CN102212133B - 人源HIV抗体的Fab片段及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人源HIV抗体的Fab片段及其编码基因与应用。该抗体的Fab片段，由抗体的重链的可变区V_H和恒定区亚单位C_H1和抗体的轻链组成，所述轻链由可变区V_L和恒定区C_L组成，所述V_H和V_L均由决定簇互补区(CDRs)和框架区(FrameworkRegion，FRs)组成，所述决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成，所述V_L的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列2的第27-32位所示、如序列2的第50-52位所示，如序列2的第89-98位所示，所述V_H的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列3的第26-33位所示、如序列3的第51-58位所示，如序列3的第97-116位所示。该Fab片段及其编码基因制备不同形式的基因工程抗体，以用于制备治疗、预防和诊断HIV感染和艾滋病的药物、疫苗以及诊断试剂。

Description

人源HIV抗体的Fab片段及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种人源HIV抗体的Fab片段及其编码基因与应用。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)简称艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起以T细胞免疫功能缺陷为主的综合征。自1981年发现艾滋病以来，全球感染人群超过6000万，其中约2500万已经死亡。新的感染人数和死亡人数逐年增加。据WHO估计，现在每天就有1.6万新发感染；推测十年后大约有1亿人感染，这无疑将是人类社会的一大灾难。我国HIV感染已从播散期进入快速增长期，现有感染者约70万人，其中艾滋病病人8万余例。在云南、河南、新疆等省份，HIV感染已出现流行趋势。虽然目前我国HIV感染者占总人口的比例很低，但绝对感染人数在亚洲居第二位，在全球居第十四位(WHO)。因此，大力开展艾滋病防治已成为当务之急。如果防治措施不力，必将对我国的人口健康和社会发展产生巨大的影响。疫苗是预防“世纪瘟疫”艾滋病的最好的手段，但二十多年来，还没有一个HIV疫苗的临床方案被证明有效。在今后相当长的一段时期内，有效的HIV疫苗恐难有重大突破。抗AIDS药物的开发对于人类的健康与社会的发展有着重要意义。随着高效逆转录疗法(highly activeanti-retroviral therapy，HAART)，也称鸡尾酒疗法引入艾滋病的治疗以来，HIV-1感染者的预期寿命得到延长。然而，HIV-1并不能被彻底地从病人的免疫系统中清除，病人必须终身用药。由于HIV-1基因组为RNA，病毒不断产生变异，在药物的选择压力下，产生大量耐药毒株，导致已有的用药方案失去作用。此外，长期用药对病人会产生严重的毒副作用，并给其带来沉重的经济负担。目前的形势下，有效的抗AIDS药物，尤其是抗现有耐药株药物的开发也十分迫切。因此，大力研究HIV-1感染以及诱导机体免疫应答的分子机制，尤其是HIV中和抗体的产生机制及其在艾滋病治疗、预防以及诊断中的应用，是当前重大的科学问题。

HIV-1进入靶细胞的过程主要由包被糖蛋白gp160介导。该蛋白由表面亚基gp120和跨膜亚基gp41通过非共价键连接。在天然状态下，gp160为三聚体，其中三分子的gp120形成一个球状复合物，而三分子gp41则象三个脚，插入病毒包膜内。在HIV感染靶细胞过程中，gp120主要功能是与受体CD4分子和辅助受体(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)结合，而gp41分子主要介导病毒和细胞的膜融合。HIV包膜蛋白不但介导病毒感染靶细胞的过程，同时也是诱导中和抗体反应的关键蛋白。艾滋病疫苗失败的一个主要的原因是以往所设计的各种疫苗免疫原都不能诱导有效的HIV中和抗体。深入研究HIV感染免疫应答的分子基础，尤其是中和抗体的分子机制，并据此改造免疫原以诱导中和抗体，是当前艾滋病疫苗设计的重点策略。尽管HIV自然感染不能诱导保护性免疫，但一些感染者的血清(多克隆抗体)却具有中和不同亚型的广谱中和活性，说明HIV本身具有保守的中和抗体表位。过去几年对先前分离的几个广谱中和单克隆抗体(b12，2G12，2F5，4E10)进行了结构解析，证实它们识别包膜蛋白gp120或gp41上相对保守的抗原结构，主要阻断受体结合和膜融合过程。因此，HIV中和抗体也被认为是“天然的”的病毒进入抑制剂，动物攻毒实验和病人治疗的临床实验皆证实被动免疫具有显著的预防和治疗效果。因此，深入研究HIV中和抗体免疫应答的分子机制，筛选和设计可以诱导中和抗体的疫苗抗原，具有极其重要的理论意义和应用价值。

目前已知的中和抗体都是针对包膜蛋白。如单克隆抗体IgG-b12和2G12作用于包膜蛋白的gp120亚基，可以阻断病毒与受体的结合，而4E10和2F5则作用于gp41亚基，主要是通过阻断病毒细胞膜融合过程而发挥中和作用。由于近年艾滋病疫苗研究的不断失败，国际社会对HIV中和抗体的研究投入极大的热情，期望通过分离和鉴定新的病毒中和抗体，解析它们的作用抗原表位，为设计艾滋病疫苗提供新线索。比如，近期发现了具有很好病毒中和活性的人源单克隆抗体VRC01、VRC02、VRC03、PG9和PGI6等。广谱高效的HIV中和抗体不但可以指导疫苗设计，而且具有可能的治疗和预防作用，对HIV感染的诊断也具有重要的意义。

