Pharma | Identification and production of antigen-specific antibodies |
GB202017555D0 (en) | 2020-11-06 | 2020-12-23 | Harbour Antibodies Bv | Antibody-conjugated nanoparticles |
TW202233684A (zh) | 2020-11-18 | 2022-09-01 | 美商泰尼歐生物公司 | 結合於葉酸受體α之重鏈抗體 |
EP4255931A1 (en) | 2020-12-03 | 2023-10-11 | Amgen Inc. | Immunoglobuline constructs with multiple binding domains |
CN117042601A (zh) | 2020-12-09 | 2023-11-10 | 特里安尼公司 | 纯重链抗体 |
KR20230147048A (ko) | 2020-12-16 | 2023-10-20 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 Fc 알파 수용체를 발현하는 마우스 |
WO2022178255A2 (en) | 2021-02-19 | 2022-08-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Single domain antibodies that neutralize sars-cov-2 |
CA3211138A1 (en) | 2021-02-25 | 2022-09-01 | Teneobio, Inc. | Anti-psma antibodies and car-t structures |
AU2022226565A1 (en) | 2021-02-26 | 2023-08-31 | Teneobio, Inc. | Anti-muc1-c antibodies and car-t structures |
TW202304994A (zh) | 2021-04-02 | 2023-02-01 | 美商泰尼歐生物公司 | 促效性抗il-2r抗體及使用方法 |
WO2022216864A1 (en) | 2021-04-06 | 2022-10-13 | Teneobio, Inc. | Anti-cd19 antibodies and car-t structures |
AU2022259688A1 (en) | 2021-04-16 | 2023-10-05 | Teneobio, Inc. | Anti-cd20 antibodies and car-t structures |
WO2022235988A1 (en) * | 2021-05-05 | 2022-11-10 | Leveragen, Inc. | Engineered non-human animals for producing antibodies |
WO2022271987A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | TeneoFour, Inc. | Anti-cd38 antibodies and epitopes of same |
WO2023004197A1 (en) | 2021-07-23 | 2023-01-26 | Teneoten, Inc. | Heavy chain antibodies binding to hepatitis b surface antigen |
WO2023036982A1 (en) | 2021-09-10 | 2023-03-16 | Harbour Antibodies Bv | Anti-sars2-s antibodies |
GB202112935D0 (en) | 2021-09-10 | 2021-10-27 | Harbour Antibodies Bv | Sars-cov-2 (sars2, covid-19) heavy chain only antibodies |
WO2024077044A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Amgen Inc. | Combination therapies comprising t-cell redirecting therapies and agonistic anti-il-2r antibodies or fragments thereof |
WO2024083843A1 (en) | 2022-10-18 | 2024-04-25 | Confo Therapeutics N.V. | Amino acid sequences directed against the melanocortin 4 receptor and polypeptides comprising the same for the treatment of mc4r-related diseases and disorders |
Family Cites Families (54)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0143151A3 (en) | 1980-08-11 | 1985-07-10 | BAUSCH & LOMB INCORPORATED | Apparatus for use in an ophthalmic instrument |
WO1988009344A1 (en) | 1987-05-21 | 1988-12-01 | Creative Biomolecules, Inc. | Targeted multifunctional proteins |
JP3771253B2 (ja) | 1988-09-02 | 2006-04-26 | ダイアックス コープ. | 新規な結合タンパク質の生成と選択 |
JP2919890B2 (ja) | 1988-11-11 | 1999-07-19 | メディカル リサーチ カウンスル | 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用 |
US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
US6150584A (en) * | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
DK0710719T3 (da) | 1990-01-12 | 2007-07-09 | Amgen Fremont Inc | Frembringelse af xenogene antistoffer |
US6673986B1 (en) | 1990-01-12 | 2004-01-06 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US5877397A (en) | 1990-08-29 | 1999-03-02 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US7041871B1 (en) | 1995-10-10 | 2006-05-09 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5843440A (en) | 1990-10-03 | 1998-12-01 | Redcell Canada, Inc. | Cellular and serum protein anchors for modulating pharmacokinetics |
AU8869291A (en) | 1990-10-04 | 1992-04-28 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation, The | Primate erythrocyte bound monoclonal antibody heteropolymers |
PT1498427E (pt) * | 1992-08-21 | 2010-03-22 | Univ Bruxelles | Imunoglobulinas desprovidas de cadeias leves |
EP0739981A1 (en) | 1995-04-25 | 1996-10-30 | Vrije Universiteit Brussel | Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes |
WO1998021355A1 (en) * | 1996-11-15 | 1998-05-22 | Life Technologies, Inc. | Mutants of green fluorescent protein |
EP0942968B1 (en) | 1996-12-03 | 2008-02-27 | Amgen Fremont Inc. | Fully human antibodies that bind EGFR |
