DE69333627T2

DE69333627T2 - Rekombinanter anti-hiv antikörper und seine herstellung

Info

Publication number: DE69333627T2
Application number: DE69333627T
Authority: DE
Inventors: Hiroaki Kumamoto-shi MAEDA; Kazuhiko gun KIMACHI; Yasuyuki Kikuchi-gun EDA; Kouichi Kikuchi-gun SHIOSAKI; Kiyoshi Kumamoto-shi OSATOMI; Sachio Kumamoto-shi TOKIYOSHI
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1993-01-14
Filing date: 1993-01-14
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2013-01-15
Also published as: EP0678523A4; DK0678523T3; CA2153165C; EP0678523A1; US5773247A; AU671608B2; ATE276276T1; DE69333627D1; WO1994015969A1; PT678523E; AU3267193A; ES2229206T3; EP0678523B1; CA2153165A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen rekombinanten Anti-HIV-Antikörper, von dem erwartet wird, dass er zur Behandlung und zur Verhütung von AIDS verwendet werden kann, welches durch das menschliche Immunschwächevirus (HIV) hervorgerufen wird. Noch spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Anti-HIV-Antikörper (umgestalteter Antikörper), der eine neutralisierende Aktivität gegen HIV aufweist, wobei dieser Antikörper unter Verwendung eines genetischen Rekombinationsverfahrens von einem Maus-Immunglobulingen und einem menschlichen Immunglobulingen exprimiert wird, sowie ein neues Verfahren zu seiner Herstellung. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin DNA-Fragmente, die die variablen Regionen der H-Kette und der L-Kette codieren, die zur Expression eines solchen nützlichen rekombinanten Antikörpers wirksam verwendet werden können.
Hintergrund des Fachgebiets
Das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) ist eine virale Erkrankung, die durch das menschliche Immunschwächevirus (HIV) hervorgerufen wird, das zu den Retroviren gehört. Diese Krankheit hat sich seit ihrer Entdeckung in den Vereinigten Staaten in 1981 rasch über die ganze Welt verbreitet, aber ein wirksamer Impfstoff oder ein Verfahren zur Behandlung dieser Krankheit steht noch nicht zur Verfügung.
Unter diesen Bedingungen gibt es Berichte von Bedeutung zwischen den Kliniken und einem neutralisierenden Antikörper bei einer Gruppe von Thalassämie-Patienten, die durch Transfusionen HIV-positiv wurden, und bei einer Gruppe von Kindern mit AIDS oder ARC (AIDS verwandtes Syndrom) [R. Guroff et al., J. Immunol. 138, S. 3731 (1987); R. Guroff et al., Pediatric Research, im Druck]. In beiden Berichten wird erwähnt, dass das klinische Symptom in den Fällen, in denen ein neutralisierender Antikörper nachweisbar war, mild und gutartig war, wohingegen es in den Fällen bösartig wurde, in denen ein neutralisierender Antikörper nicht nachgewiesen werden konnte. Diese Tatsachen deuten auf eine in vivo-Wirksamkeit eines neutralisierenden Antikörpers hin. Daher kann man von einem neutralisierenden Antikörper erwarten, dass er zur Verhütung der Ausbreitung der Infektion oder zum Ausschluß infizierter Zellen verwendbar ist, und dass er eine noch stärkere Wirkung zeigt, wenn er in Verbindung mit antiviralen Mitteln usw. angewendet wird, die derzeit in der Klinik verwendet werden.
Obwohl es möglich ist, dass der neutralisierende Anti-HIV-Antikörper, der vorstehend erwähnt wurde, direkt aus Patienten mit AIDS erhalten oder hergestellt werden kann, wird erwartet, dass dieses Verfahren eine Reihe von Schwierigkeiten mit sich bringt, wie zum Beispiel ethische Probleme, Verfügbarkeit der Materialien oder Probleme der Biogefährdung. In dieser Hinsicht wird als Alternative zu einem solchen Serum mit hohem Titer, die Verwendung eines monoclonalen Antikörpers mit einer neutralisierenden Aktivität gegen das HIV-Virus in Betracht gezogen. Obwohl die grundlegenden Techniken zur Herstellung monoclonaler Antikörper bereits für monoclonale Antikörper aus Mäusen etabliert sind, ist ein Maus-Antikörper kaum bei klinischen Anwendungen im Hinblick auf die Nebenwirkungen anwendbar (wenn ein monoclonaler Maus-Antikörper dem Menschen verabreicht wird, steht er im Verdacht Nebenwirkungen hervorzurufen, wie z. B. einen anaphylaktischen Schock oder Serum-Erkrankungen, da er ein heterogenes Protein (Fremdprotein) darstellt, usw.), und daher wird letztlich die Verwendung eines menschlichen monoclonalen Antikörpers bevorzugt.
Die Herstellung eines menschlichen monoclonalen Antikörpers ruft jedoch viele Probleme hervor, die zur Herstellung eines Antikörpers mit der gewünschten Spezifität überwunden werden müssen, und sie ist tatsächlich im Vergleich zur Herstellung eines monoclonalen Maus-Antikörpers sehr schwierig. Zur Überwindung solcher Probleme wurde vor Kurzem über ein Verfahren zur Herstellung eines chimären, monoclonalen Antikörpers unter Verwendung eines genetischen Rekombinationsverfahrens berichtet, wobei die variable Region, welche die Spezifität eines Antikörpers bestimmt, eine Aminosäuresequenz besitzt, die von einem Maus-Antikörper stammt, und die konstante Region eine Aminosäuresequenz aufweist, die von einem menschlichen Antikörper stammt.
