CN101970659A - 基于hiv特异性抗体的hiv预防疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备人免疫缺陷病毒(HIV)疫苗、预防HIV感染和/或预防HIV感染在个体中的发病方法。特别地,本发明提供了在个体中可作为免疫反应产生的HIV特异性抗体,这些抗体能够识别并结合基本上所有的HIV亚型,可结合当前流行病学中存在的HIV亚型组群和抗逆转录病毒治疗后选择出的突变体。本发明还涉及通过反向淘筛技术选择HIV-1肽/多肽/蛋白,通过液相色谱(LC)质谱联用识别HIV-1env肽/多肽/蛋白、gp120及其特定片段,在适当的具有必要的糖基化功能的宿主-利什曼原虫中重组生产HIV-1env肽,以及在HIV特异性的增强免疫反应的组合物中使用立体稳定化的脂质体(SSL)作为佐剂载体。
Description
本发明涉及制备HIV疫苗、预防HIV感染和/或预防HIV感染在个体中发病的方法。特别地,本发明提供了在个体中可作为免疫反应产生的HIV特异性抗体,其可结合现有的HIV亚型和抗逆转录病毒治疗后选择出的突变体。本发明还涉及可识别和结合基本上所有HIV亚型的HIV特异性抗体。
技术背景
人免疫缺陷病毒1类(HIV-1)的特征在于具有显著的遗传变异性,该变异性由产生于病毒复制中的突变的累积所导致,也可能通过重组作用形成[1,18,24]。HIV-1病毒株具有的这种高突变性导致了HIV治疗的化学治疗方法的失败[8]。之前的研究显示,在抗逆转录病毒治疗的不同疗程治疗,甚至在复合疗法(高效抗逆转录病毒疗法(HAART))的治疗以后,病人体内迅速产生耐药的病毒变异体。这些耐药病毒在其蛋白构象和结构中具有特殊的变化。通常那些使得HIV-1逃避现有治疗的突变,在治疗条件的选择下得以保存和累积。
用抗HIV-1药物进行治疗并不能完全阻止病毒的复制,这使得先前存在的耐药突变得以被选择和累积,并且产生和累积新的突变,从而为病毒的生存带来新的生机。因此,所有现有的抗逆转录病毒药物制剂(核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂以及甚至不同药物的混合物,如HAART)都只能在多或少地延长的时间里减缓HIV-1的复制,[7],直到耐药病毒株出现和扩增。HIV-1耐药变异体的广泛传播,对常用抗HIV疗法的耐药性,已经成为严重的问题,特别是在经济发达国家,因为发达国家中感染HIV的病人通常接受抗逆转录病毒治疗[8]。
在对HIV的25年的研究历史中,曾提出过多种HIV免疫治疗的疫苗开发方案,并研究了它们的实际应用。这些方案可以根据疫苗的活性组分、作用机制、以及疫苗的制备方法进行如下分类:
第1类:基于HIV特异性单克隆抗体的HIV/艾滋病疫苗;
第2类:基于破坏的HIV病毒颗粒的疫苗;
第3类:基于HIV肽的疫苗;以及
第4类:编码HIV肽的基因的DNA质粒或病毒载体疫苗(腺病毒、腺相关病毒、禽痘病毒、牛痘等)。
第1类:基于HIV特异性单克隆抗体的HIV/艾滋病治疗疫苗,其中包括中和抗体如单克隆抗体(mAb)或2-3种HIV-中和单克隆抗体的鸡尾酒组合(cocktail)[5,14,28]。
最先发现的关于HIV的感染机制是病毒通过CD4受体和CCR5和CXCR4共受体进入淋巴细胞或其他宿主细胞。然后对HIV囊膜蛋白结构进行了研究(图10a-b),并确立了gp120环3D结构的变异性,以及gp120-gp41复合物的形成在识别和粘附CD4和共受体中起关键性作用的原理。能够找到病毒env蛋白、并与负责HIV进入细胞的表位相结合的单克隆抗体、或能够结合CD4受体和共受体相关的结构域或表位从而可理解地能够阻断HIV感染过程或细胞结合的单克隆抗体,都叫做HIV中和抗体。
基于抗体的疫苗开发的主要问题是,某些HIV抗原引发的重组抗体不能中和不同的HIV-1分离株,这也是由HIV遗传变异性导致的。通过免疫引发的绝大多数抗HIV-1单克隆抗体没有或者仅有很差的交叉中和活性,而且通常它们所结合的决定簇要么由于突变而存在病毒间差异,要么在感染性病毒粒的表面不够暴露。虽然已经制得多种不同的中和单克隆抗体,但是后来的临床实验证明,基于针对gp120和gp41的中和抗体的疫苗在1-2个月内就不再有效(少数情况下它们从一开始起效时就不再有效),原因还是同样的-目标HIV蛋白的表面表位发生了变异和变化。
前述疫苗开发方案的缺陷存在于对用于动物免疫的病毒抗原的抗体进行单克隆挑选的方法。即使是制得了一系列特异性作用于病毒目标蛋白不同变异体的中和抗体,每种单克隆抗体也是在细菌系统中以重组单克隆的方式生产。而且,与动物或人血清中的天然抗体相比,原核重组产生的抗体对其抗原的亲和力至少低10倍。在动物中产生的多克隆HIV特异性免疫球蛋白通常对其他有机体如人类具有免疫毒性。它们可被用作诊断用途,但是它们很可能产生过敏反应,这是它们应用于免疫治疗的天然限制。杂交瘤单克隆抗体生产技术不能解决生物样本中免疫球蛋白的差异。人源化或嵌合单克隆抗体生产技术非常费力,比较耗时且花费较大。因此,使用这项技术并不能生产上十或上百种单克隆抗体的变异体以用于抗HIV免疫治疗。
第2类:基于破坏的HIV病毒颗粒的疫苗[9,20]。使用天然HIV毒粒和HIV肽的想法在15年前就已经提出,并以多种形式再度被提起。其中之一就是使用β-丙内酯、补骨脂素、或类似的公认为对小病毒致命但对肽键和蛋白质构象的破坏作用较小的物质,保留HIV病毒颗粒的感染活性。很快人们发现,通过超滤的方法从病人血流中得到的天然病毒的浓度不能提供可用于免疫的病毒量,它也不能提供研究分析用的材料。因此这种疫苗在实际中的变通方法为实验毒株的体外感染-培养,或用原代分离株感染并在供体淋巴细胞中培养。在这两种情况中都需要在百升级发酵罐中进行大规模生产,从而提供在免疫后产生HIV蛋白免疫反应所必须的大量的病毒颗粒。
这个想法本身不完全算错,它甚至与其他三种疫苗比具有优势。首先,如果在蔗糖梯度(Sucrose Pillow Gradient)中超滤后就对HIV的RNA拷贝数进行实时定量,那么使用灭活的病毒颗粒用于免疫的安全性就会变得更加明显。病毒RNA多半被破坏成小片段,降至某一水平,其与蔗糖梯度浓缩后得到的HIV毒粒或其蛋白的实际浓度相比,要低104-105。其次,获取天然病毒蛋白看起来更有机会覆盖现有的HIV env蛋白表位的多样性。但是后者才是为什么这种疫苗从未起效的真正原因。
基于破坏的HIV病毒颗粒的疫苗的开发是一个最好的实例,可以说明遗传突变选择的体外条件与在动物或人体有机体中的同样过程的范围(bounds)有多么的不同。病毒肽的分析显示,不仅不同病毒亚型具有抗原表位的高变异性,甚至同一个病人体内分离出的多个病毒变异体也是。但是,所有的实验室毒株,包括高传染性的BIII,A455,都具有恒定的和更加均一的env肽序列的组分。质谱或3D结构方法分析表示,实验室HIV毒株的env肽文库的多样性只相当于一个病人体内获取的同等材料的5%。将原代HIV分离株与供体血淋巴细胞,或者与带有CD4、CCR5、或CXCR4的人类细胞培养物进行体外共同培养,也观察到同样的趋势。这意味着,体外病毒感染的选择条件与有机体中病毒的天然复制和毒粒形成的过程有很大的区别,而且病毒在人体有机体中的生存通道要比体外培养过程中宽95%。因此,通过大规模体外生产然后灭活得到病毒粒用于制备抗HIV疫苗的所有尝试都以失败告终,还有那些源自实验室HIV毒株的基于肽的疫苗也失败了。
第3类:基于HIV肽的疫苗[3,6,13,15,27,33,36]。这种现代疫苗种类包括小HIV肽,较大HIV蛋白的多种15-20个氨基酸的小片段,其模拟负责受体识别和感染活性的病毒蛋白的表位以及这些小肽的组合。作为小慢病毒家族的成员之一,HIV由少量的肽组成(总共18个肽),主要的HIV肽疫苗包括gp120片段(gp40,gp160)或gp120和gp41这两个env蛋白,其他的包括小的易维持的基质肽和p24片段。这个种类的其他部分是在酵母中生产的全长env肽或它们的大片段,或者所谓的基于碳水化合物的HIV疫苗,其带有HIV生命周期中天然具有的糖基化。某些HIV肽疫苗旨在用于治疗性免疫,某些则宣称具有预防性作用。
但是到目前为止,不管是重组HIV肽的鸡尾酒组合还是合成的15-20个氨基酸的肽的鸡尾酒组合,都不能抵抗病毒感染和复制,其主要原因可以通过分析这些肽获得的原理来揭示。重组肽序列的获得是通过自动DNA测序的技术,将来自病人的病毒材料通过RT-PCR获得样品并进行测序,包括用长链Taq聚合酶PCR(通常为1000-3000bp)扩增得到HIV基因组片段的步骤,或者将来自病人淋巴细胞的DNA用HIV特异性的引物进行PCR后测序,然后挑选转化的大肠杆菌克隆。现有的技术是基于以随机的方式(regime)对HIV基因型进行单克隆挑选,挑选的频率为从105-106个多样的变异体中挑选一个序列,该频率平均来说可能更高,从这个值出发,平均的感染病毒滴度为1%,则有传染活性的病毒有103-104个拷贝。自己进行过HIV基因组制备和分析的研究人员都知道,用这种技术从同一病人同一血液样品中得到的两条序列,其完整的HIV基因组数据会大不一样。因此,用这些重组肽,或者用即使在真核表达系统中进行过适当糖基化(碳水化合物化(carbonhydrated))的3-4种重组肽的鸡尾酒组合,也不能形成免疫反应来特异性灭活目前面临的病毒变异体。
合成的氨基酸的小的HIV肽[37]的制做方法颇有争议-在自动肽合成仪中将上百种变异体制备成混合物,在每个肽键形成的循环步骤中,加入已知HIV序列中可能有的多种氨基酸的混合物。通过肽合成仪可以得到env蛋白可变区的多种变异体。但是,这些肽的大小仅限于为15-20个,最多30个氨基酸,更长的肽只有使用重组系统才可能得到。在实践中,用小的合成肽及其鸡尾酒组合可将HIV免疫反应增强至足够高,但不具有或者仅具有较低的特异性。另外,即使尝试用合成HIV肽免疫动物(恒河猴)得到的结果也不够满意,在它们的血液中用标准的ELISPOT方法没有发现HIV特异性的抗体。也许将现有的基于肽的HIV疫苗与HAART联用作为组合物用于治疗可能会有一些希望。但是到目前为止,没有一个肽疫苗在免疫后表现出了预防HIV感染的效果。
第4类:编码HIV肽的基因的DNA质粒或病毒载体疫苗(腺病毒、腺相关病毒、禽痘病毒、牛痘等)[11,12,16,21,26,29,30]。在世界范围内获得99项临床研究许可的55种抗HIV疫苗中,大多数都属于基于DNA的种类。但是仅有一个候选疫苗通过了临床IIb期研究,并有一定可能进入临床III期研究[37,42]。使用这类疫苗的想法有一个健康的背景,即DNA免疫不会导致即刻的副作用例如自身免疫并发症和过敏反应,因此其临床应用安全简便。虽然具有这样的优势,但所有的病毒和非病毒DNA疫苗都存在许多缺陷,使它们真正可能具有抗HIV效果的希望渺茫。
由于DNA本身不会导致任何免疫反应,疫苗的有效性主要由三个条件体现,每一个都具有同等的重要性:
1)转染/感染效率,或者有多少细胞可以从一次性施加的定量DNA中得到遗传物质;
2)表达水平,或者在得到一个或多个基因拷贝的细胞中表达了多少蛋白;
3)免疫反应的持续性,或者MHC引发可识别目标病原体的单克隆抗体的持续时间。
体外转染/感染效率的测定是指,在基因转移24小时后,直到细胞可以进入下一个分裂周期之前,计数到的表达现有蛋白的细胞中含有的,表达在相同条件下同时转化的荧光蛋白或LacZ的细胞数的百分比。对于非病毒质粒载体来说,其体外效率可以达到40-90%,但同样的载体通过体内静脉给药时,在最好的情况下也只有1-5%的效率。在这40-90%(体内1-5%)的效率中,98-99%为暂时性的或游离体(episomal)的表达,2周后会消失,而仅有1-2%的转染的遗传材料可插入细胞基因组中,提供长期的表达。质粒DNA疫苗的用量[16]局限于受体对传递物质的最大耐受剂量,传递物质有阳离子脂质和由其制得的脂质体、阳离子聚合物(聚乙烯亚胺、聚赖氨酸)、普朗尼克(pluronic)及其不同组合。实际上,所有可结合和携带带负电的DNA的阳离子物质在105-104M的浓度时都有较高的毒性。与病毒载体的表达相比,非病毒载体的表达水平相对较高。
病毒DNA载体的感染效率会变化,但一般在体外实验中不会超过10-20%。但是由于病毒载体可将遗传物质直接传递到基因组,因此变得有吸引力。所以,虽然在体内给药时病毒载体的感染效率平均仅为2-5%,但目标蛋白的表达主要是长期的,而不是暂时的。因此,病毒DNA载体被认为具有治疗或预防作用所需的足够的免疫反应持续性,和抗HIV活性。
但是,通过研究病毒DNA疫苗的成分以及它们一步一步的作用机制,可以观察到其预期活性的局限性。第一类进入临床研究的DNA载体是腺病毒构建体。虽然它们的现代版已经表现出了不为0的感染效率,并且其免疫后所诱发的单克隆抗体的滴度用所有免疫化学的方法都可以检测到,但是它们从没有被单独使用。问题在于,腺病毒-ADV[11]或腺相关病毒载体-AAV[29]只产生相对低表达量的传递蛋白,一般只能在实施免疫的两周后用ELISA,INF-γELISPOT或Western印迹实验才能识别出来。如果将这些ADV和AAV的数据与用任意重组蛋白或蛋白混合物进行标准免疫的两周后的抗体滴度进行比较,可以很明显的发现ADV和AAV疫苗接种的绝对数值低了5-10倍。研究者看到这些数字可以就免疫反应的可能时间得出一些结论。
唯一一个进入临床III期,且自2003年10月起在泰国应用于16000个未感染的个人的疫苗组合物,是基于质粒DNA-gag-pol-env疫苗(AIDSVAX B/E)的联合(lined-up)免疫,随后进行两次牛痘病毒(Vaccinia Virus)-HIV疫苗接种(ALVAC-HIV)。本专利的检验数据表明,在接种的恒河猴的血液样本中,引发的抗体滴度在每次免疫后的一到三周升高,而免疫一年期的余下时间中则略微偏向于对照组数值的正向图(Plus plot)[12]。在这种情况下如何评价免疫反应的持续性是个问题。还应注意,腺病毒和牛痘病毒是最大的病毒家族之一,它们的表面和病毒基质中暴露了上百种它们自身的蛋白。这意味着给药后在短时间内(一到两周)增强的免疫反应很高,但大多都是非特异性的,而且非特异性会导致免疫毒性等副作用。
