KR20230136604A - 개과 항체 불변 영역에서의 돌연변이 - Google Patents

개과 항체 불변 영역에서의 돌연변이 Download PDF

Info

Publication number
KR20230136604A
KR20230136604A KR1020237025434A KR20237025434A KR20230136604A KR 20230136604 A KR20230136604 A KR 20230136604A KR 1020237025434 A KR1020237025434 A KR 1020237025434A KR 20237025434 A KR20237025434 A KR 20237025434A KR 20230136604 A KR20230136604 A KR 20230136604A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
igg
canine
constant domain
antibody
ser
Prior art date
Application number
KR1020237025434A
Other languages
English (en)
Inventor
헨리 루이스 캠포스
산드라 앤 마리 라이틀
리사 마리 버거론
Original Assignee
조에티스 서비시즈 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 조에티스 서비시즈 엘엘씨 filed Critical 조에티스 서비시즈 엘엘씨
Publication of KR20230136604A publication Critical patent/KR20230136604A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 일반적으로 개과 항체 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 다양한 특성을 개선하기 위한 개과 항체의 불변 영역에서의 돌연변이에 관한 것이다.

Description

개과 항체 불변 영역에서의 돌연변이
관련 출원의 교차 참조
이 출원은 2021년 1월 28일에 출원된 미국 특허 가출원 63/142,774에 대한 우선권 및 이익을 청구하며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 개과 항체 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 다양한 특성을 개선하기 위한 개과 항체의 Fc 불변 영역에서의 하나 이상의 돌연변이에 관한 것이다.
개과 IgG 모노클로날 항체(mAb)는 수의학에서 효과적인 치료제로 개발되고 있다. 수년 전, 4개의 개과 IgG 서브클래스가 식별되고 특성화되었다(Bergeron 등, 2014, Vet Immunol Immunopathol., vol. 157(1-2), 31-41면). 그러나, 개과 IgG의 반감기를 연장하기 위한 작업은 많지 않았다.
신생아 Fc 수용체(FcRn)는 리사이클링 메카니즘을 통해 그 단편 결정화가능(Fc) 영역과 pH-의존적 상호작용에서 IgG의 반감기를 연장시킨다. 구체적으로, CH2 및 CH3 도메인의 계면에 걸쳐 있는 Fc 영역은 세포의 표면 상의 FcRn과 상호작용하여 IgG 항상성을 조절한다. 이 상호작용은 IgG 음세포작용 후 산성 상호작용에 의해 선호되고 따라서 IgG는 분해로부터 보호된다. 세포내 이입된 IgG는 그 다음 세포 표면으로 다시 재순환되고 알칼리성 pH에서 혈류 안으로 방출되어 적절한 기능을 위한 충분한 혈청 IgG를 유지한다. 따라서, IgG의 약동학적 프로파일은 그의 Fc 영역의 구조적 및 기능적 특성에 의존한다.
3개의 개과 IgG 서브클래스가 개과 FcRn에 결합하고 인간 IgG 유사체와 비교되었다. 개과 IgG의 반감기는 임의의 실험 지원 없이는 그것이 인간 IgG와 밀접하게 정렬할지 여부를 예상하거나 예측할 수 없기 때문에 완전히 연구되어야 한다.
IgG의 연장된 반감기는 항체 약물의 더 적은 빈도의 투여 및/또는 더 낮은 용량을 허용할 수 있으며, 이는 차례로 수의학적 방문을 감소시키고, 환자 순응도를 개선하고, 농도-의존적 세포독성/부작용을 낮춘다.
따라서, 반감기를 개선하기 위해 Fc 불변 영역에서 돌연변이를 식별할 필요성이 존재한다.
본 발명은 야생형 개과 IgG에 비해 더 높은 FcRn 친화도를 제공하는 돌연변이 개과 IgG에 관한 것이다. 구체적으로, 본 출원의 발명자들은 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 것이 FcRn에 대한 친화도를 놀랍게 그리고 예상외로 향상시킨다는 것을 발견하였다.
한 측면에서, 본 발명은 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 변형된 IgG를 제공하며, 여기서 상기 치환은 카바트에서와 같은 Eu 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 247, 252, 254, 256, 311, 312, 314, 431, 434, 또는 439에 있다.
일부 실시양태에서, 상기 불변 도메인은 P247V, L252Y, L252P, L252W, L252A, L252D, L252G, L252H, L252I, L252K, L252M, L252N, L252Q, L252S, L252T, L252V, L252F, L252R, A254F, A254G, A254H, A254N, A254Q, A254R, A254W, A254C, A254D, A254I, A254K, A254L, A254M, A254P, A254S, A254T, A254V, A254Y, T256H, T256I, T256K, T256L, T256Q, T256Y, T256A, T256C, T256D, T256F, T256G, T256M, T256N, T256P, T256R, T256S, T256V, T256W, T256E, Q311H, Q311R, Q311Y, Q311W, D312P, L314K, A431K, N434A, N434C, N434D, N434E, N434F, N434G, N434H, N434I, N434K, N434L, N434M, N434P, N434Q, N434R, N434S, N434T, N434V, N434W, N434Y 및 E439K 중 하나 이상의 치환을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 상기 치환은 카바트에서와 같이 Eu 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 247, 252, 254, 256, 311, 312, 314, 431, 434, 또는 439에 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 상기 치환은 카바트에서와 같이 Eu 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 247, 252, 254, 256, 311, 312, 314, 431, 434, 또는 439에 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 항체를 갖는 벡터 또는 숙주 세포를 제공하는 것을 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 치환은 아미노산 잔기 247, 252, 254, 256, 311, 312, 314, 431, 434, 또는 439, 또는 이들의 조합에 있는, 항체 또는 분자의 생산 또는 제조 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 융합 분자를 제공하고, 여기서 상기 치환은 카바트에서와 같이 Eu 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 247, 252, 254, 256, 311, 312, 314, 431, 434, 또는 439에 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개에서 항체 혈청 반감기를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은, 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 상기 개과 IgG 불변 도메인인, 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 치료적 유효량의 항체를 상기 개에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 치환은 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 252, 254, 256, 311, 434, 또는 439에 있다. 하나의 예시적인 실시양태에서, 상기 개과 IgG 불변 도메인은 L252F, L252R, L252Y, L252M, A254T, A254S, T256E, Q311W, N434H, N434Y 및 E439K 중 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 다른 예시적인 실시양태에서, 상기 개과 IgG 불변 도메인은 (1) L252F; (2) L252R, N434H 및 Q311W; (3) L252R; (4) Q311W; (5) L252R, A254T, T256E 및 N434H; (6) L252Y 및 A254T; 또는 (7) L252M, A254S 및 E439K의 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 실시예 및 도면으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 발명의 사상 및 범주 내에서 다양한 변경 및 변형이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 발명의 바람직한 실시양태를 나타내면서 상세한 설명 및 특정 실시예가 단지 예시의 방식으로 제공된 것으로 이해되어야 한다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 신청하고 필요한 수수료를 지불시 사무국에서 제공할 것이다.
도 1은 IgG의 도메인 구조를 예시한다.
도 2는 야생형(WT) 인간 IgG1, WT 개과 IgGA, WT 개과 IgGB, WT 개과 IgGC, 및 WT 개과 IgGD의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 상기 아미노산 잔기는 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따라 넘버링된다. 상기 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 아미노산 잔기는 각각 적색, 보라색, 파란색 및 녹색이다.
도 3은 개과 Fc IgGB WT 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 4는 특정 개과 IgG 점 돌연변이가 개에서 반감기를 증가시킨다는 것을 보여준다. Mut1은 L252F를 지칭하고; Mut2는 돌연변이 L252R, N434H 및 Q311W의 조합을 지칭하고; Mut3은 L252R을 지칭하고; Mut4는 돌연변이 L252Y, N434Y 및 Q311W의 조합을 지칭하고; Mut5는 Q311W를 지칭하고; Mut6은 돌연변이 L252R, A254T, T256E 및 N434H의 조합을 지칭하고; Mut7은 돌연변이 L22Y 및 A254T의 조합을 지칭하고; Mut8은 돌연변이 L252M, A254S 및 E439K의 조합을 지칭한다.
서열 목록에 대한 간략한 설명
서열번호 1은 야생형 개과 IgGA 불변 영역의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 2는 야생형 개과 IgGB (65) 불변 영역의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 3은 야생형 개과 IgGC 불변 영역의 아미노산 서열을 지칭한다
서열번호 4는 야생형 개과 IgGD 불변 영역의 아미노산 서열을 지칭한다<
서열번호 5는 일 실시양태에 따른, 코돈 최적화된 야생형 개과 IgGB (65)의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 6은 일 실시양태에 따른, 야생형 개과 IgGB (65) 불변 도메인의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 7은 야생형 개과 IgGB CH1 도메인의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 8은 야생형 개과 IgGB 힌지 도메인의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 9는 야생형 개과 IgGB CH2 도메인의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 10은 야생형 개과 IgGB CH3 도메인의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 11은 야생형 개과 IgGB CH1 도메인의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 12는 야생형 개과 IgGB 힌지 도메인의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 13은 야생형 개과 IgGB CH2 도메인의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 14는 야생형 개과 IgGB CH3 도메인의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 15는 야생형 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 16은 야생형 개과 IgGA 불변 영역의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 17은 야생형 개과 IgGC 불변 영역의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 18은 야생형 개과 IgGD 불변 영역의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 19는 야생형 인간 IgG1 불변 영역의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 20은 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 중쇄 CDR1의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 21은 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 22는 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 중쇄 CDR2의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 23은 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 24는 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 중쇄 CDR3의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 25는 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 26은 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 경쇄 CDR1의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 27은 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 28은 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 경쇄 CDR2의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 29는 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 30은 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 경쇄 CDR3의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 31은 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 32는 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 경쇄의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 33은 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 경쇄의 아미노산 서열을 지칭한다.
서열번호 34는 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 중쇄의 핵산 서열을 지칭한다.
서열번호 35는 본원에서 ZTS-8183으로 지칭되는 항-IL31 항체의 가변 중쇄의 아미노산 서열을 지칭한다.
본 대상물은 본 개시내용의 일부를 형성하는 다음의 상세한 설명을 참조함에 의해 더 쉽게 이해될 수 있다. 본 발명은 본원에 기재 및/또는 도시된 특정 생성물, 방법, 조건 또는 매개변수로 제한되지 않고, 본원에 사용된 용어는 단지 예로서 특정 실시양태를 설명하기 위한 목적이고 청구된 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 것을 이해되어야 한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.
상기 및 개시내용 전반에 걸쳐 이용된 바와 같이, 다음 용어 및 약어는 달리 지시되지 않는 한, 다음 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
정의
본 개시내용에서, 단수 형태는 복수 참조를 포함하고, 특정 수치에 대한 언급은 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 적어도 그 특정 값을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "분자" 또는 "화합물"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 이러한 분자 또는 화합물 및 그의 등가물 중 하나 이상에 대한 언급 등이다. 본원에서 사용된 용어 "복수"는 하나 이상을 의미한다. 값들의 범위가 표현될 때, 다른 실시양태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 근사치로서 표현될 때, 선행사 "약"을 사용함으로써, 특정 값이 다른 실시양태를 형성하는 것으로 이해된다. 모든 범위는 포괄적이고 결합가능하다.
명세서 및 청구범위에서, 면역글로불린 중쇄에서 아미노산 잔기의 넘버링은 카바트 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)에서와 같은 EU 인덱스의 것이다. "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 IgG 항체의 잔기 넘버링을 지칭하고 본원에서 도 2에 반영된다.
핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "단리된"은 그 천연 공급원에서 통상적으로 연관된 적어도 하나의 오염 핵산으로부터 식별 및 분리된 핵산이다. 단리된 핵산은 자연에서 발견되는 것과 다른 형태 또는 환경에 있다. 따라서 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재할 때의 핵산 분자와 구별된다. 단리된 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포의 것과 상이한 플라스미드 또는 염색체 위치에 있는 경우 통상적으로 그 안에 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다. 단리된 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산 분자가 단백질을 발현하기 위해 이용되어야 할 때, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 최소한 센스 또는 코딩 가닥을 함유할 것이지만, 센스 및 안티-센스 가닥 둘 모두를 함유할 수 있다(즉, 이중-가닥일 수 있음).
핵산 분자는 다른 핵산 분자와 기능적 관계에 놓일 때, "작동가능하게 연결"되거나 "작동가능하게 부착"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 핵산의 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 용이하게 하도록 위치된다면 그것은 핵산의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자는 발현된 융합 단백질이 변이체 Fc 영역 폴리펩티드에 상류 또는 하류에 인접한 이종 단백질 또는 이의 기능적 단편을 포함하고; 이종 단백질은 변이체 Fc 영역 폴리펩티드에 바로 인접할 수 있거나 임의의 길이 및 조성의 링커 서열에 의해 이로부터 분리될 수 있도록 위치된다면 이종 단백질(즉, 자연에 존재하므로 Fc 영역을 포함하지 않는 단백질 또는 이의 기능적 단편)을 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된다. 유사하게, 폴리펩티드(본원에서 "단백질"과 동의어로 사용됨) 분자는 다른 폴리펩티드와 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결"되거나 "작동가능하게 부착"된다.
폴리펩티드 또는 단백질(예를 들어, 변이체 Fc 영역, 또는 모노클로날 항체)과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "기능적 단편"은 전장 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 보유하는 그 단백질의 단편을 지칭한다. 단편은 6개 아미노산에서 전장 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열에서 1개 아미노산을 뺀 크기의 범위일 수 있다. 본 발명의 변이체 Fc 영역 폴리펩티드의 기능적 단편은 본원에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 "아미노산 치환"을 보유한다. 변이체 Fc 영역 폴리펩티드의 기능적 단편은 Fc 영역과 연관된 것으로 당업계에 공지된 적어도 하나의 기능을 보유한다(예를 들어, ADCC, CDC, Fc 수용체 결합, C1q 결합, 세포 표면 수용체의 하향 조절 또는 예를 들어, 작동가능하게 부착된 폴리펩티드의 생체내 또는 시험관내 반감기를 증가시킬 수 있다).
