RU2813324C1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА MBP_RBD_6His ВИРУСА SARS-CoV-2 с C-КОНЦЕВОЙ АФФИННОЙ МЕТКОЙ 6xHIS-tag, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯЧ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ COVID-19 - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА MBP_RBD_6His ВИРУСА SARS-CoV-2 с C-КОНЦЕВОЙ АФФИННОЙ МЕТКОЙ 6xHIS-tag, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯЧ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ COVID-19 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2813324C1 RU2813324C1 RU2023117738A RU2023117738A RU2813324C1 RU 2813324 C1 RU2813324 C1 RU 2813324C1 RU 2023117738 A RU2023117738 A RU 2023117738A RU 2023117738 A RU2023117738 A RU 2023117738A RU 2813324 C1 RU2813324 C1 RU 2813324C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rbd
- 6his
- mbp
- virus
- cov
- Prior art date
Links
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 88
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 42
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 39
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 title description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title description 17
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 9
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 8
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 claims description 7
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 5
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 4
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 4
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 3
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 108700010904 coronavirus proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000796533 Arna Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229940022962 COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 description 1
- 241000494545 Cordyline virus 2 Species 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710090149 Lactose operon repressor Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-CAPXFGMSSA-N allolactose Chemical class O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1OC[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-CAPXFGMSSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N cresol red Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013504 emergency use authorization Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002597 lactoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- -1 pH 8 Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150025578 slyD gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002325 super-antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, предусматривающий трансформацию штамма Escherichia coli JM109 плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His, содержащей ген, кодирующий антиген MBP_RBD_6His вируса вакцины с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. Техническим результатом изобретения является получение высокоочищенного РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. 5 ил., 2 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к области вирусологии, молекулярной биологии и биотехнологии, а именно - к разработке диагностических наборов реагентов для серодиагностики вирусных инфекционных заболеваний и может быть использовано при создании набора реагентов для выявления антител к вирусу SARS-CoV-2.
В настоящее время широкое применение при создании диагностикумов для серодиагностики вирусных инфекционных заболеваний получили рекомбинантные вирусные антигены (РВА). Использование РВА является универсальным приемом при разработке медицинских средств защиты в отношении эмерджентных вирусных инфекций.
Пандемия COVID-19 продемонстрировала роль и место рекомбинантных вирусных белков, продуцируемых искусственно созданными генно-инженерными конструкциями (ГИК), для создания средств диагностики, профилактики и лечения заболевания.
При диагностике COVID-19 в настоящее время ведущее место занимает обнаружение РНК вируса SARS-CoV-2. Данный тест предназначен для диагностики активной инфекции и проводится тем, у кого есть симптомы респираторного заболевания или тем, кто имел контакты с возможным источником инфекции [U.S. Food & Drug Administration. In Vitro Diagnostics EUAs 2020.].
Для проведения диагностики берут мазок из носа и ротоглотки и методом ОТ-ПЦР в биологическом материале выявляют наличие или отсутствие генетического материала вируса (РНК вируса SARS-CoV-2). Отрицательный результат определения генетического материала возбудителя означает, что на момент взятия анализа человек не инфицирован. Для подтверждения или исключения наличия инфекции тест выполняется повторно через 10 дней после первичного взятия мазка.
Применяемые сегодня тест-системы отличаются высокой чувствительностью. Разработанный в ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР-РВ позволяет выявить РНК в пробе при ее концентрации не менее 1,0 103 ГЭ.мл-1 [Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени. Патент RU 2732608 C1 от 09.04.2020 г. Алексеев Я.И., Борисевич С.В. Варламов Д.А. [и др.].] точностью. Однако даже использование столь чувствительного набора не исключает получение ложноотрицательных результатов, возможными причинами которых могут быть малое количество вируса в исследуемом биоматериале (ниже пороговой чувствительности метода, стадия заболевания, при которой вирус уже отсутствует в верхних дыхательных путях), человеческий фактор (нарушения при заборе биологического материала).
Другим прямым методом является выявление вирусного антигена (белка, входящего в состав вируса, который распознается иммунной системой). Для проведения анализа используют ИФА или иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА) [Möckel, М. SARS-CoV-2 antigen rapid immunoassay for diagnosis of COVID-19 in the emergency department [Text] /. M. Möckel, V.M. Corman, M.S. Stegemann [et al.] // Biomarkers. 2021 Vol. 26, N 3. - 213-220.
Согласно рекомендациям ВОЗ и управлению по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration), США, количественное определение антигена белка нуклеокапсида (N) вируса SARS-CoV-2 методом ИХЛА является высокоэффективным тестом для диагностики коронавирусной инфекции. Однако показатели диагностической чувствительности и специфичности данного метода уступают таковым при проведении ПЦР-анализа на РНК вируса SARS-CoV-2. Тест на антиген может определить наличие вируса SARS-CoV-2, при высокой концентрации вируса в исследуемой пробе, которая чаще бывает в самом начале заболевания или в период пика инфекции. При низкой концентрации вируса результат теста может быть ложноотрицательным.
Невысокая аналитическая чувствительность иммунохимических методов анализа является ограничивающим фактором методик, в которых проводится выявление вирусных антигенов.
Таким образом, успешное применение прямых методов возможно лишь при выполнении двух основных условий:
- концентрация возбудителя в пробе, превышающее значение аналитической чувствительности используемого метода при применении конкретного набора реагентов;
- своевременное взятие пробы.
По этой причине при проведении диагностики COVID-19 важное место занимают непрямые методы, направленные на выявление специфических антител (IgM и IgG), которые вырабатываются в организме человека в результате его контакта с вирусом. Для этого исследования используют капиллярная или венозная кровь.
IgM вырабатываются в самом начале заболевания, обычно они появляются на 3-5 день после появления первых симптомов и свидетельствуют о продолжающемся остром заболевании - текущей инфекции.
IgG обычно появляются на 10-14 день от начала заболевания и сохраняются в крови в течение я достаточно продолжительного времени после перенесенного заболевания. Их наличие говорит о перенесенном заболевании и о формирующемся иммунитете.
Выявление антител класса IgG имеют особо важное значение, так как позволяет оценить коллективный иммунитет против COVID-19. Полученные результаты могут служить не только для определения иммунного ответа у конкретного человека, но и для оценки количества переболевших в разных группах населения.