病毒疫苗的有效性中唯一的例外就是基于逆转录(慢)病毒载体的方法[26]。HIV本身就是来自慢病毒家族的一个很好的代表。慢病毒载体在体内的感染效率足够高(可达5%),表达传递的基因蛋白也足够多,而且是长期表达,即使该表达不是稳定表达,因为其可感染细胞的基因组。作为癌症治疗疫苗,逆转录病毒载体在临床研究中表现出的抗肿瘤活性明显优于其他任何遗传构建体。只有所有的逆转录病毒包括HIV具有的一个特点会使得其治疗应用受到质疑,而预防应用变得不可考虑-那就是它们能作为可移动的遗传元件进入人类基因组,驱动多种遗传突变,这一连串事件在某段时间后会变得不可控制,从而在不同细胞和组织中导致多种癌变。
基于DNA的疫苗的基本缺陷来源于其初始的核苷酸序列,其获得方法与上述的重组HIV肽组合物相同,例如在PCR和单克隆后进行标准DNA测序,可以将一个病人的血流中含有的HIV遗传变异的平均数理解为有105-106种变异体,这接近于真实值。以随机的方法通过这种方式得到一种或多种序列,以此制得的遗传构建体在原则上对大多数的HIV变异体都不能起效,即使来自于同一个病人。所有基于质粒DNA和任何基于病毒载体的HIV疫苗都是基于单个env、pol、gag以及它们的合并区域的序列。在这些构建体由HIV基因组区域的单克隆的核苷酸序列组成之前,HIV疫苗的开发都是一条死胡同。为了对抗HIV遗传变异性和突变性,必须保持对其现有变异的定量分析,并制备针对更加频繁存在的变异体的新疫苗。
如上所述,基于DNA的HIV疫苗的其他主要局限性是较弱的免疫反应,这是由于病毒和非病毒基因治疗载体在体内传递的已知方法不完善。下面描述的是一个合适的对比,有助于学术科学家理解基于DNA的疫苗种类难以用于提供任何种类的抗感染免疫力。请想象对任意蛋白或抗原的假设的单克隆抗体(mAb),以及它们在原核大肠杆菌系统中生产的重组连接的L-H IgG链。现在我们要比较这两种单克隆抗体种类结合抗原的亲和力,用所有可能的实验室免疫反应试验比较-ELISA、ELISPOT、免疫点印迹、Western印迹、流式细胞仪、荧光显微镜,等。在每个图片中,我们将会看到这些种类在一个实验中的位置-重组单克隆抗体的亲和力总是至少10倍低于天然动物单克隆的亲和力,而且,在滴定过程中最小结合活性中的差别可以达到100到200倍。如果研究者分析用于动物免疫的基于DNA和基于蛋白质的组合物的活性,则会发现与疫苗免疫原性的体内评价相同的情况。特异性免疫反应的有效性的测定,是在被免疫的动物的血液中测定针对现有抗原的单克隆抗体的滴度,以遗传载体方式传递的抗原的特异性免疫反应的有效性比原始蛋白抗原低了很多倍。DNA变异体的特异性抗原免疫反应的强度通常比“阳性对照”-蛋白变异体低5到20倍。
还有一类被描述为潜在的HIV疫苗候选物的一小类组合物-它们也被叫做树枝状疫苗。它们的开发是基于干细胞科学,树枝状疫苗可与化疗或放疗联用用于治疗多种肿瘤,虽然花费相对较高(一个病人治疗费用平均为4.5-6万美元)但能达到适度的治疗效果。但是,由于树枝状细胞-巨噬细胞前体是在体内原位被教导分辨和杀死某些特定病原体或微生物,它们只可自身应用于同一个病人的血液,所以它们用于HIV治疗,以及进一步的用于预防感染的效果非常值得怀疑。关于从哪里获得用于“教导”巨噬细胞的病毒肽的问题也存在同样的道理,重组病毒肽的序列已经多年不变,而天然病毒肽又需要极高的无法分离得到的浓度。因此,树枝状细胞的应用不能被认为是抗HIV疫苗的可靠候选物。
HIV-1疫情控制的唯一可能的办法就是制得一种疫苗,其可通过免疫未感染的个人,特别是高危群体的代表人群,从而预防HIV-1的感染和/或阻止其发病。这样的疫苗必须含有单个天然HIV-1肽的表位的混合物,即主要的HI1-1囊膜蛋白gp120,其是病毒表面唯一的外在蛋白,它的片段的表位,还有gp41肽,其为env gp120-gp41四聚体中物质,其具有的适当的外侧部分和/或表位可以被已接种的个人的免疫系统所识别。由于前面提到过的原因,这些肽不能是来源于病毒的天然肽(第3-4页,第13-30,1-20行)。对于重组多肽,应当提供正确的序列信息。我们开发了一种HIV疫苗开发的别样的方法,其具体细节在本专利申请中描述,包括基于以下方面的对env序列的研究:
1)用噬菌体展示反向淘筛(reverse panning technique)技术对天然病毒肽进行收集和亲和纯化;
2)随后用一组液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法进行天然病毒肽的定量和测序分析,提供关于gp120及其片段的序列信息,gp120及其片段呈现在HIV感染个体的当前病毒组群的大多数变异体中;
3)用利什曼原虫系统重建天然env肽表位,用于重组生产具有与HIV和真核细胞相同糖基化的env肽;
4)使用具免疫原性的env肽的立体稳定的脂质体包装或病毒体(virosome)的方法制得HIV预防性疫苗组合物,提供a)必要的免疫反应增强期的延长,和b)免疫毒性的控制。
目前为止做过的gp120的蛋白质组学分析很少且不完整,因为缺少从其他病毒肽和细胞蛋白的鸡尾酒组合中纯化得到的天然肽的变异体。通过反向淘筛技术,在具有足够吸收容量的柱子上进行病毒env肽的亲和吸附,可以解决这个问题。在制得用于HIV感染免疫的疫苗组合物之前,必需选择HIV感染个体的当前病毒组群中主要存在的env肽的异构体。
虽然单个病人的遗传变异体的变异性平均高达105,但在每个感染的个人中都会选择最适应的和具有更高感染生存力的变异体。流行病学的变异性资料证明,因为遗传序列的存在,HIV变异体的传播具有地区界限,性传播或注射毒品(IDU)传播的个人接触的依赖性。占统治地位的病毒肽变异体的数量远小于遗传变异体的数量,虽然占统治地位的变异体的数量可以足够迅速地改变。而且核苷酸序列不能给出信息表明哪些变异体是占统治地位和易于感染,只有通过蛋白质组学的定量分析和序列分析才能说明。我们尝试的方法是液相色谱离子电喷雾质谱。
天然的gp120 HIV肽有高免疫原性,但要使重组的变异体也具有相同水平的免疫原性且不丢失表位,则需要使用具有相似糖基化的重组系统。可以使用细胞培养、酵母培养、和利什曼原虫系统来解决这个问题。用真核细胞培养生产的重组肽产量很低,因为它们自身具有大量的细胞蛋白-平均是大肠杆菌蛋白的上千万倍。酵母培养提供了足够的产量但在酵母中的碳水化合物化并不像之前认为的那样类似于真核生物和HIV。因此,我们选择了利什曼原虫系统,其具有可诱导的高表达,并具有真核生物特有的糖基化方式。在利什曼原虫中生产的gp120重组变异体提供了100%HIV特异性的高免疫反应,下一阶段则是要使这种反应延长从而预防感染的发展。
立体稳定化的脂质体可以通过两种可能的方式用作肽类疫苗载体:一是将肽包封入脂质体载体的水分成分中,二是将肽结合在活化的聚乙二醇(PEG)远端并呈现在脂质体表面。在两种情况下,env肽都免于被蛋白酶迅速剪切和降解,因此免疫激活阶段得以延长。立体稳定化的脂质体本身无毒无害。这些载体能在几周或几月时间里都保持免疫原性肽包封在内,能在这足够长的时间里逐渐释放其内容物,而不是一次释放。这使得可以在一次疫苗接种中使用更多的蛋白量。当为HCC提供与外源蛋白更长的永久接触时,则可形成更强和时间更长的免疫反应。这也许对HIV感染的预防和疫苗的成功开发至关重要。
最后,关于HIV疫苗候选物需要牢记的是,在临床前评价中没有现有的体内模型足以评价其效果。所有使用大猩猩作为HIV感染模型,并进一步用开发的抗逆转录病毒化疗药物进行治疗的尝试都具有说服力并且有效,但是却不可能在猩猩或恒河猴中评价抗HIV的免疫反应。在猿类和猴类中引起的免疫原性反应在反应谱上与用相同抗原在人体内免疫产生的免疫反应有很大不同。而且,大猩猩,举例来说,能被任何HIV亚型感染,其在感染了对人来说致命的病毒量以后可以安然无恙地生存多年,且没有丝毫的疾病发病症状,对于猴病毒自身感染也是同样的情况。所以,对于任何抗HIV免疫原性组合物的测试来说,正常的实验室小鼠不比猿类差,但其可以统计学意义上需要的数量使用,而且有可更经常使用的血液免疫实验。临床研究只能证明当前新的HIV疫苗是否能提供免疫保护效果。
附图说明
图1:使用CD-45单克隆抗体和,共聚焦显微镜镜检得到的HIV感染的个人的B淋巴细胞的分析结果:
a,b)分离HIV特异性单克隆抗体RNA的“好”来源;
c,d)在疾病发展晚期阶段(艾滋病)的病人中非常“不好”的来源;
e)来自被感染人血液中的T和B淋巴细胞,透明扫描(transparency scanning);
图2:根据本发明方法的一优选实施例,得到噬菌体DNA文库的过程的示意图;
图3:根据本发明的一优选实施例,用ELISA技术挑选产生阳性抗体的克隆的方案示意图;
图4:重组噬菌体文库的形成和淘筛;
图5a-b:重组辅助M13噬菌体的结构,其“头部”呈现了富集的HIV env肽特异性抗体文库。使用Nano Wizard(JPK Instruments,德国),基于Nikon Eclipse 2000U,使用CSC 17/noA1刺悬臂(sting cantilever),共振频率12千赫(MicroMash,爱沙尼亚)进行了扫描探针显微镜(SPM或AFM)的接触模式分析。
噬菌体的平均长度为800nm,厚度为40-50nm,HIV特异性的ScFv文库的呈现为每个噬菌体颗粒上呈现2-10个抗体分子;测得这种“头部”的平均大小为200-250nm。
a)重组M13噬菌体和它呈现有HIV特异性抗体文库的“头部”;
b)M13Ko7辅助噬菌体对照。
图6a-b:在反向淘筛技术中使用的超大孔径环氧活化的整体亲和柱(affinitysupermacroporous monolithic epoxy-activated column)的结构。使用Nano Wizard接触模式,用CSC 17/no A1刺悬臂,进行了扫描探针显微镜(SPM)的接触模式分析。
a)在重组噬菌体嵌入之前的超大孔径环氧活化的整体吸附剂
b)在M13单克隆抗体嵌入之后的超大孔径环氧活化的整体吸附剂,带有呈现的重组噬菌体的HIV特异性的ScFv文库;
图7a-b:用于收集HIV env肽的反向淘筛技术:
a)从RP亲和柱上洗脱的组分的情况(A亚型池分离株,通过PEG沉淀并随后在蔗糖梯度中进行100000g的超离心来进行浓缩)。用Western印迹方法,使用抗HIV的多克隆抗体检测峰A和峰B中是否含有特异性的env肽;
b)从RP亲和柱上洗脱的组分的图谱(A亚型池分离株、通过超滤浓缩上清液)。用Western印迹方法,使用抗HIV的多克隆抗体检测峰。
图8a-b:用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹(ECL检测)分析从反向淘筛柱上洗脱的HIVA亚型的env肽池的组分。
a)1-高范围标记;2-第4个组分,3-第5个组分,4-第6个组分,5-第7个组分,6-第8个组分,7-第11个组分,8-第9个组分,所有实验都用β巯基乙醇(β-ME)制备。
b)1-第1个组分,含β-ME;2-第2个组分,含β-ME;3-HIV-PEG,含β-ME;4-HIV沉淀,含β-ME;5-HIV上清液,含β-ME;6-高范围标记;7-第1个组分,不含β-ME;8-第2个组分,不含β-ME;9-第6个组分,不含β-ME;10-HIV-PEG,不含β-ME;11-HIV沉淀,不含β-ME;12-HIV上清液,不含β-ME;
图9a-c:env信号肽gp120结构的重新构建,用测序和2D分析:
a)#Al.RU.03.03RU20_06_13_AY500393
MKAKGMQRNYQHLWRWGXMLFWXIIM
b)B.RU.04.04RU128005_AY682547
MRARGIRKNYQGLLRWGTLLLGILMI
c)#B.RU.04.04RU129005_AY751406
MRAKGTRKNYQRLWRWGIMLLGMLMI
图10a-d:HIV-1囊膜肽的3D结构示意图。
a)gp120核的3D结构示意图[40,41];
b)gp120的CD4-CCR5结合表位的3D结构示意图[24];
c)在CD4结合环的形成中gp120变形的3D结构示意图[22];
d)gp41外结构域(ectodomain)的结构和可变性[34]。
图11a-b:通过PCR扩增HIV env肽的DNA片段,这些片段编码:
a)整个gp120,gp120内侧和外侧结构域以及V2、V3和V4环;
b)整个gp41和gp41的外结构域。
图12:HIV env肽及其片段在不同表达系统中的生产:
a)gp120内侧结构域、gp41的外结构域的可诱导表达,SD-PAGE
b)gp120、gp41的永久表达,SDS-PAGE和ECL Western印迹检测
图13:利什曼原虫tarentolae种(Leishmania tarentolae)细胞(LEXSY表达系统)中蛋白的N-糖基化方法与其他蛋白表达系统的糖基化相比较示意图。在哺乳动物细胞中和在利什曼原虫tarentolae种中得到的糖基化模式的差别仅在于前者的糖链的末端有N-乙酰神经氨酸(Jena Bioscience GmbH)。
图14:pLEXSY I-2载体家族的示意图,含有克隆位点,以便用目标基因替代长为1kb的填充片段。5′odc和3′odc是同源重组的区域,在表达质粒用SwaI线性化以后,通过同源重组进入宿主的染色体。Utr1衍生自利什曼原虫tarentolae种的aprt基因的0.4k-IR,utr2衍生自camCB基因的0.4k-IR,utr3衍生自1.7k-IR,它们都是优化的邻近基因的非翻译区,为目标基因和标记基因在LEXSY宿主T7-TR中的表达提供mRNA转录后处理所需的剪接信号。SP表示墨西哥利什曼原虫的分泌型酸性磷酸酶LMSAP1(7)的信号肽,和H6六聚组氨酸伸展段。其他的克隆策略导致目标蛋白的细胞质(c)或分泌型(s)表达。细胞质表达的5’插入位点是BglII,NcoI,或SlaI,分泌型表达的为SalI或XbaI。在填充序列的3’端,通过限制性酶切位点NheI,MspCI,或KpnI可得到与C末端六聚组氨酸(His6)伸展段的融合,而使用NotI克隆位点可避免与His6伸展段的融合。可使用的标记基因有ble基因(耐博莱霉素)和neo基因(氨基葡萄糖甙(aminoglucoside)磷酸转移酶)(Jena Bioscience GmbH)。
图15a-d:HIV env重组肽的色谱纯化步骤:
a)大肠杆菌中表达6Hisp120id1(SDS-PAGE 5-20%);