HIV具有高度变异性，造成多种亚型(Subtypes)和重组型(CRF)在世界不同地区的流行。先前的几个HIV广谱中和抗体都是从B亚型感染者分离鉴定，最近分离的广谱中和抗体p9和p16来源于非洲A亚型感染者(Science，2009)。然而，目前发现的HIV广谱中和抗体仅是少数，介导血清中和活性的大部分抗原表位有待鉴定(Nature，2009)。在我国流行着多种HIV亚型，特别是BC和AE重组型已成为主要的流行毒株，仅国内特有的CRF-BC既占50％以上。因此，我国临床试验或研发中的艾滋病疫苗主要针对BC和AE重组型HIV毒株。最近，我们观察了国内HIV流行毒株对广谱中和抗体的敏感性，结果发现测试的多数CRF-BC和CRF-AE毒株对广谱中和抗体b12，2G12和2F5具有显著的抗性(Resistance)，但可以被感染者的血清有效中和，提示BC和AE重组型病毒含有特殊的中和表位结构。为此，我们提出的科学问题是：CRF-BC和CRF-AE中和抗体的分子机制是什么？回答这一问题不但是HIV感染基础免疫学的重要课题，而且对艾滋病疫苗的研发至关重要。而分离和鉴定新的HIV中和性单克隆抗体正是回答这一科学问题的重要手段，有助于突破艾滋病疫苗研发和免疫治疗的科学瓶颈。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种人源抗艾滋病病毒(HIV)基因工程抗体及其编码基因与应用。

本发明所提供的人源抗艾滋病病毒(HIV)基因工程抗体是抗体的Fab片段，它由抗体的重链的Fd片段和抗体的轻链组成，所述轻链由可变区V_L和恒定区C_L组成，所述重链Fd片段由可变区V_H和恒定区亚单位C_H1组成，所述V_H和V_L均由决定簇互补区(CDRs)和框架区(Framework Region，FRs)组成，所述决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；其中，所述V_L的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列3的第27-32位所示、如序列3的第50-52位所示，如序列3的第89-98位所示，所述V_H的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列4的第26-33位所示、如序列4的第51-58位所示，如序列3的第97-116位所示。

所述抗体的Fab片段中，所述V_H和V_L的框架区可均来源于人。

所述V_H的氨基酸序列具体可如序列表中序列4的第1-125位所示；所述V_L的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第1-107位所示。

所述C_L和所述C_H1均可来源于人。

所述抗体重链的Fd片段的氨基酸序列具体可如序列表中的序列4所示；所述轻链的氨基酸序列具体可如序列表中的序列3所示。其中，序列表中的序列3和序列4分别由214和239个氨基酸残基组成。含有所述抗体的Fab片段的IgG，将所述抗体的Fab片段的V_H和V_L连接得到的单链抗体也属于本发明的保护范围。

下述1)或2)的编码基因也属于本发明的保护范围：

1)所述抗体的Fab片段的编码基因；

2)所述衍生抗体的编码基因。

其中，所述1)的编码基因具体可为如下A)-E)中任一所述的DNA分子，所述2)的编码基因具体可为如下A)、B)、F)或G)中任一所述的DNA分子

A)所述V_L的CDR1的编码序列如序列表中序列1的第79-96位所示，所述V_L的CDR2编码序列如序列表中序列1的第148-156位所示，所述V_L的CDR3的编码序列如序列表中序列1的第265-294位所示，所述V_H的CDR1的编码序列如序列表中序列1的第76-99位所示，所述V_H的CDR2的编码序列如序列表中序列1的第151-174位所示，所述V_H的CDR3的编码序列如序列表中序列1的第289-348位所示；

B)所述V_H的编码序列如序列表中序列2的第1-375位所示；所述V_L的编码序列如序列表中序列1的第1-321位所示；

C)所述Fab片段的Fd片段的编码序列如序列表中序列2所示，所述Fab片段的轻链的编码序列如序列表中序列1所示；

D)在严格条件下与A)或B)或C)限定的DNA序列杂交且编码所述抗体的Fab片段的DNA分子；

E)与A)或B)或C)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述抗体的Fab片段的DNA分子；

F)在严格条件下与A)或B)限定的DNA序列杂交且编码所述衍生抗体的DNA分子；

G)与A)或B)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述衍生抗体的DNA分子。

其中，序列表中的序列1由642个脱氧核苷酸组成，序列表中的序列2由717个脱氧核苷酸组成。

含有上述编码基因的重组载体、重组细胞、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可为将上述编码基因插入pComb3XSS的多克隆位点得到的重组载体。

实验证明上述抗体的Fab片段或其编码基因可用于制备抑制HIV假病毒感染的产品；说明上述抗体的Fab片段或其编码基因、上述衍生抗体或其编码基因可用于制备HIV疫苗。

