IT202100004160A1 - Cellula ospite di leishmania - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo
?Cellula ospite di Leishmania?
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto una cellula ospite (host cell) appartenente al genere Leishmania comprendente un polinucleotide codificante per almeno una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae. Inoltre, l?invenzione si riferisce ad un processo per la generazione di una cellula ospite appartenente al genere Leishmania e ad un processo per ottenere una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae.
STATO DELL?ARTE
La crescente diffusione di malattie infettive, in particolare, di malattie infettive del tratto respiratorio, sta spingendo la ricerca scientifica verso la ricerca di nuove strategie diagnostiche e terapeutiche. Ad aggravare un quadro epidemiologico gi? ricco di nuovi potenziali microorganismi patogeni, la pandemia di COVID-19 causata dal coronavirus (CoV) SARS-CoV-2 ha portato ad una richiesta senza precedenti di test per la diagnosi delle infezioni sostenute da questo virus. Talvolta questa richiesta ha superato di gran lunga le capacit? produttive delle aziende, con un risultante allungamento dei tempi di consegna e spesso fallimento delle forniture stesse. Infatti, l?epidemia causata dal virus SARS-CoV-2 ha avuto una diffusione inaspettatamente rapida; in pochi mesi quasi tutti i Paesi del mondo hanno registrato contagiati. Si ? passati in pochissimo tempo, da un?epidemia ad una pandemia. Pertanto, individuare tutti coloro che hanno contratto il coronavirus, in modo asintomatico o sintomatico, ? di vitale importanza per cercare di isolare i focolai infettivi e limitare il pi? possibile la diffusione del COVID-19.
I primi test utilizzati per la diagnosi del COVID-19 hanno visto l?impiego della PCR (polymerase chain reaction), pi? precisamente di una ?reverse transcription quantitative polymerase chain reaction? (RT-Real Time PCR). Recentemente, sono stati utilizzati anche test sierologici, che permettono, la ricerca di anticorpi contro SARS-CoV-2. Questi test si basano sull?utilizzo di un antigene proteico, solitamente della proteina Spike di SARS-CoV-2 o di almeno una porzione di essa, fissata su piastre per test immunoenzimatici (e.g. per ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), o su altra tipologia di supporto. In ELISA, la presenza di anticorpi anti-SARS-CoV-2 genera un segnale luminescente che viene rilevato, a significare la positivit? dell?individuo testato.
L?ottenimento degli antigeni proteici di coronavirus rappresenta uno degli ostacoli per la produzione su larga scala dei test sierologici, in quanto i loro tempi e costi di produzione sono molto importanti.
I sistemi di espressione eucariotici ad oggi proposti per la produzione di antigeni proteici di coronavirus sono tre: lieviti, cellule di insetto e cellule di mammifero. Uno svantaggio relativo al sistema d'espressione in lieviti e cellule di insetto ? relativo al fatto che la glicosilazione proteica ? sensibilmente diversa rispetto alla glicosilazione in mammiferi; per tale motivo non sono sistemi idonei per l?espressione di proteine di coronavirus da utilizzarsi nella diagnostica delle infezioni di mammiferi, incluso l?uomo. Per quanto riguarda la produzione di proteine in cellule di mammifero, uno dei problemi rilevati ? il notevole costo di mantenimento delle cellule (terreno di cultura, incubatori a CO2, contenitori realizzati ad hoc per la produzione su scala industriale) nonch? la complessit? delle condizioni di crescita, incluso un tempo di espressione relativamente lungo.
Pertanto, ? sentita la necessit? di un nuovo sistema per la produzione di antigeni proteici di coronavirus che superi gli svantaggi sopra menzionati.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda una cellula ospite (host cell) appartenente al genere Leishmania codificante per almeno una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae o per almeno una porzione di detta proteina.
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda un processo per la generazione una cellula ospite (host cell) appartenente al genere Leishmania in grado di sintetizzare almeno una proteina o parte di essa di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae. Preferibilmente, il processo comprende le fasi di:
a) introdurre in un cellula appartenente al genere Leishmania un vettore comprendente un polinucleotide codificante per almeno una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae o per almeno una porzione di detta proteina; e
(b) selezionare almeno una cellula ospite prodotta nella fase (a) che esprima detta proteina o porzione di detta proteina.