b)在镍-氨三乙酸(Ni-NTA)柱上纯化6Hisp120id1;
c)在Q-PEEK的10μm 4.6×50mm柱(Waters,美国)上纯化6Hisp120id1;
d)在纯化前和纯化后在Superose 12 10/300GL上用凝胶过滤色谱纯化6Hisp120id1。
图16a-b:用于HIV env重组肽增强免疫反应的脂质体佐剂种类:
a)150nm,PEG-400的立体稳定化脂质体的示意图,在载体的水相部分内载有重组HIVenv肽;
b)200nm,PEG-2000的立体稳定化脂质体的示意图,在PEG活化的远端偶联了重组HIV env肽。
图17:SSL疫苗组分的高斯和Nicomp粒径分布:载体的平均直径为155nm。
具体发明内容
本发明提供了HIV的,优选地HIV-1A或B亚型的预防性疫苗,可在使用本发明提供的疫苗进行免疫的个体中引发特异性的免疫反应,从而提供保护作用。因此,活性物质是重组的多肽/肽混合物,其根据以下详细描述的复杂技术制备和选择。基本疫苗成分为病毒表面蛋白和囊膜蛋白及其片段,根据某优选实施方式,包括不同糖基化状态的HIV囊膜蛋白gp120、gp140、gp160(图1)和gp41,gp120的V1-V3环状结构的保守结构域,gp120的V1-V5环的耐药性相关的可变部分的抗体,gp41的糖基化变异体;病毒囊膜蛋白gp120、gp140、gp160中与CD4结合的表位,其邻近的V1/V2和V3环在CD4受体与HIV-1囊膜刺(spike)和gp41蛋白的外侧部分相互作用时发生构象变化;病毒囊膜蛋白中的CXCR5和CCR4共受体结合位点;p24病毒肽的不同表位。
使用来自不同供体的B淋巴细胞的mRNA产生的重组噬菌体展示抗体文库,对这些重组的多肽及其混合物进行收集、识别,和克隆。每一个产生的噬菌体抗体文库可特异性结合重组gp120、gp41和天然HIV多肽的不同表位,优选地还可结合重组gp140、gp160和p24HIV-1A亚型上呈现出的表位。
这些重组的噬菌体抗体文库可以应用于不同的用途,如检测、分析和/或纯化用途[23]。使用以上抗体文库的应用包括,但不限于,免疫实验、免疫印迹、色谱等。
本发明提供的抗体还可用于开发HIV治疗和/或预防的新型药物。
在本发明的一优选实施方式中,呈现在M13KO7噬菌体上的重组抗体被用于开发HIV预防性疫苗。
由于噬粒文库所展示的抗体片段结合的是HIV蛋白的基本保守的构象表位,所以所述抗体的靶点可作为针对HIV感染的疫苗,因为免疫后,个体的免疫系统可发展出特定的针对这些表位的免疫反应,例如,成熟的B细胞和T细胞,其最终可变成记忆细胞,存在于个体中使其具有免疫力。
根据本发明的一HIV疫苗含有重组的gp41和p24 HIV-1A亚型蛋白和gp120、gp140和gp160的片段,这些片段(实施例3中的表9)可结合由本发明的方法制得的抗体,并另含有常规的载体和辅料以及任选的免疫刺激剂。
所述疫苗可预防HIV感染以及HIV感染的进一步发展,因为它为个体的免疫系统提供特异性针对某表位的记忆细胞,该表位可能存在于任何HIV病毒上,也可在突变的HIV病毒上。
所述重组蛋白和/或片段是基于结合和分析天然HIV-1表位蛋白而获得的序列信息,这些表位蛋白可用通过本发明的方法得到的HIV-特异性抗体选择得到。
具体地说,蛋白,例如囊膜蛋白是从破坏的病毒颗粒中通过适当的方法获得,如通过病毒颗粒的超滤和裂解。
可用技术人员已知的任何适当的筛选方法筛选适当的蛋白。在一优选实施方式中,所述筛选可以通过以下方法进行:i)使用呈现有可收集病毒囊膜蛋白的抗体的重组噬菌体进行噬菌体淘筛;和/或ii)用粘附有HIV-特异性抗体的培养用塑料表面进行亲和吸附;和/或iii)用嵌入了HIV-特异性抗体的柱子通过亲和色谱筛选病毒囊膜蛋白。
在下一步中,可以识别出获得的和筛选出的天然病毒蛋白的序列和/或亚型的3D构象。照此进行,可获得病毒蛋白的高度特异性的可变片段和/或恒定片段的多种变异体的混合物,例如gp120、gp41和p24,它们循环在感染了HIV-1的个体的血流中,以及那些在不同治疗方案如NRTI、NNRTI和HAART中接受了抗逆转录病毒治疗的个体的血流中。
基于所述序列,生产得到病毒蛋白的重组多肽和/或片段。这些序列可以通过任何适合于生产多肽的方法来获得,这些多肽可被免疫系统识别并因此引发适当的免疫反应。
所述重组多肽可以通过任何适当的表达系统获得,例如真核表达系统,例如利什曼原虫可诱导表达系统和具有真核样糖基化的酵母。
用于制备本发明的HIV-1A和B亚型的不同变异体的预防性疫苗的示例和大体技术包括步骤1-9,在下面会进行更详细的说明:
1.建立人重组IgG嗜粒文库,其含有HIV特异性的ScFv抗体片段(噬菌体展示技术);
2.富集重组嗜粒文库,其呈现有HIV特异性抗体的ScFv片段(生物淘筛);
3.任选地,用PBMC-MT感染方法将未接受抗逆转录病毒治疗的病毒材料进行原位扩增;
4.浓缩HIV颗粒和肽;灭活和破坏病毒;
5.通过反向淘筛技术,用呈现有HIV特异性的重组ScFv的嗜粒文库收集天然HIV env肽;
6.任选地,使用液相色谱质谱联用(LC-MS)方法对env肽的变异性和频率进行定量和序列分析;
7.任选地,克隆主要的HIV env肽,在利什曼原虫tarentolae种中生产用于疫苗开发的重组肽;
8.任选地,对重组HIV env肽进行色谱纯化和3D结构分析;
9.制备HIV预防性疫苗增强免疫反应的组合物,优选地使用立体稳定化的脂质体或病毒体作为疫苗传递的载体。
1.建立人重组IgG嗜粒文库,其含有HIV特异性的ScFv抗体片段(噬菌体展示技术);
因此在本发明的方法中,可在步骤1)中按照阶段i)到iii)建立嗜粒文库,包括:
i)制备扩增从RNA衍生得到的DNA片段,该RNA分别编码IgG的轻链可变区和重链可变区,该IgG表达在从感染HIV的多个个体中获得的B淋巴细胞中;
ii)将在i)中获得的轻链和重链的两条DNA片段组合成一个结构,该结构含有编码IgG轻链可变区的核苷酸,其与编码IgG重链可变区的核苷酸结合在一起;
iii)转化入pCANTAB嗜粒载体中。
具体地,首先从多个个体中分离得到B和/或T淋巴细胞,已知这些淋巴细胞被HIV感染,且其中被认为存在有HIV特异性的抗体。还可包括带有具耐药性的HIV变异体的个体。B细胞的分离可以使用任何已知的技术,例如,白细胞分离术(leukapherese)以及随后在淋巴细胞群体中分离B/T细胞[19]。随后,从B/T淋巴细胞中分离得到RNA,用本领域公知的技术,例如,如在[23]中所述。
优选地,为建立ScFv文库,对含有HIV特异性免疫球蛋白的mRNA序列进行分离。与此相关,在RNA分离前要评价B淋巴细胞的数目,例如,在感染了HIV的人群的血液中用共聚焦显微分析进行CD45单克隆抗体免疫实验。图1显示的数据表明,某些在疾病晚期且表现出艾滋病症状的病人中,B淋巴细胞占总的分离的淋巴细胞的比例很低(图1c,d),通常低CD45免疫染色与高病毒载量和非常低的CD4:CD8状态相关。与其他不同(图1a,b),这些病人是HIV特异性嗜粒文库建立的病毒组群较差的来源。高病毒载量或先前的抗逆转录病毒治疗疗程及其频率不会限制获得HIV特异性ScFv文库的几率。
如此得到的总RNA可以转录成cDNA,通过例如使用寡聚胸腺嘧啶核苷(dT),或,按照一优选实施方式使用寡核苷酸作为引物,该引物可特定结合免疫球蛋白的重链和轻链的恒定区。免疫球蛋白重链和轻链的不同恒定区的序列在本领域为公知,因此转录成cDNA所需的适当引物可以很容易地设计得到。照此进行,可在RNA池中对免疫球蛋白转录子进行第一轮选择,而且来源于不同供体的不同RNA样品将更易于处理,因为在所述第一步中不想要的材料可以被排除在外。另外,可预见以及优选地,在mRNA转录成cDNA之前就将来自于不同供体的RNA池合并,因为可以获得更广泛的多样化(cf.如下)。对这样制得的cDNA,可按照本领域公知的技术合成其互补链。
为了制备足量的DNA片段,可以直接使用自B/T淋巴细胞获得的mRNA、cDNA、或由cDNA制得的双链DNA作为模板,来扩增感兴趣的区域。
对于所述的PCR反应,可以使用可与要扩增的核苷酸序列的5′和3′端结合的适当引物,其通常是长度为10-40、优选地15-30、更优选地20-30个核苷酸的寡核苷酸。
可以使用反向引物寡核苷酸,其序列衍生自免疫球蛋白的恒定区。优选地,所述反向寡核苷酸引物对应地与重链的CH1区、或轻链λ和κ的Cλ或Cκ区杂交。使用的正向引物与重链可变区和轻链可变区的相反末端杂交。
在一优选的实施方式中,用于初始PCR扩增的正向和反向引物选自表1到3中显示的核酸序列,这些核酸序列取自于V BASE数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)。PCR反应总体上得到长度约750的片段。
表1:用于人免疫球蛋白轻链κ的PCR扩增的寡核苷酸引物列表
# | 引物名称,方向 | 核苷酸序列(5’-3’) |
1 | Vκ1a正向 | RAC ATC CAG ATG ACC CAG |
2 | Vκ1b正向 | GMC ATC CAG TTG ACC CAG |
3 | Vκ1c正向 | GCC ATC CRG ATG ACC CAG |
4 | Vκ1d正向 | GTC ATC TGG ATG ACC CAG |
5 | Vκ2a正向 | GAT ATT GTG ATG ACC CAG |
6 | Vκ2b正向 | GAT RTT GTG ATG ACT CAG |
7 | Vκ3a正向 | GAA ATT GTG TTG ACR CAG |
8 | Vκ3b正向 | GAA ATA GTG ATG ACG CAG |
9 | Vκ3c正向 | GAA ATT GTA ATG ACA CAG |
10 | Vκ4a正向 | GAC ATC GTG ATG ACC CAG |
11 | Vκ4b正向 | GAT ATT GTG ATG ACC CAC ACT CC |
12 | Vκ5a正向 | GAA ACG ACA CTC ACG CAG |
13 | Vκ6a正向 | GAA ATT GTG CTG ACT CAG |
14 | Vκ6b正向 | GAT GTT GTG ATG ACA CAG |
15 | Cκ1’反向 | ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C |
表2:用于人免疫球蛋白轻链λ的PCR扩增的寡核苷酸引物列表
# | 引物名称,方向 | 核苷酸序列(5’-3’) |
1 | Vλ1a’正向 | CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CC |
2 | Vλ1b’正向 | CAG TCT GTG YTG ACG CAG CCG CC |
3 | Vλ1c’正向 | CAG TCT GTC GTG ACG CAG CCG CC |
4 | Vλ2正向 | CAG TCT GCC CTG ACT CAG |
5 | Vλ3a正向 | TCC TAT GWG CTG ACT CAG |
6 | Vλ3b正向 | TCC TAT GAG CTG ACA CAG |
7 | Vλ3c正向 | TCT TCT GAG CTG ACT CAG |
8 | Vλ3d正向 | TCC TAT GAG CTG ATG CAG |
9 | Vλ4正向 | CAG CYT GTG CTG ACT CAA |
10 | Vλ5正向 | CAG SCT GTG CTG ACT CAG |
11 | Vλ6正向 | AAT TTT ATG CTG ACT CAG |
12 | Vλ7正向 | CAG RCT GTG GTG ACT CAG |
13 | Vλ8正向 | CAG ACT GTG GTG ACC CAG |
14 | Vλ4/9正向 | CWG CCT GTG CTG ACT CAG |
15 | Vλ10正向 | CAG GCA GGG CTG ACT CAG |
16 | Cλ2’反向 | TGA ACA TTC TGT AGG GGC CAC TG |
17 | Cλ7’反向 | AGA GCA TTC TGC AGG GGC CAC TG |
表3:用于人免疫球蛋白重链(IgM、IgG、IgA)的PCR扩增的寡核苷酸引物列表
在下一步中,将i)中获得的轻链和重链的两条DNA片段连接成为一个结构,该结构含有编码IgG轻链可变区的核苷酸,该核苷酸与编码IgG重链可变区的核苷酸相结合,从而允许表达一多肽,其含有IgG轻链和重链各自的可变区ScFv。
根据一优选的实施方式,为获得在编码可变轻链和重链的DNA片段间的特异性连接,将在步骤i)中得到的一定量的样品等分成,例如,两份,并任选地将其稀释。所述的DNA片段,要么是从mRNA,cDNA通过扩增得到的cDNA,要么是衍生自cDNA的双链DNA,其可以分别与对轻链或重链具有特异性的连接物单独接触,这样所述连接物只与每个样品部分相应的DNA片段结合即一部分只有轻链连接物,一部分只有重链连接物。所使用的连接物在适当的条件下可允许其互相杂交,从而得到含有轻链可变区和重链可变区的DNA片段。另外,两条DNA片段的连接仍保持同样的阅读框(in frame),这样的话两条DNA片段的结合将产生含有轻链可变区和重链可变区氨基酸序列的多肽。根据需要,可用同样的方法获得特异性的两条重链和两条轻链。
在表4和表5中列出了优选的引物。
表4:用于人λ和κ轻链可变片段的第二轮PCR扩增的反向寡核苷酸引物列表
# | 引物名称,方向 | 核苷酸序列(5’-3’) |
1 | Jλ235反向 | TAG GAC GGT CAG CTY GGT CCC |
2 | Jλ7反向 | GAG GRC GGT CAG CTG GGT GCC |
3 | Jλ1反向 | TAG GAC GGT GAC CTT GGT CCC |
4 | Jλ6反向 | GAG GAC GGT CAC CTT GGT GCC |
5 | Jλ4反向 | ACC TAA AAT GAT CAG CTG GGT TCC |
6 | Jκ2反向 | TCG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC |
7 | Jκ3反向 | TCG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC |
8 | Jκ14反向 | TCG TTT GAT YTC CAC CTT GGT CCC |
9 | Jκ5反向 | TCG TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCC |
表5:用于人免疫球蛋白轻链和重链的PCR扩增和组装的寡核苷酸引物列表
在本发明更优选的实施方式中,编码((Gly)4Ser)3多肽连接物的连接物片段,被加入到编码免疫球蛋白的可变重链和可变轻链的核苷酸序列中。重链和轻链的连接物部分互相结合,在TaqSE DNA聚合酶的存在下引导填充反应(a fill-in reaction)。最后,重链和轻链通过它们的DNA连接物片段部分组装成一单个基因。
照此进行,可以通过随机分别连接编码一免疫球蛋白轻链可变区或重链可变区的核苷酸与编码另一个免疫球蛋白的轻链可变区或重链可变区的核苷酸,得到大量的人工制得的抗体,其还含有轻链和重链的组合用于积聚在最初获得的RNA池中不存在的抗原结合位点。可以表明,用免疫球蛋白可变区上的抗原结合位点中已经天然预先形成的部分,以随机的方式合并,也可以生产抗体,这些抗体与感染HIV的个体中天然产生的抗体相比,对HIV蛋白具有更高和恒定亲和力。
在得到的DNA片段中还可以引入其他的限制性酶切位点,其在随后的应用中有用,例如,在克隆步骤中。原则上,根据需要可以使用任何适合的限制性酶切位点,而对CHO-Klose适当的位点不超出技术人员的知识范围。限制性酶切位点可以通过本领域已知的任何适当的方法引入,例如,使用含有限制性酶切位点的核苷酸序列的寡核苷酸引物,或使用含有限制性酶切位点的核苷酸序列的接头分子,其分别结合在5′和/或3′端。
在本发明的一优选的实施方式中,将Sfi I和Not I限制性酶切位点引入到连接的核苷酸片段的末端,根据一优选的实施方式,其可含有一轻链和重链核苷酸序列,其中限制性位点用于进一步克隆入载体的步骤。Sfi I和Not I限制性酶切位点分别加入到所述连接的片段(ScFv基因)的5′和3′端。这些特定的限制性酶切位点在抗体基因中出现的频率非常低,可以允许大多数得到的连接的片段,例如含有轻链和重链的核苷酸序列,以单个Sfi I/Not I片段被克隆。在本发明的一更优选的实施方式中,Sfi I和Not I限制性酶切位点通过寡核苷酸引物引入。优选的含有Sfi I位点和Not I位点的寡核苷酸引物可基于文章[21]中的引物序列进行设计。在获得的含有轻链和重链核苷酸序列的连接的片段末端,可用于引入Sfi I和Not I限制性酶切位点的引物如表6所示。
表6:在组装的ScFv基因的末端引入Sfi I和Not I限制性酶切位点的寡核苷酸引物列表。
为克隆和表达获得的含有轻链和重链核苷酸序列的连接的片段,可使用本领域技术人员已知的任何适当的克隆和/或表达载体。在一优选的实施方式中,使用嗜粒载体,其包括,例如,pCANTAB 5大肠杆菌嗜粒载体。
嗜粒pCANTAB 5E带有M13和ColE1质粒复制原点,所以,可以很方便地以质粒的形式扩增,或者在辅助噬菌体,如M13KO7的帮助下,以包装成重组M13噬菌体的方式扩增。在pCANTAB 5E嗜粒载体的M13基因3的主体和引导序列之间克隆入Sfi I和Not I消化后的抗体可变区基因。得到的融合蛋白保留了两种母蛋白的功能。g3p引导序列引导蛋白转运至大肠杆菌的内侧膜/周质,在那里g3p的主要结构域将融合蛋白附着在组装中的噬菌体的顶端。pCANTAB 5E在克隆的ScFv和g3p序列之间的间隔处还含有琥珀终止密码子。得到的含有ScFv片段的pCANTAB 5E质粒衍生物池,被用于转化大肠杆菌的supE菌株,例如TG1。在大肠杆菌supE菌株中,翻译持续通过pCANTAB 5E中的琥珀终止密码子,得到表达在噬菌体顶端的ScFv-g3p融合蛋白。
表7:用于scFv片段混合物的重新扩增的寡核苷酸引物
引物 | 5’-3’核苷酸序列 |
VH12467SfiIReampl | TGC GGC CCA GCC GGC CSA G |
VH35SfiIReampl | TGC GGC CCA GCC GGC CGA RG |
JL1235NotIReampl | GAC TTG CGG CCG CTA GGA CG |
JL4NotIReampl | GAC TTG CGG CCG CAC CTA AAA TG |
JL67NotIReampl | GAC TTG CGG CCG CGA GGR C |
JK1234NotIReampl | GAC TTG CGG CCG CTC GTT TG |
JK5NotIReampl | GAC TTG CGG CCG CTC GTT TAA TC |
Not I限制性内切酶的识别位点用蓝色标记;Sfi I限制性内切酶的识别位点用绿色标记。
在非抑制子的菌株中,例如HB2151,终止密码子可以被识别,因此蛋白合成在scFv基因的末端就终止,而未能合成g3p融合蛋白。在这种情况下,得到的ScFv蛋白被转运到周质空间中,但不能被组装入噬菌体颗粒中,因为它缺乏基因3结构域。但是,可溶性抗体片段在周质中聚集,培养时间一经延长,则泄漏到培养液中。因此HB2151和类似的大肠杆菌菌株在被选择的抗原阳性噬菌体感染后被用于生产可溶的抗体,但不能用于这里的用途。ScFv文库的建立步骤在实施例1中介绍。
2.富集重组嗜粒文库,其呈现有HIV特异性抗体的ScFv片段(生物淘筛);
可以在适当的宿主中进行抗体的表达,以获得能够结合抗原的多肽,因此使用重组gp120、gp41和分离自不同供体的天然HIV多肽获得所述多肽。由此,表达的多肽如呈现在宿主的表面的话可能更有优势,虽然并不是必需的。用于表达抗体的适当宿主包括病毒系统、原核和真核细胞和/或细胞培养物。
在一更优选的实施方式中,所述抗体的片段表达在细菌噬菌体M13中,形成一个噬菌体展示文库,其使得巨大数量的不同构建子得以展示,每一个构建子由不同的噬菌体代表,用于噬菌体展示技术。噬菌体展示方法是一种用于克隆免疫球蛋白基因以及表达和检测功能性抗体的有力工具。它允许抗体的重链可变片段和轻链可变片段以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面,形成HIV特异性的抗体池或文库,而无需经过单克隆抗体挑选阶段。这个方法可以快速找到任意抗原的抗体,并且如果需要的话,可以在其他表达系统中生产带有或不带有糖基化的可溶性的变异体。
嗜粒文库淘筛是一种体外技术,其允许对大量克隆进行快速筛选,其中表面呈现有抗体的噬菌体表现出对选定的HIV多肽具有结合亲和力,可以被识别并用于维持重组嗜粒和生产新的噬菌体用于进一步的筛选步骤。交叉和循环使用本领域的SDS-PAGE,Western印迹和ELISA筛选的方法可以对噬菌体呈现的抗体文库进行结合亲和力的分析,以识别抗原阳性的克隆。
由于所展示的ScFv抗体片段保留了其抗原结合能力,所以可通过亲和筛选的方式富集表达了特定抗体的重组噬菌体。用这种方法,可以从某群体中迅速筛选出具有明确特异性和亲和力的抗体。对获得的抗体基因文库进行筛选,以提高抗原结合能力。这一步技术叫做淘筛,其包括随后使用以下多肽将呈现了HIV特异性的ScFv片段的噬菌体结合并收集:
i)重组gp120、gp140、gp160、gp41 HIV-1A和B亚型的env肽;
ii)分离自感染了HIV的不同供体的天然HIV env多肽。
在一优选的实施方式中,由于选择了对所有以上所列的多肽都表现出结合亲和力的噬菌体文库,因此被展示的抗体的数量从107-1012减少至102-103。因为是在独立的循环中将所述多肽与特定的重组HIV多肽相接触,其中那些多肽的序列是i)已知的和ii)恒定的,以及在独立的循环中将所述多肽与分离自不同供体的天然HIV多肽相接触,其中这些多肽可能发生过突变,所以可能会选择出可结合基本上所有已知的HIV突变体的抗体,这表明,所述抗体可能识别所述HIV多肽的基本恒定的构象。
照此进行,,从巨大的被感染机体池中选出可衍生出呈现在噬菌体表面的具有HIV特异性的重组抗体文库,即使池中的这些多肽发生过突变,重组抗体仍表现出对选定HIV多肽的结合亲和力,可以使用以下两种不同的方法:
i)标准生物淘筛过程[4]
ii)在硝酸纤维素膜中嵌入固态的固定化的天然HIV肽。
根据第一种方法i),为生产重组噬菌体,将4×1010pfu的M13KO7辅助噬菌体加入到准备好的对数生长期的转化的TG1大肠杆菌培养物中,进行1小时的预培养并在100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素存在的条件下,在37℃、250rpm的转动中培养12小时(通常的噬菌体产量为每毫升1010到1011氨苄青霉素转导单位)。推荐使用聚丙烯管子,因为噬菌体可能会非特异性地吸附在其他塑料表面上。
然后进行PEG沉淀。细菌培养物在1000g离心10分钟,收集并冷却上清液。将1/5体积比的20%PEG/2.5M NaCl的冷溶液加入到上清液中,在0℃培养60分钟,然后在BeckmanJA-20转头中在10000g、4℃离心20分钟。弃去上清液。沉淀物(可能不容易看见)用16ml含有0.01%硫柳汞(timerosal)的2×YT培养液重悬。我们推荐,如果要储存的话(在4℃),则将上清液通过0.45μm的滤膜过滤。含有重组噬菌体的溶液将用于淘筛。
PEG沉淀和噬菌体淘筛循环应当在救援(rescue)后尽快进行,因为某些噬菌体展示的重组抗体制备可能不稳定。将基础培养基盘中的对数期TG1细胞菌落转移至5ml的2×YT培养液中,并在37℃、250rpm条件下摇晃培养过夜。然后在10ml新鲜的2×YT培养液中接种100μl的过夜培养物,并在37℃、250rpm条件下摇晃培养,直到培养物的A600达到0.3。
用适当缓冲液,如PBS或0.05M NaCO3(pH9.6),将5ml抗原溶液用其稀释至10μg/ml,包被25cm2的组织培养瓶。抗原的包被可以在室温进行1-2小时,或者在4℃过夜。培养盘包被的条件,如缓冲液、培养温度和时间,取决于抗原,且应当与衍生出新重组抗体的原始多克隆或单克隆抗体使用的免疫实验条件近似。抗原的包被浓度可以随所需的重组噬菌体抗体的亲和力(抗原结合能力)而变化。与那些低亲和力的抗体相比,具有高亲和力的抗体所需的抗原量更少。但是,对于分离具有特异性亲和力的抗体来说,基于溶液的筛选相对于固相的筛选来说可能更为优选,因为可以更加精确地控制在筛选中使用的抗原的量。
培养瓶用PBS洗三次,每次洗后都完全倾空。然后将培养瓶充满封闭缓冲液,用以封闭在培养瓶表面的任何剩余位点,然后在室温培养1小时。再次将培养瓶用PBS洗三次,在每次洗后完全倾空。
封闭缓冲液为新鲜配制,其含有0.01%的硫柳汞或0.01%的叠氮钠作为防腐剂。将16mlPEG-沉淀的重组噬菌体用14ml封闭缓冲液(含有防腐剂)稀释并在室温培养10-15分钟。在淘筛步骤中,在M13噬菌体的天然蛋白和某些抗原之间可能产生非特异性的疏水的蛋白-蛋白相互作用。如果在稀释的噬菌体上清液中加入Triton X-100至0.1%的终浓度,则可降低这种相互作用。或者也可以用甘氨酸或酪氨酸溶液进行特异性结合的噬菌体的洗脱。在培养瓶中倾倒入20ml稀释的重组噬菌体,并在37℃培养2小时。然后倾空培养瓶,并用30-50ml PBS洗20次,并用含0.1%Tween 20的PBS洗20次(洗瓶在分装洗脱溶液中很有用)。培养瓶每次都完全倾空。
10ml对数期TG1细胞(见步骤1)全部加入到培养瓶或淘筛管中,在37℃培养1小时。1小时后,从10ml细胞悬液中取出100μl,将其用2×YT培养液制备10倍稀释物(1∶10,1∶100,1∶1000)。将100μl未稀释的细胞和100μl的每种稀释物用无菌玻璃涂布器(spreader)放入单独的SOBAG平板中。干燥时,应将平板倒置,在30℃培养过夜。如果培养后菌落太小而不能挑取,则可将培养盘留在30℃再放置4-8小时。按如下方法处理这些SOBAG平板:a)从平板上刮取细胞,制成储备培养物。将5ml 2×YT培养液倾倒入平板中,用无菌玻璃涂布器刮取细胞至培养液中。加入甘油使其终浓度为15-30%,在-70℃保存。B)密封平板,在4℃保存最多2周,以供后面的救援实验。
根据第二种方法,改进自[25],ii)将天然HIV肽的混合物在10%的SDS-PAGE胶上跑胶,然后在Western转移缓冲液中(25mM Tris,193mM甘氨酸,和20%甲醇)将其电转到7×30mm2的膜片切下,通过与10%的猪明胶和5×1011CFU/ml的辅助噬菌体在4℃培养过夜对其进行封闭。封闭后,膜被转移到结合缓冲液中(5%明胶,3×1011CFU/ml的辅助噬菌体,0.5M NaCl),并加入1012CFU的scFv嗜粒抗体文库。噬菌体文库与膜在4℃培养4小时,并轻微摇晃。膜用PBS,0.1%Tween 20洗6次(每次用100ml溶液洗涤),并用PBS洗6次(每次用100ml溶液洗涤)。或者,也可以用含有0.1%Tween 20的PBS(PBST)洗3次洗5分钟,用含有25%甘油的10%MPBS洗5次洗20分钟,最后用PBS洗3次洗5分钟。含有蛋白条带的膜用刀片切下,用100mM的TEA在室温洗脱噬菌体,洗10分钟。中和以后,将洗脱的噬菌体颗粒与明胶封闭过的膜或明胶包被的免疫管在室温培养30分钟。然后用上清液感染TG1。从大肠杆菌中制备噬菌体用于下一轮的筛选,筛选方法如前所述。
3.用PBMC-MT方法将未接受抗逆转录病毒治疗的病人的病毒分离材料进行扩增;
已知HIV能在富含CD4-CCR5-CXCR4受体的细胞培养物中成功扩增,但是,这种方法在实践中有许多局限性。首先,来源于病人的天然病毒材料或实验室毒株在体外感染时,其感染滴度从未超过以不同方法测定(实时RT-PCR,p24 ELISA等)的总病毒浓度的1-2%。这意味着,例如,如果感染材料中的病毒拷贝数是105,则研究者从体外扩增能进行分析的初始拷贝数仅有103,剩下的102倍原始HIV中可能有的变异性会丢失而不能被分析。第二,通过体外感染选择的HIV变异体的数量在最好的情况下是来源于原始103中的多个序列变异体,因此实验室病毒株不能代表HIV遗传和肽的变异性的真实情况。第三,来源于HAART或其他抗逆转录病毒疗法治疗的病人的HIV失去了在体外扩增的能力,因此耐药HIV变异体不能在体外培养。第二,我们在天然病毒培养方面的经验证明,在以下情况下可以得到最佳的结果:
