WO2010079149A1 - Fusionsantikörper - Google Patents

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WO2010079149A1
WO2010079149A1 PCT/EP2010/000191 EP2010000191W WO2010079149A1 WO 2010079149 A1 WO2010079149 A1 WO 2010079149A1 EP 2010000191 W EP2010000191 W EP 2010000191W WO 2010079149 A1 WO2010079149 A1 WO 2010079149A1
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WO
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cell
polypeptide
light chain
antibody construct
vector
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PCT/EP2010/000191
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English (en)
French (fr)
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WO2010079149A4 (de
Inventor
Martin Giersberg
Udo Conrad
Original Assignee
Ipk Gatersleben
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the invention relates to a monomer of a polypeptide comprising a light chain constant domain and a heavy chain variable domain, optionally linked via a linker, and a dimer of this polypeptide comprising two such monomers.
  • Vertebrate's immune system is a complex defensive system responsible for distinguishing between "self” and “foreign” and protecting the organism from infections and foreign substances.
  • the immune system can be divided into the innate and the adaptive immune system.
  • the adaptive immune response occurs in specialized lymphoid tissues. Different types of lymphocytes are involved, the T lymphocytes and the B lymphocytes. They have specific receptors on their surfaces that enable them to recognize structures on the surfaces of foreign substances and pathogens. As a result of this recognition, the respective lymphocyte clones (clonal selection of the best binders) proliferate and differentiate into effector cells.
  • the B cell receptors can be secreted as soluble proteins, called antibodies, into the serum and within the mucosal immune system also into the oral cavity or small intestine. These soluble antibodies belong to the humoral components of the immune system.
  • Immune protection can be induced artificially by vaccination (active immunization) or by the administration of antibodies (passive immunization). Active immunization is the introduction of an antigen into the body, which in turn stimulates the body to develop immunity to that target. Active immunization is normally used in prophylaxis, for example in vaccination, but less in the treatment of acute infections.
  • Antibodies typically consist of two identical heavy chains and two identical light chains linked together to form a Y-shaped structure.
  • the light chains each consist of a variable and a constant domain.
  • the heavy chains each have a variable and 3 or 4 constant domains.
  • the antigen-binding sites are formed by the variable domains of a light (VL) and a heavy chain (VH).
  • Classic antibodies therefore contain 2 antigen binding sites.
  • the light chains can be either kappa or lambda chains.
  • the heavy chains may be ⁇ -, ⁇ -, ⁇ - or various ⁇ chains.
  • the constant parts (Fc) of the heavy chains determine the class (isotype) of the respective immunoglobulin.
  • the Fc region of an antibody is responsible for interacting with the various Fc receptors and proteins of the complement system located on cell surfaces (effector functions). In some cases, the prevention of interaction with Fc receptors may also be therapeutically desirable.
  • An antibody can be broken down by enzymatic cleavage into a Fab fragment and a remaining Fc part.
  • the Fab fragment consists of the complete light chain as well as a part of the heavy chain, namely the variable region, and a part of the constant region.
  • variable regions of a particular antibody are different from those of any other, but the sequence variability is not uniformly distributed across the variable region but is concentrated in particular sections.
  • hypervariable regions also called complementarity determining regions (CDR 1, CDR 2, CDR 3).
  • CDR 1, CDR 2, CDR 3 complementarity determining regions
  • scFv single-chain antibody
  • VH variable region of a heavy one Chain
  • VL variable region of a light chain
  • Antibody constructs constructed from a single, monomeric variable domain of an antibody are called single domain antibodies, single domain antibodies, nanobodies or nano-antibodies. They are the smallest antibody fragments capable of antigen recognition. Frequently, cameloid antibodies (VHH) are used as single domain antibodies.
  • VHH cameloid antibodies
  • the use of cameloid antibodies is described, for example, in GB 2416768 A (Erasmus University Rotterdam, 2006) or in EP 1864998 A2 (Erasmus University Rotterdam, 2007).
  • VHH chains are fused with, among others, CH chains.
  • a broad use of single domain antibodies has so far failed due to poor expression. Another disadvantage is extremely low absorption rates, which significantly limits a possible systemic application of single-domain antibodies.
  • antibodies can also be done by cell biological and molecular biological methods.
  • Such antibodies can be used as agents in biochemical and molecular biology research as well as in diagnostics and clinical applications.
  • recombinant antibody fragments are difficult to use directly, especially in medical applications, since they usually have only a very short half-life in vivo and thus, if appropriate, their target Do not reach antigen.
  • These problems are more pronounced in the oral administration of antibodies, as they are degraded in the gastrointestinal tract by enzymes and the low pH in the stomach.
  • antibodies generated in a classical manner and by cell biological methods play a very important role in the therapy of many diseases in human and veterinary medicine.
  • the use of antibodies generated by genetic engineering technologies is at the beginning of a promising development.
  • all forms of antibodies play an important role in diagnostics. For all applications, improving stability while maintaining or improving binding specificity, affinity and avidity is an important prerequisite.
  • the invention relates to a polypeptide comprising
  • a heavy chain variable domain selected from the group comprising VH and / or VHH,
  • linker being located between the heavy chain variable domain and the light chain constant domain, wherein
  • cameloid VH chains are also called VHH chains.
  • the embodiment described above. is preferably a monomer in the context of the invention.
  • a constant domain of a light chain is also referred to as CL or C Le , cht .
  • a CL chain according to the invention can be selected from the group comprising C Ka ppa and / or C Lam bda, which are also referred to as kappa chain or lambda chain.
  • polypeptides are characterized by surprising functional features and have many advantages over the prior art.
  • the lower lipophilicity of the molecules leads to a particularly good solubility.
  • they are peptides with a high heat resistance. Unlike traditional antibodies that can be inactivated by heat, the ability of the antigen binding constructs with the invention is maintained even after a heat tape averaging at 90 0 C.
  • a particularly important advantage of the invention lies in the significantly increased expression.
  • the poor expression of single domain antibodies has hitherto prevented their use in many areas of medicine and biotechnology. It was quite surprising that fusion of single domain antibodies with a constant domain of a light chain can cause such increased expression.
  • Preferred polypeptides according to the invention are peptides consisting of
  • polypeptides can be expressed particularly well in plants. Expression in plants allows rapid and inexpensive production of the polypeptides. In addition, animal models can be dispensed with, which in addition to the savings in time, space and money ethical advantages.
  • Human VH chains are particularly well suited to achieve the object of the invention.
  • Polypeptides consisting of a human VH chain, a constant domain of a light chain and a linker are surprisingly characterized by a particularly low inherent toxicity. If a human VH chain is used instead of a VHH chain, a linker must be inserted between the VH chain and the constant domain of a light chain be arranged to achieve the advantages of the invention. Surprisingly, even very short linkers (for example 1-15 amino acids) are suitable for leading to increased stability.
  • a monomer consisting of a VHH chain and a CL chain is advantageous because the advantages of a VHH antibody can be realized particularly well here.
  • Single-domain antibodies derived from camel heavy chain antibodies have distinct antigen-recognizing loop structures compared to the variable domains of classical antibodies. As a result, these antibodies are capable of recognizing those antigenic structures that are inaccessible to classical antibodies. These include, for example, catalytic centers of enzymes. It was quite surprising that this property of VHH antibodies was retained even after a fusion with a constant domain of a light chain.
  • a polypeptide comprising a VHH chain and a light chain constant domain, with no linker located between both chains. It was particularly surprising that can be dispensed with by using a VHH chain instead of a VH chain on the linker. Even without the linker, the combination of VHH and C Le ⁇ Ch t has a high stability and an increased half-life.
  • Polypeptides according to the invention are defined as follows:
  • polypeptide is used to describe any peptide or protein comprising amino acids linked together by peptide bonds, both short chains, which are often referred to as peptides, oligopeptides or oligomers, as well as longer chains, which are generally called proteins.
  • polypeptides may often include other than the 20 amino acids, which are generally referred to as naturally occurring 20 amino acids.
  • amino acids may be modified, for example, including glycosylations or other post-translational modifications.
  • chemical modifications are known in the art. Examples of modifications are glycosylation, lipid attachment, sulfonation, gamma-carboxylation, hydroxylation or ADP-ribosylation.
  • polypeptides do not always have to be completely linear. For example, there are polypeptides that are branched or circular.
  • the invention relates to a dimer of a polypeptide comprising two monomers, each comprising
  • a heavy chain variable domain selected from the group comprising VH and / or VHH,
  • linker being located between the heavy chain variable domain and the light chain constant domain, wherein
  • a dimer consisting of two monomers, each consisting of VH and the constant domain of a light chain is excluded.
  • a problem in the prior art is the inadequate stability as well as short half lives of individual VHH or VH chains.
  • This problem could be solved particularly well by a dimer according to the invention.
  • the two constant domains of a light chain have a stabilizing effect and in addition significantly longer half-lives could be achieved. This is achieved in part by the size of the dimer and dimerization.
  • the effect is so great that other, previously unknown causes have to be additionally responsible. This was completely surprising and could not be suspected by a professional.
  • the dimers of the invention are also more resistant to gastric acid. They have a low number of proteolytic sites and are thus more resistant to proteolytic enzymes than antibodies in the prior art.
  • Another advantage of the monomers and dimers of the invention is that, because of their small size, they can pass well through the gastrointestinal tract.
  • the polypeptides of the invention are suitable for local peroral application.