Un terzo aspetto della presente invenzione riguarda un processo per produrre una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae. Preferibilmente, il processo comprende le fasi di:
a) introdurre in una cellula appartenente al genere Leishmania un vettore comprendente un polinucleotide codificante per almeno una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae o per almeno una porzione di detta proteina;
(b) selezionare almeno una cellula ospite prodotta nella fase (a) che esprima detta proteina o porzione di detta proteina;
c) recuperare la proteina espressa dalla cellula ospite nella fase (b); e, opzionalmente,
d) purificare la proteina espressa.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
La presente invenzione verr? di seguito descritta dettagliatamente ed esemplificata a scopo dimostrativo e non limitativo anche con l?ausilio della Figura a seguire.
La Figura 1 mostra il plasmide utilizzato per l?ingegnerizzazione di L. tarentolae (A) e del frammento genico in esso inserito (B), derivato dal gene codificante per lo Spike di SARS-CoV-2. Tra il peptide segnale (SP) e la coda di istidine (H6) ? stata inserita la sequenza RBD-SD1.
DEFINIZIONI
Nel contesto della presente invenzione con il termine ?Spike? si intende una struttura glicoproteica presente come protuberanza all'esterno del pericapside, il doppio strato lipidico che costituisce l'involucro di alcuni virus, presente nei virus della famiglia Coronaviridae. Tali protuberanze si legano ad alcuni recettori della cellula ospite e sono essenziali sia per la specificit? d?ospite che per l'infettivit? virale. Nel contesto della presente invenzione con il termine ?Coronaviridae? (abbreviato in ?CoV?) si intende una famiglia di virus, in molti casi respiratori, che possono causare malattie da lievi a moderate, che vanno dal comune raffreddore a sindromi respiratorie come la MERS (sindrome respiratoria mediorientale, Middle East respiratory syndrome) e la SARS (sindrome respiratoria acuta grave, Severe acute respiratory syndrome), la COVID-19, oltre a infezioni in numerose specie di vertebrati domestici e selvatici.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda una cellula ospite (host cell) appartenente al genere Leishmania codificante per almeno una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae o per almeno una porzione di detta proteina.
In una forma di realizzazione, il polinucleotide codificante per detta proteina virale ? scelto tra DNA e RNA, preferibilmente ? DNA.
In una forma di realizzazione, il polinucleotide comprende una sequenza nucleotidica sostanzialmente identica a SEQ ID NO.1 (Tabella 1). Per esempio, il polinucleotide comprende una sequenza nucleotidica identica per almeno il 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o pi? alla SEQ ID NO.1. Preferibilmente, il polinucleotide comprende una sequenza nucleotidica identica per almeno l?80%, pi? preferibilmente per almeno il 90% alla SEQ ID NO.1.
In una forma di realizzazione, il polinucleotide consiste in una sequenza nucleotidica sostanzialmente identica a SEQ ID NO.1. Per esempio, il polinucleotide consiste in una sequenza nucleotidica identica per almeno il 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o pi? alla SEQ ID NO.1.
Preferibilmente, il polinucleotide consiste in una sequenza nucleotidica omologa o identica per almeno l?80%, pi? preferibilmente per almeno il 90% alla SEQ ID NO.1.
Preferibilmente, l?almeno una proteina ? una proteina, preferibilmente una glicoproteina Spike, o almeno una porzione di essa, di un coronavirus scelto tra: SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2. In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, l?almeno una proteina ? una proteina, preferibilmente una glicoproteina Spike, del virus SARS-CoV-2 o almeno una porzione di essa.
In una forma di attuazione, l?almeno una proteina comprende una sequenza amminoacidica sostanzialmente identica a SEQ ID NO.2. Per esempio, l?almeno una proteina comprende una sequenza amminoacidica identica per almeno il 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o pi? alla SEQ ID NO.
2.
In una forma di realizzazione preferita, l?almeno una proteina comprende una sequenza amminoacidica identica per almeno l?80%, pi? preferibilmente per almeno il 90% alla SEQ ID NO.2.
In una forma di realizzazione, l?almeno una proteina consiste in una sequenza amminoacidica sostanzialmente identica a SEQ ID NO. 2. Per esempio, l?almeno una proteina consiste in una sequenza amminoacidica identica per almeno il 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o pi? alla SEQ ID NO.
