RU2332457C2 - Вектор, обеспечивающий экспрессию антигена вируса sars на поверхности клеток, и микроорганизмы, трансформированные этим вектором - Google Patents
Вектор, обеспечивающий экспрессию антигена вируса sars на поверхности клеток, и микроорганизмы, трансформированные этим вектором Download PDFInfo
- Publication number
- RU2332457C2 RU2332457C2 RU2005141528/13A RU2005141528A RU2332457C2 RU 2332457 C2 RU2332457 C2 RU 2332457C2 RU 2005141528/13 A RU2005141528/13 A RU 2005141528/13A RU 2005141528 A RU2005141528 A RU 2005141528A RU 2332457 C2 RU2332457 C2 RU 2332457C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sars
- protein
- pgsa
- antigen
- phce2lb
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 96
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 88
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 86
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 77
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 72
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 120
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 claims abstract description 51
- 101150076330 pgsA gene Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 101100059000 Bacillus subtilis (strain 168) capA gene Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 101100083407 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) pgsA1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 36
- 108700002099 Coronavirus Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 101100059011 Bacillus subtilis (strain 168) capB gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101100219452 Bacillus subtilis (strain 168) capC gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101150103033 lpxB gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 81
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 46
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 39
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 34
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 33
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 33
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 26
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 26
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 17
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 14
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 claims description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 9
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 5
- 101001024647 Severe acute respiratory syndrome coronavirus Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 claims description 3
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims description 3
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 claims description 2
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 claims description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 claims description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 2
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 claims description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 2
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 claims description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 2
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 claims 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 196
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 67
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 27
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 26
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 26
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 12
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 12
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 241001076388 Fimbria Species 0.000 description 2
- 101150112842 NB gene Proteins 0.000 description 2
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 101710178358 Peptidoglycan-associated lipoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101100240078 Severe acute respiratory syndrome coronavirus N gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 108010083364 chungkookjang Proteins 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 101150049389 tor2 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100027153 Ankyrin repeat and sterile alpha motif domain-containing protein 1B Human genes 0.000 description 1
- 101710149294 Ankyrin repeat and sterile alpha motif domain-containing protein 1B Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101710168515 Cell surface glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108700005307 Human papillomavirus HPV L1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002231 IgA-specific serine endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 102000001109 Leukocyte L1 Antigen Complex Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 241001442654 Percnon planissimum Species 0.000 description 1
- 101710132659 Protein M6 Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710099182 S-layer protein Proteins 0.000 description 1
- 229940124680 SARS vaccine Drugs 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 108700010904 coronavirus proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 108010063679 ice nucleation protein Proteins 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 101150111766 sc gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000009120 supportive therapy Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен вектор, включающий один, два или более генов pgsB, pgsC и pgsA, кодирующих комплекс синтетазы поли-гамма-глутаминовой кислоты, и ген, кодирующий белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида коронавируса SARS. При этом ген, кодирующий белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида коронавируса SARS, присоединен к С-концевой части одного, двух или более генов pgsB, pgsC и pgsA. Вектор обеспечивает экспрессию белка на поверхности клетки. Также предложены микроорганизм, трансформированный таким вектором, обеспечивающим экспрессию белка на поверхности клетки, и вакцина для предупреждения SARS, содержащая данный микроорганизм. Вакцина для предупреждения и лечения SARS с использованием рекомбинантного штамма, экспрессирующего антиген коронавируса SARS на своей поверхности, является эффективной и экономически выгодной. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 18 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается вектора, обеспечивающего экспрессию антигенов SARS на поверхности микроорганизма, микроорганизма, трансформированного данным вектором, и вакцины для предупреждения SARS, содержащей трансформированный микроорганизм или экстрагированное и очищенное вещество из данного микроорганизма. В частности, настоящее изобретение касается вектора, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки {surface expression vector), содержащего ген, кодирующий белки-антигены коронавируса, вызывающего SARS, и любой из одного, двух или более генов pgsB, pgsC и pgsA, кодирующих комплекс синтетазы поли-γ-глутаминовой кислоты, которая в микроорганизмах представляет собой мотив «заякоривания» (anchoring motif) на поверхности клетки; микроорганизма, трансформированного данным вектором, и вакцины против SARS, содержащей в качестве действующего начала трансформированный микроорганизм.
Уровень техники
Атипичная пневмония, или тяжелый острый респираторный синдром (SARS, severe acute respiratory syndrome), представляет собой новый тип эпидемии, которая распространилась по всему миру, включая Гонконг, Сингапур, Канаду (Торонто) и так далее, начиная с момента, когда она была впервые выявлена в ноябре 2002 года в провинции Гуандун в Китае. Это заболевание сопровождается респираторными симптомами, такими как лихорадка с температурой 38°С или выше, кашель, затрудненное дыхание (одышка), атипичная пневмония. Было установлено, что агент, вызывающий SARS, является мутантом патогенного коронавируса.
Как правило, члены семейства коронавирусов представляют собой очень крупные РНК-содержащие вирусы, имеющие (+)-цепь РНК. Их геном состоит примерно из 29000-31000 нуклеотидов, а при наблюдении под микроскопом вирусная частица по форме напоминает корону. У человека они вызывают заболевания верхних дыхательных путей, у животных - респираторные заболевания и болезни печени, нервов и кишечника. В природе существуют три группы коронавирусов, из которых группы I и II инфицируют млекопитающих, а группа III инфицирует птиц.
У людей с ослабленной иммунной системой известные в природе коронавирусы иногда вызывают заболевания, связанные с легкими, или вызывают тяжелые заболевания у таких животных, как собаки, кошки, свиньи, мыши, птицы и тому подобных. Эти вирусы демонстрируют очень высокую скорость мутирования и высокую скорость рекомбинации на уровне около 25%. Предполагается, что эти свойства привели к мутации исходного коронавируса и к появлению нового мутантного коронавируса (коронавируса SARS), который распространился от животных к человеку.
Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), с ноября 2002 года в 31 стране мира было идентифицировано 7447 пациентов с подозрением на SARS, из которых 551 человек умер. Зона с высокой опасностью по SARS в 2003 году включала провинции Бейджин, Гуандун, Гонконг, Внутренняя Монголия, Шанкси и Тьянджин в Китае, Сингапур, Торонто в Канаде, Тайвань, Улан-Батор в Монголии, Филиппины и тому подобное. Однако существует риск распространения данного вируса по всему миру.
С момента вспышки с 2002 года SARS, вызванного коронавирусом, Институт тропической медицины в Германии первым провел расшифровку нуклеотидной последовательности генома вируса SARS. Группа исследователей расшифровала нуклеотидную последовательность определенного генетического участка, на котором можно проводить амплификацию методом ПНР (полимеразная цепная реакция). Результат расшифровки был предоставлен компании Artus GmbH, которая в Германии работает в области биоинженерии, и был использован для создания диагностического набора для выявления инфекции SARS. Данный набор позволяет выявить инфекцию, вызванную вирусом SARS, с помощью амплификации вирусного гена при использовании материала, полученного из пациента с подозрением на SARS.
После этого был расшифрован весь геном вируса SARS, и в настоящее время полностью проанализированы последовательности более чем 12 выделенных штаммов вируса. Полная последовательность вируса штамма Urbani, который является первьм выделенным штаммом [назван по имени врача миссии ВОЗ, умершего от SARS, прежнее название - штамм SARS-Cov (Rota P.A., Science 108, 5952, 2003; GenBank Accession AY278741)], была расшифрована группой исследователей из CDC в США. Группа из Canada British Columbia Cancer search center проанализировала полную последовательность штамма Тоr2 вируса SARS, выделенного из пациента в Торонто, Канада, 12 апреля 2003 года (Магга М.А., Science 108, 5953, 2003; GenBank Accession 274119).
Несмотря на то, что эти две группы исследователей анализировали коронавирусы, выделенные из пациентов, инфицированных в двух разных местах, различие между двумя вирусами было обнаружено только в 15 нуклеотидах. Это позволяет предполагать, что SARS был вызван одним и тем же вирусом. Согласно данным геномного анализа коронавируса SARS также известно, что данный вирус имеет сходные с другими существующими коронавирусами компоненты, образующие белки, но демонстрирует при сравнении с ними низкую степень гомологии генома и аминокислотной последовательности, закодированной в геноме. Обнаружено сходство коронавируса SARS с вирусом гепатита крыс и вирусом бронхита индеек. Однако данные о корреляции коронавируса SARS и других коронавирусов, полученные с помощью молекулярного таксономического анализа, позволяют заключить, что коронавирус SARS отличается от существующих групп коронавирусов.
В настоящее время выявление коронавируса SARS начинается с ПЦР анализа и положительного результата в тесте на антитела, который проводят методом ELISA или IFA. Выделение вируса осуществляется посредством создания культуры клеток пациента, выявленного с помощью ПЦР, анализа этой культуры и установления факта инфицирования коронавирусом SARS.