용어 "정제된" 또는 "정제하다"는 샘플에서 적어도 하나의 오염물질의 실질적인 제거를 지칭한다. 예를 들어, 항원-특이적 항체는 적어도 하나의 오염 비-면역글로불린 단백질의 완전한 또는 실질적인 제거(적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 또는 보다 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%)에 의해 정제될 수 있다; 그것은 또한 동일한 항원에 결합하지 않는 면역글로불린 단백질의 제거에 의해 정제될 수 있다. 비-면역글로불린 단백질의 제거 및/또는 특정 항원에 결합하지 않는 면역글로불린의 제거는 샘플에서 항원-특이적 면역글로불린의 백분율에서 증가를 초래한다. 또 다른 예에서, 박테리아 숙주 세포에서 발현된 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린)는 숙주 세포 단백질의 완전한 또는 실질적인 제거에 의해 정제되고; 이에 의해 샘플에서 폴리펩티드의 백분율이 증가된다.
폴리펩티드(예를 들어, Fc 영역)를 지칭할 때 용어 "천연"은 폴리펩티드가 자연에서 일반적으로 발생하는 폴리펩티드 또는 이의 자연적으로 발생하는 다형성의 아미노산 서열로 구성된 아미노산 서열을 갖는 것을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 천연 폴리펩티드(예를 들어, 천연 Fc 영역)는 재조합 수단에 의해 생성될 수 있거나 자연적으로 발생하는 공급원으로부터 단리될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 원하는 코딩 서열 및 적절한 핵산 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는, 시험관내 또는 제자리, 또는 생체내에 위치되든 간에 임의의 진핵 또는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아 세포 예컨대 대장균, CHO 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포 및 곤충 세포)를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 일반적으로 허용되는 경계는 다양할 수 있지만, 개과 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로, 예를 들어, 위치 231의 아미노산 잔기로부터 그의 카르복실-말단까지 신장되는 것으로 정의된다. 일부 실시양태에서, 변이체는 Fc 영역의 일부만을 포함하고 카르복시-말단을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 및 CH3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불변 도메인 중 하나 이상을 갖는 변이체가 고려된다. 다른 실시양태에서, 이러한 불변 도메인이 없는 (또는 이러한 불변 도메인의 일부만 있는) 변이체가 고려된다.
개과 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 일반적으로, 예를 들어, 약 아미노산 231 내지 약 아미노산 340으로 연장된다(도2 참조). CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 고유하다. 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬은 온전한 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 개재된다.
개과 IgG Fc 영역의 "CH3 도메인"은 일반적으로, 예를 들어 약 아미노산 잔기 341 내지 약 아미노산 잔기 447에 이르는 Fc 영역 내의 CH2 도메인에 대한 잔기 C-말단의 신장이다(도2 참조).
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 적어도 하나의 이펙터 기능은 천연 Fc 영역 또는 변이체의 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 관련하여 증진되거나 감소될 수 있다. 이펙터 기능의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: Clq 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균 작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR) 의 하향 조절 등 이러한 이펙터 기능은 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)에 작동가능하게 연결되는 것을 요구할 수 있고 다양한 검정(예를 들어, Fc 결합 검정, ADCC 검정, CDC 검정, 전체 또는 분획화된 혈액 샘플로부터의 표적 세포 고갈 등)을 사용하여 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역" 또는 "야생형 Fc 영역"은 자연에서 일반적으로 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 지칭한다. 예시적인 천연 서열 개과 Fc 영역이 도 2에 도시되어 있으며, 개과 IgG Fc 영역의 천연 서열을 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 본원에서 정의된 것과 같은 적어도 하나의 "아미노산 치환"으로 인해 천연 서열 Fc 영역(또는 이의 단편)의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는다. 대안적 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 본원에서 개시된 방법에 따라 생성될 수 있고 이 변이체 Fc 영역은 항체 가변 도메인 또는 비-항체 폴리펩티드, 예를 들어, 수용체 또는 리간드의 결합 도메인과 같은 선택된 이종 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 맥락에서 용어 "유도체"는 아미노산 잔기 치환의 도입에 의해 변경된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "유도체"는 또한 임의의 유형의 분자의 폴리펩티드에 대한 공유 부착에 의해 변형된 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 비제한적으로, 항체는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해 변형될 수 있다. 유도체 폴리펩티드는 특정 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 화학적 변형에 의해 생성될 수 있다. 더욱이, 유도체 폴리펩티드는 그것이 유래된 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 기능을 보유한다. 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 본원에 정의된 유도체일 수 있으며, 바람직하게는 유도체화가 Fc 영역 내에서 일어나는 것으로 이해된다.
폴리펩티드(예를 들어, Fc 영역 또는 모노클로날 항체)와 관련하여 본원에 사용된 "실질적으로 개과 유래"는 폴리펩티드가 천연 개과 아미노 폴리펩티드의 것과 적어도 80%, 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 상동성인 아미노산 서열을 갖는다는 것을 나타낸다. 용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 Fc 영역(예를 들어, 항체의 Fc 영역)에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것이고, 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 Fc 감마 RI, Fc 감마 RII, Fc 감마 RIII 서브클래스의 수용체를 포함한다. 또 다른 바람직한 FcR은 태아로의 모체 IgG의 전달을 담당하는 신생아 수용체인 FcRn을 포함한다(Guyer 등, J. Immunol. 117:587(1976) 및 Kim 등, J. Immunol. 24: 249(1994)). 미래에 확인될 것을 포함한, 다른 FcR이 본원에서 용어 "FcR"에 포괄된다.
어구 "항체-의존적 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 FcR(예를 들어, 자연 살해("NK") 세포, 호중구 및 대식세포)을 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 비특이적)가 표적 세포에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용리를 야기하는 세포-매개된 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포인 NK 세포는, Fc 감마 RIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 Fc 감마 RI, Fc 감마 RII 및 Fc 감마 RIII를 발현한다.
본원에 사용된 문구 "이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구(바람직하게는 개과)를 지칭한다. 바람직하게는, 세포는 적어도 Fc 감마 RIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 백혈구의 예는 PBMC, NK 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 천연 공급원으로부터 (예를 들어, 혈액 또는 PBMC로부터) 단리될 수 있다.
"변경된" FcRn 결합 친화도를 갖는 변이체 폴리펩티드는 변이체의 모 폴리펩티드 또는 pH 6.0에서 측정시 천연 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비하여 증강되거나 (즉, 증가되거나, 더 크거나 더 높은) 또는 약화된(즉, 감소된, 줄은 또는 더 작은) FcRn 결합 친화도를 갖는 것이다. FcRn에 대한 증가된 결합 또는 증가된 결합 친화도를 나타내는 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드보다 더 큰 친화도로 FcRn에 결합한다. FcRn에 대한 감소된 결합 또는 감소된 결합 친화도를 나타내는 변이체 폴리펩티드는 그의 모 폴리펩티드보다 낮은 친화도로 FcRn에 결합한다. FcRn에 대한 감소된 결합을 나타내는 이러한 변이체는 FcRn에 대한 적은 또는 전혀 인식할 수 없는 결합, 예를 들어 모 폴리펩티드와 비교하여 FcRn에 대한 0-20% 결합을 보유할 수 있다. 그것의 모 폴리펩티드에 비하여 "증강된 친화성"으로 FcRn에 결합하는 변이체 폴리펩티드는 결합 검정에서 변이체 폴리펩티드와 모 폴리펩티드의 양이 본질적으로 동일하고, 다른 모든 조건이 동일한 경우 모 폴리펩티드보다 더 높은 결합 친화도로 FcRn에 결합하는 것이다. 예를 들어, 증강된 FcRn 결합 친화도를 갖는 변이체 폴리펩티드는, 예를 들어, ELISA 검정 또는 당업자가 이용할 수 있는 다른 방법에서 FcRn 결합 친화도가 결정되는, 모 폴리펩티드에 비하여 FcRn 결합 친화도에서 약 1.10배 내지 약 100배(더 전형적으로는 약 1.2배 내지 약 50배) 증가를 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "아미노산 치환"은 주어진 아미노산 서열에서 적어도 하나의 기존 아미노산 잔기를 또 다른 상이한 "대체" 아미노산 잔기로의 대체를 지칭한다. 대체 잔기 또는 잔기들은 "자연적으로 발생하는 아미노산 잔기"(즉, 유전자 코드에 의해 코딩됨)일 수 있고 알라닌(Ala); 아르기닌(Arg); 아스파라긴(Asn); 아스파르트산(Asp); 시스테인(Cys); 글루타민(Gln); 글루탐산(Glu); 글리신(Gly); 히스티딘(His); 이소류신(Ile): 류신(Leu); 라이신(Lys); 메티오닌(Met); 페닐알라닌(Phe); 프롤린(프로); 세린(Ser); 트레오닌(Thr); 트립토판(Trp); 티로신(Tyr); 및 발린(Val)으로부터 선택된다. 하나 이상의 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기로의 치환은 또한 본원에서 아미노산 치환의 정의에 의해 포괄된다. "비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유적으로 결합할 수 있는, 상기 열거된 이들 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기 이외의 잔기를 지칭한다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 예컨대 Ellman 등 Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991)에 기술된 기타 아미노산 잔기 유사체것들을 포함한다.
용어 "검정 신호"는 비색 검정, 형광 강도 또는 분당 붕해로부터의 흡광도 측정을 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 임의의 방법으로부터의 출력을 지칭한다. 검정 형식에는 ELISA, facs 또는 기타 방법이 포함될 수 있다. "검정 신호"에서 변화는 세포 생존율에서 변화 및/또는 운동적 오프-비율, 운동적 온-비율 또는 둘 모두의 변화를 반영할 수 있다. "더 높은 검정 신호"는 측정된 출력 숫자가 다른 숫자보다 큰 것을 지칭한다(예를 들어, 변이체는 모 폴리펩티드와 비교하여 ELISA 검정에서 더 높은(더 큰) 측정된 숫자를 가질 수 있음). "더 낮은" 검정 신호는 측정된 출력 숫자가 다른 숫자보다 작은 것을 지칭한다(예를 들어, 변이체는 모 폴리펩티드와 비교하여 ELISA 검정에서 더 낮은(더 작은) 측정된 숫자를 가질 수 있음).
용어 "결합 친화도"는 각각의 Fc 수용체-Fc 결합 상호작용과 연관된 평형 해리 상수(농도의 단위로 표현됨)를 지칭한다. 결합 친화도는 운동적 온-비율(일반적으로 단위 시간당 농도의 단위로 보고됨, 예를 들어, 몰/초)에 의해 나누어진 운동적 오프-비율(일반적으로 역 시간의 단위로 보고됨, 예를 들어, 초-1)의 비에 직접적으로 관련된다. 일반적으로 평형 해리 상수에서 변화가 온-비율, 오프-비율 또는 둘 모두에서의 차이로 기인한 것인지 여부는 이들 매개변수 각각이 실험적으로(예를 들어, BIACORE 또는 SAPIDYNE 측정에 의해) 결정되지 않는 한 명확하게 기술하는 것이 가능하지 않다.
본원에 사용된 용어 "힌지 영역"은 개과 IgG 스트레칭에서 아미노산의 스트레치, 예를 들어 개과 IgG의 위치 216으로부터 위치 230까지를 지칭한다. 다른 IgG 이소타입의 힌지 영역은 중쇄-간 이황화(S―S) 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 동일한 위치에 배치함에 의해 IgG 서열과 정렬될 수 있다.
"C1q"는 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드다. Clq는 2개의 세린 프로테아제인 Clr 및 Cls와 함께 CDC 경로의 제1 성분인 복합체 Cl을 형성한다.
본원에서 사용된 것과 같이, 용어 "항체"는 "면역글로불린" 또는 "Ig"와 상호교환적으로 사용되고, 가장 넓은 의미로 사용되며 구체적으로 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체 포함함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 원하는 생물학적 활성 또는 기능적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 단쇄 항체, 및 키메라, 개과 또는 개과화 항체, 및 상이한 종으로부터 유래된 부분을 포함하는 키메라 또는 CDR-이식된 단쇄 항체 등도 또한 본 발명 및 용어 "항체"에 포함된다. 이들 항체의 다양한 부분은 통상적인 기술에 의해 화학적으로, 합성적으로 함께 연결될 수 있거나, 유전 공학 기술을 사용하여 인접 단백질로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 또는 개과화 사슬을 코딩하는 핵산은 인접 단백질을 생산하기 위해 발현될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 미국 특허 제4,816,397호; WO 86/01533호; 미국 특허 번호 제5,225,539호; 및 미국 특허 번호 제5,585,089호 및 제5,698,762호를 참조한다. 또한, 영장류화된 항체에 관하여 Newman, R. 등 BioTechnology, 10:1455-1460, 1993, 및 단일 사슬 항체에 관하여 Ladner 등의 미국 특허 번호 제4,946,778호 및 Bird, R. E. 등, Science, 242:423-426, 1988를 참조한다. Fc 영역(또는 이의 일부)을 포함하는 항체의 모든 형태는 본원에서 "항체"라는 용어 내에 포괄되는 것으로 이해된다. 더욱이, 항체는 당업계에 공지된 방법에 따라 검출가능한 표지로 표지될 수 있고, 고체 상에 고정되고/되거나 이종 화합물(예를 들어, 효소 또는 독소)과 접합될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 지칭한다. 항체 단편의 예는 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; Fc 또는 Fc' 펩타이드; Fab 및 Fab 단편, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항체 단편은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부 및 선택적으로 IgG 중쇄의 CH1 영역을 보유한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 단편은 CH2 영역의 적어도 일부 또는 전체 CH2 영역을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "기능적 단편"은 모노클로날 항체와 관련하여 사용될 때 여전히 기능적 활성을 유지하는 모노클로날 항체의 일부를 지칭하도록 의도된다. 기능적 활성은, 예를 들어, 항원 결합 활성 또는 특이성, 수용체 결합 활성 또는 특이성, 이펙터 기능 활성 등일 수 있다. 모노클로날 항체 기능적 단편은, 예를 들어, VL, VH 및 Fd와 같은 개별 중쇄 또는 경쇄 및 이의 단편; Fv, Fab 및 Fab'와 같은 1가 단편; F(ab')2와 같은 2가 단편; 단일 사슬 Fv(scFv); 및 Fc 단편을 포함한다. 이러한 용어는, 예를 들어, Harlowe와 Lane의 문헌 Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference(Myers, R. A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Enzymol., Huston 등, Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) 및 Day, E. D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. (1990)에 기술되어 있다. 용어 기능적 단편은, 예를 들어, 프로테아제 단리 또는 모노클로날 항체의 환원에 의해 및 당업자에게 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 생성된 단편을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "단편"은 다른 폴리펩티드의 아미노산 서열의 적어도 5, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 90, 100 이상의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드의 단편은 전장 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 보유한다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 1가, 2가 또는 다가 면역글로불린을 포함한다. 1가 키메라 항체는 키메라 경쇄와 이황화 다리를 통해 연관된 키메라 중쇄에 의해 형성된 이량체이다. 2가 키메라 항체는 적어도 하나의 이황화 다리를 통해 연관된 2개 중쇄-경쇄 이량체에 의해 형성된 사량체이다. 개과에서 사용하기 위한 항체의 키메라 중쇄는 CH1 또는 CH2와 같은 개과 중쇄 불변 영역의 적어도 일부에 연결된 비-개과 항체의 중쇄로부터 유래된 항원-결합 영역을 포함한다. 개과에 사용하기 위한 항체의 키메라 경쇄는 개과 경쇄 불변 영역(CL)의 적어도 일부에 연결된 비-개과 항체의 경쇄로부터 유래된 항원 결합 영역을 포함한다. 동일하거나 상이한 가변 영역 결합 특이성의 키메라 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체, 단편 또는 유도체는 또한 공지된 방법 단계에 따라 개별 폴리펩티드 사슬의 적절한 회합에 의해 제조될 수 있다. 이 접근법으로, 키메라 중쇄를 발현하는 숙주를 키메라 경쇄를 발현하는 숙주와 별도로 배양하고 면역글로불린 사슬을 별도로 회수한 다음 회합시킨다. 대안적으로, 숙주는 공동-배양될 수 있고 사슬이 배양 배지에서 자발적으로 회합되도록 허용된 후 어셈블링된 면역글로불린 또는 단편 또는 둘 모두의 회수에 의해 중쇄 및 경쇄가 동일한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,284,471호; 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 4,816,397를 참조한다).
