ES2635497T3 - Moléculas de unión - Google Patents

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Richard W. Janssens
Dubravka Drabek
Roger Kingdon Craig
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Erasmus University Medical Center
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KINGDON CRAIG R
Erasmus University Medical Center
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Abstract

Un método para la producción de un anticuerpo únicamente de cadena pesada VH que comprende: (a) inmunizar una rata transgénica que expresa un locus de cadena pesada VH heterólogo con un antígeno en el que: (i) el locus de cadena pesada VH comprende una región variable que comprende al menos un segmento génico VH de origen natural, al menos un segmento génico D, al menos un segmento génico J y al menos una región constante de cadena pesada, y en la que los segmentos génicos V, D y J derivan de un ser humano; (ii) cada región constante no se codifica a un dominio funcional CH1; (iii) un segmento génico VH, un segmento génico D y un segmento génico J son capaces de recombinarse para formar una secuencia de codificación VDJ; (iv) el locus recombinado de cadena pesada VH, cuando se expresa, es capaz de formar un anticuerpo únicamente de cadena pesada soluble que comprende un dominio de unión VH específico de un antígeno soluble y una región efectora constante desprovista de un dominio funcional CH1; (b) aislar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el anticuerpo únicamente de cadena pesada VH de las células que producen anticuerpos; y (c) producir el anticuerpo únicamente de cadena pesada VH usando técnicas de ADN recombinante.