Вирусные антигены являются важнейшим компонентом наборов реагентов для выявления специфических антител. Относительно низкий уровень накопления вируса SARS-CoV-2 и масштаб пандемии COVID-19 (свыше 600 млн лабораторно подтвержденных случаев заболевания к началу осени 2022 г. ) не позволяют ограничиться использованием в качестве диагностикума антигенов нативного возбудителя. Вышеизложенное определяет роль РВА при проведении диагностики COVID-19.
Важным структурным элементом при создании РВА является выбор дизайна ГИК для их продукции. Этот выбор может иметь широкий диапазон различных решений. Безусловно, клетки эукариот, и, особенно, клетки млекопитающих, имеют несомненные преимущества перед прокариотами, особенно в том случае, когда целевой РВА представляет собой полноразмерный гликопротеин оболочки вируса. Так, белок S вируса SARS-CoV-2 имеет 22 сайта гликозилирования [Бруякин С.Д., Макаревич С.А. Структурные белки коронавируса SARS-COV-2: роль, иммуногенность, суперантигенные свойства и возможности использования для терапевтических целей // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета 2021. - Вып. 2.(78). С 18-27]. Воспроизведение вторичной структуры белка S в РВА, полученном при культивировании ГИК в клетках прокариот представляет очень сложную задачу.
В то же время, системы культивирования в клетках прокариот обладают определенными преимуществами, среди которых основным является высокая скорость размножения бактерии (и, следовательно, потенциально высокий выход РВА). Поэтому, если РВА представляет собой фрагмент гликопротеина без сайта гликозилирования, культивирование в клетках прокариот вполне может быть использовано для получения РВА ВЭВИ.
Целью настоящего изобретения является разработка способа получения рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, предназначенного для использования в качестве компонента набора реагентов для серодиагностики COVID-19.
Для достижения поставленной цели были проведены следующие исследования:
- путем клонирования гена, кодирующего РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 и вставки кДНК фрагмента гена белка S в плазмидный вектор рЕТ создана ГИК рЕТ MBP_RBD_6His.
- проведена трансформация плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His клеток штамма JM109 Escherichia coli с последующим получением штамма-продуцента РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. - Е. coli JM109/рЕТ MBP_RBD_6His
- проведено культивирование штамма-продуцента, наработана клеточная биомасса, путем ее разрушения в буферном растворе при рН 8.0±0.5 в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента, центрифугирования с последующим удалением клеточного дебриса, получали осветленный клеточный супернатант, который наносили на колонну с металл-хелатным аффинным сорбентом при рН 8.0±0.5.
- в ходе элюции в градиенте от 0 до 500 мМ имидазола в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента собирали фракции, содержащие РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2.
- для получения целевого продукта проведена очистка с помощью гель-фильтрационной хроматографии, раствор очищенного белка стерильно фильтровали и лиофильно высушивали.
Сущность изобретения
Сущность изобретения заключается в разработке способа получения РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 c С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, включающего конструирование рекомбинантной плазмиды ДНК рЕТ MBP RBD 6His, получение штамма-продуцента Е. coli JM109 MBP_RBD_6His путем трансформации клеток штамма Е. coli JM109 рекомбинантной плазмидной ДНК MBP_RBD_6His. культивирование штамма-продуцента, разрушение клеточной биомассы, отделение клеточного супернатанта, выделение целевого белка, его хроматографическую очистку, стерильную фильтрацию и лиофильное высушивание.
Рекомбинантный антиген MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 получали следующим образом. Сначала конструировали плазмидный вектор рЕТ MBP_RBD_6His, для чего из биологического материала выделяли РНК вируса SARS-CoV-2, штамм У-2. Амплифицировали фрагмент ген, кодирующий антиген MBP_RBD_6His с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, на полученной ДНК-матрице с использованием специфических праймеров, содержащих сайты узнавания рестриктаз NcoI и XhoI. Полученный ДНК-фрагмент клонировали в плазмидный вектор рЕТ по этим сайтам. Полученную в результате экспрессионную плазмидную ДНК рЕТ MBP_RBD_6His. Путем трансформации компетентных клеток E.coli JM109 с рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His получали штамм E.coli JM109 MBP_RBD_6His, являющийся продуцентом РВА MBP_RBD_6His с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.
Культивирование штамма-продуцента проводили в культуральной среде Лурье-Бертрана при 37 С. Индукцию белкового биосинтеза вызывали путем добавления в культуральную среду индуктора изопропилтио-β-D-галактозида (ИПТГ). Культивирование проводили в течение 3 ч при 37°С после внесения ИПТГ. При культивировании штамма-продуцента достигается высокий уровень экспрессии гена, кодирующего РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.
Выделение РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag включало стадии разрушения клеточной биомассы с помощью ультразвукового дезинтегратора в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента, отделения клеточного супернатанта, содержащего целевой белок, с помощью центрифугирования, выделения целевого белка из клеточного супернатанта, его очистку с помощью металл-хелатной аффинной и гель-фильтрационной хроматографии, стерильную фильтрацию и лиофильное высушивание.
Клеточную биомассу разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора в Трис-буферном растворе при рН 8,0±0,5 в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента. Осветленный клеточный супернатант наносили на колонну с металл-хелатным аффинным сорбентом при рН 8,0±0,5. В ходе элюции в ступенчатом градиенте от 0 до 500 мМ имидазола в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента собирали фракции, содержащие РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 c С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. Дальнейшую очистку проводили с помощью гель-фильтрационной хроматографии. Раствор очищенного белка стерильно фильтровали и лиофильно высушивали.
Созданный штамм Е.coli JM109 MBP_RBD_6His является продуцентом РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. Аминокислотная последовательность данного РВА представлена на последовательности SEQ ID NO 3.
Представленное изобретение решает задачу получения высокоочищенного рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag с иммунохимическими свойствами, позволяющими использовать его при иммуноферментном определении специфических антител к вирусу SARS-CoV-2.
