KR20230166444A - ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스(SARS-CoV2　임상 재현성 모델)에서 암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통한 면역 반응 억제 방법 - Google Patents

ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스(SARS-CoV2　임상 재현성 모델)에서 암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통한 면역 반응 억제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스(SARS-CoV2　임상 재현성 모델)에서 암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통한 면역 반응 억제 방법에 관한 것이다.

Description

ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스(SARS-CoV2　임상 재현성 모델)에서 암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통한 면역 반응 억제 방법{Method of inhibiting disturbance of immune cells through control of damage of immune cells by the anti-cancer chemotherapeutic drug (Busulfan) and neutralization of immune cell common receptors (IL-2) in ACE2 protein-overexpressed mouse (SARS-CoV2, simulatory model)}
본 발명은 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스(SARS-CoV2　임상 재현성 모델)에서 암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통한 면역 반응 억제 방법에 관한 것이다.
실험동물을 활용한 연구 모델은 약제의 적합성, 독성 평가 및 신규 의료 기술 적용 등 다양한 의학적 접근 평가에서 매우 중요한 역할을 한다. 특히 근교계마우스의 경우 유전적으로 안정적이며, 일치한 표현형 및 확인 가능한　명확한 배경 정보를 가지고 있으므로 대부분의 생물의학 연구에 사용되고 있다.
ACE2 유전자는 Angiotensin-converting enzyme2의 약자로 체내 수분과 혈압을 조절하는 중요한 역할을 담당하고 있다. ACE2 단백질은 심장, 폐, 콩팥, 혈관 내피 및 소화계통에 발현되며 특히 SARS-CoV-2를 포함한 여러 코로나바이러스가 세포에 침입할 때 이용하는 수용체이다. 즉, SARS-CoV-2의 인체세포감염을 유도하는 수용체인 ACE2 유래의 단백질을 이용하면, SARS-CoV-2의 표면에 있는 스파이크 단백질과 ACE2 단백질의 높은 결합 친화도로 인하여 바이러스가 인체 세포 내로 침입하는 것을 효과적으로 방지할 수 있다.
ACE2 단백질이 과발현되어 있는 실험동물의 경우 코로나 질환을 모방할 수 있는 생물체의 유기적 환경을 갖춘 상태이며, 체내의 다양한 면역세포의 활성/비활성을 추적 및 관찰이 용이하고 면역세포의 동태 변화를 평가할 수 있다는 장점을 지니고 있다.
따라서, ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스(SARS-CoV2　임상 재현성 모델)에서 암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통한 면역 반응 억제 기술이 요청되고있다.
대한민국 등록특허 제10-2205028호
본 발명은 이러한 종래 기술의 문제를 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스(SARS-CoV2　임상 재현성 모델)에서 암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통한 면역 반응 억제 방법을 제공하는데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ACE2(Angiotensin-converting enzyme2) 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스를 제작하는 단계; 및 암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통한 면역 반응을 억제하는 단계;를 포함하는 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스에서의 면역 반응 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스에서의 면역 반응 억제 방법에 있어서, 상기 ACE2 단백질이 ACE2 단백질의 세포외도메인(ectodomain) 유래의 단백질인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스에서의 면역 반응 억제 방법에 있어서, 상기 면역세포가 자연 살상 세포(Natural Killer cell, NK cell) 또는 T 세포인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스에서의 면역 반응 억제 방법에 있어서, 상기 인터루킨-2(IL-2)의 항체는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스에서의 면역 반응 억제 방법에 있어서, 상기 근교계마우스는 재조합 SARS-CoV-2 단백질을 이용하여 SARS-CoV-2 재현성을 구현하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스에서의 면역 반응 억제 방법은 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스(SARS-CoV2　임상 재현성 모델)에서 암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통하여 면역 반응을 억제할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 제공하는 안정화 Ace2 변이체의 모식적인 설계를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 안정화 Ace2-Fc 융합단백질 및 야생형 Ace2-Fc 융합단백질의 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 바람직한 실시예를 상세하게 설명하고자 한다. 본 발명은 본 발명의 정신 및 필수적 특징을 벗어나지 않는 범위에서 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
별도로 정의 되지 않는 한 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 화학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
이하 도면들을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스에서의 면역 반응 억제 방법은 ACE2(Angiotensin-converting enzyme2) 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스를 제작하는 단계; 및 암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통한 면역 반응을 억제하는 단계;를 포함한다.