2.
In una forma di realizzazione preferita, l?almeno una proteina consiste in una sequenza amminoacidica identica per almeno l?80%, pi? preferibilmente per almeno il 90% alla SEQ ID NO.2.
Preferibilmente, detta almeno una proteina di un virus, ? la subunit? S1 della glicoproteina Spike o almeno una porzione di essa, ancor pi? preferibilmente ? il receptor-binding domain (RBD) della subunit? S1 (RBD-S1) della glicoproteina spike di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae.
Preferibilmente, detta almeno una proteina di un virus, ? la subunit? S1 della glicoproteina Spike o almeno una porzione di essa, ancor pi? preferibilmente ? l?RBD-SD1 della glicoproteina spike di e di SARS-CoV-2. In una forma di realizzazione dell?invenzione, l?almeno una proteina comprende modifiche alla regione N-terminale e/o C-terminale. Dette modifiche sono scelte preferibilmente tra delezioni, addizioni, alterazioni di amminoacidi e loro combinazioni. Alternativamente detta almeno una proteina pu? essere modificata, preferibilmente nella struttura primaria, mediante acetilazione, carbossilazione, fosforilazione e loro combinazioni. In una ulteriore forma di realizzazione, detta almeno una proteina ? coniugata/legata con una molecola, con un metallo, con un marker, per esempio proteine, per la preparazione di proteine di fusione. In una ulteriore forma di realizzazione dell?invenzione, detta almeno una proteina ? modificata tramite tecniche di biologia molecolare note nel settore per migliorarne la resistenza alla degradazione proteolitica e/o per ottimizzarne la solubilit?.
In una forma di realizzazione dell?invenzione, la cellula ospite (host cell) che esprime il polinucleotide sopra descritto appartiene ad una specie di Leishmania scelta tra: L. tarentolae e L. infantum. L. donovani, e L. major. Preferibilmente, la cellula ospite appartiene alla specie L. tarentolae.
In una forma di realizzazione, il polinucleotide sopra descritto ? compreso in un vettore. In una forma di realizzazione, il vettore comprendente il polinucleotide sopra descritto ? scelto tra: vettore virale, plasmide, particelle virali e fago.
Preferibilmente, il vettore ? un vettore plasmidico.
Preferibilmente, il vettore, pi? preferibilmente il vettore plasmidico, comprende almeno un peptide segnale di secrezione (SP), ovvero un peptide in grado di indirizzare la proteina sintetizzata verso la secrezione. In altre parole, il vettore, preferibilmente il plasmide, comprende almeno un SP in grado di indurre la secrezione della proteina attraverso la membrana nel reticolo endoplasmatico.
In una forma di realizzazione, il vettore, preferibilmente il plasmide, comprende almeno un gene in grado di conferire la resistenza ad almeno un antibiotico.
La Richiedente ha dimostrato come il protozoo L. tarentolae rappresenti un ottimo candidato per l?espressione di proteine ricombinanti, mostrando diversi vantaggi rispetto agli attuali sistemi procariotici ed eucariotici. In primo luogo, rispetto ai sistemi di espressione in batteri, in lievito o mediante baculovirus, l?utilizzo di L. tarentolae per la produzione di antigeni proteici di Coronaviridae permette di ottenere proteine con modifiche post-traduzionali simili a quelle ottenute con cellule di mammifero. Tra queste modifiche post-traduzionali, la glicosilazione risulta fondamentale in proteine antigeniche di virus, laddove pattern di glicosilazione possono influenzare l?immunogenicit? e il riconoscimento da parte degli anticorpi. Infatti, L. tarentolae permette di produrre proteine con un pattern di glicosilazione sovrapponibile a quello ottenibile in cellule di mammifero.
Rispetto all?utilizzo di cellule di mammifero, L. tarentolae come sistema di espressione di antigeni presenta costi inferiori, un tasso di moltiplicazione molto rapido (5-6 ore), un?ottima resa (fino a 30 mg di proteina per litro). Inoltre, L. tarentolae come sistema di espressione pu? essere facilmente sviluppato su scala di produzione industriale, coltivando i parassiti in bioreattori. Complessivamente, tale sistema combina le caratteristiche dei sistemi batterici (basso costo e rapido periodo di moltiplicazione) con i vantaggi dell?espressione in cellule di mammiferi o di altri vertebrati (modificazioni post-traduzionali), senza gli svantaggi di una iper glicosilazione, tipica dei lieviti, e di contaminazioni da endotossine e formazione di corpi di inclusione e incorretto folding tipici dei batteri.
