DE102009017716A1

DE102009017716A1 - Fusionsantikörper

Info

Publication number: DE102009017716A1
Application number: DE200910017716
Authority: DE
Inventors: Martin Giersberg; Udo Conrad
Original assignee: IPK GATERSLEBEN LEIBNIZ INST F; Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Current assignee: IPK GATERSLEBEN LEIBNIZ INST F; Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Priority date: 2009-01-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2010-07-15

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Monomer eines Polypeptids, umfassend eine konstante Domäne einer leichten Kette und eine variable Domäne einer schweren Kette, wobei diese optional über einen Linker verbunden sind, sowie ein Dimer eines Polypeptids umfassend zwei dieser Monomere.

Description

Zusammenfassung
Die Erfindung betrifft ein Monomer eines Polypeptids, umfassend eine konstante Domäne einer leichten Kette und eine variable Domäne einer schweren Kette, wobei diese optional über einen Linker verbunden sind, sowie ein Dimer eines Polypeptids umfassend zwei dieser Monomere.
Hintergrund
Das Immunsystem von Vertebraten ist ein komplexes Defensivsystem, welches für die Unterscheidung zwischen „selbst” und „fremd” sowie für den Schutz des Organismus vor Infektionen und fremden Substanzen verantwortlich ist. Das Immunsystem kann in das angeborene und das adaptive Immunsystem unterteilt werden. Die adaptive Immunantwort erfolgt in spezialisierten lymphoiden Geweben. Hierbei sind verschiedene Typen von Lymphozyten beteiligt, die T-Lymphozyten und die B-Lymphozyten. Sie besitzen spezifische Rezeptoren auf ihren Oberflächen, mit deren Hilfe sie Strukturen auf den Oberflächen von Fremdstoffen und Pathogenen erkennen können. Im Ergebnis dieser Erkennung proliferieren die jeweiligen Lymphozytenklone (klonale Selektion der besten Binder) und differenzieren zu Effektorzellen. Während die T-Zellrezeptoren auf den Oberflächen verbleiben, können die B-Zellrezeptoren als lösliche Proteine, sogenannte Antikörper in das Serum und im Rahmen des mucosalen Immunsystems auch in die Mundhöhle oder den Dünndarm sekretiert werden. Diese löslichen Antiköper gehören zu den humoralen Komponenten des Immunsystems. Eine effektive adaptive Immunantwort führt zur Bekämpfung einer akuten Infektion und zum Immunschutz auch vor späteren Infektionen. Immunschutz kann künstlich durch Vaccinierung (aktive Immunisierung) oder durch die Verabreichung von Antikörpern (passive Immunisierung) hervorgerufen werden. Unter aktiver Immunisierung versteht man das Einbringen eines Antigens in den Körper, wodurch der Körper selbst angeregt wird, eine Immunität gegen dieses Target zu entwickeln. Aktive Immunisierung wird normalerweise in der Prophylaxe, zum Beispiel bei der Impfung, verwendet, jedoch weniger in der Behandlung von akuten Infektionen.
Bei der passiven Immunisierung werden vorgefertigte Antikörper in den Organismus transferiert. Diese Methode der Immunisierung wirkt relativ schnell, hat jedoch keinen lang anhaltenden Effekt, da die Antikörper auf natürlichem Wege abgebaut werden und es keine B-Zellen gibt, die weitere Antikörper produzieren könnten. Einer der Hauptnachteile der passiven Immunisierung ist die schwache Stabilität der meisten Antikörper. Vor allem die orale Administration ist nur wenig effektiv, da Antikörper im Magen-Darm-Trakt denaturiert und degradiert werden, zum einen durch Enzyme, zum anderen durch den niedrigen pH-Wert. Eine orale Administration wäre jedoch wünschenswert, da diese kostengünstig und einfach zu realisieren ist. Dies trifft vor allem für die Immunisierung von Nutztieren zu, da es besonders aufwendig ist, jedes Tier einzeln zu behandeln.
Ein weiterer Nachteil der passiven Immunisierung im Stand der Technik ist, dass fremde Antikörper selbst eine Immunreaktion auslösen können. Da der Antikörper vom eigenen Immunsystem als „fremd” erkannt wird, wird auch dieser angegriffen, was zu einer Vielzahl von unerwünschten Nebenwirkungen führt.
Antikörper bestehen typischerweise aus zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten, die zu einer y-förmigen Struktur miteinander verknüpft sind. Dabei bestehen die leichten Ketten aus jeweils einer variablen und einer konstanten Domäne. Die schweren Ketten weisen jeweils eine variable und 3 beziehungsweise 4 konstante Domänen auf. Die Antigenbindungsstellen werden durch die variablen Domänen einer leichten (VL) und einer schweren Kette (VH) gebildet. Klassische Antikörper enthalten daher 2 Antigenbindungsstellen. Bei den leichten Ketten kann es sich entweder um Kappa- oder Lambda-Ketten handeln. Bei den schweren Ketten kann es sich μ, δ, ε oder verschiedene γ-Ketten handeln. Die konstanten Teile (Fc) der schweren Ketten bestimmen die Klasse (Isotyp) des jeweiligen Immunglobulins. Die Fc-Region eines Antikörpers ist für die Interaktion mit den auf Zelloberflächen sitzenden verschiedenen Fc-Rezeptoren und Proteinen des Komplementsystems verantwortlich (Effektorfunktionen). In einigen Fällen kann die Verhinderung der Wechselwirkung mit Fc-Rezeptoren auch therapeutisch gewünscht sein.
Ein Antikörper kann durch enzymatische Spaltung in ein Fab-Fragment und einen restlichen Fc-Teil zerlegt werden. Dabei besteht das Fab-Fragment aus der kompletten leichten Kette sowie einem Teil der schweren Kette, nämlich der variablen Region und eines Teils der konstanten Region.
Die variablen Regionen eines bestimmten Antikörpers unterscheiden sich von denen jedes anderen, dabei ist die Sequenzvariabilität jedoch nicht gleichmäßig über die variable Region verteilt, sondern konzentriert sich in bestimmten Abschnitten. Es gibt 3 besonders variable Regionen in den VH- und VL-Domänen, die hypervariablen Regionen, auch komplementaritätsbestimmende Regionen genannt (CDR 1, CDR 2, CDR 3). Die Variabilität der Antikörper entsteht während der B-Lymphozytenreifung durch verschiedene genetische Mechanismen (Rekombination, Mutagenese). Sie kann in rekombinanten Systemen auch künstlich erzeugt werden (synthetische und semisynthetische Phage Display Libraries).
Eines der kleinsten Moleküle mit einer kompletten Antigen-Bindestelle ist der sogenannte Einzelkettenantikörper (scFv). Ein scFv ist eine Fusion einer variablen Region einer schweren Kette (VH) und einer variablen Region einer leichten Kette (VL) eines Immunglobulins, wobei beide Regionen über einen Linker miteinander verbunden sind. Auch eine VH-Kette allein ist in der Lage, Antigene spezifisch zu binden. Das trifft insbesondere auf VH-Ketten cameloiden Ursprungs zu, wenn diese von sogenannten single domain Antikörpern stammen, die natürlicherweise keine leichten Ketten enthalten.
Neben der Bildung von Antikörpern durch das Immunsystem des jeweiligen Organismus kann die Erzeugung von Antikörpern auch durch zellbiologische und molekularbiologische Verfahren erfolgen. Solche Antikörper können als Mittel sowohl bei der biochemischen und molekularbiologischen Forschung als auch in der Diagnostik und bei klinischen Anwendungen eingesetzt werden. Vor allem bei der medizinischen Anwendung können in vielen Fällen rekombinante Antikörperfragmente jedoch nur schwer direkt eingesetzt werden, da diese zumeist nur eine sehr kurze Halbwertszeit in vivo aufweisen und damit gegebenenfalls ihr Ziel-Antigen nicht erreichen. Diese Probleme treten verstärkt bei der oralen Administration von Antikörpern auf, da diese im Magen-Darm-Trakt durch Enzyme und den niedrigen pH-Wert im Magen abgebaut werden.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass auf klassische Weise und durch zellbiologische Verfahren erzeugte Antikörper eine sehr wichtige Rolle bei der Therapie von vielen Erkrankungen in der Human- und Veterinärmedizin spielen. Die Nutzung von Antikörpern, die durch genetic engineering Technologien erzeugt wurden, steht am Anfang einer vielversprechenden Entwicklung. Darüber hinaus spielen alle Formen von Antikörpern in der Diagnostik eine wichtige Rolle. Für alle Anwendungen ist die Verbesserung der Stabilität bei Erhalt der Bindungsspezifität, -affinität und -avidität eine wichtige Voraussetzung.
Spezieller Beschreibungsteil
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein neues antigenbindendes Polypeptid, im Speziellen ein Antikörperformat bereitzustellen, welches die genannten Nachteile im Stand der Technik nicht aufweist. Diese Polypeptide sollen vor allem für die passive Immunisierung einsetzbar sein, ohne die genannten Limitationen aufzuweisen. Die Aufgabe konnte durch die Ausführungsformen der Ansprüche realisiert werden.
In einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polypeptid, umfassend