Description

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Moleculas de union DESCRIPCION Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo de produccion de anticuerpos unicamente de cadena pesada en ratas transgenicas.
Antecedentes a la invencion
Los anticuerpos monoclonales o variantes de los mismos representaran una alta proporcion de nuevas medicinas lanzadas en el siglo XXI. La terapia con anticuerpos monoclonales ya se ha aceptado como una via preferida para el tratamiento de artritis reumatoide y enfermedad de Crohn y hay un impresionante progreso en el tratamiento de cancer. Los productos basados en anticuerpos tambien estan en desarrollo para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares e infecciosas. La mayona de los productos de anticuerpos monoclonales comercializados reconocen y se unen a un unico epitope bien definido sobre el ligando diana (por ejemplo, TNFa). La fabricacion de anticuerpos monoclonales humanos para terapia sigue dependiendo del cultivo celular de mairnfero. El ensamblaje de un complejo que consiste en dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras (el complejo H2L2) y posteriores procedimientos de glucosilacion postraduccional excluye el uso de sistemas bacterianos. Los costes de produccion y los costes de capital para la fabricacion de anticuerpos por cultivo celular de marnffero son altos y amenazan con limitar el potencial de las terapias basadas en anticuerpos en ausencia de alternativas aceptables. Una variedad de organismos transgenicos pueden expresar anticuerpos completamente funcionales. Estos incluyen plantas, insectos, pollos, cabras y ganado vacuno, pero ninguno se ha usado hasta ahora para fabricar productos terapeuticos comercializados.
Los fragmentos de anticuerpos funcionales pueden fabricarse en E. coli, pero el producto tiene generalmente baja estabilidad en suero, a menos que se PEGile durante el procedimiento de fabricacion.
Los complejos de anticuerpo biespedfico son moleculas basadas en Ig manipuladas que pueden unir dos epitopes diferentes sobre tanto el mismo antfgeno como sobre antfgenos diferentes. Las protemas de union biespedficas que incorporan anticuerpos solos o en combinacion con otros ligantes son prometedoras para las modalidades de tratamiento en las que funciones inmunes humanas capturadas provocan un efecto terapeutico, por ejemplo, la eliminacion de patogenos (Van Spriel y col., (1999) J. Infect. Diseases, 179, 661-669; Tacken y col., (2004) J. Immunol., 172, 4934-4940; documento US 5.487.890), el tratamiento de cancer (Glennie y van der Winkel, (2003) Drug Discovery Today, 8, 503-5100); e inmunoterapia (Van Spriel y col., (2000) Immunol. Today, 21, 391-397; Segal y col., (2001) J. Immunol. Methods, 248, 1-6; Lyden y col., (2001) Nat. Med., 7, 1194-1201;.
Los asuntos de fabricacion se agravan cuando un producto de anticuerpo biespedfico se basa en dos o mas complejos de H2L2. Por ejemplo, la co-expresion de dos o mas conjuntos de genes de la cadena pesada y ligera puede producir la formacion de hasta 10 combinaciones diferentes, solo una de las cuales es el heterodfmero deseado (Suresh y col., (1986) Methods Enzymol., 121,210-228).
Para tratar este asunto se han desarrollado varias estrategias para la produccion en celulas de marnffero de formatos de IgG biespedficas de longitud completa (BsIgG) que retienen la funcion efectora de la cadena pesada. Las BsIgG requieren cadenas pesadas de “boton y ojal” manipuladas para prevenir la formacion de heterodfmeros y utilizar cadenas L identicas para prevenir el apareamiento erroneo de cadenas L (Carter, (2001) J. Immunol. Methods, 248, 7-15). Tambien se han descrito estrategias de reticulacion qmmica alternativas para la produccion de complejos de fragmentos de anticuerpos que reconocen cada uno diferentes antfgenos (Ferguson y col., (1995) Arthritis and Rheumatism, 38, 190-200) o la reticulacion de otras protemas de union, por ejemplo, colectinas, a fragmentos de anticuerpos (Tacken y col., (2004) J. Immunol., 172, 4934-4940).
El desarrollo de diacuerpos o minianticuerpos (BsAb) que generalmente carecen de funciones efectoras de la cadena pesada tambien supera la redundancia de heterodfmeros. Estos comprenden anticuerpos monocatenarios mmimos que incorporan sitios de union Vh y Vl (scFv) que posteriormente se pliegan y dimerizan para formar un anticuerpo biespedfico divalente monovalente para cada uno de sus antfgenos diana (Holliger y col., (1993) PNAS, 90, 6444-6448; Muller y col., (1998) FEBS Lett., 422, 259-264). En un caso, los dominios constantes Ch1 y L se han usado como dominios de heterodimerizacion para la formacion de mini-anticuerpos bi-espedficos (Muller y col., (1998) FEBS Lett., 259-264). Se ha desarrollado una variedad de procedimientos recombinantes basados en sistemas de expresion en E. coli para la produccion de BsAb (Hudson, (1999) Curr. Opin. Immunol., 11, 548-557), aunque parecena que el coste y escala de produccion del material de anticuerpo multivalente de calidad clmica sigue siendo el impedimento primario para el desarrollo clmico (Segal y col., (2001) J. Immunol. Methods, 248, 1-6).
Recientemente, el concepto de BsAb se ha extendido para englobar di-diacuerpos, anticuerpos biespedficos tetravalentes en los que los dominios Vh y Vl en cada cadena H y L se han sustituido por pares
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manipulados de dominios de union scFv. Tales constructos, aunque son complejas de manipular, pueden ensamblarse en celulas de mai^ero en cultivo en ausencia de redundancia de hetero-dfmeros (Lu y col., (2003) J. Immunol. Methods, 279, 219-232).
La estructura de inmunoglobulinas es muy conocida en la tecnica. La mayona de las inmunoglobulinas naturales comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las cadenas pesadas se unen entre sf mediante enlaces disulfuro entre dominios bisagra localizados aproximadamente a mitad de camino a lo largo de cada cadena pesada. Una cadena ligera esta asociada a cada cadena pesada en el lado del extremo N del dominio bisagra. Cada cadena ligera esta normalmente unida a su cadena pesada respectiva por un enlace disulfuro proximo al dominio bisagra.
Cuando una molecula de Ig esta correctamente plegada, cada cadena se pliega en varios dominios globulares distintos unidos por una secuencia de polipeptidos mas lineal. Por ejemplo, la cadena ligera se pliega en un dominio variable (Vl) y uno constante (Cl). Las cadenas pesadas tienen un unico dominio variable Vh, adyacente al dominio variable de la cadena ligera, un primer dominio constante, un dominio bisagra y dos o tres dominios constantes adicionales. La interaccion de los dominios variables de la cadena pesada (Vh) y ligera (Vl) produce la formacion de una region de union a antfgeno (Fv). Generalmente, se requieren tanto Vh como Vl para la union a antfgeno, aunque se ha mostrado que dfmeros de cadenas pesadas y fragmentos del extremo amino retienen actividad en ausencia de cadena ligera (Jaton y col., (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195).
Con la aparicion de nuevas tecnicas de biologfa molecular, la presencia de anticuerpo solo de cadena pesada (que carece de cadena ligera) se identifico en trastornos proliferativos de linfocitos B en el hombre (enfermedad de la cadena pesada) y en sistemas de modelo murino. El analisis de la enfermedad de la cadena pesada al nivel molecular mostro que las mutaciones y deleciones al nivel del genoma podnan producir expresion inapropiada del dominio Ch1 de la cadena pesada, dando lugar a la expresion de anticuerpo solo de cadena pesada que carece de la capacidad para unir cadena ligera (veanse Hendershot y col., (1987) J. Cell Biol., 104, 761-767; Brandt y col., (1984) Mol. Cell. Biol., 4, 1270-1277).
Estudios separados sobre dominios Vh humanos aislados derivados de bibliotecas de fagos demostraron union espedfica a antfgeno de dominios Vh, pero estos dominios Vh demostraron ser de baja solubilidad. Ademas, se sugirio que la seleccion de dominios Vh humanos con caractensticas de union espedfica expresados sobre matrices de fago podnan formar los bloques constitutivos para anticuerpos manipulados (Ward y col., (1989) Nature, 341, 544-546).
Estudios usando otras especies de vertebrados han mostrado que los camelidos, como resultado de mutaciones de genes naturales, producen dfmeros de solo cadena pesada de IgG2 y IgG3 funcionales que no pueden unirse a cadena ligera debido a la ausencia de la region de union a cadena ligera Ch1 (Hamers-Casterman y col., (1993) Nature, 363, 446-448) y que especies tales como tiburon producen una familia de proterna de union similar a solo cadena pesada, probablemente relacionada con el receptor de linfocitos T de mairnfero o cadena ligera de la inmunoglobulina (Stanfield y col., (2004) Science, 305, 1770-1773).
Un rasgo caracterizador del anticuerpo solo de cadena pesada de camelido es el dominio Vh de camelido, que proporciona solubilidad mejorada con respecto al dominio Vh humano. Vh humano puede manipularse para caractensticas de solubilidad mejoradas (veanse Davies y Riechmann, (1996) Protein Eng., 9 (6), 531-537; Lutz y Muildermans, (1999) J. Immuno. Methods, 231, 25-38) o la solubilidad puede adquirirse por seleccion natural in vivo (vease Tanha y col., (2001) J. Biol. Chem., 276, 24774-24780). Sin embargo, si los dominios de union Vh se han derivado de bibliotecas de fagos, afinidades intnnsecas por antfgeno siguen en el intervalo de micromolar bajo a nanomolar alto, a pesar de la aplicacion de estrategias de mejora de la afinidad que implican, por ejemplo, aleatorizacion de puntos calientes de afinidad (Yau y col., (2005) J. Immunol. Methods, 297, 213-224).
Los anticuerpos VH de camelido tambien se caracterizan por un bucle de CDR3 modificado. Este bucle de CDR3 es, en promedio, mas largo que aquellos encontrados en anticuerpos de no camelido y es una caractenstica que se considera que es de gran influencia sobre la afinidad y especificidad por antfgeno global, que compensa la ausencia de un dominio Vl en especies de anticuerpos solo de cadena pesada de camelido (Desmyter y col., (1996) Nat. Struct. Biol., 3, 803-811, Riechmann y Muildermans, (1999) J. Immunol. Methods, 23, 25-28).
Recientes estudios estructurales sobre anticuerpo de camelido sugieren que la diversidad de anticuerpos esta accionada en gran parte por procesos de maduracion in vivo con dependencia de eventos de recombinacion de V(D)J y mutacion somatica (De Genst y col., (2005) J. Biol. Chem., 280 (14), 14114-14121).
Recientemente se han desarrollado procedimientos para la produccion de anticuerpos solo de cadena pesada en marnfferos transgenicos (veanse los documentos WO02/085945 y WO02/085944). El anticuerpo solo de cadena pesada funcional de posiblemente cualquier clase (IgM, IgG, IgD, IgA o IgE) y derivado de cualquier mamffero (incluyendo ser humano) puede producirse a partir de mamfferos transgenicos (preferentemente ratones) como resultado de exposicion a antfgeno.
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El sitio de la cadena pesada de la inmunoglobulina normal comprende una pluralidad de segmentos del gen V, varios segmentos del gen D y varios segmentos del gen J. Cada segmento del gen V codifica del extremo N casi al extremo C de un dominio V. El extremo C de cada dominio V esta codificado por un segmento del gen D y un segmento del gen J. La transposicion VDJ en linfocitos B, seguido de maduracion por afinidad, proporciona dominios de union Vh que luego, con dominios de union Vl, forman un sitio de reconocimiento o de union a antigeno. La interaccion de las cadenas pesadas y ligeras se facilita por la region Ch1 de la cadena pesada y la region k o X de la cadena ligera.
Para la produccion de anticuerpo solo de cadena pesada, el sitio de la cadena pesada en la lmea germinal comprende segmentos de genes que codifican algunas o todas las posibles regiones constantes. Durante la maduracion, un dominio de union Vh reorganizado se corta y empalma sobre el segmento que codifica la region constate Ch2, para proporcionar un gen reorganizado que codifica una cadena pesada que carece de un dominio Ch1 y, por tanto, no puede asociarse con una cadena ligera de la inmunoglobulina.
Los anticuerpos monoclonales de solo cadena pesada pueden recuperarse de linfocitos B del bazo por tecnologfa de clonacion convencional o recuperarse de ARNm de linfocitos B por tecnologfa de expresion en fago (Ward y col., (1989) Nature, 341, 544-546). Los anticuerpos solo de cadena pesada derivados de camelidos o animales transgenicos son de alta afinidad. El analisis de secuencias de tetrameros de H2L2 normales demuestra que la diversidad resulta principalmente de una combinacion de transposicion VDJ e hipermutacion somatica (Xu y Davies, (2000) Immunity, 13, 37-45). El analisis de secuencias de ARNm de solo cadena pesada expresada, tanto si se produce en camelidos como en animales transgenicos, soporta esta observacion (De Genst y col., (2005) J. Biol. Chem., 280, 14114-14121).