  • the dimers of the invention can be made in plants, thereby surprisingly facilitating production.
  • the problem underlying the invention could be solved particularly well by the following variants:
  • Dimer comprising 2 monomers, each comprising a VHH chain and a light chain constant domain
  • Dimer comprising 2 monomers, each comprising a VHH chain and a light chain constant domain joined by a linker,
  • Dimer comprising 2 monomers each comprising a VH chain and a light chain constant domain joined by a linker.
  • the linker links the VH chain of a monomer to the CL chain of the same monomer. It was surprising that this linker results in a markedly increased steric stability of the molecule when the heavy chain variable domain is a human V H chain.
  • Dimers comprising 2 monomers each comprising a VHH chain and a light chain constant domain exhibit particularly good tissue permeability and are therefore particularly well-suited for therapeutic approaches.
  • Dimers comprising 2 monomers each comprising a VHH chain and a light chain constant domain joined by a linker are characterized by particularly high stability. Surprisingly, the introduction of a linker does not cause the dimeric enzymes to provide more attack surface. On the contrary, the linker appears to allow a conformation that protects the peptides particularly well from degradation and denaturation.
  • Dimers comprising 2 monomers each comprising a VH chain and a light chain constant domain joined by a linker are particularly preferred because they have an extremely high affinity for their target and moreover can be expressed particularly well in plants.
  • the invention relates to a dimer of a polypeptide comprising • one of the monomers mentioned and
  • a monomer comprising
  • a marker molecule within the meaning of the invention can be, for example, a fluorescence molecule.
  • a dimer is particularly well suited for diagnostic applications. It was surprising that it is possible to incorporate a marker molecule into a dimer of the invention without the dimer losing its advantageous properties.
  • the invention relates to an antibody construct comprising
  • linker linking each heavy chain variable domain to the constant domain of a light chain.
  • the invention relates to an antibody construct comprising
  • Two heavy chain variable domains selected from the group comprising VH and VHH,
  • an antibody construct consisting of two constant domains of a light chain and two human VH chains is excluded.
  • antibody refers to both polyclonal and monoclonal antibodies
  • the term is intended to include both intact molecules and fragments thereof, such as Fv, scFv, Fab and F (ab ') 2, the antigen binding are able to include.
  • labeled antibodies and fusion proteins coupled with different molecules are included.
  • an “antigen” is a molecule or part of a molecule that is capable of being bound by an antibody, it can be a polypeptide, protein, nucleic acid or other molecule.
  • the linkers preferably consist of amino acids. More preferably, the linker is selected from the group comprising GS linker, Yol linker or linker with the sequence GGSGGS.
  • the use of these linkers resulted in a particularly high stability of the entire construct.
  • GGSGGS linkers have the advantage that they have no proteolytic sites and are therefore resistant to enzymatic degradation.
  • the preferred linkers are relatively inflexible, which has an advantageous effect on the conformation of the peptides.
  • the antibody construct is bispecific.
  • monospecific antibody constructs are preferred. Whether a monospecific or a bispecific antibody construct is better suited depends on the respective target structure.
  • An advantage of bispecific constructs is the ability to bind two different antigens simultaneously. Monospecific antibodies bind the same antigen with both antigen binding sites so that the corresponding antigen can be more efficiently eliminated or neutralized. The use of monospecific antibodies is also advantageous in diagnostic applications.
  • the invention consists in the fact that the variable domain of the heavy chain (VH) of a human antibody or a cameloid antibody (VHH) with the light chain constant domain (C Ka pp a and C lambda ) of a human antibody fused becomes.
  • VHH variable domain of the heavy chain
  • C Ka pp a and C lambda constant domain
  • Single chain antibodies are characterized by a very low immunogenicity, which is particularly advantageous for use in the livestock or human area. Particularly advantageous results were achieved by the combination of VH or VHH chains with CL chains, wherein the CL chains originate from the corresponding target organism. Side effects and defense reactions against the antibody constructs can thus be avoided.
  • polypeptide and / or an antibody construct wherein the polypeptide and / or the antibody construct binds to a pathogen and / or neutralizes its pathogenic effect.
  • pathogens are HIV, SARS, coronavirus, coccidia, Eimeria, Eimeria tenella, hepatitis B, Mycobacterium tuberculosis and / or Mycobacterium leprae.
  • a pathogen is selected from the group comprising viruses, bacteria, mycoplasma, protozoa, fungi, parasites or other microorganisms.
  • the virus is preferably selected from the group comprising HIV, herpesvirus, cytomegalovirus, rabies virus, influenza virus, hepatitis virus, preferably hepatitis B virus, SARS coronavirus, Epstein-Barr virus, mumps virus, murine leukemia virus, Simianes virus 40 and / or poliovirus.
  • the bacterium may be, for example, an anthrax bacillus, streptococcus, neisseria, pneumococcus, hemophilis, influenzae B, pseudomonas, mycobacterium tuberculosis, mycobacterium leprae and / or tetanus toxin.
  • parasites are organisms which cause parasitic infections, for example proto-zonal or protist or worm infections.
  • examples of parasites are trypanosomes, trichomonads, plasmodium, coccidia, preferably Eimeria, Annelida, Nematomorpha and / or Trematoda.
  • Protozones according to the invention may be, for example, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rhodesiensei, Trypanosoma brucei, Schistosoma mansoni, Schistosoma japanicum, Babesia bovis, Eimeria tenella, Onchocerca volvulus, Leishmania tropica, Trichinella spiralis Onchocerca volvulus, Theileria parva, Taenia hydatigena, Taenia ovis, Taenia saginata, Echinococcus granulosus or Mesocestoides corti.
  • the mycoplasma may be Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma oral, Mycoplasma arginini, Acholeplasm laidlawii, Mycoplasma salivarum and Mycoplasma pneumoniae.
  • polypeptides and / or antibody constructs of the invention is particularly advantageous in the prophylaxis, diagnosis and / or treatment of AIDS associated with AIDS Diseases, Chickenpox, Influenza, Ebola, Foot and Mouth Disease, Hepatitis, Herpes simplex, Herpes zoster, HPV, Influenza, Mumps, Norovirus, Rabies, Viral Encephalitis, Meningitis, SARS, Tuberculosis, Leprosy, Leukemia, Coccidiosis, Cancer, Kreuzfeld Jakob , Malaria, tetanus, syphilis, toxoplasmosis, autoimmune diseases and / or diphtheria.
  • the antigen-binding polypeptides and / or antibody constructs of the invention are capable of neutralizing or eliminating pathogens which have become resistant to traditional antibiotic treatments.
  • immunologically functional molecules are TNF, hormones, cytokines, transmitters or second messengers.
  • immunologically functional molecules play a major role in the pathogenesis of autoimmune diseases.
  • the neutralization or elimination of such molecules with the aid of the polypeptides or antibody constructs according to the invention can be used in the treatment or prophylaxis of diseases.
  • an antigen-binding polypeptide or antibody construct can be constructed so that it can bind or recognize any target antigen.
  • the person skilled in the art knows how to select CDR region combinations so that a particular antigen can be bound.
  • Any antigen binding polypeptide or antibody construct having the above structure is a polypeptide or antibody construct of the invention, regardless of antigen specificity.
  • polypeptide and / or antibody construct wherein both constant domains of a light chain are kappa domains.
  • kappa chains leads to increased bioactivity after expression in plants, resulting in a particularly high efficiency.
  • the use of kappa chains is advantageous because the transient expression of these antibody constructs is surprisingly high.
  • the use of kappa chains surprisingly results in high activity in vitro and in vivo. Increased activity is particularly beneficial for therapeutic applications because lower doses may be used, which helps prevent side effects.
  • the invention relates to a polypeptide and / or antibody construct, wherein both constant domains of a light chain are lambda domains. It has surprisingly been found that lambda chains especially for
  • Apps are suitable for chickens or rabbits. Also preferred is a polypeptide and / or antibody construct wherein the constant domains of a light chain are linked together, preferably via a disulfide bond and / or hydrophobic interaction.
  • a cellular system e.g., bacterial or mammalian systems.
  • the polypeptides or antibody constructs of the invention do not show the problem of dissociation.
  • the monomers are operatively linked in such a way that a stable structure of the dimer is formed.
  • the disulfide bridge also leads to increased proteolytic stability such that the polypeptide is more resistant to enzymatic cleavage.
  • hydrophobic interactions to effectively link the monomers together. Hydrophobic interactions may in some circumstances be advantageous over covalent compounds.
  • One of ordinary skill in the art knows that there are different ways to link two chains of an antibody or polypeptide together. The disulfide bridges and hydrophobic interactions are the preferred embodiments of the invention. It will be understood, however, that any type of compound, covalent or non-covalent, as known in the art, can be used to join the chains of the polypeptides or antibody constructs of the invention. The person skilled in the art knows under what circumstances which type of connection may be advantageous.
  • a polypeptide and / or antibody construct for the manufacture of a medicament for the treatment, diagnosis and / or prevention of infections, preferably infections associated with HIV, SARS, Coronavirus, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Hepatitis B, Eimeria, especially Eimeria tenella.
  • polypeptide and / or antibody construct wherein the polypeptide and / or antibody construct is a non-immunoglobulin polypeptide.
  • non-immunoglobulin peptides are advantageous because they do not have an Fc region, which is often elevated in diagnostic applications
  • the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleotide sequence which codes for a polypeptide and / or antibody construct of the invention.