Эффективных методов лечения SARS не существует, в настоящее время применяется только дополнительная поддерживающая терапия. Исследования коронавируса SARS, являющегося агентом, вызывающим новую эпидемию, находятся в начальной стадии, и пока не разработана вакцина для предупреждения этого заболевания. Во многих странах мира проводятся разнообразные исследования для создания такой вакцины.
Технология прикрепления и экспрессии определенного белка на клеточной поверхности микроорганизма носит название «технология экспонирования на клеточной поверхности» (cell surface display technology). Технология экспонирования на клеточной поверхности использует белки клеточной поверхности микроорганизмов (таких как бактерии или дрожжи) с мотивом «заякоривания» (anchoring motif) на поверхности для экспрессии чужеродных белков на поверхности клеток, а объем применения данной технологии включает производство рекомбинантной живой вакцины, создание библиотек пептидов и антител и их скрининг, абсорбентов на основе целых клеток, катализаторов для биотрансформации на основе целых клеток, и тому подобное. Область применения этой технологии определяется белком, который экспрессируется на поверхности клетки. Таким образом, технология экспонирования на клеточной поверхности имеет гигантский потенциал для промышленного применения.
Для успешного использования технологии экспонирования на клеточной поверхности наиболее важным является мотив, обеспечивающий «заякоривание» белка на поверхности. Поэтому ключевым для данной технологии является выбор и создание мотива для эффективной экспрессии чужеродного белка на клеточной поверхности.
Для выбора мотива для поверхностного «заякоривания» необходимо учитывать следующие свойства:
1) мотив должен содержать сигнал для секреции, чтобы облегчить чужеродному белку прохождение сквозь внутреннюю мембрану клетки и обеспечить перенос чужеродного белка на клеточную поверхность;
2) мотив должен иметь адресующий сигнал, чтобы обеспечить чужеродному белку стабильное закрепление на поверхности наружной мембраны клетки;
3) мотив может экпрессироваться в значительных количествах на клеточной поверхности, но не должен влиять на рост клеток;
4) мотив не должен влиять на размер белка и должен обеспечивать экспрессию чужеродного белка без изменения его пространственной трехмерной структуры.
Однако мотив «заякоривания» на поверхности, который удовлетворял бы всем перечисленным выше требованиям, пока не создан.
Известные и используемые в настоящее время мотивы «заякоривания» на поверхности подразделяются на четыре типа: белки наружной клеточной мембраны, липопротеины, секреторные белки и белки поверхностных органелл, такие как белок жгутиков. В случае грамотрицательных бактерий для этих целей использовались такие белки наружной клеточной мембраны, как LamB, PhoE (Charbit et al., J. Immunol., 139, 1658, 1987; Agterberg et al., Vaccine, 8, 85, 1990), OmpA и тому подобное. Также использовались липопротеины, такие как TraT (Felici et al., J. Mol. Biol., 222, 301, 1991), PAL (peptidoglycan associated lipoprotein, липопротеин, связанный с пептидогликаном) (Fuchs et al., Bio/Technology, 9,1369,1991) и Lpp (Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 489, 2713, 1992). Белки фимбрий (тонких выростов на поверхности клеток грамотрицательных бактерий), такие как белки адгезии фимбрий типа 1 (tppe 1) FimA или FimH (Hedegaard et al., Gene, 85, 115, 1989), белки пилей (отростков на поверхности микроорганизмов, образующиеся перед половым размножением, конъюгацией), такие как субъединица пилей РарА, также использовались в качестве мотива поверхностного «заякоривания» для экспрессии чужеродного белка. Кроме того, сообщалось, что белок, формирующий центры кристаллизации льда (ice nucleation protein, белки некоторых паразитирующих бактерий, способствующие образованию на их поверхности кристаллов льда) (Jung et al., Nat. Biotechnol., 16, 576, 1998; Jung et al., Enzyme Microb. Technol., 22, 348, 1998; Lee et al., Nat. Biotechnol., 18, 645, 2000), пуллуланаза (pullulanase) из Klebsiela oxytoca (Kornacker et al., Mol. Microl., 4,1101,1990), протеаза IgA из Neiseria (Klauser et al., EMBO J., 9, 1991, 1990), белок AIDA-1, обеспечивающий адгезию Е. coli, белок VirG из шигеллы, гибридный белок, полученный из Lpp и OmpA, также могут использоваться в качестве мотива «заякоривания» на поверхности. В случае грамположительных бактерий сообщалось, что малярийный антиген был эффективно экспрессирован с использованием в качестве мотивов «заякоривания» белков А и FnBPB из Staphyhcoccus aureus, для экспрессии на поверхности использовались также белок клеточной оболочки молочнокислых бактерий, белки клеточной поверхности грамположительных бактерий, такие как белок М6 из Streptococcus pyogenes (Medaglini D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92, 6868, 1995), белок S-слоя ЕА1 из Bacillus anthracis, белок CotB из Bacillus subtilis и тому подобное.
В настоящем изобретении создан новый вектор для эффективной экспрессии чужеродного белка на клеточной поверхности микроорганизма с использованием в качестве нового мотива «заякоривания» на поверхности ген комплекса синтетазы поли-гамма-глутаминовой кислоты (pgsBCA), происходящего из штамма рода Bacillus, а также предложен способ массовой экспрессии чужеродного белка на поверхности микроорганизма, трансформированного таким вектором (Korean Patent Application No. 10-2001-48373).
Были проведены специальные исследования для осуществления стабильной экспрессии патогенного антигена или антигенных детерминант в бактериях, подходящих для массового производства, с использованием методов генной инженерии и названных выше мотивов «заякоривания» на поверхности. В частности, сообщалось, что экзогенные иммуногены, экспрессируемые на поверхности непатогенных бактерий, при пероральном применении бактерий в живом виде могут обеспечивать более продолжительный и сильный иммунный ответ по сравнению с вакцинами, в которых использовались ослабленные патогенные бактерии или вирусы. Такая индукция иммунного ответа может объясняться усиливающим действием поверхностных структур бактерий, обеспечивающим увеличение антигенности экспрессируемого на их поверхности чужеродного белка и иммунного ответа на живые бактерии в живом организме. Создание рекомбинантной живой вакцины из непатогенных бактерий с использованием такой системы для поверхностной экспрессии привлекло внимание общественности.
Таким образом, в настоящем изобретении достигнут успех в массовой экспрессии антигенов коронавируса SARS, выбранных путем анализа генов и белков, на поверхности непатогенного микроорганизма (такого как молочнокислая бактерия), который удовлетворяет требованиям безопасности пищевых продуктов, с использованием гена комплекса синтетазы поли-γ-глутаминовой кислоты (pgsBCA), происходящего из штамма рода Bacillus, в качестве нового мотива «заякоривания» на поверхности, и в создании экономически выгодной и стабильной вакцины для индукции выработки антител против коронавируса SARS в крови и слизистых оболочках при иммунизации путем перорального введения микроорганизма.
Раскрытие изобретения
Таким образом, объектом настоящего изобретения является создание вектора, обеспечивающего экспрессию антигена коронавируса SARS с применением системы экспрессии на поверхности микроорганизма, и получение микроорганизма, трансформированного данным вектором.
Другим объектом настоящего изобретения является получение трансформированного микроорганизма, содержащего экспрессируемый на поверхности антиген коронавируса SARS, создание вакцины для предотвращения SARS, содержащей в качестве действующего начала антиген коронавируса SARS, экстрагированный из микроорганизма, или антиген коронавируса SARS, очищенный из микроорганизма.
Для достижения указанных выше целей настоящего изобретения был создан вектор, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки, включающий один, два или более генов pgsB, pgsC и pgsA, кодирующих комплекс синтетазы поли-γ-глутаминовой кислоты, и ген, кодирующий белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида коронавируса SARS.
Согласно настоящему изобретению, в качестве гена поверхностного белка-антигена может использоваться любой ген, способный кодировать белок-антиген шипов коронавируса SARS. Можно использовать как один ген белка шипов коронавируса SARS, так и комплекс из двух или более генов. К тому же ген, кодирующий комплекс синтетазы поли-γ-глутаминовой кислоты, предпочтительно включает pgsA. В качестве белков-антигенов шипов могут использоваться SARS SA, SARS SB, SARS SC, SARS SD или SARS SBC, а в качестве белков-антигенов нуклеокапсида могут использоваться SARS NA, SARS NB или SARS N.
Настоящее изобретение также обеспечивает микроорганизм, трансформированный вектором для экспрессии, и способ для получения белка-антигена шипов или белка-антигена нуклеокапсида коронавируса SARS, включающий культивирование микроорганизма.
Микроорганизм, подходящий для использования в данном изобретении, может быть любым микроорганизмом, который не проявляет токсичности при применении на живом организме, или любым ослабленным микроорганизмом. Например, микроорганизм может быть выбран должным образом из грамотрицательных бактерий, таких как Е. coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Mycobacterium bovis, Shigella и тому подобное, или из грамположительных бактерий, таких как Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria monocytogenes, Streptococcus и тому подобных. Особенно предпочтительным является выбор микроорганизма, который может использоваться в качестве пищевого продукта, как, например, молочнокислые бактерии.