所述HIV疫苗具体可为HIV-1疫苗。

本发明采用噬菌体抗体展示技术，从我国B/C重组型HIV感染者分离HIV包膜蛋白特异性人源单克隆Fab抗体，命名为HY498，它具有特殊的序列结构，可以与多种亚型的HIV包膜蛋白结合，对HIV具有很强的中和活性。可利用该抗体的CDR区或Fab或IgG全抗体基因，可在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和真核细胞及任何表达系统中制备不同形式的基因工程抗体，以用于制备治疗、预防和诊断HIV感染和艾滋病的药物、疫苗以及诊断试剂。

附图说明

图1为HY498对HIV毒株SF162的中和活性。

图2为HY498与多种HIV抗原的免疫反应性。

图3为HY498对gp120二硫键和糖链的依赖性分析。

图4为HY498与CN54-gp120突变体的反应性。

图5为HY498与多个已知抗体的竞争抑制实验。

图6为噬菌体肽库阳性克隆的ELISA筛选。

具体实施方式

本发明运用噬菌体表面呈现技术，从中国新疆地区一B/C重组亚型HIV感染者获得外周血淋巴细胞，通过基因工程技术构建了人源抗HIV基因工程抗体文库，并从中筛选获得特异性抗HIV基因工程Fab抗体HY498，获得该抗体基因及其在原核细胞中的表达，表位分析表明该抗体作用于HIV包膜蛋白的受体结合部位，具有对HIV感染的中和活性。

HY498是一种人源的在原核细胞中获得稳定表达的重组IgG Fab功能性片段，可特异性结合HIV的包膜蛋白，对HIV感染具有中和活性。该抗体作用于病毒包膜蛋白的受体结合区。

HY498特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗HIV抗体基因库的特异性筛选获得，相应的三个决定簇互补区域(Complementarity-Determining Regions，CDRs)CDR1、CDR2和CDR3为该抗体特有的全新序列，见后面所附抗体基因序列。HY498抗体重链隶属于家族VH1(IGHV1-18*01)，抗体轻链隶属于家族VL1(IGKV1-39*01)。

本发明所提供的人源抗艾滋病病毒(HIV)基因工程抗体是抗体的Fab片段HY498，其抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定簇互补区域(CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。换言之，其轻链和重链可变区相应的三个CDR区序列组合及其CDR之间的框架区(Frame Region，FRs)序列组成了每个抗体可变区特征。HY498重链的CDR1、CDR2和CDR3序列分别为：GYTFNSNG、ISGHSDET和ARSLLRSLERLMGGTDAFDI，轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列分别为：QSISSY、AAS和QQSYSTPRTF。

HY498的Fd片段的核苷酸如序列表中序列2所示，HY498的轻链的编码序列如序列表中序列1所示；

HY498的Fd片段的氨基酸序列如序列表中的序列4所示；HY498的轻链的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。

根据HY498可变区中特异性核苷酸或氨基酸序列，可在体外人工合成与此相同或接近的核苷酸序列或编码相同氨基酸的核苷酸序列，从而可以获得相同的抗体基因或用于相关基因的改造；利用上述获得的HY498基因，可在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和真核细胞及任何表达系统中制备不同形式的基因工程抗体，或以此为基础进行改建而获得含有该抗体基因的其他基因，从而获得类似于HY498具有结合并中和HIV的抗体产物。

以下的优选实施例对本发明作详细说明，但不意味着限制本发明的内容。下述实施例中的实验方法，为说明本发明，采用的材料与试剂包括：噬菌体表达载体为pComb3XSS、pComb3XTT，见由Barbas等人编著的《Phage Display-A LaboratoryManual》一书的第9章(Carbos F.Barbas III，Dennis R.Burton，Jamie K.Scott，Gregg J.Siverman.Phage Display-A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.NewYork)。所用辅助噬菌体为VCSM13(美国Stratagene公司Cat No：200251-81)；菌株为XLI-Blue(Stratagene公司Cat No：200228)；mRNA分离试剂盒(Invitrogen公司PartNo：45-0019)；第一链合成试剂盒(Invitrogen公司SuperScriptTM II First-StrandSynthesis System for RT-PCR Cat No：11904-18)；PCR扩增试剂