  • polynucleotides generally refers to polyribonucleotides or polydeoxyribonucleotides which are modified or unmodified RNA or DNA.
  • polynucleotides may be used inter alia for single-stranded or double-stranded DNA consisting of single-stranded and double-stranded regions, single-stranded or double-stranded RNA, RNA consisting of single-stranded and double-stranded regions, hybrid molecules DNA and RNA, which may be single-stranded or both.
  • polynucleotides may contain modified bases.
  • the DNA or RNA backbone may also be modified.
  • polynucleotides may contain unusual bases as well as inosines, modified bases, and tritium-labeled bases. A variety of modifications for different purposes are known in the art.
  • polynucleotide as used herein includes chemically, enzymatically or metabolically modified polynucleotides as well as the chemical forms of DNA or RNA molecules that are characteristic of particular viruses or cells.
  • nucleotide construct comprising a polynucleotide, which polynucleotide is operably linked to a promoter that regulates expression in a host cell.
  • seed-specific promoters for example USP or LeB4.
  • the advantages of expression in seeds lie in their good storability, without bearing costs arise.
  • the protein content in seeds is particularly high, and the expressed peptides are highly active.
  • promoter refers to a DNA sequence that regulates the transcription of a gene or nucleic acid segment to produce mRNA, Typically, a promoter is located in the 5 'region of a gene.
  • the invention relates to a vector comprising a polynucleotide and / or a nucleotide construct.
  • vector includes a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid molecule to which the vector is bound, vectors being, for example, plasmids or viral vectors. Also preferred is a vector wherein the vector is a phage display vector, a bacterial expression vector, a yeast expression vector, a mouse expression vector, an algal expression vector and / or a plant expression vector.
  • a host cell comprising a polynucleotide of the invention, a nucleotide construct of the invention, a vector of the invention and / or a polypeptide of the invention and / or an antibody construct of the invention.
  • a host cell wherein the host cell is selected from the group comprising a bacterial cell, a yeast cell, a fungus cell, an algal cell and / or a plant cell.
  • the invention relates to the host cell, wherein the host cell is selected from the group comprising an Escherichia coli cell, a Streptomyces cell, an Arxula cell, a Pichia pastoris cell, a Schizosaccharomyces cell, an Aspergillus cell, a Chlamydomonas cell, a Nicotiana spec. Cell, preferably Nicotiana benthamiana cell, a Pisum sativum cell, a Hordeum vulgar cell, a Zea mays cell, a rape cell, a Cucumis sativus cell and / or Linum usitatissimum cell.
  • transgenic plant portions thereof and / or microorganisms comprising a polynucleotide of the invention, a nucleotide construct of the invention and / or a vector of the invention.
  • composition comprising a polynucleotide of the invention, a nucleotide construct of the invention, a polypeptide of the invention and / or an antibody construct of the invention and a suitable carrier, buffer, stabilizer and / or binding agent.
  • composition wherein the carrier, buffer, stabilizer and / or binder comprises proteins, preferably BSA, milk powder and / or pea flour, microparticles and / or gelatin capsules.
  • proteins preferably BSA, milk powder and / or pea flour, microparticles and / or gelatin capsules.
  • the invention relates to the use of the transgenic plant, portions thereof and / or microorganisms for the manufacture of a medicament for the treatment, diagnosis and / or prevention of infections, preferably infections associated with HIV, hepatitis B, SARS, coronavirus , Coccidia, Eimeria, preferably Eimeria tenella, Mycobacterium tuberculosis and / or Mycobacterium leprae.
  • infections preferably infections associated with HIV, hepatitis B, SARS, coronavirus , Coccidia, Eimeria, preferably Eimeria tenella, Mycobacterium tuberculosis and / or Mycobacterium leprae.
  • transgenic plants or parts thereof are particularly advantageous as they can be easily, quickly and orally ingested.
  • This embodiment offers especially in the treatment, diagnosis or prevention of diseases of farm animals. It is particularly complex to treat animals individually. This can be circumvented with the teachings of the present invention, as the polypeptides or antibody constructs can be easily ingested with the feed. This leads to a significant cost reduction and a rapid and effective treatment of a variety of animals simultaneously.
  • polypeptides or antibody constructs may also be advantageous to administer the polypeptides or antibody constructs according to the invention.
  • Such an application may be particularly beneficial in the human field or for the immunization or treatment of particularly valuable farm animals, such as breeding animals.
  • the advantageous embodiments of the invention have at least one or more of the advantages mentioned.
  • Tumomecrosis factor alpha is a trimeric protein that is important in inflammatory diseases (Crohn's disease, rheumatoid arthritis). In contrast, there are therapeutic antibodies and therapeutic receptor derivatives.
  • a nanobody (VHH) to hTNFalpha has been reported by Coppieters et al. (2006). This Nanobody was used here.
  • An anti TNFalpha VHH C kappa antibody was constructed (see Figure 1) and transiently expressed in N. benthamiana using a shuttle vector and Agrobacterium tumefaciens. The antibody was purified by affinity chromatography using the His tag, and then monomers were separated from dimers by size exclusion chromatography. The successful separation was demonstrated by gel electrophoresis under non-reducing conditions (see Figure 2).
  • the purified dimers and monomers were characterized functionally.
  • the affinity constants were determined in a competitive ELISA (see Figure 3).
  • the dimer had an almost 10-fold better affinity constant. Since this dimerization is very easy to achieve by plant expression and no additional dimerization enzymes or chemical reagents are necessary for this, there is a clear advantage of Dikappa constructs and plant expression here. Further investigations were carried out to investigate to what extent anti-human TNFalpha VHH-C kappa antibody dimers and monomers can neutralize the cytotoxic effect of TNFalpha on human cells. Here it was found that dimers can also neutralize about 10 times better.
  • aHA1-VH4 2 specific, human, heavy chains against the haemagglutinin of avian influenza virus (aHA1-VH4; aHA-VH10) were converted to the dikaproformate and successfully expressed in plants.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Monomer eines Polypeptids, umfassend eine konstante Domäne einer leichten Kette und eine variable Domäne einer schweren Kette, wobei diese optional über einen Linker verbunden sind, sowie ein Dimer dieses Polypeptids, umfassend zwei derartige Monomere.

Description

Fusionsantikörper
Zusammenfassung
Die Erfindung betrifft ein Monomer eines Polypeptids, umfassend eine konstante Domäne einer leichten Kette und eine variable Domäne einer schweren Kette, wobei diese optional über einen Linker verbunden sind, sowie ein Dimer dieses Polypeptids, umfassend zwei derartige Monomere.
Hintergrund
Das Immunsystem von Vertebraten ist ein komplexes Defensivsystem, welches für die Unterscheidung zwischen „selbst" und „fremd" sowie für den Schutz des Organismus vor Infektionen und fremden Substanzen verantwortlich ist. Das Immunsystem kann in das angeborene und das adaptive Immunsystem unterteilt werden. Die adaptive Immunantwort erfolgt in spezialisierten lymphoiden Geweben. Hierbei sind verschiedene Typen von Lymphozyten beteiligt, die T-Lymphozyten und die B-Lymphozyten. Sie besitzen spezifische Rezeptoren auf ihren Oberflächen, mit deren Hilfe sie Strukturen auf den Oberflächen von Fremdstoffen und Pathogenen erkennen können. Im Ergebnis dieser Erkennung proliferieren die jeweiligen Lymphozytenklone (klonale Selektion der besten Binder) und differenzieren zu Effektorzellen. Während die T-Zellrezeptoren auf den Oberflächen verbleiben, können die B- Zellrezeptoren als lösliche Proteine, sogenannte Antikörper, in das Serum und im Rahmen des mucosalen Immunsystems auch in die Mundhöhle oder den Dünndarm sekretiert werden. Diese löslichen Antiköper gehören zu den humoralen Komponenten des Immunsystems. Eine effektive adaptive Immunantwort führt zur Bekämpfung einer akuten Infektion und zum Immunschutz auch vor späteren Infektionen. Immunschutz kann künstlich durch Vakzinierung (aktive Immunisierung) oder durch die Verabreichung von Antikörpern (passive Immunisierung) hervorgerufen werden. Unter aktiver Immunisierung versteht man das Einbringen eines Antigens in den Körper, wodurch der Körper selbst angeregt wird, eine Immunität gegen dieses Target zu entwickeln. Aktive Immunisierung wird normalerweise in der Prophylaxe, zum Beispiel bei der Impfung, verwendet, jedoch weniger in der Behandlung von akuten Infektionen.
Bei der passiven Immunisierung werden vorgefertigte Antikörper in den Organismus transferiert. Diese Methode der Immunisierung wirkt relativ schnell, hat jedoch keinen lang anhaltenden Effekt, da die Antikörper auf natürlichem Wege abgebaut werden und es keine B-Zellen gibt, die weitere Antikörper produzieren könnten. Einer der Hauptnachteile der passiven Immunisierung ist die schwache Stabilität der meisten Antikörper. Vor allem die orale Administration ist nur wenig effektiv, da Antikörper im Magen-Darm-Trakt denaturiert und degradiert werden, zum einen durch Enzyme, zum anderen durch den niedrigen pH-Wert. Eine orale Administration wäre jedoch wünschenswert, da diese kostengünstig und einfach zu realisieren ist. Dies trifft vor allem für die Immunisierung von Nutztieren zu, da es besonders aufwendig ist, jedes Tier einzeln zu behandeln.