Un rasgo importante y comun de regiones Vh de camelido y humanas naturales es que cada region se une como un monomero sin dependencia de la dimerizacion con una region Vl para solubilidad y afinidad de union optimas. Estos rasgos se han reconocido previamente como particularmente adecuados para la produccion de agentes de bloqueo y agentes de penetracion de tejidos.
Tambien pueden generarse homo- o hetero-dfmeros por escision enzimatica de anticuerpos solo de cadena pesada o por rutas de smtesis (Jaton y col., (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195 y el documento US2003/0058074 A1). Sin embargo, los beneficios de un dominio de union de anticuerpo monomerico tienen que usarse ya para aventajar en el diseno de protemas multimeras como reactivos, terapeuticos y diagnosticos.
Vh humano o Vhh de camelido producidos por tecnologfa de expresion en fago carecen de la ventaja de caractensticas mejoradas como resultado de mutaciones somaticas y la diversidad adicional proporcionada por la recombinacion de la region D y J en la region CDR3 del sitio de union a anticuerpo normal (Xu y Davies, (2000) Immunity, 13, 37-45). Vhh de camelido, aunque muestra beneficios en la solubilidad con respecto a Vh humana, es antigenica en el hombre y debe generarse por inmunizacion de camelidos o portecnologfa de expresion en fago.
La incorporacion de dominios de union Vh tiene la clara ventaja con respecto al uso de scFv que debe manipularse a partir de dominios Vh y Vl con el potencial asociado de perdida de especificidad y avidez. Los dominios de union Vh derivados de familias de genes relacionadas tales como receptores de linfocitos To la familia de inmunoglobulinas de tiburon tambien proporciona alternativas a scFv para la generacion de moleculas espedficas de bi- o multi-union. Tambien pueden usarse otras protemas de union que se producen naturalmente y dominios de las mismas que incluyen, por ejemplo, fragmentos de receptor soluble.
Las clases de anticuerpos se diferencian en su funcion fisiologica. Por ejemplo, la IgG desempena una funcion dominante en una respuesta inmunitaria madura. La IgM participa en la fijacion y aglutinacion de complemento. La IgA es la principal clase de Ig en secreciones - lagrimas, saliva, calostro, moco - y asf desempena una funcion en inmunidad local. La inclusion de regiones constantes de la cadena pesada espedficas de clase cuando se manipulan complejos de union multivalentes proporciona los beneficios terapeuticos de funcion efectora in vivo dependiente de la funcionalidad requerida. La manipulacion de regiones efectoras individuales tambien puede producir la adicion o delecion de funcionalidad (Van Dijk y van der Winkel, Curr. Opin. Chem. Biol., (2001) Aug 5 (4), 368-374). Parece probable que la produccion y seleccion optima de anticuerpos solo de cadena pesada que comprenden dominios de union Vh de alta afinidad (tanto si son de origen humano como de camelido o cualquier origen) se beneficiaran de enfoques alternativos a aquellos dependientes de la seleccion de bibliotecas de fagos al azar que no facilitan la recombinacion in vivo y maduracion por afinidad.
Asf, la inclusion de funcionalidad de la region constante de IgA proporcionana funcion mucosa mejorada contra patogenos (Leher y col., (1999) Exp. Eye. Res., 69, 75-84), mientras que la presencia de funcionalidad de la region constante de IgG1 proporciona estabilidad en suero potenciada in vivo. La presencia de dominios constantes Ch2 y Ch3 de la cadena pesada proporciona la base para dimerizacion estable como se observa en anticuerpos naturales, y proporciona sitios de reconocimiento para la glucosilacion postraduccional. La presencia de Ch2 y Ch3
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tambien permite el reconocimiento de anticuerpos secundarios cuando se usan complejos biespedficos y multivalentes como reactivos y diagnosticos.
Previamente se han clonado secuencias de la region variable de solo cadena pesada de camelido previamente reorganizadas aisladas enfrente de una region bisagra y dominio efector de IgG1 humana, insertado en vectores y expresado en celulas COS para generar anticuerpo. Los anticuerpos expresados en este entorno in vitro ya se han sometido a los procesos de cambio de clase (isotipo) y maduracion por afinidad (hipermutacion) in vivo en el camello y pueden unirse a antigeno (Riechmann y Muildermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38).
El documento WO 2004 / 049794 describe anticuerpos de cadena unica, un raton transgenico y anticuerpos de cadena unica producidos por dicho raton transgenico.
Sigue habiendo una necesidad en la tecnica para generar dominios funcionales de union Vh unicamente a cadena pesada que retienen el maximo potencial de union al antfgeno para su uso en diversas aplicaciones clmicas, industriales y de investigacion.
Breve resumen de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo de produccion de un anticuerpo unicamente de cadena pesada Vh que comprende:
(a) inmunizar una rata transgenica que expresa un locus de cadena pesada Vh heterologo con un antfgeno en
el que:
(i) el locus de cadena pesada Vh comprende una region variable que comprende al menos un segmento genico Vh de origen natural, al menos un segmento genico D, al menos un segmento genico J y al menos una region constante de cadena pesada, y en la que los segmentos genicos V, D y J derivan de un ser humano;
(ii) cada region constante no se codifica a un dominio funcional Ch1;
(iii) un segmento genico V, un segmento genico D y un segmento genico J son capaces de recombinarse para formar una secuencia de codificacion VDJ;
(iv) el locus recombinado de cadena pesada Vh, cuando se expresa, es capaz de formar un anticuerpo unicamente de cadena pesada soluble que comprende un dominio de union Vh espedfico de un antfgeno soluble y una region efectora constante desprovista de un dominio funcional Ch1;
y:
(b) aislar una secuencia de acidos nucleicos que codifica el anticuerpo unicamente de cadena pesada
Vh de las celulas que producen anticuerpos; y
(c) producir l anticuerpo unicamente de cadena pesada Vh usando tecnicas de ADN recombinante.
En ciertas realizaciones, el metodo de la invencion comprende ademas clonar un locus Vh que codifica el dominio de union de Vh del anticuerpo unicamente de cadena pesada Vh y expressa el dominio de union de Vh en un sistema de expresion bacteriano, de levadura, mairnfero o alternativo.
Preferentemente, dicha rata transgenica se ha modificado para tener una capacidad reducida para producir anticuerpos que incluyan cadenas ligeras
Preferentemente, los loci endogenos de cadena pesada de inmunoglobulina en el rata se eliminan o se silencian. Preferentemente, el locus de cadena pesada Vh comprende mas de un segmento genico V, mas de un segmento genico D y mas de un segmento genico J.
Preferentemente, se ha seleccionado el segmento genico V para mostrar la mejora de las caractensticas de solubilidad.
La region constante de la cadena pesada del sitio de la cadena pesada puede comprender un gen de la region constante de la cadena pesada Cai y/o Ca2, Ce, C8, Cy y/o C|i. Ademas, la region constante de la cadena pesada del sitio de la cadena pesada puede comprender mas de una de las siguientes regiones constantes de la cadena pesada: Cai, Ca2, Ce, C8, Cy C|i.
El sitio de la cadena pesada Vh comprende una region variable que comprende al menos un segmento del gen V humano o de camelido, al menos un segmento D humano y al menos un segmento J humano en el que un segmento del gen V, un segmento del gen D y un segmento del gen J pueden recombinarse para formar una secuencia codificante VDJ. El locus de la cadena pesada comprende preferentemente veinte o mas segmentos del gen D y/o cinco o mas segmentos del gen J. Preferentemente, los segmentos D y J son de origen vertebrado, preferentemente humano. El bucle CDR3 se deriva usando segmentos del gen D y J humanos.
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El locus de la cadena pesada Vh tambien puede comprender una secuencia de recombinacion (rss) que puede recombinar un segmento del gen J directamente con un gen de la region constante de la cadena pesada.
La region constante de la cadena pesada del locus de la cadena pesada heterologo es de origen humano u origen vertebrado, por ejemplo, de origen de camelido. Alternativamente, la region constante puede no ser de origen de la cadena pesada de la inmunoglobulina.
El metodo de la invencion da lugar a la maduracion de la celula B esencialmente normal. El dominio de union Vh puede carecer de un bucle CDR3 de tipo camelido ampliado.
La invencion tambien proporciona un metodo de produccion y seleccion de anticuerpos unicamente de cadena pesada que comprede los pasos de:
(a) inyectar un antfgeno en el mairnfero transgenico como se describe en la presente;
(b) aislar una celula o tejido que expresa un anticuerpo unicamente de cadena pesada, espedfico del antfgeno de interes; y
(c) producir un hibridoma a partir de la celula o tejido del paos (b) y
(d) opcionalmente clonar el ARNm del anticuerpo unicamente de cadena pesada a partir de dicho hibridoma para la produccion posterior en un sistema de expresion heterologo como un sistema mamffero, vegetal, de insecto, microbiano, fungico o alternativo.
Los dominios de union Vh pueden entonces producirse identificando y aislando un dominio Vh espedfico del antfgeno a partir del ARNm clonado del paso c).
Los dominios de union Vh pueden productir tambien por:
a) inyectando un antfgeno en el mamffero transgenico descrito en la presente;
b) aislando una celula o tejido que expresa un anticeurpo unicamente de cadena pesada, espedfico del antfgeno de interes;
c) clonando el locus Vh a partir del ARNm derivado de la celula o tejido aislados;
d) mostrando la protema codificada usando un fago o biblioteca similar
e) identificando los dominios Vh espedficos del antfgeno; y
f) expresando los dominios Vh solos o como una protema de fusion en sistemas de expresion bacterianos, de levadura o alternativos.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Los presentes inventores han superado las limitaciones de la tecnica anterior y muestran que los animales transgenicos, en particular ratones, pueden ser generados utilizando “micro loci” para producir anticuerpos unicamente de cadena pesada de clase espedfica, o una mezcla de diferentes clases de anticuerpos unicamente de cadena pesada que se segregan por el plasma o las celulas B. Estos pueden ser utilizados o para generar un suministro de confianza de anticuerpos unicamente de cadena pesada de clase espedfica utilizando tecnologfa de hibridoma establecida o como unafuente de dominios de union Vh unicamente a cadena pesada, prefrentemente un dominio de union unicamente de cadena pesada Vh de origen humano, que estan libres de funciones efectoras pero que retienen la funcion de union.
Los anticuerpos unicamente de cadena pesada que pueden ser generados por el metodo de la invencion muestran una alta afinidad de union, dando lugar a transposiciones del segmento genico V, D y J y mutaciones somaticas, en general en ausencia de un bucle CDR3 ampliado. Se observo una maduracion de la celula B esencialmente normal con altos niveles del anticuerpo unicamente de cadena pesada presente en el plasma aislado (siempre que el dominio Ch1 se haya eliminado de todas las clases del anticuerpo presentes en el locus recombinante). La maduracion de la celula B y la secrecion de dfmeros montados (por ejemplo, IgG) o multfmeros (por ejemplo, IgM) no tiene ninguna dependencia en la presencia o expresion de los genes de cadena ligera.
El analisis de secuencias de nucleotidos de ARNm espedfico de antfgeno que codifica una cadena pesada espedfica de antfgeno aislada de hibridomas derivados de ratones transgenicos ha demostrado que la diversidad de anticuerpos de la cadena pesada es principalmente una funcion de la recombinacion VDJ. Ademas, los presentes inventores han mostrado que la diversidad de anticuerpos se genera en la region CDR3 del dominio de union a antfgeno funcional del anticuerpo solo de cadena pesada con una contribucion mas limitada de mutaciones somaticas en los dominios Vh. Usando los procedimientos descritos en el presente documento, los dominios Vh funcionales pueden clonarse y expresarse en sistemas bacterianos para generar dominios de union Vh con retencion completa de la union a antfgeno, especificidad y afinidad. Ademas, los dfmeros y multfmeros de la cadena pesada espedficos de clase pueden secretarse por lmeas celulares de hibridoma en cultivo.
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Se muestra que los ratones transgenicos pueden programarse para producir clases preferentes de anticuerpo unicamente de cadena pesada en respuesta al estimulo del antigeno, por ejemplo, IgG solo frente a IgM solo o, por ejemplo, mezclas de IgA, IgG y IgM.