• eine variable Domäne einer schweren Kette, ausgewählt aus der Gruppe umfassend VH und/oder VHH,
• eine konstante Domäne einer leichten Kette,
• optional einen Linker, wobei dieser Linker zwischen der variablen Domäne der schweren Kette und der konstanten Domäne der leichten Kette angeordnet ist, wobei ein Polypeptid bestehend aus VH und der konstanten Domäne einer leichten Kette ausgeschlossen ist.

Im Sinne der Erfindung werden camelide VH-Ketten auch VHH-Ketten genannt. Bevorzugt stellt die variable Domäne einer schweren Kette eine VHH-Kette dar. Überraschenderweise sind außerdem besonders gut humane VH-Ketten geeignet, um die erfindungsgemäße Aufgabe zu lösen.
Die oben beschriebene Ausführungsform ist bevorzugt ein Monomer im Sinne der Erfindung.
Im Sinne der Erfindung wird eine konstante Domäne einer leichten Kette auch als CL oder C_Leicht bezeichnet. Eine CL Kette im Sinne der Erfindung kann ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend C_Kappa und/oder C_Lambda, welche auch als Kappa-Kette oder Lambda-Kette bezeichnet werden.
Wird die eine humane VH Kette und nicht eine VHH Kette verwendet, muss ein Linker zwischen der VH Kette und der konstanten Domäne einer leichten Kette angeordnet sein, um die erfindungsgemäßen Vorteile zu erzielen. Überraschenderweise sind selbst besonders kurze Linker (z. B. 1–15 Aminosäuren) geeignet um zu einer erhöhten Stabilität zu führen.
Polypeptide im Sinne der Erfindung werden wie folgt definiert:

Die Grundstruktur eines Polypeptids ist wohlbekannt im Stand der Technik und in zahlreichen Standardwerken oder Publikationen beschrieben. Im Zusammenhang mit der Erfindung wird der Term Polypeptid dazu verwendet, jedes Peptid oder Protein zu beschreiben, welches Aminosäuren umfasst, die durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Es werden sowohl kurze Ketten, welche oft auch als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch längere Ketten, welche generell Proteine genannt werden, umfasst.
Dem Fachmann ist bekannt, dass Polypeptide oft andere als die 20 Aminosäuren, welche allgemein als 20 natürlich vorkommende Aminosäuren bezeichnet werden, beinhalten können. Außerdem können Aminosäuren modifiziert sein, zum Beispiel Glykosylierungen oder andere posttranslationale Modifikationen beinhalten. Auch chemische Modifikationen sind im Stand der Technik bekannt. Beispiele für Modifikationen sind Glykosylierung, Lipid-Attachment, Sulfonierung, Gamma-Carboxylierung, Hydroxylierung oder ADP-Ribosylierung.
Außerdem ist bekannt, dass Polypeptide nicht immer komplett linear sein müssen. Zum Beispiel gibt es Polypeptide, die verzweigt sind oder zirkulär sind.
In der allgemeinen Form, wie der Term Polypeptid hier verwendet wird, sind alle Modifikationen umfasst.
Außerdem vorteilhaft ist ein Polypeptid umfassend eine VHH Kette und eine konstante Domäne einer leichten Kette, wobei kein Linker zwischen beiden Ketten angeordnet ist. Es war dabei besonders überraschend, dass durch die Verwendung von einer VHH Kette an Stelle einer VH Kette auf den Linker verzichtet werden kann. Auch ohne den Linker weißt die Kombination aus VHH und C_Leicht eine hohe Stabilität und eine erhöhte Halbwertszeit auf.
Ein einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Dimer eines Polypeptids, umfassend zwei Monomere, jeweils umfassend

• eine variable Domäne einer schweren Kette ausgewählt aus der Gruppe umfassend VH und/oder VHH,
• eine konstante Domäne einer leichten Kette (CL) und
• optional einen Linker, wobei dieser Linker zwischen der variablen Domäne der schweren Kette und der konstanten Domäne der leichten Kette angeordnet ist.

Ein Problem im Stand der Technik ist die ungenügende Stabilität sowie kurze Halbwertszeiten von einzelnen VH-Ketten. Dieses Problem konnte besonders gut durch ein erfindungsgemäßes Dimer gelöst werden. Die zwei konstanten Domänen einer leichten Kette wirken stabilisierend, zusätzlich konnten deutlich verlängerte Halbwertszeiten erreicht werden. Dies wird teilweise über die Größe des Dimers und durch die Dimerisierung erreicht. Der Effekt ist jedoch so groß, dass andere bisher unbekannte Ursachen zusätzlich dafür verantwortlich sein müssen. Dies war völlig überraschend und konnte von einem Fachmann nicht vermutet werden.
Außerdem bevorzugt ist ein Dimer eines Polypeptids, umfassend zwei Monomere jeweils umfassend

• eine variable Domäne einer schweren Kette, ausgewählt aus der Gruppe umfassend VH und/oder VHH,
• eine konstante Domäne einer leichten Kette,
• optional einen Linker, wobei dieser Linker zwischen der variablen Domäne der schweren Kette und der konstanten Domäne der leichten Kette angeordnet ist, wobei ein Dimer bestehend aus zwei Monomeren, jeweils bestehend aus VH und der konstanten Domäne einer leichten Kette ausgeschlossen ist.

Überraschenderweise konnte das erfindungsgemäße Problem besonders gut durch die folgenden Varianten gelöst werden:

• Dimer umfassend 2 Monomere, jeweils umfassend eine VHH Kette und eine konstante Domäne einer leichten Kette,
• Dimer umfassend 2 Monomere, jeweils umfassend eine VHH Kette und eine konstante Domäne einer leichten Kette, verbunden durch einen Linker,
• Dimer umfassend 2 Monomere, jeweils umfassend eine VH Kette und eine konstante Domäne einer leichten Kette, verbunden durch einen Linker.

Somit verbindet der Linker die VH-Kette eines Monomers mit der CL-Kette des selben Monomers. Es war überraschend, dass dieser Linker eine deutlich erhöhte sterische Stabilität des Moleküls zur Folge hat, wenn die variable Domäne einer schweren Kette eine humane VH Kette ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Dimer eines Polypeptids, umfassend

• eines der genannten Monomere und
• ein Monomer umfassend – eine konstante Domäne einer leichten Kette und – ein Markermolekül.