Ein solcher chimärer, monoclonaler Antikörper wird durch die Expression eines chimären Maus(V)-Mensch(C)-Antikörpergens erhalten, das ein variables (V) Gen als Material für die V-Region umfasst, das aus einem Maus-Hybridom cloniert wird, welches einen monoclonalen Maus-Antikörper produziert, und ein konstantes (C) Gen als Material für die C-Region umfasst, das aus einer menschlichen Zelle, wie zum Beispiel einer menschlichen Antikörper-produzierenden Zelle, in einer Tierzelle oder der Zelle eines Mikroorganismus usw. cloniert wird, wobei der gewünschte chimäre, monoclonale Antikörper in dem Kulturüberstand vorliegt. Es gab verschiedene Berichte über chimäre Antikörper [Japanische Patent-Erstveröffentlichung Nr. 60-155132, Japanische Patent-Erstveröffentlichung Nr. 61-47500], und die vorliegenden Erfinder haben bereits einen chimären Antikörper erfolgreich hergestellt [Japanische Patent-Erstveröffentlichung Nr. 2-2352]. Das Fachgebiet offenbart weiterhin einen monoclonalen Anti-HIV-Antikörper, 0.5β, und den dazugehörigen chimären Antikörper, Cβ1, der HTLV-IIIB neutralisieren kann (Europäische Patentanmeldung Nr. 0327000). Darüber hinaus wurde, um die Idee eines chimären Antikörpers weiter (zu beschreiben), die Herstellung eines umgestalteten Antikörpers ebenfalls berichtet [Japanische Patent-Erstveröffentlichung Nr. 62-296890]. Weiterhin offenbart die Europäische Patentanmeldung Nr. 239400 die Herstellung eines umgestalteten Antikörpers (darin als "veränderter Antikörper" bezeichnet), durch den Ersatz der CDR-Bereiche einer variablen Region in einem Antikörper mit denen aus einem unterschiedlichen Antikörper unter Verwendung einer rekombinanten DNA-Technik.
Die Analyse der Immunglobulingene hat heutzutage einen raschen Fortschritt erfahren, zusammen mit einem raschen Voranschreiten der genetischen Manipulations-Techniken. Es ist wohlbekannt, dass ein Immunglobulingen aus einem Gen für die variable Region (V-Region) besteht, das an der Bindung mit einem Antigen beteiligt ist, und einem Gen für die konstante Region (C-Region) besteht, das eine physiologische Aktivität aufweist, die an Wechselwirkungen mit dem Komplement-System oder mit spezifischen Zellen, usw. beteiligt ist. Ein Gen für die V-Region wird jeweils aus einem Gen gebildet, das aus einer Gruppe einer Anzahl von V-Genfragmenten, einer Gruppe von D-Genfragmenten (die in einer L-Kette nicht vorliegen), und einer Gruppe von J-Genfragmenten ausgewählt wird, wobei die ausgewählten Gene in dieser Reihenfolge aneinandergefügt werden. Darüber hinaus wird das aneinandergefügte Genfragment (das V-Region-Gen) weiterhin mit einer somatischen Mutation durch eine kleine Modifikation verändert. Das bedeutet, dass die Spezifität eines Antikörpers durch eine Kombination jedes der Genfragmente im V-Region-Gen einer H-Kette und einer L-Kette sowie einer somatischen Mutation bestimmt wird [vergleiche mit Susumu Tonegawa, Nature 307, S. 575 (1983); Tasuku Honjo, Annual Rev. Immunol. 1, S. 499 (1983)]. Demgemäß sollte es für ein spezielles Antigen sowohl eine Kombination eines spezifischen VDJ-Genfragments der H-Kette und eines spezifischen VJ-Genfragments der L-Kette sowie eine spezifische somatische Mutation geben. Darüber hinaus kann eine Kombination dieser Genfragmente oder ihrer Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen kaum aus der Struktur, der Nucleotid- oder der Aminosäuresequenz usw. eines Antigens abgeleitet werden, sondern kann nur durch die Isolierung eines Antikörper-Gens oder eines Antikörper-Proteins aus den Zellen bestimmt werden, die tatsächlich einen Antikörper herstellen. Auf diese Weise besitzt eine variable Region eines Antikörpermoleküls eine Aminosäuresequenz, die mit jeder Determinante des Antigens variiert, und eine variable Region besitzt eine Aminosäuresequenz, die für jedes Antigen vollständig variiert.
Als Beispiel für einen rekombinanten Anti-HIV-Antikörper, auf den die vorliegende Erfindung abzielt, haben die vorliegenden Erfinder bereits den rekombinanten Antikörper 0.5β als einen neutralisierenden Anti-HIV-Antikörper veröffentlicht [Japanische Patent-Erstveröffentlichung Nr. 2-2352], aber dieser rekombinante Antikörper kann nur HTLV-IIIB spezifisch neutralisieren, aber nicht HTLV-IIIMN, das epidemisch vorherrschend ist. Weiterhin offenbart die europäische Patentanmeldung Nr. 465979 die monoclonalen Anti-HIV-Antikörper μ5.5 und μ39.1, die HTLV-IIIMN neutralisieren können. Der darin offenbarte Antikörper ist jedoch ein monoclonaler Antikörper aus der Maus und kein rekombinanter Antikörper. Wie vorstehend erwähnt, ist es zur Herstellung eines rekombinanten Antikörpers sehr wichtig, ein Gen zu finden, das eine Aminosäuresequenz einer variablen Region eines Antikörpermoleküls codiert, das die Fähigkeit zur Bindung mit einem gewünschten Antigen aufweist. Aufgrund der Schwierigkeit ein Gen zu finden, das eine Aminosäuresequenz einer variablen Region eines Antikörpers codiert, der eine neutralisierende Wirkung gegen HIV besitzt, insbesondere gegen HTLV-IIIMN, worauf die vorliegende Erfindung abzielt, gibt es keinen Bericht über die Erlangung eines rekombinanten Antikörpers, der HTLV-IIIMN bindet und im Wesentlichen neutralisiert.