Los inventores han descrito previamente (veanse los documentos WO02/085945 y WO02/085944) la generacion de ratones transgenicos que expresan una region constante de IgG humana minima del sitio de la cadena pesada que carece del exon Ch1 y ligada por segmentos D y J humanos con dos genes Vhh de llama. Esto produce anticuerpo solo de cadena pesada IgG funcional, de alta afinidad, espedfico de antfgeno cuando se expone a antigeno. Pueden obtenerse mezclas de clases de anticuerpos solo de cadena pesada (IgM e IgG) por cambio de clase in vivo mediante la utilizacion de constructos de genes que incorporan regiones constantes de la cadena pesada en tandem (a condicion de que todos los genes de la region constante carezcan de un dominio Ch1 y, cuando este presente, un dominio Ch4).
Las mejoras descritas en el presente documento muestran que un raton construido con el mismo sitio de la region constante de IgG ligado por segmentos de D y J humanos con dos genes Vhh de llama y un sitio de la region constante de IgM humana que carece de un exon Ch1 ligado por los mismos segmentos de genes D y J humanos con dos genes Vhh de llama tambien produce anticuerpo solo de cadena pesada IgM de alto peso molecular (multimerico) y anticuerpo solo de cadena pesada IgG (dfmero). Sorprendentemente, la maduracion de linfocitos B normales y la produccion de anticuerpos depende esencialmente de la ausencia completa de secuencias de Ch1 de cada region constante de la cadena pesada presente en el sitio transgenico. Ademas, no hay requisito para la eliminacion del exon Ch4 si esta presente.
Asi, por ejemplo, un animal transgenico que lleva un sitio de la cadena pesada de IgM humana con un exon CH1 funcional ligado por los mismos segmentos de genes D y J humanos a dos segmentos del gen V de llama, y region constante de IgG del sitio de la cadena pesada que carece del exon Ch1 ligado por los mismos segmentos de genes D y J humanos a dos segmentos del gen V de llama, produce niveles muy bajos de anticuerpo solo de cadena pesada y no muestra pruebas de maduracion de linfocitos B.
Otros dominios efectores, que incluyen el dominio Ch4, pueden incorporarse o no, segun se desee, para introducir en, o eliminar de, el anticuerpo solo de cadena pesada resultante, rasgos efectores.
Los inventores han encontrado que la expresion productiva de anticuerpo (es decir, maduracion de linfocitos B) puede resultar del uso de cualquier segmento del gen V presente en la construccion. El aislamiento y la secuenciacion de ARNm de anticuerpo derivado de linfocitos B muestran que la recombinacion de segmentos de los genes D y J se produce para generar diversidad de CDR3. La comparacion de secuencias de dominios Vh resultantes revela mutaciones somaticas, que indica que los eventos de maduracion por afinidad se han producido en los segmentos de los genes D y J recombinados y tambien en el dominio Vh del ARNm de anticuerpo expresado resultante.
Constructos preferidas incorporan segmentos del gen V seleccionado o manipulado para solubilidad mejorada y ligados a una agrupacion de cadenas de D y J para la recombinacion y generacion de CDR3. Preferentemente, las secuencias de VDJ estan ligadas a dominio(s) efector(es) constante(s) de eleccion en tandem, cada uno carente de un exon Ch1.
Los dominios Vh resultantes pueden no comprender un bucle CDR3 de tipo camelido ampliado. Esto da lugar a un dominio Vh que exhibe una diversidad CDR3 y una maduracion de afinidad operativamente unida a una region efectora constante. Esta ultima asegura la secrecion funcional y opcionalmente el conjunto en el raton parental.
Estas observaciones tienen importantes implicaciones para la derivacion mejorada y simplificada de los dominios Vh solubles de alta afinidad que se incorporan a la maduracion de afinidad mediante la mutacion somatica. Los dominios Vh pueden ser expresados solo en sistemas bacterianos u otros microorganismos o segregados por hibridomas o celulas transfectadas en el cultivo. Los dominios de union Vh de origen humano tienen amplias aplicaciones en el campo de la salud como medicinas, diagnosticos y reactivos, con aplicaciones agricolas, ambientales e industriales paralelas.
Las moleculas efectoras de cadena pesada pueden ser modificadas para estar libres de dominios funcionales, por ejemplo, los dominios carboxiterminal Ch4, siempre que la modificacion no afecte a los mecanismos secretores que evitan el conjunto de superficie celular y por consiguiente la maduracion de la celulas B. Los exones Ch1 solo se eliminan a partir del locus heterologo o se ausentan a partir del locus. Las caracteristicas adicionales pueden modificarse en el locus, por ejemplo para mejorar la glicosilacion, o anadir una funcion.
Preferentemente, el sitio heterologo, cuando se expresa, puede formar moleculas de IgA, IgE, IgG, IgD o IgM funcionales o isotipos de las mismas. Tambien pueden producirse clases de anticuerpos individuales o mezclas de clases de anticuerpos o isotipos de los mismos.
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Por consiguiente, el sitio de la cadena pesada heterologo se disena para producir clases preferidas o mezclas de anticuerpo solo de cadena pesada dependiendo del (de las) clase(s) de anticuerpo requerida(s), con esencialmente maduracion de linfocitos B normales. El uso de segmentos genicos V, D y J que comprende segmentos genicos V seleccionados al azar, o seleccionados para mejorar la solubilidad, producira anticuerpos funcionales unicamente de cadena pesada humana.
Los anticuerpos obtenidos en el metodo de la invencion tienen ventaja sobre los de la tecnica anterior en que son de basicamente cualquier clase unica o conocida de origen humano. Los anticuerpos que son de alta afinidad dan lugar a una combinacion de recombinacion VDJ y maduracion de afinidad in vivo. Los fragmentos de los mismos pueden ser aislados, caracterizados y producidos utilizando metodos bien establecidos conocidos por los expertos en la tecnica.
El sitio de la cadena pesada heterologo
En el contexto de la presente invencion, el termino 'heterologo' significa una secuencia de nucleotidos o un sitio como se describe en el presente documento que no es endogeno para el mairnfero en el que se localiza.
Un “sitio de la cadena pesada Vh” en el contexto de la presente invencion se refiere a un micro-sitio mmimo que codifica un dominio Vh que comprende uno o mas segmentos del gen V, uno o mas segmentos del gen D y uno o mas segmentos del gen J, operacionalmente ligados a una o mas regiones efectoras de la cadena pesada (careciendo cada una de un dominio Ch1). Preferentemente, la fuente primaria de variabilidad del repertorio de anticuerpos es la region CDR3 formada por la seleccion de segmentos de los genes D y J por las uniones V-D y D-J.
La ventaja de la presente invencion es que el repertorio de anticuerpos y la diversidad obtenida en las secuencias de genes de Vh reorganizadas pueden maximizarse mediante el uso de multiples segmentos de los genes D y J. La posterior mutacion somatica se logra mientras se usa un sitio mmimo (micro-sitio) sin la necesidad de un gran numero de segmentos del gen V o los sitios de inmunoglobulina Vl y Lc (cadena ligera).
Preferentemente, el sitio de la cadena pesada Vh comprende de dos a cinco (2, 3, 4 o 5) segmentos del gen V derivados de cualquier especie de vertebrado.
Los segmentos del gen V son de origen humano, opcionalmente seleccionados o manipulados para solubilidad mejorada.
Preferentemente, el sitio de la cadena pesada Vh comprende de dos a cuarenta (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30 o 40) o mas segmentos del gen D. (normalmente 25 segmentos del gen D).
Preferentemente, el sitio de la cadena pesada Vh comprende de dos a veinte (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20) o mas segmentos del gen J. (normalmente 6 segmentos del gen J).
Preferentemente, el sitio de la cadena pesada Vh comprende dos o mas segmentos del gen V, veinticinco segmentos del gen D humanos funcionales y 6 segmentos del gen J humanos.
El termino “segmento genico V” abarca un segmento genico V de origen natural derivado de un humano, que se ha seleccionado opcionalmente para mejorar caractensticas, tales como la solubilidad.
Procedimientos preferidos de mejora de la solubilidad de un dominio Vh incorporan medios racionales, a diferencia de solo aleatorios, y se ejemplifican en Davies y Reichmann, (1996) Protein Eng., 9 (6), 531-537 y Riechmann y Muildermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38. Tambien puede producirse seleccion natural in vivo mediante maduracion por afinidad y la incorporacion de mutaciones favorables en el gen Vh tras la reorganizacion VDJ.
El segmento del gen V debe ser capaz de recombinarse con un segmento del gen D, un segmento del gen J y una region constante de la cadena pesada (efectora) (que puede comprender varios exones, pero excluye un exon Ch1) segun la presente divulgacion para generar un anticuerpo solo de cadena pesada Vh cuando se expresa el acido nucleico.
Asf, secuencias codificantes de Vh pueden derivarse de una fuente que se produce naturalmente o pueden sintetizarse usando procedimientos familiares para aquellos expertos en la materia.
Un “dominio Vh” en el contexto de la presente invencion se refiere a un producto de expresion de un segmento del gen V cuando se recombina con un segmento del gen D y un segmento del gen J como se han definido anteriormente. Preferentemente, el dominio Vh como se usa en el presente documento sigue en disolucion y es activo en un medio fisiologico sin la necesidad de ningun otro factor para mantener la solubilidad.
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Preferentemente, la capacidad del dominio Vh soluble para unirse a antigeno se ha mejorado por recombinacion VDJ y mutacion somatica. No hay dependencia de la presencia o ausencia del bucle CDR3 alargado peculiar a las especies de camelido. El dominio Vh puede unirse a antfgeno como un monomero y, cuando se combina con regiones efectoras constantes, puede producirse en formas mono-espedficas, bi-espedficas, multi-espedficas, bi- valentes o multivalentes, dependiente de la eleccion y manipulacion de las moleculas efectoras usadas (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, etc.) o mecanismos alternativos de dimerizacion y multimerizacion. Cualquier probabilidad de union con un dominio Vl cuando se expresa como parte de un complejo de anticuerpo solo de cadena pesada soluble se ha eliminado por eliminacion del exon Ch1 (vease Sitia y col., (1990) Cell, 60, 781-790). El dominio Vh solo tambien puede manipularse con diversos dominios de protema para producir protemas de fusion para fin terapeutico y de diagnostico diana, por ejemplo, con toxinas, enzimas y agentes de obtencion de imagenes.
El locus heterologo de cadena pesada comprende una region de ADN que codifica una region constante de cadena pesada que proporciona funciones efectoras in vivo (por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD o isotipos de las mismas).
La region constante de la cadena pesada
Operacionalmente, una region constante de cadena pesada se codifica por un segmento genico de origen natural o modificado que es capaz de recombinarse con un segmento genico V, un segmento genico D y un segmento genico J en una celula B. Preferentemente, la region constante de cadena pesada se deriva a partir del locus de inmunoglobulina.
Cada region constante de la cadena pesada comprende esencialmente al menos un gen de la region constante de la cadena pesada, que se expresa sin un dominio Ch1 funcional de manera que pueda producirse la generacion de anticuerpo solo de cadena pesada. Cada region constante de la cadena pesada tambien puede comprender uno o mas exones de la region constante de la cadena pesada adicionales, que estan seleccionados del grupo que consiste en C8, Cyi-4, C|i, Ce y Ca-i-2 con la condicion de que los genes de la region constante de la cadena pesadas adicionales tampoco expresen un dominio CHlfuncional. Los segmentos de genes de la region constante de la cadena pesada se seleccionan dependiendo de la clase preferida o mezcla de clases de anticuerpos requeridas. Opcionalmente, el sitio de la cadena pesada heterologo es deficiente en C|i y C8.
Por ejemplo, se conocen moleculas de Ig de clase M por desempenar una funcion importante en la activacion de macrofagos y la ruta del complemento. Debido a la estrecha proximidad de sus sitios de union, IgM tiene una alta avidez por patogenos, que incluyen virus. Sin embargo, tambien se sabe que IgM es diffcil de usar en tecnicas de inmunoensayo rapidas mientras que la Ig de la clase G puede usarse facilmente en estas tecnicas. Para tales usos sena util seleccionar la clase de anticuerpo preferido, es decir, IgG o IgM.
La expresion de todo o parte de un sitio Cy de la cadena pesada heterologo que carece de Ch1 producira opcionalmente algunos o todos los isotipos de IgG, dependiente de los isotipos de IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 presentes en el sitio de IgG heterologo. Alternativamente, las cadenas pesadas pueden comprender genes Ce. La molecula de IgE resultante tambien podna usarse en terapia.