본원에서 사용된 것과 같이, "개과화" 형태의 비-개과(예를 들어, 뮤린) 항체(즉, 개과화 항체)는 비-개과 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하거나 서열이 없는 항체이다. 대부분의 경우 개과화 항체는 수용체의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 랫트, 토끼, 인간 또는 비인간 영장류와 같은 비-개과 종의 초가변 영역(공여자 항체)으로부터의 잔기로 대체된 개과 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부 경우에, 개과 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-개과 잔기로 대체된다. 더욱이, 개과화 항체는 수용체 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 일반적으로 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 개과화 항체는 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프(CDR)는 비-개과 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 개과 면역글로불린 서열의 것이다. 개과화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 개과 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역부착소"는 이종 "부착소" 단백질(예를 들어, 수용체, 리간드 또는 효소)의 결합 도메인을 면역글로불린 불변 도메인과 조합시키는 항체-유사 분자를 지칭한다. 구조적으로, 면역부착소는 면역글로불린 불변 도메인 서열을 갖는 항체(즉, "이종"임)의 항원 인식 및 결합 부위(항원 조합 부위) 이외의 원하는 결합 특이성을 갖는 부착소 아미노산 서열의 융합을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "리간드 결합 도메인"은 상응하는 천연 수용체의 적어도 정성적 리간드 결합 능력을 보유하는 임의의 천연 수용체 또는 임의의 영역 또는 이의 유도체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 수용체는 면역글로불린 슈퍼유전자과의 구성원에 상동인 세포외 도메인을 갖는 세포-표면 폴리펩티드로부터의 것이다. 면역글로불린 슈퍼유전자과의 구성원은 아니지만 그럼에도 불구하고 이 정의에 의해 구체적으로 포괄되는 다른 수용체는 사이토카인에 대한 수용체, 특히 티로신 키나제 활성을 갖는 수용체(수용체 티로신 키나제), 조혈모세포 및 신경 성장 인자 수용체 슈퍼패밀리의 구성원, 및 세포 부착 분자(예를 들어, E-, L- 및 P-셀렉틴)이다.
본원에 사용된 용어 "수용체 결합 도메인"은, 예를 들어, 세포 부착 분자, 또는 상응하는 천연 리간드의 적어도 질적 수용체 결합 능력을 보유하는 이러한 천연 리간드의 임의의 영역 또는 유도체를 포함하는 수용체에 대한 임의의 천연 리간드를 지칭한다.
본원에 사용된 "단리된" 폴리펩티드는 그의 자연 환경의 성분으로부터 식별 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그 자연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 (1) Lowry 방법에 의해 결정된 폴리펩티드의 95중량% 초과, 바람직하게는 99중량% 초과, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터의 사용에 의한 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15 잔기를 수득하기에 충분한 정도, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용한 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-page에 의한 균질성으로 정제된다. 단리된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 제자리에서 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에 사용된 용어 "장애" 및 "질환"은 만성 및 급성 장애 또는 질환(예를 들어, 환자가 특정 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 상태)을 포함하는 변이체 폴리펩티드(발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드)로의 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 상태를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "수용체"는 적어도 하나의 리간드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 바람직한 수용체는 세포외 리간드-결합 도메인 및 선택적으로 다른 도메인(예를 들어, 막횡단 도메인, 세포내 도메인 및/또는 막 앵커)을 갖는 세포-표면 또는 가용성 수용체이다. 본원에 기재된 검정에서 평가될 수용체는 온전한 수용체 또는 이의 단편 또는 유도체(예를 들어, 하나 이상의 이종 폴리펩티드에 융합된 수용체의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질)일 수 있다. 더욱이, 그의 결합 특성에 대해 평가될 수용체는 세포에 존재하거나 단리되고 선택적으로 검정 플레이트 또는 일부 다른 고체 상에 코팅되거나 직접 표지되고 프로브로 사용될 수 있다.
개과 야생형 IgG
개과 IgG는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 Bergeron 등, 2014, Vet Immunol Immunopathol., vol.157 (1-2), 31-41면에 자세히 기술되어 있다. 일 실시양태에서, 개과 IgG는 gGA이다. 또 다른 실시양태에서, 개과 IgG는 IgGB이다. 또 다른 실시양태에서, 개과 IgG는 IgGC이다. 추가 실시양태에서, 개과 IgG는 IgGD이다. 특정 실시양태에서, 개과 IgG는 IgGB이다.
IgGA, IgGB, IgGC, 및 IgGD의 아미노산 및 핵산 서열은 또한 당업계에 잘 알려져 있다.
일 예에서, 발명의 IgG는 불변 도메인, 예를 들어 CH1, CH2, 또는 CH3 도메인, 또는 이의 조합을 포함한다. 또 다른 예에서, 발명의 불변 도메인은, 예를 들어 CH2 또는 CH3 도메인 또는 이의 조합을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
특정 예에서, 야생형 불변 도메인은 서열번호 1, 2, 3, or 4에 있다. 일부 실시양태에서, 야생형 IgG 불변 도메인은 서열번호 1,2,3 또는 4의 동족체, 변이체, 이성질체 또는 기능적 단편이지만 본원에 기재된 임의의 돌연변이는 없다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
IgGs 불변 도메인은 또한 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 본원에서 Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988)에 따른 FASTA 검색 방법에 의해 결정된 바와 같이, 비교된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열로서 정의된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 IgG 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일 실시양태에서, 핵산은 예를 들어 CH1, CH2, CH3 영역, 또는 이의 조합을 포함하는 항체 중쇄를 코딩할 수 있다. 다른 실시양태에서, 핵산은, 예를 들어, VH 영역 중 임의의 하나 또는 이의 일부, 또는 이의 임의의 변이체를 포함하는 VH CDR 중 임의의 하나를 포함하는 항체 중쇄를 코딩할 수 있다. 발명은 또한, 예를 들어, CL 영역 중 임의의 하나 또는 이의 일부, VL 영역 중 임의의 하나 또는 이의 일부 또는 이의 임의의 변이체를 포함하는 VL CDR 중 임의의 하나를 포함하는 항체 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산은 중쇄 및 경쇄 둘 모두, 또는 이의 일부를 코딩한다.
서열 번호 1,2,3 또는 4의 야생형 불변 도메인의 아미노산 서열은 그의 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 예를 들어, 서열 번호 2의 야생형 불변 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 5 또는 6의 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 양태에서, 서열 번호1, 2, 3 또는 4의 야생형 불변 도메인의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 16, 5, 17 또는 18에 기재된 핵산 서열에 의해 암호화된다.
변형된 개과 IgG
본 출원의 발명자들은 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 것이 FcRn에 대한 친화도를 놀랍게 그리고 예상외로 향상시킨다는 것을 발견하였다. 본원에서 사용된 바와 같은 아미노산 위치 번호는 카바트 (Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991))에서와 같은 Eu 인덱스에 따라 번호화된 위치를 지칭한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 대한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 변형된 IgG를 제공하며, 여기서 상기 치환은 카바트에서와 같은 Eu 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 247, 252, 254, 256, 311, 312, 314, 431, 434, 또는 439이다.
일부 실시양태에서, 불변 도메인은 P247V, L252Y, L252P, L252W, L252A, L252D, L252G, L252H, L252I, L252K, L252M, L252N, L252Q, L252S, L252T, L252V, L252F, L252R, A254F, A254G, A254H, A254N, A254Q, A254R, A254W, A254C, A254D, A254I, A254K, A254L, A254M, A254P, A254S, A254T, A254V, A254Y, T256H, T256I, T256K, T256L, T256Q, T256Y, T256A, T256C, T256D, T256F, T256G, T256M, T256N, T256P, T256R, T256S, T256V, T256W, T256E, Q311H, Q311R, Q311Y, Q311W, D312P, L314K, A431K, N434A, N434C, N434D, N434E, N434F, N434G, N434H, N434I, N434K, N434L, N434M, N434P, N434Q, N434R, N434S, N434T, N434V, N434W, N434Y 및 E439K 중 하나 이상의 치환을 포함한다.
특정 예에서, 본 발명은 서열 번호 1,2,3 또는 4의 야생형 아미노산 서열에서 본원에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 IgG 불변 도메인은 본원에 기재된 상동체, 변이체, 이성질체 또는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 기능적 단편이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
돌연변이체 불변 도메인의 아미노산 서열은 그의 상응하는 돌연변이체 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 발명의 항체 분자를 만드는 방법
항체 분자를 만드는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 미국 특허 번호 제8,394,925호; 제8,088,376호; 제8,546,543호; 제10,336,818호; 및 제9,803,023호 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060067930를 참조하며, 이들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법, 프로세스 또는 기술이 사용될 수 있다. 발명의 변이체 Fc 영역을 갖는 항체 분자는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 수용체 또는 리간드의 항체 가변 도메인 또는 결합 도메인과 같은 선택된 이종 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
분자 생물학 및 재조합 기술의 방법의 출현으로, 당업자는 재조합 수단에 의해 항체 및 항체-유사 분자를 생성할 수 있으며, 이에 의해 항체의 폴리펩티드 구조에서 발견되는 특정 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열을 생성할 수 있다. 이러한 항체는 상기 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 유전자 서열을 클로닝하거나, 합성된 사슬의 어셈블리로 특정 에피토프 및 항원 결정기에 친화성을 갖는 활성 사량체(H2L2) 구조를 형성하는 상기 폴리펩티드 사슬의 직접 합성에 의해 생성될 수 있다. 이것은 상이한 종 및 공급원으로부터 항체를 중화시키는 것을 특징으로 하는 서열을 갖는 항체의 용이한 생산을 가능하게 하였다.
항체의 공급원, 또는 항체가 재조합적으로 구성되는 방식, 또는 시험관내 또는 생체내에서, 트랜스제닉 동물, 실험실 또는 상업적 크기의 큰 세포 배양물을 사용하거나, 트랜스제닉 식물을 사용하거나 또는 프로세스의 임의의 단계에서 살아있는 유기체를 이용하지 않는 직접적인 화학적 합성에 의해 합성되는 방식에 관계없이, 모든 항체는 유사한 전체 3차원 구조를 갖는다. 이 구조는 종종 H2L2로 주어지고 항체가 일반적으로 2개의 경쇄(L) 아미노산 사슬과 2개의 중쇄(H) 아미노산 사슬을 포함한다는 사실을 지칭한다. 두 사슬 모두 구조적으로 상보적인 항원 표적과 상호작용할 수 있는 영역을 가지고 있다. 표적과 상호작용하는 영역은 "가변" 또는 'V" 영역으로 지칭되고 상이한 항원 특이성의 항체와 아미노산 서열에서 차이를 특징으로 한다. H 또는 L 사슬의 가변 영역은 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 함유한다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 영역"은 항원과 상호작용하고 항체에 항원에 대한 그 특이성 및 친화성을 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항체 분자의 그 부분을 지칭한다. 항체 결합 영역은 항원-결합 잔기의 적절한 형태를 유지하는 데 필요한 "프레임워크" 아미노산 잔기를 포함한다. 항원 결합 영역을 제공하는 H 또는 L 사슬의 가변 영역 내에는, 상이한 특이성의 항체 사이에서 이의 극도의 가변성 때문에 "초가변성"이라고 불리는 더 작은 서열이 있다. 이러한 초가변성 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 영역으로도 지칭된다. 이들 CDR 영역은 특정 항원 결정기 구조에 대한 항체의 기본적 특이성을 설명한다.
CDR은 가변 영역 내의 아미노산의 비-연속적인 스트레치를 나타내지만, 종에 관계없이 가변 중쇄 및 경쇄 영역 내의 이들 중요한 아미노산 서열의 위치적 위치는 가변 사슬의 아미노 산 서열 내의 유사한 위치를 갖는 것으로 밝혀졌다. 모든 항체의 가변 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR 영역을 가지며, 각각은 다른 영역과 비-인접성이다. 모든 포유동물 종에서, 항체 펩티드는 불변(즉, 고도로 보존된) 영역과 가변 영역을 함유하고, 후자 내에는 CDR과 CDR 외부가 아닌 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 내의 아미노산 서열로 구성된 소위 "프레임워크 영역"이 있다.