Ziel der Erfindung
Unter diesen Bedingungen haben die vorliegenden Erfinder erfolgreich ein Gen isoliert, das eine variable Region eines monoclonalen Antikörpers codiert, der eine neutralisierende Wirkung gegen HIV (HTLV-IIIMN) besitzt, und zwar aus Zellen (Hybridomen), die diesen Antikörper herstellen. Die vorliegenden Erfinder haben weiterhin versucht, die Expression eines rekombinanten Maus-Mensch-Antikörpers unter Verwendung dieses Gens zu bewerkstelligen, und als Ergebnis haben sie erfolgreich einen rekombinanten Antikörper hergestellt, der eine neutralisierende Wirkung gegen HIV (HTLV-IIIMN) besitzt, und somit wurde die vorliegende Erfindung fertiggestellt. Das bedeutet, dass die vorliegende Erfindung ein Gen bereitstellt, das die variable Region eines neutralisierenden Anti-HIV-Antikörpers codiert, über den bislang noch nicht berichtet wurde, sowie einen rekombinanten Anti-HIV-Antikörper bereitstellt, der unter Verwendung dieses Gens in einer transformierten Zelle exprimiert wird. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Entwicklung von diagnostischen Mitteln und Mitteln zur Behandlung und zur Verhütung von AIDS zu ermöglichen, die verminderte Nebenwirkungen aufweisen, und die diesen neuen rekombinanten Anti-HIV-Antikörper enthalten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Zum Zwecke der Erläuterung zeigt 1 die Nucleotidsequenz eines DNA-Fragments der vorliegenden Erfindung, das die variable Region der H-Kette des neutralisierenden Anti-HIV-Antikörpers μ39.1 codiert, der in Beispiel (3) gezeigt wird, sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
Zum Zwecke der Erläuterung zeigt 2 die Nucleotidsequenz eines DNA-Fragments der vorliegenden Erfindung, das die variable Region der L-Kette des neutralisierenden Anti-HIV-Antikörpers μ39.1 codiert, der in Beispiel (3) gezeigt wird, sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
3 zeigt die Nucleotidsequenz eines DNA-Fragments der vorliegenden Erfindung, das die variable Region der H-Kette des neutralisierenden Anti-HIV-Antikörpers μ5.5 codiert, der in Beispiel (3) gezeigt wird, sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
4 zeigt die Nucleotidsequenz eines DNA-Fragments der vorliegenden Erfindung, das die variable Region der L-Kette des neutralisierenden Anti-HIV-Antikörpers μ5.5 codiert, der in Beispiel (3) gezeigt wird, sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
5 zeigt zum Zwecke der Erläuterung die Struktur der Expressionsplasmide CHμ39,1 und CHμ5.5, die chimäre H-Ketten des Anti-HIV-Antikörpers (codieren), und die in Beispiel (4) konstruiert wurden.
6 zeigt zum Zwecke der Erläuterung die Struktur der Expressionsplasmide CLμ39,1 und CLμ5.5, die chimäre L-Ketten des Anti-HIV-Antikörpers (codieren), und die in Beispiel (4) konstruiert wurden.
Zum Zwecke der Erläuterung zeigt 7 die Anti-HIV-Aktivitäten des chimären Anti-HIV-Antikörpers μ39.1, die in Beispiel (5) gemessen wurde, und des umgestalteten Anti-HIV-Antikörpers μ39.1, die in Beispiel (7) gemessen wurde.
8 zeigt die Anti-HIV-Aktivitäten des chimären Anti-HIV-Antikörpers μ5.5, die in Beispiel (5) gemessen wurde, und des umgestalteten Anti-HIV-Antikörpers μ5.5, die in Beispiel (7) gemessen wurde.
Zum Zwecke der Erläuterung zeigt 9 die Nucleotidsequenz eines DNA-Fragments, das die variable Region der H-Kette des umgestalteten Anti-HIV-Antikörpers μ39.1 codiert, der in Beispiel (6) hergestellt wurde, sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (die unterstrichene Sequenz zeigt die Aminosäuresequenz, die von dem Maus-Antikörper stammt).
Zum Zwecke der Erläuterung zeigt 10 die Nucleotidsequenz eines DNA-Fragments, das die variable Region der L-Kette des umgestalteten Anti-HIV-Antikörpers μ39.1 codiert, der in Beispiel (6) hergestellt wurde, sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (die unterstrichene Sequenz zeigt die Aminosäuresequenz, die von dem Maus-Antikörper stammt).
11 zeigt die Nucleotidsequenz eines DNA-Fragments, das die variable Region der H-Kette des umgestalteten Anti-HIV-Antikörpers μ5.5 codiert, der in Beispiel (6) hergestellt wurde, sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (die unterstrichene Sequenz zeigt die Aminosäuresequenz, die von dem Maus-Antikörper stammt).
12 zeigt die Nucleotidsequenz eines DNA-Fragments, das die variable Region der L-Kette des umgestalteten Anti-HIV-Antikörpers μ5.5 codiert, der in Beispiel (6) hergestellt wurde, sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (die unterstrichene Sequenz zeigt die Aminosäuresequenz, die von dem Maus-Antikörper stammt).
Offenlegung der Erfindung
Zellen, die den monoclonalen Anti-HIV(HIV-IIIMN)-Maus-Antikörper herstellen, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurden durch die bisher etablierten Verfahren zur Herstellung von monoclonalen Maus-Antikörpern hergestellt. Zum Beispiel kann der Antikörper durch die Immunisierung von Mäusen mit einem geeigneten Immunogen hergestellt werden, wie z. B. einem viralen Partikel, der aus HIV (HTLV-IIIMN) produzierenden Zellen erhalten wurde, oder dem gereinigten Glycoprotein gp120 der Virushülle (envelope) oder über ein rekombinantes Peptid hergestellt werden, das unter Verwendung eines genetischen Rekombinationsverfahrens hergestellt wurde, wobei es sich bevorzugt um ein rekombinantes Peptid handelt, das den Aminosäuren 247–370 des gp120-Proteins entspricht, oder einem geeigneten synthetischen Peptid entspricht, das auf Grundlage der Aminosäuresequenz dieses viralen Proteins hergestellt wurde, wobei es sich bevorzugt um ein synthetisches Peptid handelt, das den Aminosäuren 303–325 usw. des gp120-Proteins entspricht; der Fusion der erhaltenen Milzzellen mit Maus-Myelomzellen; der Auswahl der Zellen, die mit dem gereinigten Hüll-Glycoprotein gp120 oder den vorstehenden rekombinanten Peptiden reagieren, aus den erhaltenen Hybridomen; und der Anzucht dieser Zellen. Als nächstes werden aus den so erhaltenen, einen monoclonalen Anti-HIV-Antikörper produzierenden Zellen, diejenigen Zellen ausgewählt, die einen monoclonalen Antikörper produzieren, der eine neutralisierende Aktivität gegen HIV aufweist. Im Falle von HIV ist es aufgrund seiner Eigenschaften nicht leicht einen monoclonalen Antikörper zu erhalten, der eine solche neutralisierende Aktivität besitzt, aber als Beispiel für eine solche Zelllinie haben die vorliegenden Erfinder bereits erfolgreich die Hybridom-Zelllinie) μ5.5 etabliert, die einen Antikörper herstellt, der eine neutralisierende Aktivität gegen HIV (HTLV-IIIMN) besitzt [Japanische Patentanmeldung Nr. 2-188300], diese Zelllinie wird am stärksten bevorzugt für die vorliegende Erfindung verwendet.