Далее, настоящее изобретение обеспечивает вакцину для предотвращения SARS, в состав которой в качестве действующего начала входит микроорганизм, содержащий экспрессируемый на поверхности белок-антиген, грубый экстракт, состоящий из компонентов клеточной мембраны данного микроорганизма, полученный после разрушения микроорганизма, или белок-антиген, очищенный из данного микроорганизма.
Согласно данному изобретению, вакцина может использоваться в качестве лекарственного средства для предотвращения SARS (атипичной пневмонии), вызываемой коронавирусом SARS.
Согласно данному изобретению, вакцина может применяться перорально или в составе продуктов питания может вводиться в виде подкожных или внутрибрюшинных инъекций или путем интраназального введения.
К настоящему моменту известно, что инфекция коронавируса SARS возникает при заражении органов дыхания воздушно-капельным путем и предположительно развивается на слизистых оболочках органов дыхания. Таким образом, защита от инфекции за счет повышения иммунитета слизистых оболочек является очень важной. Поскольку микроорганизм, экспрессирующий на своей поверхности антиген коронавируса SARS, имеет преимущество, так как может более эффективно индуцировать образование антител на мембранах слизистых оболочек (мукозальный ответ), можно ожидать, что вакцина для перорального применения или вакцина для интраназального применения с использованием трансформированного микроорганизма будет более эффективной для защиты от коронавируса SARS, чем вакцина для парентерального применения.
Краткое описание фигур
Дальнейшие объекты и преимущества данного изобретения можно лучше понять из приведенного ниже детального описания, сопровождающего приведенные фигуры.
Фигура 1 демонстрирует соответствие между четырьмя антигенными участками (А, В, С и D) вируса инфекционного гастроэнтерита свиней (TGE) и белком шипов коронавируса SARS, выявленное с помощью анализа профиля гидрофильности по методу Кайта-Дулиттла (Kyte-Doolittle), индекса антигенности по методу Джеймсона-Вольфа (Jameson-Wolf) и графика вероятности поверхностной локализации по методу Эмини (Emini).
Фигура 2 демонстрирует соответствие между белком нуклеокапсида вируса инфекционного гастроэнтерита свиней и белком нуклеокапсида коронавируса SARS, выявленное с помощью анализа профиля гидрофильности по методу Кайта-Дулиттла (Kyte-Doolittle), индекса антигенности по методу Джеймсона-Вольфа (Jameson-Wolf) и графика вероятности поверхностной локализации по методу Эмини (Emini).
Фигура 3А представляет собой генетическую карту вектора pHCE2LB:pgsA-SARS SA, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки, с использованием грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов в качестве организма-хозяина согласно данному изобретению. Фигура 3В представляет собой генетическую карту вектора pHCE2LB:pgsA-SARS SC согласно данному изобретению, и Фигура 3С представляет собой генетическую карту вектора pHCE2LB:pgsA-SARS SBC согласно данному изобретению.
Фигура 4А представляет собой генетическую карту вектора pHCE2LB:pgsA-SARS NB согласно данному изобретению, и Фигура 4В представляет собой генетическую карту вектора pHCE2LB:pgsA-SARS N согласно данному изобретению.
Фигуры 5А, 5В и 5С демонстрируют идентификацию экспрессии антигенов SARS SA, SARS SC и SARS SBC, слитых с белком наружной мембраны pgsA, в Lactobacillus с помощью специфического связывания специфичных антител против pgsA с гибридными белками, определяемого методом вестерн-иммуноблоттинга.
Фигуры 6А и 6В демонстрируют идентификацию экспрессии антигенов SARS SA и SARS SBC, слитых с белком наружной мембраны pgsA, в Lactobacillus с помощью вестерн-иммуноблоттинга с использованием белков, полученных из разрушенных клеток молочнокислых бактерий, в качестве специфических антител против pgsA, и Фигура 6С демонстрирует идентификацию поверхностной экспрессии антигена SARS SBC в Lactobacillus методом FACScan.
Фигуры 7А и 7В демонстрируют идентификацию поверхностной экспрессии антигенов SARS NB и SARS N, слитых с белком наружной мембраны pgsA, в Lactobacillus с помощью вестерн-иммуноблоттинга с использованием белков, полученных из разрушенных клеток молочнокислых бактерий, в качестве специфических антител против PgsA.
Фигура 8 показывает результаты измерения титра IgG антител против антигенов SARS SA и SARS SC в сыворотке крови мышей, которым перорально или интраназально вводили штаммы Lactobacillus casei, каждый из которых был трансформирован векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE1LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, согласно данному изобретению, и экспрессия антигенной группы на поверхности клеток была подтверждена методом ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, твердофазный иммуноферментный анализ).
Фигура 9 показывает результаты измерения титра IgA антител против антигенов SARS SA и SARS SC в промывочных жидкостях кишечника и бронхиальных альвеол мышей, которым перорально или интраназально вводили штаммы Lactobacillus casei, каждый из которых был трансформирован векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE1LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, согласно данному изобретению, и поверхностная экспрессия антигенной группы была подтверждена методом ELISA.
Фигура 10 показывает результаты измерения титра IgG антител против антигена SARS NB в сыворотке крови мышей, которым перорально или интраназально вводили штаммы Lactobacillus casei, каждый из которых был трансформирован векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE1LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, согласно данному изобретению, и поверхностная экспрессия антигенной группы была подтверждена методом ELISA.
Фигура 11 показывает результаты измерения титра IgA антител против антигена SARS NB в промывочных жидкостях кишечника и бронхиальных альвеол мышей, которым перорально или интраназально вводили штаммы Lactobacillus casei, каждый из которых был трансформирован векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE1LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, согласно данному изобретению, и поверхностная экспрессия группы антигенов была подтверждена методом ELISA.
Осуществление изобретения
Ниже настоящее изобретение будет рассмотрено более детально с помощью представленных далее примеров. Любому специалисту в данной области должно быть понятно, что примеры приводятся только для более конкретного объяснения настоящего изобретения и объем настоящего изобретения этими примерами не ограничивается.
В частности, хотя в приведенных ниже примерах используются гены антигенного участка белка шипов коронавируса SARS и гены антигенного участка белка нуклеокапсида коронавируса SARS, может быть использован любой антигенный белок или комплекс из двух или более белков.
В приведенных ниже примерах также используется ген pgsBCA белка наружной мембраны клеток, участвующий в синтезе поли-γ-глутаминовой кислоты, который был получен из Bacillus subtilis, вариант chungkookjang (KCTC 0697BP). Однако, согласно данному изобретению, включающие ген векторы сконструированы с использованием pgsBCA, полученного из всех штаммов бактерий рода Bacillus, продуцирующих поли-γ-глутаминовую кислоту, или микроорганизмов, трансформированные такими векторами. Например, в объем настоящего изобретения входит конструирование вектора для вакцины с использованием гена pgsBCA, полученного из другого штамма, имеющего гомологию последовательности 80% или более с последовательностью гена pgsBCA, из штамма Bacillus subtilis (вариант chungkookjang), и использование этого вектора.
Кроме того, в приведенных ниже примерах для конструирования вектора, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки, используется только pgsA из гена pgsBCA. Однако, как можно понять из приведенных непрямых примеров, в объем настоящего изобретения также входит конструирование вектора для вакцины с использованием всего гена или части гена pgsBCA.
В следующих примерах клетками-хозяевами для экспрессии вектора служат Salmonella typhi, как представитель грамотрицательных бактерий, и Lactobacillus, как представитель грамположительных бактерий. Однако любому специалисту в данной области понятно, что аналогичные результаты могут быть получены с использованием любой грамотрицательной бактерии или грамположительной бактерии, которая будет трансформирована по способу, предложенному в настоящем изобретении.
Кроме того, в приведенных примерах представлены результаты только тех экспериментов, где в качестве живой вакцины для введения живым организмам использовался целый микроорганизм, трансформированный вектором для получения вакцины согласно настоящему изобретению. Однако согласно данным, имеющимся в области получения и использования вакцин, совершенно очевидно, что идентичные или очень близкие результаты будут получены при применении на живых объектах экспрессируемых белков (белков-антигенов коронавируса SARS) в виде грубого экстракта из микроорганизма или в высоко очищенном виде.
Пример 1. Синтез гена антигенного участка белка шипов коронавируса SARS.
Белок шипов коронавируса SARS является гликопротеином, включающим 1256 аминокислот. В случае других коронавирусов, которые были тщательно проанализированы, белок шипов обычно встроен в белковую оболочку, покрывающую поверхность вирусной частицы, и образует структуру, выступающую снаружи над ее поверхностью. Расположенный снаружи участок и антигенный участок были интенсивно изучены как антиген-мишень вакцины для индукции вирусной инфекции и для предотвращения инфекции.