EP0954978B1 (en) * | 1998-03-12 | 2011-11-30 | VHsquared Limited | New products comprising inactivated yeasts or moulds provided with active antibodies |
US7083950B2 (en) † | 1998-09-25 | 2006-08-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | High affinity fusion proteins and therapeutic and diagnostic methods for use |
CA2634294A1 (en) * | 2000-08-03 | 2002-02-14 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Production of humanized antibodies in transgenic animals |
WO2002012467A2 (en) | 2000-08-04 | 2002-02-14 | Incyte Genomics, Inc. | Drug metabolizing enzymes |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US6992174B2 (en) * | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
US20030022240A1 (en) | 2001-04-17 | 2003-01-30 | Peizhi Luo | Generation and affinity maturation of antibody library in silico |
GB0110029D0 (en) * | 2001-04-24 | 2001-06-13 | Grosveld Frank | Transgenic animal |
MXPA03011365A (es) | 2001-06-13 | 2005-03-07 | Genmab As | Anticuerpos monoclonales humanos para el receptor de factor de crecimiento epidermico (egfr). |
GB0115256D0 (en) | 2001-06-21 | 2001-08-15 | Babraham Inst | Mouse light chain locus |
ATE477280T1 (de) † | 2001-06-28 | 2010-08-15 | Domantis Ltd | Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung |
US6880232B2 (en) | 2001-09-26 | 2005-04-19 | Intel Corporation | Method of making an electrical inductor using a sacrificial electrode |
JP2005289809A (ja) * | 2001-10-24 | 2005-10-20 | Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) | 突然変異重鎖抗体 |
US6755339B2 (en) † | 2002-06-21 | 2004-06-29 | Delphi Technologies, Inc. | Fluxing apparatus for applying powdered flux |
JP2006512895A (ja) * | 2002-06-28 | 2006-04-20 | ドマンティス リミテッド | リガンド |
GB0218030D0 (en) | 2002-08-02 | 2002-09-11 | Minos Biosystems | Multi-submit protein production system |
GB0228210D0 (en) * | 2002-12-03 | 2003-01-08 | Babraham Inst | Single chain antibodies |
GB0230203D0 (en) | 2002-12-27 | 2003-02-05 | Domantis Ltd | Fc fusion |
EP1597280B2 (en) | 2003-02-26 | 2016-08-24 | Institute for Research in Biomedicine | Monoclonal antibody production by ebv transformation of b cells |
WO2005070966A2 (en) † | 2004-01-16 | 2005-08-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion polypeptides capable of activating receptors |
US7785903B2 (en) | 2004-04-09 | 2010-08-31 | Genentech, Inc. | Variable domain library and uses |
MX2007000921A (es) * | 2004-07-22 | 2007-11-09 | Univ Erasmus Medical Ct | Moleculas de union. |
US20060117398A1 (en) | 2004-10-22 | 2006-06-01 | Roland Buelow | Suppression of endogenous immunoglobulin expression |
EP1844073A1 (en) | 2005-01-31 | 2007-10-17 | Ablynx N.V. | Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies |
MX2007014564A (es) | 2005-05-20 | 2008-02-07 | Ablynx Nv | Anticuerpos de vhh de dominio unico contra el factor de von willebrand. |
GB0618345D0 (en) | 2006-09-18 | 2006-10-25 | Univ Erasmus | Binding molecules |
CA2638117A1 (en) * | 2006-01-25 | 2007-08-30 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals |
EP2016101A2 (en) | 2006-05-09 | 2009-01-21 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with optimized scaffolds |
US7731969B1 (en) | 2006-12-06 | 2010-06-08 | Neoclone Biotechnology International, Llc | Methods for developing and producing antigen-specific antibody-producing cells |
AU2008259939B2 (en) | 2007-06-01 | 2014-03-13 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies |
WO2009013620A2 (en) | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Homologous recombination |
GB0905023D0 (en) | 2009-03-24 | 2009-05-06 | Univ Erasmus Medical Ct | Binding molecules |
CN110079550A (zh) | 2009-12-10 | 2019-08-02 | 瑞泽恩制药公司 | 生产重链抗体的小鼠 |
RS59413B2 (sr) | 2011-02-25 | 2023-06-30 | Regeneron Pharma | Adam6 miševi |
WO2012122512A1 (en) | 2011-03-10 | 2012-09-13 | Hco Antibody, Inc. | Recombinant production of mixtures of single chain antibodies |
GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