Alternativamente, pueden obtenerse mezclas de anticuerpos seleccionadas. Por ejemplo, IgA e IgM pueden obtenerse cuando la region constante de la cadena pesada comprende un gen Ca y C|i.
La region constante de la cadena pesada puede ser de origen humano, en particular cuando el anticuerpo de la cadena pesada va a usarse para aplicaciones terapeuticas en seres humanos. Cuando los anticuerpos de la cadena pesada van a usarse para fines de diagnostico o veterinarios, la region constante de la cadena pesada se deriva preferentemente del organismo diana, vertebrado o mamffero en o sobre el que va a realizarse la terapia de diagnostico o veterinaria.
Cuando se expresa, la region constante de la cadena pesada carece de un dominio Ch1 funcional. El exon Ch1 y, opcionalmente, las regiones constantes C|i y C8, pueden mutarse, delecionarse o sustituirse. Preferentemente, el exon Ch1 esta delecionado. La presencia, por ejemplo, de IgM con un dominio Ch1 funcional inhibe la maduracion de linfocitos B y, por consiguiente, limita la expresion productiva de IgG de solo cadena pesada (que carece de Ch1) dentro del mismo sitio, ya que se inhibe la maduracion de linfocitos B.
Un 'exon de la region constante de la cadena pesada ' ('exon Ch') como se define en el presente documento incluye las secuencias de vertebrado que se producen naturalmente, pero especialmente de exones Ch de mairnfero. Esto varia de un modo espedfico de clase. Por ejemplo, IgG e IgA carecen naturalmente de un dominio Ch4. El termino 'exon Ch' tambien incluye dentro de su alcance derivados, homologos y fragmentos del mismo en tanto que el exon Ch pueda formar un anticuerpo funcional de solo cadena pesada como se define en el presente documento cuando es un componente de una region constante de la cadena pesada.
Opcionalmente, cuando esta presente, el dominio funcional Ch4 u otros dominios funcionales pueden
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manipularse o delecionarse dentro del transgen dado que un procedimiento tal no inhibe el proceso secretor intracelular, la maduracion de linfocitos Bo la actividad de union del polipeptido de anticuerpo resultante.
Ratas
El mairnfero transgenico usado en los metodos de la invencion es una rata.
Preferentemente, se generan ratas transgenicas utilizando tecnolog^a de inyeccion de ovocitos establecida, y si esta establecida, tecnolog^a o clonacion de celulas ES.
Ventajosamente, los loci endogenos de cadena pesada de inmunoglobulina y opcionalmente de cadena ligera de la rata se eliminan o se silencian cuando se expresa un anticuerpo unicamente de cadena pesada segun los metodos de la invencion.
Este enfoque de generar anticuerpos unicamente de cadena pesada como se ha descrito anteriormente puede ser de uso particular en la generacion de anticuerpos para el uso terapeutico humano ya que frecuentemente la administracion de anticuerpos a una especie de vertebrado que es de origen diferente a la fuente de anticuerpos da lugar a la aparicion de una respuesta inmune contra aquellos anticuerpos administrados.
La rata transgenicoa puede ser modificada para tener una capacidad reducida para producir anticuerpos que incluyen cadenas ligeras.
Las celulas que producen anticuerpos pueden derivarse de ratas transgenicas segun la presente invencion y utilizarse, por ejemplo, en la preparacion de hibridomas para la produccion de anticuerpos unicamente de cadena pesada como se ha definido anteriormente. Ademas, o alternativamente, las secuencias de acido nucleico pueden ser aisladas a partir de ratas transgenicas segun la presente invencion y utilizadas para producir anticuerpos unicamente de cadena pesada del domino Vh o complejos bi funcionales / bi - espedficos de los mismos, utilizando tecnicas de ADN recombinante que son familiares para los expertos en la tecnica.
Alternativa o adicionalmente, los anticuerpos unicamente de cadena pesada espedficos del antfgeno pueden generarse por inmunizacion de una rata transgenica de acuerdo con la presente invencion.
Asf, en un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para la produccion de anticuerpos unicamente de cadena pesada inmunizando una rata transgenica de acuerdo con la presente invencion con un antfgeno.
Anticuerpos unicamente de cadena pesada y fragmentos de los mismos.
El dominio de union unicamente a cadena pesada espedfico de un antfgeno, es decir, dominio de union Vh, se expresa por el locus Vh como resultado de la recombinacion entre los segmentos genicos V, D y J seguido posteriormente por la mutacion somatica. Segun la invencion, los loci Vh pueden ser clonados a partir de, por ejemplo, ARNm aislado a partir de una celula que produce un anticuerpo de un raton transgenico inmunizado segun se describe anteriormente. Las secuencias clonadas pueden a continuacion expresarse utilizando un fago (Ward et al., (1989) Nature, 341, 544 - 546) o bibliotecas de expresion similares, por ejemplo utilizando sistemas basados en levaduras (Boder and Wittrup, (1997) Nat. Biotechnol., 15, 553 - 7) y dominios de union Vh espedficos al antfgeno identificados. Los dominios de union a cadena pesada espedficos de un antfgeno pueden luego ser producidos solos o como protemas de fusion en sistemas de expresion bacterianos, de levaduras o alternativos. Las secuencias que codifican los dominios de union Vh pueden ser tambien clonadas a partir de hibridomas caracterizados derivados por procedimientos clasicos de ratones transgenicos inmunizados. Estos pueden utilizarse para producir dominios de union Vh y derivados de los mismos que incluyen la modificacion de clases de anticuerpos definidos (por ejemplo, IgE o IgA) y variantes de los mismos con diferentes funciones efectoras.
Por consiguiente, la invencion tambien proporciona un metodo para producir un dominio de union Vh que comprende los pasos de:
a) aislar una celula o tejido que expresa un anticuerpo unicamente de cadena pesada espedfico del antfgeno de interes (preferiblemente un anticuerpo unicamente de cadena pesada espedfico del antfgeno de interes) ;
b) clonar la secuencia que codifica el dominio de union Vh a partir del ARNm derivado de la celula o tejido aislados;
c) mostrar la protema codificada usando un fago o biblioteca similar
d) identificar los dominios Vh espedficos del antfgeno; y
e) expresar los dominios Vh solos o como una protema de fusion en sistemas de expresion bacterianos, de levadura o alternativos.
Alternativamente, los fragmentos que contienen el dominio Vh pueden generarse a partir de anticuerpos
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unicamente de cadena pesda de la invencion usando tecnologfa de escision enzimatica o qmmica y la separacion posterior del fragmento que contiene el dominio Vh de otros productos de la escision.
Cuando el dominio de union Vh se afsla a partir de un hibridoma caracterizado, la secuencia del dominio de union Vh clonada derivada de ARNm puede ser directamente clonada en un vector de expresion sin recurrir a las etapas de seleccion adicional utilizando sistemas de expresion en fago y otros de expresion.
Los sistemas de produccion para anticuerpos unicamente de cadena pesada que incorporan regiones efectoras incluyen celulas mairnferas en cultivo (por ejemplo celulas CHO), vegetales (por ejemplo mafz, cabras transgencias, conejos, ganado, oveja, pollos y larvas de insectos para tecenologfa de crianza masiva. Otros sistemas de produccion, incluyendo infeccion vmca (por ejemplo baculovirus en larvas de insecto y lmeas celulares) son alternativas al cultivo celular y enfoques de lmea germinal. Tambien seran familiares otros metodos de produccion para los expertos en la tecnica. Cuando hay un requisito para ensamblaje de Iga o IgM de unicamente cadena pesada, la co-expresion de una "cadena J" es beneficiosa. Se conocen en la tecnica metodos adecuados de produccion de dominios unicamente de union Vh. Por ejemplo, se han producido dominios de union Vh de camelido en sistemas bacterianos y se han producido homodfmeros unicamente de cadena pesada de camelido en hibridomas y celulas de mamnfero transfectadas (vease Reichmann and Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25 -38).
Los metodos tambien estan bien establecidos para la expresion de los dominios de union Vh humanos modificados derivados utilizando tecnologfa de expresion en fago (Tanha et al., (2001) J. Biol. Chem., 276, 24774 - 24780 y referencias en el mismo).
Se ha demostrado que las larvas de insectos de lmeas de moscas transgenicas producen fragmentos funcionales de anticuerpo unicamente de cadena pesada en la hemolinfa con caractensticas indistinguibles del mismo anticuerpo producido por celulas de mamnfero (PCT / GB2003 / 0003319).
Un anticuerpo unicamente de cadena pesada producido por el metodo de la invencion o un fragmento del mismo como se describe en la presente puede usarse como un reactivo de union intracelular, o un aczima.
Un anticuerpo de cadena unica espedfico del antfgeno o dominio de union Vh producido de acuerdo con el metodo de la invencion puede ser utilizado como un inhibidor de la enzima o un bloqueador del receptor.
Un dominio Vh fusionado a una molecula efectora puede ser utilizado como un terapeutico, agente de formacion de imagenes, diagnostico, abzima o reactivo.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1: muestra la estrategia para la generacion de ratones transgenicos que expresan un locus de IgG y la generacion funcional de anticuerpos unicamente de cadena pesada y dominios Vh como resultado del estfmulo de un antfgeno.
La Figura 2: muestra la estrategia para la generacion de ratones transgenicos que expresan un locus de IgM y la generacion funcional de anticuerpos unicamente de cadena pesada y dominios Vh como resultado del estfmulo de un antfgeno.
La Figura 3: muestra la estrategia para la generacion de ratones transgenicos que expresan un locus de IgA y la generacion funcional de anticuerpos unicamente de cadena pesada y dominios Vh como resultado del estfmulo de un antfgeno.
La Figura 4: Alineamiento de secuencia de los productos PCR obtenidos a partir del ADNc de medula osea utilizando cebadores Vhh1 y Vhh2 en combinacion con el cebador Cy2 humano a partir de ratones que contienen un locus con regiones constantes que tienen una mutacion de corte y empalme de camelido para eliminar CH1. Los resultados muestran que CH1 no se elimina.
Figuras 5 - 8: Estructura de constructos de VH / VH de camelido (VHH). 1 - n corresponde a cualquier numero de genes VH, o segmentos D o J. El complemento normal del locus humano es de 51 genes V, 25 segmentos D funcionales (mas 2 no funcionales) y 6 segmentos J. En caso de una region C|j (para IgM) o Ce (para IgE) no hay region H y hay un exon CH4 adicional entre CH3 y M1. El (los) gen (es) VH se han mutado para proporcionar solubilidad segun se describe en el dominio publico. Los genes VH, segmentos D y J y exones C son preferentemente humanos, pero podnan ser de cualquier otra especie que incluye camelidos. En este ultimo caso, los genes VH de camelido (VHH) no se mutanan ya que son naturalmente solubles.
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Figura 9: Programa de inmunizacion del raton y ensayo de anticuerpo para la generacion de IgG unicamente de cadena pesada contra HSP70 de E. coli.
Figura 10: Analisis de citometna de flujo y resultados de inmunohistoqmmica para celulas de bazo derivadas de ratones transgenicos.
Figura 11: Resultados del analisis ELISA de ratones transgenicos inmunizados con DKTP y analisis de secuencias de biblioteca de anticuerpos resultante.
Figura 12: Ejemplos de mutaciones somaticas y transposicion de VDJ observada en ratones transgenicos inmunizados.
Figura 13: Resultados del ensayo de inmunotincion en la lmea celular Tet - on transfectada con el plasmido de respuesta que contiene el anticuerpo A5.
Figura 14: Resultados del analisis de transferencia Western de sueros de las lmeas de raton transgenico.
Figura 15: Fraccionamiento del tamano de IgM humana mezclada con IgM de cadena unica humana producida por el locus de IgM mas IgG de ratones.
Figura 16: Resultados del analisis de ELISA de anticuerpos IgM y IgG de cadena unica producidos contra TNFa humano.
Tecnicas generales
A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comunmente es entendido por un experto habitual en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genetica molecular, qmmica de acidos nucleicos, tecnicas de hibridacion y bioqmmica). Se usan tecnicas convencionales para procedimientos moleculares, geneticos y bioqmmicos (vease generalmente Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a ed., John Wiley & Sons, Inc.) y procedimientos qmmicos. Ademas, Harlow & Lane, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y, se refieren a tecnicas inmunologicas convencionales.