PCRSuperMix High Fidelity(Invitrogen公司Cat No：12532)；胶回收试剂盒QIAquick GelExtraction kit(QIAGEN Cat No：28706)；内切酶Sfi I(Roche公司Cat No：1288059)；T4连接酶(New England Biolab公司Cat No：M0202)；胰酶(Sigma Cat No：T7409)；酶标抗人Fab二抗(Sigma Cat No：A0293)；酶标抗HA二抗(Sigma Cat No：H6533)；TMB底物(Sigma Cat No：T0440)；核酸酶(Novagen公司Cat No：70746-3)；镍填料Ni-NTA Superflow(GE公司Cat No：17-5318-02)；蛋白G(GE公司)；肽噬菌体展示文库(美国New England Biolab公司，Cat No：E8110S)；HRP标记抗M13抗体(SinoBiological Inc，Cat No：11973-MM05)。HIV骨架质粒pSG3^ΔENV(表达HIV基因组中除ENV之外的所有蛋白)由美国国立卫生研究院NIH AIDS Research and ReferenceReagent Program提供(Cat No：11051)；用于制备HIV假病毒表达SF162的包膜蛋白编码质粒见He等发表的文献(He Y，Honnen W，Krachmarov C，Kayman S，Corvalon J，Pinter A.Efficient isolation of novel human monoclonal antibodies with neutralizingactivity against HIV-1 from transgenic mice expressing human Ig loci.Journal ofImmunology，2002；169：595-605)；用于制备HIV假病毒表达HXB2的包膜蛋白编码质粒见He等发表的文献(He Y，Liu S，Li J，Lu H，Qi Z，Liu Z，Debnath AK，Jiang S.Conserved Salt-bridge between the N-and C-Terminal Heptad Repeat Regions of HIV-1gp41 Core Structure Is Critical for Virus Entry and Inhibition.Journal of Virology，2008；82(22)：11129-11139)。

实施例1为HY498的筛选和制备方法；实施例2为HY498对HIV的中和活性；实施例3-5为HY498的反应活性；实施例6为HY498表位模拟肽的筛选和表位分析。

实施例1、人源抗HIV抗体的Fab片段的制备

一、人源抗HIV抗体的Fab片段的基因序列和氨基酸序列的获得

1、噬菌体抗体库的构建

建库技术主要参考Barbas等所介绍的方法(Carbos F.Barbas III，Dennis R.Burton，Jamie K.Scott，Gregg J.Siverman.Phage Display-A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.New York)，如抗体基因的引物设计及PCR扩增、噬菌体表达载体的制备等。首先进行人源IgG Fab段基因的PCR扩增。其步骤是：采用淋巴细胞分离液从HIV感染者分离外周血单核淋巴细胞(PBMC)，以mRNA分离试剂盒提取总细胞RNA，然后以第一链合成试剂盒的Oligo-dT引物将提取的RNA经逆转录制备成cDNA。用一组第一轮PCR引物以cDNA为模板扩增重链和轻链的可变区基因，PCR条件为：94℃15秒，56℃15秒，72℃90秒，30个循环。同时，以一套PCR引物以pComb3XTT为模板分别扩增抗体重链恒定区基因C_H1片段和轻链恒定区基因C_к片段。上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收，以DNA纯化试剂盒QIAquick^TM kit(德国QIAGEN公司)纯化后获得第一轮PCR产物。随后，用第二轮PCR引物分别对重链可变区(VH)和恒定区(C_H1)基因、轻链可变区(VL)和恒定区(C_к)基因进行连接，PCR条件为：94℃15秒，56℃15秒72℃2分钟，20个循环。如此VH和C_H1连接后产生重链的Fd片段(其中，HY498的Fd片段的核苷酸序列如序列表中的序列2所示)，VL和C_к连接后产生轻链(其中，HY498的轻链的核苷酸序列如序列表中的序列1所示)。第二轮PCR产物经琼脂糖凝胶回收，以DNA纯化试剂盒QIAquick^TM kit(德国QIAGEN公司)纯化。再用第三轮PCR引物对重链和轻链基因进行连接，PCR条件为：94℃15秒，56℃15秒72℃3分钟，20个循环。PCR产物经DNA纯化试剂盒(QIAquick^TM kit)回收后获得1.5Kb左右的Fab基因片段。将Fab片段和载体pComb3XSS均用Sfi I酶切后经QIAquick kit回收。将Fab酶切回收产物和载体pComb3XSS酶切回收的3.3Kb片段通过T4连接酶进行连接，得到连接产物pComb3XSS-Fab。连接产物经乙醇沉淀后用15μl蒸馏水重悬，电转导入300μl的XLI-Blue感受态中(电转条件：Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5K伏电压)。电转后用5ml SOC培养基37℃250rpm转摇1小时，加入10ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基并于37℃250rpm转摇2小时，加入183ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基和2ml滴度为10¹²pfu/ml的辅助噬菌体VCSM13，于37℃300rpm转摇2小时后加入卡那霉素至70μg/ml，置37℃300rpm转摇过夜。次日，于3000g离心15分钟后上清用4％PEG8000和3％NaCl沉淀，经15000g4℃离心15分钟后用2ml含1％BSA的TBS缓冲液(pH 7.4)重悬沉淀，全速离心5分钟，上清过滤分装保存-80℃冰箱中。