Das Genfragment, das die variable Region der vorliegenden Erfindung codiert, wurde aus den vorstehend erwähnten Zellen isoliert, die den neutralisierenden monoclonalen Anti-HIV-Antikörper herstellen, und die dazugehörige Gensequenz wurde analysiert. Wie vorstehend erwähnt wurde, enthalten solche Zellen jedoch eine große Anzahl an Genen, die V-Regionen enthalten, neben dem einen Gen, das die V-Region codiert, die für den gewünschten Anti-HIV-Antikörper spezifisch ist (zum Beispiel umfasst eine Gruppe von V-Genen nur einer VH-Kette, die die Spezifität eines Maus-Antikörpers bestimmen, mehr als 100 unterschiedliche Gene, eine Gruppe von D-Genen umfasst mehr als 11 Gene, und eine Gruppe von J-Genen umfasst 4 Gene. Ähnlich umfasst eine Gruppe von V-Genen der Vκ-Kette mehr als ca. 300 Gene, und eine Gruppe von J-Genen umfasst 4 Gene), und daher ist es notwendig, ein Gen zu isolieren, das eine V-Region codiert, die für einen gewünschten Anti-HIV-Antikörper spezifisch ist. Ein V-Region-Gen kann über die herkömmlichen Techniken zur Genmanipulation isoliert werden, einschließlich zum Beispiel einem Verfahren zur Clonierung eines Gens für eine V-Region aus der chromosomalen DNA der Zelle unter Verwendung des üblichen Verfahrens [vergleiche zum Beispiel mit T. Maniatis, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab. (1982)], oder ein Verfahren zur Synthese einer cDNA aus der mRNA der Zellen unter Verwendung des üblichen Verfahrens [z. B. D. M. Glover, Hrsg., "DNA Cloning, Band 1", IRL Press (1985)], und der Clonierung des Gens der V-Region. Bei jedem dieser Verfahren kann als Sonde zur Clonierung des Gens der V-Region eine DNA-Sonde usw. verwendet werden, die unter Bezugnahme auf die Nucleotidsequenz eines Maus-Immunglobulingens synthetisiert wurde, das bereits beschrieben wurde [z. B. Sakano et al., Nature 286, S. 676 (1980); E. E. Max et al., J. Biol. Chem. 256, S. 5116 (1981)]. Die Clonierung kann auch über eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion) durchgeführt werden [R. Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833 (1989); W. D. Huse et al., Science 246, 1275 (1989)].
Das so clonierte Gen der V-Region wurde durch verschiedene Verfahren genetisch analysiert, wie z. B. einem Verfahren zur Herstellung eines chimären Antikörpers [Japanische Patent-Erstveröffentlichung Nr. 2-2352], oder einem Verfahren zur Herstellung eines umgestalteten Antikörpers [Japanische Patent-Erstveröffentlichung Nr. 62-296890]. Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass das Genfragment der vorliegenden Erfindung, das die V-Region eines Anti-HIV-Antikörpers codiert, dadurch charakterisiert ist, dass es als spezifische Gensequenz ein Gen enthält, das die folgenden Aminosäuren codiert:
(H-b):

(a) Glu-Tyr-Thr-Met-His
(b) Gly-Ile-Asn-Pro-Asn-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Tyr-Thr-Gln-Lys-Phe-Lys-Gly
(c) Pro-Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Ile-Asp-Ser

(a) Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Asp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Ser-Tyr-Met-Asn
(b) Ala-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser
(c) Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pro-Trp-Thr

3

4

3

4

Aufgrund der vorstehenden Nucleotidsequenzen, die durch die vorliegende Erfindung bereit gestellt werden, kann ein rekombinanter Antikörper mit einer neutralisierenden Wirkung gegen HIV hergestellt werden. Das bedeutet, dass ein gewünschter, rekombinanter Antikörper, d. h. ein umgestalteter Anti-HIV-Antikörper, hergestellt werden kann durch die Herstellung synthetischer DNAs usw. als Gen, das die variable Region eines solchen rekombinanten Antikörpers codiert, wobei (es sich bei der synthetischen DNA) um DNA-Fragmente handelt, die die vorstehenden Aminosäuresequenzen als komplementaritätsbestimmende Region codieren, und der Fusion dieser DNAs mit einem Gen, das ein menschliches Immunglobulin codiert. Der so hergestellte rekombinante Anti-HIV-Antikörper der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die komplementaritätsbestimmende Region der variablen Region der H-Kette die folgenden Sequenzen (CDR1 bis CDR3) enthält:
(H-B):
CDR1: Glu-Tyr-Thr-Met-His
CDR2: Gly-Ile-Asn-Pro-Asn-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Tyr-Thr-Gln-Lys-Phe-Lys-Gly
CDR3: Pro-Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Ile-Asp-Ser.
Der rekombinante Anti-HIV-Antikörper der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls dadurch gekennzeichnet, dass er als komplementaritätsbestimmende Region der variablen Region der L-Kette die folgenden Sequenzen (CDR1 bis CDR3) enthält:
(L-B):
CDR1: Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Asp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Ser-Tyr-Met-Asn
CDR2: Ala-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser
CDR3: Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pro-Trp-Thr.
Des Weiteren haben die vorliegenden Erfinder ebenfalls herausgefunden, dass bei der Herstellung eines umgestalteten Antikörpers, ein rekombinanter Antikörper erhalten werden kann, der die ursprüngliche Antikörperaktivität noch besser beibehält, indem neben dem Ersatz der komplementaritätsbestimmenden Regionen, eine Teilregion des Leserasters (FR), die an die komplementaritätsbestimmenden Regionen angrenzt, mit einer aus der Maus stammenden Sequenz ersetzt wird, statt nur die komplementaritätsbestimmenden Regionen alleine mit einer aus der Maus stammenden Sequenz zu ersetzen, wie bislang berichtet wurde.