본 발명은 상기 기재된 핵산 중 적어도 하나를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 유전자 코드는 퇴화성이기 때문에 특정 아미노산을 코딩하는 데 하나 초과의 코돈이 사용될 수 있다. 유전자 코드를 사용하여 하나 이상의 상이한 뉴클레오티드 서열이 식별될 수 있으며, 이들 각각은 아미노산을 코딩할 수 있다. 특정 올리고뉴클레오타이드가 실제로 실제 코딩 서열을 구성할 확률은 비정상적인 염기 페어링 상관관계와 특정 코돈이 항체 또는 일부를 발현하는 진핵 또는 원핵 세포에서 (특정 아미노산을 코딩하기 위해) 실제로 사용되는 빈도를 고려하여 추정될 수 있다. 이러한 "코돈 사용 규칙"은 Lathe, 등, 183 J. Molec. Biol. 1-12(1985)에 개시되어 있다. Lathe의 "코돈 사용 규칙"을 사용하여 개과 IgG 서열을 코딩할 수 있는 이론적인 "가장 가능성 있는" 뉴클레오티드 서열을 함유하는 단일 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 세트가 식별될 수 있다. 또한 본 발명에 사용하기 위한 항체 코딩 영역은 본원에 기재된 항체 및 펩티드의 변이체를 생성하는 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 기존 항체 유전자를 변경함에 의해 제공될 수 있다는 것이 또한 의도된다. 이러한 변이체는 항체 또는 펩티드의 아미노산 서열에서 결실, 첨가 및 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 치환의 한 부류는 보존적 아미노산 치환이다. 이러한 치환은 개과 항체 펩티드에서의 주어진 아미노산을 유사한 특성의 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 전형적으로 보존적 치환으로 보이는 것은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 중에서 서로에 대한 대체; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 상호교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gin 간의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환, 방향족 잔기 Phe, Tyr 중에서 대체 등이다. 어떤 아미노산 변화가 표현형으로 침묵할 가능성이 있는지에 관한 지침은 Bowie 등, 247 Science 1306-10(1990)에서 찾을 수 있다.
변이체 개과 항체 또는 펩티드는 완전히 기능적일 수 있거나 하나 이상의 활성에서 기능을 결할 수 있다. 완전 기능적 변이체는 전형적으로 비임계 잔기 또는 비임계 영역에서 보존적 변이 또는 변이만을 함유한다. 기능적 변이체는 기능에 변화가 없거나 미미한 변화를 초래하는 유사한 아미노산의 치환을 함유할 수도 있다. 대안적으로, 이러한 치환은 어느 정도 기능에 긍정적 또는 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 비기능적 변이체는 전형적으로 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환, 결실, 삽입, 역위 또는 절두 또는 임계 잔기 또는 임계 영역에 치환, 삽입, 역위 또는 결실을 포함한다.
기능에 필수적인 아미노산은 부위-지향된 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 식별될 수 있다. Cunningham 등, 244 Science 1081-85 (1989). 후자의 절차는 분자의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 생성된 돌연변이 분자는 그 다음 에피토프 결합 또는 시험관내 ADCC 활성과 같은 생물학적 활성에 대해 시험된다. 리간드-수용체 결합에 중요한 부위는 결정학, 핵 자기 공명 또는 광친화성 표지와 같은 구조 분석에 의해 결정될 수도 있다. Smith 등, 224 J. Mol. Biol. 899-904 (1992); de Vos 등, 255 Science 306-12 (1992).
더욱이, 폴리펩티드는 종종 20개의 "자연적으로 발생하는" 아미노산 이외의 아미노산을 함유한다. 또한, 말단 아미노산을 비롯한 많은 아미노산은 프로세싱 및 다른 해독후 변형과 같은 천연 과정, 또는 본 기술분야에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 공지된 변형에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마 카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화 및 유비퀴틴화와 같은 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개된 첨가를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 변형은 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있으며 과학 문헌에 매우 상세하게 설명되어 있다. 몇 가지 특히 일반적인 변형, 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 하이드록실화 및 ADP 리보실화는 예로써 Proteins-Structure and Molecular Properties (2nd ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman & Co., N.Y., 1993)와 같은 가장 기본적 텍스트에 기술되어 있다. 이 주제에 대한 많은 상세한 리뷰가, 예를 들어, Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic Press, N.Y., 1983); Seifter 등 182 Meth Enzymol. 626-46 (1990); 및 Rattan 등 663 Ann. NY Acad. Sci. 48-62 (1992)에서 확인 가능하다.
다른 양태에서, 발명은 항체 유도체를 제공한다. 항체의 "유도체"는 일반적으로 단백질의 일부가 아닌 부가적인 화학적 모이어티를 함유한다. 단백질의 공유 변형이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 변형은 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화 제제와 반응시킴에 의해 분자 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 이작용성 제제를 사용한 유도체화는 항체 또는 단편을 수-불용성 지지체 매트릭스 또는 다른 거대분자 담체에 가교결합하는 데 유용하다. 유도체는 또한 표지된 방사성으로 표지된 모노클로날 항체를 포함한다.
예를 들어, 방사성 요오드(25I,131I), 탄소(4C), 황(35S), 인듐, 삼중수소(H3) 등; 비오틴 또는 아비딘과 모노클로날 항체의 접합체, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코아밀라제, 카르복실산 탈수효소, 아세틸콜린 에스테라제, 리소자임, 말산 탈수소효소 또는 글루코스 6-인산 탈수소효소와 같은 효소; 및 또한 생물발광제(예컨대 루시퍼라제), 화학발광제(예컨대 아크리딘 에스테르) 또는 형광제(예컨대 피코빌리단백질)와 모노클로날 항체의 접합체.
발명의 또 다른 유도체 이작용성 항체는 2개의 상이한 항원성 기를 인식하는 2개의 별도 항체의 부분을 조합함에 의해 생성된 이중특이적 항체이다. 이것은 가교 또는 재조합 기술에 의해 달성될 수 있다. 추가로, 모이어티는 항체 또는 이의 일부에 첨가되어 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다(예를 들어, 혈류로부터 제거되는 시간을 연장함에 의함. 이러한 기술은, 예를 들어 PEG 모이어티 추가(페길화라고도 함)를 포함하고, 당업계에 잘 알려져 있다. 미국 특허 출원 공개 번호 제20030031671호를 참조한다.
일부 실시양태에서, 대상 항체를 코딩하는 핵산은 숙주 세포 내로 직접적으로 도입되고, 세포는 코딩된 항체의 발현을 유도하기에 충분한 조건 하에 인큐베이션된다. 대상 핵산이 세포 내로 도입된 후, 세포는 통상적으로 항체의 발현을 허용하기 위해 약 1~24시간의 기간 동안 일반적으로 37℃에서, 때로는 선택하에 인큐베이션된다. 일 실시양태에서, 항체는 세포가 성장하는 배지의 상등액 안으로 분비된다. 전통적으로, 모노클로날 항체는 뮤린 하이브리도마 계통에서 천연 분자로 생산되었다. 그 기술에 더하여, 본 발명은 항체의 재조합 DNA 발현을 제공한다. 이것은 선택한 숙주 종에서 항체뿐만 아니라 일정 범위의 항체 유도체 및 융합 단백질의 생산을 허용한다.
본 발명의 적어도 하나의 항체, 일부 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 결찰을 위한 평활-말단 또는 엇갈린-단부 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 절단, 접합성 말단의 것에 적절하게 충진하고 바람직하지 않은 연결을 피하기 위한 알칼리성 포스파타제 처리 및 적절한 리가제로 결찰을 포함하는 통상적인 기술에 따라 벡터 DNA와 재조합될 수 있다. 이러한 조작을 위한 기술은, 예를 들어 Maniatis 등, MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 및 1989), 및 Ausubel 등. 1993 supra에 기술되어 있으며, 항체 분자 또는 이의 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 작제하는데 사용될 수 있다.
DNA와 같은 핵산 분자는 전사 및 번역 조절 정보를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 함유하고 이러한 서열이 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 연결"되어 있는 경우 폴리펩티드를 "발현할 수 있는" 것으로 언급된다. 작동가능한 연결은 조절 DNA 서열과 발현하고자 하는 DNA 서열이 회복가능한 양의 펩티드 또는 항체 부분으로서 유전자 발현을 허용하는 방식으로 연결되는 연결이다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 특성은 유사한 기술 분야에 잘 알려진 것과 같이 유기체마다 다를 수 있다. 예를 들어, Sambrook 등, 2001 supra; Ausubel 등, 1993 supra을 참조한다.
이에 따라 본 발명은 원핵 또는 진핵 세포에서 항체 또는 펩티드의 발현을 포괄한다. 적합한 숙주는 생체내 또는 현장에서 박테리아, 효모, 곤충, 진균, 조류 및 포유동물 세포를 포함한 박테리아 또는 진핵 숙주, 또는 포유동물, 곤충, 조류 또는 효모 기원의 숙주 세포를 포함한다. 포유동물 세포 또는 조직은 인간, 영장류, 햄스터, 토끼, 설치류, 소, 돼지, 양, 말, 염소, 개 또는 고양이 기원일 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 포유동물 세포가 또한 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 발명의 뉴클레오티드 서열은 수용체 숙주에서 자가 복제가 가능한 플라스미드 또는 바이러스 벡터 안으로 혼입될 것이다. 이 목적을 위해 다양한 벡터 중 임의의 것이 이용될 수 있다. 예를 들어, Ausubel 등, 1993 supra 참조. 특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택하는 데 중요한 요소는: 벡터를 함유하는 수용체 세포가 벡터를 함유하지 않는 이들 수용체 세포로부터 인식되고 선택될 수 있는 용이성; 특정 숙주에서 원하는 벡터의 카피의 수; 및 다른 종의 숙주 세포 사이에서 벡터를 "셔틀"할 수 있는 것이 바람직한지 여부를 포함한다.
당업계에 공지된 예시적인 원핵 벡터는 E. coli에서 복제할 수 있는 것과 같은 플라스미드 (예를 들어, pBR322, CoIE1, pSC101, pACYC 184, .pi.vX)를 포함한다. 이러한 플라스미드는 예를 들어 문헌 Maniatis 등, 1989 supra; Ausubel 등, 1993 supra에 개시되어 있다. 바실루스 플라스미드는 pC194, pC221, pT127 등을 포함한다. 이러한 플라스미드는 Gryczan에 의해 THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI 307-329 (Academic Press, NY, 1982)에 개시되어 있다. 적합한 스트렙토마이세스 플라스미드는 p1J101 (Kendall 등, 169 J. Bacteriol. 4177-83 (1987), 및 Streptomyces bacteriophages such as phLC31 (Chater 등, SIXTH INT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 (Akademiai Kaido, Budapest, Hungary 1986)을 포함한다. 슈도모나스 플라스미드는 John 등, 8 Rev.Infect. Dis. 693-704 (1986); lzaki, 33 Jpn. J. Bacteriol. 729-42 (1978); 및 Ausubel 등, 1993 supra에서 검토되어 있다.
대안적으로, 항체 또는 펩티드를 암호화하는 cDNA의 발현에 유용한 유전자 발현 요소는 (a) SV40 초기 프로모터(Okayama 등, 3 Mol. Cell Biol. 280(1983), Rous 육종 바이러스 LTR(Gorman 등, 79 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 6777(1982), 및 Moloney 쥐 백혈병 바이러스 LTR(Grosschedl 등, 41 Cell 885(1985))와 같은 바이러스 전사 프로모터 및 인핸서 요소 (b) SV40 후기 영역(Okayarea 등, 1983)에서 파생된 것과 같은 스플라이스 영역 및 폴리아데닐화 부위 및 (c) SV40(Okayama 등, 1983)에서와 같은 폴리아데닐화 부위를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
면역글로불린 cDNA 유전자는, Weidle 등, 51 Gene 21 (1987)에 의해 기술된 바와 같이 발현 요소로서 SV40 초기 프로모터 및 그의 인핸서, 마우스 면역글로불린 H 사슬 프로모터 인핸서, SV40 후기 영역 mRNA 스플라이싱, 토끼 S-글로빈 개재 서열, 면역글로불린 및 토끼 S-글로빈 폴리아데닐화 부위, 및 SV40 폴리아데닐화 요소를 사용하여 발현될 수 있다. cDNA 부분, 게놈 DNA 부분(Whittle 등, 1 Protein Engin. 499 (1987)), 으로 구성된 면역글로불린 유전자에 대해, 전사 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스일 수 있고, 프로모터 인핸서는 사이토메갈로바이러스 및 마우스/인간 면역글로불린일 수 있고, mRNA 스플라이싱 및 폴리아데닐화 영역은 천연 염색체 면역글로불린 서열일 수 있다.
일 실시양태에서, 설치류 세포에서 cDNA 유전자의 발현을 위해, 전사 프로모터는 바이러스 LTR 서열이고, 전사 프로모터 인핸서는 마우스 면역글로불린 중쇄 인핸서 및 바이러스 LTR 인핸서 중 하나 또는 둘 모두이고, 스플라이스 영역은 31bp보다 큰 인트론을 함유하고, 폴리아데닐화 및 전사 종결 영역은 합성되는 면역글로불린 사슬에 상응하는 천연 염색체 서열로부터 유래된다. 다른 실시양태에서, 다른 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 포유동물 세포에서 단백질의 발현을 달성하기 위해 상기-인용된 발현 요소와 조합된다.
각각의 융합된 유전자는 발현 벡터에 어셈블링되거나 삽입될 수 있다. 면역글로불린 사슬 유전자 생성물을 발현할 수 있는 수용체 세포는 그 다음 펩티드 또는 H 또는 L 사슬-코딩 유전자로 단독으로 형질감염되거나 H 및 L 사슬 유전자로 공동-형질감염된다. 형질감염된 수용체 세포는 혼입된 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 배양되고 발현된 면역글로불린 사슬 또는 온전한 항체 또는 단편은 배양물로부터 회수된다.
일 실시양태에서, 펩티드 또는 H 및 L 사슬, 또는 그의 일부를 코딩하는 융합된 유전자는 그 다음 수용체 세포를 공동형질감염시키기 위해 사용되는 별도의 발현 벡터에서 어셈블링된다. 대안적으로, H 및 L 사슬을 코딩하는 융합된 유전자는 동일한 발현 벡터 상에서 어셈블링될 수 있다. 발현 벡터의 형질감염 및 항체의 생산을 위해, 수용체 세포주는 골수종 세포일 수 있다. 골수종 세포는 형질감염된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 면역글로불린을 합성, 어셈블링 및 분비할 수 있고 면역글로불린의 글리코실화를 위한 메커니즘을 보유한다. 골수종 세포는 배양액 또는 마우스의 복강에서 성장할 수 있으며, 여기서 분비된 면역글로불린은 복수액에서 얻을 수 있다. 다른 적합한 수용체 세포는 개과 또는 비-개과 기원의 B 림프구, 개과 또는 비-개과 기원의 하이브리도마 세포, 또는 종간 이종하이브리도마 세포와 같은 림프 세포를 포함한다.
발명의 항체 작제물 또는 폴리펩티드를 담지하는 발현 벡터는 형질전환, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 인산칼슘-침전, 및 디에틸아미노에틸(DEAE) 덱스트란과 같은 폴리양이온으로 적용과 같은 생화학적 수단, 및 전기천공, 직접 미세주입 및 미세발사체 충격과 같은 기계적 수단을 포함하는 다양한 적절한 수단 중 임의의 것에 의해 적절한 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. Johnston 등, 240 Science 1538(1988).