본 발명은 ACE2단백질이 과발현된 Th1 면역 반응이 지배적인 근교계의 마우스를 활용함으로써 SARS-CoV2 재현성을 갖춘 실험동물모델을 대상으로 IL-2 중화제어를 통한 감염성 호흡기 질환의 대응 기술로서 면역세포의 활성을 조절하여 제어하는 기술에 관한 것이다.
근교계 마우스는 근친교배 마우스로서, 형매교배나 친자교배를 20 세대 이상 계속한 마우스이고, 혈연계수(R)는 99.6%가 되므로 일란성 쌍생아와 거의 같아 개체들이 유전적으로 균일하다. 근교계 마우스로는 C57BL/6, C58, 129, DBA 및 CBA 등의 계통이 있으며 각 계통마다 특정 질환을 가지고 있다.
본 발명의 근교계 마우스는 K18-hACE2 마우스(hACE2 mouse (B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J))인 것이 바람직하다.
상기 근교계마우스는 재조합 SARS-CoV-2 단백질을 이용하여 SARS-CoV-2 재현성을 구현하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 SARS-CoV-2의 재현을 위한 Recombinant SARS-CoV-2를 통한 재현모델을 제작하고, Flow cytometry를 이용하여 근교계마우스의 IL-2 중화항체로 인한 면역반응을 측정하였다.
SARS-CoV-2 임상 재현을 위한 유사 단백질로서 Recombinant SARS-CoV-2 (B.1.617.2 S Alexa Fluor® 647 Protein (Covid-19 spike protein))를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 ACE2 단백질은 ACE2 단백질의 세포외도메인(ectodomain) 유래의 단백질인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 면역세포는 자연 살상 세포(Natural Killer cell, NK cell) 또는 T 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인터루킨-2(IL-2)의 항체는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 증가시킨다.
Ace2는 안지오텐신 전환효소 2(Angiotensin-converting enzyme 2)의 약자로, 안지오텐신 전환효소(ACE)와 관련된 카르복시펩티다아제이다. Ace2는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)와 관련된 코로나바이러스의 기능성 수용체로, SARS-CoV-2가 인체에 침입하면 Ace2가 SARS-CoV-2의 스파이크(spike) 단백질에 결합함으로써 감염이 발생한다.
Ace2 단백질은 805개 아미노산으로 이루어져 있으며, 세포외도메인(ectodomain), 막관통도메인(membrane spanning domain) 및 세포질도메인(cytoplasmic domain)으로 구분된다. 이 중 Ace2 단백질의 세포외도메인은 약 600개의 아미노산으로 이루어진 수용성 단백질로 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 단백질과 높은 친화도를 가진다. 본 발명의 발명자들은 이와 같이 Ace2의 세포외도메인 유래의 단백질이 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 강하게 결합하는 특성을 이용하여, SARS-CoV-2 바이러스와 표적세포의 상호작용 및 감염을 방지할 수 있음을 발견하였다.
다만, Ace2 단백질의 세포외도메인은 자연 상태의 기능을 위하여 안지오텐신 펩타이드와 상호작용을 할 때 단백질 구조의 일부가 움직이는 유동성을 갖고 있어, 안정성이 그다지 좋지 않은 것으로 알려져 있다. 세포막 단백질 상태의 야생형 Ace2는 안지오텐신 펩타이드와의 상호작용, 및 세포막의 다른 단백질 및 생체 분자들과의 상호작용을 통하여 안정화될 수 있으나, 수용성 Ace2 (soluble Ace2) 상태에서는 안정성이 매우 낮아 치료제에 적용하기 어렵다는 문제가 있었다.
본 발명은 상기 Ace2 단백질의 불안정성 문제를 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 안정화 Ace2 변이체는 도 1에 나타낸 바와 같이 Ace2 유래 단백질에 이황화 결합을 도입하기 위한 돌연변이를 형성한 것이다.