Ein Markermolekül im Sinne der Erfindung kann beispielsweise ein Fluoreszenzmolekül sein. Ein solches Dimer ist besonders vorteilhaft in diagnostischen Anwendungen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Antikörperkonstrukt, umfassend

• zwei konstante Domänen einer leichten Kette, wobei die zwei konstanten Domänen einer leichten Kette wirkverbunden sind, bevorzugt durch eine Disulfidbrücke und
• zwei variable Domänen einer schweren Kette,
• optional einen Linker der jeweils die variable Domäne einer schweren Kette mit der konstanten Domäne einer leichten Kette verbindet.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Antikörperkonstrukt, umfassend

• zwei variable Domänen einer schweren Kette, ausgewählt aus der Gruppe umfassend VH und VHH,
• zwei konstante Domänen einer leichten Kette, wobei die zwei konstanten Domänen einer leichten Kette wirkverbunden sind, bevorzugt durch eine Disulfidbrücke und
• optional einen Linker der jeweils die variable Domäne einer schweren Kette mit der konstanten Domäne einer leichten Kette verbindet, wobei ein Antikörperkonstrukt bestehend aus zwei konstante Domänen einer leichten Kette und zwei humanen VH Ketten ausgeschlossen ist.

Der Begriff „Antikörper”, wie in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet, betrifft sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper. Der Begriff soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon, wie zum Beispiel Fv, scFv, Fab und F(ab')2, die zur Antigen-Bindung in der Lage sind, beinhalten. Außerdem werden markierte Antikörper und Fusionsproteine, die mir verschiedenen Molekülen gekoppelt sind umfasst.
Ein „Antigen” ist ein Molekül oder ein Teil eines Moleküls, das in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden. Es kann eine Polypeptid, Protein, Nukleinsäure oder ein anderes Molekül sein.
Bevorzugt ist, dass das Antikörperkonstrukt bispezifisch ist. Außerdem sind monospezifische Antikörperkonstrukte bevorzugt. Ob ein monospezisches oder ein bispezifisches Antikörperkonstrukt besser geeignet ist, hängt von der jeweiligen Zielstruktur ab. Ein Vorteil von bispezifischen Konstrukten ist die Möglichkeit zwei unterschiedliche Antigene gleichzeitig zu binden. Monospezifische Antikörper binden das gleiche Antigen mit beiden Antigenbindestellen; sodass das entsprechende Antigen effizienter eliminiert oder neutralisiert werden kann. Die Verwendung von monospezifischen Antikörpern ist außerdem in diagnostischen Anwendungen vorteilhaft.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Erfindung darin, dass die variable Domäne der schweren Kette (VH) eines humanen Antikörpers beziehungsweise eines cameliden Antikörpers (VHH) mit der konstanten Domäne der leichten Kette (C_Kappa bzw. C_Lambda) eines humanen Antikörpers fusioniert wird. Diese Fusion führt zu einer Reihe überraschender vorteilhafter Eigenschaften, wie die signifikante Erhöhung der Expression, vor allem in Pflanzen, und hohe Stabilität.
Eine breite Verwendung von Einzeldomänen-Antikörpern, bestehend aus VH, scheiterte bisher an der schlechten Expression in Pflanzen. Durch die erfindungsgemäße Fusion wird eine Expression im pflanzlichen System überhaupt erst effektiv möglich.
Einzelketten-Antikörper zeichnen sich durch eine sehr geringe Immunogenität aus, was besonders vorteilhaft für die Verwendung im Nutztier- oder humanen Bereich ist. Besonders vorteilhafte Ergebnisse wurden durch die Kombination von VH oder VHH Ketten mit CL Ketten erzielt, wobei die CL Ketten aus dem entsprechenden Zielorganismus stammen.
Besonders vorteilhaft hat sich außerdem die Verwendung einer Gensequenz erwiesen, die nicht durch Introns getrennt ist, welche während der Proteinexpression herausgespleißt werden. Somit entsteht während der Translation ein zusammenhängendes Protein, wobei die Sequenzen für VH und C_Kappa bzw. C_Lambda mit einem Linker verbunden sind. Bei der Verwendung von VHH wurden auch vorteilhafte Ergebnisse ohne den Linker erzielt.
Des Weiteren bevorzugt ist ein Polypeptid und/oder ein Antikörperkonstrukt, wobei das Polypeptid und/oder das Antikörperkonstrukt an ein Pathogen bindet und/oder dessen pathogenen Effekt neutralisiert. Bevorzugte Pathogene sind HIV, SARS, Coronavirus, Coccidia, Eimeria, Eimeria tenella, Hepatitis B, Mycobacterium tubercolosis und/oder Mycobacterium leprae.
Im Sinne der Erfindung ist ein Pathogen ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Viren, Bakterien, Mycoplasmen, Protozonen, Fungi, Parasiten oder andere Mikroorganismen. Der Virus ist bevorzugt aus der Gruppe, umfassend HIV, Herpesvirus, Cytomegalovirus, Tollwutvirus, Influenzavirus, Hepatitisvirus, bevorzugt Hepatitis-B-Virus, SARS Coronavirus, Epstein-Barr-Virus, Mumpsvirus, Murines Leukämievirus, Simianes Virus 40 und/oder Poliovirus. Das Bakterium kann beispielsweise ein Anthrax-Bacillus, Streptokokkus, Neisseria, Pneumokokkus, Hämophilis, Influenzae B, Pseudomonas, Mycobacterium tubercolosis, Mycobacterium leprae und/oder Tetanustoxin sein.
Im Sinne der Erfindung sind Parasiten Organismen, die parasitäre Infektionen hervorrufen, zum Beispiel Protozonen beziehungsweise Protista oder Wurminfektionen. Beispiele für Parasiten sind Trypanosomen, Trichomonada, Plasmodium, Coccidia, bevorzugt Eimeria, Annelida, Nematomorpha und/oder Trematoda.
Protozonen im Sinne der Erfindung können beispielsweise sein, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rhodesiensei, Trypanosoma brucei, Schistosoma mansoni, Schistosoma japanicum, Babesia bovis, Eimeria tenella, Onchocerca volvulus, Leishmania tropica, Trichinella spiralis, Onchocerca volvulus, Theileria parva, Taenia hydatigena, Taenia ovis, Taenia saginata, Echinococcus granulosus or Mesocestoides corti. The mycoplasma may be Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma orale, Mycoplasma arginini, Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma salivarum und Mycoplasma pneumoniae.