Cualquier tecnica de ADN recombinante adecuada puede usarse en la produccion de los complejos de polipeptido bi- y multi-valente, anticuerpos de cadena pesada individuales y fragmentos de los mismos, de la presente invencion y divulgacion. Se construyen vectores de expresion tfpicos, tales como plasmidos, que comprenden secuencias de ADN que codifican cada una de las cadenas del complejo de polipeptido o anticuerpo. Puede usarse cualquier tecnica establecida adecuada para fragmentacion enzfmica y qmmica de inmunoglobulinas y separacion de fragmentos resultantes.
Vectores de expresion adecuados que pueden usarse para clonar en sistemas bacterianos incluyen plasmidos, tales como Col E1, pcR1, pBR322, pACYC 184 y RP4, ADN de fago o derivados de cualquiera de estos.
Para su uso en clonacion en sistemas de levadura, vectores de expresion adecuados incluyen plasmidos basados en un origen de 2 micrometres.
Cualquier plasmido que contenga una secuencia promotora de genes de mairnfero apropiada puede usarse en clonar en sistemas de mamffero. Pueden usarse secuencias promotoras de insecto o baculovirales para la expresion genica de celulas de insecto. Tales vectores incluyen plasmidos derivados de, por ejemplo, pBR322, virus del papiloma bovino, retrovirus, virus de ADN y virus de la variolovacuna.
Celulas huesped adecuadas que pueden usarse para la expresion del complejo de polipeptido o anticuerpo incluyen bacterias, levaduras y celulas eucariotas, tales como lmeas celulares de insecto o de mamffero, plantas transgenicas, insectos, sistemas de expresion en mamffero y en otros invertebrados o vertebrados.
Ejemplo 1
En experimentos preliminares, ratones transgenicos se prepararon para expresar un sitio de la cadena pesada en el que dos exones Vhh de llama se ligaron a los segmentos de diversidad (D) y union (J) de la cadena pesada humana, seguido de los genes de la region constante humana C|i, C8, Cy2, Cy3 y 3' LCR de inmunoglobulina de la cadena pesada humana. Los genes Cy2 y Cy3 humanos contuvieron una mutacion de corte y empalme de G a A. La presencia del sitio Frt permitio la generacion de un raton transgenico de unica copia de una matriz de transgenes de multiples copias por recombinacion mediada por Flp. Sin embargo, secuencias del sitio transgenico con una mutacion de corte y empalme de G a A mostraron corte y empalme anomalo, pero eliminacion
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de Ch1 incompleta (Figura 9).
Constructos
Para vencer este problema, una biblioteca de cosmidos genomica se cribo para clones que conteman los genes de Vh usando procedimientos convencionales. Una (o mas) Vh de la lmea germinal diferentes se eligieron al azar basandose en su secuencia (cinco clases de generos en el caso de Vh humana). Se introdujeron codones de aminoacidos hidrofilos en las posiciones 42, 49, 50 y 52 segun la numeracion de IMGT (Lefranc y col. (1999)). Los genes de Vh se combinaron en un vector BAC mediante procedimientos convencionales tales como clonacion directa usando ligadores preparados a medida o recombinacion homologa.
Se seleccionaron dos clones de la biblioteca de Pac genomica humana RPCI-11 (BACPAC Resource Center, EE.UU.): clon 1065 N8 que contiene segmentos D y J de la cadena pesada humana, C|i (IgM) y C8 (IgD) y clon 1115 N15 que contiene los genes Cy3 (IgG3). El clon de Bac 11771 de una biblioteca genomica humana diferente (Incyte Genomics, CA, EE.UU.) se uso como fuente del gen Cy2 (IgG2) y la LCR de la cadena pesada de la inmunoglobulina (Mills y col. (1997) J. Exp Med., 15;186(6):845-58).
Usando tecnicas convencionales, los genes Cy3 y Cy2 se subclonaron por separado en el vector pFastBac (Invitrogen). Similarmente, cualquiera de las otras regiones constantes de Ig puede clonarse a partir de estos BAC (IgA, IgE). Se logro una delecion completa del exon Ch1 por recombinacion homologa (Imam y col. (2001)) usando secuencias que flanquean el exon Ch1 de cada region constante. Un sitio frt podna introducirse opcionalmente enfrente de la region de cambio de C|i para permitir la generacion de sitios de una unica copia de sitios de multiples copias mediante tratamiento con flp recombinasa in vivo por medios convencionales, por ejemplo, cruzando con ratones rosa-flp (Figura 10).
Los genes de Vh separados, segmentos D y J y exones C y LCR se clonaron en un BAC tanto por digestion por restriccion convencional y ligaciones como por recombinacion homologa (o una mezcla de ambos) o cualquier otra tecnica de clonacion.
Entonces pudieron crearse mas constructos.
Sitio solo de IgM
Con el fin de obtener la constructo de IgM (Figura 6), uno o mas genes de Vh (preferentemente genes de Vh humanos manipulados para proporcionar solubilidad o genes de Vhh de camelido), seguido de segmentos de la cadena pesada de D y J humana y C|i, se clonaron en un BAC. Para la metodologfa vease anteriormente. En este caso, solo la region C|i se clono en el BAC final.
Sitio de IgM mas IgG (CS es opcional)
Con el fin de obtener la constructo de IgM mas IgG (Figura 7), uno o mas genes de Vh (preferentemente segmentos de Vh humanos manipulados para proporcionar solubilidad o genes de Vhh de camelido), seguido de segmentos de la cadena pesada de D y J humana, C|i (sin Ch1 pero con el exon Ch4), (opcional CS) y los genes Cy2 y Cy3 humanos modificados y 3' LCR se clonaron en un BAC. Con el fin de generar un sitio de solo IgG, sitios loxP se introdujeron durante las etapas de clonacion estandar (descritas anteriormente) y el BAC se cultiva en la cepa de E. coli294 Cre (Buscholz y col.) y la recombinacion mediada por cre da bacterias que producen un sitio de solo IgG. Para mas detalles de la constructo vease anteriormente.
Sitio de IgM mas IgG (CS es opcional)
Con el fin de obtener la constructo de IgM mas IgG (Figura 8), uno o mas genes de Vh (preferentemente genes de VH humanos manipulados para proporcionar solubilidad o genes de VHH de camelido), seguido de segmentos de la cadena pesada de D y J humana, C|i (con Ch1 y Ch4) (opcional CS) y los genes Cy2 y Cy3
humanos modificados y 3' LCR se clonaron en un BAC. Con el fin de generar un sitio de solo IgG, sitios loxP se introdujeron durante las etapas de clonacion estandar (descritas anteriormente) y el BAC se cultivo en la cepa de E. coli 294 Cre (Buscholz y col.) y la recombinacion mediada por cre dio bacterias que producen un sitio de solo IgG.
Ratones transgenicos, cria y genotipado
El BAC final se introdujo en ratones transgenicos por microinyeccion convencional de ovulos fecundados o mediante tecnologfa de transfeccion embrionaria de citoblastos.
Se comprobaron sitios transgenicos para integridad y numero de copias por analisis de transferencia Southern de ADN de cola (Southern 1975) usando sondas para sitios del extremo 5' y 3'. Los que resultaron
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positivos se criaron como lmeas en el nivel inicial |iMT-/-. El genotipado se hizo por analisis por PCR convencional usando cebadores para cada una de las regiones diferentes del sitio. El analisis de secuencias de los productos de RT-PCR derivados de ADNc de BM de ratones transgenicos en los que el exon Ch1 entero de tanto Cy2 como Cy3 se ha^a delecionado (uno con (lmeas HLL) y uno sin los genes C|i y C8), mostro que los sitios transgenicos no solo son capaces de recombinacion VDJ, sino que los transcritos de IgG se parecen a aquellos encontrados en HCAb de llama y camello.
Inmunohistoqmmica
Los bazos se incorporaron en compuesto OCT. Secciones de criostato de 5 |im congeladas se fijaron en acetona y se marcaron una o dos veces como se ha descrito previamente (Leenen y col. 1998). Se aplicaron anticuerpos monoclonales anti B220/RA3-6B2, anti-CD11c/N418 (Steinman y col., 1997), como sobrenadantes de cultivo de hibridomas. IgG anti-humana e IgM anti-humana de cabra acoplada a peroxidasa fueron de Sigma. Los reactivos de la segunda etapa fueron Ig anti-rata (DAKO, Glostrup, Dinamarca) o Ig anti-hamster (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) de cabra marcadas con peroxidasa e Ig anti-rata de cabra- fosfatasa alcalina (Southern Biotechnology, Birmingam, AL, EE.UU.).
La Figura 10 muestra el analisis inmunohistoqmmico de secciones de bazos congeladas de 5 |im de ratones transgenicos |iMT'/_, WT y HLL y HLL-MD en el nivel inicial |iMT'/_. Se tineron secciones con anti-B220 (azul) para linfocitos B y anti-CD11c/N418 (marron) para celulas dendnticas. Las flechas indican la localizacion de pequenas agrupaciones de linfocitos B.
Analisis de citometria de flujo
Se prepararon suspensiones de una unica celula a partir de organos linfoides en PBS, como se ha descrito previamente (Slieker y col. 1993). Aproximadamente 1x106 celulas se incubaron con anticuerpos en PBS/ 0,5% de albumina de suero bovino (BSA) en placas de 96 pocillos durante 30 min a 4 °C. Las celulas se lavaron dos veces en PBS/0,5% de BSA. Para cada muestra, 3x104 eventos se puntuaron usando un analizador FACScan (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Los datos de FACS se analizaron usando el software informatico CellQuest version 1.0. Se realizo analisis de cuatro colores en un Becton Dickinson FACS Calibur. Se obtuvieron los siguientes mAb de BD Pharmingen (San Diego, CA): anti B220-RA3-6B2 conjugado con FITC, anti-CD19 conjugado con PE. Los datos de barrido de FACS de celulas del bazo tenidas con anti-CD19 y anti-B220 se muestran en el panel inferior de la Figura 10.
A la izquierda de la figura esta una representacion de la recombinacion de Flp in vivo cruzando lmeas HLL con una lmea transgenica FlpeR y datos de barrido de FACS de apoyo de celulas del bazo de la recombinante, que muestran rescate de linfocitos B como se observa en las lmeas HLL-MD originales directamente generadas. A la derecha esta una representacion de recombinacion de Cre in vivo cruzando con la lmea transgenica de Cre Cag y datos de FACS de celulas del bazo de la recombinante de una unica copia.
Inmunizacion y produccion de hibridomas (Figura 9)
Se crearon ratones transgenicos que conteman un sitio de anticuerpo solo de cadena pesada que consistfa en dos dominios Vhh de llama, regiones D y J humanas e IgG2 y 3 regiones constantes (sin un dominio Ch1). Ratones de 8 semanas de edad se inmunizaron con cualquier protema 70 de choque termico de E. coli (hsp70). Se inyectaron 20 |ig o 5 |ig de antfgeno con adyuvante Specol (IDDLO, Lelystadt, NL) respectivamente s.c. en los dfas 0, 14, 28, 42 e i.p. en el dfa 50. La sangre se recogio en el dfa 0, 14 y 45. Despues de tres refuerzos se detecto un tftulo bajo de anticuerpos espedficos para antfgeno en 1 de los 3 ratones HLL-MD inmunizados con Hsp70 (Figura 9).
Se realizo una fusion de celulas del bazo convencional con una lmea de celulas de mieloma para generar un anticuerpo monoclonal que produda una lmea celular de hibridoma monoclonal contra la protema hsp70. El HCAb anti-HSP 70 consiste en el segmento de Vhh de llama mas proximo a la region D (Vhh2) recombinada con el segmento IgHD3-10 humano (num. de acc. X13972) y el segmento IgHJ4-02 humano (num. de acc. X86355). Aunque no a alta frecuencia, los VHH tienen algunas mutaciones que dan lugar a las alteraciones de aminoacidos observadas en la Figura 4A cuando se compara con la configuracion de la lmea germinal. El analisis de RT-PCR tambien mostro solo un transcrito de IgH productivo en el hibridoma, sugiriendo que no se han hecho otros transcritos. El anticuerpo IgG2 aHSP70 es secretado como dfmero de solo cadena pesada (transferencias Western bajo condiciones de gel desnaturalizante (dfmero) y gel no desnaturalizante (monomero) Fig. 9). Las celulas del bazo se fusionaron con celulas de mieloma Sp2-O-Ag14 (donacion de R. Haperen) en el dfa 56 usando un kit ClonalCellTM-HY (StemCell Technologies, RU) segun las instrucciones del fabricante.
Ratones transgenicos que contienen un sitio de anticuerpo solo de cadena pesada que consiste en dos dominios Vhh de Ilama, regiones D y J humanas, una IgM e IgG2 humana y 3 regiones constantes (todas sin un dominio Ch1, Figura 7) se inmunizaron con TNFa para obtener anticuerpos HC-IgM. Uno de los tres ratones mostro
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sueros positivos en ensayos de ELISA convencionales. Una fusion de mieloma convencional dio un hibridoma de IgM positivo (Figura 11). Despues de la filtracion en gel sobre Sepharose 6B bajo condiciones no reducidas, cada fraccion de la columna se cargo a un gel bajo condiciones reductoras y se detecto por a-IgM humana-HRP (Figura 15). El fraccionamiento bajo condiciones no reductoras mostro que la HC-IgM es secretada como anticuerpo multimero con el mismo tamano que una IgM de control humano (despues de la resta del peso molecular de cadenas ligeras y el dominio Ch1 que estan ausentes de HC-IgM). El fraccionamiento del gel de cada fraccion de columna bajo condiciones reductoras mostro el monomero esperado de (Fig. 15).
ELISA de Ig en suero