효모는 면역글로불린 H 및 L 사슬의 생산에 대해 박테리아에 비해 실질적인 이점을 제공할 수 있다. 효모는 글리코실화를 포함한 번역-후 펩티드 변형을 수행한다. 효모에서 원하는 단백질을 생산하는 데 사용할 수 있는 강력한 프로모터 서열과 높은 카피 수 플라스미드를 활용하는 다수의 재조합 DNA 전략이 현재 존재한다. 효모는 클로닝된 포유동물 유전자 생성물의 리더 서열을 인식하고 리더 서열을 지니는 펩티드(즉, 프리-펩티드)를 분비한다. Hitzman 등, 11th Int'l Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982).
효모 유전자 발현 시스템은 펩티드, 항체, 이의 단편 및 영역의 생산, 분비 및 안정성의 수준에 대해 일상적으로 평가될 수 있다. 효모가 글루코스가 풍부한 배지에서 성장할 때 대량으로 생산되는 해당 효소를 코딩하는 활성적으로 발현된 유전자로부터 프로모터 및 종결 요소를 합체하는 일련의 효모 유전자 발현 시스템 중 임의의 것이 이용될 수 있다. 알려진 해당 유전자는 또한 매우 효율적인 전사 제어 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 유전자의 프로모터 및 터미네이터 신호가 이용될 수 있다. 다수의 접근방식이 효모에서 클로닝된 면역글로불린 cDNA의 발현을 위한 최적의 발현 플라스미드를 평가하기 위해 취해질 수 있다. Vol. II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK 1985 참조.
박테리아 균주는 또한 본 발명에 의해 기재된 항체 분자 또는 펩티드의 생산을 위한 숙주로서 이용될 수 있다. 숙주 세포와 호환되는 종에서 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 이들 박테리아 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 복제 부위뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 특정 유전자를 운반한다. 박테리아에서 클로닝된 면역글로불린 cDNA에 의해 코딩되는 항체, 단편 및 영역 또는 항체 사슬의 생성을 위한 발현 플라스미드를 평가하기 위해 다수의 접근법이 취해질 수 있다(Glover, 1985 supra; Ausubel, 1993 supra; Sambrook, 2001 supra; Colligan 등, eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, N.Y.(1994-2001); Colligan 등, eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y. (1997-2001) 참조).
숙주 포유류 세포는 시험관 내 또는 생체 내에서 성장할 수 있다. 포유동물 세포는 리더 펩티드 제거, H 및 L 사슬의 접힘 및 어셈블리, 항체 분자의 글리코실화 및 기능적 항체 단백질의 분비를 포함하는 면역글로불린 단백질 분자에 대한 번역 후 변형을 제공한다. 항체 단백질의 생산을 위한 숙주로서 유용할 수 있는 포유동물 세포는, 상술한 림프성 기원의 세포에 부가하여, Vero(ATCC CRL 81) 또는 CHO-K1(ATCC CRL 61) 세포와 같은 섬유아세포 기원의 세포를 포함한다. 포유동물 세포에서 클로닝된 펩티드 H 및 L 사슬 유전자의 발현을 위해 많은 벡터 시스템이 이용가능하다(Glover, 1985 supra 참조). 완전한 H2L2 항체를 얻기 위해 상이한 접근방식을 따를 수 있다. 동일한 세포에서 H 및 L 사슬을 공동-발현하여 완전한 사량체 H2L2 항체 및/또는 펩티드 안으로 H 및 L 사슬의 세포내 연합 및 연결을 달성하는 것이 가능하다. 공동-발현은 동일한 숙주에서 동일하거나 상이한 플라스미드를 사용함에 의해 발생할 수 있다. H 및 L 사슬 및/또는 펩티드 둘 모두에 대한 유전자를 동일한 플라스미드 안으로 배치할 수 있어, 그 다음 세포 안으로 형질감염시키고 이에 의해 두 사슬 모두를 발현하는 세포에 대해 직접적으로 선택할 수 있다. 대안적으로, 세포는 하나의 사슬, 예를 들어 L 사슬을 코딩하는 플라스미드로 먼저 형질감염되고, 이어서 생성된 세포주를 제2 선택가능 마커를 함유하는 H 사슬 플라스미드로 형질감염시킬 수 있다. 두 경로 중 하나를 통해 펩티드 및/또는 H2L2 분자를 생산하는 세포주는 어셈블링된 H2L2 항체 분자의 더 높은 생산 또는 형질감염된 세포주의 증강된 안정성과 같은 증강된 특성을 가진 세포주를 생성하기 위해 추가 선택가능한 마커와 연계하여 펩티드, H, L 또는 H 플러스 L 사슬의 추가 카피를 코딩하는 플라스미드로 형질감염될 수 있다.
재조합 항체의 장기간의 고수율 생산을 위해, 안정적인 발현이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 대신, 숙주 세포가 면역글로불린 발현 카세트 및 선택가능한 마커로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입에 이어서, 조작된 세포를 농후화된 배지에서 1-2일 동안 성장시킨 다음 선택 배지로 전환할 수 있다. 재조합 플라스미드에서 선택가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고 세포가 플라스미드를 염색체 안으로 안정적으로 합체하고 성장하여 초점을 형성하도록 허용하며 이는 차례로 클로닝되고 세포주 안으로 확장될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물/성분의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
발명의 항체가 생성되면, 그것은 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 및 사이징 컬럼 크로마토그래피 후 특정 항원에 대한 친화도), 원심분리, 차등 용해도, 또는 단백질의 정제를 위한 기타 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 많은 실시양태에서, 항체는 세포로부터 배양 배지 안으로 분비되고 배양 배지로부터 수확된다.
약제학적 및 수의학적 적용
본 발명은 또한 발명의 분자 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제, 및 활성 성분으로서 발명에 따른 항체 또는 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
"약제학적으로 허용가능한 담체"는 이용되는 투여량 및 농도에서, 노출되는 세포 또는 동물에 무독성인 임의의 부형제를 포함한다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가 치료제를 포함할 수 있다.
"약제학적으로 허용가능한"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 기타 문제 합병증 없이 동물의 조직과의 접촉에 적합한 이들 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 용매, 분산 매질, 완충액, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 습윤제, 방부제, 버거, 킬레이트제, 항산화제, 등장제 및 흡수 지연제를 포함한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 물; 식염수; 포스페이트 완충 식염수; 덱스트로스; 글리세롤; 알코올, 예컨대 에탄올 및 이소프로판올; 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산; 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 예컨대 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA; 나트륨 등의 염 형성 반대이온; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 플루로닉스(PLURONICS); 등장제, 예컨대 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨 및 소르비톨, 및 염화나트륨; 및 이들의 조합물을 포함한다.
발명의 약제학적 조성물은, 예를 들어 액체, 반-고체, 또는 고체 투여 형태, 예컨대 액체 용액(예를 들어, 주사가능한 및 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 리포솜, 좌약, 정제, 알약 또는 분말을 포함하는 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 주사가능한 또는 주입가능한 용액의 형태이다.
조성물은 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 비경구, 경점막, 경구, 국소 또는 경피 투여에 적합한 형태일 수 있다. 조성물은 즉시, 제어, 연장 또는 지연 방출 조성물로 제형화될 수 있다.
발명의 조성물은 개별 치료제로서 또는 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 투여될 수 있지만 일반적으로 선택된 투여 경로 및 표준 약제학적 관행에 기초하여 선택된 약제학적 담체와 함께 투여된다. 본원에 개시된 항체의 투여는 비경구 주사(예컨대 복강내, 피하 또는 근육내 주사), 경구, 또는 기도 표면으로의 항체의 국소 투여(전형적으로는 약제학적 제형으로 수행됨)에 의한 것을 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 기도 표면에 대한 국소 투여는 비강내 투여(예를 들어, 점적기, 면봉 또는 흡입기의 사용)에 의해 수행될 수 있다. 기도 표면에 대한 항체의 국소 투여는 또한 에어로졸 현탁액으로서 항체를 함유하는 약제학적 제형의 호흡가능한 입자(고체 및 액체 입자 둘 모두 포함)를 생성한 다음 대상체가 호흡가능한 입자를 흡입하게 함에 의한 것과 같이, 흡입 투여에 의해 수행될 수 있다. 약제학적 제형의 호흡가능한 입자를 투여하기 위한 방법 및 장치는 잘 알려져 있고, 임의의 통상적인 기술이 이용될 수 있다.
일부 원하는 실시양태에서, 항체는 비경구 주사에 의해 투여된다. 비경구 투여를 위해, 항체 또는 분자는 약제학적으로 허용가능한 비경구 비히클과 연계하여 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 비히클은 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 트레할로스 또는 수크로스 용액, 또는 5% 혈청 알부민, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 등과 같은 수성 담체와 같은 허용가능한 담체에 용해된 항체 또는 이의 칵테일의 용액일 수 있다. 예컨대 고정유와 같은 비수성 비히클 및 리포솜 또한 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들 조성물은 통상적이고 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등과 같은 생리학적 조건을 근사화하는 데 필요한 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제형에서 항체의 농도는, 예를 들어 중량으로 약 0.5% 미만, 일반적으로 약 1% 이상 내지 15% 또는 20% 정도로 광범위하게 변할 수 있고 주로 선택된 특정 투여 양식에 따라 유체 부피, 점도 등에 기초하여 선택될 것이다. 비히클 또는 동결건조된 분말은 등장성(예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성(예를 들어, 완충제 및 방부제)을 유지하는 첨가제를 함유할 수 있다. 제형은 일반적으로 사용되는 기술로 멸균된다. 비경구로 투여가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 당업자에게 알려져 있거나 자명할 것이고, 예를 들어, REMINGTON'S PHARMA. SCI. (15th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980)에 더 상세히 기재되어 있다.
발명의 항체 또는 분자는 저장을 위해 동결건조될 수 있고 사용 이전에 적합한 담체에서 재구성될 수 있다. 이 기술은 종래의 면역 글로불린에서 효과적인 것으로 나타났다. 임의의 적합한 동결건조 및 재구성 기술이 이용될 수 있다. 동결건조 및 재구성은 다양한 정도의 항체 활성 손실을 초래할 수 있고 사용 수준은 이를 보상하기 위해 조정되어야 할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 본 항체 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 재발의 예방 및/또는 기존 질환에 대한 치료적 처리를 위해 투여될 수 있다. 적절한 약제학적 담체는 이 기술 분야에서 표준 참조 텍스트인 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES의 최신판에 기술되어 있다. 치료적 적용에서, 조성물은 질환 및 이의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지 또는 완화시키기에 충분한 양으로 이미 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여된다.
본원에 기재된 바와 같은 병태 또는 질환의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은, 예를 들어, 특정 제제의 약력학적 특성, 및 그의 투여 방식과 경로; 대상 부위; 동물의 생리적 상태; 투여된 다른 약물; 치료가 예방적인지 치료적인지 여부; 수령체의 나이, 건강 및 체중; 동시치료의 증상 종류의 성질과 정도, 치료의 빈도, 및 원하는 효과를 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 상이한 인자에 따라 달라진다.
조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료 수의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 어떤 경우든, 약제학적 제형은 대상체를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 항체(들)를 제공해야 한다.
치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 당업자에게 공지된 일상적인 방법을 사용하여 적정될 수 있다.
발명의 약제학적 조성물은 "치료적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 분자의 치료적 유효량은 질환 상태, 연령, 성별, 및 개체의 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 분자의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 또한 치료적 유효량은 분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유익한 효과에 의해 압도당하는 양이다.
다른 양태에서, 발명의 조성물은, 예를 들어 개에서 다양한 질환 및 장애의 치료에 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 것과 같이, 용어 "치료하다" 및 "치료"는 예방적 또는 방지적 조치를 포함하는 치료적 치료를 지칭하되, 목적은 질환 또는 상태와 연관된 바람직하지 않은 생리학적 변화를 예방하거나 늦추는(경감하는) 것이다. 유익하거나 원하는 임상 결과는 증상의 완화, 질환 또는 병태의 정도 감소, 질환 또는 병태의 안정화(즉, 질환 또는 병태가 악화되지 않는 경우), 질환 또는 병태의 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 또는 병태의 개선 또는 완화, 검출 가능 여부에 관계없이 질환 또는 병태의 (부분적이든 전체적이든) 완화를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 치료를 필요로 하는 이들은 질환 또는 병태를 이미 갖고 있는 이들 뿐만 아니라 질환 또는 병태에 걸리기 쉬운 이들 또는 질환 또는 병태가 예방되어야 하는 이들을 포함한다.
본원에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌들은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
다음 실시예는 이전 개시내용을 보완하고 본원에 기술된 주제에 대한 더 나은 이해를 제공하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 기술된 주제를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본원에 기술된 실시예 및 실시양태는 단지 예시를 위한 것이다는 것과, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 명백할 것이고 발명의 진정한 범주 내에 포함되어야 하고, 이를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1
개과 IgG Fc 돌연변이체의 구축
모든 개과 IgG의 구축 (도 1)은 Bergeron 등 (Bergeron 등, 2014, Vet Immunol Immunopathol. vol. 157(1-2), 페이지 31-41)에 의해 기술된 바와 같이 수행되었으며, 여기서 IgGB (65) 서브클래스에 대한 개과 불변 영역을 코딩하는 서열을 함유하는 플라스미드가 사용되고, 본원에서 조사된 각 mAb에 대한 VH/VL 서열을 불변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드와 함께 상류 및 프레임으로 삽입하였다. 돌연변이는 유전자 단편으로서 불변 영역의 직접 DNA 합성에 의해 각각의 플라스미드의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인(도 2)의 각각의 각각의 각각의 위치에 혼입되었고, 후속적으로 각각의 관심 가변 영역 내로 서브클로닝되었다.
발현 및 정제
모노클로날 항체 (mAbs) 돌연변이체를 Thermo Fisher로부터 수득한 포유동물 현탁 세포 시스템인 EXPICHO-S (Chinese Hamster Ovary) 세포에서 발현시켰다. EXPICHO-S 세포 현탁액을 0.14 내지 8.0x10e6 cell/ml로 EXPICHO 발현 배지(Gibco)에 유지시켰다. 세포를 ExpiCHO 프로토콜 사용자 매뉴얼에 따라 Day -1 및 형질감염일에 희석시켰다. 희석된 세포를 Max Titer 조건에 따라 ExpiFectamine CHO 형질감염 키트 (Gibco)로부터 공급받은 시약을 사용하여 프로토콜에 기재된 바와 같이 형질감염시켰다. 12-14일의 인큐베이션 후에, 배양물을 수확하고 정제하였다. 항체를 PBS로 예비-평형화시킨 MabSelect Sure LX (GE Healthcare) 상에서 단백질 A 크로마토그래피로부터 정제하였다. 샘플 로딩 후, 수지를 PBS로 세척하고 이어서 20 mM 아세트산나트륨, pH 3.5로 컬럼으로부터 샘플을 용리시켰다. 용리 후, 풀(pool)을 제조하고 1 M 아세트산나트륨을 4%로 첨가하여 중화시켰다. 이용가능한 부피 및 의도된 용도에 따라, 샘플을 때때로 최종 완충액 (예를 들어, PBS, 기타)으로 교환하였다. 농도는 280 nm에서 흡광도로 측정하였다(도 3).