Поэтому для того, чтобы выбрать участок, способный проявлять антигенность, из последовательности 1256 аминокислот белка шипов коронавируса SARS, исходили из результатов сравнительного анализа белков и структурного сравнительного анализа с белком шипов другого коронавируса - коронавируса инфекционного гастроэнтерита свиней (TGE), который был изучен на предмет антигенности и синтезирован. Конкретно, антигенный участок белка шипов вируса инфекционного гастроэнтерита свиней, как хорошо известно, содержит четыре участка (А, В, С и D) (Enjuanes L., Virology, 183, 225, 1991). Соответствие между этими участками и белком шипов коронавируса SARS было проанализировано посредством сравнения профиля гидрофильности с использованием метода Кайта-Дулиттла (Kyte-Doolittle), индекса антигенности по методу Джеймсона-Вольфа (Jameson-Wolf) и графика вероятности поверхностной локализации по методу Эмини (Emini), и в результате из последовательности белка шипов коронавируса SARS штамма Тог2 были выбраны участки SARS SA, SARS SB, SARS SC и SARS SD (Фигура 1).
Сначала, основываясь на последовательности белка шипов коронавируса SARS штамма Тоr2 (21492-25259 нуклеотидов, 1255 аминокислот), полная последовательность которого была установлена, был выбран участок, включающий аминокислоты 2-114, который, как ожидалось, является антигенным участком, который обозначен как SARS SA, также был выбран участок, включающий аминокислоты 375-470, который обозначен как SARS SB, участок, включающий аминокислоты 510-596, который обозначен как SARS SC, и участок, включающий аминокислоты 1117-1197, который обозначен как SARS SD. Из числа этих антигенных участков, гены SARS SA и SARS SC участков были синтезированы.
Для того чтобы синтезировать ген, способный кодировать 113 аминокислот, который обозначен как SARS SA, проводили реакцию ПЦР с целью амплификации гена SARS SA длиной 339 п.н., используя праймеры, соответствующие последовательностям SEQ ID NOs: 1-8,
SEQ ID NO: 1: 5'-ggatcctttattttcttattatttcttactctcactagtggtagtgaccttgaccg-3'
SEQ ID NO: 2: 5'-tgagtgtaattaggagcttgaacatcatcaaaagtggtacaacggtcaaggtc-3'
SEQ ID NO: 3: 5'-aattacactcaacatacttcatctatgcgtggggtttactatcctgatgaaatttttc-3'
SEQ ID NO: 4: 5'-aaaatggaagaaataaatcctgagttaaataaagagtgtctgaacgaaaaattt-3'
SEQ ID NO: 5: 5'-cttccattttattctaatgttactgggtttcatactattaatcatacgtttggcaac-3'
SEQ ID NO: 6: 5'-ggcagcaaaataaataccatccttaaaaggaatgacagggttgccaaacgtatg-3'
SEQ ID NO: 7: S'-atttattttgctgccacagagaaatcaaatgttgtccgtggttgggtttttgg-3'
SEQ ID NO: 8: 5'-ggtaccaagcttattacacagactgtgacttgttgttcatggtagaaccaaaaaccc-3'
Для того чтобы синтезировать ген, способный кодировать участок длиной в 87 аминокислот, который обозначен как SARS SC, для получения амплифицированного гена SARS SC длиной 261 п.н. проводили ПЦР, используя праймеры с последовательностями SEQ ID NOs: 9-14.
SEQ ID NO: 9: 5'-ggatccgtttgtggtccaaaattatctactgaccttattaagaaccagtgtgtcaat-3'
SEQ ID NO: 10: 5'-gaagaaggagttaacacaccagtaccagtgagaccattaaaattaaaattgacacact-3'
SEQ ID NO: 11: 5'-aactccttcttcaaagcgttttcaaccatttcaacaatttggccgtgatgtttctga-3'
SEQ ID NO: 12: 5'-ctaaaatttcagatgttttaggatcacgaacagaatcagtgaaatcagaaacat-3'
SEQ ED NO: 13: 5'-ctgaaattttagacatttcaccttgtgcttttgggggtgtaagtgtaattaca-3'
SEQ ID NO: 14: 5'-ggtaccaagcttattaaacagcaacttcagatgaagcatttgtaccaggtgtaattac-3'
Кроме того, гены антигенных участков были получены посредством синтеза, ген, способный кодировать участок, включающий аминокислоты 264-596, был амплифицирован в реакции ПЦР при использовании кДНК клона шипа SARS (коронавирус SARS TOR2) из Canada's Michael Smith Genome Science Center в качестве матрицы и праймеров с последовательностями SEQ ГО NOs: 15 и 16 для получения гена длиной 996 п.н., который был обозначен как SARS SBC [этот ген содержит критический участок, необходимый для нейтрализации антител (PNAS, 101, 2536, 2004)].
SEQ ID NO: 15 (SBC смысловой): 5'-cgcggatccctcaagtatgatgaaaat-3'
SEQ ID NO: 16 (SBC анти-смысловой): 5'-cggggtaccttaaacagcaacttcaga-3'
Пример 2. Синтез антигенного участка гена белка нуклеокапсида коронавируса SARS.
Белок нуклеокапсида коронавируса SARS представляет собой белок, составленный из 422 аминокислот. Сообщалось, что наибольшая часть белков нуклеокапсида других коронавирусов, на которых было проведено много исследований, являются антигенами. Такие антигенные участки были интенсивно изучены с целью использования в качестве антигена-мишени вакцины для предотвращения инфицирования коронавирусом.
Поэтому участки в аминокислотной последовательности белка нуклеокапсида-коронавируса SARS, способные демонстрировать антигенность, были выбраны, исходя из результатов сравнительного анализа белков с белком нуклеокапсида коронавируса инфекционного гастроэнтерита свиней (TGE), и затем синтезированы.
Конкретно, соответствие между белком нуклеокапсида вируса инфекционного гастроэнтерита свиней и белком нуклеокапсида коронавируса SARS было проанализировано посредством сравнения профиля гидрофильности с использованием метода Кайта-Дулиттла (Kyte-Doolittle), индекса антигенности по методу Джеймсона-Вольфа (Jameson-Wolf) и графика вероятности поверхностной локализации по методу Эмини (Emini), и в результате из последовательности белка нуклеокапсида коронавируса SARS штамма Тог2 были выбраны участки SARS NA и SARS NB (Фигура 2).
Сначала, исходя из последовательности белка нуклеокапсида коронавируса SARS штамма Тог2 (28120-29388 нуклеотидов, 422 аминокислоты), полная последовательность которого была установлена, был выбран участок, включающий аминокислоты со 2 по 157, который, как ожидали, является антигенным участком, он обозначен как SARS NA, a также был выбран участок, включающий аминокислоты со 163 по 305, который обозначен как SARS NB. В настоящем изобретении ген SARS NB участка был синтезирован.
Для того чтобы синтезировать ген, способный кодировать участок из 143 аминокислот, обозначенный как SARS NB, реакцию ПЦР с целью амплификации гена SARS NB длиной 429 п.н. проводили, используя праймеры с последовательностями SEQ ID NOs: 17-26.
SEQ ID NO: 17: 5'-ggatcccctcaaggtacaacattgccaaaaggcttctacgcagagggtagccgtgg-3'
SEQ ID NO: 18: 5'-accacgactacgtgatgaagaacgagaagaggcttgactgccgccacggctacc-3'
SEQ ID NO: 19: 5'-cacgtagtcgtggtaattcacgtaattcaactcctggcagcagtcgtggtaat-3'
SEQ ID NO: 20: 51-gcgagggcagtttcaccaccaccgctagccatacgagcaggagaattaccacga-3'
SEQ ID NO: 21: 5'-gaaactgccctcgcacttttgctgcttgaccgtttgaaccagcttgagagcaa-3'
SEQ ID NO: 22: 5'-tagtgacagtttgaccttgttgttgttggcctttaccagaaactttgctctcaa-3'
SEQ ID NO: 23: 5'-caaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcatctaaaaagcctcgtcaaaaacgt-3'
SEQ ID NO: 24: 5'-ggaccacgacgcccaaatgcttgagtgacgttgtactgttttgtggcagtacgtttttg-3'
SEQ ID NO: 25: 5'-gggcgtcgtggtccagaacaaacccaaggtaatttcggggaccaagaccttatccgt-3'
SEQ ID NO: 26: 5'-ggtaccaagcttattaaatttgcggccaatgtttgtaatcagtaccttgacggataagg-3'
Кроме того, гены антигенных участков были получены посредством синтеза, ген, способный кодировать участок, включающий аминокислоты со 2 по 305, амплифицировали методом ПЦР, используя для получения гена длиной 912 п.н., который был обозначен как SARS N, клон кДНК нуклеокапсида SARS (коронавирус SARS TOR2) из Canada's Michael Smith Genome Science Center в качестве матрицы и праймеры с последовательностями SEQ ID NOs: 27 и 28.