본 발명의 발명자들은 Ace2 단백질의 특정 아미노산 잔기쌍 중 하나 이상을 시스테인으로 치환하여 구조 안정 이황화 결합을 형성함으로써, Ace2 단백질의 열안정성 및 구조안정성을 향상시켜 수용성 Ace2 상태에서도 안정하면서, 이황화 결합 형성에 의한 구조 변형을 최소화하여 바이러스와의 높은 결합 친화도를 유지할 수 있는 변이체를 개발하였다.
본 발명에서, 용어 "이황화 결합" 이란 단백질 아미노산 중 시스테인 (Cysteine)에 있는 설파이드(sulfide, -SH)기가 다른 시스테인의 설파이드기와 만나 공유결합을 이루는 상태를 의미하는 것으로서, 단백질 구조에 큰 안정성을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "수용성 Ace2" 란 Ace2의 세포외도메인을 유전자 조작으로 잘라내어, 야생형의 막단백질이 아닌 수용액에서 안정한 상태의 단백질 형태로 만든 것을 의미한다. 이와 같이 바이러스 수용체로부터 만들어진 수용성 수용체(soluble receptor)는 바이러스의 세포침입을 막는데 사용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "변이"는 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 의미로, 바람직하게, 본 발명의 변이체는 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 아미노산 잔기의 치환은 모체 아미노산 서열의 잔기, 아미노산 잔기의 번호 및 치환된 아미노산 잔기의 순서로 나타낼 수 있다.
본 발명에서, 상기 이황화 결합을 도입하기 위한 돌연변이는 Ace2 유래 단백질에 존재하는 아미노산 잔기쌍 중 하나 이상이 시스테인으로 치환된 변이를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 아미노산 잔기쌍은 시스테인 이외의 아미노산으로 구성된 두 개의 아미노산의 쌍(pair)이며, 시스테인 치환을 통해 이황화 결합을 형성하여 구조를 효과적으로 안정화시키기 위하여, 잔기쌍을 이루는 아미노산의 중심 탄소(C-alpha) 간의 거리가 45 내지 70Å인 것이 바람직하다.
본 발명의 실시예에서는, Ace2 단백질의 3차원 구조 분석을 통해 상기 잔기쌍들이 C-alpha 간의 거리가 45 내지 70Å 범위 내에 있으며, Ace2 단백질의 loop 331-347번 영역, loop 599-614번 영역, helix-helix 영역 및 strand-helix 영역의 안정화에 관여하는 잔기쌍임을 확인하였다. 또한, 상기 아미노산 잔기쌍에 이황화 결합을 형성하였을 때 야생형에 비해 단백질의 융해온도가 유의적으로 상승하면서도 바이러스와의 결합력에는 거의 영향이 없는 실험 결과를 얻었다. 이에 따라, 본 발명의 변이체에 따르면, 이황화 결합 형성에 의한 구조 뒤틀림이 최소화되어 Ace2의 특징인 바이러스와의 우수한 결합 친화도를 유지하면서, 야생형 Ace2 단백질에 비해 향상된 구조 안정성을 구현할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 안정화 Ace2 변이체를 이용하여 Ace2-Fc 융합단백질을 형성할 수 있다.
본 발명에서, 상기 Ace2-Fc 융합단백질이란 수용성 Ace2 단백질을 면역글로불린 유래의 Fc 도메인에 연결하여 제작된 단백질을 의미한다.
본 발명에서, 상기 면역글로불린 유래의 Fc 도메인이란 면역글로불린의 중쇄불변영역 중 CH2 및 CH3 도메인(또는, CH2, CH3 및 CH4 도메인)을 포함하는 C-말단 영역을 의미하며, 야생형(wild-type) Fc 도메인 및 그의 변이체를 포괄하는 의미로 사용된다. 상기 Fc 도메인의 모체가 되는 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4일 수 있으며, 바람직하게는 IgG1일 수 있다.
본 발명에서, 상기 Fc 도메인의 각 사슬은 인간 IgG1 중쇄의 221번 잔기로부터 C-말단에 이르는 영역, 또는 상기 영역에 힌지를 더 포함하는 영역을 포함할 수 있다. Fc 영역에서 아미노산 잔기의 번호는 인간 면역글로불린 중쇄 내의 잔기 번호를 정의하는 EU 넘버링(Kabat et al 등 참조)에 따른다.
본 발명의 Ace2-Fc 융합단백질에서, 상기 안정화 Ace2 변이체는 Fc 도메인을 구성하는 2개의 사슬 중 하나 이상의 사슬에 연결될 수 있다.