2、噬菌体抗体库的特异性富集和筛选

用于噬菌体抗体库的特异性富集和筛选的抗原为真核表达的重组HIV gp120蛋白，来自B/C重组型HIV-1病毒株CN54(简称为CN54-gp120)。用50μl 0.1M NaHCO₃(pH8.6)溶液包被CN54-gp120蛋白于酶标板微孔中，每孔0.5μg，于4℃过夜；次日，用150μl 3％BSA 37℃封闭1小时，弃封闭液，每孔加入50μl新鲜噬菌体抗体库，37℃孵育2小时，弃去未结合噬菌体，用0.5％TBST冲洗5次(第二次10次、第三、四次各15次)，每次冲洗用移液器吹打10-20次，吸净液体后每孔加入50μl 10mg/ml胰酶TBS溶液，37℃孵育30分钟，将洗脱的噬菌体加入2ml新鲜制备的XLI-Blue菌液(OD₆₀₀＝1)中，室温孵育15分钟，加入6ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基，于37℃250rpm转摇2小时，加入91ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基和1ml滴度为10¹²pfu/ml的辅助噬菌体VCSM13，再于37℃300rpm转摇2小时后加入卡那霉素至终浓度70μg/ml，37℃300rpm转摇过夜。于3000g离心15分钟后，上清用4％PEG8000和3％NaCl沉淀，经15000g于4℃离心15分钟后用2ml含1％BSA的TBS(pH7.4)重悬沉淀，全速离心5分钟，上清过滤保存，取50μl加入已包被CN54-gp120蛋白的酶标板中，如此反复富集4次。

3、HIV特异性Fab抗体的小量诱导表达和检测

将4次富集的噬菌体稀释10⁶、10⁷、10⁸倍后各取1μl加入50μl新鲜制备的XLI-Blue菌液，室温感染15分钟，涂氨苄抗性LB板。第二天选择合适菌落密度的板挑取单克隆菌落，每个单克隆菌落加入到2ml含氨苄青霉素的SB培养基中，于37℃300rpm转摇6小时，每管中取0.2μl菌液在氨苄抗性LB板上保菌，然后各加入8μl0.5M IPTG，37℃300rpm转摇过夜。次日离心取上清进行ELISA检测。具体步骤是，将CN54-gp120以1μg/ml浓度用100μl 0.1M NaHCO₃(pH8.6）溶液包被，4℃过夜。第二天用200μl 3％BSA 37℃封闭1小时，弃封闭液，用0.05％PBS-T洗一遍，加入100μl过夜诱导的细菌上清，37℃孵育1小时，0.05％PBS-T洗三遍。加入100μl酶标抗人Fab二抗(1∶30000稀释)，37℃孵育1小时，以0.05％PBS-T洗三遍。用TMB显色30分钟，2M H₂SO₄终止，酶标仪检测吸光度A值。

4、人源抗HIV抗体的Fab片段的核酸序列和氨基酸序列分析

从保菌板上挑取阳性克隆相应的菌落，用QIAGEN Miniprep Kit质粒提取试剂盒提取质粒DNA进行核苷酸序列测序。测序为自动测序，轻链测序引物为5’-AAGACAGCTATCGCGATTGCAG-3，重链测序引物为5’-ACCTATTGCCTACGGCAGCCG-3’。将获得的序列进行分析，并与Internet网络上基因库中的IgG序列比对，证实HY498为人源特异性Fab抗体，具有特有的轻链和重链基因可变区序列。

HY498的Fd片段的编码序列如序列表中序列2所示，HY498的轻链的编码序列如序列表中序列1所示；其中序列表中序列2的第1-375位为V_H的编码序列；序列表中序列1的第1-321位为V_L的编码序列；其中，V_L的CDR1的编码序列如序列表中序列1的第79-96位所示，V_L的CDR2编码序列如序列表中序列1的第148-156位所示，V_L的CDR3的编码序列如序列表中序列1的第265-294位所示；V_H的CDR1的编码序列如序列表中序列2的第76-99位所示，V_H的CDR2的编码序列如序列表中序列2的第151-174位所示，V_H的CDR3的编码序列如序列表中序列2的第289-348位所示。HY498的Fd片段的氨基酸序列如序列表中的序列4所示；V_H的氨基酸序列如序列表中序列4的第1-125位所示；V_L的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第1-107位所示。V_L中含有3个决定簇互补区CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如序列表中序列3的第27-32位、50-52位和89-98位所示；被这有3个决定簇互补区间隔的其余四个区为框架区。V_H中含有3个决定簇互补区CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如序列表中序列4的第26-33位、51-58位和97-116位所示；被这3个决定簇互补区间隔的其余四个区为框架区。

实施例2、人源抗HIV抗体的Fab片段的表达和纯化

将上述筛选获得的含有序列2所示的HY498的Fd片段的编码基因和序列1所示的HY498的轻链编码基因的重组载体pComb3XSS-Fab转化至大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，挑取单个菌落加入到500ml含20mM MgCl₂和50μg/ml氨苄青霉素的SB培养基中37℃250rpm摇5-8小时(OD₆₀₀＝1)，加入1ml 0.5M IPTG，37℃ 250rpm摇16小时，细菌-80℃冻融破菌，加入25μl多粘菌素B溶液，0.5μl核酸酶冰上摇匀1小时，10000转速离心30分钟，上清用镍填料Ni-NTA Superflow N柱或蛋白G柱纯化(依说明书提供的方法进行)。得到纯化的人源抗HIV抗体的Fab片段(HY498)。