SEQ ID NO: 27 (N смысловой): 5'-cgcggatcctctgataatggtccgcaa-3'
SEQ ID NO: 28 (N анти-смысловой): 5'-cggggtaccttaaatttgcggccaatgttt-3'
Пример 3. Конструирование векторов pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS SC, обеспечивающих экспрессию белка на поверхности клетки.
Векторы pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS SC, обеспечивающие экспрессию белка на поверхности клетки и способные экспрессировать антигенные участки SARS SA и SC белка шипов коронавируса SARS, были сконструированы с использованием pgsA гена (pgsBCA), кодирующего белок наружной клеточной мембраны из штамма рода Bacillus и участвующего в синтезе поли-γ-глутаминовой кислоты, используя грамотрицательный микроорганизм и грамположительный микроорганизм в качестве организмов-хозяев.
Во-первых, для того, чтобы ввести антигенные участки SARS SA и SARS SC белка шипов коронавируса SARS в вектор, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки, имеющий антиген L1 вируса папилломы человека, экспрессирующийся в грамотрицательных и грамположительных микроорганизмах как в организмах-хозяевах [вектор, содержащий промотор НСЕ, который является промотором, обеспечивающим стабильную высокоэффективную экспрессию, pgsA гена (pgsBCA) белка наружной клеточной мембраны, участвующего в синтезе поли-γ-глутаминовой кислоты, и HPV L1 в рАТ, который является вектором, подходящим для использования в грамотрицательных и в грамположительных бактериях], pHCE2LB:pgsA-HPVLl (KCTC 10349BP) переваривали, используя рестриктазы BamHI и KpnI. Ген HPVL1 был удален для получения вектора pHCE2LB:pgsA, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки.
Каждый из генов, способных кодировать антигены SARS SA и SARS SC, синтезированные в Примере 1, был переварен ферментами - эндонуклеазами рестрикции BamHI и KpnI и присоединен к С-концу гена pgsA белка наружной клеточной мембраны, который принимает участие в синтезе поли-γ-глутаминовой кислоты, находящегося в составе предварительно полученного вектора pHCE2LB:pgsA, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки, в соответствии с кодоном трансляции (с соблюдением целостности рамки считывания) для получения векторов pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS SC (Фигуры 3А и 3В). Грамположительные бактерии Lactobacillus были трансформированы сконструированными векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS SC, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, и проанализированы на присутствие плазмид pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS SC в клетках Lactobacillus.
Пример 4. Конструирование вектора pHCE2LB:pgsA:SARS SBC, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки.
Вектор pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, способный экспрессировать антигенный участок SARS SBC белка шипов коронавируса, локализующийся на поверхности клеток, был сконструирован с использованием pgsA гена (pgsBCA) белка наружной клеточной мембраны, происходящего из штамма рода Bacillus и участвующего в синтезе поли-γ-глутаминовой кислоты.
Во-первых, при использовании способа, описанного в Примере 3, был приготовлен вектор pHCE2LB:pgsA, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки. Ген, кодирующий участок, включающий аминокислоты 264-596, амплифицировали, проводя ПЦР, для которой в качестве матрицы для получения SARS SBC гена длиной 996 п.н. использовали клон кДНК шипа коронавируса SARS, описанный в Примере 1. Ген SARS SBC был затем встроен в вектор pHCE2LB:pgsA, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки, для получения pHCE2LB:pgsA-SARS SBC (Фигура 3С). Грамположительные бактерии Lactobacillus были трансформированы сконструированным вектором pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, обеспечивающим экспрессию белка на поверхности клетки, и анализировали клетки Lactobacillus на наличие плазмиды pHCE2LB:pgsA-SARS SBC.
Пример 5. Конструирование вектора pHCE2LB:pgsA:SARS NB, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки.
Вектор pHCE2LB:pgsA-SARS NB, способный экспрессировать антигенный участок SARS NB белка нуклеокапсида коронавируса SARS, локализующийся на поверхности клеток, был сконструирован при использовании pgsA гена (pgsBCA) белка наружной клеточной мембраны, происходящего из штамма рода Bacillus и участвующего в синтезе поли-γ-глутаминовой кислоты.
Сначала при использовании способа, описанного в Примере 3, был приготовлен вектор pHCE2LB:pgsA, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки. Ген антигена SARS NB, синтезированный в Примере 2, переваривали ферментами - эндонуклеазами рестрикции BamHI и KpnI и присоединяли к С-концу гена pgsA белка наружной клеточной мембраны, участвующего в синтезе поли-γ-глутаминовой кислоты, находящегося в составе предварительно приготовленного вектора pHCE2LB:pgsA, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки, в соответствии с кодоном трансляции для получения вектора pHCE2LB:pgsA-SARS NB (Фигура 4А). Грамположительные бактерии Lactobacillus трансформировали приготовленным вектором pHCE2LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающим экспрессию белка на поверхности клетки, и анализировали клетки Lactobacillus на наличие плазмиды pHCE2LB:pgsA-SARS NB.
Пример 6. Конструирование вектора pHCE2LB:pgsA-SARS N, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки.
Вектор pHCE2LB:pgsA-SARS N, способный экспрессировать антигенный участок SARS N белка нуклеокапсида коронавируса SARS, локализующийся на поверхности клеток, был сконструирован с использованием pgsA гена (pgsBCA) белка наружной клеточной мембраны, происходящего из штамма рода Bacillus и участвующего в синтезе поли-γ-глутаминовой кислоты.
Сначала способом, описанным в Примере 3, был приготовлен вектор pHCE2LB:pgsA, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки. Ген, кодирующий участок, включающий 2-305 аминокислоты, был амплифицирован методом ПЦР при использовании в качестве матрицы клона кДНК нуклеокапсида коронавируса SARS, описанного в Примере 2, для получения гена SARS N длиной 912 п.н. Ген SARS N затем был встроен в вектор pHCE2LB:pgsA, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки, для получения pHCE2LB:pgsA-SARS N (Фигура 4 В). Грамположительные бактерии Lactobacillus были трансформированы полученным вектором pHCE2LB:pgsA-SARS N, обеспечивающим экспрессию белка на поверхности клетки, и клетки Lactobacillus были проанализированы на присутствие плазмиды pHCE2LB:pgsA-SARS N.
Пример 7. Подтверждение экспрессии белка-антигена шипов вируса SARS на поверхности молочнокислых бактерий.
Lactobacillus трансформировали векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, и проверяли на наличие экспрессии соответствующих белков-антигенов.
Экспрессия антигенных участков антигена шипов вируса SARS, слитых с С-концом гена pgsA, синтезирующего поли-γ-глутаминовую кислоту, была индуцирована посредством трансформации Lactobacillus casei векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, и культивирования трансформированного штамма в среде MRS (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA) до получения стационарной культуры при 37°С.
Экспрессию каждого антигена идентифицировали, осуществляя вестерн
- иммуноблоттинг, используя SDS-электрофорез в полиакриламидном геле и специфичные антитела против pgsA. При приготовлении образцов были взяты в одинаковом количестве целые клетки Lactobacillus casei, в которых была индуцирована экспрессия, проведена денатурация и получены белки. Образцы были проанализированы методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле и после разделения белки были перенесены на PVDF мембрану (polyvinylidene-difluoride мембраны, Bio-Rad). Затем PVDF мембрану с белками переносили в буферный раствор для блокирования неспецифического связывания (50 mM трис HCl, 5% обезжиренное молоко, рН 8,0) и блокировали при покачивании в течение 1 часа, затем течение 12 часов проводили реакцию с поликлональными первичными антителами против pgsA, полученными из кролика, которые были разведены в 1000 раз буферным раствором для блокирования.
После завершения реакции мембрану промывали буферным раствором и проводили в течение 4 часов реакцию со связанными с биотином вторичными антителами против кроличьих антител, которые были разведены в 1000 раз раствором для блокирования. После завершения реакции мембрану промывали буферным раствором и проводили реакцию с реагентом авидин-биотин в течение 1 часа, а затем промывали. Отмытую мембрану обрабатывали H2O2, раствором DAB, который использовали в качестве субстрата, и агентом для развития окраски для подтверждения специфического связывания между специфичными антителами против pgsA и слитым белком (Фигура 5). На Фигуре 5А на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожках 2, 3 и 4 - Lactobacillus casei, трансформированные вектором pHCE2LB:pgsA-SARS SA. На Фигуре 5 В на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожках 2, 3, 4, 5 и 6 представлены Lactobacillus casei, трансформированные вектором pHCE2LB:pgsA-SARS SC. На Фигуре 5С на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожке 2 - Lactobacillus casei, трансформированные вектором pHCE2LB:pgsA-SARS SBC.
Как показано на Фигуре 5, в целых клетках соответствующих молочнокислых бактерий были идентифицированы специфичные слитые белки [pgsA-SARS SA размером около 54 кДа (Фигура 5А), pgsA-SARS SC размером около 51 кДа (Фигура 5В) и pgsA-SARS SBC размером около 78 кДа (Фигура 5С)].