i)将感染了HIV的病人的淋巴细胞与健康供体的淋巴细胞共培养,其中健康供体的淋巴细胞是按已述方法[19]用Ficoll-paque溶液从肝素化的新鲜血液中分离得到。值得一提的是在俄罗斯联邦的领土内广泛传播的HIV-1A亚型,如果该HIV感染的淋巴细胞与按已述方法[19]分离自健康供体新鲜血液中的单核细胞进行共同培养时,感染在大多数情况下都是成功的。
ii)将MT-2或MT-4或任何其他用于HIV培养的细胞系(CCR5F-CEM、PM-1、HeLa、U937等)制成0.25×106/ml的浓度,然后与收获的等量的HIV繁殖的单核细胞共培养,单核细胞是通过加入RPMI-1640培养液至50ml的总体积,然后在425g离心10分钟,反复两次而收获制得的。细胞混合物在CL培养液中重悬,加入10μl/ml的IL-2,用25cm2的组织培养瓶在37℃以直立的位置培养。每3-4天收集含有病毒的培养液,将一半的培养液取出,并替换入同样体积的新鲜培养液(RPMI+10%FCS)。
通过显微镜分析细胞死亡和合胞体形成以及p24 ELISA实验,来监控病毒感染作用的效果。收获的培养液在3000rpm(1000g)离心15分钟以除去细胞,在-80℃保存。
4.浓缩HIV颗粒(通过超滤、超离心),灭活和破坏病毒;
从血浆或培养上清液中制得含有约20%重量的病毒颗粒的储备溶液。首先上清液在3000rpm(1000g)离心15分钟,然后将得到的上清液在13200rpm(16000g)再离心15分钟。将体积约为样品总体积一半的20%蔗糖在超离心管的底部分层放置(stratified)(蔗糖溶液的密度为1.16-1.18g/sm3),然后将含有逆转录病毒颗粒的上清液从管的上方倾入。将管在MLS-50转头Optima MAX,Beckmann中以38000rpm(160000g)离心1小时35分钟[19]。将沉淀物溶解在小体积的培养液中(例如,RPMI-1640)。
HIV的灭活
HIV沉淀的裂解和HIV蛋白的获得
第一种方法是按照[1]中描述的进行。HIV裂解缓冲液(放射性免疫沉降缓冲液)的组分包括20mM Tris-Cl、pH8.0,120mM NaCl,2mM EDTA,0.5%脱氧胆酸盐,0.5%NP-40,2μgPMSF,10μg/ml载脂蛋白,10μg/ml胃蛋白酶抑制剂A。加入去污剂后,用磁力搅拌子轻柔搅拌并低温加热(50℃)。
第二种方法是用于质谱和晶体分析的肽混合物的标准制法。用2N HCl将得到的HIV-1蛋白混合物的pH调至2.5,并与0.15%(重量/体积)的猪胃蛋白酶(Sigma Chemical Co.,圣路易斯,密苏里州)在37℃培养4小时。通过加热到80℃持续15分钟来终止水解,然后加入2M NaOH将pH调至7.5-8。然后将水解后的蛋白混合物通过10kDa的水解膜进行超滤,除去胃蛋白酶和其他未水解的蛋白。过滤后的水解蛋白混合物冻干,并在-80℃保存。
5.通过反向淘筛技术,用呈现有HIV特异性的重组ScFv的嗜粒文库收集天然HIV env肽。
在[35]中模糊地描述了使用呈现抗体的噬菌体文库,利用噬菌体展示技术进行疫苗开发的方法。在开始进行重组噬菌体ScFv文库的操作之前,用改良的Western印迹方法检查嵌有M13呈现的文库的柱子是否具有特异性。在梯度SDS-PAGE上跑探针,然后将其电转至硝酸纤维素膜[25]。首先将抗原斑点在含有1%Tween20的PBS中浸泡1小时,使斑点处的蛋白复性。将膜进一步用溶于PBS的4%明胶溶液在37℃培养2小时以封闭,再与1012CFU/ml的噬菌体(在室温下与含有1.5%BSA的4%明胶溶液预培养30分钟)室温培养1小时。然后将膜用PBS、0.1%Tween20洗三次,用PBS洗三次,检测噬菌体的结合,通过与1∶8000稀释的溶于5%脱脂奶粉/PBS的HRP缀合的抗M-13抗体室温培养1小时。用PBS/0.1%Tween20洗三次,和用PBS洗三次后,用ECL检测剂(Amersham)将条带显影。用TPBS印迹持续洗后,将膜在ECL反应剂中培养1分钟。随后将每张膜与Hyperfilm-ECL胶片培养并冲印。
与分离自有机体的天然抗体相比,重组单克隆抗体通常仅表现出10-30%的亲和力。但是,通过噬菌体展示技术产生的,每个病毒变异体组群的个人(病人)的HIV特异性单克隆抗体的集合(嗜粒文库)足以选择大多数HIV env和其他肽及蛋白,用于开发抗HIV-1的预防性疫苗(图7a,b,8a,b)。
为了制得呈现有重组噬菌体的嗜粒文库,在TG1大肠杆菌的过夜培养物中加入M13KO7辅助噬菌体预培养1小时,并在100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素存在下,在37℃培养12小时(通常噬菌体的产量为每毫升1010到1011个氨苄青霉素转导单位)。培养物在1000g离心10分钟,收集上清液并冷却。然后在上清液中加入1/5体积比的PEG8000/NaCl(20%PEG/2.5M NaCl)溶液,在冰上培养1小时,然后在4℃10000g离心20分钟进行沉淀。将沉淀物用LB或10mM pH8.0的TrisHCl溶解,通过0.45μm的膜过滤。如果加入0.01%的硫柳汞,则重组的噬菌体可以在4℃保存。
i)在超大孔径环氧活化的整体冷冻凝胶(cryogel)(Protista Biotechnology)色谱柱中嵌入固定的M13特异性单克隆抗体。在超大孔径环氧活化的整体冷冻凝胶(ProtistaBiotechnology)中嵌入M13特异性的单克隆抗体。为此,将干燥吸附剂重悬于含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3pH8.3缓冲液中。M13特异性的单克隆抗体在同样的缓冲液中溶解至浓度为10mg/ml,加入吸附剂中,并在室温中在机械搅拌下培养1小时。培养后,吸附剂用5倍体积的同样的0.1M NaHCO3pH8.3/0.5M NaCl缓冲液洗。为了封闭非特异性的反应性基团,将吸附剂用0.1M pH 8.0的Tris-HCl缓冲液,或1M pH 8.0的乙醇胺在室温培养2小时,然后调整至5ml的色谱柱。
对两种方法来说,首先都要将特异性针对gp120、gp140、gp160以及它们的片段、gp41、p24的M13噬菌体颗粒与上述得到的(第4阶段)水解的HIV-1肽混合物在37C培养40分钟。然后将噬菌体颗粒在固定的M13噬菌体特异性抗体的帮助下嵌入到:
制备的超大孔径环氧活化的带有嵌入的M13特异性单克隆抗体的整体冷冻凝胶色谱柱,用0.05M Tris-HCl pH8.0缓冲液平衡,然后将溶于同样缓冲液的重组M13用液相色谱系统ActaPrime Plus(GE Healthcare)以0.5ml/min的速度调节5小时。然后用5倍体积的同样的0.05M Tris-HCl pH8.0缓冲液冲洗柱子。
用扫描探针显微镜方法(原子力显微镜)对重组噬菌体的嵌入进行研究。图6b显示了成功嵌入了HIV特异性的ScFv噬菌体文库的冷冻凝胶,图6a显示了对照的超大孔径环氧活化的整体冷冻凝胶柱的结构。
在0.05M Tris-HCl pH8.0缓冲液中水解的HIV-1肽混合物,以0.5ml/min的速度注入已有嵌入的亲和柱中,持续5小时。然后用5倍体积的同样的0.05M Tris-HCl,pH8.0缓冲液冲洗柱子。
结合HIV肽的噬菌体用0.1M甘氨酸在pH2.2的梯度中洗脱。得到的组分在含有0.001MPMSF的甘氨酸洗脱缓冲液中室温培养5小时,直到噬菌体抗原复合物完全重新调整。
用高效液相色谱(HPLC,Waters)将HIV肽分析[2]和纯化。用装备有Symmetry C18柱(5μm,4.6mm×150mm,流速0.5ml/min)的Waters 1525HPLC系统进行分析反相HPLC。用带有Symetry C-18柱(10μm,5.0cm×25cm)的Waters 1525HPLC系统和Waters的紫外检测器进行预备反相HPLC。用乙腈在水/0.1%三氟乙酸(TFA)中的线性梯度来洗脱结合的肽。
6.使用液相色谱质谱联用(LC-MS)方法对env肽的可变性和频率进行定量和序列分析;
从反向淘筛的HIV特异性噬菌体文库中收集天然HIV-1env肽作为样品来源。用一维液相色谱-质谱(LC-MS-MS分析)进行env肽的定量选择、质量分布以及表征分析。
用离子电喷雾四级质量分析捕捉方法,通过Esquire 6000plus设备(Bruker Daltonics,Bremen,德国)分析SDS-PAGE胶上看起来与[10]相似的蛋白条带,以及2D中的未被识别为肽质量指纹的单点。通过低压色谱系统Ultimate LC Packing和样品选择器Famos LC Packing(Dionex,加州,美国)的在线方案获取样品。色谱部分由两种随后相连的柱子组成,两者之间有一个电磁阀门。第一个柱子(100μm×3sm)具有疏水聚合物相Poros R2,大孔直径、类似物C8,其被用于样品的浓缩和脱盐。第二个柱子(75μm×25sm)具有Phenomex吸附剂,硬粒大小为5μm,孔直径为类似物C18,其被用于分离脱盐后的三(triptic)肽的混合物。色谱分离的条件如下所示:200μl/min,在分离器之前的实际消耗速度为900nl/min,分离过程中为200nl/min。使用带有5%到60%溶液B(75%乙腈(acetonitryl)、25%异丙醇、0.1%甲酸)的线性梯度进行48分钟的肽分离。
所有的测试都是在300-2500m/z间测得,捕捉质量优化等于700。带电荷数为2或更多的离子,以及密度超过阈值的离子被用于串联实验。获得的质量印迹(mass-prints)被发送至MASCOT检索系统。通过蛋白质组数据库进行检索,结果使用用于肽识别确认的软件复杂骨架Scaffold 01-07-00(http://www.proteomesoftware.com)进行验证。识别期望值超过95%的肽列在最终的数表中。所有观察到的肽质量与计算得到的平均质量匹配度在0.5Da以内。
表格代表env蛋白分子多肽序列的疏水片段(Y轴正值)和亲水片段(负值)(图3)。
onf:置信度(0=低,9=高)
pred:预测的二级结构(H=螺旋,E=链,C=卷)
AA:目标序列
疏水氨基酸相关值:
Ala:1.800Arg:-4.500Asn:-3.500Asp:-3.500Cys:2.500Gln:-3.500Glu:-3.500Gly:-0.400His:-3.200Ile:4.500Leu:3.800Lys:-3.900Met:1.900Phe:2.800Pro:-1.600Ser-0.800Thr:-0.700Trp:-0.900Tyr:-1.300Val:4.200Asx:-3.500GIx:-3.500Xaa:-0.490
a)#Al.RU.03.03RU20_06_13_AY500393
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gp120内侧结构域
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7.克隆主要的HIV env肽,在利什曼原虫tarentolae种中生产用于疫苗开发的重组肽;
HIV的生命周期发生在人体、猴或啮齿类动物中,它的蛋白的糖基化更接近于哺乳动物的代谢。真核表达系统不仅包括酵母系统、丝状真菌,还包括来源于昆虫、哺乳动物和/或植物的细胞培养体系。gp120和gp41在它们的外侧结构域中高度糖基化。如果表达的片段或蛋白需要具有糖基化,则应该在真核生物系统中进行表达,例如在酵母中、哺乳细胞培养中、利什曼细胞培养中、牛痘病毒表达培养中。可以在哺乳动物细胞中进行表达,如CHO-K1(中国仓鼠细胞)或Cos-7(非洲绿猴肾表皮细胞),但是由于哺乳动物细胞在细胞代谢中有上百万种蛋白,因此对重组蛋白的表达很低,而且生产的重组蛋白难以通过色谱分离。因此,我们选择了利用利什曼原虫tarentolae种作为env肽的生产系统。
在用定量质谱分析后,将池中代表压倒性多数的gp120变异体进行测序以及克隆。正如大量文献中所显示的那样,gp41序列的变异对于HIV特异性的免疫反应并不重要(图10d,实施例4)。对于产生HIV特异性的抗体来说,gp41的糖基化水平和与gp120的偶联要比gp41的序列变化更为重要[31],因此我们考虑只取用来自病人群体的一种变异体的基因作为标准组分用于克隆。在得到的gp120蛋白序列的基础上,使用特异的引物对(表8),从病人淋巴细胞的cDNA组中通过两轮巢式PCR,扩增对应的编码gp120env肽的前病毒DNA片段。引物本身和它们的组对可以随LC-MS分析结果而变动。
可以克隆编码整个gp120和gp41肽、gp120内侧结构域和gp120外侧结构域和gp41外结构域(请见图10a,b,c的gp120结构)的DNA片段。图11a,b中显示了HIV-1的编码gp120、gp41和它们的主要结构域的DNA片段的PCR扩增方案。表8中显示了用于扩增envgp120、gp41和它们的结构域的引物对。根据克隆载体的变异体选择限制性酶切位点,NcoI标记为粉红色,XbaI-为蓝色,NotI-为橙色,NheI-为绿色。在每种情况下,为得到最佳免疫结果,什么区域才是最适合克隆的区域由研究者根据其技术知识或经验进行选择。
表8.扩增HIV-1gp120、gp41和编码其主要结构域的DNA区域所使用的寡核苷酸引物
120正向引物是指用于扩增gp120内侧结构域的正向引物;41正向引物是指用于扩增gp41外结构域的正向引物。
选择疫苗开发中用于生产重组蛋白的表达系统时,有几个特点至关重要。它们的表达应该是:i)可诱导的;ii)具有相似的糖基化或哺乳动物的翻译后修饰。
为得到合理数量和浓度的重组肽,可诱导的表达是必要的。如图12所示,在可诱导的系统中,在SDS-PA胶电泳扫描(图12a)中可以看见重组蛋白的表达。如果细胞是用非诱导型的表达载体转染的,通常需要用Western印迹来检测,因为其在SDS-PAGE中不够明显(图12b)。