이 때, 상기 Ace2 변이체와 Fc 도메인은 0 내지 20개의 아미노산 잔기에 의해 연결될 수 있다. 즉, 상기 Ace2변이체와 Fc 도메인은 직접적으로 연결되거나, 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 링커(linker)를 통해 연결될 수 있다. 또한, 상기 Ace2 변이체는 Fc 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다.
본 발명의 Ace2-Fc 융합단백질은 동형이량체(homodimer) 또는 이형이량체(heterodimer) 형태일 수 있으며, Ace2 변이체가 Fc 도메인의 양쪽 사슬에 연결되거나, 또는 한쪽 사슬에만 연결된 형태일 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, Ace2-Fc 융합단백질이 이형이량체, 예를 들어 이중특이적(또는 다중특이적) 항체를 형성하는 경우, Fc 도메인에 이합체를 형성하기 위한 재조합 변이체가 형성될 수 있다.
예를 들어, 상기 이합체를 형성하기 위한 재조합 변이체로는 놉-인투-홀(knobs-into-hole) 기술을 이용할 수 있다.
상기 놉-인투-홀 기술은 항체 단편의 중쇄 사이에 이종이합체 만이 형성되게 하기 위하여 설계된 기술이다. 여기에서, 놉(knob)은 반대측 사슬로 돌출된 측쇄를 가지도록 설계되어, 반대측 도메인의 홀(hole)에 삽입된다. 이로 인하여, 중쇄들은 측쇄 충돌로 인하여 동종이합체화(homodimerization) 될 수 없고, 이종이합체화(heterodimerization) 만이 가능하게 된다. 본 발명에서, Fc 도메인의 각 사슬에 놉 또는 홀이 형성된 구조를 각각 Fc-knob 또는 Fc-hole이라 할 수 있다.
상기 Fc-knob은 Fc 도메인을 구성하는 사슬에서 하나 이상의 아미노산을 트립토판(W), 아르기닌(R), 페닐알라닌(F) 및 타이로신(Y)으로 구성된 군에서 선택되는 큰 아미노산으로 치환함으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, Fc-knob은 IgG1-Fc 중쇄 221 내지 447번 서열에 T366W 변이가 형성된 것일 수 있다.
상기 Fc-hole은 Fc 도메인을 구성하는 사슬에서 하나 이상의 아미노산을 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성된 군에서 선택되는 작은 아미노산으로 치환함으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, Fc-hole은 IgG1-Fc 중쇄 221 내지 447번 서열에 T366S, L368A 및 Y407V 변이가 형성된 것일 수 있다.
이와 같이 본 발명의 안정화 Ace2 변이체를 Fc 도메인과 융합시키면, Ace2 변이체가 바이러스에 강하게 결합하여 감염을 저해할 수 있을 뿐만 아니라, 면역반응을 유도하여 바이러스를 제거할 수 있고, Fc 수용체와의 상호작용에 의해 체내 잔류 기간을 연장하여 약효를 증강시킬 수 있다. 또한, 이를 이용하여 이중특이성 또는 다중 특이성 항체를 제작함으로써 NK 세포나 면역세포를 감염세포로 유도하여, 적극적인 감염세포 살상 및 면역반응 활성화를 통해 바이러스 유래 질환을 치료할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "이중특이적(또는 다중특이적) 항체"란 서로 다른 두 종류(또는 그 이상)의 항원에 결합할 수 있는 항체를 의미하는 것으로서, 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 본 발명에서, 상기 이중특이적 (또는 다중특이적) 항체는 표적 항원 및 면역세포 표면 항원에 동시에 결합함으로써, 항체의존성 세포독성에 의해 표적 항원의 사멸을 유도하는 항체를 의미할 수 있다.
본 발명에서, 상기 이중특이적(또는 다중특이적) 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, rIgG, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 탠덤 단일 사슬 Fv 단편(scFv)2, 이중특이적 T-세포 관여자(BiTE), 디아바디(Diabody), 탠덤 디아바디(TandAb), 트리아바디(Triabody) 또는 테트라바디(Tetrabody) 형태일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "면역세포"는 항원을 인식하고 직간접적으로 공격하는 세포로서, 바람직하게는 자연 살상 세포(Natural Killer cell, NK cell) 또는 T 세포일 수 있다.