Die Verwendung von Polypeptiden und/oder Antikörperkonstrukten der Erfindung ist besonders vorteilhaft bei der Prophylaxe, Diagnose und/oder Behandlung von AIDS, mit AIDS assoziierten Krankheiten, Windpocken, Grippe, Ebola, Maul- und Klauenseuche, Hepatitis, Herpes simplex, Herpes zoster, HPV, Influenza, Mumps, Norovirus, Tollwut, virale Enzephalitis, Meningitis, SARS, Tuberkulose, Lepra, Leukämie, Kokzidiose, Krebs, Kreuzfeld Jakob, Malaria, Tetanus, Syphilis, Toxoplasmose, Autoimmunerkrankungen und/oder Diphterie.
Eine steigende Zahl an antibiotikaresistenten Bakterienstämmen hat den Bedarf an alternativen Behandlungsmethoden erhöht. Überraschenderweise sind die antigenbindenden Polypeptide und/oder Antikörperkonstrukte der Erfindung in der Lage, Pathogene zu neutralisieren oder zu eliminieren, welche gegenüber traditionellen Antibiotikabehandlungen resistent geworden sind.
Ein weiters Anwendungsfeld betrifft die Neutralisierung von immunologische funktionellen Molekülen. Beispiele für immunologisch funktionelle Moleküle sind TNF, Hormone, Zytokine, Transmitter oder second Messanger. Immunologisch funktionelle Moleküle spielen beispielsweise in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten eine grolle Rolle. Das Neutralisieren oder Eliminieren solcher Moleküle mit Hilfe der erfindungsgemäßen Polypeptide oder Antikörperkonstrukte kann bei der Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen eingesetzt werden.
Im Sinne der Erfindung kann ein antigenbindendes Polypeptid oder Antikörperkonstrukt so konstruiert werden, dass es jedes Zielantigen binden beziehungsweise erkennen kann. Der Fachmann weiß, wie er CDR-Regionskombinationen selektieren kann, so dass ein bestimmtes Antigen gebunden werden kann. Jedes antigenbindende Polypeptid oder Antikörperkonstrukt mit der oben genannten Struktur ist ein Polypeptid oder Antikörperkonstrukt der Erfindung, unabhängig von der Antigenspezifität.
Auch bevorzugt ist ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt, wobei beide konstanten Domänen einer leichten Kette Kappa-Domänen sind.
Überraschenderweise führt die Verwendung von Kappaketten zu einer erhöhten Bioaktivität nach Expression in Pflanzen, was in einer besonders hohen Effektivität resultiert. Außerdem ist die Verwendung von Kappaketten vorteilhaft, da die transiente Expression dieser Antikörperkonstrukte überraschend hoch ist. Die Verwendung von Kappa-Ketten resultiert außerdem überraschenderweise in einer hohen Aktivität in vitro und in vivo. Eine erhöhte Aktivität ist besonders vorteilhaft für therapeutische Anwendungen, da geringere Dosen eingesetzt werden können, was hilft Nebenwirkungen zu verhindern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt, wobei beide konstanten Domänen einer leichten Kette Lambda-Domänen sind. Es hat sich gezeigt, dass Lambda-Kette besonders für Anwendungen bei Hühnern oder Kaninchen geeignet sind.
Außerdem bevorzugt ist ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt, wobei die konstanten Domänen einer leichten Kette miteinander verbunden sind, bevorzugt über eine Disulfidbrücke und/oder hydrophobe Interaktion.
Dimere, die über eine nicht kovalente Assoziation formiert werden, dissoziieren oft, was ein Problem im Stand der Technik darstellt. Eine schlechte Stabilität beeinträchtigt die Fähigkeit der Antikörper oder Antikörperdomänen sich richtig nach der Expression in einem Zellsystem (z. B. bakteriellen oder Säugetiersystemen) zu falten. Überraschenderweise zeigen die Polypeptide oder Antikörperkonstrukte der Erfindung das Problem der Dissoziierung nicht. Die Monomere sind in der Art wirkverbunden, dass eine stabile Struktur des Dimers entsteht. Die Disulfidbrücke führt außerdem zu einer erhöhten proteolytischen Stabilität, so dass das Polypeptid resistenter gegen enzymatische Spaltungen ist.
Auch bevorzugt ist die Verwendung von hydrophoben Interaktionen, um die Monomere miteinander wirkzuverbinden. Hydrophobe Interaktionen können unter bestimmten Umständen vorteilhaft gegenüber kovalenten Verbindungen sein. Der Fachmann weiß, dass es unterschiedliche Wege gibt, zwei Ketten eines Antikörpers oder Polypeptids miteinander zu verbinden. Die Sulfidbrücken und hydrophobe Interaktionen sind die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, es versteht sich jedoch, dass jede Art der Verbindung, kovalent oder nicht kovalent, wie sie im Stand der Technik bekannt ist, verwendet werden kann, um die Ketten der Polypeptide oder Antikörperkonstrukte der Erfindung miteinander zu verbinden. Der Fachmann weiß, unter welchen Umständen welche Art der Verbindung vorteilhaft sein kann.
Des Weiteren bevorzugt ist die Verwendung eines Polypeptids und/oder Antikörperkonstrukts für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Infektionen, bevorzugt Infektionen assoziiert mit HIV, SARS, Coronavirus, Mycobacterium tubercolosis, Mycobacterium leprae, Hepatitis B, Eimeria, speziell Eimeria tenella.
Auch bevorzugt ist ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt, wobei das Polypeptid und/oder das Antikörperkonstrukt ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid ist.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass Antikörperkonstrukte ohne einen Fc-Teil schneller aus dem Kreislauf ausgeschieden werden und deshalb ungeeignet für therapeutische Zwecke sind. Umso überraschender war es, dass die Antikörperkonstrukte der Erfindung eine hohe Stabilität im Körper aufweisen.