Tabella 1
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda un processo per la generazione di una cellula ospite (host cell) appartenente al genere Leishmania in grado di sintetizzare almeno una proteina o parte di essa di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae. Preferibilmente, il processo comprende le fasi di:
a) introdurre in una cellula appartenente al genere Leishmania un vettore comprendente un polinucleotide codificante per almeno una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae o per almeno una porzione di detta proteina; e
(b) selezionare almeno una cellula ospite prodotta nella fase (a) che esprima detta proteina o porzione di detta proteina.
In una forma di realizzazione, il polinucleotide comprende o consiste in una sequenza nucleotidica sostanzialmente identica a SEQ ID NO.1 come sopra dettagliatamente descritta.
In una forma di realizzazione, il vettore comprendente il polinucleotide sopra dettagliatamente descritto viene inserito nella cellula di Leishmania utilizzando le tecniche note al tecnico esperto. Per esempio, l?introduzione del vettore avviene tramite elettroporazione, oppure trattando la cellula di Leishmania con acetato di litio. In una forma di realizzazione preferita, il vettore comprendente il polinucleotide sopra descritto viene inserito nella cellula di Leishmania tramite elettroporazione.
In una forma di attuazione, la fase (b) prevede una sottofase (b1) di selezione clonale ed una sottofase (b2) di verifica dei cloni selezionati. Preferibilmente, la sottofase (b1) prevede la selezione di cloni di Leishmania che esprimono la proteina virale o porzione di detta proteina virale tramite l?uso di terreni di coltura comprendenti almeno un antibiotico. Infatti, il vettore, preferibilmente il plasmide, comprende preferibilmente almeno un gene in grado di conferire alla Leishmania resistenza ad almeno un antibiotico.
Preferibilmente, la sottofase (b2) prevede la verifica dell?effettiva integrazione del vettore nel genoma dei cloni di Leishmania selezionati nella fase (b1). Detta sottofase (b2) prevede il controllo della presenza del vettore e/o del polinucleotide inserito nella fase (a) tramite tecniche di biologia molecolare note al tecnico del settore, come per esempio, tramite l?utilizzo di tecniche di PCR e/o di tecniche elettroforetiche e/o di immunoblotting.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, l?almeno una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae ? una glicoproteina Spike o almeno una porzione di essa. In una forma di attuazione, l?almeno una proteina comprende o consiste in una sequenza amminoacidica sostanzialmente identica a SEQ ID NO.2 come sopra dettagliatamente descritta.
Un terzo aspetto della presente invenzione riguarda un processo per produrre una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae. Preferibilmente, il processo comprende le fasi di:
a) introdurre in una cellula appartenente al genere Leishmania un vettore, comprendente un polinucleotide codificante per almeno una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae o per almeno una porzione di detta proteina;
(b) selezionare almeno una cellula ospite prodotta nella fase (a) che esprima detta proteina o porzione di detta proteina;
c) recuperare la proteina espressa dalla cellula ospite nella fase (b); e, opzionalmente,
d) purificare la proteina espressa.
In una forma di realizzazione, il polinucleotide comprende o consiste in una sequenza nucleotidica sostanzialmente identica a SEQ ID NO.1 come sopra dettagliatamente descritta.
In una forma di realizzazione, il vettore, comprendente il polinucleotide sopra dettagliatamente descritto, viene inserito nella cellula di Leishmania utilizzando le tecniche note al tecnico esperto. Per esempio, l?introduzione del vettore avviene tramite elettroporazione, oppure trattando la cellula di Leishmania con acetato di litio. In una forma di realizzazione preferita, il vettore comprendente il polinucleotide sopra descritto viene inserito nella cellula di Leishmania tramite elettroporazione.