Также, для того чтобы подтвердить, что соответствующие белки-антигены с pgsA экспрессировались на поверхности молочнокислых бактерий, трансформированных векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS:SBC, обеспечивающими экспрессию белка на клеточной поверхности, молочнокислые бактерии, трансформированные соответствующими векторами, фракционировали посредством метода клеточного фракционирования с использованием ультрацентрифуги на клеточную стенку и цитоплазму и наличие соответствующих слитых белков подтверждали методом вестерн-блоттинга, используя специфичные антитела против pgsA.
Конкретно, Lactobacillus, которые демонстрировали экспрессию слитых белков на клеточной поверхности, индуцированную описанным выше способом, выращивали для эксперимента до достижения той же концентрации клеток, что и нетрансформированные Lactobacillus. Клетки несколько раз промывали буфером TES (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 mM EDTA, 25% сахарозы), суспендировали в дистиллированной воде, содержащей 5 мг/мл лизоцима, 1 мМ PMSF и 1 мМ EDTA, несколько раз замораживали при -60°С и оттаивали при комнатной температуре, обрабатывали ДНКазой (0,5 мг/мл) и РНКазой (0,5 мг/мл) и подвергали озвучиванию для разрушения клеток. Затем клеточный лизат центрифугировали при 4°С в течение 20 минут при 10000 × g для отделения не лизированных целых клеток Lactobacillus (осадок; фракция не разрушенных клеток) и клеточного дебриса (супернатант). Отделенный клеточный дебрис центрифугировали при 4°С в течение 1 часа при 21000 × g для получения супернатанта (растворимая фракция), содержащего белки цитоплазмы Lactobacillus, и осадков. Полученные осадки суспендировали в растворе ТЕ (10 мМ трис-HCl, рН 8,0,1 мМ EDTA, рН 7,4), содержащем 1% SDS, для получения белков клеточной стенки (фракция клеточной стенки) Lactobacillus.
Соответствующие фракции подвергали вестерн-иммуноблоттингу с использованием SDS-электрофореза в полиакриламидном геле и антител против антигена pgsA для подтверждения того, что антигены шипов вируса SARS, слитые с pgsA, из проанализированных фракций Lactobacillus локализуются во фракции клеточной стенки (Фигура 6). На Фигуре 6А на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожке 2 представлены целые клетки Lactobacillus casei, трансформированные pHCE2LB:pgsA-SARS SA, на дорожках 3 и 4 представлены растворимая фракция и фракция клеточной стенки штамма, трансформированного pHCE2LB:pgsA-SARS SA, соответственно. На Фигуре 6 В на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожке 2 представлены целые клетки Lactobacillus casei, трансформированные pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, на дорожках 3 и 4 представлены растворимая фракция и фракция клеточной стенки штамма, трансформированного pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, соответственно.
Как показано на Фигуре 6, белок SARS SA размером около 54 кДа, слитый с pgsA, и белок SARS SBC размером около 78 кДа, слитый с pgsA, были идентифицированы в целых клетках и во фракции клеточной стенки молочнокислых бактерий. Исходя из этих результатов было отмечено, что соответствующие белки-антигены SARS, слитые с pgsA, экспрессируются и располагаются на поверхности бактерий в результате миграции к поверхности молочнокислой бактерии, опосредованной pgsA.
Кроме того, методом проточной цитометрии с сортировкой клеток на основе флуоресценции (fluorescence-activating cell sorting, FACS), было установлено, что на поверхности Lactobacillus имела место экспрессия антигенной группы антигена шипов вируса SARS за счет его слияния с С-концом белка pgsA, синтезирующего поли-γ-глутаминовую кислоту.
Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки Lactobacillus, в которых была индуцирована экспрессия, были собраны при одинаковой концентрации клеток. Клетки промывали несколько раз буферным раствором (буфер PBS, рН 7,4), суспендировали в 1 мл буферного раствора, содержащего 1% бычий сывороточный альбумин, и проводили реакцию с мышиными поликлональными первичными антителами против антигена шипов вируса SARS, которые были разведены в 1000 раз, при 4°С в течение 12 часов. После завершения реакции клетки промывали несколько раз буферным раствором, суспендировали в 1 мл буферного раствора, содержащего 1% бычий сывороточный альбумин, и проводили реакцию со связанными с биотином вторичными антителами, которые были разведены в 1000 раз, при 4°С в течение 3 часов. После завершения реакции клетки снова промывали несколько раз буферным раствором, суспендировали в 0,1 мл буферного раствора, содержащего 1% бычий сывороточный альбумин, и связывали со стрептавидин-R-фикоэритрин красящим агентом, специфичным к биотину, который был разведен в 1000 раз.
После завершения реакции клетки Lactobacillus промывали несколько раз и исследовали с помощью проточной цитометрии с сортировкой клеток на основе флуоресценции (FACS). Было отмечено, что по сравнению с нетрансформированными Lactobacillus белок-антиген SBC шипов вируса SARS был экспрессирован на поверхности Lactobacillus (Фигура 6С). На фигуре 6С участок серого цвета соответствует нетрансформированным Lactobacillus casei, а участок белого цвета соответствует трансформированным pHCE2LB:pgsA-SARS SBC/Lactobacillus casei. Как показано на Фигуре 6С, очевидно, что SBC белок-антиген шипов был экспрессирован на поверхности молочнокислых бактерий, трансформированных вектором pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, в то время как в нетрансформированных Lactobacillus casei флуоресценция отсутствовала, то есть экспрессия не наблюдалась.
Пример 8. Подтверждение экспрессии белка-антигена нуклеокапсида вируса SARS на поверхности молочнокислых бактерий.
Lactobacillus трансформировали векторами pHCE2LB:pgsA-SARS NB и pHCE2LB:pgsA-SARS N, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, и проверяли на наличие экспрессии соответствующих белков-антигенов.
Экспрессию антигенных участков антигена нуклеокапсида вируса SARS, слитых соответственно с С-концом гена pgsA, участвующего в синтезе поли-γ-глутаминовой кислоты, индуцировали посредством трансформации Lactobacillus casei векторами pHCE2LB:pgsA-SARS NB и pHCE2LB:pgsA-SARS N, соответственно, и культивирования трансформированного штамма в среде MRS (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA) при 37°С до стационарной культуры.
Для того чтобы подтвердить, что соответствующие белки-антигены с pgsA были экспрессированы на поверхности молочнокислых бактерий, трансформированных векторами pHCE2LB:pgsA-SARS NB и pHCE2LB:pgsA-SARS N, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, молочнокислые бактерии, трансформированные каждым вектором при использовании того же метода, который описан в Примере 7, были фракционированы посредством метода клеточного фракционирования с использованием ультрацентрифуги на клеточную стенку и цитоплазму, после чего локализация соответствующих слитых белков была определена методом вестерн-блоттинга с использованием специфических антител против pgsA.
В результате соответствующие фракции были проанализированы с применением вестерн-иммуноблоттинга с использованием SDS-электрофореза в полиакриламидном геле и антител против антигена pgsA для подтверждения того, что нуклео-антигены вируса SARS, слитые с pgsA, локализуются в клеточной стенке и обнаруживаются в составе соответствующих фракций Lactobacillus (Фигура 7). На Фигуре 7А на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожке 2 представлены целые клетки, трансформированные pHCE2LB:pgsA-SARS NB/Lactobacillus casei, на дорожках 3 и 4 представлены растворимая фракция и фракция клеточной стенки штамма, трансформированного pHCE2LB:pgsA-SARS NB, соответственно. На Фигуре 7В на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожке 2 представлены целые клетки, трансформированные pHCE2LB:pgsA-SARS N/Lactobacillus casei, на дорожках 3 и 4 представлены растворимая фракция и фракция клеточной стенки штамма, трансформированного pHCE2LB:pgsA-SARS N, соответственно.
Как показано на Фигуре 7, белок SARS NB, размером около 57 кДа, слитый с pgsA, и белок SARS N, размером около 75 кДа, слитый с pgsA, были идентифицированы в целых клетках и во фракции клеточной стенки молочнокислых бактерий. Исходя из этих результатов, было отмечено, что соответствующие белки-антигены SARS, слитые с pgsA, экспрессировались и локализовались на поверхности молочнокислых бактерий в результате миграции к поверхности, опосредованной pgsA.
Пример 9. Анализ полезного действия вакцины, содержащей молочнокислые бактерии, экспрессирующие на поверхности белок-антиген шипов и белок-антиген нуклеокапсида вируса SARS.
Грамположительные бактерии Lactobacillus casei были трансформированы векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE2LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, приготовленными в описанных выше Примерах, затем была индуцирована экспрессия антигенов на поверхности Lactobacillus casei. Антигенные свойства белка-антигена шипов и белка-антигена нуклеокапсида вируса SARS, слитого с белком наружной мембраны клетки pgsA, участвующим в синтезе поли-γ-глутаминовой кислоты, были проверены при использовании мыши в качестве модели.