Для выбора прототипа настоящего изобретения рассмотрены описанные в литературе способы получения рекомбинантного антигена патогенных для человека коронавирусов с использованием прокариотической системы экспрессии. Наиболее близкий к заявленному для патентования способу получения описан в патенте RU 2253870 С1 [Рекомбинантные белки, содержащие диагностически значимые антигенные эпитопы белков коронавируса (SARS-CoV), связанного с тяжелым острым респираторным синдромом, и последовательности синтетических генов, кодирующих диагностически значимые антигенные детерминанты белков коронавируса (SARS-CoV), связанного с тяжелым острым респираторным синдромом, авторы: Бурков А.Н., Уланова Т.И., Обрядина А.П., Пузырев В.Ф.] в котором для синтеза рекомбинантных белков вируса SARS-CoV были предсказаны и выбраны последовательности, содержащие потенциальные эпитопы структурных белков S, М, Е и N. В предложенном авторами способе Фрагменты рекомбинантных белков, кодируемые ДНК-последовательностями, были синтезированы в виде слитых белков (фьюжн-белков) с Glutathione-S-transferase, что позволяло проводить их очистку методом аффинной хроматографии, при этом эффективность выделения РВА уступает методу, предполагающему проведение металл-хелатной хроматографии на Ni-хелатирующем сорбенте. По мнению авторов, «изобретение может найти широкое применение в области диагностики и медицины», однако конкретные результаты применения полученных РВА в работе не приведены.
Заявляемый способ отличается от прототипа структурой рекомбинантных вставок в геном, молекулярной массой, молекулярно-биологическими и иммунохимическими характеристиками целевого продукта и использованием для его получения металл-хелатной хроматографии на Ni-хелатирующем сорбенте.
Технический результат
Техническим результатом изобретения является получение высокоочищенного РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.
Технический результат изобретения достигается путем:
- выделения из биологического материала РНК вируса SARS-CoV-2, штамм У-2
- амплификации гена, кодирующего антиген MBP_RBD_6His, на полученной ДНК-матрице с использованием специфических праймеров, содержащих сайты узнавания рестриктаз NcoI и XhoI. Олигонуклеотидные последовательности, представляющие первичную структуру олигонуклеотидных праймеров, использованных при амплификации гена, кодирующего антиген MBP_RBD_6His, представлены на последовательностях SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2;
- клонирования полученного ДНК-фрагмента в плазмидный вектор рЕТ по указанным сайтам;
- трансформации компетентных клеток E.coli JM109 созданной экспрессионной плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His, физическая карта которой представлена на фиг. 1.
Предлагаемое техническое решение является новым, поскольку из общедоступных сведений в Российской Федерации неизвестен способ получения рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag с иммунохимическими свойствами, позволяющими использовать его при иммуноферментном определении специфических антител к вирусу SARS-CoV-2.
Предлагаемое техническое решение имеет изобретательский уровень, поскольку предлагаемый способ получения рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, включающий конструирование экспрессионной плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His путем клонирования гена, кодирующего антиген MBP_RBD_вируса SARS-CoV-2 в плазмидный вектор, трансформацию плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His L клеток штамма Е. coli JM109 с последующим получением штамма-продуцента растворимой формы рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, разрушение клеточной биомассы, содержащей целевой белок, его выделение, хроматографическую очистку, стерильную фильтрацию и лиофильное высушивание обеспечивает получение целевого продукта, который может быть использовано в качестве специфического компонента набора реагентов для выявления антител к вирусу SARS-CoV-2.
Предлагаемое техническое решение промышленно применимо, поскольку для его реализации может быть использовано типовое оборудование, а также широко распространенные в вирусологических и молекулярно-генетических исследованиях реактивы и материалы.
Изобретение иллюстрируют следующие примеры, в которых представлена как процедура наработки биомассы рекомбинантного антигена, так и его практического применения
1 Получение ГИК рЕТ MBP_RBD_6His
Плазмидный вектор рЕТ MBP_RBD_6His.получали по следующей методике. Проводили наработку биомассы вируса SARS-CoV-2. В работе был использован штамм У-2 (Инв. №в коллекции ФГБУ «48 ЦНИИ» - 1226)
Для проведения культивирования использовали следующую методику. Ддвухсуточную монослойную культуру клеток Vero С 1008 в пластиковых матрасах фирмы Cell Star (США) с площадью рабочей поверхности 25 см (посевная концентрация 2,0. 105 кл.мл-1) инфицировали вирусом SARS-CoV-2 из расчета множественности заражения 0,01 БОЕ.кл-1. Затем матрасы укладывали горизонтально, при этом поверхность с клеточным монослоем должна находиться внизу, и оставляли при температуре (37,5±0,5)°С. Через 60 минут инокулят из флаконов удаляли пипеткой и в каждый флакон вносили 7,5 мл поддерживающей среды Эрла с 2% фетальной телячьей сыворотки (ФТС). Культивирование проводили в течение 3-х суток. После окончания культивирования вируссодержащую среду сливали и определяли биологическую активность полученной рабочей культуры по методу негативных колоний. Для контроля процесса репродукции возбудителя часть матрасов сразу после проведения адсорбции инфицирующей дозы возбудителя в течение 1 ч при комнатной температуре и внесения поддерживающей среды Эрла с 2% ФТС помещали в холодильник с температурой от 2 до 6°С. После окончания культивирования определяли концентрацию биологически активного вируса в исследуемых препаратах.
Подлинность полученных препаратов вируса SARS-CoV-2 проверяли с помощью ОТ-ПЦР-РВ, которую проводили по разработанной ранее методике [Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени. Патент RU 2732608 C1 от 09.04.2020 г. Алексеев Я.И., Борисевич С.В. Варламов Д.А. [и др.].].
Данные оценки подлинности дали положительный результат, что позволило использовать полученный вируссодержащий препарат для выделения РНК вируса SARS-CoV-2 для использования в экспериментах по созданию ГИК, продуцирующих РВА вируса SARS-CoV-2.
Выделение РНК вируса SARS-CoV-2 проводили в условиях 2-й санитарной зоны согласно разработанной инструкции, основанной на использовании метода сорбции НК на развитой поверхности оксида кремния в присутствии высокой концентрации раствора гуанидина изотиоцината с применением на стадиях отмывки осадка НК от солевого раствора 70% этанолом и ацетоном. После отмывки и для ускорения дегидратации осадка ацетоном, РНК в нативном виде элюировали при нагревании в растворе с низкой ионной силой (в дистиллированной воде). В результате на заключительной стадии выделения был получен водный раствор геномной РНК анализируемого возбудителя, не содержащий биологически активный вирус.