In una forma di attuazione, la fase (b) prevede una sottofase (b1) di selezione clonale ed una sottofase (b2) di verifica dei cloni selezionati. Preferibilmente, la sottofase (b1) prevede la selezione di cloni di Leishmania che esprimono la proteina virale o porzione di detta proteina virale tramite l?uso di terreni di coltura comprendenti almeno un antibiotico. Infatti, il vettore, preferibilmente il plasmide, comprende preferibilmente almeno un gene in grado di conferire la resistenza ad almeno un antibiotico.
Preferibilmente, la sottofase (b2) prevede la verifica dell?effettiva integrazione del vettore nel genoma dei cloni di Leishmania selezionati nella fase (b1). Detta sottofase (b2) prevede il controllo della presenza del vettore e/o del polinucleotide inserito nella fase (a) tramite tecniche di biologia molecolare note al tecnico del settore, come per esempio, tramite l?utilizzo di tecniche di PCR e/o di tecniche elettroforetiche e/o di immunoblotting.
In una forma di attuazione, l?almeno una proteina comprende o consiste in una sequenza amminoacidica sostanzialmente identica a SEQ ID NO.2 come sopra dettagliatamente descritta.
In una forma di attuazione, l?almeno una cellula ospite appartenente al genere Leishmania selezionata nella fase (b) viene espansa tramite tecniche di colture cellulari note al tecnico del settore. Per esempio, l?almeno una cellula di Leishmania viene posta in coltura in un terreno selettivo, ovvero comprendente un antibiotico in grado di selezionare solo la crescita delle cellule di Leishmania comprendenti il vettore inserito nella fase (a).
Nella fase (c), l?almeno una proteina virale espressa viene recuperata dal terreno di coltura preferibilmente tramite tecniche note all?esperto del settore. Per esempio, l?almeno una proteina virale viene recuperate tramite centrifugazione del terreno di coltura ed eliminazione del pellet contenete cellule e i detriti.
In una forma di realizzazione, nella fase (d) l?almeno una proteina virale viene purificata dal terreno di coltura con metodi noti al tecnico del ramo. Per esempio, l?almeno una proteina virale pu? essere purificata tramite metodi biochimici, quali filtrazione, affinit?, immunoaffinit? o tramite cromatografia liquida ad alta efficienza (HPLC, RP-HPLC, HPLC a scambio ionico, size-exclusion HPLC).
ESEMPIO
1. Ingegnerizzazione del protozoo L. tarentolae per l?espressione del dominio RBD-SD1 (leish-RBD-SD1) della proteina Spike di SARS-CoV-2 ? stato generato un ceppo di Leishmania tarentolae per la secrezione costitutiva della proteina RBD-SD1. La Figura 1 presenta le informazioni relative al plasmide utilizzato e all?inserto. Il costrutto ? stato realizzato per ottenere una produzione della proteina in forma secreta. In particolare, a monte del polinucleotide codificante per la proteina Spike, ? stato inserito un peptide segnale (SP) di secrezione, ovvero in grado di provocare la secrezione della proteina Spike sintetizzata. A valle del polinucleotide codificante ? stata inserita una ?coda? di 6 istidine.
2. Purificazione della proteina leish-RBD-SD1 prodotta in L. tarentolae La proteina ricombinante leish-RBD-SD1 ? stata purificata mediante colonna per la cattura dei residui di istidina, quindi eluizione, dialisi e concentrazione in concentratore centrifugo. Al momento la resa della produzione ? pari ad almeno 3 mg di proteina per litro di coltura di Leishmania.
3. Confronto tra leish-RBD-SD1 e RBD commerciale prodotto in cellule di mammifero, tramite saggi ELISA
La proteina ricombinante leish-RBD-SD1 ? stata testata attraverso saggi ELISA e confrontata con le letture ottenute utilizzando una proteina RBD di riferimento prodotta in cellule di mammifero (SinoBiological HEK Derived) e gi? ampiamente utilizzata nella diagnostica sierologica di COVID-19. Utilizzando la proteina RBD-SD1 prodotta in Leishmania, i valori di OD dei campioni positivi sono paragonabili a quelli ottenuti con la proteina commerciale; i valori di OD dei campioni di siero negativi sono paragonabili ai valori di bianco, quindi la proteina non d? segnali di background (vedi esempio su diluizioni di un siero negativo e di un positivo in Tabella 2).
Tabella 2- Confronto tra OD ottenuti in saggi ELISA con la proteina RBD commerciale e con la proteina RBD-SD1 prodotta in Leishmania.