Sangre de ratones de 15-25 semanas de edad se recogio en tubos recubiertos con EDTA, se centrifugo durante 15' a temperatura ambiente (TA) y el sobrenadante se diluyo 1:5 en PBS. Una placa de 96 pocillos se recubrio durante 2 h con 5 mg/ml de una IgG anti-humana de cabra (YES Biotechnology) o una IgM anti-humana de cabra (Sigma), se lavo con PBS, se bloqueo durante 1 h a TA con disolucion de bloqueo (1,5% de BSA/1,5% de leche en polvo/0,1% de Tween 20/PBS) y se lavo tres veces con PBS. Las series de dilucion de muestras de suero y patrones (IgG2 humana o IgM humana (Sigma, Zwijndrecht, NL)) se cargaron y se incubaron durante 2-4 h y las placas se lavaron 6 veces con PBS antes de la adicion de un anticuerpo secundario (IgG anti-humana de cabra diluida 1:2000 o IgM anti-humana de cabra acoplada a HRP (Sigma, Zwijndrecht, NL)). Todas las diluciones se hicieron en una disolucion de bloqueo. Despues de 1-2 h de incubacion a TA y lavado en PBS se anadio sustrato POD (Roche).
El ELISA para la deteccion de sdAb solubles espedficos para antfgeno de la biblioteca de fagos de IgG2 se muestra en la Figura 16. Se usaron sdAb solubles como anticuerpos primarios sobre placas recubiertas de antfgeno, seguido de anticuerpo a-myc de raton y anticuerpo a-raton de cabra conjugado con HRP. Se uso POD como sustrato. El panel inferior muestra huella genetica de clones con enzima de restriccion Hinf I, que muestra 5 insertos diferentes que codifican sdAb contra B. pertussis.
Construccion y cribado de bibliotecas de anticuerpos
Se aislo ARN total de bazos de ratones solo de IgG de una unica copia inmunizados con DKTP (Figura 12 despues de tratamiento con cre) usando un sistema de aislamiento de ARN Ultraspec (Biotecx Laboratories Inc, Houston, Texas, EE.UU.). Se preparo ADNc usando oligo dT. Fragmentos de ADN que codifican fragmentos de VHHDJ se amplificaron por pCr usando cebadores espedficos: cebador vh1 back Sfi I (Dekker y col. 2003) en combinacion con el cebador hIgG2hingrev (5'-AATCTGGGCAGCGGCCGCCTCGACACAACATTTGCGCTC-3'). Los VHHDJ amplificados (- 400 pb) se digirieron con Sfi I / Not I, se purificaron en gel y se clonaron en vector de fagemido digerido con Sfi I / NotI pHEN-1.
La transformacion en celulas electro-competentes TG1 dio biblioteca de anticuerpos de un unico dominio humano. Se realizaron dos rondas de seleccion usando inmunopurificacion sobre antfgenos de vacuna adsorbidos sobre plastico (inmunotubos recubiertos con vacuna sin diluir). El analisis y la secuenciacion de restriccion fueron convencionales.
RT-PCR de sitio solo de la cadena pesada
Entonces se investigo si el sitio HLL-MD funciona o no como sitio normal en la produccion de un diverso repertorio de anticuerpos secuenciando los productos de RT-PCR obtenidos usando cebadores espedficos de IgG2 e IgG3 sobre ADNc de parches de Peyer. La Figura 17 muestra algunos ejemplos de mutaciones somaticas de clones de ratones no inmunizados (panel izquierdo) y ratones inmunizados (panel derecho). Los ratones fueron sitios solo de IgG, hsp70 de E. coli inmunizada, lisado de Pertussis, toxoide tetanico. En sombra gris esta la region bisagra de IgG2 que empieza con ERKCCV.
Aunque, el analisis por RT-PCR sobre parches de Peyer mostro que se usan ambos Vh, todos los anticuerpos secuenciados reorganizaron Vh2. La fuente de variabilidad del repertorio es la region CDR3 formada por la seleccion de segmentos D y J y por las uniones V-D y D-J. El uso de segmentos J humanos es similar al observado en transposiciones humanas, usandose casi siempre los segmentos JH4 y JH6 .
Este analisis mostro que ambas Vh, diferentes segmentos de D humanos y todos los de J humanos se usan, para contribuir a un diverso repertorio de anticuerpos. Tambien mostro la presencia de linfocitos B cambiados a IgG3 y la aparicion de mutaciones somaticas por comparacion de cada gen reorganizado con su lmea germinal homologa, es decir, el Vh original en la construccion transgenica (vease la Figura 12). Por tanto, el receptor de antfgeno IgG solo de cadena pesada humana puede proporcionar las senales necesarias para la maduracion de linfocitos B.
Inmunotincion
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65
La Figura 13 muestra los resultados de inmunotincion de una lmea celular Tet-on adicionalmente transfectada con el plasmido de respuesta que contiene anticuerpo A5 (Dekker y col. 2003). El panel superior muestra produccion inducida por doxiciclina de anticuerpo A5 (rojo) en citoplasma y tincion nuclear de las celulas con DAPI (azul). El panel inferior muestra que celulas que expresan rtTA en el nucleo son las que producen A5 tras la induccion (panel superior). La tincion se hizo con uno de HCAb humano contra rtTA (verde) con la secuencia mostrada a continuacion. La IgG anti-humana de cabra conjugada con FITC se uso como etapa secundaria. A5 se detecto como se describe previamente por Dekker y col. 2003. El anticuerpo rTTA fue una IgG3 con la siguiente secuencia:
241 AGACTCT 80 R L
301 CCTGTGCAGCCTCTGGAAGCATCTTCAGTATCAATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTC 100S C A A S G S1F SINAMGWYRQA
361 CAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAGCTATTACTAGTGGTGGTAGCACAAGGTATGCAG 120 P G KQ R E L V A A .1 T S GGS T R YA
421 ACTCCGTGAAGGGCCG ATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGC HOD SVKGRFTISRDNAKNTVY'L 481 AAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTTTGATCTCTATGGTTC 160Q MN S L K P E D TAVYYCL I S MV
541 GGGGAGCCCGTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGAGCTCA 180R G A RFDYWGQG TL VTVSSE L 601 AAACCCCACTT 200 K T P L
La bisagra IgG3 empieza en el aminoacido 198 ELKTPL. Para comparacion vease la region bisagra de IgG2 en la Figura 12.
Analisis de transferencia Western
La Figura 14 muestra transferencias Western de sueros de diferentes lmeas de raton transgenico que contienen el sitio IgM mas IgG (Figura 5) despues de tratamiento con cre (es decir, IgM delecionado, solo queda IgG). Se purificaron sueros por prot G y se fraccionaron en gel bajo condiciones reductoras (Figura 14, panel derecho) y no reductoras (Figura 14, panel izquierdo). Los controles fueron los ratones KO de referencia y una muestra de suero humano normal. Observese la diferencia de tamano entre los dos geles que muestran que IgG solo de cadena pesada humana es un dfmero.
La senal mostrada en la Figura 14 se detecto con un anticuerpo dirigido contra IgG humana mediante procedimientos convencionales.
Fraccionamiento por tamano de IgM humana producida por el sitio de IgM mas IgG de raton
El suero de los ratones IgM mas IgG (Figura 8) se fracciono por filtracion en gel bajo condiciones no reductoras despues de mezclar con una muestra de suero humano como control. Los resultados se muestran en la Figura 15. Los pesos moleculares de los complejos sobre la columna disminuyen con cada carril (que representan cada fraccion) de izquierda a derecha. Las fracciones (cada carril) se analizaron por electroforesis en gel bajo condiciones reductoras.
Se realizaron analisis de ELISA en varios hibridomas preparados a partir de ratones que contienen el sitio de IgM mas IgG (Figura 8) inmunizado con TNFa humano. Los resultados se muestran en la Figura 16. Las dos filas superiores en la Figura 21 se analizaron con una IgG anti-humana, las dos siguientes filas con una IgM anti-humana. Las muestras de suero (flechas) muestran que el raton ha generado anticuerpos anti-TNFa tanto IgG como IgM. La flecha sencilla muestra un hibridoma positivo de IgM. Los pocillos se recubrieron con TNFa humano comercialmente disponible. Todos los procedimientos fueron convencionales.
5
10
15
20
25
30
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45
50
55
60
65
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> ERASMUS UNIVERSITY MEDICAL CENTER ROTTERDAM
<110> CRAIG, Roger Kingdon
<120> MOLECULAS DE UNION
<130> PO55642EP
<150> GB0416392.9 <151> 2004-07-22
<150> GB0511881.5 <151> 2005-06-10
<150> EP05766644.8 <151> 2005-07-22
<160> 35
<170> SeqWin99, version 1.02
<210> 1 <211> 39 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador de PCR <400> 1
aatctgggca gcggccgcct cgacacaaca tttgcgctc 39
<210>2 <211> 106 <212> ADN
<213> HCAb (IgG3) Humana frente a rtTA <400> 2
60 120 180 240 300 318
<210>3 <211> 106 <212> PRT
<213> HCAb (IgG3) Humana frente a rtTA <400> 3
agactctcct
caggctccag
tatgcagact
tatctgcaaa
atggttcggg
gagctcaaaa
gtgcagcctc
ggaagcagcg
ccgtgaaggg
tgaacagcct
gagcccgttt
ccccactt
tggaagcatc
cgagttggtc
ccgattcacc
gaaacctgag
tgactactgg
ttcagtatca
gcagctatta
atctccagag
gacacggccg
ggccagggaa
atgccatggg
ctagtggtgg
acaacgccaa
tctattactg
ccctggtcac
ctggtaccgc
tagcacaagg
gaacacggtg
tttgatctct
cgtctcctca
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Arg
Leu Ser Cys
1
Gly
Trp Tyr Arg
20
He
Thr Ser Gly
35
Phe
Thr lie Ser
50
Asn
Ser Leu Lys
65
Met
Val Arg Gly
Ala Ala Ser Gly
5
Gin Ala Pro Gly
Gly Ser Thr Arg 40
Arg Asp> Asn Ala 55
Pro Glu Asp> Thr 70
Ala Arg Phe Asp> 85
Ser lie Phe Ser 10
Lys Gin Arg Glu 25
Tyr Ala Asp Ser
Lys Asn Thr Val
60
Ala Val Tyr Tyr 75
Tyr Trp Gly Gin 90
lie Asn Ala 15
Leu Val Ala
30
Val Lys Gly 45
Tyr Leu Gin
Cys Leu Tie
Gly Thr Leu 95
Met
Ala
Arg
Met
Ser
80
Val
imagen1
<210>4 <211> 33 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador de PCR <400> 4
ctggaattct caaccatgga gctggggctg agc 33
<210> 5 <211> 30 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador de PCR <400> 5
gacaagcttt acccggagac agggagaggc 30
<210> 6 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador de PCR <400> 6
gacaagcttt acccggagac agggagaggc 30
<210>7 <211> 34 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador de PCR <400> 7
gtcctcgagg cccaggtcca actgcaggag tctg 34 <210>8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 37 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador de PCR <400>8
gtcgaattct cattccgagg agacggtgac ctgggtc 37
<210>9 <211> 36 <212> ADN
<213> Secuencia bisagra de IgG <400> 9
gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgccca 36
<210> 10 <211> 44 <212> ADN
<213> Secuencia bisagra de IgG de reemplazo <400> 10
agcttctgag cgcaaaccac cagtcgagcc accaccgcca ccac 44
<210> 11 <211> 44 <212> ADN
60
120
180
240
300
360
404
60
120
180
240
300
352
<210> 14 <211> 394 <212> ADN
<213> Complemento de Secuencia bisagra de IgG de reemplazo <400> 11
tcgagtggtg gcggtggtgg ctcgactggt ggtttgcgct caga 44
<210> 12 <211> 404 <212> ADN <213> VDJg*1
<400> 12
gacacggccg
cactgcggct
ccatcggtct
ggctgcctgg
ctgaccagcg
agcagcgtgg
gatcacaagc
tgtagtatct
agaggggcca
tccccctggc
tcaaggacta
gcgtgcacac
tgaccgtgcc
ccagcaacac
gtaaggcaga
gggaacactg
gccctgctcc
cttccccgaa
cttcccagct
ctccagcaac
caagagcgca
tggggtagta
gtcgcggtgt
aggagcacct
ccggtgacgg
gtcctacagt
ttcggcaccc
aatgttgtgt
ctatggttcg
catcagcctc
ccgagagcac
tgtcgtggaa
cctcaggact
agacctacac
cgag
gggagtccac
caccaagggc
agcggccctg
ctcaggcgct
ctactccctc
ctgcaacgta
<210> 13 <211> 352 <212> ADN <213> VDJg*2
<400> 1
gacattccca cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca agagcgcaaa tgttgtgtcg ag
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<213> VDJg*3 <400> 14
gacacggccg
actggggcca
tccccctggc
tcaaggacta
gcgtgcacac
tgaccgtgcc
ccagcaacac
<210> 15 <211> 380 <212> ADN <213> VDJg*4
<400> 15
gacacggccg
accctggtca
tgctccagga
cccgaaccgg
ccagctgtcc
agcaacttcg
agcgcaaatg
<210> 16 <211> 417 <212> ADN <213> VDJg*5
<400> 16
gacacggccg
ttactactac
ctccaccaag
cacagcggcc
gaactcaggc
a ct ct act c c cacctgcaac
<210> 17 <211>108 <212> PRT
<213> alfa-B.pertussis 1 <400> 17
tctattactg
gggaaccctg
gccctgctcc
cttccccgaa
cttcccagct
ctccagcaac
caagagcgca
tccaatcgga
ccgtctcctc
gcacctccga
tgacggtgtc
tacagtcctc
gcacccagac
ttgtgtcgag
tctattactg
tacggtatgg
ggcccatcgg
ctgggctgcc
gctctgacca
ctcagcagcg
gtagatcaca
taatgccact
gtcaccgtct
aggagcacct
ccggtgacgg
gtcctacagt
ttcggcaccc
aatgttgtgt
tacagctatg
agcctccacc
gagcacagcg
gtggaactca
aggactctac
ctacacctgc
taatgcagat
acgtctgggg
tcttccccct
tggtcaagga
gcggcgtgca
tggtgaccgt
agcccagcaa
acgatatttt
cctcagcctc
ccgagagcac
tgtcgtggaa
cctcaggact
agacctacac
cgag
gttacgtact
aagggcccat
gccctgggct
ggcgctctga
tccctcagca
aacgtagatc
gtattactat
ccaagggacc
ggcgccctgc
ctacttcccc
caccttccca
gc c ct c cage caccaagagc
gactggttat
cgccaagggc
agcggccctg
ctcaggcgct
ctactccctc
ctgcaacgta
ttgactactg
cggtcttccc
gcctggtcaa
ccagcggcgt
gcgtggtgac
acaagcccag
ggttcgggga
acggtcaccg
tccaggagca
gaaccggtga
gctgtcctac
aaetteggea
gcaaatgttg
tatagaeget
ccatcggtct
ggctgcctgg
ctgaccagcg
agcagcgtgg
gatcacaagc
gggccaggga
cctggcgccc
ggactacttc
gcacaccttc
cgtgccctcc
caacaccaag
gcctatagcc
tctcctcagc
cctccgagag
cggtgtcgtg
agtcctcagg
c c caga c ct a tgtegag
Arg
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser He Asn Ala Met
1
5 10 15
Gly
Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Ala
20 25 30
He
Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
35 40 45
Phe
Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met
50 55 60
Asn
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys
65
70 75 80
Gly
Pro lie Thr His Val Arg Gly Val His Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
85 90 95
Leu
Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val
100 105
60
120
180
240
300
360
394
60
120
180
240
300
360
380
60
120
180
240
300
360
417
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 18 <211> 108 <212> PRT
<213> alfa-B.pertussis 2 <400> 18