В дальнейшем для оценки биологической безопасности и полноты инактивации исходного препарата были проведены три последовательных пассажа через монослойную культуру клеток Vero С1008. Оценку биологической активности полученной пробы определяли по образованию негативных колоний на монослое культуры клеток Vero С1008 под агаровым покрытием.
Формирования негативных колоний на монослое культуры клеток Vero С1008, под агаровым покрытием при титровании материалов, полученных в каждом их трех последовательных пассажей, не наблюдали.
На основании проведенных исследований был сделан вывод о том, что полученный из вируссодержащего препарата вируса SARS-CoV-2 с исходной
биологической активностью 2,0⋅107 БОЕ⋅мл-1 материал после проведенной пробоподготовки не содержит биологически активный вирус и опасности не представляет и может быть передан в чистую зону для проведения молекулярно-биологических исследований.
При проведении реакции обратной транскрипции (ОТ) в качестве универсального неспецифического компонента использовали ОТ-смесь, содержащую 1 мкМ Трис-HCl, 0,05% Тритона Х-100, 0,1 мкМ магния хлорида, 0,4 мкМ аммония сульфата, смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов, по 0,02 мкМ каждого, 100 ед. M-MLV обратной транскриптазы, 20 ед. ингибитора РНКаз, случайные гексануклеотидные праймеры и краситель крезоловый красный и ОТ-растворитель, содержащий 10 мкМ Трис-HCl, 0,5 М Na2 ЭДТА, 10% глицерина.
Использование данных универсальных неспецифических компонентов позволяет получить препарат кДНК анализируемой пробы, предназначенный для направленной амплификации РНК вируса SARS-CoV-2.
Для постановки ОТ использовали 10 мкл раствора РНК, выделенной в ходе вышеизложенных исследований. Реакцию проводили с использованием комплекта реагентов для получения кДНК на матрице РНК «Реверта L» производства ФГУНЦНИИИЭ, Россия. В реакционную смесь вносили фермент M-MLV-ревертазу (200 ЕД в 2 мкл) и при 37°С в течение 1 ч проводили ОТ-реакцию.
Необходимо отметить, что для очистки получаемых с помощью ГИК РВА целесообразно вставка в состав последних N-концевого 6His-участка который может быть использован для аффинной очистки генетически модифицированных белков. Поэтому на 5/-конце всех используемых нами для конструирования ГИК обратных праймеров содержится последовательность gtggtgatggtgatggtg.
Амплификацию проводили согласно следующему температурно-временному режиму 95°С - 60 с- 1 цикл; 95°С - 10 с, 50°С - 10 с, 60°С - 90 с - 30 циклов.
После завершения амплификации проводили очистку полученного продукта с помощью переосаждения этиловым спиртом.
В реакционную смесь добавляли 2 мкл 1,5 М ацетата натрия и 2,5 объема 96% спирта, перемешивали на вортексе.
Проводили центрифугирование (центрифуга Эппендорф, Германия 3200 об⋅мин-1 30 мин при 4°С).
Отбирали супернатант и добавляли 100 мкл 70% этилового спирта, перемешивали на вортексе.
Проводили центрифугирование (центрифуга Эппендорф, Германия 3200 об⋅мин-1 5 мин при 4°С).
Супернатант высушивали в вакуумном концентраторе 5 минут при 60°С и добавляли 10 мкл деионизованного формамида, перемешивали на вортексе, центрифугировали (центрифуга Эппендорф, Германия 3200 об⋅мин-1 5 мин при 4°С). (центрифуга Эппендорф, Германия 3200 об⋅мин-1 5 мин при 4°С).
ДНК денатурировали в амплификаторе в течение 5 минут при темрературе 95°С.
Амплификат для клонирования в выбранном плазмидном векторе получали с кДНК вируса SARS-CoV-2.
Встраивание полученных очищенных фрагментов кДНК гена белка S в плазмиду рЕТ проводили по следующей методике.
Лигирование очищенного фрагмента кДНК гена белка S вируса SARS-CoV-2- с вектором проводили с использованием Т4 ДНК-лигазы (Promega, США). Лигазную смесь составляли по схеме, предложенной фирмой-производителем Т4 ДНК-лигазы (Promega, США). Реакцию лигирования проводили при температуре 15±2°С в течение 18 ч.
Трансформацию клеток Е. coli, штамм JM109, лигазной смесью, содержащей рекомбинантные плазмиды, проводили по стандартной методике с использованием хлористого кальция [Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование [Текст]: / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук Пер. с англ. / - М., 1984.]. Тепловой шок проводили при 42°С в течение 90 с. Для трансформации использовали только высокоэффективные компетентные клетки с концентрацией выше 1.108 cfu.мг-1 ДНК.
Скрининг клонов, содержащих рекомбинантную ДНК, проводили на селективной среде, содержащей 1,5% агар (фирма Difco, США) в присутствие ампициллина (50 мг.мл-1), изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (0,05 мг.мл-1), 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозид (80 мг.мл-1) при температуре 37±2 °С. Колонии, окрашенные в белый цвет, считали депонентами клонированной последовательности и отбирали для выделения ДНК и последующего изучения в ПЦР.
Для выделения рекомбинантной ДНК и проверка полученной ДНК на наличие вставки чужеродного гена в ПЦР со специфическими праймерами.
Отобранные полоски переносили в среду LB с добавлением ампициллина (50 мг.мл-1) и культивировали при температуре 37±2°С в течение суток. Бактериальные клетки осаждали центрифугированием и выделяли рекомбинантную ДНК клонов с использованием наборов DNA Purification System (Promega, США) по рекомендации фирмы производителя [Инструкция к набору для выделения плазмидной ДНК WizardR Plus minipreps/Promega.-2003.-Кат №1330.] Количественные характеристики полученной ДНК оценивали электрофоретически в 1% геле агарозы.
Для получения клонов, способных к экспрессии рекомбинантного белка RBD проводили ко-трансформацию плазмид компетентных клеток E.coli (штамм BL21(DE3) методом теплового шока в соотношении 1:1:1, наносили на твердый селективный агар, содержащий ампициллин/карбециллин (100 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и инкубировалив течение 12 час.при температуре 37°С при 170 об/мин. Отбирали выросшие клоны и проводили ПЦР-скрининг на содержание всех трех конструкций в отобранных клонах. Полученные клоны использованы для хранения и получения рекомбинантного белка.