본 발명의 Ace2-Fc 융합단백질에서, Fc 도메인의 사슬에 안정화 Ace2 변이체 및 면역세포 표면 항원에 결합하는 결합 단백질을 각각 연결함으로써, 이중특이적 항체를 제작할 수 있다. 이러한 이중특이적 항체는 SARS-CoV-2 바이러스 및 면역세포 표면 항원에 동시에 결합할 수 있다. 또는, 면역세포 표면 항원에 결합하는 결합 단백질을 2종 이상 연결함으로써, 다중특이적 항체를 제작하는 것도 가능하다.
이와 같은 이중특이적(또는 다중특이적) 항체를 이용하면, 항체의존성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)에 의해 면역세포가 SARS-CoV-2를 인식하여 바이러스의 중화를 유도할 수 있다.
본 발명의 안정화 Ace2 변이체를 이용하면, SARS-CoV-2와 Ace2 간의 높은 결합력으로 인하여 면역세포가 SARSCoV-2를 효과적으로 인식하고 사멸시킬 수 있으며, Ace2가 구조적으로 안정하기 때문에 치료제에 적용하는 경우 보관 및 환경 변화에 대해 안정성이 우수하고, 인체 내에서 질병 치료에 유효한 구조가 장기간 유지되도록 하여 낮은 투여량으로도 장기간의 약효를 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, 바이러스에 변종이 생기더라도 표면 항원에서 세포수용체를 인식하는 부위는 변하지 않기 때문에, 다양한 변종에 대해 바이러스 사멸 효과가 나타난다는 장점이 있다.
IL-2Rγ
인터류킨-2 수용체 서브유닛 감마는 또한 CD132; 통상의 사이토킨 수용체γc-쇄; IL-2RG; IL-2Rg; IL2R감마; IL-2Rγ, IMD4; P64: SCIDX; 또는 SCIDX1로서 공지되어 있다. IL2Rγ은 IL-2R, IL-4R, IL-7R, IL-9R, IL-15R 및 IL21R을 포함하는 여러 인터류킨 수용체에 통상적인 서브유닛이다.
항원-결합 단백질
본 발명은 IL2Rγ 단백질 또는 이의 항원 단편(예를 들어, IL2Rγ의 세포외 도메인)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체(예를 들어, 사람 항체, 모노클로날 항체 및 재조합 항체) 및 이의 항원-결합단편을 제공한다. IL2Rγ와 동일한 IL2Rγ상의 에피토프에 결합하거나, IL2Rγ가 본원에 제시된 임의의 항원-결합 단백질과 결합하는 것에 대해 경쟁하는 항원-결합 단백질은 또한 본 발명의 일부이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄(LC)인 4개의 폴리펩타이드 쇄(즉, “완전한 항체 분자”)(예를 들어, IgG)를 포함하는 면역글로불린 분자를 언급한다.
본 발명의 구현예에서, 항-IL2Rγ 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어, 유형IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4(예를 들어, S228P 및/또는 S108P 돌연변이를 포함하는) 또는 IgM의 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 본 발명의 구현예에서, 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어, 카파 또는 람다의 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편과 같은 용어 "사람” 항원-결합 단백질은 사람 세포에서든 또는 비-사람 세포, 예를 들어, 마우스 세포에 이식된 것이든 상관 없이 사람 생식 세포 계열의 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체 및 단편을 포함한다. 예를 들어, 문헌(US8502018,
US6596541 또는 US5789215)을 참조한다. 본 발명의 사람 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명의 구현예에서 예를들어, CDR 및 특히 CDR3에 사람 생식 세포 계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되어 있지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 유발된 돌연변이를 갖는)를 포함한다. 그러나, 본원에 사용된 "사람 항체"라는 용어는, 또 다른 포유동물 종 (예를 들어, 마우스)의 생식세포 계열로부터 유래된 CDR 서열이 사람 FR 서열로 이식된 mAb를 포함하려는 것은 아니다. 상기 용어는 비-사람 포유동물, 또는 비-사람 포유동물의 세포에서 재조합에 의해 제조된 항체를 포함한다. 상기 용어는 사람 대상체로부터 단리되거나 사람 대상체에서 생성된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 용어 "재조합” 항원-결합 단백질은 DNA 스플라이싱(splicing) 및 전이 유전자 발현을 포함하는 재조합 DNA 기법으로 당업계에 공지된 기법 또는 방법들에 의해 생성되거나, 발현되거나, 단리되거나 또는 수득된 분자를 언급한다. 상기 용어는 사람이 아닌 포유동물 (사람이 아닌 유전자전이 포유동물, 예를 들어, 유전자전이 마우스 포함), 또는 숙주 세포 (예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포) 또는 세포 발현 시스템에서 발현되거나 또는 재조합 조합형 사람 항체 라이브러리로부터 단리된 항체를 포함한다.