Конкретно, Lactobacillus casei трансформировали векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE2LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, в соответствии с настоящим изобретением. Культуры клеток выращивали до одинаковой концентрации клеток, собирали и промывали несколько раз буферным раствором (буфер PBS, рН 7,4). Клетки Lactobacillus (5×109 клеток) с антигеном, экспрессированным на поверхности, вводили перорально 4-6-недельным мышам BALB/c 3 раза в день через день, 3 раза в день через день после 1 недели, 3 раза в день через день после 2 недель и 3 раза в день через день после 4 недель. Также, клетки Lactobacillus (1×109 клеток) с антигеном, экспрессированным на поверхности, вводили мыши интраназально 3 раза в день через день, 3 раза в день через день после 1 недели, 2 раза в день через два дня после 2 недель и 2 раза в день через два дня после 4 недель. После перорального и интраназального введения каждые две недели была отобрана (1) сыворотка каждой мыши и в ней измерено значение титра IgG антител против белка-антигена шипов и белка-антигена нуклеокапсида в сыворотке и (2) в суспензиях, которые были получены после промывания изнутри кишечника каждой мыши, и суспензиях, которые были получены после промывания изнутри бронхов и альвеол каждой мыши, были измерены значения титра IgA антител против белка-антигена шипов и белка-антигена нуклеокапсида с использованием метода ELISA.
В одну группу объединяли по десять мышей BALB/c (4-6-недельного возраста). Смесь молочнокислых бактерий, экспрессирующих SARS SA и SARS SC, составляли одну группу, молочнокислые бактерии, экспрессирующие SARS NB, составляли одну группу, и смесь молочнокислых бактерий, экспрессирующих SARS SA, SARS SC и SARS NB, составляли одну группу. Эти три группы были в свою очередь разделены на группу для перрорального введения и группу для интраназального введения, в результате получили 8 групп, включая контрольную группу.
На Фигуре 8 показан результат измерения величины титра IgG антител против SARS SA и SARS SC антигенов, которые являются белками-антигенами шипов вируса SARS, в сыворотке мыши. На Фигуре 9 показан результат измерения методом ELISA величины титра IgA антител против антигенов SARS SA и SARS SC, которые являются белками-антигенами шипов, в суспензии, которая была получена после промывания изнутри кишечника, и в суспензии, которая была получена после промывания изнутри бронхов и альвеол мыши, на панели А - величина титра IgA антител для группы перорального введения и на панели В - величина титра IgA антител для группы интраназального введения.
Кроме того, Фигура 10 показывает величины титра IgG антител против антигена SARS NB, который является белком-антигеном нуклеокапсида вируса SARS, в сыворотке мыши. Фигура 11 представляет величины титра IgA антител против антигена SARS NB, который является белком-антигеном нуклеокапсида вируса SARS, в суспензии, которая получена после промывания изнутри кишечника, и в суспензии, которая получена после промывания изнутри бронхов и альвеол мыши, согласно ELISA, где на панели А - величина титра IgA антител для группы перорального введения и на панели В - величина титра IgA антител для группы интраназального введения.
Как показано на Фигурах 8-11, было отмечено, что величина титра IgG антител и величина титра IgA антител против антигенных групп белков-антигенов шипов и нуклеокапсида вируса SARS были значительно выше в сыворотке, промывочной жидкости кишечника и промывочной жидкости бронхов и альвеол BALB/c у мышей, которым были введены Lactobacillus, трансформированные векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE2LB:pgsA-SARS NB, только одним или в комбинации, по сравнению с контрольной группой.
Следовательно, было отмечено, что микроорганизм, имеющий антигенные группы белков-антигенов шипов и нуклеокапсида вируса SARS, экспрессированные на его поверхности согласно настоящему изобретению, может быть эффективно использован в виде живой вакцины.
Несмотря на то, что настоящее изобретение описано с помощью достаточно конкретных иллюстративных воплощений, оно не ограничивается только этими воплощениями, а включает в себя все воплощения, приведенные в формуле изобретения. Это должно приниматься во внимание всеми специалистами в данной области, способными внести изменения или модификации в конкретные воплощения без отклонения от объема и сущности данного изобретения.
Применимость в производстве
Как описано выше, трансформированный микроорганизм, экспрессирующий на своей поверхности белок-антиген коронавируса, вызывающего SARS, в соответствии с настоящим изобретением, и белок-антиген, экстрагированный и очищенный из микроорганизма, могут быть использованы как вакцина для профилактики и лечения SARS. В частности, значительным преимуществом является возможность промышленного производства вакцины для перрорального применения с использованием рекомбинантного штамма, экспрессирующего антиген коронавируса SARS согласно настоящему изобретению.
Claims (19)
1. Вектор, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки, включающий один, два или более генов pgsB, pgsC и pgsA, кодирующих комплекс синтетазы полигамма-глутаминовой кислоты, и ген, кодирующий белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида коронавируса SARS, в котором ген, кодирующий белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида коронавируса SARS, присоединен к С-концевой части одного, двух или более генов pgsB, pgsC и pgsA.
2. Вектор по п.1, в котором белком-антигеном шипов является SARS SA, SARS SB, SARS SC, SARS SD или SARS SBC.
3. Вектор по п.1, в котором белком-антигеном нуклеокапсида является SARS NA, SARS NB или SARS N.
4. Вектор по п.2, который является pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC или pHCE2LB:pgsA-SARS SBC.
5. Вектор по п.З, который является pHCE2LB:pgsA-SARS NB или pHCE2LB:pgsA-SARS N.
6. Микроорганизм, экспрессирующий на поверхности белок-антиген коронавируса SARS, трансформированный вектором по любому из пп.1-5.
7. Микроорганизм по п.6, который выбирают из группы, состоящей из Е. coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium. Vibrio cholerae, Mycobacterium bovis, Shigella, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria monocytogenes и Streptococcus.
8. Способ получения белка-антигена шипов или белка-антигена нуклеокапсида коронавируса SARS, включающий культивирование микроорганизма по п.6.
9. Способ по п.8, в котором микроорганизм является молочнокислыми бактериями.
10. Вакцина для предупреждения заражения вирусом SARS, включающая в качестве эффективного ингредиента белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида, полученный согласно способу по п.8.
11. Вакцина по п.10, в которой в качестве белка-антигена используют микроорганизмы, экспрессирующие на поверхности указанный белок, в виде грубого экстракта или в очищенном виде.
12. Вакцина по п.10, которую вводят перорально или в составе пищевых продуктов.
13. Вакцина по п.10, которую вводят подкожно или внутрибрюшинно.
14. Вакцина по п.10, которую вводят интраназально.
15. Молочнокислая бактерия, экспрессирующая на поверхности белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида коронавируса SARS, полученная согласно способу по п.9.
16. Вакцина для предотвращения SARS, включающая в качестве эффективного ингредиента молочнокислые бактерии по п.15, белок-антиген, экстрагированный из указанной молочнокислой бактерии, или белок-антиген, выделенный из указанной молочнокислой бактерии.
17. Вакцина по п.16, которую вводят перорально или в составе пищевых продуктов.
18. Вакцина по п.16, которую вводят подкожно или внутрибрюшинно.