Схема полученной рекомбинантной плазмиды рЕТ MBP_RBD_6His / SARS-CoV-2 приведена на фиг 1.
Характеристики полученной ГИК:
- размер 5430 пар нуклеотидных остатков п. н.о.;
- вставка кДНК вируса SARS-CoV-2, имеющая первичную структуру 5/ - cggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg tggtg - 3/ кодирующая антиген MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag;
- NcoI/XhoI-фрагмент ДНК плазмиды рЕТ размером 3587 п.н.о., содержащийо участки инициации репликации плазмидного вектора (ori) и фага fl (florigin), промотор и терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7, ген РНК-организующего белка (Rop), ген β-лактамазы (AmpR), детерминирующий устойчивость трансформированных рекомбинантной плазмидой рЕТклеток Е. Coli к пенициллиновым антибиотикам, и NcoI/XhoI-фрагмента ДНК длиной 172 п.о., кодирующего РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2;
- уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии от сайта NcoI: EcoRV- 280 п. о., XhoI - 332 п. о., ScaI - 1397 п. о., PvuI - 1508 п. о., BglI - 1756 п. о, BglII - 3822 п. о., XbaI - 3880 п. о..
С помощью сконструированной ГИК при культивировании штамма-продуцента достигается высокий уровень экспрессии фрагмента гена белка S, кодирующего РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.
Хранение рекомбинантных плазмид осуществляли в культуре клеток Е. Coli, штамм JM109, с добавлением 50% глицерина при температуре от минус 18 до минус 22°С.
Свойства ГИК рЕТ_MBP_RBD_6His были стабильны в течение 12 месяцев хранения (срок наблюдения)
Пример 2. Получение штамма-продуцента Escherichia coli JM109 /рЕТ MBP_RBD_6His и определение его продуктивности
Штамм, являющийся продуцентом РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, получают путем трансформации клеток штамма Е. coli JM109 рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His создание которой описано в примере 1..
Клетки штамма Е. coli JM109/рЕТ MBP_RBD_6His являются продуцентом РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.
Трансформированные клетки высевают на агаризованную среду LB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), и выращивают в течении 14 ч при 37°С для получения отдельных колоний. После чего несколько колоний переносят в 50 мл среды LB, содержащей 2% глюкозу и ампициллин (100 мкг/мл), и выращивают 8-10 ч при 37°С на шейкере при перемешивании со скоростью 180 об/мин для получения маточной культуры. Полученной культурой (процент засева составляет 2.5%) засевают требуемый объем среды LB, содержащей0.2% глюкозу и ампициллин (100 мкг/мл), и выращивают при 37°С при перемешивании со скоростью 180 об/мин. При плотности клеточной культуры ОД600=0.8-0.9 о.е. вносят ИПТГ до концентрации 0.4 мМ и выращивают при 37°С в течение 3 ч. Каждый час после добавления ИПТГ отбирают аликвоты для последующего электрофоретического анализа. По окончании выращивания клеточную культуру центрифугируют в течение 30 мин при 4000 об/мин и охлаждении 10°С.
Штамм-продуцент Е. coli JM109/рЕТ MBP_RBD_6His характеризуется следующими показателями:
Морфологические признаки.
Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки.
Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или среде Лурье-Бертрана) образуют интенсивную ровную муть.
Физико-биологические признаки.
Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам.
Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 100 мкг/мл).
Генетические особенности штамма.
Генотип штамма - canr::CBD fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] arnA::CBD slyD::CBD glmS6Ala ΔhsdS λ DE3=λ sBamHIo ΔEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7 genel) i21 Δnin5 pET MBP_RBD_6His.
Для экспрессии белка брали культуру в объеме 10 мкл и На фиг. 2 представлен результат электрофоретического анализа накопления РВА MBP_RBD_6His в ходе выращивания клеточной культуры штамма-продуцента Е. coli/pET MBP_RBD_6His 1 - стандарт молекулярных масс; 2 - лизат клеточной культуры до внесения ИПТГ; 3 - тотальный клеточный лизат после 1 ч выращивания после внесения ИПТГ; 4 - тотальный клеточный лизат после 2 ч выращивания после внесения ИПТГ; 5 - тотальный клеточный лизат после 3 ч выращивания после внесения ИПТГ; А - антиген MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2/
Пример 3 Получение РВА MBP _RBD_6His вируса SARS-CoV-2
Проводили культивирование в среде LB при температуре 30°С пре перемешивании со скоростью 275 об/мин до достижения плотности культуры ОД600 0,3…0,4. Затем вводили изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,5 мМ. Это соединение используется в качестве аналога аллолактозы, метаболита лактозы, который запускает транскрипцию lac оперона.
Клетки охлаждали до 18°С при 150 об.мин-1 в течение 16 час. Осажденные клетки хранили при минус 20°С.
Для выделения РВА из осажденных клеток использовали следующую методику. Клетки размораживали и ресуспендировали в буфере, содержащем 20 мм Трис-HCl рН 7,4, 0,2 М NaCl и 50 мкл смеси ингибиторов протеаз (Sigma, Cat.# Р8849) на грамм клеточной биомассы. Затем ресуспендированные клетки лизировали с помощью эмульгирования. Полученный лизат осветляли центрифугированием при 40000 g в течение 30 минут при 4°С. Затем осветленный лизат фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм (Миллипор) и пропускали через колонку MBPTrap объемом 5 мл (GE) с использованием AKTA FPLC (Amersham Biosciences). Неспецифически связанные белки вымывали из колонки 10 мл буфера для ресуспензирования, и РВА RBD-MBP элюировали в течение 10 мл градиентным методом, используя буфер, содержащий 20 мм Трис-HCl, рН 7,4, 0,2 М NaCl и 10 мм мальтозы. Содержащие белок фракции определяли по показателю ОД280, и проверяли с помощью электрофореза с использованием 10%-ного геля SDS-PAGE (Genscript). Окрашивания геля проводили Coomassie Brilliant Blue G-250. Затем фракцию загружали на колонку NiAff объемом 1 мл (GE) с рабочим буфером, содержащим 2 PBS с 20 мм имидазолом, рН 8, и буфером для элюирования, содержащим 2 PBS с 1 М имидазолом, рН 8. Полученные пики были снова проверены с помощью электрофореза в геле. Полосы с ММ, соответствующей 74 кДа (ожидаемый размер белка слияния RBD-MBP), концентрировали и загружали в эксклюзионную колонку HiLoad 16/60 Superdex75 (GE).