Außerdem ist die Verwendung von Nicht-Immunglobulin-Peptiden vorteilhaft, da diese keine Fc-Region aufweisen, welche in diagnostischen Anwendungen oft für eine erhöhte Hintergrundfärbung zuständig ist.
Des Weiteren bevorzugt ist ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
Der Term Polynukleotide bezieht sich im Allgemeinen auf Polyribonukleotide oder Polydeoxyribonukleotide, welche modifizierte oder unmodifizierte RNA oder DNA darstellen. Zum Beispiel kann der Term Polynukleotide im Sinne der Erfindung unter anderem dafür verwendet werden, Einzelstrang- oder Doppelstrang-DNA, welche aus Einzelstrang- und Doppelstrangregion besteht, Einzelstrang- oder Doppelstrang-RNA, RNA, die aus Einzelstrang und Doppelstrangregion besteht, Hybridmoleküle, umfassend DNA und RNA, welche einzelsträngig oder beides sein können. Im Sinne der Erfindung können Polynukleotide modifizierte Basen enthalten. Auch das DNA- oder RNA-Grundgerüst kann modifiziert sein. Außerdem können Polynukleotide ungewöhnliche Basen sowie Inosine, oder modifizierte Basen sowie Trizium gelabelte Basen enthalten. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Modifikationen zu unterschiedlichen Zwecken bekannt. Der Term Polynukleotid, so wie er hier verwendet wird, umfasst chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Polynukleotide, sowie die chemischen Formen von DNA- oder RNA-Molekülen, welche charakteristisch für bestimmte Viren oder Zellen sind.
Auch bevorzugt ist ein Nukleotidkonstrukt, umfassend ein Polynukleotid, wobei diese Polynukleotid wirkverbunden mit einem Promotor ist, der die Expression in einer Wirtszelle reguliert.
Bevorzugt sind samenspezifische Promotoren, z. B. USP oder LeB4. Die Vorteile einer Expression in Samen liegen in deren guter Lagerfähigkeit ohne dass Lagerkosten entstehen. Außerdem ist der Proteingehalt in Samen besonders hoch und die exprimierten Peptide sind hochaktiv.
Der Term Promotor bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche die Transkription eines Genes oder eines Nukleinsäureabschnittes reguliert, so dass RNA hergestellt wird. Typischerweise ist ein Promotor in der 5'-Region eines Genes lokalisiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Vektor, umfassend ein Polynukleotid und/oder eine Nukleotidkonstrukt.
Der Term Vektor beinhaltet ein Nukleinsäuremolekül, welches in der Lage ist, ein anderes Nukleinsäuremolekül, an welches der Vektor gebunden ist, zu transportieren. Vektoren sind beispielsweise Plasmide oder virale Vektoren.
Außerdem bevorzugt ist ein Vektor, wobei der Vektor ein Phagen Display Vektor ein bakterieller Expressionsvektor, eine Hefeexpressionsvektor, ein Fungusexpressionsvektor, ein Algenexpressionsvektor und/oder einen Pflanzenexpressionsvektor.
Des Weiteren bevorzugt ist eine Wirtszelle, umfassend ein Polynukleotid, ein Nukleotidkonstrukt, ein Vektor und/oder ein Polypeptid und/oder ein Antikörperkonstrukt.
Auch bevorzugt ist eine Wirtszelle, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Funguszelle, eine Algenzelle und/oder Pflanzenzelle.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Wirtszelle, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend eine Escherichia coli Zelle, eine Streptomyces Zelle, eine Arxula Zelle, eine Pichia pastoris Zelle, eine Schizosaccharomyces Zelle, eine Aspergillus Zelle, eine Chlamydomonas Zelle, eine Nicotiana spec. Zelle, bevorzugt Nicotiana benthamiana Zelle, eine Pisum sativum Zelle, eine Hordeum vulgare Zelle, eine Zea mays Zelle, eine Rapszelle, eine Cucumis sativus Zelle und/oder Linum usitatissimum Zelle.
Auch bevorzugt ist eine transgene Pflanze, Teile davon und/oder Mikroorganismen, umfassend eine Polynukleotid, ein Nukleotidkonstrukt und/oder einen Vektor.
Des Weiteren bevorzugt ist eine Zusammensetzung, umfassend ein Polynukleotid, ein Nukleotidkonstrukt, ein Polypeptid und/oder ein Antikörperkonstrukt und einen geeigneten Träger, Puffer, Stabilisator und/oder Bindemittel.
Auch bevorzugt ist eine Zusammensetzung, wobei der Träger, Puffer, Stabilisator und/oder Bindemittel umfasst Proteine, bevorzugt BSA, Milchpulver und/oder Erbsenmehl, Mikropartikel und/oder Gelantinekapseln.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der transgenen Pflanze, Teile davon und/oder Mikroorganismen für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Infektionen, bevorzugt Infektionen assoziiert mit HIV, Hepatitis B, SARS, Coronavirus, Coccidia, Eimeria, bevorzugt Eimeria tenella, Mycobacterium tubercolosis und/oder Mycobacterium leprae.
Die Verwendung von transgenen Pflanzen oder Teilen davon ist besonders vorteilhaft, da diese einfach und schnell und oral aufgenommen werden können. Diese Ausführungsform bietet sich vor allem bei der Behandlung, Diagnose oder Prävention von Erkrankungen von Nutztieren an. Es ist besonders aufwändig Tiere einzeln zu behandeln, dies kann mit der erfindungsgemäßen Lehre umgangen werden, da die Polypeptide oder Antikörperkonstrukte einfach mit dem Futter aufgenommen werden können. Dies führt zu einer erheblichen Kostenreduktion sowie einer schnellen und effektiven Behandlung von einer Vielzahl von Tieren gleichzeitig.
Es kann außerdem vorteilhaft sein die erfindungsgemäßen Polypeptide oder Antikörperkonstrukte zu applizieren. Eine solche Anwendung kann vor allem im humanen Bereich oder für die Immunisierung oder Behandlung von besonders wertvollen Nutztieren, beispielsweise Zuchttieren, vorteilhaft sein.
Die anmeldungsgemäße Lehre zeichnet sich durch folgende Merkmale aus