항체의 항원-결합 단편은 발명의 구현예에서 적어도 하나의 가변 도메인을 포함한다. 상기 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성의 도메인일 수 있으며, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하고 있거나 이와 함께 프레임을 이루는 적어도 하나(예를 들어, 3)의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 연합된 VH 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 서로 상대적으로 임의의 적합한 정렬로 위치할 수 있다.
예를 들어, 가변 영역은 이량체성이고 VH-VH, VH-VL 또는 VL -VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 비-공유적으로 결합된 단량체성 VH 및/또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
본 발명은 IL2Rγ 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 항-IL2Rγ 항원-결합 단백질은 사람 및/또는 마우스 및/또는 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) 및/또는 래트 IL2Rγ 또는 이의 도메인에 결합하는 것에 대해 표 3-1 내지 3-12에 제시된 임의의 KD 값을 포함한다. “항-IL2R감마”는 항원-결합 단백질(또는 다른 분자), 예를 들어, IL2R감마에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 언급한다.
“단리된" 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편), 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 벡터는 적어도 부분적으로 이들이 생성되는 세포 또는 세포 배양물 기원의 다른 생물학적 분자가 없다. 상기 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 다른 항체 또는 항원-결합 단편, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질, 예를 들어, 세포 잔해 및 성장 배지를 포함한다. 단리된 항원-결합 단백질은 추가로 숙주 세포로부터의 생물학적 분자와 같은 발현 시스템 성분 또는 이의 성장 배지가 적어도 부분적으로 부재일 수 있다. 일반적으로 용어 "단리된"은 상기 생물학적 분자의 완전한 부재(예를 들어, 소량 또는 미량의 불순물이 잔류할 수 있다) 또는 물, 완충액 또는 염의 부재 또는 항원-결합 단백질 (예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편)을 포함하는 약제학적 제형의 성분을 언급한다.
항원은 예를 들어 항체 결합하는 분자, 예를 들어, 펩타이드(예를 들어, IL2R 감마 또는 이의 단편(항원 단편))이다. 항체가 인지하고 결합하는 항원 상의 특이적 영역은 에피토프로 불리운다. 상기 항원에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 본 발명의 일부이다.
용어 “에피토프"는 파라토프(paratope)로서 공지된, 항원-결합 단백질의 특이적 항원-결합 부위, 예를 들어, 항체 분자의 가변 영역과 상호작용하는 항원 결정기 (예를 들어, IL2Rγ 상에)를 언급한다. 단일 항원은 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체들은 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수도 있고 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 용어 “에피토프”는 또한 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위 및/또는 항체에 의해 결합된 항원의 영역을 언급할 수 있다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 한정될 수도 있다.
기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 하위세트이고 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 잔기들을 가진다. 에피토프는 선형 또는 입체적 구조일 수도 있는데, 즉, 비선형 아미노산으로 구성될 수도 있다.
특정 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 기, 또는 설포닐 기와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹인 결정기를 포함할 수도 있고, 특정 구현예에서는, 특이적인 3차원 구조적 특성 및/또는 특이적인 전하 특성을 가질 수도 있다. 본 발명의 항원-결합 단백질이 결합하는 에피토프는 IL2Rγ, 예를 들어, 사람 IL2Rγ의 단편, 예를 들어, 엑토도메인, 이의 도메인1 또는 도메인 2에 포함될 수 있다. 상기 에피토프에 결합하는 본 발명의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체)는 본 발명의 일부이다.