SDS-PAGE
비-환원된 (nr) 및 환원된 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 전기영동 (SDS-PAGE)은 MES-SDS 러닝 버퍼 내의 모두 인비트로젠으로부터 입수된 4-12 % Bis-Tris NuPAGE gels 및 SeeBlue Plus 2 standards을 사용하여 수행하였다. 환원되지 않은 샘플의 경우, 1 mM의 알킬화제 N-에틸말레이미드(NEM)를 첨가하고, 환원된 샘플의 경우 환원제 디티오트레이톨(DTT)을 첨가하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 단백질 밴드를 검출하였다.
분석 SEC
분석 SEC는 0.25 ml/min으로 200 mM NaPhosphate pH 7.2 실행 완충액에서 TOSOH BioScience로부터의 TSK gel Super SW3000, 4.6 mm, 10x30 cm, 4 μm 컬럼을 사용하여 수행하였다.
NR-CGE
비-환원된 모세관 겔 전기영동(nrCGE)은 제조자의 지시에 따라 A55625 모세관 카트리지를 사용하는 Beckman Coulter PA800 plus 분석기를 사용하여 수행하였다.
SMAC
스탠드업 단층 흡수 크로마토그래피(SMAC)는 0.35 ml/min으로 200 mM Na 포스페이트 pH 7.2 실행 완충액에서 Sepax Zenix SEC-300, 4.6X300 mm 컬럼을 사용하여 수행하였다.
HIC
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 Sepax Proteomix HIC Butyl-NP5, 4.6x100 mm 컬럼을 사용하여 수행되었다. 0.1 M Na 포스페이트 pH 6.5 중 100 % 1.8 M 황산암모늄 내지 100 % 0.1 M Na 포스페이트 pH 6.5의 선형 구배를 0.75 ml/min으로 20분 동안 적용하였다.
Octet-BLI
이 분석은 아민 반응성 2세대 바이오센서들과 함께 Forte Bio's Octet QKe를 사용하여 수행되었다. 샘플은 칼슘 및 마그네슘 없이 1x Gibco PBS로 교환되고 0.5 mg/mL의 농도로 희석된다. 바이오센서의 기준선 설정 후, 바이오센서를 시료 100 μL에 600초 동안 침지시켰다.
Octet QKe 정량화 (Pall ForteBio Corp, Menlo Park, CA, USA)를 통해 단백질 A 또는 단백질 G 센서에 대한 결합에 대해 항체를 스크리닝하였다. 단백질 A에 결합된 작제물은 단백질 품질을 위해 Bergeron 등에 기재된 바와 같이 정제되고 정량되었다.
실시예 2
FcRn 결합 검정
상기 논의된 Bergeron 등에 따라 개과 FcRn을 단리하였고, 제조하였고 돌연변이체 Fc IgGs를 개과 FcRn에 대해 검정하였다. 표준 PCR을 사용하여 개과 FcRn-α 서브유닛 및 β-마이크로글로불린을 증폭시켰다. FcRn-α 서브유닛 및 β-마이크로글로불린을 HEK 293 세포 내로 공동-형질감염시키고, FcRn 복합체를 c-말단 His 태그를 통해 IMAC 친화성 정제에 의해 정제하였다. FcRn 복합체는 BirA 효소적 비오티닐화 반응을 통해 비오틴으로 표지되었다. KD는 SA 센서 칩을 사용하여 Biacore 3000 또는 Biacore T200(GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)에 의해 측정되었다.
FcRn은 변형된 SA 캡처 방법을 이용하여 센서의 표면에 캡처하였다. 10 mM MES; 150 mM NaCl; 0.005 % Tween 20; 0.5 mg/mL BSA; pH 6을 캡처, 방법 실행 완충액 및 적정으로 사용하였다. 1x HBS-P, 0.5 mg/mL BSA; pH 7.4도 또한 방법 실행 완충액 및 적정에 사용되었다. Fc 돌연변이체 IgG를 수용체 표면 위로 흘려보내고, 친화도를 Scrubber2 소프트웨어 분석 (BioLogic Software Pty, Ltd., Campbell, Australia) 또는 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 측정하였다 (표 1). 완충액만 포함하는 빈 실행은 모든 실행에서 제외되었다. 유동 세포를 50 mM 트리스 pH 8을 사용하여 재생시켰다. 실행은 15 ℃에서 수행되었다.
각각의 위치에서 만들어진 돌연변이는 pH 6에서 FcRn에 대한 IgG의 친화도에 현저한 효과를 갖는다. IgG에 대한 FcRn 친화도의 증가는 VHVL 도메인에 의존하지 않으며, 임의의 개과 IgG에 대해 보편적이다.
야생형(WT) 및 돌연변이체 IgGs와 개과 FcRn의 결합은 표면 플라스몬 공명(Biacore)에 의해 측정되었다. 생물물리학적 특성화 또한 수행되었다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 생물물리학적 특성화 데이터는 복수의 돌연변이가 특히 다중반응성에 대해 개선된 생물물리학적 특성을 나타냄을 보여준다.
표 1. FcRn 결합 친화도에 대한 돌연변이체의 효과.
이 결과는 다양한 위치에서 이루어진 돌연변이가 FcRn에 대한 IgG의 친화도에 현저한 효과를 갖는다는 것을 명확하게 보여준다.
실시예 3
개에서 Fc 돌연변이체 IgG PK 연구
다양한 개과 IgG 점 돌연변이의 반감기 연장 효과를 나타내기 위해 약동학(PK) 연구를 수행하였다: (1) L252F; (2) L252R, N434H, Q311W; (3) L252R; (4) L252Y, N434Y, Q311W; (5) Q311W; (6) L252R, A254T, T256E, N434H; (7) 252Y, A254T 및 (8) L252M, A254S, E439K.
표 5에 열거된 8개의 Fc 변형된 개과화 모노클로날 항체와 야생형 개과화 모노클로날 항체를 실험에 사용하였다. 8개의 Fc 변형된 개과화 모노클로날 항체를 단일 1 mg/kg 피하로 ~4세 비글개 (n=2)에 투여하였다. 리간드 결합 방법을 이용하여 이들 분자의 혈청 농도를 분석하였다.
8 개의 Fc 변형된 개과 모노클로날 항체의 약동학적 특성을 Watson™의 도움으로 비분열 접근법(AUC 계산을 위한 선형 사다리꼴 규칙)을 사용하여 개들에서 평가하였다. 약물을 2차 및 3차 주사한 후 농도-시간 프로파일의 중첩에 대한 AUC의 보정을 포함하는 추가 계산을 Excel™으로 수행하였다. Excel™ 또는 Watson™을 이용하여 간단한 통계(평균, 표준편차, 변동계수)를 가진 집중시간 자료와 약동학 자료의 요약을 계산하였다. 다른 통계 분석은 실시하지 않았다.
그 결과를 하기 표 5에 정리하였다.
상기 결과는 Fc 영역의 특정 변형이 상기 표에 나타낸 바와 같이 반감기에 상당한 영향을 미친다는 것을 입증한다. 구체적으로, 개과 IgG 점 돌연변이 (1) L252F; (2) L252R, N434H, Q311W; (3) L252R; (5) Q311W; (6) L252R, A254T, T256E, N434H; (7) L252Y, A254T; 및 (8) L252M, A254S, E439K 들이 야생형에 비해 반감기를 향상시키는데 효과적이다.
야생형 mAb ZTS-8183의 반감기 (T1/2)는 ~ 11일이었다. 그러나, Fc 변형된 개과 모노클로날 항체, ZTS-00530712, ZTS-00530713, ZTS-00530714, ZTS-00530716, ZTS-00530717, ZTS-00530718 및 ZTS-00530719의 반감기(T1/2)는 각각 23.0, 4.23, 13.9, 22.2, 31.4, 27.8 및 25.3이었다.
상기 표 5 및 도 4에 나타낸 바와 같이, Fc 변형된 개과 모노클로날 항체인 ZTS-00530715 (즉, 돌연변이 L252Y, N434Y, 및 Q311W의 조합)의 반감기 (T1/2)는 효과적이지 않다.
요컨대, 이 결과는 개과 IgG 점 돌연변이 (1) L252F; (2) L252R, N434H, Q311W; (3) L252R; (5) Q311W; (6) L252R, A254T, T256E, N434H; (7) L252Y, A254T; 및 (8) L252M, A254S, E439K 들이 개과의 반감기를 향상시키는데 매우 효과적이라는 것을 명백하게 보여준다.
본 발명의 바람직한 실시양태를 설명하였는데, 본 발명은 정확한 실시양태들에 한정되지 않으며, 첨부된 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 또는 취지를 벗어나지 않고, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Zoetis Services LLC <120> MUTATIONS IN CANINE ANTIBODY CONSTANT REGIONS <130> ZP000372A <140> PCT/US2022/014146 <141> 2022-01-27 <140> US 63/142,774 <141> 2021-01-28 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 331 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> MISC_FEATURE <223> The Wildtype Canine IgGA Constant Region <400> 1 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu His Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Val His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Phe Asn Glu Cys Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val 100 105 110 Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro 115 120 125 Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 130 135 140 Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val 145 150 155 160 Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln 165 170 175 Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln 180 185 190 Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp 195 200 205 Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala 210 215 220 His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser 225 230 235 240 Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro 245 250 255 Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu 260 265 270 Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr 275 280 285 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 290 295 300 Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr 305 310 315 320 Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> MISC_FEATURE <223> The Wildtype Canine IgGB Constant Region <400> 2 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln 145 150 155 160 Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys 195 200 205 Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser 225 230 235 240 Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys 245 250 255 Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln 260 265 270 Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu 275 280 285 Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300 Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320 His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 335 <210> 3 <211> 333 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> MISC_FEATURE <223> The Wildtype Canine IgGC Constant Region <400> 3 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Gln Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Ile Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Val Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Ala Lys Glu Cys Glu Cys Lys Cys Asn Cys Asn Asn Cys Pro 100 105 110 Cys Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 115 120 125 Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr 130 135 140 Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser 145 150 155 160 Trp Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg 165 170 175 Glu Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 180 185 190 Gly His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn 195 200 205 Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro 210 215 220 Gly Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240 Glu Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe 245 250 255 Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu 260 265 270 Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly 275 280 285 Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 290 295 300 Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn 305 310 315 320 His Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 4 <211> 331 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> MISC_FEATURE <223> The Wildtype Canine IgGD Constant Region <400> 4 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Thr Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Val His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Pro Lys Glu Ser Thr Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val 100 105 110 Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro 115 120 125 Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val 130 135 140 Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val 145 150 155 160 Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln 165 170 175 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln 180 185 190 Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly 195 200 205 Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala 210 215 220 His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser 225 230 235 240 Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro 245 250 255 Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu 260 265 270 Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr 275 280 285 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 290 295 300 Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr 305 310 315 320 Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 5 <211> 1005 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> misc_feature <223> The Wildtype Canine IgGB constant domain - codon optimized. <400> 5 gccagcacca cagctccctc cgtgttcccc ctggctccta gctgcggctc tacctccggc 60 agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtcc ggctacttcc ctgagccagt gaccgtgagc 120 tggaactccg gctccctgac ctccggagtg cacacatttc caagcgtgct gcagtcttcc 180 ggcctgtatt ctctgagctc tatggtgacc gtgccttcca gcaggtggcc atctgagaca 240 ttcacctgca acgtggccca tcccgcttcc aagacaaagg tggacaagcc cgtgcctaag 300 agggagaatg gaagggtgcc ccggccccct gattgcccta agtgtccagc tccagagatg 360 ctgggaggac catccgtgtt catctttcca cccaagccca aggataccct gctgatcgct 420 agaacccctg aggtgacatg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaggtgcag 480 atctcttggt tcgtggatgg caagcagatg cagaccgcca agacacagcc tagggaggag 540 cagtttaacg gcacctacag ggtggtgtcc gtgctgccaa tcggccacca ggactggctg 600 aagggcaagc agtttacctg caaggtgaac aataaggctc tgccttctcc aatcgagaga 660 acaatctcca aggccagggg ccaggctcat cagcctagcg tgtacgtgct gcctccatcc 720 agagaggagc tgagcaagaa caccgtgtct ctgacatgtc tgatcaagga tttctttccc 780 cctgacatcg atgtggagtg gcagagcaat ggccagcagg agccagagtc taagtatcgc 840 accacaccac cccagctgga cgaggatggc agctacttcc tgtatagcaa gctgtctgtg 900 gacaagtcta gatggcagcg cggcgatacc tttatctgtg ccgtgatgca cgaggcactg 960 cacaatcact acacccagga gagtctgagc cacagcccag gaaaa 1005 <210> 6 <211> 1005 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> misc_feature <223> The wildtype canine IgGB constant domain <400> 6 gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60 agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120 tggaacagcg gctctctgac ctccggggtg cacacatttc catctgtgct gcagtctagt 180 ggcctgtact ccctgtcaag catggtgact gtgccttcct ctaggtggcc atcagaaact 240 ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc cgtgcctaaa 300 agggagaatg gaagggtgcc aagaccacct gattgcccta agtgtccagc tccagaaatg 360 ctgggaggac caagcgtgtt catctttcca cccaagccca aagacacact gctgattgct 420 agaactcccg aggtgacctg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaagtgcag 480 atctcctggt tcgtggatgg gaagcagatg cagacagcca aaactcagcc tcgggaggaa 540 cagtttaacg gaacctatag agtggtgtct gtgctgccaa ttggacacca ggactggctg 600 aagggcaaac agtttacatg caaggtgaac aacaaggccc tgcctagtcc aatcgagagg 660 actatttcaa aagctagggg acaggctcat cagccttccg tgtatgtgct gcctccatcc 720 cgggaggaac tgtctaagaa cacagtgagt ctgacttgtc tgatcaaaga tttctttccc 780 cctgacattg atgtggagtg gcagagcaat gggcagcagg agccagaatc caagtacaga 840 accacaccac cccagctgga cgaagatggc tcctatttcc tgtacagtaa gctgtcagtg 900 gacaaatcta ggtggcagcg cggggatacc tttatctgcg ccgtgatgca cgaggctctg 960 cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005 <210> 7 <211> 98 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> MISC_FEATURE <223> The wildtype canine IgGB CH1 Domain <400> 7 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> MISC_FEATURE <223> The wildtype canine IgGB Hinge Domain <400> 8 Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro <210> 9 <211> 110 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> MISC_FEATURE <223> The wildtype canine IgGB CH2 Domain <400> 9 Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe 35 40 45 Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg 100 105 110 <210> 10 <211> 109 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> MISC_FEATURE <223> The wildtype canine IgGB CH3 Domain <400> 10 Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe 20 25 30 Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu 35 40 45 Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly 50 55 60 Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 