– Abkehr vom technisch Üblichen
– neue Aufgabenstellung
– Vorliegen eines seit langem ungelösten dringenden Bedürfnisses für die Lösung des mit der Erfindung gelösten Problems
– bisheriges vergebliches Bemühen der Fachwelt
– die Einfachheit der Lösung spricht für erfinderische Tätigkeit, insbesondere da sie kompliziertere Lehren ersetzt
– Entwicklung der wissenschaftlichen Technik ging in eine andere Richtung
– entwicklungsstraffende Leistung
– Fehlvorstellungen der Fachwelt über die Lösung des entsprechenden Problems (Vorurteil)
– technischer Fortschritt, wie z. B.: Verbesserung, Leistungssteigerung, Verbilligung, Ersparnis an Zeit, Material, Arbeitsstufen, Kosten oder schwer beschaffbaren Rohstoffen, erhöhte Zuverlässigkeit, Beseitigung von Fehlern, Qualitätshebung, Wartungsfreiheit, größere Effektivität, höhere Ausbeute, Vermehrung der technischen Möglichkeiten, Bereitstellung eines weiteren Mittels, Eröffnung eines zweiten Weges, Eröffnung eines neuen Gebietes, erstmalige Lösung einer Aufgabe, Reservemittel, Alternativen, Möglichkeit der Rationalisierung, Automatisierung oder Miniaturisierung oder Bereicherung des Arzneimittelschatzes
– glücklicher Griff, da aus einer Vielzahl von Möglichkeiten eine bestimmte gewählt wurde, deren Ergebnis nicht vorausgesagt werden konnte, daher handelt es sich um ein patentwürdigen glücklichen Griff)
– Irrtümer in der Fachliteratur bzw. sehr widersprüchliche Darstellung zum Erfindungsgegenstand
– junges Gebiet der Technik
– Kombinationserfindung, d. h. mehrere bekannte Elemente werden zu einer Kombination zusammengeführt, die einen überraschenden Effekt aufweist
– Lizenzvergabe
– Lob der Fachwelt und
– wirtschaftlicher Erfolg.