Фракции, соответствующие белку слияния, объединяли и концентрировали (с использованием концентраторов регенерированной целлюлозы Amicon (Cat # UFC803096). Идентичность RBD-MBP после каждой колонки была подтверждена в Вестерн-блот Peggy Sue (Protein Simple) с использованием антитела против S- белка коронавируса (Cat # 40591-Т62). Концентрацию рекомбинантного белка определяли с помощью НаноДроп1000 Фишера, используя ММ 74 кДа для белка слияния, и проводили расчет по формуле 1:
Е280=101,19 М-1 см-1
Для практического использования РВА необходимо было отработать метод получения очищенного препарата.
Наиболее распространенными методами очистки рекомбинантных белков в биотехнологии являются хроматографические методы и, в частности, металлохелатная аффинная хроматография. Один из приемов металлоафинной хроматографии основан на том, что некоторые аминокислоты, в частности гистидин, способны формировать комплексы с ионами металлов. После иммобилизации на хроматографической фазе хелатирующих групп целевой рекомбинантный белок, содержащий блок из нескольких остатков гистидина, связывается с хроматографической фазой, после чего отделяются сопутствующие белки и проводится элюция целевого белка.
Кроме блока из остатков гистидина, целевой рекомбинантный белок может содержать последовательности глутатион-S-трансферазы (GST), хитина, S-белка и другие, при этом принципы хроматографического выделения целевого рекомбинантного белка остаются теми же.
Для проведения очистки РВА MBP_RBD_6His использовали следующую методику. Клетки E.coli, содержащие РВА, осаждали центрифугированием (6000 g, 4°С, 20 мин), промывали буфером (10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (20 мМ натрий-фосфатный буфер, 0,5 М Nad), содержащем 10 мМ имидазол, 20% глицерин и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (буфер для выделения). Клетки подвергали двукратному замораживанию-оттаиванию. После этого клетки подвергали ультразвуковой дезинтеграции (22 кГц, 3×10 с), добавляли рибонуклеазу до концентрации 2 ед./мл и дезоксирибонуклеазу до концентрации 300000 ед./мл и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Фрагменты разрушенных клеток осаждали центрифугированием (100000 g, 4°С, 1 ч). Осадок ресуспендировали в буфере для выделения, содержащем 1% Emulgen-913, инкубировали в течение 2 часов при температуре 4°С и медленном покачивании, после чего повторно центрифугировали при указанных выше условиях. Полученный в обоих случаях супернатант пропускали через фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.
К лизату клеток E.coli добавляли порошок никеля с диаметром частиц 50 нм в соотношении 5 мг частиц никеля на 1 мг суммарного белка грубого лизата, инкубировали при интенсивном встряхивании в течение 15 мин при комнатной температуре. Магнитную сепарацию частиц никеля проводили с использованием Magnetic Separation Unit (Promega, США). Несвязавшиеся белки удаляли, частицы никеля промывали путем добавления фосфатно-солевого буфера при интенсивном встряхивании 15 мин при комнатной температуре. Далее, частицы также были сепарированы, элюцию белка проводили с использованием фосфатно-солевого буфера с добавлением 250 мМ имидазола. Наличие очищенного белка в полученном препарата проверяли с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (10%). РВА MBP_RBD_6His, очищенный с помощью данной процедуры использовали при проведении дальнейших экспериментов.
Выход из 1 литра культуры составлял приблизительно 2,5 мг очищенного РВА MBP_RBD_6His. Очищенный РВА MBP RBD_6His хранили при -20°С в 2Х PBS с добавлением конечной концентрации 30% глицерина
Пример 4 Оценка определение соответствия РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 антигену возбудителя COVID-19
В качестве критерия соответствия полученного РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 антигену нативного возбудителя COVID-19 использовали следующие показатели:
- полученный РВА вируса SARS-CoV-2 должен реагировать с сыворотками конвалесцентов COVID-19;
- антитела к РВА вируса SARS-CoV-2 должны реагировать с антигеном вируса SARS-CoV-2.
При проведении экспериментов использовали следующую методику Была проведена внутрибрюшинная иммунизация беспородных белых мышей РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2. В качестве варианта сравнения использовали инактивированный вирус SARS-CoV-2. Использовали одну и ту же схему иммунизации в опыте и контроле (трехкратное введение без ПАФ с интервалом 7 суток, взятие крови через 3-е суток после заключительной иммунизации). При исследовании полученных сывороток в ИФА в качестве антигена использовали либо инактивированный вирус SARS-CoV-2, либо РВА MBP_RBD_6His. Полученные данные представлены в таблице 33.
Титр специфических антител определяли по следующей методике:
- лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали либо инактивированным вирусом SARS-CoV-2, либо РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2. Адсорбцию проводили в течение суток при температуре 4°С;
- лунки промывали раствором ФСБ-Т и вносили в них по 0,2 см3 блокирующего буфера (ФСБ-Т-БСА) и помещали на 1 час в термостат при температуре 37°С;
- лунки промывали раствором ФСБ-Т и вносили в них по 100 мкл соответствующего разведения исследуемой иммунной сыворотки. Инкубировали 1 час при 37°С
- содержимое сунок удаляли, лунки промывали раствором ФСБ-Т и в дунки вносили 100 мкл рабочего разведения антимышиных антител, конъюгмрованных с пероксидазой хрена (из коммерческого наборо. Инкубацию проодили в течение 60 мин при 37°С.
- после 5-кратной промывки в лунки добавляли 50 мкл субстрат-индикаторного раствора (ТМБ+цитратно-ацетатный буфер+H2O2). Инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего в лунки добавляли 50 мкл стоп-реагента (2 н H2SO4)
Определяли оптическую плотность раствора при длине волны 450 нм.
За титр иммунной сыворотки (в соответствующем варианте опыта принимали ее высшее разведение, в котором еще была зарегистрирована положительная реакция в ИФА. Результаты представлены в таблице.
Как следует из полученных данных, результаты, полученные в ходе ИФА, свидетельствуют о достаточно эффективной экспрессии специфических антител. С учетом ошибки метода анализа (при используемом двукратном шаге разведения -×/:2 различия между определяемыми показателями недостоверны
При анализе исследуемых сывороток в ИФА с использованием различных антигенов не выявлено никаких различий при смене антигена, используемого для проведения анализа.