为疫苗接种而生产的重组肽的糖基化应当尽可能地与病毒宿主-真核淋巴细胞-的天然典型形式相似。在真核细胞培养物中,要在它们自身的上百万种蛋白质中获得对重组蛋白的任何足够量的表达都很困难,而且非常昂贵。因此,可以在酵母菌株、昆虫细胞或真核的细胞寄生虫系统中进行HIV-1囊膜蛋白(gp120、gp41和整个gp160)的生产。我们考虑的选择是锥虫类原生动物(trypanosomatid protozoan)的宿主利什曼原虫tarentolae种,其综合了真核蛋白的表达/折叠/修饰类型以及易于操作的特点,而且对哺乳动物没有致病性。这种表达系统的主要的优势在于可对目标蛋白进行哺乳动物类型的翻译后修饰,如糖基化、磷酸化或异戊烯化(图13)。
最方便的方法是用Jena Bioscienece GmbH公司设计的LEXSYcon2表达试剂盒和LEXSinduce2表达试剂盒中的pLEXSY载体来克隆HIV-1囊膜蛋白。在锥虫类原生动物中,mRNA被转录成多顺反子的前体,其可在转录后通过反剪切以及在基因间隔区内进行多聚腺苷酸化,处理成单个mRNA。在这些物种中的蛋白表达调控主要发生在RNA水平,可能受基因间隔区的结构的影响。在pLEXSY载体中,使用的基因间隔区被优化以便于在利什曼原虫tarentolae种中进行异源蛋白表达(Jena Bioscienece GmbH)。
pLEXSY-2载体允许目标蛋白的组成型表达,可以带有或不带有分泌信号肽(图14中的SP),然后将表达框整合入染色体的18S rRNA基因座(ssu)。因此同样的载体可以用于克隆细胞质表达或分泌型表达的开放阅读框(ORF)。编码在这些载体上的LmSAP信号肽来自墨西哥利什曼原虫的分泌型酸性磷酸酶基因(lmsap1)。目标HIV-1蛋白的ORF与这个信号肽在表达框内的融合可允许在LEXSY宿主中进行分泌型表达,而在编码信号肽的序列的5′末端克隆插入任何的限制性酶切位点都会导致细胞质内表达。
将目标基因插入pLEXSY表达载体中
pLEXSY-2载体允许通过替代其所包含的1kb填充片段来直接插入目标基因表达框。得到的连接混合物用于转化大肠杆菌的感受态细胞,其可耐受利什曼原虫的序列(Stbl2,Stbl4,XL-1,XL-10,SURE等)。使用氨苄青霉素来选择重组的大肠杆菌克隆。在大肠杆菌中进行构建之后,通过SwaI完全消化将表达质粒线性化,此后将含有目标基因的表达框通过同源重组的方法整合入LEXSY宿主P10的染色体18S rRNA ssu基因座。在大肠杆菌中,在目标基因插入点前没有转录和/或翻译信号,因此,在大肠杆菌中不能进行的基因表达有利于生产对大肠杆菌有毒的蛋白的构建子。
为进行组成型细胞质表达或由HIV-1囊膜信号肽支持的组成型分泌型表达,HIV-1囊膜基因(gp120、gp41和编码信号肽、gp120和gp41的整个env基因)用含有NcoI(正向)和NheI(反向)位点的引物(表8)进行扩增,用NcoI/NheI消化后克隆入pLEXSY-2载体中。在这种情况下,目标HIV-1蛋白融合带有C末端的六聚组氨酸伸展段。或者,HIV-1囊膜基因用含有NcoI(正向)和NotI(反向)位点的引物扩增,用NcoI/NheI消化后克隆入pLEXSY-2载体中。在这种情况下,获得的目标HIV-1蛋白缺乏C末端的六聚组氨酸伸展段。
为进行由来自pLEXSY-2载体的LmSAP信号肽所确保的组成型分泌型表达,HIV-1囊膜基因(gp120、gp41和缺乏信号肽部分的整个env基因)用含有XbaI(正向)和NheI(反向)的引物进行扩增,用XbaI/NheI消化后克隆入pLEXSY-2载体中。在这种情况下,目标HIV-1蛋白融合带有C末端的六聚组氨酸伸展段。或者,用含有XbaI(正向)和NotI(反向)位点的引物扩增HIV-1囊膜基因,用XbaI/NotI消化后克隆入pLEXSY-2载体中。在这种情况下,获得的目标HIV-1蛋白不含C末端的六聚组氨酸伸展段。
注意:XbaI、NcoI、NheI和NotI等限制性酶切位点在来源于前苏联的HIV-1 A1亚型的env基因中比较少见。pLEXSY-2载体的图示在图14中显示。LEXSinduce2表达试剂盒含有pLEXSY_I-neo2(编码氨基葡萄糖甙磷酸转移酶),其适合在LEXSY宿主T7-TR中用于四环素诱导的细菌噬菌体T7聚合酶驱动的表达。
重组蛋白的表达
pLEXSY_I-2载体允许带有或不带有分泌信号肽的目标蛋白的可诱导表达。因此,同样的载体可用于克隆可诱导的细胞质表达或可诱导的分泌型表达的开放阅读框。在这些载体中编码的LmSAP信号肽来自墨西哥利什曼原虫的分泌型酸性磷酸酶的基因(lmsap1)。目标蛋白的ORF与这个信号肽在表达框内的融合可允许在LEXSY宿主中的分泌表达,而在编码信号肽的序列的5′末端克隆插入任何的限制性酶切位点都会导致细胞质表达(图5)。在表达框整合入利什曼原虫tarentolae种T7-TR接受菌株的染色体中鸟氨酸脱羧酶(odc)基因座后,pLEXSY_I-2载体家族确保了目标蛋白的可诱导表达。利什曼原虫T7-TR接受菌株在宿主RNA聚合酶I的控制下,组成型表达细菌噬菌体T7 RNA聚合酶和TET阻遏子。在最初的克隆步骤中,向目标基因提供含有限制性酶切位点的连接序列,使得其可以插入pLEXSY_I-2载体的T7启动子/TET操纵子结构的下游。这些载体含有优化过的位于目标基因插入位点邻近区域的非翻译区,其为转录后mRNA的处理提供了剪接信号。在大肠杆菌中进行构建以后,将表达质粒线性化,然后将其通过同源重组的方法整合入LEXSY宿主T7-TR的odc基因座中。
为进行四环素可诱导的细胞质表达或由HIV-1囊膜信号肽保证的四环素可诱导的分泌型表达,HIV-1囊膜基因(gp120、gp41和编码信号肽、gp120和gp41的整个env基因)用含有NcoI(正向)和NheI(反向)位点的引物进行扩增,用NcoI/NheI消化后克隆入pLEXSY-2载体中。在这种情况下,目标HIV-1蛋白融合带有C末端的六聚组氨酸伸展段。或者,用含有NcoI(正向)和NotI(反向)位点的引物扩增HIV-1囊膜基因,用NcoI/NotI消化后克隆入pLEXSY-2载体中。在这种情况下,获得的目标HIV-1蛋白不含C末端的六聚组氨酸伸展段。
为进行由来自载体的LmSAP信号肽保证的四环素可诱导的分泌型表达,HIV-1囊膜基因(gp120、gp41和缺乏信号肽部分的整个env基因)用含有XbaI(正向)和NheI(反向)的引物进行扩增,用XbaI/NheI消化后克隆入pLEXSY-2载体中。在这种情况下,目标HIV-1蛋白融合带有C末端的六聚组氨酸伸展段。或者,用含有XbaI(正向)和NotI(反向)位点的引物扩增HIV-1囊膜基因,用XbaI/NotI消化后克隆入pLEXSY-2载体中。在这种情况下,获得的目标HIV-1蛋白不含C末端的六聚组氨酸伸展段。
在pLEXSY载体家族中用NcoI/NheI或NcoI/NotI位点克隆的整个HIV-1 env基因,或者不含固有信号肽的HIV-1 env基因,以及,或者融合了来自pLEXSY载体中的LmSAP信号肽的HIV-1 env基因(在pLEXSY载体中用XbaI/NheI或XbaI/NotI克隆),可以用于建立质粒构建子,从而允许将特定的gp120序列迅速替换为从不同HIV-1病毒株中获得的其他gp120序列的变异体。为此,在env基因序列的gp120末尾和gp41起始之间通过定点突变引入另一个XbaI位点。此后,pLEXSY::HIV-1 env质粒构建子用NcoI/XbaI消化(当整个env基因是克隆在NcoI/NheI或NcoI/NotI位点中时)或只用XbaI消化(当不含固有信号肽的HIV-1的env基因是克隆在XbaI/NheI或XbaI/NotI位点中时),并除去gp120序列。得到的质粒衍生物适用于克隆gp120序列,这些gp120序列是从其他HIV-1病毒变异体中通过使用含有NcoI(正向)或XbaI(正向)和XbaI(反向)位点的引物PCR扩增得到的。
培养LEXSY-2宿主和表达株
利什曼原虫在有氧条件下生长,分两个阶段:有鞭毛的前鞭毛体(在昆虫宿主中的野生型)和脊椎动物宿主中的无鞭毛体。在T7-TR LEXSY-2宿主中,两种阶段都可在体外培养,在26℃暗处培养,使用完全培养基(LEXSY BHI或LEXSY YS),或化学配制的培养基(合成LEXSY培养基),用37g/l的LEXSY BHI粉末配制培养基,经高压灭菌(琥珀色),最多存放6个月。使用前,培养液中添加入5μg/ml血红素,100μg/ml青霉素和50μg/ml链霉素以防止细菌污染。培养液可在4℃暗处存放,添加后2周内使用。在完全培养基中无须加入血清,因为胎牛血清不能促进利什曼原虫tarentolae种的生长。在宿主或LEXSY株出现生长抑制的情况下,应将细胞在2000g离心5分钟,在新鲜培养液中小心重悬,然后继续培养。细胞株可以通过1∶10到1∶50的比例进行常规稀释,以及持续的悬浮培养进行维持。在中-晚期生长期时(OD2-3;8×107-1.4×108个细胞/ml)进行接种可以得到最佳结果。对于细胞株的维持,可以很方便地在周一和周五将10ml培养物以1∶20倍稀释,并在TC瓶中直立培养。在显微镜下可见存活的细胞是带有运动鞭毛的运动的前鞭毛体;死细胞则是圆形或破损的形状,它们也不运动。
可以在用于悬浮培养的透气的组织培养(TC)瓶中进行重组蛋白表达培养,培养体积为10-200ml,或者在三角瓶中在培养箱里以大约140rpm的速度摇晃培养,在标准生物反应器中的培养体积为50ml到1L,最高为1L。在50μg/ml的新霉素存在下选择pLEXSY-neo2载体的重组子。
LEXSY宿主和LEXSY表达株可以在20%的甘油中在-80℃保存至少1年。在15ml的Falcon管中加入1/4体积的高压灭菌的甘油(80%)和3/4体积的含有处于中期生长期的4-8×107个细胞/ml(OD1.2-1.8)的LEXSY BHI*培养基,与甘油混合并分装到无菌冻存管中。将这些管在室温放置10分钟,然后在湿冰中放置1小时,在-20℃放置一段时间,并转移到-80℃长期存放。为重新激活甘油储备物,将冻存管在冰上化开,内容物倾倒入10倍的补充培养液中,在直立的透气瓶中在26℃静置培养2天,直到培养物变混浊。
制备LEXSY宿主转染用的表达质粒
将1-5μg从大肠杆菌中获得的含有目标基因的表达质粒用SwaI完全消化。产生的2.9kbp片段代表大肠杆菌的组分,一更大的片段代表线性化的表达框,其含有要整合入LEXSY宿主的染色体ssu基因座的目标基因,将这些片段在琼脂糖凝胶上跑胶。该更大的表达框片段用琼脂糖凝胶提取试剂盒分离。酶和缓冲盐可以用PCR纯化试剂盒除去。或者,将消化物用乙醇沉淀,用70%的乙醇洗涤,并且每次转染最多用50μl的无菌双蒸水或10mM Tris pH8重新溶解。
电穿孔转染LEXSY宿主株
为有效转染,利什曼原虫tarentolae种预培养物以1∶20的比例接种到10ml LEXSY BHI培养液中,并在组织培养(TC)瓶中在26℃直立培养,两天后,预培养物以1∶10的比例在10ml培养液中稀释,在同样的条件下培养过夜。长成的培养物应当含有6×107个细胞/ml(OD1.4,波长550到600nm之间,3%福尔马林);用显微镜镜检确保细胞的存活以及呈水滴形状。细胞在2000g室温离心5分钟,除去1/2体积的上清液。沉淀物在剩余的培养液中重悬(108个细胞/ml),湿冰上放置10分钟。平行管中是溶于最多为50μl的水或Tris缓冲液的0.1-5μg的转化DNA,在湿冰上备好。350μl预冷的细胞加入有DNA的管中,转移至在湿冰上的直径为2mm的电穿孔杯中,避免产生气泡。电穿孔参数为450V、450μF、脉冲5-6毫秒。电穿孔后,将电穿孔杯放回冰上,放置正好10分钟。然后将电转过的细胞用毛细管转入10ml LEXSY BHI中,并在26℃培养过夜(ca.20小时,OD0.3-0.4)。
选择转基因的LEXSY株
为建立表达株,可以使用下面平行描述的两种常规方法。为染色体整合而设计的线性化的表达框在转染以后可进行克隆或非克隆的挑选,当比较衍生自这两种挑选的培养物时,发现它们总是具有相似的表达水平。但是环状表达质粒的转染需要克隆挑选,因为游离体更易于扩增并最终以异源的方式整合入基因组。用环状DNA转染后在悬浮培养物中进行非克隆挑选往往导致表达水平降低。
在固体培养基上铺板进行克隆挑选
LEXSY宿主细胞在新鲜制备的琼脂糖平板上挑选。从转染后的10ml o/n培养物中取出1-4批2ml的样品,剩下的培养物可以平行用于非克隆挑选。细胞在2000g 20℃离心5分钟,沉淀物在50-100μl的剩余培养液中重悬,重悬的细胞铺展到新鲜制备的添加了50μg/ml新霉素的LEXSY BHI琼脂糖基上,铺展的方法是将细胞在置于琼脂糖表面的硝酸纤维素滤膜上划线。在这些膜上铺板比直接在1%琼脂糖基上铺板更容易,而且还可减少细胞的聚团。除此之外,在膜上铺板可允许揭起膜进行克隆群体的表达谱测试,例如,通过荧光扫描或对给定目标蛋白的特定检测方法进行。培养板用封口膜密封,在26℃倒置培养。
铺板后5-7天,开始出现小的清晰的菌落,在铺板后第7-9天,当菌落长到1-2mm直径时,就可以用枪头将它们转移至96孔板中的0.2ml选择性生长培养基中,培养1天后,转移至24孔板中的1ml选择性培养基中。再经过26℃中的24-48小时的培养,可将培养物扩大至TC瓶中的10ml选择性培养基中,可被用于评价和冻存。
悬浮培养物的筛选
从转染实验中获得10ml o/n培养物(见4.4)一旦开始变得轻微混浊(OD600 0.4,ca.107个细胞/ml;通常在电穿孔后大约20小时),就加入50μg/ml新霉素并在26℃继续培养7天。在显微镜下可见重组细胞可运动,呈水滴形状且长成“雾状”悬浮培养物,而阴性对照的细胞则在筛选期间开始死亡,且在显微镜下呈现出球形或不规则形态,没有鞭毛。通常在选择的第7天接着再以1∶10的比例接种细胞至含有新霉素的新鲜培养液中就足以获得耐抗生素的重组细胞系的混浊培养物。
基因组整合和重组env肽表达的确证
表达框在ssu基因座的整合可以通过诊断性PCR或者测序来确证,使用转基因株的基因组DNA作为模板。对于pLEXSY I-2载体,可以使用抗生素耐药表达框的正向引物和odc反向引物P1510(表9)进行诊断性PCR(退火温度55℃)。将表达框整合入odc基因座会导致一特征性片段(分别为1.9或2.0kbp),其在对照组的反应中没有发现。此外,还可以使用odc正向引物A1304和aprt反向引物A1715(在目标基因的5′非翻译区内杂交)进行诊断性PCR(退火温度60℃)。将表达框整合入odc基因座会得到一特征性的1.1kbp片段,其在使用表达质粒或LEXSY宿主株的基因组DNA的对照组的反应中无法得到。