实施例3、HY498对HIV的中和活性检测

采用HIV假病毒感染系统评价人源抗HIV抗体的Fab片段的抗病毒活性。具体步骤为，将表达HIV毒株SF162或HXB2的ENV蛋白的质粒pcDNA3.1-ENV和骨架质粒pSG3^ΔENV(表达HIV基因组中除ENV之外的所有蛋白)，按质量比1∶2的比例转染293T细胞，同时设pSG3ΔENV对照，即只转染相同量的pSG3^ΔENV。于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育6hr以后使质粒进入细胞，而后换液，于细胞培养箱中继续孵育48hr，假病毒分泌至上清中。用移液器尽量多地吸出细胞培养瓶或细胞培养板中的上清，经0.45μm滤器过滤或1000g离心10min取上清，向其中加入FBS使其终浓度为20％，转移入聚丙烯管中于-80℃保存备用或直接进行病毒滴定。收获大量的假病毒后，加入牛血清终浓度达20％，分装冻存。取出假病毒在96孔板中做5倍稀释，8个梯度，4个复孔，终体积为100μl。其中用pSG3^ΔENV单独转染所收上清做相同稀释。将TZM-bl细胞胰酶消化，细胞计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释至10⁵个/ml，每孔加100μl，每孔细胞为10⁴个，加入DEAE-dextran，终浓度为15μg/ml。将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂培养48小时。之后从细胞培养箱中取出96孔板，从上样孔中吸弃上清，加入30μl细胞裂解液，放置10min后加入100μl荧光素酶检测试剂。用移液器从每孔中吸出100μl液体，加于对应96孔白板中，于微孔板光度计读取发光值。以pSG3^ΔENV对照孔化学发光值的3倍作为cutoff值，结果用S/CO值表示。用Reed-Muench法计算假病毒的病毒滴度。为检测HY498的中和病毒活性，将人源抗HIV抗体的Fab片段(HY498)按倍比稀释铺入96孔板中，终体积为50μl，其中用50μl DMEM培养基替代药物作为阴性对照。加入TZM-bl细胞100μl(10⁵个细胞/ml)含DEAE-dextran终浓度为15μg/ml，加入已获得的HIV-1假病毒50μl，每孔相当于100TCID₅₀。培养48h后，利用荧光素酶检测试剂(Promega)测定每孔的相对荧光单位(RLU)。半数中和剂量是能引起50％最大效应(量反应)的剂量，用半数中和剂量(ND5₀)表示。结果如图1所示，HY498对HIV病毒株SF162的中和活性(ND₅₀)为1.12μg/ml，对HIV病毒株HXB2的中和活性(ND₅₀)为5.60μg/ml，该结果说明该Fab片段为HIV中和抗体。

实施例4、HY498与HIV包膜蛋白的反应性

以ELISA法检测HY498与15种来自不同亚型HIV的包膜蛋白重组抗原(gp120或gp140)的交叉反应性，包括HIV亚型A，B和C。其步骤为，将每个蛋白以1μg/ml浓度用100μl 0.1M NaHCO₃(pH8.6)溶液分别包被，4℃过夜。第二天用200ml 3％BSA37℃封闭1小时，弃封闭液，0.05％PBS-T洗一遍，加入100μl小量诱导的细菌上清，37℃孵育1小时后，用0.05％PBS-T洗三遍。加入100μl以1∶30000稀释的酶标抗人Fab二抗，37℃孵育1小时，0.05％PBS-T洗三遍。用TMB显色30分钟，2M H₂SO₄终止，酶标仪检测吸光度A值。结果发现，HY498可以与来自不同HIV亚型的包膜蛋白重组抗原反应。如图2所示，HY498可以与来自92RW020(A)、Bal(B)、HXB2(B)、JRFL(B)、JRCSF(B)、89.6(B)、YU2(B)、R2(B)、LAI(B)、Du156.12(C)、96ZM951(C)和CN54(B/C)病毒株的重组包膜蛋白反应。对照抗体SARS-20为一抗SARS冠状病毒S蛋白的抗体，不与以上HIV抗原有任何交叉反应。

实施例5、HY498作用于依赖于gp120糖基和环区的构象表位

为测定Fab抗体与二硫键降解的gp120反应性，取CN54-gp120用PBS稀释至50μl，加二硫苏糖醇(DTT)至10mM，加碘乙酰胺至10mM，不加DTT和碘乙酰胺作对照，两者于37℃孵育30分钟，用0.1M NaHCO₃(pH8.6)溶液包被，4℃过夜。第二天用200ml 3％BSA 37℃封闭1小时，弃封闭液，0.05％PBS-T洗一遍，加入100μl Fab抗体(15μg/ml)，37℃孵育1小时，0.05％PBS-T洗三遍。加入100μl以1∶30000稀释的酶标抗人Fab二抗，37℃孵育1小时，0.05％PBS-T洗三遍。用TMB显色30分钟，2M H₂SO₄终止，酶标仪检测吸光度A值。如图3所示，HY498与天然构象的gp120反应，但不与DTT处理的gp120反应，说明抗体表位取决于二硫键依赖的构象；同时，为测定gp120上的糖链是否参与抗体的表位，CN54-gp120先用内切糖苷酶PNGase F处理，然后用于ELISA包被。图3的结果也显示，HY498不与去糖后的gp120反应，说明gp120糖链对抗体表位的重要性。因此，HY498作用于糖基依赖的gp120构象表位。为进一步分析HY498的作用表位，采用三个去掉gp120环区的突变体作为ELISA抗原，它们分别是缺失V1V2环(ΔV1V2)、缺失V3环(ΔV3)和V1V2、V3环都缺失(ΔV1V2V3)的CN54-gp120蛋白。从图4的结果可见，单独V1V2缺失可导致HY498的反应性显著减弱，单独V3环缺失或V1V2V3环全部缺失皆可导致抗体的反应性消失，说明V1V2环和V3环尤其是V3环对两抗体的表位组成极其重要。