65 70 75 80 Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn 85 90 95 His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 11 <211> 294 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> misc_feature <223> The wildtype canine IgGB CH1 Domain <400> 11 gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60 agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120 tggaacagcg gctctctgac ctccggggtg cacacatttc catctgtgct gcagtctagt 180 ggcctgtact ccctgtcaag catggtgact gtgccttcct ctaggtggcc atcagaaact 240 ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc cgtg 294 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> misc_feature <223> The wildtype canine IgGB Hinge Domain <400> 12 cctaaaaggg agaatggaag ggtgccaaga ccacctgatt gccctaagtg tcca 54 <210> 13 <211> 330 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> misc_feature <223> The wildtype canine IgGB CH2 Domain <400> 13 gctccagaaa tgctgggagg accaagcgtg ttcatctttc cacccaagcc caaagacaca 60 ctgctgattg ctagaactcc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacctgga tccagaggac 120 cccgaagtgc agatctcctg gttcgtggat gggaagcaga tgcagacagc caaaactcag 180 cctcgggagg aacagtttaa cggaacctat agagtggtgt ctgtgctgcc aattggacac 240 caggactggc tgaagggcaa acagtttaca tgcaaggtga acaacaaggc cctgcctagt 300 ccaatcgaga ggactatttc aaaagctagg 330 <210> 14 <211> 327 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> misc_feature <223> The wildtype canine IgGB CH3 Domain <400> 14 ggacaggctc atcagccttc cgtgtatgtg ctgcctccat cccgggagga actgtctaag 60 aacacagtga gtctgacttg tctgatcaaa gatttctttc cccctgacat tgatgtggag 120 tggcagagca atgggcagca ggagccagaa tccaagtaca gaaccacacc accccagctg 180 gacgaagatg gctcctattt cctgtacagt aagctgtcag tggacaaatc taggtggcag 240 cgcggggata cctttatctg cgccgtgatg cacgaggctc tgcacaatca ttacacacaa 300 gaaagtctgt cacatagccc cggcaag 327 <210> 15 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> The Wildtype Human IgG1 Constant Region <400> 15 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 16 <211> 993 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> misc_feature <223> The Wildtype Canine IgGA Constant Region <400> 16 gcctccacca cggcgccctc ggttttccca ctggccccca gctgcgggtc cacttccggc 60 tccacggtgg ccctggcctg cctggtgtca ggctacttcc ccgagcctgt aactgtgtcc 120 tggaactccg gctccttgac cagcggtgtg cacaccttcc cgtccgtcct gcagtcctca 180 gggcttcact ccctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggcc cagcgagacc 240 ttcacctgca acgtggtcca cccagccagc aacactaaag tagacaagcc agtgttcaat 300 gaatgcagat gcactgatac acccccatgc ccagtccctg aacctctggg agggccttcg 360 gtcctcatct ttcccccgaa acccaaggac atcctcagga ttacccgaac acccgaggtc 420 acctgtgtgg tgttagatct gggccgtgag gaccctgagg tgcagatcag ctggttcgtg 480 gatggtaagg aggtgcacac agccaagacc cagtctcgtg agcagcagtt caacggcacc 540 taccgtgtgg tcagcgtcct ccccattgag caccaggact ggctcacagg gaaggagttc 600 aagtgcagag tcaaccacat agacctcccg tctcccatcg agaggaccat ctctaaggcc 660 agagggaggg cccataagcc cagtgtgtat gtcctgccgc catccccaaa ggagttgtca 720 tccagtgaca cagtcagcat cacctgcctg ataaaagact tctacccacc tgacattgat 780 gtggagtggc agagcaatgg acagcaggag cccgagagga agcaccgcat gaccccgccc 840 cagctggacg aggacgggtc ctacttcctg tacagcaagc tctctgtgga caagagccgc 900 tggcagcagg gagacccctt cacatgtgcg gtgatgcatg aaactctaca gaaccactac 960 acagatctat ccctctccca ttctccgggt aaa 993 <210> 17 <211> 999 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> misc_feature <223> The Wildtype Canine IgGC Constant Region <400> 17 gcctccacca cggcgccctc ggttttccca ctggccccca gctgtgggtc ccaatccggc 60 tccacggtgg ccctggcctg cctggtgtca ggctacatcc ccgagcctgt aactgtgtcc 120 tggaactccg tctccttgac cagcggtgtg cacaccttcc cgtccgtcct gcagtcctca 180 gggctctact ccctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggcc cagcgagacc 240 ttcacctgca atgtggccca cccggccacc aacactaaag tagacaagcc agtggccaaa 300 gaatgcgagt gcaagtgtaa ctgtaacaac tgcccatgcc caggttgtgg cctgctggga 360 gggccttcgg tcttcatctt tcccccaaaa cccaaggaca tcctcgtgac tgcccggaca 420 cccacagtca cttgtgtggt ggtggatctg gacccagaaa accctgaggt gcagatcagc 480 tggttcgtgg atagtaagca ggtgcaaaca gccaacacgc agcctcgtga ggagcagtcc 540 aatggcacct accgtgtggt cagtgtcctc cccattgggc accaggactg gctttcaggg 600 aagcagttca agtgcaaagt caacaacaaa gccctcccat cccccattga ggagatcatc 660 tccaagaccc cagggcaggc ccatcagcct aatgtgtatg tcctgccgcc atcgcgggat 720 gagatgagca agaatacggt caccctgacc tgtctggtca aagacttctt cccacctgag 780 attgatgtgg agtggcagag caatggacag caggagcctg agagcaagta ccgcatgacc 840 ccgccccagc tggatgaaga tgggtcctac ttcctataca gcaagctctc cgtggacaag 900 agccgctggc agcggggaga caccttcata tgtgcggtga tgcatgaagc tctacacaac 960 cactacacac agatatccct ctcccattct ccgggtaaa 999 <210> 18 <211> 993 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> misc_feature <223> The Wildtype Canine IgGD Constant Region <400> 18 gcctccacca cggcgccctc ggttttccca ctggccccca gctgcgggtc cacttccggc 60 tccacggtgg ccctggcctg cctggtgtca ggctacttcc ccgagcctgt aactgtgtcc 120 tggaactccg gctccttgac cagcggtgtg cacaccttcc cgtccgtcct gcagtcctca 180 gggctctact ccctcagcag cacggtgaca gtgccctcca gcaggtggcc cagcgagacc 240 ttcacctgca acgtggtcca cccggccagc aacactaaag tagacaagcc agtgcccaaa 300 gagtccacct gcaagtgtat atccccatgc ccagtccctg aatcactggg agggccttcg 360 gtcttcatct ttcccccgaa acccaaggac atcctcagga ttacccgaac acccgagatc 420 acctgtgtgg tgttagatct gggccgtgag gaccctgagg tgcagatcag ctggttcgtg 480 gatggtaagg aggtgcacac agccaagacg cagcctcgtg agcagcagtt caacagcacc 540 taccgtgtgg tcagcgtcct ccccattgag caccaggact ggctcaccgg aaaggagttc 600 aagtgcagag tcaaccacat aggcctcccg tcccccatcg agaggactat ctccaaagcc 660 agagggcaag cccatcagcc cagtgtgtat gtcctgccac catccccaaa ggagttgtca 720 tccagtgaca cggtcaccct gacctgcctg atcaaagact tcttcccacc tgagattgat 780 gtggagtggc agagcaatgg acagccggag cccgagagca agtaccacac gactgcgccc 840 cagctggacg aggacgggtc ctacttcctg tacagcaagc tctctgtgga caagagccgc 900 tggcagcagg gagacacctt cacatgtgcg gtgatgcatg aagctctaca gaaccactac 960 acagatctat ccctctccca ttctccgggt aaa 993 <210> 19 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> The Wildtype Human IgG1 Constant Region <400> 19 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Heavy Chain CDR1 <400> 20 aactacggca tgagc 15 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Heavy Chain CDR1 <400> 21 Asn Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Heavy Chain CDR2 <400> 22 accatcagct acggcggcag ctacacctac taccccgaca acatcaaggg c 51 <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Heavy Chain CDR2 <400> 23 Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile Lys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Heavy Chain CDR3 <400> 24 gtgcggggct acggctacga cacaatggac tac 33 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Heavy Chain CDR3 <400> 25 Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Light Chain CDR1 <400> 26 aaggccagcc agagcgtgtc cttcgccggc acaggcctga tgcac 45 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Light Chain CDR1 <400> 27 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Gly Leu Met His 1 5 10 15 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Light Chain CDR2 <400> 28 cgggccagca acctggaagc c 21 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Light Chain CDR2 <400> 29 Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala 1 5 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Light Chain CDR3 <400> 30 cagcagagca gagagtaccc ctggacc 27 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Light Chain CDR3 <400> 31 Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 32 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZTS-8183 - Variable Light Nucleic Acid Sequence - Caninized <400> 32 gagatcgtga tgacccagag ccccgccagc ctgagcctga gccaggaaga gaaagtcacc 60 atcacatgca aggccagcca gagcgtgtcc ttcgccggca caggcctgat gcactggtat 120 cagcagaagc ccggccaggc ccccaagctg ctgatctacc gggccagcaa cctggaagcc 180 ggcgtgccaa gcagattcag cggcagcggc tccggcaccg acttcagctt caccatcagc 240 agcctcgaac ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccagc agagcagaga gtacccctgg 300 accttcggcc agggtaccaa gctggaaatc aagcggaacg acgcccagcc cgccgtgtac 360 ctgttccagc ccagccccga tcagctgcac accggcagcg cttcagtcgt ctgcctgctg 420 aacagcttct accccaagga catcaacgtg aagtggaagg tggacggcgt gatccaggac 480 accggcatcc aggaaagcgt caccgagcag gacaaggaca gcacctacag cctgagcagc 540 accctgacca tgtccagcac cgagtacctg agccacgagc tgtatagctg cgagatcacc 600 cacaagagcc tgcctagcac cctgatcaag agcttccagc ggagcgagtg ctagtag 657 <210> 33 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZTS-8183 - Variable Light Amino Acid Sequence - Caninized <400> 33 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala 20 25 30 Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp Gln 115 120 125 Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe Tyr 130 135 140 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln Asp 145 150 155 160 Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser His 180 185 190 Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr Leu 195 200 205 Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys 210 215 <210> 34 <211> 1365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZTS-8183 - Variable Heavy Nucleic Acid Sequence - Caninized <400> 34 gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgtgtgg ccagcggctt caccttcagc aactacggca tgagctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gactgcagtg ggtggccacc atcagctacg gcggcagcta cacctactac 180 cccgacaaca tcaagggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccatgt actactgcgt gcggggctac 300 ggctacgaca caatggacta ctggggccag ggcaccctcg tgaccgtctc gagcgcctca 360 acaactgctc ctagcgtgtt tcccctggcc cctagctgcg gaagtacctc aggcagcaca 420 gtggccctgg cttgtctggt gtctggatat ttccctgagc cagtgaccgt gagttggaac 480 agcggctctc tgacctccgg ggtgcacaca tttccatctg tgctgcagtc tagtggcctg 540 tactccctgt caagcatggt gactgtgcct tcctctaggt ggccatcaga aactttcacc 600 tgcaacgtgg cccatcccgc cagcaagacc aaagtggaca agcccgtgcc taaaagggag 660 aatggaaggg tgccaagacc acctgattgc cctaagtgtc cagctccaga aatgctggga 720 ggaccaagcg tgttcatctt tccacccaag cccaaagaca cactgctgat tgctagaact 780 cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacctg gatccagagg accccgaagt gcagatctcc 840 tggttcgtgg atgggaagca gatgcagaca gccaaaactc agcctcggga ggaacagttt 900 aacggaacct atagagtggt gtctgtgctg ccaattggac accaggactg gctgaagggc 960 aaacagttta catgcaaggt gaacaacaag gccctgccta gtccaatcga gaggactatt 1020 tcaaaagcta ggggacaggc tcatcagcct tccgtgtatg tgctgcctcc atcccgggag 1080 gaactgtcta agaacacagt gagtctgact tgtctgatca aagatttctt tccccctgac 1140 attgatgtgg agtggcagag caatgggcag caggagccag aatccaagta cagaaccaca 1200 ccaccccagc tggacgaaga tggctcctat ttcctgtaca gtaagctgtc agtggacaaa 1260 tctaggtggc agcgcgggga tacctttatc tgcgccgtga tgcacgaggc tctgcaccat 1320 cattacacac aagaaagtct gtcacatagc cccggcaagt agtag 1365 <210> 35 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZTS-8183 - Variable Heavy Amino Acid Sequence - Caninized <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala 130 135 140 Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Lys Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val 210 215 220 Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu 245 250 255 Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met 275 280 285 Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly 305 310 315 320 Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile 325 330 335 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val 340 345 350 Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu 370 375 380 Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His His His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser 435 440 445 His Ser Pro Gly Lys 450

Claims (72)

  1. 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 변형된 IgG로서, 상기 치환은 카바트에서와 같은 Eu 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 247, 252, 254, 256, 311, 312, 314, 431, 434 또는 439에 있는, 변형된 IgG.
  2. 제1항에 있어서, 상기 불변 도메인은 P247V, L252Y, L252P, L252W, L252A, L252D, L252G, L252H, L252I, L252K, L252M, L252N, L252Q, L252S, L252T, L252V, L252F, L252R, A254F, A254G, A254H, A254N, A254Q, A254R, A254W, A254C, A254D, A254I, A254K, A254L, A254M, A254P, A254S, A254T, A254V, A254Y, T256H, T256I, T256K, T256L, T256Q, T256Y, T256A, T256C, T256D, T256F, T256G, T256M, T256N, T256P, T256R, T256S, T256V, T256W, T256E, Q311H, Q311R, Q311Y, Q311W, D312P, L314K, A431K, N434A, N434C, N434D, N434E, N434F, N434G, N434H, N434I, N434K, N434L, N434M, N434P, N434Q, N434R, N434S, N434T, N434V, N434W, N434Y 및 E439K 중 하나 이상의 치환을 포함하는, 변형된 IgG.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변형된 IgG는 야생형 개과 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG보다 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 갖는, 변형된 IgG.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변형된 IgG는 개과 또는 개과화 IgG인, 변형된 IgG.