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 15 10 15
Gly Trp> Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Ala

2 0" 25 " 30
lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met

50 55 60

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys

65 70 75 80
Thr Pro lie Thr His lie Arg Gly Val His His Trp Gly Gin Gly Thr

85 90 95

Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105
<210> 19 <211>108 <212> PRT
<213> alfa-B.pertussis 3 <400> 19

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 15 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30

lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met

50 55 60
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Arg

65 70 75 80
Thr Pro lie Thr Val Val Arg Gly Val His Tyr Trp Gly Gin Gly Thr

85 90 95

Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105
<210> 20 <211> 108 <212> PRT
<213> alfa-B.pertussis 4 <400> 20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
imagen2
<210> 21 <211> 108 <212> PRT
<213> alfa-B.pertussis 5 <400> 21
imagen3
<210> 22 <211> 59 <212> PRT
<213> neVHH1 original <400> 22
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala lie 15 10 15
Gly Trp Phe Arg Gin Ala Glu Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys
imagen4
<210> 23 <211> 59
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<212> PRT <213> neVHHI clon 1
<400> 23

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala lie 15 10 15

Gly Trp Phe Arg Gin Ala Glu Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys 20 25 30

lie Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp> Ser Val Lys Gly 35 40 45
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp> Asn Ala Lys Asn

50 55
<210> 24 <211> 59 <212> PRT <213> neVHHI clon 2
<400> 24

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp> Tyr Tyr Val lie 15 10 15

Gly Trp> Phe Arg Gin Ala Glu Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys 20 25 30

lie Ser Ser Ser Asp> Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp> Ser Val Lys Gly 35 40 45
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp> Asn Ala Lys Asn

50 55
<210> 25 <211> 59 <212> PRT <213> neVHHI clon 3
<400> 25

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp> Tyr Tyr Ala lie 15 10 15

Gly Trp> Phe Arg Gin Ala Glu Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys 20 25 30

lie Ser Ser Ser Asp> Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp> Ser Val Lys Gly 35 40 45
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp> Lys Ala Lys Asn

50 55
<210> 26 <211> 58 <212> PRT
<213> neVHH2 original <400> 26
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Gly Trp> Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30

lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp> Asn Ala Lys Asn

50 55
<210> 27 <211> 58 <212> PRT <213> neVHH2 clon 1
<400> 27

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 15 10 15

Gly Trp> Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30

lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp> Asn Ala Lys Asn

50 55
<210> 28 <211> 58 <212> PRT <213> neVHH2 clon 2
<400> 28

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Val Met 15 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Gly 20 25 30

Val Thr Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp> Asn Ala Lys Asn

50 55
<210> 29 <211> 58 <212> PRT <213> neVHH2 clon 3
<400> 29

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 15 10 15

Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Pro 20 25 30

lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp> Asn Ala Lys Asn

50 55
<210> 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 78 <212> PRT
<213> lmea germinal de VHH2 <400> 30

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 15 10 15

Gly Trp> Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30

lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp> Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met

50 55 60

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 65 70 75
<210> 31 <211> 105 <212> PRT <213> alfa-Tetanus 1
<400> 31

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 15 10 15

Gly Trp> Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30

lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met

50 55 60
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu

65 70 75 80
Arg Ala Gly Asp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr

85 90 95

Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105
<210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> alfa-Tetanus 2
<400> 32
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Gly Trp> Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Ala

2 0" 25 " 30
lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met

50 55 60
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp> Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Val Leu

65 70 75 80
Trp Phe Gly Glu Leu Ser Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr

85 90 95

Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105
<210> 33 <211> 108 <212> PRT <213> alfa-Tetanus 3
<400> 33

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser lie Asn Ala Met 15 10 15

Gly Trp> Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30
lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp> Ser Val Lys Gly Arg

35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met

50 55 60
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp

65 70 75 80
Cys Trp Gly Ser Arg Trp Tyr Phe Asp His Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

85 90 95

Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105
<210> 34 <211> 111 <212> PRT <213> alfa-Tetanus 4
<400> 34
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Gly Trp> Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30

lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met

50 55 60
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp

65 70 75 80
Thr Ser Pro Pro Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

85 90 95

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105 110
<210> 35 <211> 112 <212> PRT <213> alfa-hsp70
<400> 35

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn Ala Met 15 10 15

Gly Trp> Ser Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Ala 20 25 30

lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp> Asn Ala Lys Asn Thr Val His Leu Gin Met

50 55 60
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly

65 70 75 80
Asn Thr Met Val Arg Gly Val lie lie Lys Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp

85 90 95

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val 100 105 110

Claims (5)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Un metodo para la produccion de un anticuerpo unicamente de cadena pesada Vh que comprende:
    (a) inmunizar una rata transgenica que expresa un locus de cadena pesada Vh heterologo con un antigeno en el que:
    (i) el locus de cadena pesada Vh comprende una region variable que comprende al menos un segmento genico Vh de origen natural, al menos un segmento genico D, al menos un segmento genico J y al menos una region constante de cadena pesada, y en la que los segmentos genicos V, D y J derivan de un ser humano;
    (ii) cada region constante no se codifica a un dominio funcional Ch1;
    (iii) un segmento genico Vh, un segmento genico D y un segmento genico J son capaces de recombinarse para formar una secuencia de codificacion VDJ;
    (iv) el locus recombinado de cadena pesada Vh, cuando se expresa, es capaz de formar un anticuerpo unicamente de cadena pesada soluble que comprende un dominio de union Vh espedfico de un antfgeno soluble y una region efectora constante desprovista de un dominio funcional Ch1;
    (b) aislar una secuencia de acidos nucleicos que codifica el anticuerpo unicamente de cadena pesada Vh de las celulas que producen anticuerpos; y
    (c) producir el anticuerpo unicamente de cadena pesada Vh usando tecnicas de ADN recombinante.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente clonar un locus Vh que codifica el dominio de union Vh del anticuerpo unicamente de cadena pesada Vh y que expresa el dominio de union Vh en un sistema de expresion bacteriano, de levadura, mamffero o alternativo.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que dicha rata transgenica ha sido modificada para tener una capacidad reducida para producir anticuerpos que incluyan cadenas ligeras.
  4. 4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los locis de cadena pesada de inmunoglobulina endogenos a la rata se eliminan o silencian.
  5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el locus de cadena pesada Vh comprende mas de un segmento genico Vh, mas de un segmento genico D y mas de un segmento genico J.
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