Ein weiterer Nachteil der passiven Immunisierung im Stand der Technik ist, dass fremde Antikörper selbst eine Immunreaktion auslösen können. Da der Antikörper vom eigenen Immunsystem als „fremd" erkannt wird, wird auch dieser angegriffen, was zu einer Vielzahl von unerwünschten Nebenwirkungen führt.
Antikörper bestehen typischerweise aus zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten, die zu einer y-förmigen Struktur miteinander verknüpft sind. Dabei bestehen die leichten Ketten aus jeweils einer variablen und einer konstanten Domäne. Die schweren Ketten weisen jeweils eine variable und 3 beziehungsweise 4 konstante Domänen auf. Die Antigenbindungsstellen werden durch die variablen Domänen einer leichten (VL) und einer schweren Kette (VH) gebildet. Klassische Antikörper enthalten daher 2 Antigenbindungsstellen. Bei den leichten Ketten kann es sich entweder um Kappa- oder Lambda-Ketten handeln. Bei den schweren Ketten kann es sich μ-, δ-, ε- oder verschiedene γ- Ketten handeln. Die konstanten Teile (Fc) der schweren Ketten bestimmen die Klasse (Isotyp) des jeweiligen Immunglobulins. Die Fc-Region eines Antikörpers ist für die Interaktion mit den auf Zelloberflächen sitzenden verschiedenen Fc-Rezeptoren und Proteinen des Komplementsystems verantwortlich (Effektorfunktionen). In einigen Fällen kann die Verhinderung der Wechselwirkung mit Fc-Rezeptoren auch therapeutisch gewünscht sein.
Ein Antikörper kann durch enzymatische Spaltung in ein Fab-Fragment und einen restlichen Fc- Teil zerlegt werden. Dabei besteht das Fab-Fragment aus der kompletten leichten Kette sowie einem Teil der schweren Kette, nämlich der variablen Region, und einem Teil der konstanten Region.
Die variablen Regionen eines bestimmten Antikörpers unterscheiden sich von denen eines jeden anderen, dabei ist die Sequenzvariabilität jedoch nicht gleichmäßig über die variable Region verteilt, sondern konzentriert sich in bestimmten Abschnitten. Es gibt 3 besonders variable Regionen in den VH- und VL-Domänen, die hypervariablen Regionen, auch komplementaritätsbestimmende Regionen genannt (CDR 1 , CDR 2, CDR 3). Die Variabilität der Antikörper entsteht während der B-Lymphozytenreifung durch verschiedene genetische Mechanismen (Rekombination, Mutagenese). Sie kann in rekombinanten Systemen auch künstlich erzeugt werden (synthetische und semisynthetische Phage .Display Libraries).
Eines der kleinsten Moleküle mit einer kompletten Antigen-Bindestelle ist der sogenannte Einzelkettenantikörper (scFv). Ein scFv ist eine Fusion einer variablen Region einer schweren Kette (VH) und einer variablen Region einer leichten Kette (VL) eines Immunglobulins, wobei beide Regionen über einen Linker miteinander verbunden sind. Auch eine VH-Kette allein ist in der Lage, Antigene spezifisch zu binden. Das trifft insbesondere auf VH-Ketten cameloiden Ursprungs zu, wenn diese von sogenannten Single domain Antikörpern stammen, die natürlicherweise keine leichten Ketten enthalten.
Antikörperkonstrukte, die aus einer einzelnen, monomeren variablen Domäne eines Antikörpers aufgebaut sind, werden Einzeldomänenantikörper, Single domain Antikörper, Nanobodies oder Nanoantikörper genannt. Sie sind die kleinsten Antikörperfragmente, die zur Antigenerkennung befähigt sind. Häufig werden cameloide Antikörper (VHH) als Einzeldomänenantikörper verwendet. Der Einsatz von cameloiden Antikörpern wird zum Beispiel in der GB 2416768 A (Erasmus Universität Rotterdam, 2006) oder in der EP 1864998 A2 (Erasmus Universität Rotterdam, 2007) beschrieben. Hier werden VHH-Ketten unter anderem mit CH-Ketten fusioniert. Eine breite Verwendung von Einzeldomänenantikörpern scheiterte bisher an der schlechten Expression. Ein weiterer Nachteil sind extrem niedrige Resorptionsquoten, wodurch eine mögliche systemische Anwendung von Einzeldomänenantikörpern deutlich eingeschränkt wird.
In einer Veröffentlichung von DuI et al (Ig light chains are secreted predominantly as monomers. J Immunol 1996 Oct 1 ;157(7):2969-75) werden VH-CL Fusionsproteine beschrieben. Die Konstrukte weisen keinen Linker auf und wurden für die Untersuchung von Dimerbildungen hergestellt. Diese Fusionsproteine konnten jedoch nicht zur Neutralisierung von Antigenen verwendet werden und lösen daher nicht das der Erfindung zugrunde liegende Problem.
Lee et al beschrieben 1999 in der Veröffentlichung „Generation and characterization of a novel single-gene-encoded single-chain immunoglobulin molecule with antigen binding activity and effector functions" (Molecular Immunology 36 (1999) 61 - 71 ) ein neues Antikörperformat, welches sich durch eine Verbindung von VH und CL auszeichnet. Das hier beschriebene Antikörperformat ist jedoch nicht klein genug, um die Nachteile im Stand der Technik zu überwinden. Die Antikörper weisen außer den VH und CL Domänen auch CH und VL Domänen auf, so dass der Aufbau den herkömmlichen Antikörpern aus dem Stand der Technik gleicht.
Neben der Bildung von Antikörpern durch das Immunsystem des jeweiligen Organismus kann die Erzeugung von Antikörpern auch durch zellbiologische und molekularbiologische Verfahren erfolgen. Solche Antikörper können als Mittel sowohl bei der biochemischen und molekularbiologischen Forschung als auch in der Diagnostik und bei klinischen Anwendungen eingesetzt werden. Vor allem bei medizinischen Anwendungen können in vielen Fällen rekombinante Antikörperfragmente jedoch nur schwer direkt eingesetzt werden, da diese zumeist nur eine sehr kurze Halbwertszeit in vivo aufweisen und damit gegebenenfalls ihr Ziel- Antigen nicht erreichen. Diese Probleme treten verstärkt bei der oralen Administration von Antikörpern auf, da diese im Magen-Darm-Trakt durch Enzyme und den niedrigen pH-Wert im Magen abgebaut werden.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass auf klassische Weise und durch zellbiologische Verfahren erzeugte Antikörper eine sehr wichtige Rolle bei der Therapie von vielen Erkrankungen in der Human- und Veterinärmedizin spielen. Die Nutzung von Antikörpern, die durch genetic engineering Technologien erzeugt wurden, steht am Anfang einer vielversprechenden Entwicklung. Darüber hinaus spielen alle Formen von Antikörpern in der Diagnostik eine wichtige Rolle. Für alle Anwendungen ist die Verbesserung der Stabilität bei Erhalt oder Verbesserung der Bindungsspezifität, -affinität und -avidität eine wichtige Voraussetzung.
Spezieller Beschreibunqsteil
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein neues antigenbindendes Polypeptid, im Speziellen ein Antikörperformat bereitzustellen, welches die genannten Nachteile im Stand der Technik nicht aufweist. Diese Polypeptide sollen vor allem für die passive Immunisierung und/oder die Therapie einsetzbar sein, ohne die genannten Limitationen aufzuweisen. Die Aufgabe konnte durch die Ausführungsformen der Ansprüche realisiert werden.
In einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polypeptid, umfassend
• eine variable Domäne einer schweren Kette, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend VH und/oder VHH,
• eine konstante Domäne einer leichten Kette,
• optional einen Linker, wobei dieser Linker zwischen der variablen Domäne der schweren Kette und der konstanten Domäne der leichten Kette angeordnet ist, wobei
ein Polypeptid, bestehend aus VH und der konstanten Domäne einer leichten Kette ausgeschlossen ist.
Im Sinne der Erfindung werden cameloide VH-Ketten auch VHH-Ketten genannt. Die oben beschriebene Ausführungsform. ist bevorzugt ein Monomer im Sinne der Erfindung. Im Sinne der Erfindung wird eine konstante Domäne einer leichten Kette auch als CL oder CLe,cht bezeichnet. Eine CL-Kette im Sinne der Erfindung kann ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend CKappa und/oder CLambda, welche auch als Kappa-Kette oder Lambda-Kette bezeichnet werden.
Diese Polypeptide zeichnen sich durch überraschende funktionelle Merkmale aus und haben viele Vorteile gegenüber dem Stand der Technik. Die geringere Lipophilie der Moleküle führt zu einer besonders guten Löslichkeit. Zusätzlich handelt es sich um Peptide mit einer hohen Hitzebeständigkeit. Im Gegensatz zu klassischen Antikörpern, die durch Hitze inaktiviert werden können, bleibt die Fähigkeit der Antigenbindung bei Konstrukten der Erfindung auch nach einer Hitzebandlung bei 90 0C erhalten.
Ein besonders wichtiger Vorteil der Erfindung liegt in der signifikant erhöhten Expression. Die schlechte Expression von Einzeldomänenantikörpern verhinderte bisher deren Einsatz in vielen Gebieten der Medizin und Biotechnologie. Es war völlig überraschend, dass eine Fusion von Einzeldomänenantikörpern mit einer konstanten Domäne einer leichten Kette eine solch erhöhte Expression bewirken kann.