DK2931030T4 (da) | 2012-12-14 | 2024-04-22 | Omniab Inc | Polynukleotider, der koder for graver-antistoffer med humane idiotyper, og dyr, der omfatter disse |
US10993420B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-05-04 | Erasmus University Medical Center | Production of heavy chain only antibodies in transgenic mammals |
-
2005
- 2005-07-22 MX MX2007000921A patent/MX2007000921A/es active IP Right Grant
- 2005-07-22 BR BRPI0513577-0A patent/BRPI0513577A/pt active Search and Examination
- 2005-07-22 PT PT101797843T patent/PT2311874T/pt unknown
- 2005-07-22 EP EP08075481A patent/EP1978032A3/en not_active Withdrawn
- 2005-07-22 PL PL05766644T patent/PL1776383T3/pl unknown
- 2005-07-22 EP EP10179784.3A patent/EP2311874B1/en active Active
- 2005-07-22 PT PT57666448T patent/PT1776383E/pt unknown
- 2005-07-22 WO PCT/GB2005/002892 patent/WO2006008548A2/en active Application Filing
- 2005-07-22 KR KR1020117019563A patent/KR101457753B1/ko active IP Right Review Request
- 2005-07-22 CN CN201210057668.0A patent/CN102659940B/zh active Active
- 2005-07-22 RU RU2007106728/13A patent/RU2398882C2/ru active
- 2005-07-22 DK DK10179784.3T patent/DK2311874T3/en active
- 2005-07-22 EP EP23218163.6A patent/EP4353819A2/en active Pending
- 2005-07-22 KR KR1020127016031A patent/KR101443473B1/ko active IP Right Grant
- 2005-07-22 SI SI200532162T patent/SI2311874T1/sl unknown
- 2005-07-22 DK DK07075586.3T patent/DK1864998T4/da active
- 2005-07-22 EP EP05766644.8A patent/EP1776383B1/en not_active Revoked
- 2005-07-22 ES ES10179784.3T patent/ES2635497T3/es active Active
- 2005-07-22 EP EP07075586.3A patent/EP1864998B2/en active Active
- 2005-07-22 CN CN201210057684.XA patent/CN102659941B/zh active Active
- 2005-07-22 PL PL10179784T patent/PL2311874T3/pl unknown
- 2005-07-22 ES ES07075586T patent/ES2440990T5/es active Active
- 2005-07-22 SG SG2013004643A patent/SG188080A1/en unknown
- 2005-07-22 HU HUE10179784A patent/HUE034335T2/en unknown
- 2005-07-22 JP JP2007522034A patent/JP2008512987A/ja active Pending
- 2005-07-22 EP EP17173113.6A patent/EP3272770B1/en active Active
- 2005-07-22 LT LTEP10179784.3T patent/LT2311874T/lt unknown
- 2005-07-22 DK DK05766644.8T patent/DK1776383T3/da active
- 2005-07-22 ES ES05766644.8T patent/ES2523661T3/es active Active
- 2005-07-22 KR KR1020077004055A patent/KR101422286B1/ko active IP Right Grant
- 2005-07-22 US US11/658,361 patent/US20090285805A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-22 SI SI200531906T patent/SI1776383T1/sl unknown
- 2005-07-22 AU AU2005263994A patent/AU2005263994B2/en active Active
- 2005-07-22 KR KR1020107026625A patent/KR101151957B1/ko active IP Right Grant
- 2005-07-22 CA CA2580336A patent/CA2580336C/en active Active
-
2007
- 2007-01-22 MX MX2012000436A patent/MX338603B/es unknown
- 2007-02-09 ZA ZA2007/01186A patent/ZA200701186B/en unknown
-
2008
- 2008-02-26 ZA ZA2008/01820A patent/ZA200801820B/en unknown
-
2009
- 2009-12-23 US US12/645,684 patent/US8921524B2/en active Active
- 2009-12-23 US US12/645,653 patent/US8921522B2/en active Active
-
2010
- 2010-08-24 AU AU2010212518A patent/AU2010212518B2/en active Active
-
2011
- 2011-01-25 US US13/013,156 patent/US20110118444A1/en active Pending
- 2011-07-29 JP JP2011166561A patent/JP5855381B2/ja active Active
- 2011-07-29 JP JP2011166562A patent/JP5888893B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-02-25 ZA ZA2013/01416A patent/ZA201301416B/en unknown
- 2013-03-15 US US13/837,520 patent/US9346877B2/en active Active
- 2013-03-15 US US13/837,402 patent/US9353179B2/en active Active
-
2014
- 2014-11-17 CY CY20141100953T patent/CY1115762T1/el unknown
-
2017
- 2017-08-11 CY CY20171100869T patent/CY1119561T1/el unknown
-
2018
- 2018-04-16 US US15/953,622 patent/US10906970B2/en active Active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
РОЙТ А. с соавт. Иммунология.: Изд. "Мир", 2000, с.107-112. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2398882C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА Vh ИСПОЛЬЗОВАНИЕ | |
AU2011203061B2 (en) | Binding molecules |