Таким образом, проведенное иммунохимическими методами сравнение полученных РВА вируса SARS-CoV-2 антигенам нативного возбудителя COVID-19 показало высокий уровень соответствия. РВА, продуцируемые разработанными ГИК, могут быть использованы для создания наборов реагентов для выявления антител к вирусу SARS-CoV-2.
Пример 5 Использование РВА вируса SARS-CoV-2 в качестве компонента набора реагентов
В экспериментах использовали сыворотки конвалесцентов COVID-19, сыворотки от иммунизированных вакциной против COVID-19, взятые спустя 21-28 суток после заключительной иммунизации. При проведении исследований был в качестве варианта сравнения использовали коммерческий набор для определения антител к возбудителю COVID-19 методом ИФА. В качестве «захватывающих антигенов использованы антиген, входящий в состав коммерческого набора, инактивированный вирус SARS-CoV-2 и
При проведении экспериментов использовали следующую методику:
- лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали либо антигеном, входящим в состав набора, либо инактивированным вирусом SARS-CoV-2, либо РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2. Адсорбцию проводили в течение суток при температуре 4°С;
- лунки промывали раствором ФСБ-Т и вносили в них по 0,2 см блокирующего буфера (ФСБ-Т-БСА) и помещали на 1 час в термостат при температуре 37°С;
- лунки промывали раствором ФСБ-Т и вносили в них по 100 мкл соответствующего разведения исследуемой иммунной сыворотки. Инкубировали 1 час при 37°С
- содержимое сунок удаляли, лунки промывали раствором ФСБ-Т и в дунки вносили 100 мкл рабочего разведения античеловеческих антител, конъюгмрованных с пероксидазой хрена (из коммерческого наборо. Инкубацию проодили в течение 60 мин при 37°С.
- после 5-кратной промывки в лунки добавляли 50 мкл субстрат-индикаторного раствора (ТМБ+цитратно-ацетатный буфер+Н2О2). Инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего в лунки добавляли 50 мкл стоп-реагента (2 н H2SO4)
Определяли оптическую плотность раствора при длине волны 450 нм.
За титр иммунной сыворотки (в соответствующем варианте опыта принимали ее высшее разведение, в котором еще была зарегистрирована положительная реакция в ИФА. Результаты представлены в таблице.
Как следует из представленных данных, с учетом ошибки метода анализа (при используемом двукратном шаге разведения -×/:2 различия между определяемыми показателями недостоверны.
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:
На фиг. 1 показана физическая карта рекомбинантной плазмиды рЕТ MBP_RBD_6His Указаны уникальные сайты эндокуклеаз рестрикции. Ori - участок инициации репликации плазмидного вектора, М13 ori - участок инициации репликации фага М13, AmpR - ген устойчивости к ампициллину, lacI - ген репрессора лактозного оперона, Rop - ген РНК-организующего белка, MBP_RBD - ген, кодирующий РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.
На фиг. 2 представлена электрофореграмма анализа накопления РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag в ходе выращивания клеточной культуры штамма-продуцента Е. coli JM109/рЕТ MBP_RBD_6His
1 - стандарт молекулярных масс; 2 - лизат клеточной культуры до внесения ИПТГ; 3 - тотальный клеточный лизат после 1 ч выращивания после внесения ИПТГ; 4 - тотальный клеточный лизат после 2 ч выращивания после внесения ИПТГ; 5 - тотальный клеточный лизат после 3 ч выращивания после внесения ИПТГ; А - РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.
На фиг. 3 представлена электрофореграмма анализа постадийного выделения РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.
1 - стандарт молекулярных масс; 2 - Клеточный лизат; 3 - Клеточный супернатант; 4 - Объединенный элюат после металл-хелатной аффинной хроматографии; 5 - Объединенный элюат после гель-фильтрационной хроматографии; 6 - очищенный белок MBP_RBD_6His после лиофилизации; А - РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.
На фиг. 4 представлена электрофореграмма анализа очищенного РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. 1 - восстанавливающие условия; 2 - стандарт молекулярных масс; 3 - невосстанавливающие условия; А - РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.
На фиг. 5 представлен результат анализа очищенного РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag методом иммуноблотинга с использованием человеческих IgG к вирусу SARS-CoV-2 (восстанавливающие условия). 1 - стандарт молекулярных масс; 2 - РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, нагрузка 0.5 мкг; 3 - антиген MBP_RBD_6His, нагрузка 1 мкг; 4 - РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, нагрузка 2 мкг.
В таблице 1 представлены результаты иммуноферментного определения титра специфических антител в сыворотках после иммунизации белых мышей РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2.