Vor allem in Pflanzen konnte eine besonders hohe Expression und Stabilität erreicht werden. Bisher war die Expression von Einzeldomänenantikörpern in Pflanzen nur in niedrigen Konzentrationen möglich, was sich unter anderem nachteilig auf die Kosten und den Aufwand der Produktion auswirkt. Die Polypeptide der Erfindung hingegen können problemlos in Pflanzen exprimiert werden.
Bevorzugte Polypeptide im Sinne der Erfindung sind Peptide bestehend aus
VHH und CL,
VHH1 Linker und CL oder
VH, Linker und CL.
Diese Polypeptide können überraschenderweise besonders gut in Pflanzen exprimiert werden. Die Expression in Pflanzen ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Herstellung der Polypeptide. Außerdem kann auf Tiermodelle verzichtet werden, was neben den Ersparnissen an Zeit, Raum und Geld auch ethische Vorteile mit sich bringt.
Humane VH-Ketten sind besonders gut geeignet, um die erfindungsgemäße Aufgabe zu lösen. Polypeptide, bestehend aus einer humanen VH-Kette, einer konstanten Domäne einer leichten Kette und einem Linker, zeichnen sich überraschenderweise durch eine besonders niedrige inhärente Toxizität aus. Wird eine humane VH-Kette an Stelle einer VHH-Kette verwendet, muss ein Linker zwischen der VH-Kette und der konstanten Domäne einer leichten Kette angeordnet sein, um die erfindungsgemäßen Vorteile zu erzielen. Überraschenderweise sind selbst besonders kurze Linker (zum Beispiel 1 - 15 Aminosäuren) geeignet, um zu einer erhöhten Stabilität zu führen.
Ein Monomer, bestehend aus einer VHH-Kette und einer CL-Kette, ist vorteilhaft, da hier die Vorteile eines VHH-Antikörpers besonders gut realisiert werden können. Einzeldomänenantikörper, die aus Schwerkettenantikörpem von Kamelen gewonnen wurden, besitzen im Vergleich zu den variablen Domänen klassischer Antikörper ausgeprägte antigenerkennende Loop-Strukturen. Dadurch sind diese Antikörper in der Lage, solche Antigenstrukturen zu erkennen, die für klassische Antikörper unerreichbar bleiben. Dazu zählen zum Beispiel katalytische Zentren von Enzymen. Es war völlig überraschend, dass diese Eigenschaft der VHH-Antikörper auch nach einer Fusion mit einer konstante Domäne einer leichten Kette erhalten blieb. Außerdem vorteilhaft ist ein Polypeptid, umfassend eine VHH- Kette und eine konstante Domäne einer leichten Kette, wobei kein Linker zwischen beiden Ketten angeordnet ist. Es war dabei besonders überraschend, dass durch die Verwendung einer VHH-Kette an Stelle einer VH-Kette auf den Linker verzichtet werden kann. Auch ohne den Linker weist die Kombination aus VHH und CLeιCht eine hohe Stabilität und eine erhöhte Halbwertszeit auf.
Auch die Verwendung eines Monomers, bestehend aus VHH-Kette und CL-Kette, verbunden über einen Linker, führt zu überraschend guten Ergebnissen. Durch den Linker kann die Konformation des Polypeptides beeinflusst werden, so dass eine erhöhte sterische Stabilität erreicht werden kann.
Polypeptide im Sinne der Erfindung werden wie folgt definiert:
Die Grundstruktur eines Polypeptids ist im Stand der Technik wohlbekannt und in zahlreichen Standardwerken oder Publikationen beschrieben. 1m Zusammenhang mit der Erfindung wird der Term „Polypeptid" dazu verwendet, jedes Peptid oder Protein zu beschreiben, welches Aminosäuren umfasst, die durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Es werden sowohl kurze Ketten, welche oft auch als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch längere Ketten, welche generell Proteine genannt werden, umfasst.
Dem Fachmann ist bekannt, dass Polypeptide oft andere als die 20 Aminosäuren, welche allgemein als 20 natürlich vorkommende Aminosäuren bezeichnet werden, beinhalten können. Außerdem können Aminosäuren modifiziert sein beispielsweise Glykosylierungen oder andere posttranslationale Modifikationen beinhalten. Auch chemische Modifikationen sind im Stand der Technik bekannt. Beispiele für Modifikationen sind Glykosylierung, Lipid-Attachment, Sulfonierung, Gamma-Carboxylierung, Hydroxylierung oder ADP-Ribosylierung. Außerdem ist bekannt, dass Polypeptide nicht immer komplett linear sein müssen. Zum Beispiel gibt es Polypeptide, die verzweigt oder zirkulär sind.
In der allgemeinen Form, wie der Term Polypeptid hier verwendet wird, sind alle Modifikationen umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Dimer eines Polypeptids, umfassend zwei Monomere, jeweils umfassend
• eine variable Domäne einer schweren Kette, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend VH und/oder VHH,
• eine konstante Domäne einer leichten Kette (CL) und
• optional einen Linker, wobei dieser Linker zwischen der variablen Domäne der schweren Kette und der konstanten Domäne der leichten Kette angeordnet ist, wobei
ein Dimer, bestehend aus zwei Monomeren, jeweils bestehend aus VH und der konstanten Domäne einer leichten Kette ausgeschlossen ist.
Ein Problem im Stand der Technik ist die ungenügende Stabilität sowie kurze Halbwertszeiten von einzelnen VHH- oder VH-Ketten. Dieses Problem konnte besonders gut durch ein erfindungsgemäßes Dimer gelöst werden. Die zwei konstanten Domänen einer leichten Kette wirken stabilisierend und es konnten zusätzlich deutlich verlängerte Halbwertszeiten erreicht werden. Dies wird teilweise über die Größe des Dimers und durch die Dimerisierung erreicht. Der Effekt ist jedoch so groß, dass andere, bisher unbekannte Ursachen zusätzlich dafür verantwortlich sein müssen. Dies war völlig überraschend und konnte von einem Fachmann nicht vermutet werden.
Überraschenderweise sind die erfindungsgemäßen Dimere auch beständiger gegenüber Magensäure. Sie weisen eine geringe Anzahl an proteolytischen Sites auf und sind somit resistenter gegenüber proteolytischen Enzymen als Antikörper im Stand der Technik.
Ein weiterer Vorteil der Monomere und Dimere der Erfindung liegt darin, dass sie aufgrund der geringen Größe den Magen-Darm-Trakt gut passieren können. Damit eignen sich die erfindungsgemäßen Polypeptide für lokal-perorale Anwendung.
Auch die Dimere der Erfindung können in Pflanzen hergestellt werden, wodurch die Produktion überraschend erleichtert wird. Überraschenderweise konnte das der Erfindung zugrundeliegende Problem besonders gut durch die folgenden Varianten gelöst werden:
• Dimer, umfassend 2 Monomere, jeweils umfassend eine VHH-Kette und eine konstante Domäne einer leichten Kette,
• Dimer, umfassend 2 Monomere, jeweils umfassend eine VHH-Kette und eine konstante Domäne einer leichten Kette, verbunden durch einen Linker,
• Dimer, umfassend 2 Monomere, jeweils umfassend eine VH-Kette und eine konstante Domäne einer leichten Kette, verbunden durch einen Linker.
Somit verbindet der Linker die VH-Kette eines Monomers mit der CL-Kette des selben Monomers. Es war überraschend, dass dieser Linker eine deutlich erhöhte sterische Stabilität des Moleküls zur Folge hat, wenn die variable Domäne einer schweren Kette eine humane VH- Kette ist.
Dimere, umfassend 2 Monomere, jeweils umfassend eine VHH-Kette und eine konstante Domäne einer leichten Kette zeigen eine besonders gute Gewebepermeabilität und sind daher vor allem für therapeutische Ansätze gut geeignet.
Dimere, umfassend 2 Monomere, jeweils umfassend eine VHH-Kette und eine konstante Domäne einer leichten Kette, verbunden durch einen Linker, zeichnen sich durch eine besonders hohe Stabilität aus. Überraschenderweise führt das Einbringen eines Linkers nicht dazu, dass die Dimere Enzymen mehr Angriffsfläche bieten. Im Gegenteil scheint der Linker eine Konformation zu ermöglichen, welche die Peptide besonders gut vor Abbau und Denaturierung schützt.
Dimere, umfassend 2 Monomere, jeweils umfassend eine VH-Kette und eine konstante Domäne einer leichten Kette, verbunden durch einen Linker, sind besonders bevorzugt, da sie eine extrem hohe Affinität für ihr Target aufweisen und außerdem besonders gut in Pflanzen exprimiert werden können.
Ein Vorteil, den alle Polypeptide der Erfindung zeigen, liegt in dem Fehlen des FC-Fragments. Dadurch kann eine Aktivierung des Komplementsystems verhindert werden, wodurch weniger Nebenwirkungen verursacht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Dimer eines Polypeptids, umfassend • eines der genannten Monomere und
• ein Monomer, umfassend
o eine konstante Domäne einer leichten Kette und
o ein Markermolekül.