19. Вакцина по п.16, которую вводят интраназально.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2003-0035993 | 2003-06-04 | ||
| KR20030035993 | 2003-06-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005141528A RU2005141528A (ru) | 2006-06-27 |
| RU2332457C2 true RU2332457C2 (ru) | 2008-08-27 |
Family
ID=36611852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005141528/13A RU2332457C2 (ru) | 2003-06-04 | 2004-06-04 | Вектор, обеспечивающий экспрессию антигена вируса sars на поверхности клеток, и микроорганизмы, трансформированные этим вектором |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060140971A1 (ru) |
| EP (1) | EP1629104A4 (ru) |
| JP (1) | JP2006526403A (ru) |
| KR (1) | KR100469936B1 (ru) |
| CN (1) | CN1798844A (ru) |
| AU (1) | AU2004245859B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0411393A (ru) |
| CA (1) | CA2527346A1 (ru) |
| RU (1) | RU2332457C2 (ru) |
| WO (1) | WO2004108937A1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2639246C1 (ru) * | 2016-12-21 | 2017-12-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Применение домена белка S-слоя из Lactobacillus brevis в качестве компонента системы для экспонирования слитых белков на поверхности клеток молочнокислых бактерий |
| RU2739593C2 (ru) * | 2015-03-05 | 2020-12-28 | Петер Унд Траудль Энгельхорн-Штифтунг Цур Фёрдерунг Дер Лебенсвиссеншафтен | Система презентации пептидов на клеточной поверхности |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050079162A (ko) * | 2004-02-04 | 2005-08-09 | 주식회사 바이오리더스 | 파보바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 상기 벡터에의해 형질전환된 미생물 |
| KR100517114B1 (ko) * | 2005-02-25 | 2005-09-27 | 주식회사 바이오리더스 | 폴리감마글루탐산을 함유하는 면역보강제 조성물 |
| US20080206276A1 (en) * | 2005-07-08 | 2008-08-28 | Michael Otto | Targeting Poly-Gamma-Glutamic Acid to Treat Staphylococcus Epidermidis and Related Infections |
| KR100872042B1 (ko) | 2005-09-14 | 2008-12-05 | 주식회사 바이오리더스 | 마이오스타틴을 발현하는 세포표면 발현벡터 및 상기벡터에 의해 형질전환된 미생물 |
| KR100782332B1 (ko) * | 2006-01-23 | 2007-12-06 | 주식회사 바이오리더스 | 새우 흰 반점 바이러스 항원의 표면 발현벡터 및 이에 의해형질전환된 미생물 |
| CN101802169B (zh) * | 2007-09-20 | 2015-11-25 | 花王株式会社 | 重组微生物以及聚-γ-谷氨酸的制造方法 |
| JP2014210747A (ja) | 2013-04-19 | 2014-11-13 | アンジェスＭｇ株式会社 | 細胞性免疫誘導能が改善された経口ワクチン |
| US20220033812A1 (en) * | 2018-10-10 | 2022-02-03 | Bioleaders Corporation | Surface expression vector for constitutive high-expression using promoter of galactose mutarotase gene derived from lactobacillus casei, and use thereof |
| KR102604524B1 (ko) * | 2018-10-10 | 2023-11-22 | 주식회사 비엘 | 락토바실러스 카제이 유래의 두 종류 프로모터를 이용한 두 가지 목적단백질의 동시 표면발현벡터 및 이를 이용한 단백질의 미생물표면 발현 방법 |
| WO2021147025A1 (en) * | 2020-01-22 | 2021-07-29 | The University Of Hong Kong-Shenzhen Hospital | Anti 2019-ncov vaccine |
| CN112877351A (zh) * | 2020-04-14 | 2021-06-01 | 文利新 | 一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用 |
| US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
| US20230263882A1 (en) * | 2020-06-26 | 2023-08-24 | Elicio Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for inducing an immune response against coronavirus |
| CN112760336A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-07 | 广州辉园苑医药科技有限公司 | 一种抗原表位肽的表达系统和表面展示系统及它们的构建方法 |
| US20240091342A1 (en) * | 2021-01-26 | 2024-03-21 | National University Corporation Kobe University | Oral coronavirus infection vaccine |
| KR20220125776A (ko) | 2021-03-07 | 2022-09-14 | 오영운 | 돼지갈비 포의 가공 및 분류방법 |
| CA3228856A1 (en) * | 2021-08-16 | 2023-02-23 | Peter C. Demuth | Compositions containing polynucleotide amphiphiles and methods of use thereof |
| WO2023044327A1 (en) * | 2021-09-15 | 2023-03-23 | Colorado State University Research Foundation | Recombinant vaccine compositions |
| CN113755421B (zh) * | 2021-09-28 | 2024-04-12 | 梦芊细胞因子有限公司 | 一种用于covid-19的口服性疫苗及抗体加强剂 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001017182A (ja) * | 1999-07-09 | 2001-01-23 | Nagase & Co Ltd | ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法 |
| CN1311082C (zh) * | 2001-08-10 | 2007-04-18 | 生物领先公司 | 具有编码多聚－γ－谷氨酸合成酶的基因pgsBCA的表面表达载体以及利用该载体在微生物表面表达目的蛋白的方法 |
| US7425438B2 (en) * | 2002-10-17 | 2008-09-16 | Bioleaders Corporation | Vector for anti-HPV vaccine and transformed microorganism by the vector |
| US20050002953A1 (en) * | 2003-05-06 | 2005-01-06 | Jens Herold | SARS-coronavirus virus-like particles and methods of use |
-
2004
- 2004-06-04 RU RU2005141528/13A patent/RU2332457C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-06-04 JP JP2006508539A patent/JP2006526403A/ja active Pending
- 2004-06-04 WO PCT/KR2004/001341 patent/WO2004108937A1/en active Application Filing
- 2004-06-04 US US10/559,631 patent/US20060140971A1/en not_active Abandoned
- 2004-06-04 CN CNA2004800152757A patent/CN1798844A/zh active Pending
- 2004-06-04 KR KR10-2004-0040894A patent/KR100469936B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2004-06-04 CA CA002527346A patent/CA2527346A1/en not_active Abandoned
- 2004-06-04 BR BRPI0411393-4A patent/BRPI0411393A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-06-04 EP EP04736153A patent/EP1629104A4/en not_active Withdrawn
- 2004-06-04 AU AU2004245859A patent/AU2004245859B2/en not_active Ceased
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ASHTUCHI M. et al., "A poly-gamma-glutamate synthetic system of Bacillus subtilis IFO 3336: gene cloning and biochemical analysis of poly-gamma-glutamate produced by Escherichia coli clone cells", Biochem Biophys Res Commun. 1999 Sep 16; 263(1):6-12. * |
| MARRA M. et al., "The Genome sequence of the SARS-associated coronavirus", Science. 2003 May 30; 300(5624):1399-404. Epub 2003 May 1. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2739593C2 (ru) * | 2015-03-05 | 2020-12-28 | Петер Унд Траудль Энгельхорн-Штифтунг Цур Фёрдерунг Дер Лебенсвиссеншафтен | Система презентации пептидов на клеточной поверхности |
| RU2639246C1 (ru) * | 2016-12-21 | 2017-12-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Применение домена белка S-слоя из Lactobacillus brevis в качестве компонента системы для экспонирования слитых белков на поверхности клеток молочнокислых бактерий |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2004108937A1 (en) | 2004-12-16 |
| KR20040104936A (ko) | 2004-12-13 |
| KR100469936B1 (ko) | 2005-02-03 |
| CA2527346A1 (en) | 2004-12-16 |
| CN1798844A (zh) | 2006-07-05 |
| US20060140971A1 (en) | 2006-06-29 |
| AU2004245859B2 (en) | 2007-02-08 |
| JP2006526403A (ja) | 2006-11-24 |
| BRPI0411393A (pt) | 2006-08-01 |
| AU2004245859A1 (en) | 2004-12-16 |
| RU2005141528A (ru) | 2006-06-27 |
| EP1629104A4 (en) | 2006-11-02 |
| EP1629104A1 (en) | 2006-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2332457C2 (ru) | Вектор, обеспечивающий экспрессию антигена вируса sars на поверхности клеток, и микроорганизмы, трансформированные этим вектором | |
| ES2322213T3 (es) | Proteina nap de helicobacter pylori. | |
| JPH03504336A (ja) | 組換えポックスウイルス及び連鎖球菌ｍタンパク質ワクチン | |
| US9061002B2 (en) | Use of flagellins from the genus Marinobacter as vaccination adjuvants | |
| KR101919002B1 (ko) | 구제역 바이러스의 가용성 다가 항원단백질 및 이의 용도 | |
| JP2007131610A (ja) | 免疫機能が強化された死菌化乳酸菌製剤及びその製造方法 | |
| KR100609866B1 (ko) | 인간 파필로마바이러스에 대한 백신용 벡터 및 그에 의해형질전환된 미생물 | |
| JP2024512575A (ja) | 弱毒化されたレオウイルスベースのワクチン組成物及びその用途 | |
| JP2005528085A (ja) | 修飾された細菌表層タンパク質 | |
| JP5132780B2 (ja) | 水産用サブユニットワクチン | |
| KR100720755B1 (ko) | 파보바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 상기 벡터에의해 형질전환된 미생물 | |
| CN111607605B (zh) | 一种多价表位和亚单位疫苗的构建方法 | |
| WO2007083893A1 (en) | Cell surface expression vector of white spot syndrome virus antigen and microorganism transformed with the same | |
| TWI241407B (en) | Live attenuated bacteria of the species actinobacillus pleuropneumoniae | |
| JP2007525215A6 (ja) | パルボウイルス抗原の細胞表面発現ベクター及び該ベクターによって形質転換された微生物 | |
| CN107129527B (zh) | 一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原hp0623及其制备方法 | |
| CN114058634B (zh) | 一种鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗 | |
| WO2018066948A9 (ko) | 다수의 에피토프로 구성된 재조합 항원 단백질 및 이의 제조방법 | |
| JP2006025782A (ja) | スーパー抗原融合蛋白及びその応用方法 | |
| KR102542601B1 (ko) | 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이의 용도 | |
| RU2813324C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА MBP_RBD_6His ВИРУСА SARS-CoV-2 с C-КОНЦЕВОЙ АФФИННОЙ МЕТКОЙ 6xHIS-tag, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯЧ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ COVID-19 | |
| CN116462743B (zh) | 鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白、制备方法及应用 | |
| KR102711723B1 (ko) | 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물 및 이의 용도 | |
| TWI297359B (en) | Surface display vector of sars virus antigen and microorganisms transfomred thereby | |
| CN105821065A (zh) | 一种双抗原重组蛋白及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090605 |