Wenn die vorstehenden Sequenzen (H-B), die die komplementaritätsbestimmenden Regionen enthalten, als Gen mit variabler Region der H-Kette verwendet werden, kann ein umgestalteter Anti-HIV-Antikörper mit einer wesentlich besseren Aktivität hergestellt werden, was durch die Herstellung eines Gens mit variabler Region der H-Kette erfolgt, in dem eine Aminosäure am C-Terminus von FR1, die an die komplementaritätsbestimmende Region CDR1 angrenzt, in einer variablen Region Threonin (Thr) ist, eine zwei Aminosäuren lange Sequenz am C-Terminus von FR2, die an die CDR2 angrenzt, Ile-Gly ist, eine sechs Aminosäuren lange Sequenz am N-Terminus von FR3, die an die CDR2 angrenzt, Lys-Ala-Thr-Met-Thr-Val ist, und eine Aminosäure am C-Terminus von FR3, die an die CDR3 angrenzt, Threonin (Thr) ist.
Eine Nucleotidsequenz des so hergestellten Gens, das die variable Region eines Gens der H-Kette des umgestalteten Anti-HIV-Antikörpers der vorliegenden Erfindung codiert, und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz, umfasst als bevorzugtes Beispiel die in 11 gezeigten Sequenz (worin der unterstrichene Teil eine Aminosäuresequenz zeigt, die aus der Maus stammt). Andererseits umfasst eine Nucleotidsequenz, die die variable Region eines Gens der L-Kette des umgestalteten Anti-HIV-Antikörpers der vorliegenden Erfindung codiert, und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz, als bevorzugtes Beispiel die in 12 gezeigten Sequenz (worin der unterstrichene Teil eine Aminosäuresequenz zeigt, die aus der Maus stammt).
Andererseits umfasst bei der Herstellung eines chimären Anti-HIV-Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung, eine Nucleotidsequenz des Gens, das die variable Region einer H-Kette codiert, und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz, als bevorzugtes Beispiel die in 3 gezeigten Sequenz. Eine Nucleotidsequenz des Gens, das die variable Region einer L-Kette codiert, und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz, umfasst als bevorzugtes Beispiel die in 4 gezeigten Sequenzen.
Andererseits kann ein Gen für eine konstante (C) Region eines menschlichen Immunglobulingens für eine H-Kette und eine L-Kette, das zur Herstellung eines rekombinanten Anti-HIV-Antikörpers verwendet wird, auf die gleiche Weise isoliert werden, zum Beispiel aus einer, einen menschlichen Antikörper produzierenden Zelle. Da in einem Gen der C-Region keine Neuanordnungen (rearrangements) stattfinden, ist es zur Isolierung eines menschlichen Gens für die C-Region nicht nötig, eine menschliche antikörperproduzierende Zelle zu verwenden. Die Isolierung kann auf die gleiche Weise durchgeführt werden, wie die Isolierung eines Gens der V-Region der Maus, wie vorstehend erwähnt wurde. Ein Gen der C-Region ist nicht auf die γ1-Kette oder die κ-Kette beschränkt, sondern es kann jedes Gen der C-Region verwendet werden, wie z. B. eine μ-Kette, eine α-Kette, eine γ2-Kette, eine γ3-Kette eine γ4-Kette, eine ε-Kette oder eine λ-Kette. Wenn jedoch die Komplement-aktivierende Kapazität oder eine Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxität gewünscht wird, wird die γ1-Kette bevorzugt.
Das rekombinante Anti-HIV-Antikörpergen, d. h. sowohl das Gen der H-Kette als auch das Gen der L-Kette, können im Grunde durch die Kombination der vorstehend erwähnten beiden Genfragmente (Gen der V-Region und Gen der C-Region) konstruiert werden. Zum Beispiel kann die Konstruktion gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, das bereits durch Watanabe et al. beschrieben wurde [Watanabe et al., Cancer Research 47, S. 999–1005 (1987)], oder durch Verfahren, die durch M. Bruggemann [Waldmann H., (Hrsg.), Monoclonal Antibody Therapy, Prog. Allergy, Basel, Karger, 1988, Band 45, S. 91 ff.] oder durch S. L. Morrison [Advances in Immunology 44, 65 (1989)] beschrieben wurden. Ein Vektorsystem variiert in Abhängigkeit von dem zur Expression verwendeten Wirt, wie z. B. ein Tierzellen-Expressionssystem, ein E. coli-Expressionssystem oder ein Hefe-Expressionssystem, aber das Gen der vorliegenden Erfindung kann in jedem dieser Expressionssysteme exprimiert werden. Darüber hinaus kann auch ein Gen-Amplifikationssystem verwendet werden, wie z. B. DHFR.
Es wurde bestätigt, dass der so hergestellte rekombinante Antikörper der vorliegenden Erfindung eine neutralisierende Aktivität gegen HIV aufweist, und daher erlaubt die vorliegende Erfindung die Herstellung eines rekombinanten Anti-HIV-Antikörpers, der bislang noch nicht hergestellt wurde. Ein solcher rekombinanter Anti-HIV-Antikörper kann in einer AIDS-Klinik ein wirksames Mittel zur Behandlung von AIDS darstellen. Darüber hinaus offenbaren die Genfragmente, die die variable Region des Anti-HIV-Antikörpers codieren, der in der vorliegenden Erfindung bereit gestellt wird, eine spezifische Aminosäuresequenz oder eine Nucleotidsequenz einer variablen Region eines Antikörpers, der eine neutralisierende Wirkung gegen HIV besitzt, und erlauben die Entwicklung eines noch besseren rekombinanten Anti-HIV-Antikörpermoleküls durch Modifizierung oder teilweisen Ersatz eines gewünschten Antikörpermoleküls über die Anwendung von weiter fortgeschrittenen genetischen Rekombinationsverfahren.
Die beste Vorgehensweise zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird in Einzelheiten durch Beispiele erklärt, aber es sollte nicht so ausgelegt werden, dass sie die Erfindung einschränken. Zum Zwecke der Erläuterung betreffen die folgenden Beispiele auch den Antikörper μ39.1.