Ein Markermolekül im Sinne der Erfindung kann beispielsweise ein Fluoreszenzmolekül sein. Ein solches Dimer ist besonders gut für diagnostische Anwendungen geeignet. Es war dabei überraschend, dass es möglich ist, ein Markermolekül in ein Dimer der Erfindung zu integrieren, ohne dass das Dimer seine vorteilhaften Eigenschaften verliert.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Antikörperkonstrukt, umfassend
• zwei konstante Domänen einer leichten Kette, wobei die zwei konstanten Domänen einer leichten Kette wirkverbunden sind, bevorzugt durch eine Disulfidbrücke und
• zwei variable Domänen einer schweren Kette,
• optional einen Linker, der jeweils die variable Domäne einer schweren Kette mit der konstanten Domäne einer leichten Kette verbindet.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Antikörperkonstrukt, umfassend
• zwei variable Domänen einer schweren Kette, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend VH und VHH,
• zwei konstante Domänen einer leichten Kette, wobei die zwei konstanten Domänen einer leichten Kette wirkverbunden sind, bevorzugt durch eine Disulfidbrücke und
• optional einen Linker, der jeweils die variable Domäne einer schweren Kette mit der konstanten Domäne einer leichten Kette verbindet, wobei
ein Antikörperkonstrukt, bestehend aus zwei konstante Domänen einer leichten Kette und zwei humanen VH-Ketten, ausgeschlossen ist.
Der Begriff „Antikörper", wie in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet, betrifft sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper. Der Begriff soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon, wie zum Beispiel Fv, scFv, Fab und F(ab')2, die zur Antigenbindung in der Lage sind, beinhalten. Außerdem werden markierte Antikörper und Fusionsproteine, die mit verschiedenen Molekülen gekoppelt sind, umfasst.
Ein „Antigen" ist ein Molekül oder ein Teil eines Moleküls, das in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden. Es kann eine Polypeptid, Protein, Nukleinsäure oder ein anderes Molekül sein.
Bevorzugt bestehen die Linker aus Aminosäuren. Besonders bevorzugt ist der Linker ausgewählt aus der Gruppe, umfassend GS-Linker, Yol-Linker oder Linker mit der Sequenz GGSGGS. Der Verwendung dieser Linker führte zu einer besonders hohen Stabilität des gesamten Konstrukts. GGSGGS-Linker haben den Vorteil, dass sie keine proteolytischen Sites aufweisen und daher resistent gegenüber enzymatischem Abbau sind. Außerdem sind die bevorzugten Linker relativ unflexibel, was sich vorteilhaft auf die Konformation der Peptide auswirkt.
Bevorzugt ist, dass das Antikörperkonstrukt bispezifisch ist. Außerdem sind monospezifische Antikörperkonstrukte bevorzugt. Ob ein monospezifisches oder ein bispezifisches Antikörperkonstrukt besser geeignet ist, hängt von der jeweiligen Zielstruktur ab. Ein Vorteil von bispezifischen Konstrukten ist die Möglichkeit zwei unterschiedliche Antigene gleichzeitig zu binden. Monospezifische Antikörper binden das gleiche Antigen mit beiden Antigenbindestellen, so dass das entsprechende Antigen effizienter eliminiert oder neutralisiert werden kann. Die Verwendung von monospezifischen Antikörpern ist außerdem in diagnostischen Anwendungen vorteilhaft.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Erfindung darin, dass die variable Domäne der schweren Kette (VH) eines humanen Antikörpers beziehungsweise eines cameloiden Antikörpers (VHH) mit der konstanten Domäne der leichten Kette (CKappa bzw. CLambda) eines humanen Antikörpers fusioniert wird. Diese Fusion führt zu einer Reihe überraschender, vorteilhafter Eigenschaften wie die signifikante Erhöhung der Expression, vor allem in Pflanzen, und eine hohe Stabilität.
Eine breite Verwendung von Einzeldomänenantikörpern, bestehend aus VH, scheiterte bisher an der schlechten Expression in Pflanzen. Durch die erfindungsgemäße Fusion wird eine Expression im pflanzlichen System überhaupt erst effektiv möglich.
Einzelkettenantikörper zeichnen sich durch eine sehr geringe Immunogenität aus, was besonders vorteilhaft für die Verwendung im Nutztier- oder humanen Bereich ist. Besonders vorteilhafte Ergebnisse wurden durch die Kombination von VH- oder VHH-Ketten mit CL-Ketten erzielt, wobei die CL-Ketten aus dem entsprechenden Zielorganismus stammen. Nebenwirkungen und Abwehrreaktionen gegen die Antikörperkonstrukte können so vermieden werden.
Besonders vorteilhaft hat sich außerdem die Verwendung einer Gensequenz in der Herstellung erwiesen, die nicht durch Introns getrennt ist, welche während der Proteinexpression herausgespleißt werden. Somit entsteht während der Translation ein zusammenhängendes Protein, wobei die Sequenzen für VH und CKappa bzw. CLambda mit einem Linker verbunden sind. Bei der Verwendung von VHH wurden auch vorteilhafte Ergebnisse ohne den Linker erzielt.
Des Weiteren bevorzugt ist ein Polypeptid und/oder ein Antikörperkonstrukt, wobei das Polypeptid und/oder das Antikörperkonstrukt an ein Pathogen bindet und/oder dessen pathogenen Effekt neutralisiert. Bevorzugte Pathogene sind HIV, SARS, Coronavirus, Coccidia, Eimeria, Eimeria tenella, Hepatitis B, Mycobacterium tuberculosis und/oder Mycobacterium leprae.
Im Sinne der Erfindung ist ein Pathogen ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Viren, Bakterien, Mycoplasmen, Protozonen, Fungi, Parasiten oder andere Mikroorganismen. Der Virus ist bevorzugt aus der Gruppe, umfassend HIV, Herpesvirus, Cytomegalovirus, Tollwutvirus, Influenzavirus, Hepatitisvirus, bevorzugt Hepatitis-B-Virus, SARS Coronavirus, Epstein-Barr-Virus, Mumpsvirus, Murines Leukämievirus, Simianes Virus 40 und/oder Poliovirus. Das Bakterium kann beispielsweise ein Anthrax-Bacillus, Streptokokkus, Neisseria, Pneumokokkus, Hämophilis, Influenzae B, Pseudomonas, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae und/oder Tetanustoxin sein.
Im Sinne der Erfindung sind Parasiten Organismen, die parasitäre Infektionen hervorrufen, zum Beispiel Protozonen- beziehungsweise Protista- oder Wurminfektionen. Beispiele für Parasiten sind Trypanosomen, Trichomonada, Plasmodium, Coccidia, bevorzugt Eimeria, Annelida, Nematomorpha und/oder Trematoda.
Protozonen im Sinne der Erfindung können beispielsweise sein, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rhodesiensei, Trypanosoma brucei, Schistosoma mansoni, Schistosoma japanicum, Babesia bovis, Eimeria tenella, Onchocerca volvulus, Leishmania tropica, Trichinella spiralis, Onchocerca volvulus, Theileria parva, Taenia hydatigena, Taenia ovis, Taenia saginata, Echinococcus granulosus or Mesocestoides corti. The mycoplasma may be Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma orale, Mycoplasma arginini, Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma salivarum und Mycoplasma pneumoniae.
Die Verwendung von Polypeptiden und/oder Antikörperkonstrukten der Erfindung ist besonders vorteilhaft bei der Prophylaxe, Diagnose und/oder Behandlung von AIDS, mit AIDS assoziierten Krankheiten, Windpocken, Grippe, Ebola, Maul- und Klauenseuche, Hepatitis, Herpes simplex, Herpes zoster, HPV, Influenza, Mumps, Norovirus, Tollwut, virale Enzephalitis, Meningitis, SARS, Tuberkulose, Lepra, Leukämie, Kokzidiose, Krebs, Kreuzfeld Jakob, Malaria, Tetanus, Syphilis, Toxoplasmose, Autoimmunerkrankungen und/oder Diphterie.
Eine steigende Zahl an antibiotikaresistenten Bakterienstämmen hat den Bedarf an alternativen Behandlungsmethoden erhöht. Überraschenderweise sind die antigenbindenden Polypeptide und/oder Antikörperkonstrukte der Erfindung in der Lage, Pathogene zu neutralisieren oder zu eliminieren, welche gegenüber traditionellen Antibiotikabehandlungen resistent geworden sind.
Ein weiters Anwendungsfeld betrifft die Neutralisierung von immunologisch funktionellen Molekülen. Beispiele für immunologisch funktionelle Moleküle sind TNF, Hormone, Zytokine, Transmitter oder second Messanger. Immunologisch funktionelle Moleküle spielen beispielsweise in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten eine große Rolle. Das Neutralisieren oder Eliminieren solcher Moleküle mit Hilfe der erfindungsgemäßen Polypeptide oder Antikörperkonstrukte kann bei der Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen eingesetzt werden.
Im Sinne der Erfindung kann ein antigenbindendes Polypeptid oder Antikörperkonstrukt so konstruiert werden, dass es jedes Zielantigen binden beziehungsweise erkennen kann. Der Fachmann weiß, wie er CDR-Regionskombinationen selektieren kann, so dass ein bestimmtes Antigen gebunden werden kann. Jedes antigenbindende Polypeptid oder Antikörperkonstrukt mit der oben genannten Struktur ist ein Polypeptid oder Antikörperkonstrukt der Erfindung, unabhängig von der Antigenspezifität.
Auch bevorzugt ist ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt, wobei beide konstanten Domänen einer leichten Kette Kappa-Domänen sind.