본 발명은 임의의 검출가능한 정도로 IL2Rγ의 활성(예를 들어, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및/또는 IL-21과 같은 사이토킨으로의 결합으로부터 사이토킨-특이적 수용체 서브유닛과 복합체화된 IL2Rγ를 포함하는 하이브리드 수용체의 결합)을 억제하는 분자를 포함하는 “중화시키는” 또는 “길항제” 항-IL2Rγ 항원-결합 단백질 (예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편)을 포함한다.
포유동물 세포를 포함하는 진핵 및 원핵 숙주 세포는 항-IL2Rγ 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 발현을 위한 숙주로서 사용될 수 있다. 상기 숙주 세포는 당업계에 널리 공지되어 있고 많은 세포들은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection (ATCC))으로부터 가용하다. 이들 숙주 세포는 특히 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 몽키 신장 세포(COS), 사람 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 사람, 마우스, 래트, 개, 몽키, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다.
재조합 항체를 제조하기 위한 여러 방법이 당업계에 공지되어 있다. 항체의 재조합 제조를 위한 방법의 하나의 예는 문헌(US4816567)에 기재되어 있다.
형질전환은 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의한 것일 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포유동물 세포로 도입하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 덱스트란 매개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포좀 내 폴리뉴클레오타이드(들)의 캡슐화, 바이오리스틱(biolistic) 주사 및 DNA의 핵으로의 미세주사를 포함한다. 추가로, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포로 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명에 따른 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스에서의 면역 반응 억제 방법은 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스(SARS-CoV2　임상 재현성 모델)에서 암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통하여 면역 반응을 억제할 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예 및 실험예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
<실시예>
안정화 Ace2 변이체의 제조
Ace2 단백질 구조에서 불안정성을 야기하는 잔기쌍에 이황화 결합을 도입한 변이체를 설계하여 아래 표 1에 나타내었다. 또한, 돌연변이 대상이 되는 아미노산 잔기쌍에서, 아미노산 간의 C-alpha 거리 및 안정화 기작을 표1에 함께 나타내었다.
[표 1]
<실험예> 효소 결합 면역 흡착 어세이(ELISA)를 통한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 결합력 측정
SARS-CoV-2 스파이크 단백질(잔기 319~541)을 0.1M sodium carbohydrate pH 9.0 조성의 완충용액에 25μg/ml의 농도로 희석하고, 96 웰 플레이트에 코팅하였다. 코팅 후 플레이트는 5% (w/v) 탈지분유를 이용하여 블로킹 처리하였다. 코팅된 각 웰에 Ace2(N51C/V343C)-Fc 단백질 및 야생형 Ace2(WT)-Fc 단백질을 5% (w/v) 탈지분유에 각각의 농도로 희석하여 첨가한 후 상온에서 2시간 반응시켰다.
반응이 끝난 용액을 버리고, 인간 Fc 항체와 결합 가능한 HRP 결합 2차 항체(GW Vitek)를 5% (w/v) 탈지분유에 희석하여 첨가한 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 각 과정이 끝날 때마다 웰을 인산 완충용액으로 3차례 세척하였다.
반응을 마친 각 웰에 tetramethylbenzidine (고마바이오텍) 용액을 넣어 발색 현상이 나타나도록 방치한 후, 0.2M 황산 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응이 끝난 용액은 450nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서, 각각의 농도에서 왼쪽 막대는 야생형 Ace2(WT)-Fc 단백질에 대한 결과이며, 오른쪽 막대는 안정화 Ace2(N51C/V343C)-Fc 단백질에 대한 결과를 나타낸다.
도 2의 결과에 따라, 본 발명에 따른 안정화 Ace2를 도입한 단백질이 야생형 Ace2를 도입한 단백질과 매우 유사한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 결합력을 가지는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명의 안정화 Ace2 변이체는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과의 결합력에 유의미한 영향을 미치지 않으면서, Ace2 단백질의 안정성만을 효과적으로 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
한편, 이상의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (1)

  1. ACE2(Angiotensin-converting enzyme2) 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스를 제작하는 단계; 및
    암화학요법 치료제(Busulfan)로 인한 면역세포 손상 및 공통 수용체(Interleukin2(IL2)의 중화 제어를 통한 면역 반응을 억제하는 단계;
    를 포함하는 ACE2 단백질이 과발현 유도된 근교계마우스에서의 면역 반응 억제 방법.
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