实施例6、HY498的竞争实验

为确定HY498在gp120上的识别位点，采用竞争ELISA法测定HY498是否与已知表位的抗体竞争结合gp120。竞争抗体包括针对gp120受体(CD4)结合区的抗体IgGb12和HY5，针对V3环的447-52D和HY7，以及针对gp120糖链表位的2G12。将CN54-gp120蛋白以1μg/ml浓度用100μl 0.1M NaHCO₃(pH8.6)溶液包被，4℃过夜。第二天用200ml3％BSA 37℃封闭1小时，弃封闭液，0.05％PBS-T洗一遍，加入100μl竞争抗体(100μg/ml)，37℃孵育1小时。0.05％PBS-T洗三遍，加入100μl Fab抗体，37℃孵育1小时。0.05％PBS-T洗三遍，加入100μl以1∶4000稀释的酶标抗HA二抗，37℃孵育1小时，0.05％PBS-T洗三遍。用TMB显色30分钟，2M H₂SO₄终止，酶标仪检测吸光度A值。结果见图5。HY498与HY5有部分竞争，但可与IgGb12有效竞争，说明HY498抗体可以竞争结合针对gp120上CD4结合区的位点。图5的结果也说明，HY498不与针对V3环区的抗体447-52D和HY7以及针对糖链表位的抗体2G12有竞争结合于gp120。因此，HY498抗体的表位主要针对gp120的受体结合部位。

实施例7、HY498表位模拟肽的筛选和表位分析

为鉴定HY498抗体结合表位及关键的结合氨基酸位点，本发明进一步采用New England Biolabs公司的12肽噬菌体展示文库(ph.D.12 peptide library)筛选与HY498特异性结合的模拟肽。主要步骤为，在灭菌聚苯乙烯96孔微量板中，每孔加入150μl 100μg/ml的HY498(溶于0.1M pH8.6的NaHC03)，4℃轻微震荡，孵育过夜。倒掉包被液。每板(或孔)加满封阻液[0.1M NaHCO3(pH 8.6)，5mg/ml BSA，0.02％NaN3)]，4℃作用至少1小时。封阻反应后，用100μl的TBST缓冲液(TBS+0.1％Tween-20)，稀释2×10¹¹的噬菌体(即10μl的原始文库)，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60分钟。用0.3ml TBST洗10次。每孔加入100μl 0.2MGlycine-HCl(pH 2.2)，1mg/ml BSA来分离已结合的分子：温和摇动10分钟，洗脱液加入干净微量离心管中。然后再用15μl 1M Tris-HCl(pH 9.1)中和洗脱液。将洗脱的噬菌体溶液加入20ml对数生长前期的ER2738菌液中，37℃震荡培养4.5小时。10000rpm离心10分钟。加入1/6体积的PEG/NaCl(20％PEG-8000，2.5M NaCl)溶液，4℃静置过夜。10000rpm 4℃离心15分钟。倒掉上清，用1mL PBS溶解沉淀噬菌体。4℃离心5分钟，吸取上清，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃静置1小时。10000rpm 4℃离心15分钟。倒掉上清，用200μL PBS溶解沉淀噬菌体，4℃保存。重复上述步骤，进行再一轮的筛选。第三轮筛选后，挑取单一噬菌体空斑至对数期的ER2738菌中，37℃培养4.5-5小时，离心收集噬菌体上清进行ELISA检测。包被10μg/ml浓度的HY498，加入上述噬菌体上清孵育，然后加入HRP标记抗M13抗体(1∶5000稀释)作为二抗，以BSA包被作为阴性对照。图6显示噬菌体多肽的检测结果。噬菌体库筛选的多肽针对目标抗体HY498的读值显著高于BSA对照3倍以上，有较好的特异性。根据噬菌体ELISA的检测结果挑选阳性克隆，通过扩增后，按12肽噬菌体展示文库操作说明书的常规操作抽提DNA，以该DNA模板进行测序，获得以上噬菌体展示肽的序列，见表1。采用Internet网络Mapitope分析软件(Bublil EM，Freund NT，Mayrose I，Penn O，Roitburd-Berman A，J，Rubinstein ND，Pupko T，Gershoni JM，Stepwise Predictionof Conformational Discontinuous B-Cell Epitopes Using the Mapitope Algorithm.PROTEINS：Structure，Function，and Bioinformatics 2007；68：294-304.)对模拟肽序列进行分析，预测的HY498抗体结合的gp120关键氨基酸序列。HY498结合的关键氨基酸包括ASN92、PHE93、MET95、TRP96、LYS97、ASN98、THR236、GLY237、PR0238、SER274、VAL275、ASN276、PHE277、THR278、ASP279、ASN280、SER347、GLN352、PHE353、GLY354、ASN355、ASN356、LYS357、THR358、SER393、THR394、TRP395、PHE396、TYR484。经序列和结构分析，这些氨基酸的多数参与形成受体结合。经序列和结构分析，这些氨基酸的多数也位于gp120受体结合区域。该结果与上述实验表明的结果即HY498的表位坐落在gp120受体结合区吻合。因此，HY498中和病毒的机制是通过阻断病毒吸附结合靶细胞的过程。同时，分析表明，HY498结合的氨基酸位点与文献报道的IgGb12、F105等抗体结合的表位不同。