通过用SDS-PAGE和Western印迹分析细胞提取物,或者如果是分泌型表达的话,分析上清液的等分,来评价目标蛋白在重组LEXSY株中的表达。为得到最优的表达,可以针对每种单个蛋白选择调节在不同的四环素浓度中平均1μg/ml四环素诱导的表达、培养条件和收获时间。
表9:LEXSinduce2试剂盒(Jena Bioscience)可使用的引物序列。
引物 | 5’-3’核苷酸序列 | |
插入测序正向P1442 | CCG ACT GCA ACA AGG TGT AG | 所有带有aprt的5’非翻译区的“AP”表达载体 |
插入测序反向A264 | CAT CTA TAG AGA AGT ACA CGT AAAAG | 所有LEXSI表达载体 |
Odc正向引物A1304 | TCC GCC ATT CAT GGC TGG TG | 所有odc表达载体的诊断整合 |
Aprt反向引物A1715 | TAT TCG TTG TCA GAT GGC GCA C | 所有带有aprt的5’非翻译区的aprt表达载体的诊断整合 |
Neo正向引物A1432 | GCA TGG CGA TGC CTG CTT GC | 所有odc表达载体的诊断整合 |
Odc反向引物P1510 | GTG CAC CCA TAG TAG AGG TGC | 所有SSU整合载体的诊断整合 |
8.重组HIV env肽的生产和色谱纯化
为生产蛋白,重组株在完全LEXSY培养液BHI(Jena Bioscience)中生长至OD600D2(108个细胞/ml)。在细胞转移入新鲜培养基后1小时,加入5mg/ml四环素,诱导蛋白生产,将培养物在26℃在MultitronII培养箱摇床(Infors AG,瑞士)上以130rpm的速度摇晃培养24-72小时直到OD值达到ca.1.8。通过含有十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹,检测培养物上清液中和细胞中存在的重组gp120。为验证N-糖基化的存在,我们将培养物上清液或细胞用N-糖基化酶处理,并分析处理后的蛋白的电泳迁移。
表达蛋白的利什曼原虫细胞在2500g离心10分钟,沉淀物在20mM Tris,pH8.0,150mMNaCl,5mM EDTA,1mM PMSF中重悬。用超声器在2OkHz用19mm探针进行细胞裂解,在冰上用10次1分钟的脉冲,脉冲间隔为2分钟。收集澄清的上清液,用0.45μm孔径的滤膜过滤,在色谱柱中对重组的gp120进行亲和纯化,色谱柱含有固定的金属离子,使用偶联在琼脂糖上并带有镍的氨三乙酸(Ni-NTA)(GE Healthcare)。简单地说,Ni-NTA柱用三倍体积的缓冲液以1ml/min的流速冲洗(LC Akta Prime Plus,GE Healthcare),缓冲液含20mMTris,pH8.0,150mM NaCl,5mM EDTA,1mM PMSF。然后将含有重组gp120(r-gp120)的过滤后的上清液以0.25ml/min的流速上样至色谱柱。上样后,色谱柱用三倍体积的冲洗缓冲液冲洗(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5mM咪唑,pH7.4)。r-gp120被色谱柱里的肠激酶切断,从而除去多聚组氨酸尾。为做到这点,在色谱柱中用含有10mM Tris-HCl,10mM CaCl2,pH8.0的缓冲液引入1个国际单位(IU)的肠激酶(Ek),允许剪切反应在25℃时进行18小时。或者,将带有多聚组氨酸尾的目标蛋白在咪唑梯度(溶于100mM Tris-HCl pH 8.0的0-0.5M咪唑,含有150mM NaCl)中洗脱。合并含有蛋白的组分,并进行超滤浓缩。通过SDS-PAGE/银染,和用抗人gp120抗体进行Western印迹分析这些组分。合并含有r-gp120的组分,以0.1MTris-EDTA缓冲液,pH8.0进行透析,上样至按照标准方法[2]用相同的缓冲液平衡过的阴离子交换柱(Q-PEEK 10μm AXC Biosuite,Waters)。用0-1M NaCl梯度洗脱蛋白。含有r-gp120的组分最后通过胶过滤的方法用Sephacryl S-200HR(GE Healthcare)精制。
用自动Edman降解的方法对纯化的rhEPO的N末端进行测序。纯化后的蛋白用BCA实验测定浓度。用SDS-PAGE对在蛋白表达的不同阶段获得的和纯化的组分进行分析。蛋白条带用考马斯亮蓝R-250或银染进行显色。
a.制备HIV预防性疫苗增强免疫反应的组合物,使用立体稳定化的脂质体或病毒体作为疫苗传递的载体。
任何通过口服、皮下、肌内或者静脉内给药的,用于在将来接触某些细菌或病毒感染疾病时对这些疾病提供特定免疫反应的药物,其通常被称为“疫苗”,必须满足多个要求。这些要求主要有:
iii)该免疫反应对确定的致病微生物或者感染有高度的特异性;
iv)该免疫反应足以抵抗这种特定感染的发展,防止疾病症状的出现;
v)该免疫反应能持续很长一段时间,几个月或是几年;
vi)除了以上提到的要求以外,该疫苗对人类有机体不具有反应性(免疫毒性)。
根据本发明内容,可以通过将HIV预防性疫苗与免疫刺激剂或者免疫原性载体如佐剂相结合,来增强它的效果。碳水化合物化的重组gp120以及天然HIV env蛋白的混合物有很强的免疫原性,当皮下接种时不易耐受,其本身提供很强的免疫反应(实施例4)。但是就所有的纯蛋白质而言,其在有机体中的生物降解很快,如果没有用任何防腐剂或蛋白酶抑制剂佐剂将肽固定的话,则免疫反应将在两至三个星期内耗尽。我们的第一个想法是保护env肽不被降解,将它们包装在对网状内皮系统不可见的立体稳定化的脂质体(SSL)中。但是在最初的小鼠实验中,SSL能够在足够长的某段时间内使肽保持内载(enloaded)或者结合状态,从而降低其急性免疫毒性。对于肽来说,立体稳定化的脂质体平台汇集了总免疫毒性低和药效更好(药物的适时释放)的优点,正如在蒽环类的脂质体药物形式中已经证实的那样。脂质体肽可以从SSL中缓慢地准确地释放出,就像细胞稳定剂(cytostatics)或其它小分子量的制剂那样。对即时免疫反应的抑制使得可以在单次给药中增加肽的剂量,并延长病毒env肽与MHC的会合(junction)接触时间,以产生足够长的增强免疫反应。通过这种方法,SSL同时作为增强免疫反应的佐剂和作为疫苗传送系统使用。
可以通过任何合适的方法制备本发明的有效组合物的具体制剂形式,使得当制剂给药时佐剂在给药对象中具有生物可降解性,安全性和有效性。以下进一步描述了两种方式:
i)env肽混合物载入立体稳定化的脂质体(SSL)中;
ii)env肽共价连接到SSL的PEG活化基团;
iii)env肽呈现在具有可能构造的病毒体上(pNL3-4、IRIV等)。
i)立体稳定化的脂质体的制备和肽的载入。
立体稳定化的脂质体是通过从含大约7∶3的磷脂:胆固醇和0.2-0.5Mol/%的聚乙二醇-二硬脂酰(磷脂酰)乙醇胺(PEG-DSPE)的混合液中真空干燥出氯仿,并在氮气流中形成囊泡的方法制备[40]。使用的脂混合物为:DOPC/Chol/DSPE-PEG350,DOPC/Chol/DSPE-PEG400等(Avanti Polar Lipids,伯明翰,阿拉巴马州)。脂质体的主要成份是二油酰磷脂酰胆碱(DOPC),它可以从如蛋黄,脑组织或大豆等天然资源中提取或者通过合成制备。胆固醇对于稳定脂质体膜中的双层磷脂是必需的,PE-PEG使膜稳定且坚固,防止悬浮的脂质体融合或降解,并且使它们能够保持其粒径分布和制剂内载而几个月不泄漏。SSL中PEG理想的分子量为400-700,在SSL设计中使用更长的PEG链1000-2000不具有优势,因为脂质体膜的坚固度会升高,超过传递其内容物所需要的坚固度,并且长PEG SSL组合物不符合自身生物降解的要求。为获得具有期望特征的脂质体,DSPE-PEG的百分含量是主要的微调因素。
将干燥的脂与有机溶剂-氯仿或者乙醇-氯仿-混合,然后在旋转蒸发仪中蒸发(BuchiR-200)形成一层薄的脂膜。在进一步的水合作用中制备脂质体混悬液,水合作用在含有溶解物质(例如,50mM NaH2PO4,400mM NaCl,pH 8.0)的水相缓冲溶液中进行,以300-400rpm速度搅拌,温度为+45℃,进行30分钟。制得大的多层囊泡(multilamellar vesicles)(MLV,300nm-1μm)和小的单一层囊泡(unilamellar vesicles)(SUV,80-250nm)的混合物。对于任何水溶性的物质如肽类的传递,小的单一层囊泡是必要的,因此,进行超声处理(600mV,Avanti Polar Lipids),并用0.4-0.2-0.1μm的聚碳酸酯膜(Avanti Polar Lipids)进行几轮过滤挤出。此外,在无菌条件下(分层的无菌注射器,膜和烧瓶)通过0.2-0.1μm的膜挤出制备可用于免疫的制剂。通过动态光散射激光亚微米粒径分析方法,使用DLS Nicomp-380仪器,确定脂质体在水相混悬液中粒径分布和稳定性(图17)。
在脂膜的水合阶段将用于免疫的重组肽混合物引入脂质体组合物中-肽混合物溶于磷酸盐缓冲液,并被装入脂质体囊泡的内部水相中[40]。经过挤出过程后,使用SephacrylS-200HR和Akta Prime LC系统(GE Healthcare)将SSL通过尺寸排除凝胶过滤色谱法进行转移,囊泡外多余的肽被分离并保留在色谱柱中。如果有必要的话,可以通过透析浓缩SSL混悬液,该SSL含有可用于免疫的疫苗组合物。
SSL疫苗组合物的皮下给药可能抑制免疫效果,因为该方法减缓了env重组肽从中性到MHC脂质体的引出。这个过程可以通过热敏脂质体-tSSL调节。TSSL不同于其它脂质体,其膜成份具有特别的定量组合或者具有某些额外的磷脂成份,其使得脂质体膜能够在温度达到特定度数时,通常为40-45℃,就立即融化。当局部加热时,热敏脂质体被破坏,其内容物-肽-被放入到组织中。例如,普通的立体稳定化的脂质体的熔化温度约为54-58℃,用于形成脂膜的干重混合物由磷脂酰胆碱∶胆固醇∶二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺-PEG组成,其比例为:对于PC∶Chol∶DSPE-PEG400为6.85∶2.75∶0.4(最高至0.5)Mol/%,对于更长PEG链PC∶Chol∶DSPE-PEG2000为6.9∶2.95∶0.15(最高至0.25)Mol/%。为制备热敏脂质体,研究人员可以改变某些参数,首先是混合物中脂的比例:分别将胆固醇的量从27-29增加至30-35Mol/%,将PE-PEG的百分含量从2-5Mol/%降低至1.5-2Mol/%。其他软化脂质体膜、降低其熔点的方法是,使用带有较短脂肪酸尾链的磷脂:二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC,C-14),二硬脂酰磷脂酸胆碱(DSPC,C-16),或者使用30-40Mol/%DMPC或DSPC代替等量的DOPC。
ii)与SSL的PEG活化基团相偶联的env肽
用于env重组肽的脂混合物的第二种脂质体载体是以活化的用于肽结合的更长的DSPE-PEG2000为代表:PDP-PEG2000-DSPE/Chol/DOPC,马来酰亚胺(苯丁酸盐)-PEG2000-DSPE/Chol/DOPC,对硝基苯(羰基)-PEG2000-DSPE/Chol/DOPC。PEG-2000在这些脂混合物中的浓度不应超过1.5-2Mol/%,因为与较短的聚乙二醇相比,较长的聚乙二醇能更有效的提高脂质体的稳定性,并且同样的浓度能使脂质体膜过于坚固而无法释放疫苗并阻碍脂的无害的生物降解。
肽和PEG活化远端缀合的第一种方法[38]是,在脂质体混悬液中将对硝基苯(羰基)-PEG-2000-DSPE与肽的氨基反应,以每25-40mg脂对1mg肽的比例,在pH为4.0-5.0,0.1M的柠檬酸盐缓冲液中进行(混悬液总体积为5.5-9ml)。加入NaOH使pH升至7.5-8.5使反应终止,无需任何特别的肽处理。
使用马来酰亚胺-PEG-2000-DSPE的方法[39]需要用Trautt试剂(2-亚氨基硫烷)将肽预先硫醇化。将1mg ICO-25溶解于含有Na3BO3和EDTA的硼酸盐缓冲液中,然后加入50-70μg干燥的Trautt试剂,混合物在室温下培养1小时,然后通过超滤洗去多余的蛋白质,同时将缓冲液更换为pH 8.0的PBS。通过Sepharose CL-6B(GE Healthcare,瑞典)液相色谱提取具有均匀大小和均匀的内载细胞稳定剂浓度的脂质体组分。
与含有PDP-PEG-PE的脂质体偶联的ODN-HIV env肽
为了制备PDP-肽衍生物,将肽溶解于25mM HEPES,140mM NaCl,pH 7.4溶液中,浓度为10mg/ml,然后向该肽溶液中缓慢加入溶于DMF的25mM琥珀酰亚胺基-4-MPB(SMPB)溶液,至20∶1的摩尔比例(SMPB:肽),并在室温下培养30分钟。使用SephacrylS-200HR色谱柱(GE Healthcare),在25mM HEPES,25mM MES,140mM NaCl,pH 6.7缓冲液中,通过凝胶过滤在低pH时除去未结合的SMPB。
加入二硫苏糖醇(DTT)至20mM的终浓度,并在室温下培养30分钟,以减少PEG链远端上的吡啶二硫基团。在升高的pH中,将脂质体通过Sephadex G-25色谱柱,用25mMHEPES,25mM MES,140mM NaCl,pH 6.7溶液洗脱,以分离DTT。硫醇化的脂质体与MPB-肽衍生物在室温下培养过夜,肽/脂的比例约为1∶1000。将脂质体用25mM HEPES,140mM NaCl,pH 7.4的溶液通过Sephacryl S-200HR色谱柱,以便通过凝胶过滤除去未结合的肽。
与COOH-PEG-PE-脂质体偶联的ODN-HIV env肽