Sono stati inoltre testati con metodo qualitativo 40 sieri umani di cui 19 risultati precedentemente positivi in ELISA attraverso l?utilizzo dell?antigene commerciale prodotto in cellule di mammifero, e 21 risultati negativi.
Tabella 3. Confronto dell?indagine qualitativa per la rilevazione di anticorpi anti-SARS-CoV-2
ll saggio effettuato con la proteina leish-RBD-SD1 ha prodotto risultati sovrapponibili, con un solo esito discordante (Tabella 3), confermando nel 97,5% dei campioni il valore di positivit? o negativit? ottenuto utilizzando la proteina commerciale.
Claims (15)
1. Una cellula ospite appartenente al genere Leishmania, comprendente un polinucleotide codificante per almeno una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae o per almeno una porzione di detta proteina.
2. La cellula ospite secondo la rivendicazione 1, dove l?almeno una proteina ? una glicoproteina Spike.
3. La cellula ospite secondo la rivendicazione 2, dove l?almeno una proteina ? una proteina, preferibilmente una glicoproteina Spike, di coronavirus appartenente alla famiglia Coronaviridae, scelto tra: SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2, preferibilmente di SARS-CoV-2.
4. La cellula ospite secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, dove il polinucleotide comprende una sequenza identica per almeno l?80% alla SEQ ID NO:1.
5. La cellula ospite secondo la rivendicazione 4, dove il polinucleotide comprende una sequenza identica per almeno il 90% alla SEQ ID NO:1.
6. La cellula ospite secondo la rivendicazione 4 o 5, dove il polinucleotide comprende una sequenza che consiste nella SEQ ID NO:1.
7. La cellula ospite secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, dove l?almeno una proteina comprende una sequenza amminoacidica identica per almeno l?80% con la SEQ ID NO: 2, preferibilmente per almeno il 90% con la SEQ ID NO: 2.
8. La cellula ospite secondo la rivendicazione 7, dove l?almeno una proteina comprende una sequenza amminoacidica che consiste nella SEQ ID NO:2.
9. La cellula ospite secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, dove la cellula ospite appartiene ad una specie di Leishmania scelta tra: L. tarentolae, L. donovani, L. major e L. infantum, preferibilmente L. tarentolae.
10. Un processo per la generazione di una cellula ospite appartenente al genere Leishmania in grado di sintetizzare almeno una proteina o parte di essa di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae, comprendente le fasi di:
a) introdurre in una cellula appartenente al genere Leishmania un vettore, comprendente un polinucleotide codificante per almeno una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae o per almeno una porzione di detta proteina; e
(b) selezionare almeno una cellula ospite prodotta nella fase (a) che esprima detta proteina o porzione di detta proteina.
11. Un processo per produrre una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae, comprendente le fasi di:
a) introdurre in una cellula di Leishmania una molecola di acido nucleico, preferibilmente un vettore plasmidico, comprendente un polinucleotide codificante per almeno una proteina di un virus appartenente alla famiglia dei Coronaviridae o per almeno una porzione di detta proteina;
(b) selezionare almeno una cellula ospite prodotta nella fase (a) che esprima detta proteina o porzione di detta proteina;
c) recuperare la proteina espressa dalla cellula ospite nella fase b) e, opzionalmente,
d) purificare la proteina espressa.
12. Il processo secondo la rivendicazione 10 o 11, dove il polinucleotide ha una sequenza identica per almeno l?80% alla SEQ ID NO:1, preferibilmente identica per almeno il 90% alla SEQ ID NO:1.
13. Il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-12, dove l?almeno una proteina ? una proteina, preferibilmente una glicoproteina Spike, di un virus appartenente alla famiglia Coronaviridae scelto tra: SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2, preferibilmente di SARS-CoV-2.
14. Il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-13, dove l?almeno una proteina ha una sequenza amminoacidica con un?identit? di almeno l?80% con la SEQ ID NO: 2, preferibilmente con un?identit? di almeno il 90% con la SEQ ID NO: 2.
15. Il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-14, dove la cellula ospite appartiene ad una specie di Leishmania scelta tra: L. tarentolae, L. donovani, L. major e L. infantum, preferibilmente L. tarentolae.
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Citations (2)
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Patent Citations (2)
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