В таблице 2 представлены результаты иммуноферментного определения титра вирусспецифических антител в сыворотках крови реконвалесцентов м иммунизированных против COVID-19 при использовании РВА MBP _RBD_6HisBHpyca SARS-CoV-2 в качестве захватывающего антигена.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"
nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"
fileName="Sequence list.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-10-24">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2023117738</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-07-03</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский
институт» Министерства обороны Российской Федерации (ФГБУ «48 «ЦНИИ»
Минобороны России)</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Inctitution 48 Central
Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian
Federation</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО
АНТИГЕНА MBP_RBD_6His ВИРУСА SARS-CoV-2 с С-КОНЦЕВОЙ АФФИННОЙ МЕТКОЙ
6xHIS-tag, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА
НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ COVID-19</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q7">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Direct primer used to amplife the gene
encoding MBP_RBD_6His virus SARS-CoV-2</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taagagtcattttgctattggcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>41</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..41</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q9">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer used to amplify the gene
encoding MBP_RBD_6His virus SARS-CoV-2</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtggtgatggtgatggtgtgtaaagttgccacattcctac</INSDSe
q_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>34</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Amino acid sequence MBP_RBD_6His of the
virus SARS-CoV-2 with C-terminal 6xHis-tag</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>SSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGA</INSDSeq_seque
nce>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>68</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..68</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>The nucleotide sequence MBP_RBD_6His of
the virus SARS-CoV-2 with C-terminal 6xHis-tag
</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acgtccctcgtcggagctctcaggtgggttgtcttagataacctctgag
ctcccatggagtaataatt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (1)
- Способ получения рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, предусматривающий трансформацию штамма Escherichia coli JM109 плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His, содержащей ген, кодирующий антиген MBP_RBD_6His вируса вакцины с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, создание штамма-продуцента рекомбинантного антигена MBP RBD_6His Escherichia coli рЕТ MBP_RBD_6His, культивирование штамма-продуцента для накопления целевого продукта, разрушение клеточной биомассы с помощью ультразвукового дезинтегратора в буферном растворе с рН 8,0±0,5 в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента, отделение клеточного супернатанта, содержащего целевой белок, с помощью центрифугирования, выделение и очистку антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с помощью металл-хелатной аффинной и гель-фильтрационной хроматографии, его стерильную фильтрацию и лиофильное высушивание, отличающийся аминокислотной структурой рекомбинантного антигена, представленной в SEQ ID NO 3.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2813324C1 true RU2813324C1 (ru) | 2024-02-12 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2781294C1 (ru) * | 2022-07-06 | 2022-10-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Конъюгат белка рецепторсвязывающего домена (RBD) поверхностного гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 с полимером полиглюкин-спермидин (PGS) и вакцинный комплекс против коронавирусной инфекции COVID-19 на основе указанного конъюгата и плазмидной ДНК pVAX-RBD |
US20220339279A1 (en) * | 2021-04-15 | 2022-10-27 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Recombinant proteins, compositions, vectors, kits, and methods for immunizing against, and testing for exposure to, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220339279A1 (en) * | 2021-04-15 | 2022-10-27 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Recombinant proteins, compositions, vectors, kits, and methods for immunizing against, and testing for exposure to, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 |
RU2781294C1 (ru) * | 2022-07-06 | 2022-10-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Конъюгат белка рецепторсвязывающего домена (RBD) поверхностного гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 с полимером полиглюкин-спермидин (PGS) и вакцинный комплекс против коронавирусной инфекции COVID-19 на основе указанного конъюгата и плазмидной ДНК pVAX-RBD |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Gromova, M.S., Gromov, A.V., Grunina, T.M. et al. Recombinant RBD of the SARS-CoV-2 Spike Protein: Production in Escherichia coli Cells, Binding to Antibodies, and Antiviral Activity. Mol. Genet. Microbiol. Virol. 38, 86-94 (2023). doi 10.3103/S0891416823020052. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pei et al. | Expression of SARS-coronavirus nucleocapsid protein in Escherichia coli and Lactococcus lactis for serodiagnosis and mucosal vaccination | |
CN107176977B (zh) | 牛支原体MbovP730蛋白在自然感染和疫苗免疫鉴别中的应用 | |
JPH06509710A (ja) | バキュロウイルスにおけるインフルエンザaのm2蛋白の改良発現及びm2蛋白の使用 | |
RU2332457C2 (ru) | Вектор, обеспечивающий экспрессию антигена вируса sars на поверхности клеток, и микроорганизмы, трансформированные этим вектором | |
Sander et al. | Characterization of Bartonella clarridgeiae flagellin (FlaA) and detection of antiflagellin antibodies in patients with lymphadenopathy | |
TW201300421A (zh) | 用於偵測豬繁殖及呼吸道綜合症病毒(prrsv)之試劑及方法 | |
WO2020238458A1 (zh) | 用于表达e2蛋白的细胞株及其应用,e2蛋白及其应用 | |
CN113293145A (zh) | 一种麻疹病毒活载体新冠疫苗 | |
JP2013518563A (ja) | ワクチンにおいて使用するための組換えタンパク質、前記タンパク質に対する抗体、ならびに該タンパク質を含む診断法および療法 | |
RU2603056C2 (ru) | Экспрессирующий плазмидный вектор pet32b(+)asfv/p30e2 для синтеза рекомбинантного белка, состоящего из фрагмента p30 вируса африканской чумы свиней, тиоредоксина и полигистидиновых участков | |
CN105567660A (zh) | 一种大肠杆菌重组表达结核分枝杆菌Rv2837c活性蛋白的方法及其应用 | |
RU2813324C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА MBP_RBD_6His ВИРУСА SARS-CoV-2 с C-КОНЦЕВОЙ АФФИННОЙ МЕТКОЙ 6xHIS-tag, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯЧ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ COVID-19 | |
JPH05501401A (ja) | 組換え微生物との転移増殖によるワクチン又はトキソイド製剤及び免疫の方法 | |
CN110257405B (zh) | 牛支原体乙醇脱氢酶基因及其编码蛋白与应用 | |
WO2012126149A1 (zh) | 结核杆菌融合蛋白及其制备方法和应用 | |
CN111621506A (zh) | 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用 | |
CN116478953A (zh) | 鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白、制备方法及应用 | |
CN106397546B (zh) | 一种o型口蹄疫病毒人工重组抗原及其制备与应用 | |
RU2742511C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pET21-VP40VE, содержащая ген матриксного белка VP40 вируса Эбола и рекомбинантный белок VP40-ВЭ, полученный в результате экспрессии гена белка VP40 вируса Эбола с использованием рекомбинантной плазмидной ДНК pET21-VP40VE и обладающий иммуногенными и антигенными свойствами | |
EP0238893B1 (en) | Recombinant parvovirus ra-1 products and methods of use thereof | |
RU2341288C1 (ru) | СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ СВОЙСТВОМ ФОРМИРОВАТЬ КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ ПРОТИВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS H37 Rv, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЕГО (ВАРИАНТЫ), РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ И СРЕДСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА | |
Deneke et al. | Purification and properties of the plasmid maintenance proteins from the Borrelia burgdorferi linear plasmid lp17 | |
RU2739505C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pET21-NPVE, содержащая ген нуклеопротеина (NP) вируса Эбола и рекомбинантный белок NP-ВЭ, полученный в результате экспрессии гена NP вируса Эбола с использованием рекомбинантной плазмидной ДНК pET21-NPVE и обладающий иммуногенными и антигенными свойствами | |
RU2441666C1 (ru) | Комплексный антиген вируса кори, используемый в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори | |
Tailakova et al. | CONSTRUCTION, EXPRESSION AND PURIFICATION OF BRUCELLA SPP. RECOMBINANT PROTEINS L7/L12 AND SODC IN E. COLI |