Überraschenderweise führt die Verwendung von Kappa-Ketten zu einer erhöhten Bioaktivität nach Expression in Pflanzen, was in einer besonders hohen Effektivität resultiert. Außerdem ist die Verwendung von Kappa-Ketten vorteilhaft, da die transiente Expression dieser Antikörperkonstrukte überraschend hoch ist. Die Verwendung von Kappa-Ketten resultiert außerdem überraschenderweise in einer hohen Aktivität in vitro und in vivo. Eine erhöhte Aktivität ist besonders vorteilhaft für therapeutische Anwendungen, da geringere Dosen eingesetzt werden können, was hilft, Nebenwirkungen zu verhindern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt, wobei beide konstanten Domänen einer leichten Kette Lambda-Domänen sind. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass Lambda-Ketten besonders für
Anwendungen bei Hühnern oder Kaninchen geeignet sind. Außerdem bevorzugt ist ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt, wobei die konstanten Domänen einer leichten Kette miteinander verbunden sind, bevorzugt über eine Disulfidbrücke und/oder hydrophobe Interaktion.
Dimere, die über eine nicht kovalente Assoziation formiert werden, dissoziieren oft, was ein Problem im Stand der Technik darstellt. Eine schlechte Stabilität beeinträchtigt die Fähigkeit der Antikörper oder Antikörperdomänen sich nach der Expression in einem Zellsystem (z. B. bakteriellen oder Säugetiersystemen) richtig zu falten. Überraschenderweise zeigen die Polypeptide oder Antikörperkonstrukte der Erfindung das Problem der Dissoziierung nicht. Die Monomere sind in der Art wirkverbunden, dass eine stabile Struktur des Dimers entsteht. Die Disulfidbrücke führt außerdem zu einer erhöhten proteolytischen Stabilität, so dass das Polypeptid resistenter gegen enzymatische Spaltungen ist.
Auch bevorzugt ist die Verwendung von hydrophoben Interaktionen, um die Monomere miteinander wirkzuverbinden. Hydrophobe Interaktionen können unter bestimmten Umständen vorteilhaft gegenüber kovalenten Verbindungen sein. Der Fachmann weiß, dass es unterschiedliche Wege gibt, zwei Ketten eines Antikörpers oder Polypeptids miteinander zu verbinden. Die Disulfidbrücken und hydrophobe Interaktionen sind die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung. Es versteht sich jedoch, dass jede Art der Verbindung, kovalent oder nicht kovalent, wie sie im Stand der Technik bekannt ist, verwendet werden kann, um die Ketten der Polypeptide oder Antikörperkonstrukte der Erfindung miteinander zu verbinden. Der Fachmann weiß, unter welchen Umständen welche Art der Verbindung vorteilhaft sein kann.
Des Weiteren bevorzugt ist die Verwendung eines Polypeptids und/oder Antikörperkonstrukts für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Infektionen, bevorzugt Infektionen assoziiert mit HIV, SARS, Coronavirus, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Hepatitis B, Eimeria, speziell Eimeria tenella.
Auch bevorzugt ist ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt, wobei das Polypeptid und/oder das Antikörperkonstrukt ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid ist.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass Antikörperkonstrukte ohne einen Fc-Teil schneller aus dem Kreislauf ausgeschieden werden und deshalb ungeeignet für therapeutische Zwecke sind. Umso überraschender war es, dass die Antikörperkonstrukte der Erfindung eine hohe Stabilität im Körper aufweisen.
Außerdem ist die Verwendung von Nicht-Immunglobulin-Peptiden vorteilhaft, da diese keine Fc- Region aufweisen, welche, in diagnostischen Anwendungen oft für eine erhöhte
Hintergrundfärbung zuständig ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt der Erfindung kodiert.
Der Term Polynukleotide bezieht sich im Allgemeinen auf Polyribonukleotide oder Polydeoxyribonukleotide, welche modifizierte oder unmodifizierte RNA oder DNA darstellen. Zum Beispiel kann der Term Polynukleotide im Sinne der Erfindung unter anderem dafür verwendet werden, Einzelstrang- oder Doppelstrang-DNA, welche aus Einzelstrang- und Doppelstrangregionen besteht, Einzelstrang- oder Doppelstrang-RNA, RNA, die aus Einzelstrang und Doppelstrangregionen besteht, Hybridmoleküle, umfassend DNA und RNA, welche einzelsträngig oder beides sein können, zu beschreiben. Im Sinne der Erfindung können Polynukleotide modifizierte Basen enthalten. Auch das DNA- oder RNA-Grundgerüst kann modifiziert sein. Außerdem können Polynukleotide ungewöhnliche Basen sowie Inosine, modifizierte Basen sowie Tritium-markierte Basen enthalten. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Modifikationen zu unterschiedlichen Zwecken bekannt. Der Term „Polynukleotid", so wie er hier verwendet wird, umfasst chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Polynukleotide sowie die chemischen Formen von DNA- oder RNA-Molekülen, welche charakteristisch für bestimmte Viren oder Zellen sind.
Auch bevorzugt ist ein Nukleotidkonstrukt, umfassend ein Polynukleotid, wobei dieses Polynukleotid wirkverbunden mit einem Promotor ist, der die Expression in einer Wirtszelle reguliert.
Bevorzugt sind samenspezifische Promotoren, zum Beispiel USP oder LeB4. Die Vorteile einer Expression in Samen liegen in deren guter Lagerfähigkeit, ohne dass Lagerkosten entstehen. Außerdem ist der Proteingehalt in Samen besonders hoch, und die exprimierten Peptide sind hochaktiv.
Der Term „Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche die Transkription eines Genes oder eines Nukleinsäureabschnittes reguliert, so dass mRNA hergestellt wird. Typischerweise ist ein Promotor in der 5'-Region eines Genes lokalisiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Vektor, umfassend ein Polynukleotid und/oder eine Nukleotidkonstrukt.
Der Term „Vektor" beinhaltet ein Nukleinsäuremolekül, welches in der Lage ist, ein anderes Nukleinsäuremolekül, an welches der Vektor gebunden ist, zu transportieren. Vektoren sind beispielsweise Plasmide oder virale Vektoren. Außerdem bevorzugt ist ein Vektor, wobei der Vektor ein Phagen-Display-Vektor, ein bakterieller Expressionsvektor, ein Hefeexpressionsvektor, ein Fungusexpressionsvektor, ein Algenexpressionsvektor und/oder ein Pflanzenexpressionsvektor ist.
Des Weiteren bevorzugt ist eine Wirtszelle, umfassend ein Polynukleotid der Erfindung, ein Nukleotidkonstrukt der Erfindung, ein Vektor der Erfindung und/oder ein Polypeptid der Erfindung und/oder ein Antikörperkonstrukt der Erfindung.
Auch bevorzugt ist eine Wirtszelle, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Funguszelle, eine Algenzelle und/oder eine Pflanzenzelle.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Wirtszelle, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend eine Escherichia coli Zelle, eine Streptomyces Zelle, eine Arxula Zelle, eine Pichia pastoris Zelle, eine Schizosaccharomyces Zelle, eine Aspergillus Zelle, eine Chlamydomonas Zelle, eine Nicotiana spec. Zelle, bevorzugt Nicotiana benthamiana Zelle, eine Pisum sativum Zelle, eine Hordeum vulgäre Zelle, eine Zea mays Zelle, eine Rapszelle, eine Cucumis sativus Zelle und/oder Linum usitatissimum Zelle.
Auch bevorzugt ist eine transgene Pflanze, Teile davon und/oder Mikroorganismen, umfassend ein Polynukleotid der Erfindung, ein Nukleotidkonstrukt der Erfindung und/oder einen Vektor der Erfindung.
Des Weiteren bevorzugt ist eine Zusammensetzung, umfassend ein Polynukleotid der Erfindung, ein Nukleotidkonstrukt der Erfindung, ein Polypeptid der Erfindung und/oder ein Antikörperkonstrukt der Erfindung und einen geeigneten Träger, Puffer, Stabilisator und/oder Bindemittel.
Auch bevorzugt ist eine Zusammensetzung, wobei der Träger, Puffer, Stabilisator und/oder Bindemittel Proteine umfasst, bevorzugt BSA, Milchpulver und/oder Erbsenmehl, Mikropartikel und/oder Gelantinekapseln.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der transgenen Pflanze, der Teile davon und/oder der Mikroorganismen für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Infektionen, bevorzugt Infektionen assoziiert mit HIV, Hepatitis B, SARS, Coronavirus, Coccidia, Eimeria, bevorzugt Eimeria tenella, Mycobacterium tuberculosis und/oder Mycobacterium leprae.
Die Verwendung von transgenen Pflanzen oder der Teilen davon ist besonders vorteilhaft, da diese einfach, schnell und oral aufgenommen werden können. Diese Ausführungsform bietet sich vor allem bei der Behandlung, Diagnose oder Prävention von Erkrankungen von Nutztieren an. Es ist besonders aufwändig Tiere einzeln zu behandeln. Dies kann mit der erfindungsgemäßen Lehre umgangen werden, da die Polypeptide oder Antikörperkonstrukte einfach mit dem Futter aufgenommen werden können. Dies führt zu einer erheblichen Kostenreduktion sowie einer schnellen und effektiven Behandlung einer Vielzahl von Tieren gleichzeitig.
Es kann außerdem vorteilhaft sein, die erfindungsgemäßen Polypeptide oder Antikörperkonstrukte zu applizieren. Eine solche Anwendung kann vor allem im humanen Bereich oder für die Immunisierung oder Behandlung von besonders wertvollen Nutztieren, beispielsweise Zuchttieren, vorteilhaft sein.