在300μl溶于pH 4-5.5的MES缓冲液的含有HO2C-PEG-PE的脂质体的混悬液(总共3μmol脂)中加入120μl 0.25M的1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺的水溶液和120μl0.25M N-羟基磺基琥珀酰亚胺的水溶液。该混合液在室温下培养10分钟,并用1M NaOH中和至pH 7.5。将15μM HIV env肽加入至活化的脂质体中,反应混合液在4℃下轻柔搅拌培养8小时。使用PBS预平衡的Sephacryl S-200HR色谱柱(GE Healthcare)将结合了肽的脂质体从未结合的肽中分离出来。将在空体积(void volume)中洗脱的结合了肽的脂质体的峰组分进行收集、合并,如果必要的话,用盐水稀释至所需的体积。
还可以将env肽与镍修饰的磷脂结合,镍修饰的磷脂位于脂质体组合物DOPC/DOGS-NTA-Ni/Chol/DSPE-PEG-2000的PC尾链和PEG-DSPE尾链之间。然而,虽然已知DOGS-NTA可以刺激粘膜和其它B-淋巴细胞的免疫反应,但是env肽在PEG位置下被隐蔽,从而削弱了其抗HIV的特异性。该方法如下所述。
在结合反应中,重组(His)6-肽(10-80μg)与脂质体(1μM)在总体积为50μl的磷酸盐缓冲液中(50mM NaH2PO4,400mM NaCl,pH 8),在37℃或是室温下旋转摇动培养30分钟[17]。通过测量反应结束时的游离蛋白量来间接定量与脂质体结合的蛋白质。未结合的蛋白质使用Microcon-100离心仪分离。离心前,脂质体-肽混合物在磷酸盐缓冲液中稀释至250μl的终体积。在12000g离心13分钟后,使用micro-BCA实验分析20μl滤液中的游离蛋白的含量。通过从使用的总量中减去游离蛋白的量来确定与脂质体结合的肽的量。将这种对His-蛋白与脂质体结合的间接定量方法与直接方法进行比较,其可得出与直接方法相同的结果,直接的方法是通过Sephacryl S-200HR凝胶阵列(GE Healthcare)进行尺寸排除凝胶过滤色谱法分离出游离蛋白,之后用micro-BCA实验直接定量结合于脂质体的肽。
iii)呈现在具有可能构造的病毒体上(pNL3-4、IRIV等)的env肽
小的病毒及由其构成的载体可以用于表达和呈递env肽HIV疫苗。病毒体不太可能适用于预防性疫苗技术,并且其HIV特异性的增强免疫反应的作用也低于用于疫苗传递的SSL技术所能提供的作用。疫苗组合物仅含有表达在小病毒表面-病毒体(virosomes)-上的HIVenv肽,而不是病毒载体传递的env肽的基因。大病毒如腺病毒,腺相关病毒,牛痘病毒等不如病毒体候选物好,因为它们的衣壳上表达有上百种肽,而且在给药后它们增强的免疫反应的非特异性多于特异性。病毒体载体包括缺陷的HIV衍生物pNL3-4,对疟疾有确认的功效的流感病毒载体IRIV,和甲肝疫苗,麻疹病毒衍生物,不同脑炎病原体的α病毒,黄热病病毒载体和其它可能的变异体。
本发明的佐剂和含有佐剂的疫苗组合物可以有效应用的宿主动物包括灵长类动物和啮齿类动物或者其它哺乳动物。BalbC小鼠被用于确认首次免疫增强反应。两种载入的脂质体佐剂可以分开使用或者以不同比例混合使用。
对3周龄的BalbC小鼠进行皮下免疫,剂量为20-50μg动物用纯肽,干燥脂MW的混悬液中佐剂的浓度为5mg/ml。每组取7-8只或更多只小鼠。对那些开始吃硬食,重11-14g的动物进行免疫,第一次免疫是在小鼠3周龄时,第二次免疫是在2周后当它们为5周龄时,第三次免疫是在1个月后,当小鼠为9周龄时。重组gp120和其结构域和重组gp41及其外结构域被分别或共同用于制成组合物。使用之前用于噬粒文库生物淘筛中的r-gp120(gp110,gp160)变异体,r-gp41,以及天然的HIV蛋白混合物通过ELISA测定HIV env肽抗体的滴度。在最后一次皮下给药后的第三天、第十四天和第二十八天进行ELISA测试。实施例4中显示了某些结果。
从小鼠的实验中可以得出两个主要的结论:
1.gp120及其所有的衍生物,重组物和天然肽通过皮下注入BalbC小鼠后,具有高度的免疫原性,引发了HIV特异性的、持续的、强免疫反应。通过相同方法接种的重组gp41及其外结构域变异体引发了滴度低好几倍的特异性单克隆抗体和多克隆抗体。在HIV感染的人的血清中,以及在噬菌体M13上对抗体文库的呈现中,都观察到了抗体滴度的同样的情况。在病人中这种情况被认为是因为gp41的位置靠内,其在病毒囊膜中gp120之下。但是重组蛋白免疫具有相同的现象则证明了我们的观点,即在HIV预防性疫苗的开发中,正确识别gp120序列及其重组代表很重要,gp41应该作为组合肽“材料”使用,但是其序列中的变异并没有多少重要性。
2.与仅仅用肽免疫相比,脂质体佐剂组合物提供的免疫反应增强的时间更长,同时能减少急性的免疫毒性反应,从而允许增加肽剂量以产生抗HIV的保护反应。
使用常规的抗体滴度测量技术和常规的生物效应/生物兼容性方法,根据佐剂的特定种类期望的治疗效果,和期望的生物活性时长,本领域普通技术人员可以无需过多实验即可很容易地确定本发明的佐剂和疫苗组合物的剂量率和合适的剂型。疫苗及其成份的给药方式可以包括肠胃外方法如:皮下注射、经皮给药、透皮给药、鼻内给药和肌内给药。
感染者组群的HIV抗体文库用于HIV预防性疫苗的选择和产生,所开发的HIV预防性疫苗可抑制由所述感染者组群的HIV变异体所传播的感染,就此而言,开发的HIV预防性疫苗是在个体化药物的道路上迈出的一步。该疫苗不能作为单一的一次性开发的组合物用作对抗HIV感染传播的万能武器。但是,25年来对HIV研究和与艾滋病的对抗中所收集的全部HIV流行病学知识会为其实用开发提供大力的支持。
实施例
实施例1:下列电泳数据显示了含有HIV-特异性ScFv抗体片段的人重组IgG噬粒文库的各阶段(噬菌体展示技术)。
PCR-I结果——带有相应的部分Cκ或CL片段的κ和λ可变链。
从凝胶上切除的感兴趣的条带,以箭头标示。
缩写:1VL-带有部分CL片段的λ可变链
2VL-带有部分CL片段的λ可变链
1VK-带有部分Cκ片段的κ可变链
1a-10-不同的引物对
-VK-PCR阴性对照
100bp-GeneRulerTM 100bp DNA梯状条带(Fermentas)GeneRulerTM 100bp
DNA梯状条带
PCR-I结果——带有部分Cκ片段的κ-可变链,从凝胶上切除的感兴趣的条带,以箭头标示。
1a-10-不同的引物对1VK(2VK,3VK,4VK)
带有部分Cκ片段的κ-可变链
100bp-GeneRulerTM 100bp DNA梯状条带(Fermentas)
PCR-I结果——带有部分CL片段的λ可变链和带有部分CHl片段的IgM和IgG重链(H)可变链,从凝胶上切除的感兴趣的条带,以箭头标示。
1VL——文库1,带有部分CL片段的λ-可变链
1VHM(2VHM,3VHM,4VHM)-带有部分CHl片段的重链可变链(IgM)。
1VHG(2VHM,3VHM,4VHM)-文库1、2、3、4,带有部分CH1片段的重链(H)可变链(IgG)。
1a-10-不同的引物对
-VL;-VHG;-VHM-PCR阴性对照组
100bp-GeneRulerTM 100bp DNA梯状条带(Fermentas)
PCR-II结果-带有添加的连接片段的重链(H)可变链,编码((Gly)4Ser)3。从凝胶上切除的感兴趣的条带,以箭头标示。
1HG(2HG,3HG,4HG)-文库1、2、3、4,来自IgG cDNA池中的重链可变链;
1HM(2HM,3HM,4HM)-文库1、2、3、4,来自IgM cDNA池中的重链可变链
1a-7a-含有连接片段的不同的引物对
-H-PCR阴性对照;
PCR-II结果-带有添加的连接片段的κ-和λ-可变链,编码((Gly)4Ser)3。从凝胶上切除的感兴趣的条带,以箭头标示。
1K(2K,3K)-文库1、2、3、κ-可变链
1L(2L,3L,4L)-文库1、2、3、4、λ-可变链
1a-8-含有连接片段的不同的引物对
-K和-L-PCR阴性对照
100bp-GeneRulerTM 100bp DNA梯状条带(Fermentas)
PCR-II结果-带有添加的连接片段的κ-、λ-和重链(H)可变链,编码((Gly)4Ser)3。从凝胶上切除的感兴趣的条带以箭头标示。
1K(2K,3K,4K)-,κ-可变链
1L-文库1、λ-可变链
2HG(3HG,4HG)-文库2,3和4,来自于IgG cDNA池中的重链可变链;
3HM(4HM)-文库3和4,来自于IgM cDNA池中的重链可变链
1a-8-含有连接片段的不同的引物对
-K和-L-PCR阴性对照
100bp-GeneRulerTM 100bp DNA梯状条带(Fermentas)
收集的ScFv片段的凝胶定量。不同VH-连接片段-Vkappa ScFv变异体(文库4)。
再次放大VH-连接片段-Vkappa ScFv混合物(从文库4中)。从凝胶上切除的感兴趣的条带,以箭头标示。
K- 100bp VH-连接片段-Vkappa ScFv混合物
实施例2:重组HIV-特异性文库的特异性定量结果
a)用HIV-1阳性血清进行重组单克隆抗体克隆的ELISA检测结果
b)来自于由病毒肽A455选择出的噬菌文库中的38个噬菌体单克隆的ELISA结果(SigmaPlot 10.0统计分析)
c)来自于由重组gp110-,gp160选择出的噬菌体文库的26个噬菌体单克隆的ELISA结果(SigmaPlot 10.0统计分析)
实施例3:HIV Env肽可变性
HIV与其它致病病毒不同的是,它的肽序列具有极高的不均一性。序列改变的肽的三维结构也变得不同,在许多情况下,这些改变是在出现耐药病毒的表型以后,由相同的突变导致的。因此,使用单克隆抗体文库可以收集频繁碰到的变异体,并且获得表面病毒蛋白的重组形式。下面列出了某些A和B亚型HIV env肽序列的常见的变异体。可变氨基酸用蓝色标记,保守氨基酸用红色标记。其中一些序列是之前在我们实验室得到的。
实施例4:动物免疫的初步结果(SigmaPlot 10.0统计分析)
对3周龄的体重为11-14g的BalbC小鼠进行皮下免疫,剂量为20-50μg动物用纯肽,脂浓度MW为5mg/ml。对3周龄的老鼠进行免疫,2周后当它们5周龄时再进行第二次免疫,一个月后当小鼠9周龄时进行第三次免疫。重组gp120引发的免疫反应比重组gp41外结构域平均高5倍。将从病人血清中分离得到的人多克隆抗体用于同浓度的重组gp120和gp41ELISA染色时,可以观察到在特异性抗体滴度上同样的差别。
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Claims (18)
1.制备预防感染的HIV疫苗的方法,包括下列步骤:
i)建立单克隆抗体的噬粒文库,所述单克隆抗体表达于从感染了HIV-1A或B亚型的多个个体中获得的B淋巴细胞中;
ii)用天然或重组HIV-1肽进行淘筛以富集抗体嗜粒文库;
iii)用反向淘筛的方法,使用结合在支持物上的HIV-1噬粒文库,收集HIV-1肽/多肽/蛋白材料;
iv)对步骤iii)中得到的所述肽材料进行识别和分析;
v)用步骤iv)中的结果,在表达系统中生产糖基化的重组HIV-1env肽;
vi)纯化重组的HIV-1env肽并生产疫苗组合物。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述的个体,其为HIV材料的获得来源,是被同样的或不同的HIV亚型感染。
3.如任一前述权利要求所述的方法,其中所述个体,其为HIV材料的获得来源,是未接受过抗逆转录病毒治疗的病人或者是已经接受过抗逆转录病毒治疗的病人。
4.如任一前述权利要求所述的方法,其中所述获得的病毒材料在与所述支持物接触之前被扩增。
5.如任一前述权利要求所述的方法,其中所述的带有多种不同HIV特异性抗体和/或抗体片段的支持物是选自噬粒文库、肽芯片、或细菌文库。
6.如权利要求5所述的方法,其中所述噬粒文库是通过以下步骤制备:
a)制备DNA片段,所述DNA片段分别衍生自编码免疫球蛋白的轻链可变区和重链可变区的核苷酸,所述免疫球蛋白表达于从感染了HIV的多个个体中获得的B淋巴细胞中;
b)连接编码了免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段,使含有免疫球蛋白的轻链可变区和重链可变区的多肽分别得以表达,以得到大量的不同特异性;
c)在噬粒载体中克隆连接后的片段,转化细菌菌株,使其在细菌噬菌体的表面表达。
7.如权利要求6所述的方法,其中步骤a)中的DNA片段的制备包括从RNA池中制备cDNA,所述RNA池从感染了HIV-1A和B亚型的病人的B淋巴细胞中获得,所述病人接受过和/或未接受过抗逆转录病毒治疗,以及扩增所述轻链可变区和重链可变区。
8.如权利要求7所述的方法,其中扩增是用表1-7中所列的任意引物组合进行。
9.如权利要求6-8任一所述的方法,其中获得的scFv噬粒重组抗体特异性针对于耐药的HIV毒株,所述耐药的HIV毒株来自接受过HAART或其他任何抗逆转录病毒治疗的病人中。
10.如权利要求6到9所述的方法,其中步骤i)进一步包括在淘筛过程中富集呈现有抗体ScFv片段的噬粒文库,淘筛过程中HIV特异性抗体与重组gp120、gp41和分离自不同供体的天然HIV多肽相结合。
11.如权利要求1所述的方法,其中在步骤iii)中使用发明的反向淘筛技术进行HIV-1env肽/多肽/蛋白的分离。
12.如权利要求1所述的方法,其中在步骤iv)中使用液相质谱对HIV-1gp120及其标准片段和可变片段进行定量分析、识别和测序。
13.如任一前述权利要求所述的方法,其中步骤v)进一步包括在具有真核生物糖基化能力的适当的宿主中生产重组的HIV-1肽/多肽/蛋白。
14.如任一前述权利要求所述的方法,其中包括通过添加/结合任选的免疫原性刺激物、佐剂或载体来制备HIV预防性疫苗组合物。
15.如权利要求13所述的HIV疫苗,其包括重组gp41和gp120HIV-1A和B亚型env肽/多肽/蛋白。
16.如权利要求10-15所述的HIV疫苗,进一步包括立体稳定化的脂质体(SSL)或病毒体和它们的可能的变异体作为佐剂-载体。
17.一种HIV预防性疫苗,其可根据任一前述权利要求所述的方法获得。
18.如权利要求16所述的HIV疫苗,用于免疫未感染的个体使其免于获得和发展HIV感染和艾滋病的用途。
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