(1) Die Herstellung von Zellen, die den monoclonalen Maus-Antikörper produzieren
Nachstehend wird ein Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms beschrieben, das einen monoclonalen Anti-HIV-Maus-Antikörper produziert. Das Antigen zur Immunisierung umfasste ein synthetisches Peptid, das den Aminosäuresequenz-Nummern 303 bis 325 des Hüll-Glycoproteins gp120 des HTLV-IIIMN-Stammes entsprach (SP-1: YNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIG), und ein Peptid-KLH (Keyhole-Limpet-Hämocyanin)-Konjugat, das dieses synthetische Peptid gebunden an KLH umfasste, oder einen Viruspartikel, der aus dem Kulturüberstand von HTLV-IIIMN produzierenden Zellen (H9/HTLV-IIIMN) über Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation erhalten wurde, oder gp120, das durch Lyse der Zellen der H9/HTLV-IIIMN-Kultur mit 1% Triton X-100 und anschließende Reinigung durch Affinitäts-Chromatographie über eine ConA-Sepharose-4B-Säule und eine HIV-Antikörper(IgG)-Sepharose-4B-Säule erhalten wurde, oder die V3-Domäne (Aminosäuren 247–370) des HTLV-IIIMN-gp120-β-Galactosidase-Fusionsproteins, das durch Isolierung und Amplifikation eines DNA-Fragments über das PCR-Verfahren [G. I. LaRosa et al., Science 249, S. 932 (1990)] hergestellt wurde, das die V3-Domäne (Aminosäuren 247–370) des gp120 von HTLV-IIIMN codiert, und zwar aus hochmolekularer DNA (genomischer DNA) aus H9/HTLV-IIIMN-Zellen, und der Expression dieses DNA-Fragments in E. coli unter Verwendung des pUEX2-Expressionsvektors (hergestellt durch Amersham), oder eine Kombination dieser Antigene. Nach viermaliger Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit diesen Immunogenen wurden die Milzzellen entnommen und mit P3X63Ag8-U1X63-Maus-Myelomzellen [ATCC CRL 1597] unter Verwendung von Polyethylenglycol (Sigma) fusioniert, und die Clonierung wurde durchgeführt. Die Bindeaktivität der Antikörper im Kulturüberstand der erhaltenen Clone an die vorstehenden Immunogene wurde durch einen Enzym-Immuno-Testansatz gemessen. Für die als positiv bestimmten Clone wurden die Ergebnisse durch das Western-Blot-Verfahren und durch ein indirektes Fluoreszenzverfahren weiter bestätigt, um die Hybridome zu etablieren, die die monoclonalen Anti-HIV-Antikörper μ39.1 oder μ5.5 produzierten [Japanische Patentanmeldung Nr. 2-188300, Hinterlegungs-Nummern: μ39.1 (P-11471), μ5.5 (BP-3402)]. Diese Antikörper binden an das SP-1-Peptid und hemmen die Bildung von Syncytien zwischen HIV-infizierten Zellen und nicht infizierten CD4-positiven Zellen. Des Weiteren wurde die neutralisierende Aktivität dieser Antikörper ebenfalls durch einen Virus-Neutralisations-Test bestätigt, wobei diese Antikörper mit dem HIV-Virus gemischt und Zellen (H9) mit diesem Gemisch infiziert werden.
Zur Herstellung eines Gens der V-Region des rekombinanten Anti-HIV-Antikörpers der vorliegenden Erfindung, wie er hierin nachstehend beschrieben wird, wurden die Zellen verwendet, die diese monoclonalen Anti-HIV-Maus-Antikörper mit der neutralisierenden Aktivität herstellten (μ39.1-, μ5.5-Zellen).
(2) Isolierung eines Gens der V-Region eines Anti-HIV-Maus-Antikörpers
Die Isolierung eines variablen (V) Maus-Immunglobulingens wurde auf folgende Weise durchgeführt.
Die Gesamt-RNA wurde aus μ39.1- und aus μ5.5-Zellen gemäß dem herkömmlichen Verfahren extrahiert [D. M. Glover, Hrsg., "DNA Cloning, Band 1", IRL Press (1985)], und eine einzelstängige cDNA wurde unter Verwendung des cDNA-Synthese-Systems Plus (Amersham) synthetisiert. Unter Verwendung dieser Einzelstrang-cDNA als Matrize wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit DNA-Primern durchgeführt, die auf Grundlage der Nucleotidsequenzen der V-Region und der J-Region synthetisiert wurden, wie sie durch Kabat et al. klassifiziert wurden [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Ausgabe, Public Health Service, NIH, Washington, DC, 1987]. In den Primer in der V-Region und in den Primer in der J-Region wurde eine HindIII-, beziehungsweise eine BamHI-Schnittstelle eingeführt. Die PCR wurde gemäß den Vorschriften von CETUS durchgeführt. Das heißt, es wurden jeweils 100 pmol dieser Primer verwendet, und die Reagenzien für die PCR stammten aus dem von CETUS hergestellten Kit. Die PCR wurde über 25 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 72°C bestand. Nach der PCR wurden die erhaltenen DNA-Fragmente in die HincII-Schnittstelle von pUC18 cloniert (hergestellt durch Takara Shuzo; die in den Beispielen verwendeten Reagenzien wurden durch Takara Shuzo oder Toyobo hergestellt, sofern nicht anders erwähnt).
(3) Nucleotidsequenz des Gens der V-Region des Anti-HIV-Maus-Antikörpers
Unter Verwendung des durch Toyobo hergestellten Sequenase-Kits, Version 2, wurde das in pUC18 eingebaute Gen der V-Region sequenziert. Die so erhaltenen Nucleotidsequenzen von μ39.1 und μ5.5 werden in den 1 bis 4 gezeigt. Die aus den Nucleotidsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden ebenfalls in den 1 bis 4 gezeigt. Sowohl die Nucleotidsequenz von μ39.1 als auch die von μ5.5 weist die für ein Gen der V-Region spezifische Neuanordnung (rearrangement) auf und zeigt ein offenes Leseraster (ORF), das die Expression ermöglicht.