Claims (18)

1.抗体的Fab片段，它由抗体的重链的Fd片段和抗体的轻链组成，所述轻链由可变区V_L和恒定区C_L组成，所述重链Fd片段由可变区V_H和恒定区亚单位C_H1组成，所述V_H和V_L均由决定簇互补区和框架区组成，所述决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；其特征在于：所述V_L的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3的第27-32位所示、如SEQ ID NO：3的第50-52位所示，如SEQ ID NO：3的第89-98位所示；所述V_H的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4的第26-33位所示、如SEQ ID NO：4的第51-58位所示，如SEQ ID NO：4的第97-116位所示。

2.根据权利要求1所述抗体的Fab片段，其特征在于：所述V_H和V_L的框架区均来源于人。

3.根据权利要求1或2所述抗体的Fab片段，其特征在于：所述V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO：4的第1-125位所示；所述V_L的氨基酸序列如SEQ ID NO：3的第1-107位所示。

4.根据权利要求1或2所述抗体的Fab片段，其特征在于：所述C_L和所述C_H1均来源于人。

5.根据权利要求1或2所述抗体的Fab片段，其特征在于：所述抗体重链的Fd片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

6.由权利要求1至5中任一所述抗体的Fab片段衍生的抗体，是下述a）或b）的抗体：

a）由权利要求1至5中任一所述抗体的Fab片段的V_H和V_L连接得到的单链抗体；

b）含有权利要求1至5中任一所述抗体的Fab片段的IgG。

7.权利要求1至5中任一所述抗体的Fab片段的编码基因。

8.根据权利要求7所述的编码基因，其特征在于：所述V_L的CDR1的编码序列如SEQ ID NO：1的第79-96位所示，所述V_L的CDR2编码序列如SEQ ID NO：1的第148-156位所示，所述V_L的CDR3的编码序列如SEQ ID NO：1的第265-294位所示，所述V_H的CDR1的编码序列如SEQ ID NO：2的第76-99位所示，所述V_H的CDR2的编码序列如SEQ ID NO：2的第151-174位所示，所述V_H的CDR3的编码序列如SEQ ID NO：2的第289-348位所示。

9.根据权利要求7所述的编码基因，其特征在于：所述V_H的编码序列如SEQ ID NO：2的第1-375位所示；所述V_L的编码序列如SEQ ID NO：1的第1-321位所示。

10.根据权利要求7所述的编码基因，其特征在于：所述Fab片段的Fd片段的编码序列如SEQ ID NO：2所示，所述Fab片段的轻链的编码序列如SEQ ID NO：1所示。

11.权利要求6所述衍生的抗体的编码基因。

12.根据权利要求11所述的编码基因，其特征在于：所述V_L的CDR1的编码序列如SEQ ID NO：1的第79-96位所示，所述V_L的CDR2编码序列如SEQ ID NO：1的第148-156位所示，所述V_L的CDR3的编码序列如SEQ ID NO：1的第265-294位所示，所述V_H的CDR1的编码序列如SEQ ID NO：2的第76-99位所示，所述V_H的CDR2的编码序列如SEQ ID NO：2的第151-174位所示，所述V_H的CDR3的编码序列如SEQ ID NO：2的第289-348位所示。

13.根据权利要求11所述的编码基因，其特征在于：所述V_H的编码序列如SEQ IDNO：2的第1-375位所示；所述V_L的编码序列如SEQ ID NO：1的第1-321位所示。

14.含有权利要求7至13中任一所述的编码基因的重组载体、重组菌或重组病毒。

15.权利要求1至5中任一所述抗体的Fab片段或其编码基因在制备诊断HIV感染的试剂或治疗HIV感染的药物中的应用。

16.权利要求1至5中任一所述抗体的Fab片段或其编码基因在制备诊断艾滋病的试剂或治疗艾滋病的药物中的应用。

17.权利要求6所述衍生抗体或其编码基因在制备诊断HIV的试剂或治疗HIV感染的药物中的应用。

18.权利要求6所述衍生抗体或其编码基因在制备诊断艾滋病的试剂或治疗艾滋病的药物中的应用。

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