Die anmeldungsgemäße Lehre zeichnet sich außerdem durch folgende Merkmale aus
- Abkehr vom technisch Üblichen
- neue Aufgabenstellung
- Vorliegen eines seit langem ungelösten, dringenden Bedürfnisses für die Lösung des mit der Erfindung gelösten Problems
- bisheriges vergebliches Bemühen der Fachwelt
- die Einfachheit der Lösung spricht für erfinderische Tätigkeit, insbesondere da sie kompliziertere Lehren ersetzt
- Entwicklung der wissenschaftlichen Technik ging in eine andere Richtung
- entwicklungsstraffende Leistung
- Fehlvorstellungen der Fachwelt über die Lösung des entsprechenden Problems (Vorurteil)
- technischer Fortschritt, wie z. B.: Verbesserung, Leistungssteigerung, Verbilligung, Ersparnis an Zeit, Material, Arbeitsstufen, Kosten, erhöhte Zuverlässigkeit, Beseitigung von Fehlern, Qualitätshebung, Wartungsfreiheit, größere Effektivität, höhere Ausbeute, Vermehrung der technischen Möglichkeiten, Bereitstellung eines weiteren Mittels, Eröffnung eines zweiten Weges, erstmalige Lösung einer Aufgabe, Automatisierung, Bereicherung des Arzneimittelschätzes - glücklicher Griff, da aus einer Vielzahl von Möglichkeiten eine bestimmte gewählt wurde, deren Ergebnis nicht vorausgesagt werden konnte, daher handelt es sich um ein patentwürdigen glücklichen Griff
- junges Gebiet der Technik
- Kombinationserfindung, das heißt mehrere, bekannte Elemente werden zu einer Kombination zusammengeführt, die einen überraschenden Effekt aufweist
- wirtschaftlicher Erfolg.
Insbesondere die vorteilhaften Ausführungsformen der Erfindung weisen mindestens einen oder mehrere der genannten Vorteile auf.
Beispiel
Ausführungsbeispiel anti TNFalpha VHH Ck
Tumomecrosisfaktor alpha ist ein trimeres Protein, das bei inflammatorischen Erkrankungen (Morbus Crohn, rheumatoide Arthritis) wichtig ist. Dagegen existieren therapeutische Antikörper und therapeutische Rezeptorderivate. Ein Nanobody (VHH) gegen hTNFalpha wurde von Coppieters et al. (2006) beschrieben. Dieser Nanobody wurde hier genutzt. Ein anti TNFalpha VHH Ckappa Antikörper wurde konstruiert (vgl. Figur 1 ) und in N. benthamiana mit Hilfe eines Shuttlevektors und Agrobakterium tumefaciens transient exprimiert. Durch Affinitätschromatografie unter Verwendung des His-Tags wurde der Antikörper gereinigt, und anschließend wurden durch Size-Exclusion-Chromatography Monomere von Dimeren getrennt. Die erfolgreiche Trennung wurde durch Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen gezeigt (vgl. Figur 2).
Die gereinigten Dimere und Monomere wurden funktional charakterisiert. Zunächst wurden in einem kompetitiven ELISA die Affinitätskonstanten bestimmt (vgl. Figur 3). Das Dimer wies eine beinahe 10-fach bessere Affinitätskonstante auf. Da diese Dimerisierung durch pflanzliche Expression sehr einfach zu erreichen ist und keine zusätzlichen Dimerisierungsenzyme oder chemischen Reagenzien dafür notwendig sind, ergibt sich hier ein klarer Vorteil von Dikappa- Konstrukten und pflanzlicher Expression. In weiterführenden Untersuchungen wurde geprüft, inwieweit anti human TNFalpha VHH-Ckappa-Antikörper-Dimere und -Monomere die zytotoxische Wirkung von TNFalpha auf humane Zellen neutralisieren können. Hier zeigte es sich, dass Dimere ebenfalls etwa 10-fach besser neutralisieren können.
Weiterhin wurden noch 2 spezifische, humane, schwere Ketten gegen das Haemagglutinin des Vogelgrippevirus (aHA1-VH4; aHA-VH10) in das Dikappaformat umgewandelt und erfolgreich in Pflanzen exprimiert.

Claims

Ansprüche
1. Polypeptid, umfassend
• eine variable Domäne einer schweren Kette, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend VH und/oder VHH,
• eine konstante Domäne einer leichten Kette,
• optional einen Linker, wobei dieser Linker zwischen der variablen Domäne der schweren Kette und der konstanten Domäne der leichten Kette angeordnet ist, wobei
ein Polypeptid, bestehend aus VH und der konstanten Domäne einer leichten Kette, ausgeschlossen ist.
2. Dimer eines Polypeptids, umfassend zwei Monomere, nach Anspruch 1 , wobei
ein Dimer, bestehend aus zwei Monomeren, jeweils bestehend aus VH und der konstanten Domäne einer leichten Kette, ausgeschlossen ist.
3. Dimer eines Polypeptids, umfassend
• ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder ein Monomer nach Anspruch 2 und
• ein Monomer, umfassend
o eine konstante Domäne einer leichten Kette und
o ein Markermolekül.
4. Ein Antikörperkonstrukt, bevorzugt nach Anspruch 2, umfassend
• zwei konstante Domänen einer leichten Kette, wobei die zwei konstanten Domänen einer leichten Kette wirkverbunden sind, bevorzugt durch eine Disulfidbrücke,
• zwei variable Domänen einer schweren Kette, wobei jede variable Domäne einer schweren Kette mit einer konstanten Domäne einer leichten Kette bevorzugt über einen Linker, verbunden ist.
5. Ein Polypeptid und/oder ein Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid und/oder das Antikörperkonstrukt an ein Pathogen bindet und/oder dessen pathogenen Effekt neutralisiert, bevorzugt, HIV1 SARS, Coronavirus, Coccidia, Eimeria, Eimeria tenella, Hepatitis B, Mycobacterium tuberculosis und/oder Mycobacterium leprae.
6. Ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die konstante Domäne einer leichten Kette eine Kappadomäne ist.
7. Ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die konstante Domäne einer leichten Kette eine Lambdadomäne ist.
8. Ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die konstanten Domänen einer leichten Kette miteinander verbunden sind, bevorzugt über eine Disulfidbrücke und/oder hydrophobe Interaktion.
9. Verwendung eines Polypeptids und/oder Antikörperkonstrukts nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Infektionen, bevorzugt Infektionen assoziiert mit HIV, SARS, Coronavirus, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Hepatitis B, Eimeria, speziell Eimeria tenella.
10. Ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid und/oder das Antikörperkonstrukt ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid ist.
11. Ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
12. Ein Nukleotidkonstrukt, umfassend ein Polynukleotid nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei diese Polynukleotid wirkverbunden mit einem Promotor ist, der die Expression in einer Wirtszelle reguliert.
13. Ein Vektor, umfassend ein Polynukleotid nach Anspruch 11 und/oder ein Nukleotidkonstrukt nach Anspruch 12.
14. Ein Vektor nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der Vektor ein Phagen-Display- Vektor ein bakterieller Expressionsvektor, ein Hefe-Expressionsvektor, ein Fungus- Expressionsvektor, ein Algen-Expressionsvektor und/oder einen Pflanzen- Expressionsvektor ist.
15. Eine Wirtszelle, umfassend ein Polynukleotid nach Anspruch 11 , ein Nukleotidkonstrukt nach Anspruch 12, einen Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14 und/oder ein Polypeptid und/oder ein Antikörperkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
16. Eine Wirtszelle nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Funguszelle, eine Algenzelle und/oder Pflanzenzelle.
17. Die Wirtszelle nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend eine Escherichia coli Zelle, eine Streptomyces Zelle, eine Pichia pastoris Zelle, eine Schizosaccharomyces Zelle, eine Arxula Zelle, eine Aspergillus Zelle, eine Klamydomonas Zelle, eine Nicotiana Spec. Zelle, bevorzugt Nikotine benthamiana Zelle, eine Pisum sativum Zelle, eine Hordeum vulagare Zelle, eine Zea mays Zelle, eine Rapszelle, eine Cucumis sativus Zelle und/oder eine Linum usitatissimum Zelle.
18. Eine transgene Pflanze, Teile davon und/oder ein Mikroorganismus, umfassend ein Polynukleotid nach Anspruch 11 , ein Nukleotidkonstrukt nach Anspruch 12, einen Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14 und/oder ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10.
19. Eine Zusammensetzung, umfassend ein Polynukleotid nach Anspruch 1 1 , ein Nukleotidkonstrukt nach Anspruch 12, ein Polypeptid und/oder ein Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 und einen geeigneten Träger, Puffer, Stabilisator und/oder Bindemittel.
20. Eine Zusammensetzung nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der Träger, Puffer, Stabilisator und/oder Bindemittel Proteine umfasst, bevorzugt BSA, Milchpulver und/oder Erbsenmehl, Mikropartikel und/oder Gelantinekapseln.
21. Verwendung der transgenen Pflanze, Teile davon und/oder der Mikroorganismen nach Anspruch 18 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Infektionen, bevorzugt Infektionen assoziiert mit HIV, Hepatitis B, SARS, Coronavirus, Coccidia, Eimeria, bevorzugt Eimeria tenella, Mycobacterium tuberculosis und/oder Mycobacterium leprae.
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