(4) Die Herstellung eines chimären Anti-HIV-Antikörpers
Um zu bestätigen, dass die Gene μ39.1 und μ5.5 der V-Region, die im vorstehenden Beispiel (2) isoliert wurden, tatsächlich Gene darstellen, die eine V-Region codieren, welche für die Anti-HIV-Aktivität verantwortlich ist, wurde ein chimärer Maus-Mensch-Antikörper hergestellt. Zur Expression eines chimären Antikörpers wurden der Expressionsvektor HCMV-κ, beziehungsweise HCMV-γ1 verwendet, die den Verstärker (enhancer) und den Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (HCMV) enthalten [N. Whittle et al., Protein Engineering 1, 409 (1987)]. HCMV-κ enthält ein menschliches Gen für die konstante Region der κ-Kette, und HCMV-γ1 enthält ein menschliches Gen für die konstante Region der γ1-Kette. Das durch das vorstehende Verfahren (2) hergestellte Gen μ39.1 der V-Region wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI verdaut, und die VH- und die VL-Fragmente wurden in die HindIII-BamHI-Schnittstellen von HCMV-γ1, beziehungsweise HCMV-κ eingebaut. Die 5 und 6 zeigen die Struktur der Expressionsvektoren (CHμ39.1, beziehungsweise CLμ39.1) mit den chimären μ39.1-Antikörpergenen. In ähnlicher Weise wurden die Gene der VH- und der VL-Region von μ5.5 in HCMV-γ1 und HCMV-κ eingebaut (CHμ5.5, beziehungsweise CLμ5.5, vergleiche mit 5 und 6).
(5) Die Expression des chimären Anti-HIV-Antikörpers
Die Aktivität, welche die Antikörper aufweisen, der von dem chimären μ39.1- oder dem μ5.5-Antikörpergen (codiert werden), die wie vorstehend erwähnt konstruiert worden waren, wurde in einem transienten Expressionssystem unter Verwendung von COS7-Zellen [ATCC CRL 1651] untersucht. Unter Verwendung eines Elektroporationgeräts, das von Bio-Rad hergestellt wird, wurde ein Gemisch von CHμ39.1- und CLμ39.1-Plasmid-DNAs oder ein Gemisch von CHμ5.5- und CLμ5.5-Plasmid-DNAs gemäß der Vorschrift von Bio-Rad in COS7-Zellen eingebracht, und die Zellen wurden in DMEM-Medium angezogen, das mit 10% fötalem Kälberserum (GIBCO) ergänzt worden war. Nach drei Tagen wurde der Kulturüberstand gesammelt, und die Aktivität der in dem Kulturüberstand vorliegenden Antikörper wurde durch ELISA unter Verwendung von Anti-Mensch-IgG oder des SP-1-Antigen-Peptids gemessen. Wie in 7 als Ergebnis gezeigt wird, banden beide Expressionsprodukte aus dem Gemisch der CHμ39.1- und CLμ39.1-Plasmid-DNAs und aus dem Gemisch der CHμ5.5- und CLμ5.5-Plasmid-DNAs das SP-1-Peptid. Somit wurde bestätigt, dass die Gene μ39.1 und μ5.5 der V-Region, die in dem Verfahren (2) isoliert worden waren, tatsächlich Gene darstellen, die die V-Regionen von Antikörpern codieren, die eine Anti-HIV-Aktivität aufweisen.
(6) Die Herstellung eines umgestalteten Anti-HIV-Antikörpers
Um zu untersuchen, welcher Teil der VH- oder der VL-Region der clonierten μ39.1- oder μ5.5-(Antikörpergene) für die Bindung an ein Antigen wichtig ist, wurden die CDR(komplementaritätsbestimmenden)-Regionen von μ39.1 und μ5.5 in menschliche V-Regionen transplantiert. Dies wurde gemäß dem Verfahren zur Herstellung eines umgestalteten Antikörpers durchgeführt [Japanische Patent-Erstveröffentlichung Nr. 62-296890]. Die CDR-Regionen der VH-Regionen von μ39.1 und μ5.5 wurden in die VH-Region mit einer Grundgerüst(FR)-Region der menschlichen Untergruppe I [SGI: bereitgestellt von Dr. Bendig aus dem MRC Collaborative Center, England] (8 und 10) transplantiert, wohingegen die CDR-Regionen der VL-Region von μ39.1 und μ5.5 in eine VL-Region transplantiert wurden, die eine FR-Region der menschlichen κ-Kette [REI: W. Palm und N. Hilschmann, Z. Physiol. Chem. 356, 167 (1975)] (9 und 11) besaß. Spezifisch wurde ein umgestalteter Antikörper durch ein Amersham-PCR-Verfahren hergestellt, das einen Amersham-Kit (Oligonucleotid-gesteuertes in vitro-Mutagenese-System, Version 2, Code RPN 1523) mit einer PCR [Saiki, R. G. et al., Science 239, 487, (1988)] kombiniert. Ein langkettiges Nucleotid, das den Abschnitt codierte, der aus der VH- oder der VL-Region von μ39.1 oder von μ5.5 transplantiert werden sollte, wurde an M13- DNA angelagert, in der die Gene der V-Region von SGI oder von REI eingebaut worden waren, und dann wurde eine Strangverlängerung und Bindung (Anlagerung) der DNA in einer Lösung durchgeführt, die dCTPαS enthielt. Die M13-Matrizen-DNA wurde mit NciI gespalten, und die Matrizen-DNA wurde mit Exonuclease III verdaut, um nur die mutierte M13-DNA zu erhalten (bis zu diesem Zeitpunkt wurde das Verfahren gemäß der Amersham-Vorschrift durchgeführt). Dann wurde, unter Verwendung des Produkts nach dem Exonuclease III-Verdau als Matrize, eine PCR unter Verwendung eines universellen Primers (UP: dieser Primer enthält eine Sequenz, die zur 5'-Seite von M13mp18 komplementär ist) und eines reversen Primers (RSP: dieser Primer enthält die gleiche Sequenz als 3'-Seite von M13mp18) durchgeführt. Es wurden jeweils 20 pmol dieser Primer verwendet, und die Reagenzien für die PCR stammten von CETUS. Die PCR wurde über 25 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 74°C bestand. Nach Beendigung der PCR wurden die Produkte mit BamHI/HindIII verdaut, und die verdauten Produkte wurden in die BamHI/HindIII-Schnittstellen von pUC18 eingebaut, das zur Transformation von DH5α (BRL) verwendet wurde. Zur ersten Durchmusterung wurde eine Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung der CDR-Primer durchgeführt, die zur Mutagenese gemäß der Vorschrift des Amersham-Kits verwendet worden waren, um Clone zu selektieren, die in der CDR erfolgreich mutagenisiert worden waren. Dann wurde zur zweiten Durchmusterung das Plasmid aus den Clonen hergestellt, die bei der ersten Durchmusterung erhalten worden waren, und mit dem Sequenase-Kit (Toyobo) wurde eine Sequenzierung durchgeführt, um die korrekte Transplantation der CDR zu bestätigen. Auf diese Weise wurden umgestaltete V-Regionen von μ39.1 oder μ5.5 erhalten (RHμ39.1, RLμ39.1, beziehungsweise RHμ5.5, RLμ5.5; vergl. mit 8 bis 11). Wie bei der Herstellung eines chimären Antikörpers nach dem Verfahren (4), wurden diese umgestalteten Fragmente der V-Region mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI verdaut, und die VH- und die VL-Fragmente wurden in die HindIII-BamHI-Schnittstellen von HCMV-γ1, beziehungsweise HCMV-κ eingebaut. Somit wurden die Expressionsvektoren (RHμ39.1 und RLμ39.1) mit dem umgestalteten μ39.1-Antikörpergen und die Expressionsvektoren (RHμ5.5 und RLμ5.5) mit dem umgestalteten μ5.5-Antikörpergen hergestellt.