  5. 제1항에 있어서, 상기 IgG는 IgGA, IgGB, IgGC 또는 IgGD인, 변형된 IgG.
  6. 제1항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 IgGA, IgGB, IgGC 또는 IgGD의 불변 도메인인, 변형된 IgG.
  7. 제1항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 CH3 도메인을 갖는 Fc 불변 영역을 포함하는, 변형된 IgG.
  8. 제1항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 Fc 불변 영역을 포함하는, 변형된 IgG.
  9. 제1항에 있어서, 상기 야생형 개과 IgG 불변 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 IgG.
  10. 제1항의 변형된 IgG 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 용기 내에 제1항의 변형된 IgG 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  12. 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 치환은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 247, 252, 254, 256, 311, 312, 314, 431, 434 또는 439에 있는, 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 불변 도메인은 P247V, L252Y, L252P, L252W, L252A, L252D, L252G, L252H, L252I, L252K, L252M, L252N, L252Q, L252S, L252T, L252V, L252F, L252R, A254F, A254G, A254H, A254N, A254Q, A254R, A254W, A254C, A254D, A254I, A254K, A254L, A254M, A254P, A254S, A254T, A254V, A254Y, T256H, T256I, T256K, T256L, T256Q, T256Y, T256A, T256C, T256D, T256F, T256G, T256M, T256N, T256P, T256R, T256S, T256V, T256W, T256E, Q311H, Q311R, Q311Y, Q311W, D312P, L314K, A431K, N434A, N434C, N434D, N434E, N434F, N434G, N434H, N434I, N434K, N434L, N434M, N434P, N434Q, N434R, N434S, N434T, N434V, N434W, N434Y 및 E439K 중 하나 이상의 치환을 포함하는, 폴리펩티드.
  14. 제12항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 야생형 개과 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 폴리펩티드보다 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 갖는, 폴리펩티드.
  15. 제12항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 개과 또는 개과화 IgG의 폴리펩티드인, 폴리펩티드.
  16. 제12항에 있어서, 상기 IgG는 IgGA, IgGB, IgGC 또는 IgGD인, 폴리펩티드.
  17. 제12항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 IgGA, IgGB, IgGC 또는 IgGD의 불변 도메인인, 폴리펩티드.
  18. 제12항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 CH3 도메인을 갖는 Fc 불변 영역을 포함하는, 폴리펩티드.
  19. 제12항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 Fc 불변 영역을 포함하는, 폴리펩티드.
  20. 제12항에 있어서, 상기 야생형 개과 IgG 불변 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  21. 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 항체로서, 상기 치환은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 247, 252, 254, 256, 311, 312, 314, 431, 434 또는 439에 있는, 항체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 불변 도메인은 P247V, L252Y, L252P, L252W, L252A, L252D, L252G, L252H, L252I, L252K, L252M, L252N, L252Q, L252S, L252T, L252V, L252F, L252R, A254F, A254G, A254H, A254N, A254Q, A254R, A254W, A254C, A254D, A254I, A254K, A254L, A254M, A254P, A254S, A254T, A254V, A254Y, T256H, T256I, T256K, T256L, T256Q, T256Y, T256A, T256C, T256D, T256F, T256G, T256M, T256N, T256P, T256R, T256S, T256V, T256W, T256E, Q311H, Q311R, Q311Y, Q311W, D312P, L314K, A431K, N434A, N434C, N434D, N434E, N434F, N434G, N434H, N434I, N434K, N434L, N434M, N434P, N434Q, N434R, N434S, N434T, N434V, N434W, N434Y 및 E439K 중 하나 이상의 치환을 포함하는, 항체.
  23. 제21항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 야생형 개과 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 폴리펩티드보다 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 갖는, 항체.
  24. 제21항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 개과 또는 개과화 IgG의 폴리펩티드인, 항체.
  25. 제21항에 있어서, 상기 IgG는 IgGA, IgGB, IgGC 또는 IgGD인, 항체.
  26. 제21항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 IgGA, IgGB, IgGC 또는 IgGD의 불변 도메인인, 항체.
  27. 제21항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 CH3 도메인을 갖는 Fc 불변 영역을 포함하는, 항체.
  28. 제21항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 Fc 불변 영역을 포함하는, 항체.
  29. 제21항에 있어서, 상기 야생형 개과 IgG 불변 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  30. 제29항의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  31. 용기 내에 제29항의 항체 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  32. 제21항의 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 상기 야생형 개과 IgG 불변 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 벡터.
  33. 제32항의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  34. 제33항의 세포를 제공하는 단계; 및 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 또는 분자의 제조 방법.
  35. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체를 제공하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
  36. 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 융합 분자로서, 상기 치환은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 247, 252, 254, 256, 311, 312, 314, 431, 434 또는 439에 있는, 융합 분자.
  37. 제36항에 있어서, 상기 불변 도메인은 P247V, L252Y, L252P, L252W, L252A, L252D, L252G, L252H, L252I, L252K, L252M, L252N, L252Q, L252S, L252T, L252V, L252F, L252R, A254F, A254G, A254H, A254N, A254Q, A254R, A254W, A254C, A254D, A254I, A254K, A254L, A254M, A254P, A254S, A254T, A254V, A254Y, T256H, T256I, T256K, T256L, T256Q, T256Y, T256A, T256C, T256D, T256F, T256G, T256M, T256N, T256P, T256R, T256S, T256V, T256W, T256E, Q311H, Q311R, Q311Y, Q311W, D312P, L314K, A431K, N434A, N434C, N434D, N434E, N434F, N434G, N434H, N434I, N434K, N434L, N434M, N434P, N434Q, N434R, N434S, N434T, N434V, N434W, N434Y 및 E439K 중 하나 이상의 치환을 포함하는, 분자.
  38. 제36항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 야생형 개과 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 폴리펩티드보다 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 갖는, 분자.
  39. 제36항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 개과 또는 개과화 IgG의 폴리펩티드인, 분자.
  40. 제36항에 있어서, 상기 IgG는 IgGA, IgGB, IgGC 또는 IgGD인, 분자.
  41. 제36항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 IgGA, IgGB, IgGC 또는 IgGD의 불변 도메인인, 분자.
  42. 제36항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 CH3 도메인을 갖는 Fc 불변 영역을 포함하는, 분자.
  43. 제36항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 Fc 불변 영역을 포함하는, 분자.
  44. 제36항에 있어서, 상기 야생형 개과 IgG 불변 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 분자.
  45. 제36항의 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  46. 용기 내에 제36항의 분자 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  47. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 생물물리학적 특성을 향상시키는, 변형된 IgG.
  48. 제47항에 있어서, 상기 생물물리학적 특성은 다중반응성인, 변형된 IgG.
  49. 제12항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 생물물리학적 특성을 향상시키는, 폴리펩티드.
  50. 제49항에 있어서, 상기 생물물리학적 특성은 다중반응성인, 폴리펩티드.
  51. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 생물물리학적 특성을 향상시키는, 항체.
  52. 제51항에 있어서, 상기 생물물리학적 특성은 다중반응성인, 항체.
  53. 제36항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 생물물리학적 특성을 향상시키는, 분자.
  54. 제53항에 있어서, 상기 생물물리학적 특성은 다중반응성인, 분자.
  55. 야생형 개과 IgG 불변 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 개과 IgG 불변 도메인을 포함하는 치료적 유효량의 항체를 개에게 투여하는 단계를 포함하는, 개에서 항체 혈청 반감기를 증가시키는 방법으로서, 상기 치환은 카바트에서와 같은 Eu 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 252, 254, 256, 311, 434 또는 439에 있는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 개과 IgG 불변 도메인은 L252F, L252R, L252Y, L252M, A254T, A254S, T256E, Q311W, N434H, N434Y 및 E439K 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 개과 IgG 불변 도메인은 (1) L252F; (2) L252R, N434H 및 Q311W; (3) L252R; (4) Q311W; (5) L252R, A254T, T256E 및 N434H; (6) L252Y 및 A254T; 또는 (7) L252M, A254S 및 E439K의 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는, 방법.
  58. 제55항에 있어서, 상기 개과 IgG 불변 도메인은 돌연변이 L252F를 포함하는, 방법.
  59. 제55항에 있어서, 상기 개과 IgG 불변 도메인은 돌연변이 L252R, N434H 및 Q311W의 조합을 포함하는, 방법.
  60. 제55항에 있어서, 상기 개과 IgG 불변 도메인은 돌연변이 L252R 또는 Q311W를 포함하는, 방법.
  61. 제55항에 있어서, 상기 개과 IgG 불변 도메인은 돌연변이 L252R, A254T, T256E 및 N434H의 조합을 포함하는, 방법.
  62. 제55항에 있어서, 상기 개과 IgG 불변 도메인은 돌연변이 L252Y 및 A254T의 조합을 포함하는, 방법.
  63. 제55항에 있어서, 상기 개과 IgG 불변 도메인은 돌연변이 L252M, A254S 및 E439K의 조합을 포함하는, 방법.
  64. 제55항에 있어서, 상기 개과 IgG 불변 도메인은 야생형 개과 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG보다 더 높은 혈청 반감기를 갖는, 방법.
  65. 제55항에 있어서, 상기 IgG는 IgGA, IgGB, IgGC 또는 IgGD인, 방법.
  66. 제55항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 IgGA, IgGB, IgGC 또는 IgGD의 불변 도메인인, 방법.
  67. 제55항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 CH3 도메인을 갖는 Fc 불변 영역을 포함하는, 방법.
  68. 제55항에 있어서, 상기 IgG 불변 도메인은 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 Fc 불변 영역을 포함하는, 방법.
  69. 제55항에 있어서, 상기 야생형 개과 IgG 불변 도메인은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  70. 제55항에 있어서, 상기 항체는 항-IL31 항체인, 방법.
  71. 치료적 유효량의 항-IL31 항체를 개과 대상체에게 투여함으로써, 개과 대상체에서 IL-31 매개 소양증 또는 알레르기 상태를 치료하는 단계를 포함하는, 개과 대상체에서 IL-31 매개 소양증 또는 알레르기 상태를 치료하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 IL-31 매개 소양증 또는 알레르기 상태는 아토피성 피부염, 습진, 건선, 피부경화증 및 소양증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 소양증 상태인, 방법.
KR1020237025434A 2021-01-28 2022-01-27 개과 항체 불변 영역에서의 돌연변이 KR20230136604A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163142774P 2021-01-28 2021-01-28
US63/142,774 2021-01-28
PCT/US2022/014146 WO2022165067A2 (en) 2021-01-28 2022-01-27 Mutations in canine antibody constant regions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230136604A true KR20230136604A (ko) 2023-09-26

Family

ID=80786846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237025434A KR20230136604A (ko) 2021-01-28 2022-01-27 개과 항체 불변 영역에서의 돌연변이

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20240059777A1 (ko)
EP (1) EP4284825A2 (ko)
JP (1) JP2024505072A (ko)
KR (1) KR20230136604A (ko)
CN (1) CN116802205A (ko)
AU (1) AU2022214843A1 (ko)
CA (1) CA3207285A1 (ko)
CL (1) CL2023002202A1 (ko)
CO (1) CO2023009994A2 (ko)
EC (1) ECSP23057156A (ko)
IL (1) IL304522A (ko)
TW (1) TW202246318A (ko)
WO (1) WO2022165067A2 (ko)

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
US5698762A (en) 1994-12-09 1997-12-16 Dauerman; Leonard Microwave-assisted pyrolysis of waste polyaromatic hydrocarbons
US20030031671A1 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Sydney Welt Methods of treating colon cancer utilizing tumor-specific antibodies
RU2367667C2 (ru) 2004-08-19 2009-09-20 Дженентек, Инк. Полипептидные варианты с измененной эффекторной функцией
KR101027427B1 (ko) 2004-11-12 2011-04-11 젠코어 인코포레이티드 ＦcRn에 대하여 증가된 결합력을 갖는 Ｆc 변이체
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
US8790651B2 (en) 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
US20200181258A1 (en) * 2016-10-17 2020-06-11 Vetoquinol Sa Modified antibody constant region
KR20210110563A (ko) * 2018-10-18 2021-09-08 킨드레드 바이오사이언시스, 인코포레이티드 수의학적 용도를 위한 신생아 fc 수용체(fcrn)에 변경된 결합을 갖는 fc 변이체
MX2021008144A (es) * 2019-01-03 2021-10-13 Invetx Inc Composiciones para aumentar la media vida de un agente terapeutico en caninos y metodos de uso.

Also Published As

Publication number Publication date
IL304522A (en) 2023-09-01
CA3207285A1 (en) 2022-08-04
WO2022165067A3 (en) 2022-09-22
AU2022214843A1 (en) 2023-07-20
CO2023009994A2 (es) 2023-08-09
ECSP23057156A (es) 2023-08-31
TW202246318A (zh) 2022-12-01
EP4284825A2 (en) 2023-12-06
US20240059777A1 (en) 2024-02-22
CL2023002202A1 (es) 2024-01-12
JP2024505072A (ja) 2024-02-02
AU2022214843A9 (en) 2024-05-16
CN116802205A (zh) 2023-09-22
WO2022165067A2 (en) 2022-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115996949A (zh) 犬抗体变异体
JP2023522030A (ja) ネコ科動物抗体バリアント
RU2739208C2 (ru) Анти-pcsk9 антитело, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение
TW202235437A (zh) 含抗tslp抗體的藥物組合物
TW202229337A (zh) 犬抗體變異體
KR20230136604A (ko) 개과 항체 불변 영역에서의 돌연변이
TW202222838A (zh) 一種抗ceacam5的人源化抗體及其製備方法和用途
TWI814094B (zh) 貓抗體變異體
US20230416410A1 (en) Bovine antibody variants
TW202233687A (zh) 貓抗體恆定區中之突變
WO2023250284A2 (en) Canine antibody mutants
WO2024031043A2 (en) Bovine antibody mutants
KR20240004694A (ko) 항체
KR20180129791A (ko) 혈 중에서 합토글로빈에 결합하여 다가의 면역 복합체를 형성하는 항체를 유효 성분으로 하는 자기 면역 질환 치료제