Insbesondere die vorteilhaften Ausführungsformen der Erfindung weisen mindestens einen oder mehrere der genannten Vorteile auf.

Claims

Polypeptid, umfassend • eine variable Domäne einer schweren Kette, ausgewählt aus der Gruppe umfassend VH und/oder VHH, • eine konstante Domäne einer leichten Kette, • optional einen Linker, wobei dieser Linker zwischen der variablen Domäne der schweren Kette und der konstanten Domäne der leichten Kette angeordnet ist, wobei ein Polypeptid bestehend aus VH und der konstanten Domäne einer leichten Kette ausgeschlossen ist.
Dimer eines Polypeptids, umfassend zwei Monomere, bevorzugt nach Anspruch 1, jeweils umfassend • eine variable Domäne einer schweren Kette, ausgewählt aus der Gruppe umfassend VH und/oder VHH, • eine konstante Domäne einer leichten Kette, • optional einen Linker, wobei dieser Linker zwischen der variablen Domäne der schweren Kette und der konstanten Domäne der leichten Kette angeordnet ist.
Dimer eines Polypeptids, umfassend zwei Monomere, bevorzugt nach Anspruch 1, jeweils umfassend • eine variable Domäne einer schweren Kette, ausgewählt aus der Gruppe umfassend VH und/oder VHH, • eine konstante Domäne einer leichten Kette, • optional einen Linker, wobei dieser Linker zwischen der variablen Domäne der schweren Kette und der konstanten Domäne der leichten Kette angeordnet ist, wobei ein Dimer bestehend aus zwei Monomeren, jeweils bestehend aus VH und der konstanten Domäne einer leichten Kette ausgeschlossen ist.
Dimer eines Polypeptids, umfassend • ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder ein Monomer nach Anspruch 2 und • ein Monomer umfassend – eine konstante Domäne einer leichten Kette und – ein Markermolekül.
Ein Antikörperkonstrukt, bevorzugt nach Anspruch 2, umfassend • zwei konstante Domänen einer leichten Kette, wobei die zwei konstanten Domänen einer leichten Kette wirkverbunden sind, bevorzugt durch eine Disulfidbrücke, • zwei variable Domänen einer schweren Kette, wobei jede variable Domäne einer schweren Kette mit einer konstanten Domäne einer leichten Kette bevorzugt über einen Linker verbunden ist.
Ein Polypeptid und/oder ein Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid und/oder das Antikörperkonstrukt an ein Pathogen bindet und/oder dessen pathogenen Effekt neutralisiert bevorzugt, HIV, SARS, Coronavirus, Coccidia, Eimeria, Eimeria tenella, Hepatitis B, Mycobacterium tubercolosis und/oder Mycrobacterium leprae.
Ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die konstanten Domäne einer leichten Kette eine Kappadomäne ist.
Ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die konstante Domäne einer leichten Kette eine Lambdadomäne ist.
Ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die konstanten Domänen einer leichten Kette miteinander verbunden sind, bevorzugt über eine Disulfidbrücke und/oder hydrophobe Interaktion.
Verwendung eines Polypeptids und/oder Antikörperkonstrukts nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Infektionen, bevorzugt Infektionen assoziiert mit HIV, SARS, Coronavirus, Mycobacterium tubercolosis, Mycobacterium leprae, Hepatitis B, Eimeria, speziell Eimeria tenella.
Ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid und/oder das Antikörperkonstrukt ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid ist.
Ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
Ein Nukleotidkonstrukt, umfassend ein Polynukleotid nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei diese Polynukleotid wirkverbunden mit einem Promotor ist, der die Expression in einer Wirtszelle reguliert.
Ein Vektor, umfassend ein Polynukleotid nach Anspruch 11 und/oder eine Nukleotidkonstrukt nach Anspruch 12.
Ein Vektor nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der Vektor ein Phagen-Display-Vektor ein bakterieller Expressionsvektor, ein Hefe-Expressionsvektor, ein Fungus-Expressionsvektor, ein Algen-Expressionsvektor und/oder einen Pflanzen-Expressionsvektor.
Eine Wirtszelle, umfassend ein Polynukleotid nach Anspruch 11, ein Nukleotidkonstrukt nach Anspruch 12 ein Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14 und/oder ein Polypeptid und/oder ein Antikörperkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Eine Wirtszelle nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Funguszelle, eine Algenzelle und/oder Pflanzenzelle.
Die Wirtszelle nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend eine Escherichia coli Zelle, eine Streptomyces Zelle, eine Pichia pastoris Zelle, eine Schizosaccharomyces Zelle, eine Arxula Zelle, eine Aspergillus Zelle, eine Klamydomonas Zelle, eine Nicotiana Spec. Zelle, bevorzugt Nikotine benthamiana Zelle, eine Pisum sativum Zelle, eine Hordeum vulagare Zelle, eine Zea mays Zelle, eine Rapszelle, eine Cucumis sativus Zelle und/oder eine Linum usitatissimum Zelle.
Eine transgene Pflanze, Teile davon und/oder ein Mikroorganismus, umfassend eine Polynukleotid nach Anspruch 11, ein Nukleotidkonstrukt nach Anspruch 12, einen Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14, und/oder ein Polypeptid und/oder Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10.
Eine Zusammensetzung, umfassend ein Polynukleotid nach Anspruch 11, ein Nukleotidkonstrukt nach Anspruch 12, ein Polypeptid und/oder ein Antikörperkonstrukt nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 und einen geeigneten Träger, Puffer, Stabilisator und/oder Bindemittel.
Eine Zusammensetzung nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der Träger, Puffer, Stabilisator und/oder Bindemittel umfasst Proteine, bevorzugt BSA, Milchpulver und/oder Erbsenmehl, Mikropartikel und/oder Gelantinekapseln.
Verwendung der transgenen Pflanze, Teile davon und/oder der Mikroorganismen nach Anspruch 18 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung, Diagnose und/oder Prävention von Infektionen, bevorzugt Infektionen assoziiert mit HIV, Hepatitis B, SARS, Coronavirus, Coccidia, Eimeria, bevorzugt Eimeria tenella, Mycobacterium tubercolosis und/oder Mycobacterium leprae.