(7) Die Expression der umgestalteten Anti-HIV-Antikörper
Die Aktivität der Antikörper, die von diesen umgestalteten μ39.1- oder μ5.5-Antikörpergenen erhalten wurde, wurde in dem vorstehend erwähnten transienten Expressionssystem unter Verwendung von COS7-Zellen untersucht. Wie bei dem Verfahren (5) wurde ein Kulturüberstand der Zellen gesammelt, in die das Gen eingebracht worden war, und die Aktivität der Antikörper, die in dem Kulturüberstand vorlagen, wurde über ELISA unter Verwendung von Anti-Mensch-IgG oder des SP-1-Peptids gemessen. Wie in 7 als Ergebnis gezeigt wird, banden beide Expressionsprodukte aus dem Gemisch der RHμ39.1- und RLμ39.1-Plasmid-DNAs und aus dem Gemisch der RHμ5.5- und RLμ5.5-Plasmid-DNAs das SP-1-Peptid. Demgemäß wurde bestätigt, dass in den Aminosäuresequenzen von μ39.1 und von μ5.5, wie in den 9 bis 12 gezeigt wird, die transplantierten CDR-Regionen die wichtigsten Regionen für die Ausübung einer Anti-HIV-Aktivität darstellen. Mit diesem Ergebnis wurde bestätigt, dass die Gene, die diese Regionen codieren, sehr nützliche Gene zur Herstellung eines rekombinanten Anti-HIV-Antikörpers sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Genetisch rekombinante, umgestaltete anti-HIV-Antikörperkette, umfassend eine Aminosäuresequenz abgeleitet von einem Maus-Antikörper und eine Aminosäuresequenz abgeleitet von einem menschlichen Antikörper, wobei diese genetisch rekombinante, umgestaltete anti-HIV-Antikörperkette eine neutralisierende Aktivität gegen menschlichen Immun-Schwäche-Virus (HIV) besitzt, dadurch gekennzeichnet, dass die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR1 bis CDR3) die folgenden Aminosäuresequenzen besitzen: (a) CDR1: Glu-Tyr-Thr-Met-His CDR2: Gly-Ile-Asn-Pro-Asn-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Tyr-Thr-Gln-Lys-Phe-Lys-Gly CDR3: Pro-Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Ile-Asp-Ser wobei diese Antikörperkette eine H-Kette ist und wobei eine Aminosäure am C-Terminus von FR1, die angrenzt an die komplementaritätsbestimmende Region CDR1 in einer variablen Region, Threonin (Thr) ist, eine Zwei-Aminosäuresequenz am C-Terminus von FR2, die angrenzen an CDR2, Ile-Gly ist, eine Sechs-Aminosäuresequenz am N-Terminus von FR3, die angrenzen an CDR2, Lys-Ala-Thr-Met-Thr-Val ist und eine Aminosäure am C-Terminus von FR3, die angrenzt an CDR3, Threonin (Thr) ist; oder (b) CDR1: Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Asp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Ser-Tyr-Met-Asn CDR2: Ala-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser CDR3: Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pro-Trp-Thr wobei die Antikörperkette eine L-Kette ist.
Rekombinante anti-HIV-Antikörper-H-Kette nach Anspruch 1(a), wobei eine gesamte Aminosäuresequenz einer variablen Region eine Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 118 im Sequenzprotokoll: SEQ ID NO: 7 ist.
Rekombinante Anti-HIV-Antikörper L-Kette nach Anspruch 1(b), wobei eine gesamte Aminosäuresequenz einer variablen Region eine Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 111 im Sequenzprotokoll: SEQ ID NO: 8 ist.
Rekombinanter, umgestalteter anti-HIV-Antikörper, umfassend die rekombinante umgestaltete anti-HIV-Antikörper H-Kette nach Anspruch 1(a) und die rekombinante umgestaltete anti-HIV Antikörper-L-Kette nach Anspruch 1(b).
DNA-Fragment, codierend für eine variable Region einer H- oder L-Kette oder ein Teil davon, wobei die H- oder L-Kette in einem der Ansprüche 1 bis 3 weiter definiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines umgestalteten anti-HIV-Antikörpers, umfassend Konstruktion eines Expressionsvektors unter Verwendung eines DNA-Fragmentes, das die variable Region der H-Kette nach Anspruch 1(a) oder 2 codiert, und eines DNA-Fragments, das die variable Region der L-Kette nach Anspruch 1(b) oder 3 codiert, und von DNA-Fragmenten, die menschliches Immunglobulin codieren, wobei der Expressionsvektor die Expression eines rekombinanten Antikörpers erlaubt, wobei zumindest die komplementaritätsbestimmenden Regionen eine Aminosäuresequenz haben, die von einem Maus-Antikörper abgeleitet ist, Expression der rekombinanten DNA in einer Tierzelle und Sammeln des Antikörpers.
Arzneimittel umfassend mindestens eine umgestaltete anti-HIV- Antikörperkette nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder den rekombinanten, umgestalteten anti-HIV-Antikörper nach Anspruch 4.
Diagnostische Zusammensetzung umfassend mindestens eine umgestaltete anti-HIV-Antikörperkette nach einem der Ansprüche 1 bis 3, den rekombinanten, umgestalteten anti-HIV-Antikörper nach Anspruch 4 oder mindestens ein DNA-Fragment nach Anspruch 5.
Vektor, umfassend ein DNA-Fragment nach Anspruch 5.
Wirtszelle, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 9.